ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΓΕΝ.ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ ΟΜΑΔΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΑΡΧΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ & ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 3 Η ΗΜΕΡΙΔΑ ΣΑΒΒΑΤΟ 8 ΜΑΪΟΥ 2010 Ανδρέας Σκορίλας: Αναπλ. Καθηγητής, Τομέας Βιοχημείας & Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Αυγέρης Μαργαρίτης, Επιστημονικός Συνεργάτης, Τομέας Βιοχημείας & Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Κεντρικό δόγμα: Αντιγραφή Μεταγραφή Μετάφραση DNA RNA Πρωτεΐνες Επιγενετικές τροποποιήσεις 1. Μεθυλίωση CpG νησίδων Μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις 1. Προσθήκη καλύμματος στο 5 άκρο 2. Πολυαδενυλίωση του 3 άκρου 3. Μάτισμα Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις
ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ 1. Ακυλίωση, acetylation, formylation, lipoylation, meristoylation, palmitoylation 2. Αλκυλίωση, methylation, isoprenylation 3. Προσθήκη αμινοξέων, π.χ. polyglutamilation & polyglycylation of tubulin 4. Καρβοξυλίωση, π.χ. παραγόντων πήξης αίματος 5. Γλυκοζυλίωση, για την δημιουργία των γλυκοπρωτεϊνών 6. Πρόσδεση αίμης σε σφαιρίνες 7. Υδροξυλίωση, π.χ. κολλαγόνο 8. Ιωδίωση, π.χ. θυροειδικές ορμόνες 9. Προσθήκη νουκλεοτιδίων, αδενυλίωση, ADP-ριβοζυλίωση 10. Οξείδωση
ΜΕΤΑ-ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ 11. Φωσφορυλίωση 12. Δημιουργία πυρογλουταμικού 13. Προσθήκη θειϊκών ομάδων, π.χ. πρωτεογλυκάνες & γλυκοπρωτεΐνες 14. Τροποποίηση αμινοξέων, Arg to citrulline, Gln to Glu, Asn to Asp 15. Ανάπτυξη δισουλφιδικών δεσμών 16. Πρωτεόλυση 17. Προσθήκη ουμπικιτίνης
ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Καλείται η προσθήκη φωσφορικών ριζών (PO 3 2- )σε αμινοξικά ή υδατανθρακικά κατάλοιπα των πρωτεϊνών, μέσω της ανάπτυξης φωσφοεστερικών δεσμών. ΚΙΝΑΣΕΣ Κινάσες Τυροσίνης Κινάσες Σερίνης - Θρεονίνης Προκαλεί την αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσης των πρωτεϊνών με αποτέλεσμα: 1. Τροποποίηση (ενεργοποίηση ή καταστολή) της λειτουργικής τους δράσης 2. Ενδοκυτταρική στόχευση (Πρωτεΐνες λυσοσσώματος) 3. Δομική αναδιάταξη (Πυρηνικές λαμίνες)
ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΛΥΣΟΣΣΩΜΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Η διαλογή των λυσοσωμικών ενζύμων πραγματοποιείται μέσω της φωσφορυλίωσης καταλοίπων μαννόζης 1. Τα λυσοσωμικά ένζυμα συνθέτονται από ριβοσώματα του ΚΕΔ και απελευθερώνονται στον αυλό αυτού. 2. Εντός του ΚΕΔ μια ολιγοσακχαρύλο-τρανσφεράση προσθέτει 8 μαννόζες & 2 Ν-ακέτυλογλυκοζαμίνες σε ένα ασπαραγινικό κατάλοιπο 3. Στις δεξαμενές Golgi, τα λυσοσωμικά ένζυμα φωσφορυλιώνονται σε κατάλοιπα μαννόζης 4. Αναγνώριση της 6-P-μαννόζης από τον υποδοχέα της 6-P-μαννόζης(MPR) 5. Πακετάρισμα σε κυστίδια που κατευθύνονται στο λυσόσωμα
ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΛΑΜΙΝΩΝ Οι λαμίνες είναι πρωτεϊνικά μόρια Μ.Β. 65-75 Kda, οι οποίες αποτελούν το βασικό συστατικό του ελάσματος του πυρηνοπλάσματος. Με την βοήθεια εναλλακτικού ματίσματος, τα τρία LMNA, LMNB1 & LMNB2 γονίδια των λαμινών κωδικοποιούν 7 διαφορετικές πρωτεϊνικές ισομορφές. Φωσφορυλίωση λαμινών σε κατάλοιπα Ser ΜΕΣΟΦΑΣΗ Επανασχηματισμός δικτύου πυρηνικών λαμινών ΜΙΤΩΣΗ Αποσυγκρότηση δικτύου πυρηνικών λαμινών Αποφωσφορυλίωση λαμινών
ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ & ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ Μεταγωγή σήματος: Κυτταρικές διεργασίες με την βοήθεια των οποίων ένα φυσικό ή χημικό ερέθισμα επάγει επιλεκτικά συγκεκριμένες κυτταρικές λειτουργίες Τα κυριότερα βιολογικά σήματα των ανώτερων οργανισμών περιλαμβάνουν: 1. Στεροειδείς ορμόνες 2. Αυξητικούς παράγοντες 3. Κυτταροκίνες 4. Πεπτιδικές ορμόνες 5. Νευροδιαβιβαστές 6. Νευροπεπτίδια & Νευροορμόνες 7. Μικρά μόρια (ασβέστιο, μονοξείδιο αζώτου κ.α.)
ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ & ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ Διαμεμβρανικοί υποδοχείς κινάσης Tyr (Αυξητικοί παράγοντες, Κυτταροκίνες) Παρουσία του προσδέτη (π.χ. EGF) προκαλείται ομοδιμερισμός των υποδοχέων και ενεργοποίηση τους με αποτέλεσμα την αυτοφωσφορυλίωσή τους Η φωσφορυλίωση προκαλεί τροποποίησην της στερεοδομή τους και έκθεση θέσεων πρόσδεσης για πλήθως ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών
ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ & ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ Πορεία RTK Ras MAPK 1. Πρόσδεση της Grb2 2. Πρόσδεση& ενεργοποίηση της Sos 3. Πρόσδεση & ενεργοποίηση της Ras (Ras-GTP) 4. Φωσφορυλίωση & ενεργοποίηση της Raf κινάσης 5. Φωσφορυλίωση & ενεργοποίηση των ΜΕΚ κινασών 6. Φωσφορυλίωση & ενεργοποίηση των ERK κινασών 7. Μετακίνηση των ERK κινασών στον πυρήνα 8. Φωσφορυλίωση μεταγραφικών παραγόντων 9. Μεταγραφική ρύθμιση
ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ & ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ Πορεία τριφωσφορικής ινοσιτόλης (IP 3 ) Ο ενεργοποιημένος Ras-GTP προκαλεί επίσης: 1. Ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C (PLC-γ) 2. Η PLC-γ υδρολύει την 4,5-διφωσφορικήφωσφατιδυλο-ινοσιτόλη (P 1 P 2 ) σε IP 3 και διάκυλογλυκερόλη (DAG). 3. H IP 3 ενεργοποιεί κανάλια Ca 2+ στο ΕΔ 4. Η DAG ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση C (PKC) η οποία φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την αντλία Na + -H + 5. Η συγκέντρωση Ca 2+ & H + επηρεάζει τους μηχανισμούς αντιγραφής, μεταγραφής μετάφρασης
ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ & ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ Πορεία JAK STAT (Διαφοροποίηση ερυθρών αιμοσφαιρίων, ενεργοποίηση γονιδίου καζεΐνης για παραγωγή γάλακτος) 1. Παρουσία του παράγοντα διαφοροποίησης προκαλείται ομοδιμερισμός των υποδοχέων. 2. Ο διμερισμός τους προκαλεί την ενεργοποίηση των JAK κινασών που προσδένουν και την φωσφορυλίωση STAT μεταγραφικών παραγόντων 3. Οι φωσφορυλιωμένοι STAT παράγοντες διμερίζονται και εισέρχονται στον κυτταρικό πυρήνα όπου και ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση.
ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗ ΙΣΤΟΝΩΝ ΠΥΡΗΝΑΣ Πυρηνόπλασµα Χρωµατίνη Πυρηνίσκος Χρωµοσωµικό DNA Πρωτεΐνες hnrna Ιστόνες Η1, Η 2 Α, Η 2 Β, Η3, Η4 Μη ιστόνες
ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗ ΙΣΤΟΝΩΝ Ο βαθμός συμπήκνωσης της χρωματίνης (ευχρωματίνη / ετεροχρωματίνη) ελέγχεται από την ακετυλίωση καταλοίπων λυσίνης του ΝΗ 2 -άκρου των ιστονών ΗΑΤ: ακετυλοτρανσφεράση ιστονών HDAC: αποακετυλάσες ιστονών Η ακετυλίωση των ιστονών από τις HAT προκαλεί την εξουδετέρωση του θετικού φορτίου του αμινοτελικού άκρου των ιστονών και την εξασθένηση των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων με το αρνητικά φορετισμένο DNA
ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Πρωτεΐνες Κυτταροπλασματικές Γλυκοζυλιώνονται σε πολύ μικρό βαθμό με την προσθήκη Ν-ακετυλογλυκοζαμινών σε κατάλοιπα Ser-Thr Εκκρινόμενες, διαμεμβρανικές, ΕΔ, Golgi, λυσοσώματος Γλυκοζυλιώνονται έντονα σε κατάλοιπα Asp Στόχος η σταθερότητα των πρωτεϊνών και η σωστή ανάπτυξη της τεταρτοταγούς δομής
ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Η γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών ξεκινάει στον αυλό του ΚΕΔ: 1. Προσθήκη ενός προσχηματισμένου ολιγοσακχαρίτη στη πλευρική ΝΗ 2 ενός Asp καταλοίπου (Ν-συνδεδεμένοι), με την βοήθεια του ενζύμου της γλυκοζυλικής μεταφοράσης. 2. Απομάκρυσνη των 3 μορίων γλυκόζης και 1 μορίου μαννόζης
ΓΛΥΚΟΖΥΛΙΩΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Η γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών συνεχίζεται στο σύστημα Golgi: 1. Τροποποίηση των Ν-συνδεδεμένων υδατανθρακών από το ΚΕΔ μέσω της προσθήκης Ν-ακέτυλο-γλυκοζαμινών, γαλακτόζης, σιαλικού οξέος και φουκόζης 2. De novo προσθήκη ολιγοσακχαριτών στην ΟΗτης πλευρικής ομάδας καταλοίπων Ser, Thrή υδρο-lys (Ο-συνδεδεμένοι)
ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΟΥΜΠΙΚΙΤΙΝΗΣ -ΠΡΩΤΕΑΣΩΜΑ Η μη λυσοσωμική αποικοδόμηση των πρωτεϊνών λαμβάνει χώρα στο πρωτεάσωμα. Πρόκειται για ένα μεγαλομοριακό πρωτεολυτικό πρωτεϊνικό σύμπλεγμα με συνολικό Μ.Β. 2.000 Kda Η δράση του πρωτεασώματος είναι εξειδικευμένηκαι ελέγχεται από τη σήμανση των προς αποικοδόμηση πρωτεϊνών από την ουμπικιτίνη(77 αμινοξέα) σε κατάλοιπα Lys των πρωτεϊνών.
ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΔΙΣΟΥΛΦΙΔΙΚΩΝ ΔΕΣΜΩΝ Οι δισουλφιδικοί δεσμοί αποτελούν το μοναδικό ομοιοπολικό δεσμό (πέραν του πολυπεπτιδικού) ο οποίος συμμετέχει στην πτύχωση των πρωτεϊνών Σχηματίζονται έπειτα από την σύνθεση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, από την οξείδωση των σουλφιδριλομάδων δυο καταλοίπων Cys. Πραγματοποιείται στον αυλό του ΚΕΔ Τα κατάλοιπα Cys τα οποία συμμετέχουν στην ανάπτυξη του δεσμού μπορεί να βρίσκονται στην ίδια ή διαφορετική πολυπεπτιδική αλυσίδα.
ΥΔΡΟΞΥΛΙΩΣΗ Η είσοδος των πολυπεπτιδικών αλυσίδωνστο ΚΕΔ πραγματοποιείται υδροξυλίωση καταλοίπων Lys ή Pro. Η υδροξυλίωση εξαρτάται από την παρουσία Vit. C. Ακολουθεί γλυκοζυλίωση καταλοίπων υδροξυ-lys. Ανάπτυξη της τριπλής έλικας του προκολλαγόνου Ο σωστός σχηματισμός της έλικας του προκολλαγόνου οδηγεί στην ανάπτυξη των ινιδίων του κολλαγόνου στο εξωκυττάριο περιβάλλον. Απουσία υδροξυλίωσης η τεταρτοταγής δομή των τριπλετών του προκολλαγόνου αποσταθεροποιείται ταχύταταμε αποτέλεσμα την μειωμένη συσσώρευση φυσιολογικών ινιδίων κολλαγόνου
ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ Το κύτταρο επιλέγει την σύνθεση πολλών πολυπεπτιδικών αλυσίδων με ένα σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό αμινοξικών καταλοίπων σε σχέση με την τελική παραγώμενη δομική ή λειτουργική πρωτεϊνη. Η παραγωγή του τελικού πρωτεϊνικού μορίου απαιτεί την εξειδικευμένη πρωτεόλυσή του από τα ένζυμα του κυττάρου Η ενεργειακά αυτή κοστοβόρος σύνθεση αποσκοπεί: 1. Στην ορθή ανάπτυξη της στερεοδομής των πρωτεϊνών (π.χ. κολλαγόνο) 2. Στην ενδοκυτταρική διαλογή των πρωτεϊνών, καθώς και την έκκρισή τους 3. Στην χρονικά και τοπολογικά εξαρτώμενη ενεργοποίηση της καταλυτικής τους δράσης.
ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ Η σύνθεση όλων των πολυπεπτιδικών αλυσίδων ξεκινά από ελεύθερα ριβοσώματα Ωστόσο πολλές από αυτές πρέπει να εισέλθουν στο ΚΕΔγια την στοχευμένη τροποποίηση και διαλογή τους. Η παρουσία ενός πεπτιδικού σήματος 15-60 καταλοίπων στο NH 2 -άκρο της αλυσίδας επάγει την πρόσδεση του ριβοσώματος στο ΚΕΔ και την απελευθέρωσή του στον αυλό αυτού Ειδικές πεπτιδάσες του ΚΕΔ στη συνέχεια απομακρύνουν το πεπτιδικό σήμα για την παραγωγή της πρωτεϊνης.
ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ Η υδρόλυση πεπτιδικών δεσμών σε πολυπεπτιδικές αλυσίδες ελέγχεται από εξειδικευμένα ένζυμα, τις πρωτεάσες. ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ Μη εξειδικευμένη πρωτεϊνική αποικοδόμηση 1. Απόπτωση 2. Λυσοσωμική δράση Επιλεκτική υδρόλυση πεπτιδικών δεσμών 1. Ανάπτυξη στερεοδομής 2. Ενεργοποίηση / Απενεργοποίηση ενζύμων 3. Απόπτωση
ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΑΣΕΣ Εξωπρωτεάσες Υδρολύουν ΝΗ 2 -ή COOH-τελικούς πεπτιδικούς δεσμούς Ενδοπρωτεάσες Υδρολύουν εσωτερικούς πεπτιδικούς δεσμούς ΠΡΩΤΕΑΣΕΣ Κυστεΐνης Σερίνης Θρεονίνης Ασπαρτικού Μεταλλοπρωτεάσες
ΑΠΟΠΤΩΣΗ - ΚΑΣΠΑΣΕΣ Η απόπτωση συνδιάζει την εξειδικευμένη και ρυθμιζόμενη πρωτεόλυση και ενεργοποίηση των κασπασών και την μη επιλεκτική πρωτεολυτική αποικοδόμηση πλήθους πρωτεϊνών. Η πρόσδεση FASL-FAS οδηγείστην αυτοπρωτεόλυση και ενεργοποίηση της procaspase-8 Η caspase-8 (εναρκτήριος κασπάση): 1. Πρωτεόλυσηpro-caspase-3 2. Πρωτεολύει την BID σε tbidεπάγοντας την μετακίνησή της στην μιτοχονδριακή μεμβράνη και την έξοδο κυτοχρώματος-c. 3. To τριμερές σύμπλοκο: Κυτόχρωμα-C/Apaf-1/pro-caspase-9 αποτελεί το «αποπτώσωμα» το οποίο επάγει την πρωτεόλυσηκατά σειρά της pro-caspase-9 και της pro-caspase-3. 4. H caspase-3 λειτουργεί ως κασπάση τελεστής πρωτεολύοντας σημαντικό αριθμό κυτταρικών πρωτεϊνών
ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ Η ινσουλίνη, μια πεπτιδική ορμόνη των νησιδίων του Langerhans, συνθέτεται αρχικά ως προ-προ-ινσουλίνη 114 καταλοίπων. Αρχικά, πραγματοποιείται η πρωτεολυτική απομάκρυνση ενός τελικού πεπτιδίου 30 καταλοίπων με αποτέλεσμα την συσσώρευση της προ-ινσουλίνης(84 κατάλοιπα) Η παραγωγή τα ινσουλίνης απαιτεί την περαιτέρω δράση πρωτεασών για την απομάκρυνση του C-πεπτιδίου και την δημιουργία δυο ολιγοπεπτιδίων τα οποία συγκρατούνται μέσω δισουλφιδικών δεσμών
ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ Πλήθος ενζύμων συνθέτονται ως ανενεργά προένζυμα, η πρωτεόλυση των οποίων επιτρέπει την επιλεκτική ενεργοποίησή τους 19q13.3-13.4 1998: Η οικογένεια των ιστικών καλλικρεϊνών αποτελείται από 3 μέλη, την KLK1, KLK2 και το PSA(KLK3) 1999-2001: Η ομάδα των Yousef, Scorilas & Diamandis κλωνοποιούν και χαρτογραφούν 12 επιπλέον γονίδια της οικογένειας Η συγκεκριμένη γονιδιακή οικογένεια κωδικοποιεί 15 ομόλογες εκκρινόμενες πρωτεάσες σερίνης. Η σύνθεσή τους στα ριβοσώματα του ΚΕΔ οδηγεί στην παραγωγή ανενεργών προ-ενζύμων (pre-pro-enzyme) μεγαλύτερου μήκους από το τη λειτουργική πολυπετιδική αλυσίδα.
ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ Το σύνολο των KLKs φέρουν πέραν της καταλυτικής υπομονάδας, ένα πεπτίδιο οδηγητή και ένα προπεπτίδιοστοnh 2 -τελικόάκρο Το πεπτίδιο οδηγητής οδηγεί την έκκριση των KLKs και απομακρύνεται πρωτεολυτικά εντός του ΚΕΔ. Το εκκρινόμενο pro-enzyme δεν εμφανίζει καταλυτική ενεργότητα, η οποία επάγεται από την πρωτεολυτική απελευθέρωση της καταλυτικής υπομονάδας από το προ-πεπτίδιο.
ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ Ρευστοποίηση σπέρματος: Στο προστατικό υγρό τα Zn 2+ προσδένονται στις KLKs αποτρέποντας την ενεργοποίησή τους Έπειτα από την εκσπερμάτηση, η αλληλεπίδρασητωνzn 2+ μετιςsgi&sgii προκαλεί την πρωτεόλυση των proklk-2, -4,-5,-15 και την ενεργοποίησή τους Οι KLK2, KLK4 & KLK15 πρωτεολύουν και ενεργοποιούν με την σειρά τους το propsa σε PSA. Η συνδιασμένη δράση των PSA & KLK5 στην πρωτεόλυση των SgI & SgII οδηγεί στην ρευστοποίηση του σπέρματος και την επαγωγή της κινητικότητας των σπερματοζωαρίων
ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Alberts, B. et al (2002). Molecular Biology of the cell, 4 th edition. Garland Publ. Inc. NY, London 2. Berg, J.M. et al (2006). Biochemistry, 6 th edition. W.H. Freeman and Company, NY 3. Nelson, D.L. and Cox M.M. (2005). Lehninger princibles of biochemistry, 4 th edition. W.H. Freeman and Company, NY 4. Αλετράς Α. et al (1997). Lubert Stryer Βιοχημεία, 3 η έκδοση. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Κρήτη 5. Μαργαρίτης Λ.Χ. et al(2004). Βιολογία κυττάρου, 4 η έκδοση. Ιατρικές εκδόσεις Λίτσας, Αθήνα