Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. των πρωτεϊνών

Transcript

1 Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών

2 Στερεοδιαμόρφωση των πρωτεϊνών

3 Η δομή των πρωτεϊνών εξαρτάται από την αμινοξική τους αλληλουχία Η πρωτεϊνική δομή ξεκινάει από δημιουργία α-ελίκων και β-φύλλων. Στη συνέχεια διαμορφώνονται οι πρωτεϊνικές δομικές και λειτουργικές μονάδες και ακολουθούν οι ανώτερες στερεοδιαμορφώσεις. Η πρωτεϊνική δομή είναι τέτοια ώστε στο μικροπεριβάλλον του το μόριο να λάβει μία από τις διαμορφώσεις ελάχιστης ενέργειας.

4 ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ- ΔΟΜΗ ΠΡΩΤΟΤΑΓΗΣ ΔΟΜΗ- ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΔΕΥΤΕΡΟΤΑΓΗΣ ΔΟΜΗ- ΕΛΙΚΑ, ΦΥΛΛΟ ΤΡΙΤΟΤΑΓΗΣ ΔΟΜΗ- ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ Β ΤΑΓΩΝ ΔΟΜΩΝ ΤΕΤΑΡΤΟΤΑΓΗΣ ΔΟΜΗ- ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ

5 F U Hartl & M Hayer-Hartl. Nature Structural & Molecular Biology 2009; 16,

6 Η δομή των πρωτεϊνών εξαρτάται από τις αλληλεπιδράσεις των αμινοξικών καταλοίπων τόσο μεταξύ τους όσο και με τα μόρια του περιβάλλοντος διαλύτη- στα συστήματα ζώσας ύλης είναι το νερό. 1. δεσμοί υδρογόνου 2. δυνάμεις van der Waals 3. ηλεκτροστατικές δυνάμεις 4. αλληλεπιδράσεις υδροφοβικότητας 5. δυνάμεις μοριακών τροχιακών 6. εντροπία στερεοδιαμόρφωσης

7 Molecular Cell Biology Fig 2-12

8 Κυτταρικές περιοχές όπου λαμβάνει χώρα η πρωτεϊνοσύνθεση Προκαρυωτικούς: κυτταρόπλασμα (τυχαία κατανομή- χωροκατευθυνόμενη) Ευκαρυωτικούς: κυτταρόπλασμα (τυχαία κατανομή- χωροκατευθυνόμενη) ενδοπλασματικό δίκτυο μιτοχόνδριο χλωροπλάστης

9 Το ριβόσωμα με τη βοήθεια υποδοχέα πρόσδενεται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) και η εξελισσόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα μέσω μεμβρανικού καναλιού εισέρχεται στον αυλό του ER. Τα μιτοχόνδρια και η χλωροπλάστες φέρουν γενετικό υλικό που κωδικοποιεί για πρωτεϊνες που μεταφράζονται στο εσωτερικό των οργανιδίων με τη βοήθεια ατιστίχων ριβοσωμάτων.

10 Κυτταρικές περιοχές όπου μεταφέρονται πρωτεϊνες στα ευκαρυωτικά ενδοπλασματικό δίκτυο σύστημα Golgi- κυστιδίων μεταφοράς πυρήνας μιτοχόνδριο χλωροπλάστης περοξυσώματα λυσοσώματα κυτταροπλασματική μεμβράνη

11 E Schleiff & Τ Becker Nature Reviews Molecular Cell Biology 2011; 12: 48-59

12

13 Η στερεοδιαμόρφωση των πρωτεϊνών γίνεται με τη βοήθεια ειδικών πρωτεϊνών Chaperones Οικογένεια HSP70: TF, DnaJ/DnaK, Hsp70/Hsp40, PFD, BiP Οικογένεια HSP90 Chaperonins GroEL/GroES Thermosome TRiC/CCT

14 F U Hartl & M Hayer-Hartl. Nature Structural & Molecular Biology 2009; 16,

15 F U Hartl, A Bracher, M Hayer-Hartl. Nature 2011; 475:

16 F U Hartl, A Bracher, M Hayer-Hartl. Nature 2011; 475:

17 Τα διάφορα συστήματα Chaperones/Chaperonines συνεργάζονται προκειμένου να γίνει σωστή στερεοδιαμόρφωση των πρωτεϊνών, να διατηρηθεί η δομή των πρωτεϊνών σε αντίξοες συνθήκες, να προαχθεί η πρωτεόλυση των βλαμμένων πρωτεϊνών.

18 F U Hartl & M Hayer-Hartl. Nature Structural & Molecular Biology 2009; 16,

19 F U Hartl & M Hayer-Hartl. Nature Structural & Molecular Biology 2009; 16,

20 F U Hartl, A Bracher, M Hayer-Hartl. Nature 2011; 475:

21 Βιοχημικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις πρωτεϊνών 1. Αποκοπή πεπτιδικού τμήματος 2. Φωσφορυλίωση- αποφωσφορυλίωση 3. Δημιουργία δισουλφιδικού δεσμού 4. Σύνδεση με συμπαράγοντα- ιόν, βιταμίνη, αίμη 5. Σύνδεση με λιπίδια: μυριστοποίηση, παλμιτοποίηση, ισοπρενιλίωση 6. Σύνδεση με σάκχαρα- γλυκοζυλίωση 7. Ακετυλίωση ή Μεθυλίωση 8. Προϊόντα οξείδωσης με ρίζες Ο ή Ν 9. Προσθήκη Ubiquitin ή SUMO

22 Καταστροφή των πρωτεϊνών

23 Πρωτεόλυση 1. Σήμανση των πρωτεϊνών με Ubiquitin- Ubiquitinilation και καταστροφή στο πρωτεόσωμα 2. Συσσωματώματα πρωτεϊνών καταστρέφονται με τη διαδικασία της αυτοφαγίας μικροαυτοφαγία γενικευμένη μικροαυτοφαγία συνδεδεμένη με ubiquitinilation των πρωτεϊνών

24 F U Hartl, A Bracher, M Hayer-Hartl. Nature 2011; 475:

25 Το σύστημα σήμανσης μιας πρωτεϊνης με ουρά: Lys48-Ubiquitine Η πρωτεϊνη Ε1 χρησιμοποιείται για ενεργοποίηση της Lys48-Ubiquitine. Στη συνέχεια αυτή μεταφέρεται στο μόριο Ε2. Το τελευταίο αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο Ε3-πρωτεϊνη και ακολουθεί μεταφορά της ενεργοποιημένης ubiquitine στην πρωτεϊνη.

26 Το πρωτεόσωμα Πρωτεϊνικό σύμπλοκο από δύο διμερή καθένα από τα οποία αποτελείται από δύο 7μερείς πρωτεϊνικούς δακτυλίους (τον α και τον β) και ένα καπέλο. Στο τμήμα β πραγματοποιείται η πρωτεόλυση ενώ από το καπέλο γίνεται η εισαγωγή μετά από αναγνώριση των ubiquitinitaled πρωτεϊνών. Η κατανάλωση ATP απαιτείται για την αποδιάταξη και όχι για την καταστροφή των πεπτιδικών αλυσίδων.

27 Πρωτεόλυση με αυτοφαγία Στο πρώτο μονοπάτι- γενικευμένη μικροαυτοφαγία πραγματοποιείται εγκόλπωμα σε λυσόσωμα με απορρόφηση μικρού τμήματος του κυττοσολίου Στο δεύτερο μονοπάτι- μικροαυτοφαγία με μεσολάβηση chaperones πραγματοποιείται πρόσδεση του συμπλόκου chaperone-πρωτεϊνη σε μεμβρανικούς υποδοχείς του λυσόσωμα και ακόλουθη είσοδος στο λυσόσωμα

28 Δομή κυτταρικών μεμβρανών

29 Κυτταροπλασματική μεμβράνη Η κυτταροπλασματική μεμβράνη είναι μια λιπιδική διπλοστιβάδα η οποία παρουσιάζει κατά τόπους ετερογένεια που σχετίζεται με την λιπιδική σύσταση και την παρουσία πρωτεϊνών.

30 Ενδοκυττάριες μεμβράνες Αντίστοιχη δομή με την κυτταροπλασματική μεμβράνη παρουσιάζουν και όλες οι ενδοκυττάριες μεμβράνες: Υπάρχουν συστήματα που δομούνται 1. με διπλή μεμβράνη: μιτοχόνδρια, πυρήνας 2. με απλή μεμβράνη: ενδοπλασματικό δίκτυο, σύμπλεγμα Golgi-κυστίδια, λυσόσωμα, περοξείσωμα. Οι χλωροπλάστες θεωρούνται συστήματα τριπλής μεμβράνης

31 Στη δομή των μεμβρανών συμμετέχουν τρείς κατηγορίες λιπιδίων 1. φωσφογλυκερίδια 2. σφιγγολιπίδια 3. στερόλες

32 Η δομή και η ιδιότητες κάθε μεμβράνης- κατά τόπους, αλλά και μεμβρανών διαφορετικών κυτταρικών δομών εξαρτάται και από τη λιπιδική σύσταση όπως φαίνεται παρακάτω:

33 Τα λιπιδικά νησίδια- lipid rafts Στα πλαίσια ετερογένειας και λειτουργικής διαφορικότητας μεμβρανικών τμημάτων αναφέρονται οι περιοχές που είναι πλούσιες σε χοληστερίνη- τα λιπιδικά νησίδια: lipid rafts. Σε αυτές της θέσεις παρατηρείται συσσώρευση κυτταροπλασματικών και μεμβρανικών πρωτεινών που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και συμμετέχουν σε κοινά μονοπάτια μεταγωγής σήματος.

34 Σύνθεση των λιπιδίων Η έναρξη της σύστασης των μεμβρανικών λιπιδίων γίνεται στο κυτταρόπλασμα από το AcetylCoA με τη δημιουργία ενεργοποιημένω λιπαρών οξέων και ολοκληρώνεται με την παρουσία P-γλυκερόλης και τη δράση ακετυλοτρανσφερασών στην κυτταροπλασματική μεμβράνη του λείου ενδοπλασματικού δικτύου- φψσφατιδικό οξύ. Περαιτέρω τροποποιήσεις γίνονται με τη δράση άλλων ενζύμων και τελικά το λιπίδια μεταφέρονται στην μεμβρανική επιφάνεια του αυλού με τη δράση μιας φλιπάσης. Η χοληστερόλη δημιουργείται από AcetylCoA και AcetacetylCoA. Κομβικό μόριο είναι το μεβαλονικό οξύ που προέρχεται από το υδρόξυμεθυλογλουταριλοcoa- HMG-CoA με τη δράση της αντίστοιχης αναγωγάσης. Από το ίδιο μονοπάτι προκύπτουν και ενδιάμεσα λιπίδια που συμμετέχουν σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις πρωτεϊνώνισοπεντενύλιο και φαρνεσύλιο. Με περαιτέρω τροποποιήσεις του χοληστερονικού δακτυλίου προκύπτουν: VitD, στεροειδείς ορμόνες, χολικά οξέα. Κύρια θέση σύνθεσης όλων αυτών είναι το λείο ενδοπλασματικό δίκτυο.

35 Μεταφορά των πρωτεϊνών διαμέσου των κυτταρικών δομών

36 Η πορεία των πρωτεϊνών στο κύτταρο Η πρωτεϊνοσύνθεση γενετικά καθορισμένων από τον πυρήνα πρωτεϊνών λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα ή στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Στην πρώτη περίπτωση αναφερόμαστε σε: κυτταροπλασματικές πρωτεϊνες, πυρηνικές πρωτεϊνες, πρωτεϊνες μιτοχονδρίου, πρωτεϊνες χλωροπλάστη, πρωτεϊνες περοξεισώματος. Στη δεύτερη περίπτωση αναφερόμαστε σε: πρωτεϊνες ενδοπλασματικού δικτύου, πρωτεϊνες συμπλέγματος Golgi, πρωτεϊνες λυσοσωμάτων και πρωτεϊνες κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Η πορεία αυτή των πρωτεϊνών είναι προκαθορισμένη και εξαρτάται από την πρωτοδίαταξη τους- παρουσία χαρακτηριστικών αλληλουχιών

37 Μετακίνηση των πρωτεϊνών στον πυρήνα Ο πυρηνικός πόρος είναι μια σύνθετη δομή που επιτρέπει την επικοινωνία του πυρηνοπλάσματος με το κυτταρόπλασμα. Αποτελείται από μια δομή που σταθεροποιείται ανάμεσα στη διπλή πυρηνική διπλοστιβάδα- μεμβρανικές νουκλεοπορίνες και σύμπλεγμα Υ, ενώ αλληλεπίδρα με το κυτταρικό και πυρηνικό σκελετό- στην τελευταία περίπτωση δημιουργείται μια δομή που καλείται πυρηνικό καλάθι. Το κέντρο του πόρου ελέγχεται από το δίκτυο των FG-νουκλεοπορινών. Για να μετακινηθεί μια πρωτεϊνη στον πυρήνα πρέπει να φέρει μια ειδική αλληλουχία- NLS. Η αλληλουχία αυτή αναγνωρίζεται από ειδική πρωτεϊνη μεταφορέα- importin η οποία και τη μεταφέρει στον πυρήνα μετά από αλληλεπίδραση με τις FG- νουκλεοπορίνες. Στη συνέχεια η importin στο κυτταρόπλασμα με τη βοήθεια της Ran και κατανάλωση ενέργειας (GTP).

38 Μετακίνηση των πρωτεϊνών στo μιτοχόνδριο (βλέπε επόμενη διαφάνεια) Η μετακίνηση των πρωτεϊνών στα διάφορα μιτοχονδριακά τμήματα: εξωτερική μεμβράνη (θα περιγραφτεί παρακάτω στο ενδοπλασματικό δίκτυο), ενδομεμβρανικό χώρο (σχ.1), εσωτερική μεμβράνη (σχ.2) και στρώμα (σχ.3) εξαρτάται από χαρακτηριστικές αλληλουχίες που αναγνωρίζονται στην πρωτοδιάταξη των όπως δίδεται στο παρακάτω σχήμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε όλες τις περιπτώσεις μετακίνησης πρωτεϊνών προς τα ενδότερα του μιτοχονδρίου παρατηρείται η ύπαρξη της αλληλουχίας κατεύθυνσης στο στρώμα- matrix targeting sequence-mts. Τέλος προκειμένου να διέλθουν των διαμεμβρανικών συμπλόκων μετακίνησης Tom οι πρωτεϊνες πρέπει να είναι αποδιατεταγμένες- δράση του κυτταροπλασματικου Hsc70.

39 Μετακίνηση των πρωτεϊνών στo μιτοχόνδριο II Τα βασικά σύμπλοκα μετακίνησης της εξωτερικής μεμβράνης είναι τα Tom20/22,Tom40 ενώ στην εσωτερική μεμβράνη υπάρχουν τα Tim44, Tim23/17. Από αυτά τα πρώτα αναγνωρίζουν την MTS ενώ τα δεύτερα επιτρέπουν τη διέλευση του πολυπεπτιδίου. Στο Σχ1. οι πρωτεϊνες παράμενουν στον διαμεμβρανικό χώρο μετά από αλλοστερικές τροποποιήσειςπρωτεόλυση, δισουλφιδικοί δεσμοί. Στο Σχ.2 οι πρωτεϊνες είτε αγκυστρώνονται στη μεμβράνη κατά την πρωτεϊνοσύνθεση ή ενσωματώνονται σε δευτερο χρόνο (με τη βοήθεια της Oxa1) ή αναδιπλώνονται στο διαμεμβρανικό χώρο και σε δεύτερο χρόνο ενσωματώνονται στη μεμβράνη (με τη βοήθεια των Tim9/10, Tim 22, Tim64). Στο Σχ.3 το πολυπεπτίδιο διέρχεται πλήρως από τα δύο σύμπλοκα μετακίνησης και απελευθερώνεται στο στρώμα. Σχ.1 Σχ.3 Σχ.2

40 Μετακίνηση των πρωτεϊνών στο περοξείσωμα Το περοξείσωμα είναι μια δομή όπου πραγματοποιούνται αντιδράσεις της οξείδωσης των λιπαρών οξέων και του κύκλου των φωσφοπεντοζών. Για να μετακινηθεί μια πρωτεϊνη στο περοξείσωμα πρέπει να φέρει μια ειδική αλληλουχία- PTS1. Η αλληλουχία αυτή αναγνωρίζεται από ειδική πρωτεϊνη μεταφορέα- Pex5 η οποία και τη μεταφέρει στο στρώμα μετά από αλληλεπίδραση με τον υποδοχέα Pex14.

41 Μετακίνηση των πρωτεϊνών στο στρώμα του ενδοπλασματικού δικτύου Οποιαδήποτε πρωτεΐνη πρόκειται να εισέλθει στο ενδοπλασματικό δίκτυο ή να ενσωματωθεί στη μεμβράνη του φέρει μια ειδική αλληλουχία- signal sequence. Αυτή η αλληλουχία αναγνωρίζεται από ειδική πρωτεΐνη- SRP. Η τελευταία προκαλεί προσωρινή παύση της πρωτεϊνοσύνθεσης και μεταφορά του ριβοσώματος στο ενδοπλασματικό δίκτυο μετά από πρόσδεση με τον υποδοχέα της. Ο υποδοχέας βρίσκεται σε επαφή με ένα σύμπλοκο μετακίνησης και το συντιθέμενο πολυπεπτίδιο εισέρχεται μέσα από τον αυλό του συμπλόκου στο στρώμα. Εκεί με τη βοήθεια του Chaperone BiP γίνεται στερεοδιαμόρφωση του μορίου- αν αποτύχει αυτό μόρια BiP αφήνουν ελεύθερο τον υποδοχέα Ire1 ο οποίος διμερίζεται και κινητοποιεί το μονοπάτι σήματος για καταστροφή των πρωτεϊνών με λάθος στερεοδιαμόρφωση.

42 Μετακίνηση των πρωτεϊνών σε μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου Η ενσωμάτωση των πρωτεϊνών στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου εξαρτάται από την αλληλουχία τους. Συγκεκριμένες αλληλουχίες καθορίζουν την κατεύθυνση και τον τρόπο διευθέτησης του πρωτεΐνης στη μεμβράνη. Από τις αλληλουχίες αυτές αξίζει να αναφερθούν οι STA και SA με παρόμοια δράση αφού προκαλούν παύση της εξέλιξης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας προς το στρώμα και ενσωμάτωση του μορίου στη μεμβράνη- η SA συνοδεύεται από παρακείμενη θετικά φορτισμένη περιοχή που τροποποιεί τη φορά ενσωμάτωσης. Μόρια που φέρουν τη SA δε φέρουν την κλασική αλληλουχία αναγνώρισης. Η υδρόφοβη COOH tail anchored protein- αναγνωρίζεται από τη Cet3 η οποία εναποθέτει το πολυπεπτίδιο μετά από πρόσδεση στον υποδοχέα Cet1/Cet2.

43 Type II Type III Tale-anchored protein GPI-linked protein

44 Γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών στο στρώμα του ενδοπλασματικού δικτύου Κάποιες πρωτεϊνες που προορίζονται για το εξωκυττάριο τμήμα της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και πρωτεϊνες του λυσοσώματος γλυκοζυλιώνονται. Το ολιγοσακχαριτιδικό πρόδρομο μόριο- ως γλυκολιπίδιο συντίθεται αρχικά στο κυτοσολικό τμήμα της μεμβράνης και στη συνέχεια με τη δράση μιας φλιπάσης στο στρώμα του ενδοπλασματικού δικτύου. Το τελικό μόριο- Glc3Man9(GlcNAc)2 συνδέεται με τη δράση μια Ν- ολιγοσακχαροτρανσφεράση σε Asn- μοτίβο Asn-X-Ser, Asn-X-Thr. Ακολουθούν περαιτέρω τροποποιήσεις στο ολιγοσακχαριτιδικό κατάλοιπο που επιτρέπουν εκλεκτική δέσμευση από λεκτίνες.

45 Chaperons στο ενδοπλασματικό δίκτυο Οι γλυκοζυλιωμένες πρωτεϊνες λαμβάνουν τη στερεοδιαμόρφωση τους στο χώρο με τη βοήθεια των chaperons: BiP, PDI- δισουλφιδική ισομεράση, και των λεκτινών: Calreticulin-CRT, Calnexin-CNX. Πρωτεϊνες με λάθος στερεοδιαμόρφωση προκαλούν κατανάλωση των μορίων BiP και ενεργοποίηση των Ire1 υποδοχέων και αναγνώριση από εναλλακτικές λεκτίνες- EDEM, OS9. Και τα δυο αυτά μονοπάτια ενεργοποιούν μονοπάτια πρωτεόλυσης.

46 Η πορεία των πρωτεϊνών από το ΕΔ στο σ.golgi και απόκει στα κυστίδια μεταφοράς Οι πρωτεϊνες από το ΕΔ μεταφέρονται με κυστίδια στο εγγύς Golgi και ωριμάζουν μαζί με την ωρίμανση των δεξαμενών του συστήματος. Στο σύστημα Golgi γίνεται τροποποίηση-ωρίμανση των γλυκοπρωτεϊνών, ωρίμανση των λυσοσωμικών ενζύμων, προσωρινή αποθήκευση εκκριτικών πρωτεϊνών, και πακετάρισμα πρωτεϊνών προς κυστίδια μεταφοράς (άπω Golgi)

47 Τροποποίηση- ωρίμανση των γλυκοπρωτεϊνών στις δεξαμενές του σ.golgi (αριστερά) Τροποίηση- σήμανση γλυκοπρωτεϊνών για μεταφορά προς τα λυσοσώματα (κάτω)

48 Η επικοινωνία του ΕΔ με το εγγύς Golgi Οι πρωτεϊνες από το ΕΔ μεταφέρονται με τα COP II κυστίδια στο εγγύς Golgi. Η ανακύκλωση πρωτεϊνών και μεμβρανικών στοιχείων του ΕΔ πραγματοποιείται μέσω των COP I κυστιδίων. Η δημιουργία και των δύο κυστιδίων πραγματοποιείται με το σχηματισμό ενός μανδύα ενώ η σύζευξη τους γίνεται μέσω του ζεύγους υποδοχέων: vsnare(κυστίδιο), tsnare(μεμβράνη στόχος) (αριστερά) Δημιουργία κυστιδίου COP II (κάτω) Η φωσφορυλιωμένη Sar1 καθηλώνεται στη μεμβράνη και προσελκύει το σύμπλοκο μανδύα: Sec23/Sec24

49 Κυστίδια μεταφοράς από το trans Golgi 1. κυστίδια COPΙ: ανάστροφη κίνηση στις δεξαμενές 2-3. κυστίδια μεταφορά λυσοσωμικών ενζύμων καλυμμένα ή όχι με κλαθρίνη 4-5. κυστίδια συνεχούς έκκρισης ή έκκρισης αποθηκευμένων πρωτεϊνών

50 Κυστίδια καλυμμένα με κλαθρίνη (αριστερή εικόνα) Η κλαθρίνη είναι μια 6μερής τρισκελής πρωτεϊνη: 3 μεγάλες & 3 μικρές αλυσίδες που περιβάλει AP-καλλυμένα κυστίδια. Τα κυστίδια αυτά είτε είναι αποτέλεσμα ενδοκύττωσης (βλέπε κάτω εικόνα για λεπτομέρειες) ή προέρχονται από το trans Golgi και φέρουν λυσοσωμικά ένζυμα. Και στις δύο περιπτώσεις συνεισφέρουν στη δημιουργία του όψιμου ενδοσώματος.