ΙΣΤΟΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΙΣΤΟΧΗΜΕΙΑ Σήµανση ακτίνης και βινκουλίνης µε µεθόδους φθορισµού και ανοσοφθορισµού ιαλύµατα Ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού (Langangerand de Mey, 1989) χλωριούχο νάτριο (NaCl) χλωριούχο κάλιο (KCl) µονόξινο φωσφορικό νάτριο (Na2HPO4 ) δισόξινο φωσφορικό κάλιο (KH2PO4 ) χλωριούχο µαγνήσιο (MgCl2) EGTA PIPES γλυκόζη απεσταγµένο νερό ph 6.1 137mM 5mM 1.1mM 0.4 mm 2 mm 2 mm 5 mm 5.5 mm Παραφορµαλδεύδη 7.4% παραφορµαλδεύδη απεσταγµένο νερό 100 ml 7.4 γραµ Παραφορµαλδεύδη 3.7% Φτιαχνόταν µε ανάµιξη παραφορµαλδεύδης 7.4% και ρυθµιστικού διαλύµατος κυτταροσκελετού µε αναλογία 1:1. ιάλυµα Triton 0.5% Triton X-100 100µl ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού 20ml ιαδικασία Για τη σήµανση της ακτίνης και της βινκουλίνης, τα κύτταρα καλλιεργούνταν σε κυτταρικές µονοστιβάδες σε ειδικές γυάλινες αντικειµενοφόρες πλάκες (Νunc), οι οποίες ήταν χωρισµένες σε 2 ή/και 8 τµήµατα και δεν αυτοφθόριζαν. Μετά το τέλος της καλλιέργειας,τα κύτταρα ξεπλένονταν µε 500µl/ τµήµα της αντικειµενοφόρου
ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού για 5 λεπτά, σε θερµoκρασία δωµατίου. Ακολουθούσε µονιµοποίηση µε 500µl/ τµήµα της αντικειµενοφόρου παραφορµαλδεύδη 3.7%, για 20 λεπτά, σε θερµοκρασία δωµατίου και κατόπιν τα κύτταρα γίνονταν διαπερατά µε επώαση µε 500µl/ τµήµα της αντικειµενοφόρου διάλυµα Triton Χ-100 0,5%, για 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Στη συνέχεια τα κύτταρα ξεπλένονταν τρεις φορές µε 500µl/ τµήµα της αντικειµενοφόρου ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού, για πέντε λεπτά κάθε φορά, σε θερµοκρασία δωµατίου. Σήµανση ακτίνης Μετά τη διαπερατοποίηση των κυττάρων, γινόταν επώαση µε 300µl/τµήµα της αντικειµενοφόρου φαλλοιδίνη συνδεδεµένη µε ισοθειοκυανική τετραµεθυλροδαµίνη (TRITC) σε τελική συγκέντρωση 3ng/ml στο ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού, για 1 ώρα, στους 37οC. Ακολουθούσε ξέπλυµα των κυττάρων τρεις φορές µε 500µl/ τµήµα της αντικειµενοφόρου ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού, για πέντε λεπτά κάθε φορά, σε θερµοκρασία δωµατίου και κάλυψη τους µε το ειδικό υγρό κάλυψης aqua-poly mount (Polysciences), για να εµποδίζεται η γρήγορη εξασθένιση της έντασης του φθορισµού. Σήµανση βινκουλίνης Μετά τη διαπερατοποίηση των κυττάρων, πραγµατοποιούνταν επώαση µε 500µl/ τµήµα της αντικειµενοφόρου διάλυµα δέσµευσης µη ειδικών θέσεων πρόσδεσης που περιείχε 0.1% αλβουµίνη ορού βοός (BSA) και 5% φυσιολογικό ορό κατσίκας (NGS) για 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθούσε επώαση µε 100µl/ τµήµα της αντικειµενοφόρου µονοκλωνικό αντίσωµα βινκουλίνης (Sigma) σε τελική αραίωση 1/50 στο ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού το οποίο περιείχε 1% αλβουµίνη ορού βοός (BSA), για 1 ώρα στους 37οC και δύο φορές ξέπλυµα µε 500µl/ τµήµα της αντικειµενοφόρου ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού, για 5 λεπτά κάθε φορά. Ως δεύτερο αντίσωµα χρησιµοποιούταν goat anti-mouse ΙgG (Fc specific) συνδεδεµένο µε ισοθειοκυανική τετραµεθυλροδαµίνη (Sigma) σε τελική αραίωση 1/50 σε ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού το οποίο περιείχε 1% αλβουµίνη ορού βοός (BSA), για 1 ώρα, στους 37οC. Ακολουθούσε ξέπλυµα των κυττάρων τρεις φορές µε 500µl/ τµήµα της αντικειµενοφόρου ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού, για πέντε λεπτά κάθε φορά, σε θερµοκρασία δωµατίου και κάλυψη τους µε το ειδικό υγρό κάλυψης aqua-poly mount (Polysciences).
Μάρτυρες Για τη σήµανση της ακτίνης ως µάρτυρες χρησιµοποιούνταν κύτταρα στα οποία δεν είχε προστεθεί φαλλοιδίνη, ενώ για τον εντοπισµό της βινκουλίνης στους µάρτυρες δεν είχε προστεθεί είτε το πρώτο είτε το δεύτερο αντίσωµα. Παρατήρηση των κυττάρων Η παρατήρηση των κυττάρων γινόταν σε µικροσκόπιο Zeiss Axiovert S-100 εφοδιασµένο µε λυχνία HBO 50 και φίλτρο ροδαµίνης 546/580-590nm (Zeiss) µε καταδυτικό αντικειµενικό φακό x63. Η φωτογράφηση γινόταν µε φιλµ Kodak T-max 400 ASA (Kodak), µε φωτογραφική µηχανή MC 80DX (Zeiss) ενσωµατωµένη στο µικροσκόπιο. Τα φιλµ εµφανιζόταν σε σκοτεινό θάλαµο µε τη χρήση εµφανιστή D-76 (Kodak) για 13,5 λεπτά, στους 20οC, και µονιµοποιητή... (Kodak) για 10 λεπτά, στους 20οC και ξεπλένονταν για 20 λεπτά σε τρεχούµενο νερό βρύσης. Τα αρνητικά σαρώνονταν µε σαρωτή υψηλής ανάλυσης Agfa Duoscan T2500, µε ανάλυση 4000ppi (pixels per inch) και οι φωτογραφίες αποθηκεύονταν µε τη µορφή *TIFF, σε υπολογιστή Pentium... Σήµανση ακτίνης µε τη µέθοδο του κολλοειδούς ανοσοχρυσού ιαλύµατα Ρυθµιστικό διάλυµα Tris Tris 0.6 γραµ απεσταγµένο νερό 20 ml Γινόταν διόρθωση του ph του διαλύµατος µε 10Ν υδροχλώριο, µέχρι η τιµή του να φτάσει το 7.6. Στη συνέχεια συµπληρωνόταν απεσταγµένο νερό στο διάλυµα µέχρι τα 100 ml, χωριζόταν το διάλυµα σε τέσσερα µέρη και γινόταν ξανά διόρθωση του ph µε 10Ν υδροχλώριο έτσι ώστε να πάρουµε τρία διαλύµατα µε ph 7.2, 7.4 και 7.6, και µε 1Ν καυστικό νάτριο για να πάρουµε ένα διάλυµα µε ph 8.2. ιάλυµα αλβουµίνης ορού βοός (BSA) 0.2% σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris, ph 7.6 ιάλυµα αλβουµίνης ορού βοός (BSA) 0.8% σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris, ph 7.6 ιάλυµα αλβουµίνης ορού βοός (BSA) 1% σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris, ph 7.6
Ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 7.4, µαζί µεtween 0.1% Ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 7.2, µαζί µε αλβουµίνη ορού βοός (BSA) 0.2% και Tween 0.1% Ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 8.2, µαζί µε αλβουµίνη ορού βοός (BSA) 1% και Tween 0.1% Ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 7.6, µαζί µε αλβουµίνη ορού βοός (BSA) 0.8%, ζελατίνα ψαριού 0.1%, φυσιολογικό ορό κατσίκας (NGS) 5% και Tween 0.1% Ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 7.4, µαζί µε αλβουµίνη ορού βοός (BSA) 1% και Tween 0.1% ιαδικασία Η επώαση των πλεγµάτων µε τις τοµές στα διαλύµατα της ανοσοιστοχηµείας, γινόταν σε ειδικά πλακίδια Terasaki (Nunc) τα οποία είχαν 72 θέσεις τοποθέτησης των διαλυµάτων, χωρητικότητας 20µl το κάθε ένα. Επίσης τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνταν, φιλτράρονταν µε φίλτρο 0.2µm. Αρχικά τα πλέγµατα µε τις τοµές επωάζονταν µε ρυθµιστικό διάλυµα Tris, ph 7.4, τέσσερις φορές, για ένα λεπτό κάθε φορά και στεγνώνονταν µε χαρτί µικροσκοπίου. Ακολουθούσε επώαση για 30 λεπτά µε διάλυµα που εµπόδιζε τη µη-ειδική σύνδεση των αντισωµάτων και το οποίο αποτελούταν από ζελατίνα ψαριού 0,1%, αλβουµίνη ορού βοός (BSA) 0,8%, Tween 0,1% και φυσιολογικό ορό κατσίκας (NGS) 5% σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris 7.4. και στη συνέχεια µε µονοκλωνικό αντίσωµα ακτίνης (...) µε τελική αραίωση 1/10 σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris, ph 7.4, το οποίο περιείχε αλβουµίνη ορού βοός (BSA) 1% και ζελατίνα ψαριού 0,1%. Η επώαση γινόταν όλη τη νύχτα, στους 4οC. Την επόµενη ηµέρα γινόταν εκτεταµένο ξέπλυµα των τοµών µε συνεχή ανακίνηση των πλεγµάτων, ως εξής: ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 7.4, µαζί µε Tween 0.1%, δύο φορές, για δύο λεπτά κάθε φορά ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 7.4, µαζί µε Tween 0.1%, δύο φορές, για τρία λεπτά κάθε φορά ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 7.4, µαζί µε Tween 0.1%, πέντε φορές, για ένα λεπτό κάθε φορά
ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 7.2, µαζί µε αλβουµίνη ορού βοός (BSA) 0.2% και Tween 0.1%, τρεις φορές, για ένα λεπτό κάθε φορά ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 8.2, µαζί µε αλβουµίνη ορού βοός (BSA) 1% και Tween 0.1%, για πέντε λεπτά Στη συνέχεια γινόταν η προσθήκη του δευτερογενούς αντισώµατος, το οποίο είναι goat anti-mouse ΙgG συνδεδεµένο µε κόκκους χρυσού διαµέτρου 20nm, µε τελική αραίωση 1/20 σε ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 8.2, µαζί µε αλβουµίνη ορού βοός (BSA) 1%, και ζελατίνα ψαριού 0,1%. Η επώαση γινόταν για µία ώρα, σε θερµοκρασία δωµατίου και ακολουθούσε εκτεταµένο ξέπλυµα των τοµών µε συνεχή ανακίνηση των πλεγµάτων: ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 7.2, µαζί µε αλβουµίνη ορού βοός (BSA) 0.2% και Tween 0.1%, πέντε φορές, για ένα λεπτό κάθε φορά ρυθµιστικό διάλυµα Τris, ph 7.4, µαζί µε Tween 0.1%, πέντε φορές, για ένα λεπτό κάθε φορά απεσταγµένο νερό, οκτώ φορές, για ένα λεπτό κάθε φορά. Τέλος οι τοµές χρωµατίζονταν µε οξικό ουρανύλιο 7% και κιτρικό µόλυβδο και παρατηρούνταν σε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο διέλευσης Ζeiss EM900. Η φωτογράφηση των κυττάρων γινόταν µε µεγέθυνση x20000, για να είναι ορατοί οι κόκκοι χρυσού, σε πλαστικά τετράγωνα αρνητικά (Kodak)... ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΕΓΚΛΙΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ SERTOLI ΣΕ ΑΚΡΥΛΙΚΗ ΡΗΤΙΝΗ ΗΜ20 ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο ΤΗΣ ΣΤΑ ΙΑΚΗΣ ΜΕΙΩΣΗΣ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ (PLT) Εξοπλισµός Η µέθοδος της αφυδάτωσης και έγκλισης µε σταδιακή µείωση της θερµοκρασίας (PLT) πραγµατοποιούνταν µε τη χρήση του ειδικού µηχανήµατος Leica EM AFS. Το µηχάνηµα αυτό αποτελείται από έναν κάδο υγρού αζώτου, πάνω στον οποίο είναι προσαρµοσµένος ειδικός θάλαµος για τη διεκπεραίωση των διαδικασιών και από την µονάδα λειτουργικού ελέγχου του µηχανήµατος, στην οποία γίνεται ο προγραµµατισµός και η αποθήκευση των επιµέρους βηµάτων της µεθόδου. Τα εξαρτήµατα και τα διαλύµατα που επρόκειτο να χρησιµοποιηθούν, προψύχονταν στον ειδικό θάλαµο στις θερµοκρασίες που καθορίζονταν από το πρόγραµµα που εφαρµοζόταν
ιαλύµατα Ρυθµιστικό διάλυµα PBS δισόξινο φωσφορικό νάτριο (NaH2PO4 H2O) mm µονόξινο φωσφορικό νάτριο (Na2HPO4 2H2O) χλωριούχο νάτριο (NaCl) mm απεσταγµένο νερό ph 7.4 mm Παραφορµαλδεύδη 4% παραφορµαλδεύδη απεσταγµένο νερό 100 ml 4 γραµ ιάλυµα παραφορµαλδεύδης 2% και γλουταραλδεύδης 0.1% σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS παραφορµαλδεύδη 4% 50% ρυθµιστικό διάλυµα PBS 50% γλουταραλδεύδη 25% 0.1% ιάλυµα ζελατίνας 4% ζελατίνα 4 γραµ. ρυθµιστικό διάλυµα PBS 100 ml Mονιµοποίηση κυττάρων Sertoli Για την αφυδάτωση και έγκλιση των κυττάρων Sertoli µε τη µέθοδο της σταδιακής µείωσης της θερµοκρασίας (PLT), τα κύτταρα καλλιεργούνταν σε τρυβλία Petri, µε τελική πυκνότητα 9x104 κύτταρα/τρυβλίο. Μετά το τέλος της καλλιέργειας αφαιρούνταν το καλλιεργητικό υλικό και τα κύτταρα ξεπλένονταν µε ρυθµιστικό διάλυµα PBS, ph 7.4, στους 32οC. Ακολουθούσε µονιµοποίηση των µονοστιβάδων µε 1 ml διάλυµα φορµαλδεύδης 2% και γλουταραλδεύδης 0.1% σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS, ph 7.4, για 30 λεπτά, στους 32οC. Στη συνέχεια τα κύτταρα ξύνονταν από τον πάτο του τρυβλίου µε τη χρήση ειδικής λαστιχένιας ξύστρας, το περιεχόµενο του τρυβλίου µεταφερόταν σε Εppendorf του1.5ml και γινόταν φυγοκέντρηση των κυττάρων στα 500g, για 5 λεπτά. Κατόπιν, αφαιρούνταν το υπερκείµενο, γινόταν
προσθήκη 500µl ρυθµιστικού διαλύµατος PBS και φυγοκέντρηση ξανά στα 500g για 5 λεπτά. Το υπερκείµενο αφαιρούνταν πάλι και γινόταν προσθήκη αυτή τη φορά 500µl διαλύµατος 4% ζελατίνας και φυγοκέντρηση στα 500g, για 5 λεπτά. Με την τελευταία αυτή φυγοκέντρηση η ζελατίνα στερεοποιούταν και µε τη χρήση στερεοσκοπίου, κοβόταν το κοµµάτι της ζελατίνας που είχε τα κύτταρα συγκεντρωµένα, το οποίο στη συνέχεια τεµαχιζόταν σε πολύ µικρά κοµµάτια. Αφυδάτωση και έγκλιση κυττάρων Seroli µε τη µέθοδο της σταδιακής µείωσης της θερµοκρασίας (PLT) Αρχικά το µηχάνηµα ζεσταινόταν για 30 λεπτά, στους 30οC, για να εξατµιστεί η υγρασία που υπήρχε στο µηχάνηµα. Στη συνέχεια ξεκινούσε το πρώτο πρόγραµµα, το οποίο κατέβαζε τη θερµοκρασία στον θάλαµο στους 0οC. Στη θερµοκρασία αυτή, µεταφέρονταν στο µηχάνηµα τα κοµµάτια της ζελατίνας που περιείχαν τα κύτταρα και ξεκινούσε η αφυδάτωσή τους, σε υδατικά διαλύµατα αιθυλικής αλκοόλης µε σταδιακά αυξανόµενες συγκεντρώσεις, σε σταδιακά µειωµένες θερµοκρασίες, ως εξής: 30% αιθυλική αλκοόλη για 30 λεπτά, στους 0οC 50% αιθυλική αλκοόλη για 30 λεπτά στους -10οC 70% αιθυλική αλκοόλη για 30 λεπτά στους -25οC 100% αιθυλική αλκοόλη για 30 λεπτά στους -40οC 100% αιθυλική αλκοόλη για 30 λεπτά στους -50οC Κατά τη διάρκεια της παραµονής των κυττάρων σε ένα διάλυµα αιθυλικής αλκοόλης, τοποθετούνταν µέσα στο θάλαµο το επόµενο διάλυµα αιθυλικής αλκοόλης, έτσι ώστε να κατέβει η θερµοκρασία του στην επιθυµητή τιµή. Μετά την ολοκλήρωση των αφυδατώσεων, ακολουθούσε η εµπότιση των κυττάρων στην ακρυλική ρητίνη ΗΜ20 ως εξής: 1 ρητίνη : 3 απόλυτη αιθυλική αλκοόλη, για 60 λεπτά στους -50οC 1 ρητίνη : 1 απόλυτη αιθυλική αλκοόλη, για 60 λεπτά στους -50οC 3 ρητίνη : 1 απόλυτη αιθυλική αλκοόλη, για 60 λεπτά στους -50οC καθαρή ρητίνη, για 60 λεπτά στους -50οC καθαρή ρητίνη, για 16 ώρες στους -50οC
Την επόµενη ηµέρα γινόταν η έγκλιση των κυττάρων στην ακρυλική ρητίνη HM20, στους -50οC. Ο πολυµερισµός της ΗΜ20 γινόταν µε λάµπα υπεριώδους για 48 ώρες στους -50οC και για 24 ώρες στους 0οC.