Elucigene CF-EU2v1 Οδηγίες χρήσης

Elucigene CF-EU2v1 Οδηγίες χρήσης Κωδικός καταλόγου: CF2EUB2 50 εξετάσεις CF2EUBX 10 εξετάσεις Για in vitro διαγνωστική χρήση Κατασκευάζεται από την Elucigene Diagnostics Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ Για πωλήσεις, εξυπηρέτηση πελατών και τεχνική υποστήριξη: T: +44 (0) 161 669 8122 F: +44 (0) 161 669 8129 E: enquiries@elucigene.com E: techsupport@elucigene.com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and Wales, registration number 8696299. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 1 από 29

Elucigene CF-EU2v1 Χρήση για την οποία προορίζεται Για την ταυτόχρονη in vitro ποιοτική ανίχνευση των παρακάτω μεταλλάξεων του ανθρώπινου γονιδίου του ρυθμιστή διαμεμβρανικής αγωγιμότητας της κυστικής ίνωσης (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator, CFTR) σε DNA που εκχυλίζεται από δείγματα ολικού αίματος (που έχει συντηρηθεί σε EDTA) και αποξηραμένων κηλίδων αίματος: Παραδοσιακή Σύμφωνα με τις οδηγίες HGVS * cdna name Protein name CFTRdele2,3 c.54-5940_273+1025del Protein (c.54-5940_273+10250del21080) name E60X c.178g>t p.glu60x P67L c.200c>t p.pro67leu G85E c.254g>a p.gly85glu 394delTT c.262_263del (c.262_263deltt) p.leu88ilefsx22 444delA c.313del (c.313dela) p.ile105serfsx2 R117C c.349c>t p.arg117cys R117H c.350g>a p.arg117his Y122X c.366t>a p.tyr122x 621+1G>T c.489+1g>t 711+1G>T c.579+1g>t L206W c.617t>g p.leu206trp 1078delT c.948del(c.948delt) p.phe316leufsx12 R334W c.1000c>t p.arg334trp R347P c.1040g>c p.arg347pro R347H c.1040g>a p.arg347his A455E c.1364c>a p.ala455glu I507del c.1519_1521del (c.1519_1521delatc) p.ile507del F508del c.1521_1523del (c.1521_1523delctt) p.phe508del 1677delTA c.1545_1546del (c.1545_1546delta) p.tyr515x V520F c.1558g>t p.val 520Phe 1717-1G>A c.1585-1g>a G542X c.1624g>t p.gly542x S549R(T>G) c.1647t>g p.ser549arg S549N c.1646g>a p.ser549asn G551D c.1652g>a p.gly551asp R553X c.1657c>t p.arg553x R560T c.1679g>c p.arg560thr 1811+1.6kbA>G c.1680-886a>g 1898+1G>A c.1766+1g>a 2143delT c.2012del (c.2012delt) p.leu671x 2184delA c.2052del (c.2052dela) p.lys684asnfsx38 2347delG c.2215del (c.2215delg) p.val739tyrfsx16 W846X c.2538g>a p.trp846x 2789+5G>A c.2657+5g>a Q890X c.2668c>t p.gln890x CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 2 από 29

Παραδοσιακή Σύμφωνα με τις οδηγίες HGVS * 3120+1G>A 3272-26A>G c.2988+1g>a c. 3140-26A>G cdna name Protein name R1066C c.3196c>t p.arg1066cys Y1092X(C>A) c.3276c>a p.tyr1092x M1101K c.3302t>a p.met1101lys D1152H c.3454g>c p.asp1152his R1158X c.3472c>t p.arg1158x R1162X c.3484c>t p.arg1162x Protein name 3659delC c.3528del (c.3528delc) p.lys1177serfsx15 3849+10kbC>T c.3718-2477c>t S1251N c.3752g>a p.ser1251asn 3905insT c.3773dup (c.3773dupt) p.leu1258phefsx7 W1282X c.3846g>a p.trp1282x N1303K c.3909c>g p.asn1303lys * with reference to Mutation Nomenclature in Practice: Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme. Berwouts S, Morris M, Girodon G, Schwarz M, Stuhrmann M and Dequeker E. Human Mutation, Vol.00, No. 0, 1-7 (2011) Η ανάλυση CF-EU2v1 μπορεί να διακρίνει άτομα που είναι ετερόζυγα και ομόζυγα για όλες τις παραπάνω μεταλλάξεις και παραλλαγές, με εξαίρεση τη μετάλλαξη S549R(T>G) βλ. ενότητα «Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα» στο παρόν έγγραφο. Σύνοψη και επεξήγηση Η κυστική ίνωση (CF) είναι η πιο συνηθισμένη απειλητική για τη ζωή αυτοσωμική υπολειπόμενη διαταραχή στον πληθυσμό Καυκάσιας φυλής. Η επίπτωση της νόσου είναι 1:3.200 ζώντες γεννήσεις μεταξύ ατόμων της Καυκάσιας φυλής (1). Στον πληθυσμό Καυκάσιας φυλής, η συχνότητα των ετεροζυγωτών είναι περίπου 1:25. Η κυστική ίνωση επηρεάζει τα επιθήλια διαφόρων οργάνων με αποτέλεσμα μια σύνθετη πολυσυστηματική νόσο, που περιλαμβάνει την εξωκρινή μοίρα του παγκρέατος, το έντερο, την αναπνευστική οδό, τη γεννητική οδό των αρρένων, το ηπατοχολικό σύστημα και τους εξωκρινείς ιδρωτοποιούς αδένες. Η έκφραση της νόσου διαφέρει ανάλογα με τη βαρύτητα των μεταλλάξεων CFTR (2), τους γενετικούς τροποποιητές (3) και περιβαλλοντικούς παράγοντες (4). Το εύρος της έκφρασης εκτείνεται από τον θάνατο κατά την πρώιμη παιδική ηλικία ως αποτέλεσμα προοδευτικής αποφρακτικής πνευμονικής νόσου με βρογχεκτασίες, έως ανεπάρκεια του παγκρέατος με σταδιακά προοδευτική αποφρακτική πνευμονική νόσο κατά την εφηβεία και αυξημένη συχνότητα νοσηλειών για πνευμονική νόσο στην πρώιμη ενήλικο ζωή, έως υποτροπιάζουσα παραρρινοκολπίτιδα και βρογχίτιδα ή αντρική υπογονιμότητα στην νεαρή ενήλικη ζωή. Πιο συχνά η διάγνωση της κυστικής ίνωσης εδραιώνεται σε άτομα με ένα ή περισσότερα χαρακτηριστικά φαινοτυπικά γνωρίσματα CF, σε συνδυασμό με στοιχεία ανωμαλίας στη λειτουργία του CFTR με βάση ένα από τα παρακάτω: παρουσία δύο μεταλλάξεων που προκαλούν νόσο στο γονίδιο CFTR ή δύο παθολογικών τιμών χλωρίου στον ιδρώτα με ποσοτική ιοντοφόρεση με πιλοκαρπίνη (>60 meq/l) ή μετρήσεις διεπιθηλιακής ρινικής διαφοράς δυναμικού (NPD) που είναι χαρακτηριστικές της κυστικής ίνωσης. Το ποσοστό ανίχνευσης της μετάλλαξης CFTR διαφέρει βάσει της μεθόδου εξέτασης και του εθνικού υποβάθρου. Σε ορισμένα συμπτωματικά άτομα, ανιχνεύεται μόνο μία ή καμία μετάλλαξη που προκαλεί νόσο. Σε ορισμένους φορείς, δεν ανιχνεύεται η μετάλλαξη που προκαλεί νόσο. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 3 από 29

Οι διαταραχές που σχετίζονται με το CFTR-κληρονομούνται με αυτοσωμικό υπολειπόμενοτρόπο. Αμφιθαλή αδέρφια με αδερφό ή αδερφή με κυστική ίνωση έχουν πιθανότητα 25% να έχουν προσβληθεί, πιθανότητα 50% να είναι ασυμπτωματικοί φορείς και πιθανότητα 25% να μην έχουν προσβληθεί και να μην είναι φορείς. Χρησιμοποιούνται δοκιμασίες μοριακής γενετικής για τη μετάλλαξη (ή μεταλλάξεις) που προκαλεί νόσοστο γονίδιο CFTR για τον εντοπισμό φορέων σε προγράμματα προσυμπτωματικού ελέγχου του πληθυσμού. Διατίθενται προγενετικές διαδικασίες για κυήσεις με αυξημένο κίνδυνο διαταραχών που σχετίζονται με CFTR εάν είναι γνωστή η παρουσία μεταλλάξεων που προκαλούν νόσο στην οικογένεια. Από την ανακάλυψη του γονιδίου CFTR το 1989 (5), έχουν περιγραφεί περισσότερες από 1700 μεταλλάξεις και παραλλαγές του γονιδίου (6). Πολλές από αυτές τις μεταλλάξεις είναι «ιδιωτικές» και έχουν περιγραφεί μόνο σε έναν ασθενή ή/και μία οικογένεια. Η δοκιμασία ρουτίνας για όλες τις πιθανές μεταλλάξεις δεν είναι ούτε εφικτή ούτε και οικονομικά συμφέρουσα και συνεπώς περιοριζόμαστε στη δοκιμασία για τις πιο συνηθισμένες μεταλλάξεις. Το κιτ CF-EU2v1 είναι ένα κιτ δοκιμασίας κυστικής ίνωσης ειδικά σχεδιασμένο για την αναζήτηση των πιο συνηθισμένων μεταλλάξεων που ανευρίσκονται σε πληθυσμούς Ευρωπαϊκής καταγωγής. Αυτός ο προσδιορισμός αναγνωρίζει 50 μεταλλάξεις συνολικά και αναλύει επίσης την οδό πολυθυμιδίνης του ιντρονίου 9 με ακριβή μέτρηση των παρακείμενων επαναλήψεων TG. Η πολυμορφική οδός της θυμιδίνης στη σύνδεση του ιντρονίου 9 με το εξώνιο 10 επηρεάζει τη μεταγραφή. Ο αριθμός των καταλοίπων θυμιδίνης (5T, 7T ή 9T) επηρεάζει την αποτελεσματικότητα του ματίσματος του εξωνίου 10. Εάν υπάρχει αλληλόμορφο 5T θα απουσιάζει ένα ποσοστό μεταγραφημάτων του εξωνίου 10 με αποτέλεσμα τη δημιουργία μη λειτουργικής πρωτεΐνης και διαφόρων συμπτωμάτων λόγω κυστικής ίνωσης. Αναφέρεται ότι ο αριθμός των επαναλήψεων TG 5 στην οδό της πολυθυμιδίνης μπορεί επίσης να επηρεάσει το μάτισμα του εξωνίου 10 (7). Εάν υπάρχει το ίδιο αλληλόμορφο με την παραλλαγή 5T όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός επαναλήψεων TG τόσο υψηλότερο είναι το ποσοστό μεταγραφημάτων CFTR δεν θα φέρουν το εξώνιο 10. Ο αριθμός των επαναλήψεων TG μπορεί να προσδιοριστεί με χρήση του κιτ CF-EU2v1 με τον προσδιορισμό του μεγέθους των αιχμών αμπλικονίου 5T. Αρχές της διαδικασίας Η μέθοδος που χρησιμοποιείται από το κιτ Elucigene CF-EU2v1 χρησιμοποιεί ειδική φθορίζουσα τεχνολογία ενίσχυσης αλληλόμορφων ARMS (Amplification Refractory Mutation System), που μπορεί να ανιχνεύει σημειακές μεταλλάξεις, προσθήκες ή ελλείψεις στο DNA (8). Η αρχή του συστήματος ARMS είναι ότι τα ολιγονουκλεοτίδια με ένα παράταιρο κατάλοιπο 3 δεν θα λειτουργήσουν ως εκκινητές αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) υπό ειδικές συνθήκες. Η επιλογή κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδίων επιτρέπει την ενίσχυση και την ανίχνευση ειδικών μεταλλαγμένων ή φυσιολογικών αλληλουχιών DNA. Οι ενισχυμένες αλληλουχίες (αμπλικόνια) διαχωρίζονται με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας γενετικό αναλυτή της Applied Biosystems. Το λογισμικό της ανάλυσης καθιστά δυνατή την ταυτοποίηση και σήμανση των αμπλικονίων ανάλογα με το μέγεθός τους και το χρώμα της χρωστικής τους. Το Elucigene CF-EU2v1 είναι ένας ιδιαίτερα πολυπλεκτικός προσδιορισμός που περιλαμβάνει δύο (A και B) αντιδράσεις PCR. Ανιχνεύτηκαν πενήντα μεταλλαγμένες αλληλουχίες εντός του γονιδίου CFTR στο μίγμα Α και απεικονίστηκαν ως μπλε αιχμές αμπλικονίων. Αντίστοιχες μη μεταλλαγμένες, φυσιολογικές (φυσικού τύπου) αλληλουχίες ανιχνεύθηκαν στο μίγμα Β και απεικονίστηκαν ως πράσινες αιχμές αμπλικονίων. Το μίγμα Α ανιχνεύει επίσης φυσιολογική αλληλουχία για τη συνηθέστερα παρατηρούμενη μετάλλαξη που προκαλεί κυστική ίνωση σε πληθυσμούς Καυκάσιας φυλής, που αποκαλείται F508del, και απεικονίζεται ως πράσινη αιχμή αμπλικονίου. Επιπρόσθετα ανιχνεύθηκαν αλληλουχίες επανάληψης polyt στο μίγμα Α και απεικονίζονται ως μαύρες αιχμές αμπλικονίων. Εσωτερικοί δείκτες ελέγχου ενίσχυσης (χωρίς κυστική ίνωση) περιλαμβάνονται τόσο στο μίγμα Α όσο και στο μίγμα Β για παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της ενίσχυσης του δείγματος και απεικονίζονται ως κόκκινες αιχμές αμπλικονίων. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 4 από 29

Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 1. Ο μάρτυρας DNA που παρέχεται σε αυτό το κιτ είναι ανθρώπινης προέλευσης και έχει εξεταστεί ξεχωριστά χρησιμοποιώντας μέθοδο που βασίζεται σε PCR και έχει διαπιστωθεί αρνητικό για τους ιούς της ηπατίτιδας Β (HBV), της ηπατίτιδας C (HBC) και για τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας 1 (HlV 1). 2. Θα πρέπει να προσέχετε κατά τον χειρισμό υλικού ανθρώπινης προέλευσης. Όλα τα δείγματα θα πρέπει να θεωρούνται δυνητικά μολυσματικά. Καμία μέθοδος εξέτασης δεν μπορεί να διασφαλίσει απόλυτα ότι απουσιάζουν οι ιοί HBV, HCV, HIV 1 ή άλλοι μολυσματικοί παράγοντες. 3. Ο χειρισμός των δειγμάτων και των συστατικών της εξέτασης, η χρήση τους, η φύλαξη και η απόρριψή τους θα πρέπει να γίνονται σύμφωνα με τις διαδικασίες που ορίζει η ανάλογη εθνική κατευθυντήρια οδηγία ή κανονισμός ασφαλείας για βιολογικούς κινδύνους. 4. Σύμφωνα με την τρέχουσα ορθή εργαστηριακή πρακτική, τα εργαστήρια θα πρέπει να αναλύουν τα δικά τους δείγματα εσωτερικού ποιοτικού ελέγχου γνωστού φαινοτύπου σε κάθε προσδιορισμό, ούτως ώστε να μπορεί αξιολογηθεί η εγκυρότητα της διαδικασίας. 5. Εάν το κουτί του κιτ έχει υποστεί ζημιά, ενδέχεται να έχει προκληθεί ζημιά στο περιεχόμενο. Μη χρησιμοποιήσετε το κιτ, επικοινωνήστε με το τμήμα εξυπηρέτησης πελατών. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 5 από 29

Σύμβολα που χρησιμοποιούνται στις ετικέτες Τα σύμβολα που χρησιμοποιούνται σε όλες τις ετικέτες και τις συσκευασίες συμμορφώνονται με το εναρμονισμένο πρότυπο ISO15223 Παρασκευαστής Αριθμός εξετάσεων Δείτε τις οδηγίες χρήσης X C Φυλάσσετε σε χαμηλότερη θερμοκρασία από την αναγραφόμενη Χρησιμοποιείτε πριν από την αναγραφόμενη ημερομηνία Κωδικός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Ιατροτεχνολογικό προϊόν για in vitro διαγνωστική χρήση CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 6 από 29

Υλικά που παρέχονται Τα αντιδραστήρια θα πρέπει να φυλάσσονται σε περιοχή που δεν περιέχει μολυσματικό DNA ή προϊόν PCR. Όλα τα αντιδραστήρια παρέχονται έτοιμα για χρήση. Φυλάσσετε τα μη ανοιγμένα και τα ανοιγμένα αντιδραστήρια σε θερμοκρασία -20 C. Τα ανοιγμένα αντιδραστήρια μπορούν να φυλαχθούν επί έως και 3 μήνες. Παρέχονται επαρκή υλικά για 50 (10) εξετάσεις: 2 φιαλίδια x 120 µl (50 µl) του μίγματος εκκινητή A του CF-EU2v1, που περιέχει εκκινητές για την ενίσχυση των παρακάτω μεταλλαγμένων αλληλόμορφων R347H, R347P, 2789+5G>A, 3120+1G>A, 711+1G>T, R334W, I507del, F508del, 3849+10kbC>T, 1677delTA, 1078delT, V520F, L206W, W1282X, R560T, 2347delG, Q890X, R553X, G551D, S549N, M1101K, G542X, 3905insT, Y1092X(C>A), S1251N, 444delA, 1811+1.6kbA>G, 1717-1G>A, R117H, R117C, N1303K, Y122X, 394delTT, G85E, R1066C, 1898+1G>A, W846X, 2184delA, D1152H, CFTRdele2,3, P67L, 2143delT, E60X, 3659delC, 3272-26A>G, 621+1G>T, A455E, R1162X και R1158X. Αυτό το μίγμα περιέχει επίσης εκκινητές φυσικού τύπου για τον εντοπισμό του φυσιολογικού αλληλόμορφου F508del, εκκινητές για τον εντοπισμό των παραλλαγών πολυθυμιδίνης, IVS8-5T, IVS8-7T, IVS8-9T και εκκινητές για την ταυτοποίηση 2 υπερμεταβλητών δεικτών σύντομης διαδοχικής επανάληψης (STR) 404473 (450043). 2 φιαλίδια x 120 µl (50 µl) μίγματος εκκινητή Β του CF-EU2v1, που περιέχει εκκινητές φυσικού τύπου για την ενίσχυση των φυσιολογικών αλληλόμορφων των μεταλλάξεων που ενισχύθηκαν με το μίγμα εκκινητή A με εξαίρεση το F508del, το φυσιολογικό αλληλόμορφο, το οποίο ενισχύθηκε με εκκινητές που περιλαμβάνονται στο μίγμα εκκινητή A. Το μίγμα περιέχει επίσης εκκινητές για την ταυτοποίηση 2 υπερμεταβλητών δεικτών STR 404474 (450044). 2 φιαλίδια x 400 µl (75 µl) του κυρίου μίγματος PCR που περιέχει DNA πολυμεράση HotStart Taq και τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια σε ρυθμιστικό διάλυμα 404480 (450045). 1 φιαλίδιο x 50 µl μάρτυρα DNA στα 6 ng/µl, φυσιολογικό ως προς τις μεταλλάξεις που ανιχνεύονται από το κιτ Elucigene CF EU2v1-404489 Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται Εργαστηριακά αναλώσιμα Γάντια, σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης με βιδωτό πώμα, φιαλίδια PCR 0,2 ml ή πλάκες μικροτιτλοποίησης που συνιστώνται από τον κατασκευαστή του χρησιμοποιούμενου θερμικού κυκλοποιητή, ρύγχη πιπετών. Παρασκευή DNA Κιτ QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, αρ. κατ. 51304/51306) ή ισοδύναμο. Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση πρότυπο μεγέθους GeneScan 600 LIZ (αρ. κατ. ABI 4366589), πρότυπο μεγέθους GeneScan 600v2 LIZ (αρ. κατ. ABI 4408399), πρότυπο μήτρας DS-33 πολλαπλών τριχοειδών (σετ χρωστικής G5) (αρ. κατ. ABI 4345833), πολυμερές POP-7 (αρ. κατ. ABI 4352759), ρυθμιστικό διάλυμα γενετικού αναλυτή 10x (αρ. κατ. ABI 402824) και φορμαμίδη Hi-Di (αρ. κατ. ABI 4311320). Σημείωση: Βεβαιωθείτε ότι κανένα από τα υλικά που χρησιμοποιούνται δεν έχει υπερβεί την ημερομηνία σταθερότητας που προσδιορίζεται από τον κατασκευαστή. Απαιτούμενος εξοπλισμός Εργαστηριακός εξοπλισμός πιπέτες ακριβείας (2 σετ: 1 για τον χειρισμό πριν από την ενίσχυση και 1 για τον χειρισμό μετά την ενίσχυση), προστατευτικός ρουχισμός, ανακινητήρας CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 7 από 29

περιδίνησης τύπου vortex, μικροφυγόκεντρος, φυγόκεντρος πλάκας μικροτιτλοποίησης 96 κυψελίδων. Ενίσχυση PCR Θερμικός κυκλοποιητής που δέχεται πλάκες μικροτιτλοποίησης 96 κυψελίδων ή φιαλίδια 0,2 ml με ακρίβεια ελάχιστης θερμοκρασίας +/-1 C μεταξύ 33 C και 100 C και ομοιομορφία στατικής θερμοκρασίας +/-1 C. Σημείωση: Ο εξοπλισμός του θερμικού κυκλοποιητή πρέπει να συντηρείται τακτικά, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και να βαθμονομείται ώστε να διασφαλίζεται η ακριβής κυκλοποίηση PCR και η βέλτιστη απόδοση. Ο προσδιορισμός Elucigene CF-EU2v1 αναπτύχθηκε σε θερμικούς κυκλοποιητές 9700 της Applied Biosystems. Άλλες μάρκες και μοντέλα θα πρέπει να ελεγχθούν πλήρως και να αξιολογηθούν για βέλτιστη απόδοση από το χρήστη πριν από την αναφορά αποτελεσμάτων με CF-EU2v1. Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Γενετικός αναλυτής ABI 3130/3500 (με λογισμικό ανάλυσης τμημάτων GeneMapper), συστοιχία τριχοειδών 36 cm ή 50 cm (ABI3500), οπτικές πλάκες 96 κυψελίδων, διαφράγματα 96 κυψελίδων, κασέτες 96 κυψελίδων. Σημείωση: Ο εξοπλισμός της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης πρέπει να συντηρείται τακτικά, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και να βαθμονομείται ώστε να διασφαλίζεται η βέλτιστη απόδοση. Συλλογή και φύλαξη δειγμάτων Δείγματα ολικού αίματος (EDTA) και αποξηραμένες κηλίδες αίματος έχουν αξιολογηθεί ως συμβατά με αυτή τη δοκιμασία. Οι διατάξεις συλλογής δειγμάτων έχει αναφερθεί ότι, κατά περιπτώσεις, είναι επιβλαβείς για την ακεραιότητα ορισμένων αναλυόμενων ουσιών και μπορεί να παρεμβάλλονται σε ορισμένες τεχνολογίες μεθόδων (9). Συνιστάται να επιβεβαιώνει κάθε χρήστης ότι η επιλεγμένη διάταξη χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ότι οι διατάξεις συλλογής δειγμάτων είναι συμβατές με αυτή την εξέταση. Τα δείγματα αίματος θα πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία -20 C πριν από την προετοιμασία του DNA. Να αποφεύγεται η επανειλημμένη κατάψυξη και απόψυξη. Προετοιμασία DNA από δείγματα ολικού αίματος (EDTA) Λαμβάνονται σταθερά αποτελέσματα με εκχυλισμένο DNA με χρήση του κιτ QIAamp 96 DNA Blood Kit (ή του κιτ QIAamp DNA Mini Kit με χρήση πρωτεϊνάσης K) ακολουθώντας το πρωτόκολλο όπως περιγράφεται στο εγχειρίδιο QIAamp, ξεκινώντας με 200 µl υγρού ολικού αίματος και έκλουση σε 200 µl νερού επιπέδου μοριακής βιολογίας. Προετοιμασία DNA από αποξηραμένες κηλίδες αίματος Λαμβάνονται σταθερά αποτελέσματα με εκχυλισμένο DNA με χρήση του κιτ QIAamp DNA Mini Kit, ακολουθώντας το πρωτόκολλο όπως περιγράφεται στο εγχειρίδιο QIAamp, αλλά ξεκινώντας με δίσκους 2 x 3 mm από αποξηραμένη κηλίδα αίματος και έκλουση σε 100 µl νερού επιπέδου μοριακής βιολογίας. Συνιστάται η ενδελεχής αξιολόγηση εναλλακτικών μεθόδων εκχύλισης DNA και τύπων δειγμάτων με τη δοκιμασία Elucigene CF-EU2v1 πριν από τη χρήση των αποτελεσμάτων για διαγνωστικούς σκοπούς. Σημαντικές επισημάνσεις Ποσότητα DNA Υπό βέλτιστες συνθήκες PCR και χρησιμοποιώντας τις συνιστώμενες ρυθμίσεις ένεσης δειγμάτων (δείτε τη σημείωση της ενότητας «Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση») που δίνονται στις λειτουργικές μονάδες εκτέλεσης ανάλυσης με τριχοειδή στήλη, λαμβάνονται συνήθως αποδεκτά αποτελέσματα από DNA που εκχυλίζεται με χρήση των παραπάνω μεθόδων σε συγκεντρώσεις μεταξύ 1,5 ng/µl και 25 ng/µl. Η ποσοτικοποίηση του DNA είναι πολύ σημαντική. Η συγκέντρωση κάθε δείγματος DNA που πρόκειται να αναλυθεί θα πρέπει να μετράται ώστε να διασφαλίζονται βέλτιστα αποτελέσματα. Τεχνικές όπως αυτή του φθορισμού PicoGreen ή της απορρόφησης UV θεωρούνται αποδεκτές. Λόγω της CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 8 από 29

διαφοροποίησης των τεχνικών ποσοτικοποίησης του DNA, ο χρήστης θα πρέπει να λάβει υπόψη τις οδηγίες που ακολουθούν: Πολύ υψηλές ποσότητες DNA προς ανάλυση θα αυξήσουν την πιθανότητα σήμανσης αιχμών υποβάθρου από το λογισμικό της ανάλυσης. Για να μειωθεί η πιθανότητα σήμανσης αιχμών υποβάθρου μπορούν να ληφθούν τα παρακάτω μέτρα. Αραιώστε το δείγμα DNA και επαναλάβετε την ενίσχυση Μειώστε το χρόνο ένεσης βλ. ενότητα «Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση» Αυξήστε τον ουδό ελάχιστου εύρους αιχμής βλ. Οδηγός Elucigene CF-EU2v1 για το λογισμικό της ανάλυσης Χαμηλές ποσότητες DNA προς ανάλυση θα αυξήσουν την πιθανότητα ασθενών διαγνωστικών αιχμών που δεν θα σημανθούν από το λογισμικό της ανάλυσης. Εκτελέστε τα βήματα που ακολουθούν προκειμένου να αυξηθεί το σήμα. Αυξήστε το χρόνο ένεσης στα 36 δευτερόλεπτα (συνιστάται ιδιαίτερα για εκχυλίσματα κηλίδων αίματος) βλ. ενότητα «Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση» Επαναλάβετε την εκχύλιση του δείγματος κηλίδας αίματος και διενεργήστε έκλουση σε μειωμένο όγκο (50 µl) νερού Αυξήστε τον αριθμό κηλίδων αίματος που πρόκειται να εκχυλιστούν σε δίσκους 4 x 3 mm Σημαντικές επισημάνσεις Ποιότητα DNA Το CF-EU2v1 είναι ένας ιδιαίτερα πολυπλεκτικός προσδιορισμός και απαιτεί αποτελεσματική ενίσχυση PCR προκειμένου να επιτευχτεί η βέλτιστη λειτουργία του. Η ποιότητα του DNA μπορεί να καθορίσει την απόδοση της διαδικασίας PCR. Αναστολείς που εκχυλίζονται ταυτόχρονα με το δείγμα DNA ενδέχεται να οδηγήσουν σε κατώτερης ποιότητας ενίσχυση με αποτέλεσμα ασθενείς και κακώς ισορροπημένες αιχμές. Η Elucigene Diagnostics έχει επικυρώσει τη χρήση του κιτ QIAamp 96 DNA Blood Kit και του κιτ QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH) σε συνδυασμό με το κιτ CF-EU2v1. Άλλα κιτ ή μέθοδοι εκχύλισης DNA θα πρέπει να επικυρωθούν και να βελτιστοποιηθούν για χρήση με το CF-EU2v1. Σημείωση: Για περισσότερες πληροφορίες, βλ. τον Οδηγό αντιμετώπισης προβλημάτων του Elucigene CF-EU2v1. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 9 από 29

Πρωτόκολλο διαδικασίας Έλεγχος μόλυνσης PCR Η διαδικασία PCR δημιουργεί μεγάλο αριθμό ενισχυμένων προϊόντων (αμπλικονίων) και εμπεριέχει υψηλό κίνδυνο μόλυνσης που μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα αποτελέσματα. Μόλυνση μπορεί να προκληθεί από δύο πηγές: Διασταυρούμενη μόλυνση μόλυνση του δείγματος με μη ενισχυμένο υλικό από το περιβάλλον ή άλλα δείγματα που περιέχουν την αλληλουχία-στόχο. Μόλυνση τελικού προϊόντος μόλυνση του δείγματος με αμπλικόνια από προηγούμενες PCR που οδηγεί σε ενίσχυση τόσο του αμπλικονίου-στόχου όσο και του αμπλικονίου που προκάλεσε τη μόλυνση. Τα εργαστήρια που διεξάγουν PCR θα πρέπει να γνωρίζουν αυτές τις πηγές μόλυνσης και να είναι έτοιμα να χρησιμοποιήσουν διαδικασίες που μειώνουν σημαντικά τον κίνδυνο μόλυνσης. Μέθοδοι ελέγχου της μόλυνσης έχουν περιγραφεί διεξοδικά (10) και περιλαμβάνουν το χωροθετικό σχεδιασμό των εργαστηρίων, τη ροή εργασίας, τις διαδικασίες χειρισμού των δειγμάτων και τις χημικές και ενζυματικές προσεγγίσεις. Οι σαφείς και ορθές εργαστηριακές διαδικασίες είναι σημαντικές για τον έλεγχο της μόλυνσης της PCR και θα πρέπει να εφαρμόζονται πριν από τη δοκιμασία κλινικών δειγμάτων. Διαδικασία ενίσχυσης Σημείωση: Για να ελαχιστοποιήσετε τον κίνδυνο μόλυνσης, τα βήματα 3-5 πρέπει να διεξάγονται σε περιοχή που δεν περιέχει προϊόν PCR, κατά προτίμηση σε θάλαμο νηματικής ροής. 1. Προγραμματίστε τον θερμικό κυκλοποιητή για κύκλο ενός βήματος για την ενεργοποίηση του HotStart Taq σε θερμοκρασία 94 C για 20 λεπτά, συνδεδεμένο με ένα πρόγραμμα κύκλου ενίσχυσης 1 λεπτού σε θερμοκρασία 94 C (αποδιάταξη), 2 λεπτών σε θερμοκρασία 58 C (υβριδοποίηση) και 1 λεπτού σε θερμοκρασία 72 C (επιμήκυνση) για 30 κύκλους. Αυτό θα πρέπει να συνδεθεί σε αρχείο χρονοκαθυστέρησης διάρκειας 20 λεπτών σε θερμοκρασία 72 C (επιμήκυνση) στον τελικό κύκλο. 2. Πρέπει να περιλαμβάνεται ένας αρνητικός μάρτυρας με κάθε εκτέλεσης ανάλυσης PCR. 3. Αποψύξτε τα μίγματα εκκινητών και το κύριο μίγμα PCR και φυγοκεντρήστε για σύντομο χρονικό διάστημα για να συλλέξετε τα περιεχόμενα στον πυθμένα των φιαλιδίων. Αναμίξτε ήπια με ανακίνηση σε ανακινητήρα τύπου vortex και φυγοκεντρήστε ξανά τα φιαλίδια για σύντομο χρονικό διάστημα. Παρασκευάστε επαρκές μίγμα αντίδρασης για τον αριθμό δειγμάτων και μαρτύρων που θα εξεταστούν (Πίνακας 1). Σημείωση: Το κύριο μίγμα PCR είναι ιξώδες και θα πρέπει να είστε προσεκτικοί ώστε να διασφαλίσετε το χειρισμό των σωστών όγκων. Συνιστάται η προσθήκη του κύριου μίγματος PCR στα μίγματα εκκινητών που έχουν διανεμηθεί προηγουμένως ώστε να διασφαλίσετε ότι έχει διανεμηθεί όλο το υγρό εντός του μίγματος εκκινητή. Σημείωση: Μη χρησιμοποιείτε διαφορετικά μίγματα ή συστατικά από διαφορετικές παρτίδες του κιτ CF-EU2v1. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 10 από 29

CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 11 από 29

Ενεργοποίηση ενζύμων 94 C 94 C Κυκλοποίηση Τελική επιμήκυνση 20 λεπτά. 1 λεπτά. 72 C 72 C 58 C 1 λεπτά. 20 λεπτά. Θερμοκρασία περιβάλλοντος 2 λεπτά 30 κύκλοι Πίνακας 1: Ιδιοσκεύασμα μίγματος αντίδρασης Αριθμός δειγμάτων που πρόκειται να εξεταστούν 1 10 25 50 Μίγμα εκκινητών (μl) 4,5 45 112,5 225 Κύριο μίγμα PCR (μl) 7,5 75 187,5 375 Σύνολο (μl) 12 120 300 600 4. Μεταφέρετε με πιπέτα 10 μl κάθε μίγματος αντίδρασης στον πυθμένα των κατάλληλα επισημασμένων φιαλιδίων 0,2 ml ή πλακών PCR. 5. Χρησιμοποιώντας διαφορετικά ρύγχη πιπετών προσθέστε 2,5 μl του δείγματος DNA προς εξέταση σε κάθε φιαλίδιο και πωματίστε τα. Μην προσθέτετε DNA στο φιαλίδιο του αρνητικού μάρτυρα, υποκαταστήστε το με 2,5 µl στείρου απιονισμένου νερού. 6. Αποψύξτε τα φιαλίδια PCR και φυγοκεντρήστε για σύντομο χρονικό διάστημα για να συλλέξετε τα περιεχόμενα στον πυθμένα των φιαλιδίων. 7. Τοποθετήστε τα φιαλίδια σταθερά στο τμήμα του θερμικού κυκλοποιητή. Ξεκινήστε τον κύκλο ενός βήματος στους 94 C, ακολουθούμενο από το πρόγραμμα κύκλου ενίσχυσης. 8. Κατά την ολοκλήρωση του προγράμματος κύκλου ενίσχυσης, τα δείγματα είναι δυνατόν να φυλάσσονται σε θερμοκρασία δωματίου όλη τη νύχτα ή σε θερμοκρασία 2-8 C για έως και 7 ημέρεςστο σκοτάδι πριν από την ανάλυση με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Συνιστάται να επιβεβαιώνει κάθε χρήστης ότι ο επιλεγμένος εξοπλισμός τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ότι είναι συμβατός με αυτή τη δοκιμασία. Σε αυτό το πλαίσιο, οι βασικές παράμετροι είναι το πολυμερές και η συστοιχία CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 12 από 29

τριχοειδών. Μπορείτε να επιτύχετε βέλτιστα αποτελέσματα εάν χρησιμοποιήσετε τις παρακάτω συνθήκες τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης: 1. Συνδυάστε 6,8 μl προτύπου μεγέθους GS600v2 LIZ με 250 μl φορμαμίδης Hi-Di και αναμίξτε ενδελεχώς (μίγμα που επαρκεί για 16 κυψελίδες). Διανείμετε 15 μl του μίγματος σε κάθε κυψελίδα της πλάκας PCR 96 κυψελίδων. 2. Προσθέστε 3 µl προϊόντος PCR από κάθε ενίσχυση των μιγμάτων A και B για να διαχωρίσετε τις κυψελίδες που περιέχουν μίγμα πρότυπου μεγέθους/φορμαμίδης (από το βήμα 1) που έχει ήδη διανεμηθεί στην πλάκα. 3. Αποδιατάξτε το προϊόν PCR που έχει διανεμηθεί στην πλάκα PCR σε έναν θερμικό κυκλοποιητή χρησιμοποιώντας τις παρακάτω παραμέτρους: 94 C για 3 λεπτά, συνδεδεμένο σε 4 C για 30 δευτερόλεπτα. 4. Φυγοκεντρήστε την πλάκα για σύντομο χρονικό διάστημα για να συλλέξετε τα περιεχόμενα στον πυθμένα των φιαλιδίων και για να αφαιρέσετε τυχόν φυσαλίδες που έχουν παραμείνει στις κυψελίδες και φορτώστε την αμέσως στον γενετικό αναλυτή. Σημείωση: Οι ρυθμίσεις έγχυσης δειγμάτων μπορούν να τροποποιηθούν ώστε να ταιριάζουν με την ποσότητα του αμπλικονίου που παρήχθηκε κατά την PCR, η οποία μπορεί να διαφέρει ανάλογα με την ποσότητα γενωμικού DNA που προστέθηκε αρχικά. Μπορεί να εφαρμοστεί μικρότερη ποσότητα αμπλικονίου στη στήλη για ανάλυση, με μείωση είτε του χρόνου είτε της τάσης της ένεσης. Αντίστροφα, μπορεί να εφαρμοστεί μεγαλύτερη ποσότητα αμπλικονίου στη στήλη για ανάλυση, με αύξηση είτε του χρόνου είτε της τάσης της ένεσης. Δείγματα που έχουν ενισχυθεί προηγουμένως μπορούν να εγχυθούν εκ νέου πολλές φορές για επανάληψη της ανάλυσης για περισσότερες πληροφορίες, βλ. τον Οδηγό αντιμετώπισης προβλημάτων του Elucigene CF-EU2v1. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 13 από 29

ABI 3130 Instruments (Όργανα ABI): Πρέπει να δημιουργηθεί μία λειτουργική μονάδα και ένα πρωτόκολλο για την ανάλυση CF-EU2, τα οποία μπορεί κατόπιν να χρησιμοποιηθούν για κάθε εκτέλεση ανάλυσης CF-EU2. Δημιουργήστε τη λειτουργική μονάδα εκτέλεσης ανάλυσης CF-EU2 στο Module Manager (πρόγραμμα διαχείρισης λειτουργικών μονάδων) του λογισμικού συλλογής δεδομένων 3130. Βεβαιωθείτε ότι έχουν επιλεγεί τα εξής: Type (Τύπος): Regular (Κανονικός) Template (Μήτρα): FragmentAnalysis36_POP7 Καταχωρίστε τις ρυθμίσεις που περιγράφονται λεπτομερώς στον παρακάτω πίνακα: Λειτουργική μονάδα τριχοειδών 36 cm # Ονομασία παραμέτρου Τιμή Εύρος 1 Oven Temperature (Θερμοκρασία κλιβάνου) 60 μεταξύ 18 65 C 2 Poly_Fill_Vol. (Όγκος πλήρωσης με πολυμερές) 6500 6500 38000 βήματα 3 Current Stability (Σταθερότητα έντασης ρεύματος) 5,0 μεταξύ 0 2000 ua 4 PreRun_Voltage (Τάση πριν από την ανάλυση) 15,0 0 15 kv 5 Pre_Run_Time (Χρόνος πριν από την ανάλυση) 180 1 1000 s 6 Injection_Voltage (Τάση ένεσης) 3,0 1 15 kv 7 Injection_Time (Χρόνος ένεσης) 12,0** 1 600 s 8 Voltage_Number_Of_Steps (Τάση_Αριθμός_Βημάτων) 20 1 100 nk 9 Voltage_Step_Interval 15 1 60 s (Μεσοδιάστημα βημάτων τάσης) 10 Data_Delay_Time 60 1 3600 s (Χρόνος καθυστέρησης δεδομένων) 11 Run_Voltage (Τάση ανάλυσης) 15,0 0 15 kv 12 Run_Time (Χρόνος ανάλυσης) 1200 300 14000 s **Αυξήστε το χρόνο ένεσης σε 36 δευτερόλεπτα για ανάλυση DNA που έχει εκχυλιστεί από κηλίδες αίματος Σημείωση: Ο απαιτούμενος «χρόνος ανάλυσης» θα διαφέρει ανάλογα με τη θερμοκρασία περιβάλλοντος της θέσης στην οποία έχει εγκατασταθεί ο γενετικός αναλυτής. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη δημιουργία λειτουργικών μονάδων εκτέλεσης ανάλυσης ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήστη του γενετικού αναλυτή 3130 της Applied Biosystems. Δημιουργήστε το πρωτόκολλο CF-EU2 στο Protocol Manager (πρόγραμμα διαχείρισης πρωτοκόλλων) και βεβαιωθείτε ότι έχουν γίνει οι παρακάτω επιλογές: Type (Τύπος): Regular (Κανονικός) Run Module (Λειτουργική μονάδα εκτέλεσης ανάλυσης): CF-EU2 (βλ. λειτουργική μονάδα εκτέλεσης ανάλυσης παραπάνω) Dye Set (Σετ χρωστικών): G5 Για την εκτέλεση της ανάλυσης των δειγμάτων δημιουργήστε ένα φύλλο δειγμάτων χρησιμοποιώντας το Plate Manager (πρόγραμμα διαχείρισης CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 14 από 29

πλακών) και βεβαιωθείτε ότι έχει επιλεγεί το σωστό πρωτόκολλο για την ανάλυση CF-EU2v1 ως πρωτόκολλο του οργάνου (βλ. παραπάνω). Σημείωση: Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την εγκατάσταση, τη λειτουργία και την αντιμετώπιση προβλημάτων του οργάνου ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήστη του γενετικού αναλυτή 3130 της Applied Biosystems. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 15 από 29

ABI 3500 Instruments (Όργανα ABI): Πρέπει να δημιουργηθεί ένα Instrument Protocol (πρωτόκολλο οργάνου) CF-EU2 το οποίο μπορεί κατόπιν να χρησιμοποιηθεί για κάθε εκτέλεση ανάλυσης CF-EU2v1. Δημιουργήστε το Instrument Protocol (πρωτόκολλο οργάνου) CF-EU2 μέσω της βιβλιοθήκης πρωτοκόλλων του οργάνου 3500. Βεβαιωθείτε ότι έχουν επιλεγεί τα εξής: Run Module (Λειτουργική μονάδα εκτέλεσης ανάλυσης): FragmentAnalysis50_POP7 Καταχωρίστε τις ρυθμίσεις που περιγράφονται λεπτομερώς στην παρακάτω εικόνα: ** ** Αυξήστε το χρόνο ένεσης σε 36 δευτερόλεπτα για ανάλυση DNA που έχει εκχυλιστεί από κηλίδες αίματος Για την εκτέλεση ανάλυσης δειγμάτων, ημιουργήστε μία πλάκα δειγμάτων κάνοντας κλικ στην επιλογή «Create Plate from Template» (δημιουργία πλάκας από μήτρα) στο «Dashboard» (πίνακας εργαλείων) και βεβαιωθείτε ότι έχει αντιστοιχιστεί το σωστό πρωτόκολλο οργάνου για την ανάλυση CF- EU2v1 (βλ. παραπάνω). Ρύθμιση φύλλων δειγμάτων για το πρόγραμμα GeneMarker: Το λογισμικό GeneMarker επιτρέπει την άμεση σύγκριση μεταξύ των δεδομένων A και B του ίδιου ατόμου. Για τη διευκόλυνση αυτής της διαδικασίας είναι σημαντικό ο τρόπος ονομασίας του αρχείου εξόδου μη επεξεργασμένων δεδομένων (fsa) να είναι σταθερός για όλα τα δείγματα και μίγματα. Το φύλλο δειγμάτων θα πρέπει να περιέχει τη μοναδική ονομασία δειγμάτων για κάθε δείγμα που εξετάζεται μαζί με επίθημα _A ή _B, ανάλογα με το μίγμα που εξετάζεται. Εάν πρόκειται να συμπεριληφθεί το αναγνωριστικό πλάκας στην ονομασία fsa, τότε θα πρέπει να χρησιμοποιείται σταθερή μορφή κάθε φορά, π.χ. CFEU2 ΗΗΜΜΕΕΕΕ. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 16 από 29

Στο όργανο 3130, οι παράμετροι «Results Destination» (Προορισμός αποτελεσμάτων) θα πρέπει να οριστούν ώστε να περιλαμβάνεται το όνομα του δείγματος στο όνομα του αρχείου fsa, π.χ. CFEU2 ΗΗΜΜΕΕΕΕ_1234,5_A_A01. Στο όργανο 3500, η σύμβαση ονομασίας αρχείων θα πρέπει να οριστεί ώστε να περιλαμβάνεται το όνομα του δείγματος στο όνομα του αρχείου fsa, π.χ. CFEU2 ΗΗΜΜΕΕΕΕ_1234,5_A_A01. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Κατά τη συλλογή δεδομένων, θα παρατηρούνται τμήματα PCR είτε ως μπλε (μεταλλαγμένα) είτε ως πράσινες (φυσικού τύπου) αιχμές στο ηλεκτροφόρημα μη επεξεργασμένων δεδομένων. Ένα άτομο έχει δύο αντίγραφα του γονιδίου CFTR. Όπου αυτά τα αντίγραφα έχουν την ίδια αλληλουχία για μία συγκεκριμένη θέση, το άτομο περιγράφεται ως ομόζυγο για αυτή τη θέση. Όπου τα αντίγραφα έχουν διαφορετική αλληλουχία για μία συγκεκριμένη CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 17 από 29

θέση, το άτομο περιγράφεται ως ετερόζυγο για αυτή τη θέση. Μόλις ολοκληρωθεί η συλλογή δεδομένων, θα πρέπει να καθορίζεται και πάλι το μέγεθος των τμημάτων CF-EU2v1 PCR έναντι του προτύπου μεγέθους GS600v2 LIZ, με χρήση λογισμικού ανάλυσης τμημάτων. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 18 από 29

Το έγγραφο οδηγός λογισμικού ανάλυσης Elucigene CF-EU2v1 παρέχει περισσότερο λεπτομερείς κατευθυντήριες οδηγίες για τις ρυθμίσεις, την ανάλυση και την ερμηνεία του λογισμικού. Διατίθενται διαδικασίες του οδηγού λογισμικού ανάλυσης για το λογισμικό GeneMapper και το λογισμικό GeneMarker από την ιστοσελίδα της Elucigene Diagnostics: www.elucigene.com/products Τα αποτελέσματα από το μίγμα A (με τη μετάλλαξη) καθορίζουν εάν ένα άτομο φέρει μετάλλαξη και εμφανίζονται με την παρουσία μπλε αιχμής. Το μίγμα με τη μετάλλαξη περιέχει επίσης εκκινητές για το φυσιολογικό αλληλόμορφο F508, συνεπώς αυτό το μίγμα μπορεί να καθορίσει εάν ένα άτομο είναι φυσιολογικό για το αλληλόμορφο F508 (μόνον πράσινη αιχμή), ομόζυγο για τη μετάλλαξη F508del (μόνο μπλε αιχμή) ή ετερόζυγο για το αλληλόμορφο F508del (μπλε και πράσινη αιχμή). Εάν παρατηρηθεί οποιαδήποτε άλλη μετάλλαξη, τα αποτελέσματα από το μίγμα Β (φυσικού τύπου) μπορούν να αναλυθούν ώστε να καθοριστεί η ομόζυγη ή ετερόζυγη κατάσταση. Η παρουσία πράσινης αιχμής για το συγκεκριμένο αλληλόμορφο στο μίγμα φυσικού τύπου υποδεικνύει ότι το άτομο είναι ετερόζυγο, ενώ η απουσία πράσινης αιχμής υποδεικνύει ότι το άτομο είναι ομόζυγο για τη συγκεκριμένη μετάλλαξη. Υπερμεταβλητοί δείκτες STR (κόκκινοι) περιλαμβάνονται και στα δύο μίγματα. Αυτό επιτρέπει τη σύγκριση μεταξύ του δείγματος που ενισχύεται με το μίγμα με τη μετάλλαξη και του δείγματος που ενισχύεται με το μίγμα φυσικού τύπου για να μειωθεί το ενδεχόμενο μπερδέματος των δειγμάτων. Η παρουσία διαφορετικού προφίλ STR σε καθένα από το δύο μίγματα υποδεικνύει μπέρδεμα των δειγμάτων. Η απουσία αυτών των δεικτών STR υποδεικνύουν αποτυχημένο δείγμα. Η παρουσία δεικτών STR σε πολύ χαμηλές σχετικές μονάδες φθορισμού (rfu) υποδεικνύει ασθενές δείγμα, το οποίο θα πρέπει να αναλύεται με προσοχή. Σημείωση: Για περισσότερες πληροφορίες δείτε τον οδηγό αντιμετώπισης προβλημάτων. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 19 από 29

Δείκτες που ανιχνεύονται Ο παρακάτω πίνακας συνοψίζει τους δείκτες που ανιχνεύονται με το μίγμα CF-EU2v1. Οι δείκτες παρατίθενται σύμφωνα με το εύρος μεγέθους του προϊόντος PCR που παρατηρείται. Δείκτης (Αρ. αιχμής) Δείκτες που ανιχνεύονται Δείκτης 01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5G>A 124-130 04 3120+1G>A 132.5-138.5 05 711+1G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10KbC>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G)* 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kbA>G 332-338 29 1717-1G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2,3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272-26A>G 470-476 47 621+1G>T 485.5-491.5 Εύρος μεγέθους ζευγών βάσεων (bp) για το προϊόν (δεδομένα 3130/POP7) CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 20 από 29

Αρ. δείκτη Δείκτης Εύρος μεγέθους ζευγών βάσεων (bp) για το προϊόν (δεδομένα 3130/POP7) 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T** IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195 *S549R(T>G) Η αιχμή 20 υπάρχει μόνο στο μίγμα A. ** Μεγέθη αλληλόμορφων 5T Εύρος μεγέθους Δείκτης ζευγών βάσεων (bp) για το προϊόν (δεδομένα 3130/POP7) 5T (9) 117.25 118.75 5T (10) 119.25 120.75 5T (11) 121.25 122.75 5T (12) 123.25 124.75 5T (13) 125.25 126.75 ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα μεγέθη των δεικτών μπορεί να διαφέρουν λόγω του οργάνου και του πολυμερούς που χρησιμοποιούνται. Παραδείγματα ερμηνείας I507del Λόγω της θέσης της έλλειψης I507del στο γονίδιο CFTR είναι δυνατός ο εντοπισμός της παρουσίας αυτού του δείκτη μέσω μιας αλλαγής κατά 3 bp στο μέγεθος της αιχμής F508del, καθώς επίσης και της παρουσίας μιας αιχμής που είναι ειδική για τη μετάλλαξη I507del. Όταν υπάρχει ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο I507del, η αιχμή μετάλλαξης I507del θα παρατηρηθεί ως μπλε αιχμή στα 159 bp περίπου. Θα παρατηρηθεί η παρουσία μίας αιχμής φυσικού τύπου για το F508, αλλά με το μισό περίπου ύψος της αιχμής που σχετίζεται φυσιολογικά με ομόζυγο γονότυπο φυσικού τύπου. Αυτό παρατηρείται ως μία πράσινη αιχμή στα 167 bp περίπου. Θα υπάρξει επίσης μία πρόσθετη πράσινη αιχμή που παρατηρείται στα 164 bp περίπου. Δείγμα ετεροζυγώτη με μετάλλαξη I507del CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 21 από 29

Ένα δείγμα με μετάλλαξη I507del/F508del θα αποδώσει μια μετακινηθείσα πράσινη αιχμή F508del WT στα 164 bp περίπου (3 bp λιγότερα από το φυσιολογικό), μια μπλε αιχμή F508del M στα 166 bp και μία μπλε αιχμή I507del M στα 159 bp περίπου. Ένα δείγμα με μετάλλαξη I507del/I507del θα αποδώσει μία μπλε αιχμή στα 159 bp περίπου και μία μεμονωμένη πράσινη αιχμή στα 164 bp περίπου (κατά 3 bp μικρότερη από την αιχμή του φυσιολογικού F508 που παρατηρείται όταν δεν υπάρχει μετάλλαξη I507del). F508del Η παρουσία μετάλλαξης F508del παρεμποδίζει τη λειτουργία του εκκινητή I507del WT. Συνεπώς, ένα άτομο που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη F508del δεν θα έχει καμία αιχμή I507del WT στο μίγμα WT (βλ. παρακάτω). Στα αποτελέσματα του μίγματος B από άτομο που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη F508del, θα παρατηρηθεί μειωμένο ύψος της αιχμής I507del WT και 2 αιχμές με διαφορά 3 bp στις θέσεις 10 και 12 του μίγματος WT (βλ. παρακάτω). Προσθήκες και ελλείψεις Λόγω της φύσης του σχεδιασμού του κιτ CF-EU2v1 η παρουσία προσθηκών ή ελλείψεων μεταξύ δύο αντίθετων εκκινητών θα οδηγήσει σε αλλαγές στο μέγεθος όλων των αμπλικονίων που παράγονται μεταξύ των δύο αυτών εκκινητών. Ως εκ τούτου, επιπλέον των 50 μεταλλάξεων που εντοπίστηκαν από το κιτ CF-EU2v1, οποιεσδήποτε προσθήκες και ελλείψεις στις ενισχυμένες αλληλουχίες-στόχους μπορούν να εντοπιστούν από την αλλαγή στο αναμενόμενο μέγεθος του αμπλικονίου του μίγματος φυσικού τύπου (Β). Αυτές παρουσιάζονται σε μορφή πίνακα και διατίθενται σε ξεχωριστό αρχείο από την ιστοσελίδα της Elucigene Diagnostics: www.elucigene.com/products Παρουσιάζονται παρακάτω παραδείγματα της επίδρασης που έχουν οι προσθήκες και οι ελλείψεις που ανιχνεύονται από το κιτ στο προφίλ του μίγματος Β: CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 22 από 29

F508del/1677delTA Στα αποτελέσματα του μίγματος Β ενός ατόμου που είναι ετερόζυγο για τις μεταλλάξεις F508del/1677delTA, θα παρατηρηθούν δύο αιχμές σε απόσταση 1 bp στη θέση 12 (V520F WT). V520F Στα αποτελέσματα του μίγματος Β ενός ατόμου που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη V520F, θα παρατηρηθεί μία αιχμή φυσικού τύπου με μειωμένο ύψος στη θέση 10 (1677delTA WT), καθώς αυτή παρεμποδίζει τη λειτουργία του εκκινητή 1677delTA WT. Στα αποτελέσματα από άτομο που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη V520F, οι αιχμές 10 και 12 θα απουσιάζουν. 394delTT Στα αποτελέσματα του μίγματος Β ενός ατόμου που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη 394delTT, θα παρατηρηθούν δύο αιχμές σε απόσταση 2 bp στις θέσεις 35 (G85E WT), 42 (P67L WT) και 44 (E60X WT). Στα αποτελέσματα από άτομο που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη 394delTT, η αιχμή 34 θα απουσιάζει και οι αιχμές 35, 42 και 44 θα έχουν το αναμενόμενο ύψος, αλλά θα έχουν μέγεθος 2 bp μικρότερο από το αναμενόμενο. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 23 από 29

F508del/CFTRdele2,3 Στα αποτελέσματα του μίγματος Β ενός ατόμου που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη CFTRdele2,3, θα παρατηρηθούν μειωμένα ύψη αιχμών στις θέσεις 34 (394delTT), 35 (G85E WT), 41 (CFTRdele2,3 WT), 42 (P67L WT) και 44 (E60X WT). Στα αποτελέσματα από άτομο που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη CFTRdele2,3, οι αιχμές 34, 35, 41, 42 και 44 θα απουσιάζουν. 444delA Στα αποτελέσματα του μίγματος Β ενός ατόμου που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη 444delA, θα παρατηρηθούν δύο αιχμές σε απόσταση 1 bp στις θέσεις 30 (R117H WT), 31 (R117C WT), 33 (Y122X WT) και 47 (621+1 WT). Στα αποτελέσματα από άτομο που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη 444delA, η αιχμή 27 θα απουσιάζει και οι αιχμές 30, 31, 33 και 47 θα έχουν το αναμενόμενο ύψος αλλά θα έχουν μέγεθος 1bp μικρότερο από το αναμενόμενο. 2347delG Στα αποτελέσματα του μίγματος Β ενός ατόμου που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη 2347delG, θα παρατηρηθούν δύο αιχμές σε απόσταση 1 bp στις θέσεις 39 (2184delA WT) και 43 (2143delT WT). Στα αποτελέσματα από άτομο που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη 2347delG, η αιχμή 16 θα απουσιάζει και οι αιχμές 39 και 43 θα έχουν το αναμενόμενο ύψος αλλά θα έχουν μέγεθος 1bp μικρότερο από το αναμενόμενο. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 24 από 29

3905insT Στα αποτελέσματα του μίγματος Β ενός ατόμου που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη 3905insT, θα παρατηρηθούν δύο αιχμές σε απόσταση 1 bp στη θέση 26 (S1251N WT). Στα αποτελέσματα από άτομο που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη 3905insT, η αιχμή 24 θα απουσιάζει και η αιχμή 26 θα έχει το αναμενόμενο ύψος αλλά θα έχει μέγεθος 1 bp μεγαλύτερο από το αναμενόμενο. R1158X Στα αποτελέσματα του μίγματος Β ενός ατόμου που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη R1158X, θα παρατηρηθεί μειωμένο ύψος αιχμής στη θέση 49 (R1162X WT). Στα αποτελέσματα από άτομο που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη R1158X, η αιχμή 49 θα απουσιάζει. Πολυμορφισμοί rs4148721 (delat) στο ιντρόνιο 22 Στα αποτελέσματα του μίγματος Β ενός ατόμου ενός ατόμου που είναι ετερόζυγο για τον πολυμορφισμό rs4148721 (έλλειψη AT) στο ιντρόνιο 22, θα παρατηρηθούν δύο αιχμές σε απόσταση 2 bp στις θέσεις 45 (3659delC WT), 49 (R1162X WT) και 50 (R1158X WT). Στα αποτελέσματα από άτομο που είναι ομόζυγο για τον πολυμορφισμό rs4148721, οι αιχμές 45, 49 και 50 θα έχουν το αναμενόμενο ύψος αλλά θα έχουν μέγεθος 2 bp μικρότερο από το αναμενόμενο. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 25 από 29

Άλλες παρατηρήσεις V520F Πολυμορφισμός 1584G>A στο εξώνιο 12 Ο πολυμορφισμός 1584G>A έχει βρεθεί ότι επηρεάζει την ενίσχυση της μετάλλαξης V520F και την αλληλουχία φυσικού τύπου. Σε άτομο ετερόζυγο για τον πολυμορφισμό 1584G>A, θα παρατηρηθεί μειωμένο ύψος αιχμής στη θέση 12 (V520F) στο μίγμα B. Σε άτομο ομόζυγο για τον πολυμορφισμό 1584G>A, η αιχμή 12 θα απουσιάζει από το μίγμα Β. Άτομο που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη F508del και επίσης ετερόζυγο για τη μετάλλαξη 1584G>A θα παρουσιάσει μόνο μία αιχμή 12 στο μίγμα B και όχι τις δύο αναμενόμενες αιχμές στη θέση 12 που παρατηρούνται φυσιολογικά στον ετεροζυγώτη F508del βλ. το παράδειγμα που ακολουθεί. Σε άτομο ετερόζυγο για τη μετάλλαξη V520F και τον πολυμορφισμό 1584G>A στο ίδιο αλληλόμορφο, η αιχμή 12 θα απουσιάζει από το μίγμα A. Τέτοιο αποτέλεσμα δεν έχει παρατηρηθεί προς το παρόν και πιθανώς πρόκειται για σπάνιο συνδυασμό. Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα Έχει καταβληθεί κάθε δυνατή προσπάθεια κατά την ανάπτυξη της εξέτασης για να αποφευχθεί η παρεμβολή στη λειτουργία της εξέτασης λόγω της παρουσίας άλλων αναφερόμενων πολυμορφισμών και μεταλλάξεων του γονιδίου CFTR. Η σπάνια μετάλλαξη R1283M έχει αξιολογηθεί ως προς τυχόν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα από το κιτ Elucigene CF-EU2v1. Επιπλέον, οι παρακάτω πολυμορφισμοί δεν ανιχνεύτηκαν από την εξέταση: 1655T/G (F508C), 1651A/G. Η αξιολόγηση γνωστών μεταλλάξεων και πολυμορφισμών του γονιδίου CFTR έχει επισημάνει τις παρακάτω επιδράσεις στα αποτελέσματα του κιτ Elucigene CF-EU2v1: 1. Ο εκκινητής μετάλλαξης G551D στο μίγμα A θα εντοπίσει επίσης τη μετάλλαξη S549RT>G. Το λογισμικό της ανάλυσης θα την επισημάνει ως αιχμή 20. Δεν θα υπάρχει αντίστοιχη αιχμή φυσικού τύπου στο μίγμα B. 2. Ο εκκινητής μετάλλαξης 2184delA στο μίγμα A θα παρουσιάσει διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με την αλληλουχία 2183AA>G μεταλλαγμένου DNA και θα προκαλέσει τη δημιουργία αιχμής μετάλλαξης στη θέση 2184delA. 3. Ο εκκινητής μετάλλαξης 1078delT στο μίγμα A θα παρουσιάσει διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με την αλληλουχία F316L μεταλλαγμένου DNA και θα προκαλέσει τη δημιουργία αιχμής μετάλλαξης στη θέση 1078delT. 4. Ο εκκινητής μετάλλαξης R347P στο μίγμα A θα παρουσιάσει διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με την αλληλουχία R347H μεταλλαγμένου DNA και θα προκαλέσει τη δημιουργία αιχμής μετάλλαξης στη θέση R347P, η οποία θα έχει μικρότερο ύψος σε σχέση με την αληθή αιχμή R347P. 5. Η παρουσία πολυμορφισμού F508C (1655T>G) θα προκαλέσει τη μείωση του ύψους της αιχμής I507del στο μίγμα B της ανάλυσης CF-EU2v1. 6. Η παρουσία πολυμορφισμού R117H θα προκαλέσει τη μείωση του ύψους της αιχμής R117C στο μίγμα B της ανάλυσης CF-EU2v1. Σε δείγμα ατόμου που είναι ομόζυγο για τον πολυμορφισμό R117H, η αιχμή R117C θα απουσιάζει. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 26 από 29

7. Η παρουσία πολυμορφισμού G85E θα προκαλέσει τη μείωση του ύψους της αιχμής 394delTT στο μίγμα B της ανάλυσης CF-EU2v1. Σε δείγμα ατόμου που είναι ομόζυγο για τον πολυμορφισμό G85E, η αιχμή 394delTT θα απουσιάζει. 8. Στα αποτελέσματα ενός δείγματος ατόμου που είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη F508del και ιδιαίτερα ενός δείγματος ατόμου που είναι ομόζυγο για τη μετάλλαξη F508del, μπορεί να παρατηρηθεί, μερικές φορές, μία πολύ μικρή αιχμή λόγω τεχνήματος στη θέση I507del. 9. Οι παρακάτω μεταλλάξεις, οι οποίες δεν έχουν ελεγχθεί ως προς τυχόν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα λόγω μη διαθεσιμότητας αντίστοιχων δειγμάτων, ενδέχεται να παρεμβάλλονται στη λειτουργία της δοκιμασίας: R117P, R117L, 1717-2A>G, 621+2T>C, 621+2T>G, R553G, R553Q, R347L, I506T, I506S, I506V και ο σπάνιος συνδυασμός μετάλλαξης I507del με τον πολυμορφισμό 1651A/G. Χαρακτηριστικά απόδοσης Εκατόν δέκα δείγματα DNA που εκχυλίστηκαν από υγρό ολικό αίμα (EDTA) εξετάστηκαν με τυφλό τρόπο με χρήση της ανάλυσης Elucigene CF-EU2v1. Πέντε δείγματα απέτυχαν μετά από την PCR λόγω χαμηλών συγκεντρώσεων DNA (χαμηλότερη από 1,5 ng/μl). Από αυτά για τα οποία ελήφθησαν αποτελέσματα που ήταν δυνατόν να ερμηνευθούν, 96 ήταν φυσιολογικά, 5 ήταν ετερόζυγα για τη μετάλλαξη F508del, 1 ήταν ετερόζυγο για τη μετάλλαξη 1717-1G>A, 1 ήταν ετερόζυγο για τη μετάλλαξη G551D, 1 ήταν ετερόζυγο για τη μετάλλαξη 621+1G>T, 1 ήταν ετερόζυγο για τη μετάλλαξη G542X και 1 ήταν σύνθετο ετερόζυγο για τις μεταλλάξεις G542X/F508del. Ενενήντα ένα δείγματα DNA που εκχυλίστηκαν από αποξηραμένες κηλίδες αίματος εξετάστηκαν με τυφλό τρόπο με χρήση της ανάλυσης Elucigene CF-EU2v1. Πέντε δείγματα απέτυχαν να ενισχυθούν. Από αυτά τα δείγματα που δεν ενισχύθηκαν 20 απέτυχαν να ανταποκριθούν στα κριτήρια της ανάλυσης για ερμηνεία μετά από ένε. 12 δευτερολέπτων σε γενετικό αναλυτή 3500. Όλα τα αποτυχημένα δείγματα συσχετίστηκαν με χαμηλή συγκέντρωση DNA (χαμηλότερη από 1,5 ng/μl). Τα 20 αποτυχημένα δείγματα ενέθηκαν εκ νέου για 36 δευτερόλεπτα και αναλύθηκαν σε γενετικό αναλυτή 3500. Επτά (7) δείγματα απέτυχαν να ανταποκριθούν στα κριτήρια της ανάλυσης για ερμηνεία. Από τα 79 δείγματα εκ των οποίων ελήφθησαν αποτελέσματα που ήταν δυνατόν να ερμηνευθούν, 38 ήταν φυσιολογικά, 5 ήταν ετερόζυγα για F508del, 3 ήταν ετερόζυγα για G551D, 3 ήταν ετερόζυγα για W1282X, 2 ήταν ετερόζυγα για D1152H και 2 ήταν ετερόζυγα για G542X. Καθορίστηκαν επίσης τέσσερις σύνθετοι ετεροζυγώτες, 3120+1G>A/F508del, R117H/F508del, R1162X/F508del και R553X/F508del. Επιπλέον, τα ακόλουθα ετερόζυγα δείγματα παρατηρήθηκαν σε μία και μόνο περίπτωση το καθένα, E60X, G85E, 394delTT, Y122X, 621+1G>T, 1078delT, R334W, R347P, A455E, I507del, 1717-1G>A, R553X, 1811+1.6kbA>G, 1898+1G>A, 2184delA, W846X, 3272-26A>G, Y1092X, 3659delC, 3849+10kbC>T, S1251N και N1303K. Σαράντα έξι δείγματα DNA που αντιπροσωπεύουν και τις 50 μεταλλάξεις και εντοπίστηκαν από το κιτ CF-EU2v1 ενισχύθηκαν σε πέντε ξεχωριστές περιπτώσεις. Όλα τα δείγματα έδωσαν τα αναμενόμενα αποτελέσματα χωρίς κανένα ψευδώς αρνητικό και κανένα ψευδώς θετικό αποτέλεσμα, επιδεικνύοντας κλινική ειδικότητα και ευαισθησία 100%. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 27 από 29

Αντιμετώπιση προβλημάτων Οι παρούσες οδηγίες χρήσης παρέχονται για τη διασφάλιση της βέλτιστης απόδοσης του προσδιορισμού. Οι χρήστες δεν πρέπει να παρεκκλίνουν από τις διαδικασίες που συνιστώνται. Οποιαδήποτε παρέκκλιση ενδέχεται να οδηγήσει σε υποδεέστερη απόδοση και κακή ποιότητα δεδομένων. Ένας οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων είναι διαθέσιμος από την Elucigene Diagnostics κατόπιν αίτησης και παρέχει παραδείγματα και λύσεις για ορισμένα από τα συνηθέστερα προβλήματα που παρατηρούνται με το κιτ Elucigene CF- EU2v1 και τα οποία περιλαμβάνουν: Απουσία διαγνωστικών αιχμών ή αιχμών STR Ασθενείς διαγνωστικές αιχμές ή αιχμές STR Υπερβολικές αιχμές διαφυγής (breakthrough)/αιχμές υποβάθρου Μη σημασμένες αιχμές Ασθενείς αιχμές FAM (με μετάλλαξη) Μη ισορροπημένο προφίλ μίγματος Α Μη ισορροπημένο προφίλ μίγματος Β Διαχωρισμένες αιχμές στο προφίλ του μίγματος Β Για να πάρετε αντίγραφο του οδηγού αντιμετώπισης προβλημάτων του Elucigene CF- EU2v1 επικοινωνήστε με το τμήμα τεχνικής υποστήριξης: T: +44 (0) 161 669 8122 F: +44 (0) 161 669 8129 E: enquiries@elucigene.com E: techsupport@elucigene.com Περιορισμοί της διαδικασίας 1. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από αυτή ή οποιαδήποτε διαγνωστική εξέταση θα πρέπει να χρησιμοποιούνται και να ερμηνεύονται μόνο στο πλαίσιο της γενικής κλινικής εικόνας. Elucigene Diagnostics δεν είναι υπεύθυνη για τις κλινικές αποφάσεις που λαμβάνονται. 2. Η απουσία μεταλλάξεων που ανιχνεύονται με αυτό το κιτ δεν αποτελεί εγγύηση απουσίας άλλων μεταλλάξεων του γονιδίου CFTR. Είναι πιθανή η παρουσία άλλων μεταλλάξεων και αυτές δεν ανιχνεύονται από αυτό το κιτ. 3. Οι μεταλλάξεις διαφέρουν ως προς τη συχνότητά τους μεταξύ διαφορετικών πληθυσμών. Διατίθενται δεδομένα συχνότητας μεταλλάξεων σε διαφόρους πληθυσμούς από την Ένωση The Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium (6). Ο χρήστης αυτού του κιτ θα πρέπει να τονίσει αυτά τα σημεία κατά την αναφορά αποτελεσμάτων στον κλινικό γιατρό που θα καθορίσει τη διάγνωση/στον γενετικό σύμβουλο. Αποποίηση εγγύησης Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τον παρόντα ή άλλους διαγνωστικούς προσδιορισμούς πρέπει να ερμηνευτούν σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά δεδομένα που είναι διαθέσιμα στον ιατρό. Αυτά τα αντιδραστήρια Elucigene παρέχονται για in vitro διαγνωστική εξέταση. Περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με την ερμηνεία των δεδομένων διατίθενται στις διαδικασίες του οδηγού λογισμικού ανάλυσης Elucigene CF-EU2v1: www.elucigene.com/products CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 28 από 29

Βιβλιογραφία 1. Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement. Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr. 1998;132:589 95. 2. De Braekeleer M, Allard C, Leblanc JP, Simard F, Aubin G. Genotype-phenotype correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation. Hum Genet. 1997;101:208 11 3. Drumm ML, Konstan MW, Schluchter MD, Handler A, Pace R, Zou F, Zariwala M, Fargo D, Xu A, Dunn JM, Darrah RJ, Dorfman R, Sandford AJ, Corey M, Zielenski J, Durie P, Goddard K, Yankaskas JR, Wright FA, Knowles MR. Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis. N Engl J Med. 2005;353:1443 53 4. Goss CH, Newsom SA, Schildcrout JS, Sheppard L, Kaufman JD. Effect of ambient air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 2004;169:816 21 5. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M, and Tsui LC. «Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Genetic Analysis.» Science 1989; 245 (4922): 1073-8 6. Cystic Fibrosis Mutation Database, www.genet.sickkids.on.ca/cftr/app 7. Joshua D. Groman et al. Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene Is Pathogenic or Benign. Am J Hum Genet. 2004; 74(1): 176 179. 8. Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: 2503-2516 (1989). 9. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343:1509-1510 (1994). 10. PCR Primer: A Laboratory Manual, 2 nd edition. ColdSpring Harbour Laboratory Press: Section 1 ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics (UK) Ltd. Το ARMS είναι εμπορικό σήμα της AstraZeneca UK Ltd. Το QIAAMP είναι εμπορικό σήμα της Qiagen GmbH. Το PICOGREEN είναι εμπορικό σήμα της Molecular Probes Inc. Το GENEMARKER είναι εμπορικό σήμα της SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, NED, VIC, PET, POP-7, LIZ και HI-DI είναι εμπορικά σήματα της Life Technologies Corporation ΣΗΜΕΙΩΣΗ ΓΙΑ ΤΟΝ ΑΓΟΡΑΣΤΗ: ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΗ ΑΔΕΙΑ Τα πολυνουκλεοτίδια που σημαίνονται με χρωστικές VIC, NED και PET ή/και η χρήση τους μπορεί να καλύπτονται από μία ή περισσότερες άδειες ευρεσιτεχνίας που ανήκουν στην Life Technologies Corp. Η τιμή αγοράς αυτού του προϊόντος περιλαμβάνει περιορισμένα, μη μεταβιβάσιμα δικαιώματα βάσει ορισμένων αξιώσεων σε συγκεκριμένες άδειες ευρεσιτεχνίας που ανήκουν στην Life Technologies Corp. για χρήση μόνον αυτής της ποσότητας του προϊόντος αποκλειστικά για τις δραστηριότητες του αγοραστή για την ανίχνευση στόχου (ή στόχων) εντός του πεδίου των διαγνωστικών προϊόντων του ανθρώπου. Δεν μεταφέρονται άλλα δικαιώματα. Μπορείτε να λάβετε περισσότερες πληροφορίες για τις άδειες αγοράς που σχετίζονται με τις χρωστικές που αναφέρθηκαν παραπάνω επικοινωνώντας με την Director of Licensing, outlicensing@lifetech.com Copyright 2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd. CF2EUBYEL 002 Sep-2014 Σελίδα 29 από 29