2. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ

Transcript

1 ...Υλικό και Μέθοδοι ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1 ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΤΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Το υλικό της µελέτης αποτέλεσαν βιοψίες α) από διηθητικά πορογενή καρκινώµατα µαστού, β) από ινοαδενώµατα, που αποτελούν καλοήθεις νεοπλασίες µαστού, και γ) από αλλοιώσεις µαστού ινοκυστικού τύπου, αδενώσεις και µαστοπάθειες. Όλες οι βιοψίες αφαιρέθηκαν χειρουργικά από γυναίκες, ηλικίας από 19 έως 80 ετών. Το υλικό παραχωρήθηκε από το Ιατρικό Κέντρο ιάγνωσης και Παρακολούθησης «Πρόληψις» σε συνεργασία µε το Παθολογοανατοµικό Εργαστήριο του Ευγενιδείου Θεραπευτηρίου. Η χρήση του υλικού έγινε µετά από άδεια από την Επιτροπή Ηθικής εοντολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Αθηνών (αρ. αδείας: 5758/ ). 2.2 ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Ιστοί αναφοράς Στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήθηκε µία βιοψία από φυσιολογικό ιστό που ήταν γειτονικός σε καρκινική εστία για τη συγκριτική µελέτη της µορφολογίας µε αυτή των βιοψιών από διηθητικά πορογενή καρκινώµατα του µαστού σε επίπεδο τόσο οπτικού όσο και ηλεκτρονικού µικροσκοπίου. Για την συγκριτική µελέτη της ανοσοεντόπισης της αντιγονικής οµάδας Η σε σχέση µε την κυτοκερατίνη 8, ως ιστοί αναφοράς για τα διηθητικά πορογενή καρκινώµατα του µαστού, χρησιµοποιήθηκαν βιοψίες από α) ινοαδενώµατα, β) αλλοιώσεις του µαστού ινοκυστικού τύπου και γ) αδένωση Ιστολογική ταξινόµηση του υλικού Ο βαθµός κακοήθειας των νεοπλασµάτων καθορίσθηκε σύµφωνα µε το σύστηµα βαθµοποίησης Bloom-Richardson (1957) (Nottingham modification). Τα είδη των βιοψιών που συλλέχθηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.1. Τα κλινικοπαθολογικά δεδοµένα των ατόµων, από τα οποία ελήφθησαν οι βιοψίες, παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.2.Από το παραπάνω υλικό, οι βιοψίες που µελετήθηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.3. Τα κλινικοπαθολογικά δεδοµένα των ατόµων, από τα οποία ελήφθησαν οι βιοψίες που εξετάσθηκαν στην παρούσα µελέτη παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.4. Από αυτά τα δεδοµένα, ο βαθµός κακοήθειας των βιοψιών αποτέλεσε

2 ...Υλικό και Μέθοδοι την βασική παράµετρο µε την οποία συσχετίσθηκε η ανοσοεντόπιση της αντιγονικής οµάδας Η και της κυτοκερατίνης 8 στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Πίνακας 2.1 Ιστολογική ταξινόµηση των βιοψιών µαστού που συλλέχθηκαν. Είδος βιοψίας µαστού Ποσότητα Φυσιολογικός ιστός γειτονικός σε καρκινική εστία 1 Ινοαδένωµα 7 Αλλοιώσεις ινοκυστικού τύπου 9 Αδένωση 2 Μαστοπάθεια 1 ιηθητικό πορογενές καρκίνωµα µαστού µε βαθµό κακοήθειας Ι 5 ιηθητικό πορογενές καρκίνωµα µαστού µε βαθµό κακοήθειας ΙΙ 27 ιηθητικό πορογενές καρκίνωµα µαστού µε βαθµό κακοήθειας ΙΙΙ 19

3 ...Υλικό και Μέθοδοι Πίνακας 2.2 Κλινικοπαθολογικά δεδοµένα των βιοψιών µαστού που συλλέχθηκαν από το Ιατρικό Κέντρο ιάγνωσης και Παρακολούθησης «Πρόληψις» σε συνεργασία µε το Παθολογοανατοµικό Εργαστήριο του Ευγενιδείου Θεραπευτηρίου. Κωδ. αριθµ. Ηλικία (έτη) Ιστολογικός τύπος Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. εν ελήφθησαν λεµφαδένες Νο2 70 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. Λεµφ. θετικοί: 5/14 Νο3 35 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. Λεµφ. θετικοί: 1/13 Βαθµός κακοήθειας (grade) III Νο4 43 Μυελοειδές καρκ. αρ. µαστού, µείζονος διαµ. 2cm, λεµφαδένες (-) Νο5 59 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα II µαστού. Λεµφ. θετικοί: 1/17 Νο6 70 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού III Νο7 65 In situ καρκ. δεξιού µαστού,νόσ. Paget Νο8 57 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα II µαστού. Λεµφαδένες (-) S14 60 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα II µαστού. Λεµφαδένες (-) S15 50 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα III αριστερού µαστού, µείζονος διαµ. 2cm. Λεµφαδένες (-) S16/α 73 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα III µαστού, λεµφαδένες θετικοί: 10/17 S16/β 73 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού I µαστού, καρκινωµατώδης διήθηση της θηλής S17 65 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα II µαστού, λεµφαδένες (-) S18/α 67 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα III αριστερού µαστού S18/β 73 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα III αριστερού µαστού S19/α 70 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα II µαστού, διήθηση ενός λεµφαδένα επιπέδου Ι S19/β Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα III αριστερού µαστού. εν ελήφθησαν λεµφαδένες. S20/α 49 Ινοαδένωµα S20/β 74 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, λεµφαδένες αρνητικοί S20/γ 80 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα II-III αριστερού µαστού, µεταστατική διήθηση λεµφαδένων επιπ. ΙΙΙ (1/11) S21 68 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, λεµφαδένες αρνητικοί II II II

4 ...Υλικό και Μέθοδοι S22/α 43 Ινοκυστικού τύπου αλλοιώσεις, αριστερός µαστός S22/β 43 Λίγες εστίες αδένωσης και επιθηλίωσης, αριστερός µαστός S23/α 33 Αριστερός µαστός, ινοκυστικού τύπου αλλοιώσεις. Παρουσία αιµορραγικής κύστης διαµ. 0,7cm S23/β 43 Ινοαδένωµα, αριστερός µαστός S24/α 42 Ινοαδένωµα, αριστ. µαστός S24/β 51 Ηπιες ινοκυστικού τύπου αλλοιώσεις αριστερού µαστού S24/γ 36 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, αρχόµενη µεταστατική διήθηση ενός λεµφαδένα επιπέδου ΙΙ S25/α 40 Θήλωµα δεξ. µαστού. Ινοκυστικού τύπου αλλοιώσεις S25/β 37 Μαστοπάθεια δεξιού µαστού, µετρίου βαθµού (αρνητικό) S26/α 64 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, διαµ. 1cm. εύτερη εστία διαµ. 1,5 cm ενδοποριακού in situ πορογ. Καρκ. Λεµφαδένες αρνητικοί S26/β 80 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, διαµ.1,5 cm, λεµφαδ. (-) S26/γ 53 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, διαµ. 4cm, λεµφαδ. (+) S27 53 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, διαµ. 1,5cm, διήθηση ενός λαµφαδένα επιπέδου 1 (1/11) S28/α 19 Ινοαδένωµα νεανικού τύπου, διαµ. 3cm, αρ. µαστός S28/β 76 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, διαµ. 2cm, λεµφαδ. (-) S28/γ Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, διαµ. 2cm. S29/α 45 Θετικό α) αριστερός µ. Β) δεξιός µαστός. Πορ. διηθ. καρκ. µαστού διαµ. 2,5 cm, λεµφαδ. (+) και οι δύο (2/20) S29/β 32 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, διαµ. 2cm, λεµφ. αρνητικοί S30/α 58 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, διαµ. 1,5cm, λεµφ. αρνητικοί S30/β 44 Ινοαδένωµα, δεξιός µαστός S30/γ Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, διαµ. 2cm. εξιός µαστός in situ πορογενές καρκ. φαγεσωρικού τύπου µε µικροδιηθητική εστία διαµ. 0.3cm. εν ελήφθησαν λεµφαδένες. II I I III ΙΙΙ I III II III III II

5 ...Υλικό και Μέθοδοι S31 64 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, διαµ. 1cm, λεµφαδ. (-) S32/α 56 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, 2,5cm, λεµφαδένες (-) S32/β 59 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού,1,5 cm, λεµφαδ. (-) S32/γ 38 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, 3cm, 9 λεµφαδ. (9/24) µε µεταστατική διήθηση S33 46 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, λεµφαδένες (-) S34/α 45 Μέτριες αλλοιώσεις ινοκυστικού τύπου S34/β 39 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, εκτεταµένη παρουσία ενδοεπιθηλιακού κλάσµατος in situ, 1 µασχαλ. αδένας (1/8) S35/α 41 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού µε παρουσία ενδοεπιθηλιακού (in situ) κλάσµατος (µειζ. διαµ.: 2,5cm). Λεµφαδένες µασχάλης (4/28), µεταστατικά διηθηµένοι, εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S35/β 40 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού (µ.δ.:1,3cm) µετρίου βαθµού διαφοροποίη-σης. Λεµφαδένες µασχάλης (0/11), εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S36/α 49 Ινοαδενώµατα δεξ. µαστού S36/β 38 Ινοαδένωµα δεξ. µαστού, S36/γ 38 Αρ. µαστός, ινοκυστικού τύπου αλλοιώσεις S36/δ 78 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού. Λεµφαδένες µασχάλης (0/17), εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S36/ε 73 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού. Λεµφαδένες αρνητικοί. S37 51 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού. S38/α 52 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού. Λεµφαδένες µασχάλης (0/20), εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S38/β 42 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, (µ.δ.: 4cm) µέτρια διαφοροποιηµένο. Λεµφαδένες µασχάλης (9/18), µεταστατικά διηθηµένοι, εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S39 62 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού (µ.δ.:2cm). Λεµφαδένες µασχάλης (0/13), εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S40/α 63 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού (διαµ. 2cm). Λεµφαδένες II III II III grade II grade II grade II grade IIΙ grade IIΙ grade II grade II grade II grade II grade II grade I

6 ...Υλικό και Μέθοδοι µασχάλης (0/18), εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S40/β 52 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού (διαµ. 2cm). Λεµφαδένες µασχάλης (0/17), χωριστά αποσταλείς λεµφαδένας (0/1) εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S41 34 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού. Λεµφ. θετικοί (3/23) S42/α 55 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, µειζ. διαµ. 3cm, µέτρια διαφοροποιηµένο, αρ. µαστός.μεταστατική διήθηση 1 µασχ, λεµφαδ. επιπέδου Ι (1/15) S42/β 52 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, µειζ. διαµ. 3cm. Λεµφαδένες µασχάλης 15, ελεύθερα νεοπλασµατικής διηθήσεως (0/15). S43/α 49 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού (µειζ. διαµ. 1,8cm), µέτρια διαφοροποιηµένο, αρ. µαστός. Λεµφαδένες µασχάλης (0/21), εγχ. όρια εκτοµής ελεύθερα νόσου. S43/β 49 Φυσιολογικός γειτονικός ιστός S44/α 31 Έντονες αλλοιώσεις ινοκυστικής νόσου (δεξιός µαστός) S44/β 45 Έντονη και εκτεταµένη αλλοίω-ση ινοκυστικής µαστοπάθειας (δεξιός µαστός) S45 72 Αδένωση S46/α 49 Αλλοιώσεις ινοκυστικής νόσου. S46/β Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού. Λεµφαδένες αρνητικοί. S47/α 66 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. Λεµφαδένες αρνητικοί. S47/β 45 Αλλοιώσεις ινοκυστικής νόσου. S48/α 54 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, µείζ. ιαµ. 2,3cm. Στην περιφέρεια του όγκου συνυπήρχε in situ πορογενές καρκίνωµα. Λεµφ.:1/12 S48/β 36 50% πορογενές in situ, Comedo τύπου υψηλού βαθµού πυρηνικής κακοήθειας και 50% διηθητικό πορογενές grade III. Μεταστατική διήθηση σε 5/21 λεµφαδένες grade ΙI grade ΙI grade ΙI grade ΙIΙ grade ΙΙ Grade II Grade III grade II In situ/comedo ιηθητικό/grade III

7 ...Υλικό και Μέθοδοι Πίνακας 2.3 Ιστολογική ταξινόµηση των βιοψιών µαστού που µελετήθηκαν. Είδος βιοψίας µαστού Ποσότητα Φυσιολογικός ιστός* 1 Ινοαδένωµα** 6 Αλλοιώσεις ινοκυστικού τύπου 4 Αδένωση 1 ιηθητικό πορογενές καρκίνωµα µαστού µε βαθµό κακοήθειας Ι 5 ιηθητικό πορογενές καρκίνωµα µαστού µε βαθµό κακοήθειας ΙΙ 19 ιηθητικό πορογενές καρκίνωµα µαστού µε βαθµό κακοήθειας ΙΙΙ 13 *Ο φυσιολογικός ιστός είναι γειτονικός σε καρκινική εστία και χρησιµοποιήθηκε ως ιστός αναφοράς για τη συγκριτική µελέτη της µορφολογίας σε σχέση µε αυτήν των κακοήθων νεοπλασµάτων. **Οι βιοψίες των ινοαδενωµάτων χρησιµοποιήθηκαν ως τα καλοήθη νεοπλάσµατα για τη συγκριτική µελέτη του ανοσοεντοπισµού της κυτοκερατίνης 8 και της αντιγονικής οµάδας Η σε σχέση µε τον ανοσοεντοπισµό στα κακοήθη νεοπλάσµατα.

8 ...Υλικό και Μέθοδοι Πίνακας 2.4 Κλινικοπαθολογικά δεδοµένα των υπό µελέτη βιοψιών µαστού Κωδ. αριθµ. Ηλικία (έτη) Ιστολογικός τύπος Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. εν ελήφθησαν λεµφαδένες. Νο2 70 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. Λεµφ. θετικοί: 5/14 Νο3 35 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. Λεµφ. θετικοί: 1/13 Νο4 43 Μυελοειδές καρκ. αρ. µαστού, µείζονος διαµ. 2cm, λεµφαδένες (-) Νο5 59 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. Λεµφ. θετικοί: 1/17 Νο6 70 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού Νο8 57 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. Λεµφαδένες (-) S14 60 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. Λεµφαδένες (-) S15 50 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, µείζονος διαµ. 2cm. Λεµφαδένες (-) S16/α 73 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, λεµφαδένες θετικοί: 10/17 S17 65 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, λεµφαδένες αρνητικοί S18/β 73 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού S19/β Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού. εν ελήφθησαν λεµφαδένες. S20/α 49 Ινοαδένωµα S20/γ 80 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, µεταστατική διήθηση λεµφαδένων επιπ. ΙΙΙ (1/11) S21 68 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, λεµφαδένες αρνητικοί S23/β 43 Ινοαδένωµα, αριστερός µαστός S24/α 42 Ινοαδένωµα, αριστ. µαστός S26/α 64 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, διαµ. 1cm. εύτερη εστία διαµ. 1,5 cm ενδοπορικού in situ πορογ. καρκ. Λεµφαδένες αρνητικοί S26/β 80 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, διαµ.1,5 cm, Βαθµός κακοήθειας (grade) III II II II III II II III III II III III II-III II I I

9 ...Υλικό και Μέθοδοι λεµφαδ. (-) S28/β 76 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, διαµ. 2cm, λεµφαδ. (-) S29/β 32 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, διαµ. 2cm, λεµφ. αρνητικοί S30/β 44 Ινοαδένωµα, δεξιός µαστός S30/γ Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, διαµ. 2cm. εξιός µαστός in situ πορογενές καρκ. φαγεσωρικού τύπου µε µικροδιηθητική εστία διαµ. 0.3cm. εν ελήφθησαν λεµφαδένες. S31 64 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, διαµ. 1cm, λεµφαδ. (-) S32/α 56 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, 2,5cm, λεµφαδένες (-) S32/β 59 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού,1,5 cm, λεµφαδ. (-) S32/γ 38 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού, 3cm, 9 λεµφαδ. (9/24) µε µεταστατική διήθηση S33 46 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, λεµφαδένες (-) S34/β 39 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, εκτεταµένη παρουσία ενδοεπιθηλιακού κλάσµατος in situ, 1 µασχαλ. αδένας (1/8) S36/α 49 Ινοαδενώµατα δεξ. µαστού S36/β 38 Ινοαδένωµα δεξ. µαστού, S36/δ 78 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού. Λεµφαδένες µασχάλης (0/17), εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S37 51 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού. S38/α 52 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού. Λεµφαδένες µασχάλης (0/20), εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S39 62 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού (µ.δ.:2cm). Λεµφαδένες µασχάλης (0/13), εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S40/α 63 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού (διαµ. 2cm). Λεµφαδένες µασχάλης (0/18), εγχ. όρια ελεύθερα «νόσου» S41 34 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα δεξιού µαστού. Λεµφ. θετικοί: 3/23 I III II II III II III II II IIΙ II II II I ΙI

10 ...Υλικό και Μέθοδοι S42/α 55 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού, µειζ. διαµ. 3cm, µέτρια διαφοροποιηµένο, αρ. µαστός.μεταστατική διήθηση 1 µασχ, λεµφαδ. επιπέδου Ι (1/15) S42/β 52 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, µειζ. διαµ. 3cm. Λεµφαδένες µασχάλης 15, ελεύθερα νεοπλασµατικής διηθήσεως (0/15). S43/β 49 Φυσιολογικός γειτονικός ιστός S44/α 31 Έντονες αλλοιώσεις ινοκυστικής νόσου (δεξιός µαστός) S44/β 45 Έντονη και εκτεταµένη αλλοίω-ση ινοκυστικής µαστοπάθειας (δεξιός µαστός) S45 72 Αδένωση S46/α 49 Αλλοιώσεις ινοκυστικής νόσου. S46/β Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού. Λεµφαδένες αρνητικοί. S47/α 66 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα µαστού. Λεµφαδένες αρνητικοί. S47/β 45 Αλλοιώσεις ινοκυστικής νόσου. S48/α 54 Πορογενές διηθητικό καρκίνωµα αριστερού µαστού, µείζ. ιαµ. 2,3cm. Στην περιφέρεια του όγκου συνυπήρχε in situ πορογενές καρκίνωµα. Λεµφ.:1/12 S48/β 36 50% πορογενές in situ, Comedo τύπου υψηλού βαθµού πυρηνικής κακοήθειας και 50% διηθητικό πορογενές grade III. Μεταστατική διήθηση σε 5/21 λεµφαδένες ΙI ΙIΙ II III II In situ/comedo ιηθητικό/grade III 2.3 ΛΗΨΗ ΤΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΤΟΥ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Η υπό µελέτη βιοψία, αµέσως µετά τη χειρουργική της αφαίρεση, µεταφερόταν σε ειδικό πλαστικό δοχείο στο παθολογοανατοµικό εργαστήριο για την περαιτέρω ιστολογική εξέτασή του. Μικρό τµήµα της βιοψίας (περίπου 0.5 cm 3 ), µετά από επιλογή της καρκινικής περιοχής, εµβαπτιζόταν σε µονιµοποιητικό διάλυµα. Το είδος του µονιµοποιητικού διαλύµατος, η χρονική διάρκεια της µονιµοποίησης και η θερµοκρασία διεξαγωγής της ήταν άµεσα εξαρτώµενα από τη µεθοδολογία που θα εφαρµοζόταν, όπως αναλύεται στην παράγραφο 2.4. Μετά την ολοκλήρωση της µονιµοποίησης, ο ιστός εµβαπτιζόταν σε ρυθµιστικό διάλυµα, το είδος του οποίου ήταν ίδιο µε αυτό που είχε χρησιµοποιηθεί στο µονιµοποιητικό διάλυµα. Στη συνέχεια γινόταν µεταφορά του

11 ...Υλικό και Μέθοδοι ιστού στο Eργαστήριο Ιστολογίας-Εµβρυολογίας, µέσα σε κουτί µε θερµοµονωτικά τοιχώµατα. Στο Εργαστήριο, κάτω από το στερεοσκόπιο American Optical, σε µεγέθυνση x 0.7, η κάθε βιοψία χειριζόταν ως εξής: α) σε ένα γυάλινο τρυβλίο Petri εµβαπτιζόταν σε µικρή ποσότητα ρυθµιστικού διαλύµατος, ώστε να µην είναι εκτεθειµένη στον αέρα, β) κοβόταν σε µικρότερα ιστοτεµάχια (1-2mm 3 ) για την περαιτέρω επεξεργασία τους για ηλεκτρονική µικροσκοπία. Ο τεµαχισµός γινόταν µε προσεχτικές κινήσεις µε τη χρήση λαβίδας µε σχετικά λεπτά άκρα (Νο 3) και λεπίδας Astor, η οποία είναι λεπτή και κοφτερή, έτσι ώστε να µην προκληθούν τεχνικές αλλοιώσεις στη µορφολογία του ιστού. Στην περίπτωση που το τεµάχιο της βιοψίας προοριζόταν για αποθήκευση σε ατµούς υγρού αζώτου (Ν 2 ), εξασφαλιζόταν η διατήρηση της φυσικής του κατάστασης µε τοποθέτησή του, αµέσως µετά τη χειρουργική του αφαίρεση και τη µεταφορά του στο παθολογοανατοµικό εργαστήριο, σε γάζα εµποτισµένη µε φυσιολογικό ορό (NaCl 0.9%) µέσα σε γυάλινο τρυβλίο Petri. Στη συνέχεια µεταφερόταν στους 4 ο C στο Εργαστήριο Ιστολογίας-Εµβρυολογίας, το αργότερο σε 1h από τη λήψη της βιοψίας, µέσα σε κουτί µε θερµοµονωτικά τοιχώµατα που περιείχε παγοκυψέλες. 2.4 ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΩΝ Μονιµοποίηση του ιστού για ανοσοϊστοχηµική και µορφολογική µελέτη στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο διέλευσης (ΗΜ) Στη χηµική µονιµοποίηση των ιστών για ηλεκτρονική µικροσκοπία καθοριστικό ρόλο παίζει το είδος του µονιµοποιητή, η θερµοκρασία και η διάρκεια της µονιµοποίησης (Χαβάκη, 1998). Η γλουταραλδεΰδη και η φορµαλδεΰδη είναι δύο αλδεΰδες που χρησιµοποιούνται ευρέως για τη µονιµοποίηση ιστών στην Ηλεκτρονική Μικροσκοπία. Λόγω των διαφορετικών χηµικών ιδιοτήτων τους (βλ. Εισαγωγή, Παράγραφος ) χρησιµοποιούνται η κάθε µία χωριστά ή και οι δύο µαζί σε διάφορες συγκεντρώσεις (Hayat, 1986; Hayat, 2000). Με βάση τα παραπάνω, έγιναν προκαταρκτικά πειράµατα, όπου χρησιµοποιήθηκαν ως µονιµοποιητές η γλουταραλδεΰδη και η φορµαλδεΰδη σε διάφορες συγκεντρώσεις και δοκιµάσθηκαν επίσης η χρονική διάρκεια και η θερµοκρασία της µονιµοποίησης. Σκοπός αυτών των πειραµάτων ήταν να τυποποιηθούν οι συνθήκες κάτω από τις οποίες θα εξασφαλιζόταν η καλύτερη διατήρηση της µορφολογίας και της αντιγονικότητας του

12 ...Υλικό και Μέθοδοι υπό µελέτη ιστού. Σε όλες τις δοκιµές που περιγράφονται, η φορµαλδεΰδη που χρησιµοποιήθηκε προέρχεται από αποπολυµερισµό παραφορµαλδεΰδης υψηλής καθαρότητας. Σε αυτά τα πειράµατα, εκτός από τις βιοψίες µαστού, χρησιµοποιήθηκε επίσης λεπτό έντερο επίµυος της σειράς Wistar ως πειραµατικό πρότυπο ιστού λόγω της αφθονίας των κυτταροσκελετικών στοιχείων. Έγιναν οι εξής δοκιµές: 1. 3% φορµαλδεΰδη 0.25% γλουταραλδεΰδη σε ρυθµιστικό φωσφορικό διάλυµα (PB) 0.1Μ, ph 7.4 (βλ. συνταγή στο Παράρτηµα), για 3 h στους 4 ο C. Αυτές ο συνθήκες µονιµοποίησης χρησιµοποιούνται ευρέως όταν σκοπός είναι η διατήρηση των αντιγονικών θέσεων του ιστού, κάτι που επιτυγχάνεται µε την µεγαλύτερη συγκέντρωση της φορµαλδεΰδης σε σχέση µε την γλουταραλδεΰδη και τη σύντοµη διάρκεια της µονιµοποίησης. 2. 3% φορµαλδεΰδη 0.25% γλουταραλδεΰδη σε 0.1Μ PB, ph 7.4, για 20 h στους 4 ο C. Σε σχέση µε την προηγούµενη διαδικασία µονιµοποίησης, σε αυτήν τη δοκιµή έγινε αλλαγή µόνο στη διάρκεια της µονιµοποίησης, για να εξετασθεί εάν διατηρείται η αντιγονικότητα του ιστού µε την αύξηση του χρόνου µονιµοποίησης. 3. 2% φορµαλδεΰδη 0.5% γλουταραλδεΰδη σε αλατούχο ρυθµιστικό φωσφορικό διάλυµα (PBS) 0.01Μ, ph 7.4 (βλ. συνταγή στο Παράρτηµα), για 1 h στους 4 ο C (Robertson et al., 1992). Αυτό το µονιµοποιητικό διάλυµα, στο οποίο έγινε µείωση της συγκέντρωσης της φορµαλδεΰδης και αύξηση της συγκέντρωσης της γλουταραλδεΰδης, ενώ παράλληλα µειώθηκε και ο χρόνος της µονιµοποίησης, δοκιµάσθηκε για να εξετασθεί αν διατηρείται καλύτερα η αντιγονικότητα και η µορφολογία του ιστού σε σχέση µε το προηγούµενο µονιµοποιητικό διάλυµα. 4. 2% φορµαλδεΰδη 0.5% γλουταραλδεΰδη σε 0.01Μ PBS, ph 7.4, για 1 h σε θερµοκρασία δωµατίου (Θ : 22 o C). Χρησιµοποιήθηκε το ίδιο είδος µονιµοποιητικού διαλύµατος, όπως και στη προηγούµενη δοκιµή. Η θερµοκρασία όµως της µονιµοποίησης ήταν στους 22 o για να µελετηθεί σε αυτές τις συνθήκες η διατήρηση τόσο της µορφολογίας των µικροσωληνίσκων, οι οποίοι σε αυτήν τη θερµοκρασία δεν αποπολυµερίζονται (Moskalewski et al., 1980; Cassimeris et al., 1986), όσο και της αντιγονικότητας του ιστού. 5. 2% φορµαλδεΰδη 0.5% γλουταραλδεΰδη σε 0.01Μ PBS, ph 7.4, για 1 h, στους 32 o C. Επίσης σε αυτή τη δοκιµή χρησιµοποιήθηκε το ίδιο µονιµοποιητικό διάλυµα όπως στην τρίτη δοκιµή, αλλά η θερµοκρασία που έγινε η µονιµοποίηση ήταν ίδια µε

13 ...Υλικό και Μέθοδοι αυτή του σώµατος του πειραµατοζώου, ώστε να µελετηθεί σε αυτές τις συνθήκες αν διατηρείται η αντιγονικότητα του ιστού % γλουταραλδεΰδη σε 0.01Μ PBS, ph 7.4 (βλ. συνταγή στο Παράρτηµα), για 1 h στους 4 ο C. Αυτό το µονιµοποιητικό διάλυµα δοκιµάσθηκε για τη µελέτη της διατήρησης της αντιγονικότητας του ιστού µε χρήση ενός µόνο είδους αλδεΰδης (της γλουταραλδεΰδης σε µεγάλη συγκέντρωση (Kosaka et al., 1986; Seretis et al., 2001) % γλουταραλδεΰδη σε 0.01Μ PBS, ph 7.4, για 1 h σε Θ. Χρησιµοποιήθηκε το ίδιο είδος µονιµοποιητικού διαλύµατος, όπως και στην προηγούµενη δοκιµή. Όµως, όπως και στην τέταρτη δοκιµή, η θερµοκρασία της µονιµοποίησης ήταν στους 22 o για να µελετηθεί σε αυτές τις συνθήκες, εκτός από τη διατήρηση της αντιγονικότητας του ιστού και η διατήρηση της µορφολογίας των µικροσωληνίσκων, ως συστατικό του κυτταροσκελετού στα νεοπλασµατικά κύτταρα % γλουταραλδεΰδη - 0.5% φορµαλδεΰδη σε 0.01Μ PBS, ph 7.4 (βλ. συνταγή στο Παράρτηµα), για 1 h στους 4 ο C. Σε αυτή τη δοκιµή έγινε πρόσθεση στο µονιµοποιητικό διάλυµα της φορµαλδεΰδης σε µικρή συγκέντρωση για να µελετηθεί, συγκριτικά µε την προηγούµενη δοκιµή, αν υπάρχει βελτίωση στη διατήρηση της αντιγονικότητας και της µορφολογίας του ιστού όταν χρησιµοποιείται συνδυασµός αυτών των αλδεϋδών (Hayat, 1986; Kirkeby and Moe, 1986; Hayat, 2000) % γλουταραλδεΰδη - 0.5% φορµαλδεΰδη σε 0.01Μ PBS, ph 7.4, για 1 h σε Θ. Χρησιµοποιήθηκε το ίδιο είδος µονιµοποιητικού διαλύµατος, όπως και στην προηγούµενη δοκιµή. Όµως, η θερµοκρασία της µονιµοποίησης ήταν στους 22 o C για να µελετηθεί σε αυτές τις συνθήκες, εκτός από τη διατήρηση της αντιγονικότητας του ιστού και η διατήρηση της µορφολογίας των µικροσωληνίσκων, ως συστατικό του κυτταροσκελετού στα νεοπλασµατικά κύτταρα. Οι παραπάνω δοκιµές παρουσιάζονται συνοπτικά στον πίνακα 2.5.

14 ...Υλικό και Μέθοδοι Πίνακας 2.5 οκιµές συνθηκών µονιµοποίησης των βιοψιών µαστού µε σκοπό την τυποποίηση των µεθοδολογιών για µορφολογικές και ανοσοϊσοχηµικές µελέτες Μονιµοποιητικό διάλυµα Χρόνος (h) Θερµοκρασία 1. 3% φορµαλδ. 0.25% γλουτ. σε 0.1Μ PB, ph % φορµαλδ. 0.25% γλουτ. σε 0.1Μ PB, ph % φορµαλδ. 0.5% γλουτ. σε 0.01Μ PBS, ph % φορµαλδ. 0.5% γλουτ. σε 0.01Μ PBS, ph Θ 5. 2% φορµαλδ. 0.5% γλουτ. σε 0.01Μ PBS, ph % γλουτ. σε 0.01Μ PBS, ph % γλουτ. σε 0.01Μ PBS, ph Θ % γλουτ % φορµαλδ. σε 0.01Μ PBS, ph % γλουτ % φορµαλδ. σε 0.01Μ PBS, ph Θ Θ : Θερµοκρασία δωµατίου Γλουτ.: γλουταραλδεΰδη Φορµαλδ.: φορµαλδεΰδη ( o C) Μορφολογική µελέτη του κυτταροσκελετού στο ΗΜ Εφαρµόσθηκαν δύο µεθοδολογίες για τη µελέτη της κατανοµής του κυτταροσκελετού στα νεοπλασµατικά κύτταρα του µαστού: Ανάδειξη του κυτταροσκελετού µε το απορρυπαντικό Triton X-100 (Rosenberg et al., 1981; Franke et al., 1978) Ιστοτεµάχια, τόσο από βιοψίες διηθητικών πορογενών καρκινωµάτων µαστού, όσο και καλοήθων νεοπλασµάτων (ινοαδενώµατα, αλλοιώσεις ινοκυστικού τύπου, αδενώσεις) µονιµοποιήθηκαν α) σε 2.5% γλουταραλδεύδη σε ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού (CB), ph 6.1 (137mM NaCl, 5mM KCl, 1.1mM Na 2 HPO. 4 2H 2 O, 0.4mM KH 2 PO 4, 2mM MgCl 2, 2mM EGTA, 5mM PIPES, 5.5mM Γλυκόζη, βλ. συνταγή στο Παράρτηµα), για 1 h σε Θ για τη διατήρηση των µικροσωληνίσκων, β) σε 2.5% γλουταραλδεύδη σε 0.01Μ PBS, ph 7.4, για 1 h, στους 4 ο C και γ) σε 1% γλουταραλδεύδη σε 0.01Μ PBS, ph 7.4, για 2.5 h, στους 4 ο C. Προκειµένου να αναδειχθούν τα κυτταροσκελετικά στοιχεία του ιστού, έγινε µερική διαλυτοποίηση των συστατικών του κυτοσολίου µε επώαση των ιστοτεµαχίων στο µη-ιονικό απορρυπαντικό

15 ...Υλικό και Μέθοδοι Triton X-100 σε Θ, εκτός από τα ιστοτεµάχια που µονιµοποιήθηκαν µε το τρίτο είδος µονιµοποιητή, όπου έγινε ταυτόχρονη επώασή τους µε το απορρυπαντικό, διαλυτοποιώντας το τελευταίο στο µονιµοποιητικό διάλυµα. οκιµάσθηκαν διάφορες συγκεντρώσεις του απορρυπαντικού, αραιωµένο µε το αντίστοιχο ρυθµιστικό διάλυµα του µονιµοποιητικού διαλύµατος, σε σχέση µε διάφορους χρόνους και θερµοκρασίες επώασης, όπως φαίνεται στον πίνακα 2.6. Πίνακας 2.6 οκιµές συνθηκών επώασης των βιοψιών µαστού µε το µη-ιονικό απορρυπαντικό Triton X-100 για την ανάδειξη των κυτταροσκελετικών στοιχείων των νεοπλασµατικών κυττάρων Μονιµοποιητικό διάλυµα Triton X-100 (%) Χρόνος επώασης (min) Θερµοκρασία % γλουταρ. σε CB, ph Θ % γλουταρ. σε CB, ph Θ % γλουταρ. σε CB, ph Θ % γλουταρ. σε CB, ph Θ % γλουταρ. σε CB, ph Θ % γλουταρ. σε PBS, ph Θ 7. 1% γλουταρ. σε PBS, ph o C Θ : θερµοκρασία δωµατίου CB: ρυθµιστικό διάλυµα κυτταροσκελετού PBS: αλατούχο φωσφορικό διάλυµα Βαφή in toto µε τανικό οξύ (Fujiwara and Linck, 1982; Chaplin, 1985; Hirose et al., 1990) Ιστοτεµάχια, τόσο από βιοψίες διηθητικών πορογενών καρκινωµάτων µαστού, όσο και καλοήθων νεοπλασµάτων (ινοαδενώµατα, αλλοιώσεις ινοκυστικού τύπου, αδενώσεις), µονιµοποιήθηκαν σε 2.5% γλουταραλδεύδη σε ρυθµιστικό διάλυµα κακοδυλικού νατρίου 0.1Μ, ph 7.2, για 1 h στους 4 ο C. Ακολούθησε συµπληρωµατική χρώση των ιστοτεµαχίων µε υδατικό διάλυµα τανικού οξέος για την ενίσχυση της µορφολογίας του κυτταροσκελετού και τελικά επώασή τους µε 1% υδατικό διάλυµα τετροξείδιο του οσµίου (OsO 4 ) για 1 h στους 4 ο C. Ακολούθησε η αφυδάτωση των ιστοτεµαχίων, η εµπότιση, η έγκλειση σε εποξικές ρητίνες, η σκήνωση και τελικά ο πολυµερισµός τους, όπως περιγράφεται παρακάτω στην παράγραφο

16 ...Υλικό και Μέθοδοι Επειδή το τανικό οξύ µεγάλου µοριακού βάρους (C 76 H 52 O 46 ) που χρησιµοποιείται για ιστολογικές χρώσεις ρουτίνας δεν µπορεί να διεισδύσει σε ιστούς που είναι εγκλεισµένοι σε εποξικές ρητίνες, χρησιµοποιήθηκε τανικό οξύ µικρού µοριακού βάρους (C 14 H 10 O 9 ) κατάλληλο για ηλεκτρονική µικροσκοπία, ώστε να είναι δυνατή η διείσδυσή του στα κύτταρα. οκιµάσθηκαν διάφορες συγκεντρώσεις διαλυµάτων τανικού οξέος και χρόνοι επώασης σε Θ, όπως φαίνεται στον πίνακα 2.7. Πίνακας 2.7 οκιµές συνθηκών επώασης των βιοψιών µαστού µε τανικό οξύ µικρού µοριακού βάρους µε σκοπό την ανάδειξη κυτταροσκελετικών στοιχείων των νεοπλασµατικών κυττάρων Τανικό οξύ Χρόνος επώασης Θερµοκρασία (%) (min) min Θ min Θ min Θ 2.5 ΚΡΥΟΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΙΣΤΩΝ ΣΕ ΥΓΡΟ ΑΖΩΤΟ Μικρά ιστοτεµάχια (<0.5cm 2 ) από βιοψίες διηθητικών πορογενών καρκινωµάτων µαστού και ινοαδενωµάτων αποθηκεύονταν σε ατµούς υγρού αζώτου (N 2 ) (θ ~ -170 ο C), προκειµένου να υπάρχει η δυνατότητα επανάληψης των πειραµατικών διαδικασιών και επανελέγχου, αλλά και η δυνατότητα εφαρµογής τυχόν νέων µεθοδολογιών στο ίδιο υλικό. Όπως αναφέρεται αναλυτικά στην παράγραφο 2.3, τα ιστοτεµάχια των βιοψιών που προορίζονταν για αποθήκευση σε ατµούς υγρού Ν 2, έφταναν στο εργαστήριο, το αργότερο µέσα σε 1 h από τη λήψη της βιοψίας, µέσα σε φορητό µονωµένο κουτί που περιείχε παγοκυψέλες. Τα ιστοτεµάχια είχαν ήδη τοποθετηθεί µέσα σε γυάλινο τρυβλίο Petri σε γάζα εµποτισµένη µε φυσιολογικό ορό (NaCl 0.9%), ώστε να διατηρηθεί η φυσική τους κατάσταση. Στο εργαστήριο, ακολουθούσε κρυοµονιµοποίηση των ιστοτεµαχίων, µε σκοπό την καλύτερη διατήρηση της υπερµικροσκοπικής δοµής του ιστού. οκιµάσθηκαν δύο µέθοδοι κρυοµονιµοποίησης, όπως περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω:

17 ...Υλικό και Μέθοδοι Μέθοδος εµβάπτισης του ιστού σε κρυογόνο µέσο Ως κρυογόνο µέσο χρησιµοποιήθηκε το ισοπεντάνιο. Εφαρµόσθηκαν οι εξής µέθοδοι εµβάπτισης του ιστού σε ισοπεντάνιο: 1. το ιστοτεµάχιο αποστραγγιζόταν από την περίσσεια του φυσιολογικού ορού (NaCl 0.9%) µε διηθητικό χαρτί και αµέσως µετά - χωρίς άλλη διαδικασία κρυοπροστασίας - εµβαπτιζόταν σε ισοπεντάνιο που βρισκόταν σε θερµοκρασία κοντά στο σηµείο τήξης του (-160 ο C). Αυτό γινόταν δυνατό µε την τοποθέτηση ποτήρι ζέσεως που περιείχε ισοπεντάνιο σε µεγαλύτερο δοχείο που περιείχε υγρό Ν 2. Το ισοπεντάνιο παρέµενε στο περιβάλλον του υγρού Ν 2 (Σχήµα 2.1α)µέχρι να ψυχθεί και να φτάσει στο σηµείο πήξης του (Σχήµα 2.1β). Αµέσως µετά το ποτήρι ζέσεως µε το στερεοποιηµένο πλέον ισοπεντάνιο έβγαινε από το δοχείο του υγρού Ν 2 (Σχήµα 2.1γ) και όταν το ισοπεντάνιο άρχιζε να υγροποιείται (σηµείο τήξης) βυθιζόταν σε αυτό το ιστοτεµάχιο µέσω µίας µακριάς µεταλλικής λαβίδας (Σχήµα 2.1δ). Σχήµα 2.1 Το κατεψυγµένο ιστοτεµάχιο αποθηκευόταν σε προψυγµένο ειδικό πλαστικό φιαλίδιο (χωρητικότητας ml), στο οποίο αναγράφονταν τα στοιχεία του ιστού. Στη συνέχεια, το φιαλίδιο στηριζόταν σε ειδικούς µεταλλικούς δειγµατοφορείς (Εικ. 2.1), και φυλασσόταν σε ειδικό κάδο φύλαξης ιστών σε ατµούς υγρού Ν 2 (Εικ. 2.2). Με αυτή τη διαδικασία η κρυοµονιµοποίηση του ιστού γινόταν σε θερµοκρασία (-160 o C) που πλησίαζε τη θερµοκρασία φύλαξής του (-170 ο C).

18 ...Υλικό και Μέθοδοι Εικόνα 2.1 Εξαρτήµατα του κάδου φύλαξης ιστών σε υγρό άζωτο (Ν 2 ). 1. Θήκη αποθήκευσης ιστών σε υγρό Ν 2. Σε αυτήν τοποθετούνται οι µεταλλικοί δειγµατοφορείς µε τα ειδικά για χαµηλή θερµοκρασία πλαστικά φιαλίδια που περιέχουν τα κατεψυγµένα ιστοτεµάχια. Στη συνέχεια, η θήκη τοποθετείται στον κάδο υγρού Ν 2 µε ειδική λαβή. 2. Μεταλλικός δειγµατοφορέας. 3. Πλαστικό φιαλίδιο, ειδικό για χαµηλή θερµοκρασία. Εικόνα 2.2 Κάδος φύλαξης ιστών σε υγρό Ν Κάδος µε ειδικά θερµοµονωτικά τοιχώµατα χωρητικότητας περίπου 30lt. Κατά την φύλαξη των ιστών η ποσότητα του αζώτου είναι περίπου 10lt, ώστε τα ιστοτεµάχια να βρίσκονται στους ατµούς του υγρού Ν Λαβές θηκών αποθήκευσης των ιστών. 3. Καπάκι από αφρολέξ που κλείνει, όχι στεγανά, ώστε να ελαχιστοποιούνται οι απώλειες του υγρού Ν 2 που εξατµίζεται συνεχώς. 4. Εξωτερικό καπάκι κάδου. 5. Ειδικός πλαστικός χάρακας µε διαβαθµίσεις για τον έλεγχο του ύψους της στάθµης του υγρού Ν ο χειρισµός του ιστοτεµαχίου γινόταν µε τον ίδιο τρόπο όπως και στην προηγούµενη διαδικασία, εκτός από το γεγονός ότι εµβαπτιζόταν σε ισοπεντάνιο που είχε ήδη προψυχθεί στους 80 ο C. Με αυτόν τον τρόπο η κρυοµονιµοποίηση του ιστού γινόταν σε µεγαλύτερη θερµοκρασία από αυτή της φύλαξης του. 3. πριν την κρυοµονιµοποίηση του ιστοτεµαχίου µε εµβάπτισή του σε ισοπεντάνιο που είχε ήδη προψυχθεί στους 80 ο C, γινόταν κρυοπροστασία του µε εµπότιση στο χηµικό κρυοπροστατευτικό µέσο DMSO (διµεθυλ-σουλφοξείδιο) σε συγκεντρώσεις 5% και 10%. Ακολουθούσε αποθήκευση του ιστοτεµαχίου σε ατµούς υγρού Ν 2, όπως περιγράφεται παραπάνω.

19 ...Υλικό και Μέθοδοι Οι διάφορες συνθήκες κρυοµονιµοποίησης του ιστού που δοκιµάσθηκαν µε εµβάπτισή του σε ισοπεντάνιο παρουσιάζονται συνοπτικά στον πίνακα 2.8. Πίνακας 2.8 οκιµές συνθηκών κρυοµονιµοποίησης των βιοψιών µαστού µε εµβάπτισή του σε ισοπεντάνιο Κρυοπροστατευτικό µέσο Ισοπεντάνιο ( ο C) Αποθήκευση 1. _ -160 ατµούς υγρού Ν 2 2. _ -80 ατµούς υγρού Ν % DMSO -80 ατµούς υγρού Ν % DMSO -80 ατµούς υγρού Ν 2 DMSO: διµεθυλσουλφοξείδιο Ν 2 : άζωτο Μέθοδος επαφής µε µεταλλικό καθρέφτη (metal mirror) (Escaig, 1982; Philips and Boyne, 1984) Αυτή η µέθοδος κρυοµονιµοποίησης είναι η πιο αξιόπιστη γιατί επιτυγχάνεται ακαριαία ψύξη του ιστού (µέσα σε msec), αποφεύγοντας την εµφάνιση µορφολογικών αλλοιώσεων λόγω του σχηµατισµού κρυστάλλων πάγου. Σύµφωνα µε την τεχνική αυτή, το δείγµα πέφτει µε ταχύτητα, κατευθυνόµενο κατακόρυφα, πάνω σε µία στιλπνή µεταλλική πλάκα, η οποία είναι προψυγµένη σε περιβάλλον υγρού Ν 2. Η µεταλλική πλάκα αποτελείται από χαλκό που περιβάλλεται από επιφανειακό στρώµα χρυσού πολύ καλά γυαλισµένο (καθρέφτης) για να µην αφήνει ψευδή αποτυπώµατα στον ιστό. Η κρυοµονιµοποίηση µε επαφή του ιστού σε µεταλλικό καθρέφτη έγινε στο εργαστήριο µε το µηχάνηµα Leica EM CPC (Εικ. 2.3α), το οποίο αποτελείται από α) την κεντρική συσκευή όπου γίνεται η κρυοµονιµοποίηση, β) ένα στερεοσκόπιο, γ) έναν κάδο υγρού Ν 2 χωρητικότητας περίπου 40lt, δ) µία αντλία που µεταφέρει το υγρό Ν 2 από τον κάδο στη συσκευή κρυοµονιµοποίησης και ε) την ηλεκτρονική µονάδα ελέγχου του µηχανήµατος. Η κεντρική συσκευή κρυοµονιµοποίησης αποτελείται από τον θάλαµο κρυοµονιµοποίησης (Εικ. 2.3β) και τον άξονα κρυοµονιµοποίησης, ο οποίος κατευθύνει τον ιστό στον µεταλλικό καθρέφτη. Στην κεντρική συσκευή υπάρχει, επίσης, δυνατότητα ρύθµισης α) του πάχους του ιστού που θα κρυοµονιµοποιηθεί, β) της ταχύτητας πτώσης

20 ...Υλικό και Μέθοδοι του άξονα που φέρει τον ιστό στον µεταλλικό καθρέφτη και γ) της δύναµης πτώσης του άξονα στον µεταλλικό καθρέφτη. Η ρύθµιση της ταχύτητας και της δύναµης πτώσης του άξονα έχει ως σκοπό την πιο γρήγορη απαγωγή της θερµότητας του ιστού από τον µεταλλικό καθρέφτη, χωρίς να προκληθούν τεχνητές αλλοιώσεις της µορφολογίας του ιστού από άσκηση µεγαλύτερης δύναµης από αυτή που αντέχει η υφή του υπό µελέτη ιστού. Εικόνα 2.3α Μηχάνηµα Leica EM CPC, όπου γίνεται κρυοµονιµοποίηση ιστοτεµαχίων µε επαφή µε µεταλλικό καθρέφτη. 1: ψυχόµενος θάλαµος κρυοµονιµοποίησης µε περιστρεφόµενη τράπεζα. 2: άξονας κρυοµονιµοποίησης. Στην άκρη του στηρίζεται ο ιστός, ο οποίος ωθείται προς τον µεταλλικό καθρέφτη µε συγκεκριµένη δύναµη και ταχύτητα. 3: κοµβίο ελευθέρωσης του άξονα κρυοµονιµοποίησης. 4: στερεοµικροσκόπιο παρατήρησης του δείγµατος. 5: κάδος υγρού Ν 2. 6: αντλία υγρού Ν 2. 7: ηλεκτρονική µονάδα ελέγχου του µηχανήµατος, απ όπου ρυθµίζεται η άντληση του υγρού Ν 2 και η θερµοκρασία του θαλάµου κρυοµονιµοποίησης. Επίσης υπάρχουν ενδείξεις για τη στάθµη του υγρού Ν 2 στον κάδο. Εικόνα 2.3β Λεπτοµέρεια του θαλάµου κρυοµονιµοποίησης. 1: περιστρεφόµενη τράπεζα. 2: µεταλλικός καθρέφτης. 3: αισθητήρας θερµοκρασίας του θαλάµου. Μετά από δοκιµές που έγιναν και σύµφωνα µε τους Monaghan και συν (1990), οι παράµετροι που χρησιµοποιήθηκαν για την κρυοµονιµοποίηση βιοψίας του µαστού έχουν ως εξής: πάχος ιστού: 2 (κλίµακα 0-12), ταχύτητα πτώσης άξονα: 5 (κλίµακα 1-11), δύναµη πτώσης άξονα: 5 (κλίµακα 1-11). Πριν την έναρξη της διαδικασίας της κρυοµονιµοποίησης, στον ειδικό υποδοχέα του θαλάµου κρυοµονιµοποίησης της κεντρικής συσκευής τοποθετήθηκαν τα εξαρτήµατα

21 ...Υλικό και Μέθοδοι που είναι απαραίτητα για τον χειρισµό του κρυοµονιµοποιηµένου ιστού, όπως είναι λαβίδα µε θερµοµονωµένα σκέλη και νυστέρι. Επίσης, στην περιστρεφόµενη τράπεζα του θαλάµου τοποθετήθηκαν ο µεταλλικός καθρέφτης και δύο ειδικά δισκία, πάνω στα οποία τεµαχίζεται ο παγωµένος ιστός µετά την κρυοµονιµοποίηση. Στη συνέχεια, ο θάλαµος κρυοµονιµοποίησης ψύχθηκε στους 194 ο C περίπου, µε την άντληση υγρού Ν 2 από τον κάδο. Ιδιαίτερη προσοχή δίνεται στην αποφυγή τεχνικών αλλοιώσεων που µπορούν να προκληθούν από την ξήρανση του ιστού κατά τους χειρισµούς του πριν την κρυοµονιµοποίηση. Γι αυτόν το λόγο όλοι οι χειρισµοί γίνονται σε θάλαµο διατήρησης της υγρασίας του ιστού. Αντιθέτως, η περίσσεια υγρού γύρω από τον ιστό αποµακρύνεται µε διηθητικό χαρτί γιατί θα προκαλέσει τον σχηµατισµό πάγου κατά την κρυοµονιµοποίηση του. ιαδικασία 1. Ο ιστός κόβεται σε τοµές πάχους mm µε ειδικό µακροτόµο (Σχήµα 2.2). 2. Η τοµή τοποθετείται µε ειδική λαβίδα µε θερµοµονωµένα στελέχη, στον υποδοχέα του δείγµατος, που αποτελείται από αφρολέξ στηριγµένο σε µεταλλική βάση (Σχήµα 2.3). 3. Ο υποδοχέας του δείγµατος τοποθετείται στο µηχάνηµα µε τη µεταλλική του πλευρά να ακουµπάει στον µαγνήτη που βρίσκεται στην άκρη του άξονα κρυοµονιµοποίησης. 4. Ο άξονας ελευθερώνεται και ο ιστός έρχεται σε επαφή µε τον παγωµένο (-194 ο C) µεταλλικό καθρέφτη. Αφού ο ιστός παραµείνει σε επαφή µε τον µεταλλικό καθρέφτη για τουλάχιστον 1 min, αποµακρύνεται από αυτόν. Η καλά κατεψυγµένη περιοχή του ιστού, όπου δεν υπάρχουν µορφολογικές αλλοιώσεις από την δηµιουργία κρυστάλλων πάγου, είναι από την πλευρά του ιστού που έρχεται σε επαφή µε τον µεταλλικό καθρέφτη και έχει πάχος µm (από την επιφάνεια προς το εσωτερικό του ιστού). 5. Ο ιστός αποµακρύνεται από τον υποδοχέα πιέζοντας ήπια το παγωµένο πλέον αφρολέξ γύρω από τον ιστό και ελέγχεται κάτω από το στερεοσκόπιο αν έχει κρυοµονιµοποιηθεί σωστά. Κριτήριο της επιτυχούς κρυοµονιµοποίησης είναι η εµφάνιση στα όρια του ιστού µίας διαυγούς ζώνης, η οποία αντιπροσωπεύει τον σχηµατισµό του υαλώδους πάγου. Στη συνέχεια ο ιστός κόβεται µέσα στο θάλαµο

22 ...Υλικό και Μέθοδοι κρυοµονιµοποίησης (θερµοκρασία -194 ο C) µε νυστέρι, του οποίου η λεπίδα έχει προψυχθεί στο υγρό N 2, σε µικρότερα τεµάχια mm Τα ιστοτεµάχια αποθηκεύονται σε ειδικά προψυγµένα φιαλίδια, χωρητικότητας 1ml, στα οποία αναγράφονται τα στοιχεία του ιστού και φυλάσσονται στον κάδο φύλαξης/αποθήκευσης των ιστών σε ατµούς υγρού Ν 2. Σχήµα 2.2 Σχηµατική απεικόνηση του µακροτόµου για το µηχάνηµα Leica EM CPC για τη λήψη τοµών ιστού πάχους 0.5mm ή 1mm. Ο ιστός (1) τοποθετείται σε µία µικρή στρογγυλή τράπεζα (2) που βρίσκεται στο κέντρο της βάσης του µακροτόµου (3). Στη συνέχεια, πάνω στον ιστό τοποθετείται το καπάκι του µακροτόµου (4), το οποίο σταθεροποιείται στη βάση µε τις βίδες (τόξα). Η τοποθέτηση ενός µικρού δίσκου (5) στο κέντρο του καπακιού δίνει τοµές ιστού πάχους 0.5mm, ενώ αν δεν τοποθετηθεί οι τοµές έχουν πάχος 1mm. Σχήµα 2.3 Σχηµατική απεικόνηση του υποδοχέα του δείγµατος για το µηχάνηµα Leica EM CPC. Αποτελείται από αφρολέξ (1) συγκεκριµένου ύψους ( ) που είναι κολληµένο σε µεταλλική βάση (2). Πάνω στο αφρολέξ τοποθετείται η τοµή του ιστοτεµαχίου (3) που έχει ληφθεί µε τον µακροτόµο. 2.6 ΕΓΚΛΕΙΣΕΙΣ Έγκλειση σε παραφίνη ιαδικασία Α) Μονιµοποίηση Το υλικό της βιοψίας (µέγεθος ~0.5-1cm 3 ) µονιµοποιείται σε διάλυµα 3% φορµαλδεΰδη % γλουταραλδεΰδη σε 0.1Μ PB, ph 7.4, για h στους 4 ο C. Στη συνέχεια γίνεται έκπλυση του ιστού µε 0.1Μ PB (3x5min).

23 ...Υλικό και Μέθοδοι Β) Αφυδάτωση Όλα τα βήµατα της αφυδάτωσης γίνονται σε Θ (22 ο C). 1. Αιθυλική αλκοόλη 50%, για 30min. 2. Αιθυλική αλκοόλη 75%, για 50min. 3. Αιθυλική αλκοόλη 95%, για 50min. 4. Αιθυλική αλκοόλη 100% (άνυδρη), 3x30min. 5. Ξυλόλη 100%, 3x30min. Γ) Εµπότιση Όλα τα βήµατα της εµπότισης γίνονται σε κλίβανο στους 58 ο C. Η παραφίνη, που σε αυτή τη θερµοκρασία είναι ρευστή, είναι διπλά φιλτραρισµένη µέσα από διηθητικό χαρτί, για την αποµάκρυνση τυχόν ξένων σωµατιδίων. 1. Ξυλόλη 100% : παραφίνη = 1 : 1, για 30min. 2. καθαρή παραφίνη, για 6 h. 3. καθαρή παραφίνη, για h. ) Σκήνωση Φρέσκια ρευστή παραφίνη τοποθετείται σε πλαστικό εκµαγείο και τοποθετείται µέσα σε αυτή ο ιστός, ο οποίος προσανατολίζεται κατάλληλα. Στη συνέχεια, η όλη διάταξη αφήνεται σε θερµοκρασία δωµατίου, ώστε να πήξει η παραφίνη Έγκλειση σε µίγµα εποξικών ρητινών Epon/Araldite (Pickel et al., 1976) ιαδικασία Α) Μονιµοποίηση 1 η µονιµοποίηση: τα ιστοτεµάχια των βιοψιών (µέγεθος ~1-2 mm 3 ) µονιµοποιούνται σε διάλυµα 2.5% γλουταραλδεΰδης σε 0.01Μ PBS, ph 7.4, για 1 h στους 4 ο C. Ακολουθεί έκπλυση µε 0.01Μ PBS, ph 7.4, στους 4 ο C, 3x10 min. 2 η µονιµοποίηση: σε υδατικό διάλυµα 1% OsO 4 για 1 h στους 4 ο C (για συνταγή βλ. Παράρτηµα). Ακολουθεί έκπλυση µε 0.01Μ PBS, ph 7.4, στους 4 ο C, 3x10 min. Β) Αφυδάτωση Όλα τα βήµατα της αφυδάτωσης γίνονται σε Θ, µε διαδοχική χρήση διαλυµάτων αιθυλικής αλκοόλης αυξανόµενης συγκέντρωσης όπως περιγράφεται παρακάτω: 1. Αιθυλική αλκοόλη 30%, για 7min. 2. Αιθυλική αλκοόλη 50%, για 7min. 3. Αιθυλική αλκοόλη 70%, για 7min.

24 ...Υλικό και Μέθοδοι Αιθυλική αλκοόλη 90%, για 7min. 5. Αιθυλική αλκοόλη 100% (άνυδρη), 3x10 min. Γ) Εµπότιση Όλα τα βήµατα γίνονται σε Θ. Επειδή οι εποξικές ρητίνες έχουν µεγάλο ιξώδες γίνεται σταδιακή εµπότιση των ιστοτεµαχίων, αρχικά µε οξείδιο του προπυλενίου (P.O.) και στη συνέχεια µε µίγµα εποξικών ρητινών (για συνταγή βλ. Παράρτηµα) / Ρ.Ο. σε διαλύµατα αυξανόµενης συγκέντρωσης ως προς τις ρητίνες, όπως περιγράφεται παρακάτω: 1. Ρ.Ο. 100%, 3x5 min. 2. Μίγµα εποξικών ρητινών Epon/Araldite: Ρ.Ο. = 1:3 για 15min. 3. Μίγµα εποξικών ρητινών Epon/Araldite: Ρ.Ο. = 1:1 για 30min. 4. Μίγµα εποξικών ρητινών Epon/Araldite: Ρ.Ο. = 3:1 για 1h. 5. Καθαρό µίγµα εποξικών ρητινών Epon/Araldite, 3x10min. Τα βήµατα 2-5 γίνονται µε περιστροφή των γυάλινων φιαλιδίων, που περιέχουν τα ιστοτεµάχια, σε ειδική συσκευή περιστροφής, µε συχνότητα 10 στροφές/min, ώστε να εξασφαλισθεί η πιο ταχεία, οµοιόµορφη και αποτελεσµατική εµπότιση του µίγµατος των εποξικών ρητινών, καθώς αυξάνει η αναλογία τους σε σχέση µε αυτή του Ρ.Ο. ) Σκήνωση Πολυµερισµός Τα ιστοτεµάχια τοποθετούνται µε τη βοήθεια βελόνας ανατοµίας σε επίπεδα ελαστικά εκµαγεία πολλαπλής χρήσεως, και προσανατολίζονται κατάλληλα. Στη συνέχεια, τα εκµαγεία τοποθετούνται σε κλίβανο στους 60 ο C και το µίγµα των εποξικών ρητινών αφήνεται να πολυµερισθεί για 24h Έγκλειση σε ακρυλική ρητίνη Lowicryl HM20 Μέθοδος βαθµιαίας µείωσης της θερµοκρασίας (PLT - Progressive Lowering of Temperature) (Robertson et al., 1992) Σύµφωνα µε τη µέθοδο PLT, γίνεται αρχικά χηµική µονιµοποίηση του ιστού µε αλδεΰδες στους 0-4 ο C, και στη συνέχεια γίνεται αφυδάτωση µε βαθµιαία µείωση της θερµοκρασίας από 0 ο C στους 50 ο C µε άνυδρη αιθυλική αλκοόλη. Ακολουθεί η εµπότιση, η σκήνωση και ο πολυµερισµός του ιστού στους 50 ο C. Η όλη επεξεργασία του ιστού σε αυτές τις χαµηλές θερµοκρασίες γίνεται στο θάλαµο εργασίας του µηχανήµατος Leica ΕΜ AFS, η θερµοκρασία του οποίου ρυθµίζεται σε κάθε βήµα µε

25 ...Υλικό και Μέθοδοι κατάλληλο προγραµµατισµό της ηλεκτρονικής µονάδας ελέγχου του µηχανήµατος (Εικ. 2.4α). Εικόνα 2.4α Μηχάνηµα Leica EM AFS. 1. Κάδος υγρού αζώτου µε ειδικά θερµοµονωτικά τοιχώµατα, χωρητικότητας περίπου 40lt. 2. Σωλήνας διαφυγής ατµών υγρού αζώτου. 3. Τράπεζα εργασίας προσαρµοσµένη στον κάδο. 4. Ειδικός θάλαµος για την επεξεργασία του υλικού σε χαµηλή θερµοκρασία. Ο χώρος του αποµονώνεται από το εξωτερικό περιβάλλον µε ένα εσωτερικό γυάλινο καπάκι (δεν φαίνεται στην εικόνα) που ανεβοκατεβαίνει µέσω του εµβόλου (5) και ένα εξωτερικό γυάλινο καπάκι που είναι σταθερό στο έµβολο. 6. Μονάδα λειτουργικού ελέγχου του µηχανήµατος, µε την οποία γίνεται η καταχώρηση των προγραµµάτων για τη ρύθµιση της θρµοκρασίας του θαλάµου σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα. Επίσης υπάρχουν ενδείξεις για την τρέχουσα θερµοκρασία του θαλάµου, του χρόνου που αποµένει για την ολοκλήρωση του προγράµµατος, για τη στάθµη του υγρού αζώτου στον κάδο, και για την σωστή λειτουργία της λάµπας UV, όταν είναι προσαρµοσµένη στον θάλαµο (δεν φαίνεται στην εικόνα). Λεπτοµερέστερα, η διαδικασία επεξεργασίας του ιστού σύµφωνα µε τη µέθοδο PLT περιγράφεται παρακάτω: ιαδικασία A) Μονιµοποίηση Τα ιστοτεµάχια των βιοψιών (µέγεθος ~0.5-1mm 3 ) µονιµοποιούνται σε διάλυµα 2.5% γλουταραλδεΰδης σε 0,01Μ PBS, ph 7.4, για 1h στους 4 ο C. Ακολουθεί έκπλυση µε 0.01Μ PBS, ph 7.4, στους 4 ο C, 3x10 min. Στη συνέχεια, τα ιστοτεµάχια µεταφέρονται σε

26 ...Υλικό και Μέθοδοι πλαστικές κάψουλες, οι οποίες έχουν πλέγµα στον πυθµένα και βρίσκονται ήδη σε ειδικά δοχεία αλουµινίου µε PBS (Σχήµα 2.4). Σχήµα 2.4 Σχηµατική απεικόνηση των εξαρτηµάτων για την επεξεργασία ιστοτεµαχίων σε χαµηλή θερµοκρασία κατά τη µέθοδο PLT. 1. πλαστικές κάψουλες µε πλέγµα στον πάτο. 2. δοχείο αλουµινίου. B) Αφυδάτωση Η αφυδάτωση των ιστοτεµαχίων γίνεται µε διαδοχική χρήση διαλυµάτων αιθυλικής αλκοόλης αυξανόµενης συγκέντρωσης, ενώ παράλληλα σε κάθε βήµα αφυδάτωσης γίνεται βαθµιαία µείωση της θερµοκρασίας µε ρυθµό 5 ο C/h. 1. Aιθυλική αλκοόλη 30%, για 30min στους 0 ο C. 2. Aιθυλική αλκοόλη 50%, για 30min στους -10 ο C. 3. Aιθυλική αλκοόλη 70%, για 30min στους -25 ο C. 4. Aιθυλική αλκοόλη 100% (άνυδρη), για 30min στους -40 ο C. 5. Αιθυλική αλκοόλη 100% (άνυδρη), για 30min στους -50 ο C. Παρατήρηση: η αιθυλική αλκοόλη που χρησιµοποιείται βρίσκεται στο προσροφητικό µέσο Molecular Sieve 0.3nm τουλάχιστον για 24 h πριν τη χρήση της. Γ) Εµπότιση Όλα τα βήµατα γίνονται στους -50 ο C. Λόγω αυτής της χαµηλής θερµοκρασίας, η εµπότιση γίνεται σταδιακά µε διαλύµατα ρητίνης Lowicryl HM20 (για συνταγή βλ. Παράρτηµα) /άνυδρης αιθυλικής αλκοόλης, σε αυξανόµενη αναλογία ως προς τη ρητίνη, όπως περιγράφεται παρακάτω: 1. Ρητίνη Lowicryl HM20 : αιθυλική αλκοόλη 100% = 1:3 για 1h. 2. Ρητίνη Lowicryl HM20 : αιθυλική αλκοόλη 100% = 1:1 για 1h. 3. Ρητίνη Lowicryl HM20 : αιθυλική αλκοόλη 100% = 3:1 για 1h. 4. Καθαρή ρητίνη Lowicryl HM20 για 1h. 5. Καθαρή ρητίνη Lowicryl HM20 για 20 24h.

27 ...Υλικό και Μέθοδοι ) Σκήνωση Πολυµερισµός Τα ιστοτεµάχια µεταφέρονται από τις πλαστικές κάψουλες - µε το πλέγµα στον πυθµένα - σε κάψουλες Leica, έτσι ώστε κάθε µία να έχει ένα ιστοτεµάχιο. Πριν γίνει η µεταφορά, οι κάψουλες Leica έχουν ήδη τοποθετηθεί σε ειδικό µεταλλικό υποδοχέα µε καθαρή ρητίνη Lowicryl HM20. Στην συνέχεια, αυτές οι κάψουλες µεταφέρονται και εισάγονται µε κατάλληλο εξάρτηµα σε κάψουλες ζελατίνης, που είναι ήδη γεµάτες µε καθαρή ρητίνη. Η όλη διάταξη (κάψουλες ζελατίνης και κάψουλες Leica) µεταφέρεται τελικά σε ειδικό δοχείο στήριξης, το οποίο περιέχει 15ml άνυδρη αιθυλική αλκοόλη (Σχήµα 2.5). Σχήµα 2.5 Σχηµατική απεικόνηση των εξαρτηµάτων για τη σκήνωση ιστοτεµαχίων σε κάψουλες Leica µε τη µέθοδο PLT. 1. πλαστικές κάψουλες Leica. 2. κάψουλες ζελατίνης µεγέθους Εξάρτηµα µέσω του οποίου εισάγεται και εξάγεται διάλυµα από το δοχείο-υποδοχέα για τις κάψουλες Leica. 4. δοχείο-υποδοχέας για τις κάψουλες Leica. 5. εξάρτηµα µεταφοράς της τελικής διάταξης των καψουλών Leica. 6. κρυο-χειριστής µε Μ4 σπείρωµα. 7. δοχείο-υποδοχέας για τις κάψουλες ζελατίνης. 8. ειδική λαβίδα µε θερµοµονωµένα σκέλη. 9. εξάρτηµα στήριξης της τελικής διάταξης των καψουλών Leica. Όταν ολοκληρωθεί η διαδικασία της σκήνωσης στο θάλαµο εργασίας του µηχανήµατος προσαρµόζεται πάνω σε αυτόν η συσκευή που φέρει τη λάµπα UV (ισχύς: 6W, µήκος κύµατος: 350nm) για να γίνει ο πολυµερισµός της ρητίνης Lowicryl HM20 (Εικόνα 2.4β). Ο πολυµερισµός γίνεται αρχικά στους 50 ο C για 48 h και ολοκληρώνεται στους 0 ο C για 24 h. Ο ρυθµός αύξησης της θερµοκρασίας από τους 50 ο C στους 0 ο C είναι 5 ο C/h.

28 ...Υλικό και Μέθοδοι Εικόνα 2.4β Συσκευή της λάµπας UV (1) προσαρµοσµένη στον θάλαµο επεξεργασίας του ιστού σε χαµηλή θερµοκρασία. Στην συσκευή υπάρχουν µεταλλικοί ανακλαστήρες έτσι ώστε κατά την διάρκεια του πολυµερισµού, η ακρυλική ρητίνη Lowicryl HM20 να εκτίθεται έµµεσα στο υπεριώδες φως. Όταν η λάµπα µετακινηθεί κατά τη λειτουργία της από τη θέση της σβήνει αµέσως για να αποφευχθεί τυχόν έκθεση του προσωπικού στην υπεριώση ακτινοβολία, ενώ παράλληλα υπάρχει και ηχητική ειδοποίηση Έγκλειση στην ακρυλική ρητίνη Lowicryl K4M. Μέθοδος ταχείας έγκλεισης για ανοσοϊστοχηµεία στο ΗΜ (τροποποίηση της µεθόδου Altman et. al, 1984) ιαδικασία Οι βιοψίες που χρησιµοποιήθηκαν γι αυτήν τη διαδικασία, µετά τη χειρουργική τους αφαίρεση, τυλίχθηκαν µε προσοχή σε αλουµινόχαρτο και καταψύχθηκαν άµεσα στους - 80 ο C, χωρίς να έχει προηγηθεί κρυοπροστασία µε κάποιο µέσο. Όταν επρόκειτο να χρησιµοποιηθούν αποψύχονταν, παραµένοντας τυλιγµένες στο αλουµινόχαρτο µέχρι να έρθουν σε θερµοκρασία δωµατίου. Α) Μονιµοποίηση Τα ιστοτεµάχια των βιοψιών (µέγεθος ~0.5-1mm 3 ) µονιµοποιούνται σε διάλυµα 3% φορµαλδεΰδης % γλουταραλδεύδης σε 0.1Μ PB, ph 7.4, για 3 h στους 4 ο C. Η φορµαλδεΰδη που χρησιµοποιείται προέρχεται από αποπολυµερισµό παραφορµαλδεΰδης υψηλής καθαρότητας. Ακολουθεί έκπλυση του ιστού µε 0.1Μ PB, ph 7.4, στους 4 ο C, 3x5 min. Β) Αφυδάτωση Όλα τα βήµατα της αφυδάτωσης γίνονται στους 4 ο C, µε διαδοχική χρήση υδατικών διαλυµάτων διµεθυλφορµαµιδίου (DMF) αυξανόµενης συγκέντρωσης, όπως περιγράφεται παρακάτω: 1. DMF 50%, για 10min. 2. DMF 75%, για 10min.

29 ...Υλικό και Μέθοδοι DMF 90%, για 10min. Γ) Εµπότιση Όλα τα βήµατα γίνονται στους 4 ο C. Λόγω της χαµηλής θερµοκρασίας, η εµπότιση γίνεται σταδιακά µε διαλύµατα ρητίνης Lowicryl Κ4Μ (για συνταγή βλ. Παράρτηµα) / DMF 90%, σε αυξανόµενη αναλογία ως προς τη ρητίνη, όπως περιγράφεται παρακάτω: 1. Ρητίνη Lowicryl Κ4Μ : DMF 90% = 1:2 για 1h. 2. Ρητίνη Lowicryl Κ4Μ : DMF 90% = 1:1 για 1h. 3. Ρητίνη Lowicryl Κ4Μ : DMF 90% = 2:1 για 1h. 4. Καθαρή ρητίνη Lowicryl Κ4Μ για 1h. 5. Καθαρή ρητίνη Lowicryl Κ4Μ για 20-24h. Πριν τη σκήνωση γίνεται µία επιπλέον αλλαγή της ρητίνης για 1h. ) Σκήνωση Πολυµερισµός Τα ιστοτεµάχια τοποθετούνται στις κάψουλες ζελατίνης και στη συνέχεια η κάθε κάψουλα τοποθετείται στον αντίστοιχο υποδοχέα στη συσκευή πολυµερισµού, η οποία έχει κατασκευασθεί σύµφωνα µε οδηγίες και σχέδιο που δόθηκαν από το Εργαστήριο Βοτανικής, Τµήµα Βιολογίας, Παν/µιο Αθηνών (Εικ. 2.5). Τελικά, ο πολυµερισµός της ρητίνης γίνεται µε την τοποθέτηση της συσκευής πολυµερισµού, η οποία φέρει δύο λάµπες UV (ισχύς:, µήκος κύµατος: 350nm), σε καταψύκτη στους 30 ο C για 48h. Εικόνα 2.5 Συσκευή πολυµερισµού της ακρυλικής ρητίνης Lowicryl K4M. Αποτελείται από ένα κουτί (1), του οποίου το καπάκι φέρει δύο λάµπες UV (2) για τον πολυµερισµό της ρητίνης, και έναν υποδοχέα στήριξης των παρασκευασµάτων (3), ο οποίος είναι καλυµµένος µε αλουµινόχαρτο για να διαχέεται το υπεριώδες φως και να µην γίνεται άµεση έκθεση των παρασκευασµάτων της ακρυλικής ρητίνης σε αυτό. Η συσκευή είναι ιδιοκατασκευή σύµφωνα µε τις οδηγίες και το σχέδιο που δόθηκαν από το Εργαστήριο Βοτανικής, Τµήµα Βιολογίας, Παν/µιο Αθηνών.

30 ...Υλικό και Μέθοδοι ΤΟΜΕΣ Τοµές φωτονικής µικροσκοπίας Τοµές ιστού εγκλεισµένου σε παραφίνη Χρησιµοποιήθηκε η µικροτόµος παραφίνης τύπου American Optical. Οι τοµές είχαν πάχος 5-7 µm. Αφού κoβόταν µία λωρίδα σειριακών τοµών παραφίνης (~6 τοµές), γινόταν µεταφορά της στην επιφάνεια απεσταγµένου νερού θερµοκρασίας 45 ο C σε υδατόλουτρο, ώστε µε την επίδραση της θερµότητας οι τοµές παραφίνης, οι οποίες έχουν συµπιεσθεί κατά το κόψιµο, να επανέλθουν στις κανονικές τους διαστάσεις. Στη συνέχεια γινόταν µεταφορά των τοµών σε αντικειµενοφόρες πλάκες (76 x 26mm), οι οποίες ήταν ήδη καλυµµένες µε poly-l-λυσίνη (# P8920, Sigma, USA) (βλ. διαδικασία παρακάτω), ώστε να αποφευχθεί η αποκόλληση τους κατά τη διάρκεια των ιστοχηµικών ή ανοσοϊστοχηµικών µεθόδων που θα ακολουθούσαν. Οι αντικειµενοφόρες πλάκες µε τις τοµές στέγνωναν σε κλίβανο, παρουσία του αφυγραντικού µέσου Silica Gel, στους 37 ο C µέχρι την επόµενη µέρα. Κάλυψη αντικειµενοφόρων πλακών µε poly-l-λυσίνη Αντικειµενοφόρες πλάκες (76 x 26mm) (Mattrand, Germany), προπλυµένες από τον κατασκευαστή, εµβαπτίζονταν σε υδατικό διάλυµα 10% poly-l-λυσίνης για 5min και στη συνέχεια στέγνωναν στον αέρα για 24 h. Ηµίλεπτες τοµές ιστού εγκλεισµένου σε εποξικές και ακρυλικές ρητίνες Χρησιµοποιήθηκαν οι υπερµικροτόµοι LKB III και Leica Ultracut R. Οι τοµές είχαν πάχος 1µm, και κόβονταν µε γυάλινο µαχαίρι ακµής 6.4 mm (#840031, Leica). Οι τοµές κατά την κοπή τους επέπλεαν και συλλέγονταν από την επιφάνεια απεσταγµένου νερού που βρίσκονταν σε κατάλληλα διαµορφωµένο «βαρκάκι» προσαρµοσµένο στο γυάλινο µαχαίρι. Τελικά, οι τοµές µεταφέρονταν από την επιφάνεια του απεσταγµένου νερού µε τη βοήθεια συρµάτινης θηλειάς, πάνω σε σταγόνες απεσταγµένου νερού που ήταν ήδη σε αντικειµενοφόρες πλάκες καλυµµένες µε διάλυµα poly-l-λυσίνης. Το στέγνωµα των τοµών γινόταν σε θερµαινόµενη πλάκα στους 50 ο C για 5-7min. Χρώση ηµίλεπτων τοµών Για την µορφολογική εξέταση του ιστού, οι ηµίλεπτες τοµές τόσο των εποξικών, όσο και των ακρυλικών ρητινών, βάφονταν µε υδατικό διάλυµα 1% κυανό της τολουιδίνης