Elucigene CF29v2. Οδηγίες χρήσης

Elucigene CF29v2 Οδηγίες χρήσης Αρ. Καταλόγου - CF029B1 25 δοκιμασίες με AmpliTaq Gold CF029B2-50 δοκιμασίες με AmpliTaq Gold YF029B2 50 δοκιμασίες χωρίς AmpliTaq Gold Για in vitro διαγνωστική χρήση Κατασκευάζεται από την Elucigene Diagnostics Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ Για πωλήσεις, εξυπηρέτηση πελατών και τεχνική υποστήριξη: T: +44 (0) 161 669 8122 F: +44 (0) 161 669 8129 E: enquiries@elucigene.com E: techsupport@elucigene.com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and Wales, registration number 8696299. CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 1 από 13

Elucigene CF29v2 Χρήση για την οποία προορίζεται Για την ταυτόχρονη in vitro ποιοτική ανίχνευση των παρακάτω μεταλλάξεων του ανθρώπινου γονιδίου του ρυθμιστή διαμεμβρανικής αγωγιμότητας της κυστικής ίνωσης (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator, CFTR) σε DNA που εκχυλίζεται από δείγματα ολικού αίματος (που έχει συντηρηθεί σε EDTA) και αποξηραμένων κηλίδων αίματος: Παραδοσιακή Σύμφωνα με τις οδηγίες HGVS * CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 2 από 13

Αρχές της διαδικασίας Η μέθοδος του κιτ Elucigene CF29v2 χρησιμοποιεί την ειδική τεχνολογία προς τα αλληλόμορφα ARMS, που μπορεί να ανιχνεύει σημειακές μεταλλάξεις ή μικρές διαγραφές στο δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) (6). Η αρχή της ARMS είναι ότι τα ολιγονουκλεοτίδια με ένα ασύμβατο υπόλειμμα 3 δεν θα λειτουργήσουν ως εκκινητές Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR) υπό ειδικές συνθήκες. Η επιλογή κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδίων επιτρέπει ειδικές μεταλλάξεις ή φυσιολογικές αλληλουχίες DNA να ενισχυθούν και ανιχνευθούν. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 1. Το υλικό ελέγχου φυσιολογικού DNA που παρέχεται σε αυτό το κιτ έχει εξεταστεί ξεχωριστά και έχει διαπιστωθεί αρνητικό για τους ιούς της ηπατίτιδας Β (HBV), της ηπατίτιδας Γ (HBC) και για τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) 1 και 2. 2. Θα πρέπει να δίνεται προσοχή κατά το χειρισμό υλικών ανθρώπινης προέλευσης. Όλα τα δείγματα θα πρέπει να θεωρούνται δυνητικώς μολυσματικά. Καμία μέθοδος εξέτασης δεν είναι δυνατό να παρέχει πλήρη διασφάλιση ότι το υλικό είναι απαλλαγμένο από HBV, HCV, HIV ή άλλους μολυσματικούς παράγοντες. 3. Μπορεί να απαιτούνται άδειες για την in vitro διαγνωστική ανάλυση των γονιδιακών μεταλλάξεων που ανιχνεύει αυτό το αντιδραστήριο, οι οποίες ανήκουν στην ευθύνη του αγοραστή του αντιδραστηρίου. 4. Ο χειρισμός των δειγμάτων και των συστατικών του τεστ, η χρήση τους, η φύλαξη και η απόρριψή τους θα πρέπει να γίνονται σύμφωνα με τις διαδικασίες που ορίζει η ανάλογη εθνική οδηγία ή κανονισμός για τους βιολογικούς κινδύνους. 5. Σύμφωνα με την τρέχουσα ορθή εργαστηριακή πρακτική, τα εργαστήρια θα πρέπει να επεξεργάζονται τα δικά τους δείγματα εσωτερικού ποιοτικού ελέγχου γνωστών γονοτύπων σε κάθε προσδιορισμό, ούτως ώστε να μπορεί αξιολογηθεί η εγκυρότητα της διαδικασίας. 6. Εάν το κουτί του κιτ έχει υποστεί ζημιά, ενδέχεται να έχει προκληθεί ζημιά στο περιεχόμενο. Μη χρησιμοποιήσετε το κιτ, επικοινωνήστε με το τμήμα εξυπηρέτησης πελατών. CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 3 από 13

Σύμβολα που χρησιμοποιούνται στις ετικέτες Τα σύμβολα χρησιμοποιούνται σε όλες τις ετικέτες και τις συσκευασίες σύμφωνα με το εναρμονισμένο πρότυπο ISO15223 Παρασκευαστής Αριθμός δοκιμασιών Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης X C Φυλάσσετε σε χαμηλότερη θερμοκρασία από την αναγραφόμενη Χρήση πριν από την αναγραφόμενη ημερομηνία Κωδικός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Ιατροτεχνολογικό προϊόν για in vitro διαγνωστική χρήση CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 4 από 13

Παρεχόμενα υλικά Φυλάσσετε όλα τα ανωτέρω συστατικά σε θερμοκρασία χαμηλότερη από -20 C. Απορρίψτε τα 3 μήνες μετά το άνοιγμά τους εκτός κι αν υποκλασματοποιηθούν 1. 1(2) φιαλίδιο(α) x 450 L καθένα με CF029TA, CF029TB, CF029TC και CF029TD). Επαρκές για 25(50) φιαλίδια δοκιμασιών καθένα με 4 Primer Mix (TA,TB,TC και TD) που περιέχουν εκκινητές για την ανίχνευση των ακόλουθων μεταλλάξεων 29 CFTR: D1152H, 1717-1G>A, G542X, W1282X, N1303K, F508, 3849+10kbC>T, 394delTT, 621+1G>T, S1251N, G551D, R117H, R1162X, R334W, A455E, 2183AA>G, 3659delC, 1078delT, I507, R347P, R553X, E60X, 3120+1G>A, 2789+5G>A, 1898+1G>A, 711+1G>T, G85E, 2184delA και R560T, κάθε μείγμα εκκινητών περιέχει επίσης εκκινητές ελέγχου και dntps σε ρυθμιστικό διάλυμα. 2. 1 φιαλίδιο x 200µL 404482 Ρυθμιστικού Διαλύματος (DB) 3. 1(2) φιαλίδιο(α) x 600µL 404481 Χρωστική Φόρτωσης (LD) για 25 (50) δοκιμασίες 4. 1(2) φιαλίδιο(α) x 40µL 404483 AmpliTaq Gold (AG) επαρκές για 25 (50) δοκιμασίες. Σημείωση: δεν παρέχετε με YF029B2 5. 1 x 50µL φιαλίδιο 404487 Υλικού ελέγχου DNA (DC), φυσιολογικού για τις μεταλλάξεις που ανιχνεύει το Elucigene CF29v2 25(50) χρωματιστά φιαλίδια PCR (πορτοκαλί, μωβ, πράσινο και μπλε) διατίθενται μετά από αίτηση. Yλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Παρασκευή του DNA Αποστειρωμένο απιονισμένο νερό καλής ποιότητας, χλωριούχο νάτριο (NaCl), δισοδικό άλας του EDTA, συσσωματώματα υδροξειδίου του νατρίου (NaOH), 2-αμινο-2-(υδροξυμεθυλ)- 1,3-προπανηδιόλη, κρυσταλλωμένο (Tris-base), υδροχλωρικό οξύ 36% ειδικού βάρους 1,18 (HCl), χλωριούχο αμμώνιο (NH 4Cl). Ενίσχυση PCR Ελαφρύ λευκό ορυκτέλαιο Sigma (a) ; καλής ποιότητας αποστειρωμένο αποσταγμένο νερό. (a) Απαιτείται για θερμικούς κυκλοποιητές χωρίς θερμαινόμενά καπάκια και για ενίσχυση PCR σε 0,5ml PCR. Ηλεκτροφόρηση Υλικά ηλεκτροφόρησης πηκτώματος συμπεριλαμβανομένου NuSieve 3:1 Αγαρόζης (Lonza) και κλίμακα 50 ζευγών βάσεων. Απαιτούμενα υλικά Γενικά Αναλώσιμα υλικά εργαστηρίου γάντια, σωλήνες μικροφυγόκεντρου με βιδωτό καπάκι, στατό δοκιμαστικών σωλήνων, ρύγχη πιπετών. Εργαστηριακός εξοπλισμός πιπέτες ακριβείας (2 σετ: 1 για τον χειρισμό πριν την ενίσχυση και 1 για μετά την ενίσχυση: (κατά προτίμηση πιπέτες θετικής μετατόπισης), γυαλιά, προστατευτικός ρουχισμός, αναμείκτης περιδίνησης, μικροφυγόκεντρος, ζυγαριά. Παρασκευή DNA κλίβανος (θέρμανση στους 100 C). Ενίσχυση PCR Θερμικός κυκλοποιητής που δέχεται φιαλίδια 0,5mL ή 0,2mL με ακρίβεια θερμοκρασίας +/-1,0 C μεταξύ 33 C και 100 C και ομοιομορφία στατικής θερμοκρασίας +/-1 C, θερμαινόμενο καπάκι προαιρετικό. Ηλεκτροφόρηση Οριζόντιο δοχείο πηκτώματος, γεννήτρια ηλεκτρικών παλμών, μικροκύματα, υδατόλουτρο για να ψυχθεί η αγαρόζη, διαφανοσκόπιο UV, φωτογραφικό σύστημα. CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 5 από 13

Συλλογή και φύλαξη των δειγμάτων Θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν δείγματα ολικού αίματος (EDTA). Έχει αναφερθεί ενίοτε ότι οι συσκευές συλλογής δειγμάτων ζημιώνουν την ακεραιότητα ορισμένων αναλυτών και μπορεί να επηρεάσουν ορισμένες τεχνολογικές μεθόδους (9). Συνιστάται κάθε χρήστης να βεβαιώνεται ότι η συσκευή που έχει επιλεγεί χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ότι τόσο οι συσκευές συλλογής δειγμάτων όσο και οι εναλλακτικές μέθοδοι παρασκευής DNA είναι συμβατές με αυτή την εξέταση. Πριν την παρασκευή του DNA, τα δείγματα αίματος θα πρέπει να φυλάσσονται στους -20 C. Αποφύγετε την επανειλημμένη κατάψυξη και απόψυξη. Δείγματα αίματος (EDTA) Παρασκευή DNA από δείγματα ολικού αίματος (EDTA) 1. Διανείματε με πιπέτα 80 L από κάθε δείγμα αίματος μέσα σε έναν σωλήνα μικροφυγόκεντρου με βιδωτό καπάκι. 2. Διανείματε με πιπέτα 320 L από τα 170mM (9,09 g/l) διαλύματος NH 4Cl σε κάθε σωλήνα. 3. Αναμείξτε επί 20 λεπτά με ελαφριά περιδίνηση και αναστροφή. Αποφύγετε την έντονη ανατάραξη και την δημιουργία αφρού. 4. Φυγοκεντρίστε κάθε σωλήνα επί 2 λεπτά στα 12 000g μέχρι να σχηματιστούν κυτταρικά σφαιρίδια. 5. Χρησιμοποιώντας μια πιπέτα, αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό. 6. Αναρροφήστε με πιπέτα 300 L των 10mM (0,58g/L) NaCl/10mM (3,72g/L) EDTA σε κάθε σωλήνα και επανεναιωρήστε τα κύτταρα σε αναμείκτη περιδίνησης. 7. Φυγοκεντρίστε κάθε σωλήνα επί 1 λεπτό στα 12 000g μέχρι να σχηματιστεί κυτταρικό ίζημα. 8. Επαναλάβετε τα βήματα 5 έως 7 τουλάχιστον ακόμη δύο φορές μέχρι να αφαιρεθεί όλη η ορατή κόκκινη χρώση στο υπερκείμενο υγρό. 9. Χρησιμοποιώντας μια πιπέτα, αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό. 10. Διανείματε με πιπέτα 200 L των 50mM (2g/L) του διαλύματος NaOH σε κάθε σωλήνα και επανεναιωρήστε τα κύτταρα σε αναμείκτη περιδίνησης. 11. Επωάστε σε κλίβανο στους 100 C επί 10 λεπτά. 12. Διανείματε με πιπέτα 40 L του 1M (121,1g/L) Tris-base/HCl (ph 7,5) σε κάθε σωλήνα και αναμείξτε σε αναμείκτη περιδίνησης. 13. Προσθέστε 1mL αποστειρωμένο απιονισμένο νερό σε κάθε σωλήνα μικροφυγόκεντρου ώστε να αποκτήσετε συνολικό όγκο δείγματος DNA 1,24mL. 14. Φυγοκεντρίστε κάθε σωλήνα επί 1 λεπτό στα 12 000g μέχρι να σχηματιστεί ίζημα κυτταρικών υπολειμμάτων. Το DNA περιέχεται μέσα στο υπερκείμενο υγρό. Παρασκευή DNA από αποξηραμένες κηλίδες αίματος 1. Αποσπάστε 2 x 3mm δίσκους (b) από την κάρτα δειγμάτων και τοποθετήστε τους σε ένα σωλήνα με βιδωτό καπάκι 1,5mL. CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 6 από 13

Οι κηλίδες θα πρέπει να αφαιρεθούν από μια περιοχή της κάρτας που είναι πλήρως κορεσμένη με αίμα. Αφαιρέστε αρκετές καθαρές κηλίδες της κάρτας για να απορριφθούν πριν από κάθε δείγμα ώστε να αποφευχθεί το φαινόμενο μεταφοράς του δείγματος. 2. Προσθέστε 1mL από 10mM (0,58g/L) NaCl/10mM (3,72g/L) EDTA και αναμείξτε σε περιστροφικό αναμείκτη επί 15-20 λεπτά. Αν δεν διαθέτετε περιστροφικό αναμείκτη τότε ο χρόνος της κάθε πλύσης μπορεί να χρειαστεί να αυξηθεί στα 30 λεπτά. 3. Αφαιρέστε και απορρίψτε το διάλυμα πλύσης. 4. Επαναλάβετε τα βήματα 2 και 3 ακόμη μία φορά. 5. Σε αυτό το σημείο, η πλειονότητα της χρωστικής αίμης θα πρέπει να έχει φύγει από τον δίσκο. Μία ελαφρώς κοκκινωπή καφέ χρώση των κηλίδων αίματος δεν είναι ασυνήθης σε αυτό το στάδιο. 6. Μικροφυγοκεντρίστε σύντομα (3 δευτερόλεπτα) για να συλλέξετε το εναπομείναν διάλυμα πλύσης στο κάτω μέρος του σωλήνα. Χρησιμοποιώντας μια πιπέτα, αφαιρέστε και απορρίψτε όσο περισσότερο διάλυμα πλύσης μπορείτε, χωρίς να πειράξετε τις κηλίδες. 7. Αυτό το σύντομο βήμα μικροφυγοκέντρισης αφαιρεί τα πρόσθετα χρωστικά στοιχεία αίμης από τις κηλίδες αίματος. 8. Προσθέστε 150μL από 50mM (2g/L) NaOH σε κάθε σωλήνα. Τινάξτε ελαφρά με το δάχτυλο για να αναμείξετε. 9. Επωάστε σε κλίβανο στους 100 C επί 10 λεπτά. 10. Μικροφυγοκεντρίστε σύντομα για να συλλέξετε το εναπομένον υπερκείμενο στο κάτω μέρος του σωλήνα. 11. Προσθέστε 30μL από 1M (121,1g/L) Tris-base/HCl (ph 7,5) σε κάθε σωλήνα, για να εξουδετερώσετε, και αναμείξτε προσεκτικά. 12. Προσθέστε 420μL αποστειρωμένο νερό Sigma σε κάθε δείγμα DNA ώστε να αποκτήσετε συνολικό όγκο 600 L. 13. Αναμείξτε καλά τα δείγματα και μικροφυγοκεντρίστε για να συλλέξετε. 14. Μεταφέρετε το υπερκείμενο σε σωλήνα με βιδωτό καπάκι με καινούργια επισήμανση. Φυλάξτε το DNA που έχει εξαχθεί στους -20 0 C. (b) Η συνολική περιοχή του δείγματος αίματος που χρησιμοποιείται θα πρέπει να ισούται τουλάχιστον με την περιοχή 2 x 3mm κυκλικών κηλίδων αίματος. Για παράδειγμα, αν βολεύει, μπορούν να χρησιμοποιηθούν κηλίδες κάρτας 1x 6mm. Η Κάρτα IsoCode Η Συσκευή Απομόνωσης DNA για κιτ Ενίσχυσης (Schleicher and Schuell, Inc.) χρησιμοποιήθηκε για την Παρασκευή DNA από κηλίδες αίματος και επίσης ευρέθη ότι παράγει ερμηνεύσιμα αποτελέσματα. Δείγματα στοματικού λουτρού Παρασκευή DNA από δείγματα στοματικού λουτρού 1. Αναταράξτε 10mL αλατούχου διαλύματος 0,9% στο στόμα επί 20 δευτερόλεπτα. Συλλέξτε το εναιώρημα σε αποστειρωμένο πλαστικό σωλήνα. 2. Προκαλέστε τον σχηματισμό κυτταρικού ιζήματος φυγοκεντρίζοντας στα 800g επί 10 λεπτά στους 18-28 C. CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 7 από 13

3. Χρησιμοποιώντας προσεκτικά μια πιπέτα, αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό. 4. Αναρροφήστε με πιπέτα 500 L των 10mM (0,58g/L) NaCl/10mM (3,72g/L) EDTA σε κάθε σωλήνα και επανεναιωρήστε τα κύτταρα σε αναμείκτη περιδίνησης. 5. Μεταφέρετε το κάθε δείγμα σε σωλήνα μικροφυγόκεντρου με βιδωτό καπάκι. 6. Φυγοκεντρίστε κάθε σωλήνα επί 1 λεπτό στα 12 000g μέχρι να σχηματιστεί κυτταρικό ίζημα. 7. Χρησιμοποιώντας μια πιπέτα, αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό. 8. Διανείματε με πιπέτα 500 L των 50mM (2g/L) του διαλύματος NaOH σε κάθε σωλήνα και επανεναιωρήστε τα κύτταρα σε αναμείκτη περιδίνησης. 9. Επωάστε σε κλίβανο στους 100 C επί 10 λεπτά. 10. Διανείματε με πιπέτα 100 L του 1M (121,1g/L) Tris-base/HCl (ph 7,5) σε κάθε σωλήνα και αναμείξτε σε αναμείκτη περιδίνησης. 11. Φυγοκεντρίστε κάθε σωλήνα επί 1 λεπτό στα 12 000g μέχρι να σχηματιστεί ίζημα κυτταρικών υπολειμμάτων. Το DNA περιέχεται μέσα στο υπερκείμενο υγρό. 12. Μεταφέρετε 100μL από το υπερκείμενο (δείγμα DNA) σε καινούργιο σωλήνα μικροφυγόκεντρου με επισήμανση. 13. Προσθέστε 400 L αποστειρωμένου απιονισμένου νερού σε κάθε δείγμα DNA ώστε να αποκτήσετε συνολικό όγκο 500 L. Εναλλακτικές μέθοδοι παρασκευής DNA Η Elucigene Diagnostics συνιστά τις μεθόδους παρασκευής του DNA που περιγράφονται άνωθεν οι οποίες έχει καταδειχθεί ότι παράγουν συνεπή και αξιόπιστα αποτελέσματα. Η παρασκευή DNA με χρήση άλλων μεθόδων ή άλλων ειδών δειγμάτων ενδέχεται να μην είναι η ιδανική για την εξέταση Elucigene CF29v2 και να μην δώσει βέλτιστα αποτελέσματα. Τα σημαντικότερα κριτήρια για εναλλακτικές μεθόδους παρασκευής DNA είναι η συγκέντρωση DNA και οι απουσία αναστολέων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Συνιστάται οι εναλλακτικές μέθοδοι και είδη δειγμάτων να αξιολογούνται ενδελεχώς με την εξέταση Elucigene CF29v2 πριν χρησιμοποιηθούν τα αποτελέσματα για διαγνωστική χρήση. Η εξέταση των δειγμάτων DNA σε συγκεντρώσεις <10ng/5µL δεν συνιστάται. Υπό ιδανικές συνθήκες αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), τα αποτελέσματα προκύπτουν σταθερά σε συγκεντρώσεις DNA μεταξύ 10 και 100ng/5μL. Πρωτόκολλο εξέτασης Διαδικασία ενίσχυσης Σημείωση: Για να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος μόλυνσης, τα βήματα 4-7 πρέπει να εκτελεστούν σε περιοχή χωρίς DNA. Θα πρέπει επίσης να ληφθούν μέτρα για αποφυγή μόλυνσης με το προϊόν PCR. 1. Προγραμματίστε τον θερμικό κυκλοποιητή για έναν μόνο κύκλο ώστε να ενεργοποιηθεί το AmpliTaq Gold στους 94 C επί 20 λεπτά συνδεδεμένο με ένα πρόγραμμα κύκλων ενίσχυσης 30 δευτερολέπτων στους 94 C (μετουσίωση), 2 λεπτών στους 58 C (προσκόλληση) και 1 λεπτού στους 72 C (επέκταση) για 35 κύκλους. Αυτό θα πρέπει να συνδεθεί με ένα αρχείο χρονοκαθυστέρησης 20 λεπτών στους 72 C (έκταση) στον τελικό κύκλο. Σημείωση: Επιλέξτε τη μέθοδο Block αν διατίθεται στον θερμικό κυκλοποιητή για αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) σε φιαλίδια 0,5ml. 2. Θα πρέπει να συμπεριλαμβάνεται αρνητικό υλικό ελέγχου σε κάθε εκτέλεση PCR. 3. Τήξτε και φυγοκεντρίστε τα φιαλίδια των Primer Mix (TA,TB,TC,TD), του AmpliTaq Gold (AG), της χρωστικής φόρτωσης (LD) και του ρυθμιστικού διαλύματος (DB) επί 10 δευτερόλεπτα στα 12 000g, CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 8 από 13

αναμείξτε ελαφρώς με αναμείκτη περιδίνησης και φυγοκεντρίστε ξανά τα φιαλίδια επί 10 δευτερόλεπτα. 4. Παρασκευάστε αρκετό διάλυμα AmpliTaq Gold με το Ρυθμιστικό Διάλυμα και τη Χρωστική Φόρτωσης που παρέχεται και αποστειρωμένο αποσταγμένο νερό για τον αριθμό των δειγμάτων και των υλικών ελέγχου που θα εξεταστούν. Για 10 δείγματα ή υλικά ελέγχου διανείματε με πιπέτα 85 L αποστειρωμένο απιονισμένο νερό, 25 L Ρυθμιστικό Διάλυμα, 125 L Χρωστική Φόρτωσης και 15 L AmpliTaq Gold σε σωλήνα μικροφυγόκεντρου. Αναμείξτε σχολαστικά το ενζυμικό διάλυμα αναρροφώντας απαλά με πιπέτα. 5. Παρασκευάστε μείγμα αντίδρασης προσθέτοντας τον κατάλληλο όγκο Primer Mix στο ενζυμικό διάλυμα από το βήμα 4. Για 10 δείγματα ή υλικά ελέγχου διανείματε με πιπέτα 165 L Primer Mix στα 55 L ενζυμικού διαλύματος που παρασκευάσατε στο βήμα 4. Αναμείξτε σχολαστικά αναρροφώντας απαλά. Αναμείξτε σχολαστικά αναρροφώντας με πιπέτα. 6. Διανείματε 20 L από κάθε μείγμα αντίδρασης στο κάτω μέρος του κατάλληλου αριθμού λεπτών φιαλιδίων PCR και επαναπωματίστε. Σημείωση: Θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν χρωματιστά φιαλίδια PCR για να διακρίνονται τα μείγματα αντίδρασης των εκκινητών TA,TB,TC και TD. 7. Επισημάνετε ένα φιαλίδιο από κάθε χρωματιστό φιαλίδιο PCR για κάθε δείγμα ή υλικό ελέγχου. 8. Χρησιμοποιώντας ξεχωριστά ρύγχη πιπετών κάθε φορά, προσθέστε 5 L του δείγματος εξέτασης σε καθένα από τα τέσσερα χρωματιστά φιαλίδια PCR. Αν χρειάζεται (γ), προσθέστε 1 σταγόνα ελαφρού λευκού ορυκτέλαιου Sigma και επαναπωματίστε σφιχτά. Μην προσθέτετε DNA στο φιαλίδιο PCR για το αρνητικό υλικό ελέγχου. 9. Φυγοκεντρίστε τα φιαλίδια PCR επί 10 δευτερόλεπτα στα 12.000g. 10. Τοποθετήστε στέρεα όλα τα φιαλίδια στον θερμικό κυκλοποιητή. Ξεκινήστε τον κύκλο ενός βήματος 94 C τον οποίο ακολουθεί το κυκλικό πρόγραμμα ενίσχυσης. 11. Απορρίψτε όλο το εναπομένον μη χρησιμοποιημένο διάλυμα AmpliTaq Gold. 12. Αφού ολοκληρωθεί το κυκλικό πρόγραμμα ενίσχυσης, τα δείγματα μπορούν να φυλαχτούν σε θερμοκρασία δωματίου ή στους 2-8 C για έως και 7 ημέρες πριν την ανάλυση με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος. (γ) Για ενίσχυση που διεξάγεται σε φιαλίδια PCR 0,5ml ή σε θερμικούς κυκλοποιητές χωρίς θερμαινόμενα καπάκια. Ηλεκτροφόρηση πηκτώματος Συνιστάται κάθε χρήστης να βεβαιώνεται ότι ο εξοπλισμός που έχει επιλεγεί χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ότι είναι συμβατός με αυτή την εξέταση. Σε αυτό το πλαίσιο, οι βασικοί παράμετροι είναι οι διαστάσεις της μήτρας και της χτένας του πηκτώματος (εκμαγείο φατνίων). Τα αποτελέσματα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες ηλεκτροφόρησης: 1. Το προϊόν PCR ηλεκτροφορήθηκε σε πήκτωμα αγαρόζης 3% NuSieve 3:1 με χρήση tris-βορικού με βρωμιούχο αιθίδιο (TBE/EtBr) ως ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Το TBE/EtBr παρασκευάστηκε ως Tris-βάση 134mM (16,2g/L), 74,9mM (4,63g/L) βορικό οξύ, 2,55mM (0,95g/L) ρυθμιστικό διάλυμα EDTA με 0,1 g/ml βρωμιούχο αιθίδιο. 2. 3g NuSieve 3:1 διαλύθηκαν σε 100mL TBE/EtBr και χύθηκαν σε οριζόντιο δίσκο πηκτώματος 15 x 12cm με φατνία 1,5mm x 5mm αιωρούμενα 1mm πάνω από τη βάση. 3. 15 L του προϊόντος PCR (η χρωστική φόρτωσης προστίθεται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ρύθμισης της PCR) φορτώθηκαν σε πήκτωμα. 4. Μία κλίμακα 50 ζευγών βάσεων στα 1,5 g/15 L παρασκευάστηκε στην Χρωστική Φόρτωσης που παρέχεται (80 L αποσταγμένο νερό / 10 L Χρωστική Φόρτωσης / 10 L κλίμακα 50 ζευγών βάσεων). CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 9 από 13

Σημειώστε ότι το μείγμα ενδέχεται να είναι πορτοκαλί χρώματος πριν την φόρτωση του πηκτώματος. 15 L αυτού του διαλύματος φορτώθηκαν στο πήκτωμα και έτρεξε δίπλα στα δείγματα ως δείκτης μοριακού βάρους. 5. Η ηλεκτροφόρηση εκτελέστηκε στα 5 με 6 V/cm (δ) μεταξύ των ηλεκτροδίων μέχρι η εμπρός χρωστική να μεταναστεύσει 5cm από τα φατνία φόρτωσης προς την άνοδο (1,5 με 2 ώρες). 6. Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα πηκτώματα τοποθετήθηκαν σε διαφανοσκόπιο UV στα 260nm, οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν. (δ) Υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την απόσταση σε cm μεταξύ των ηλεκτροδίων. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Τα προϊόντα PCR θα παρατηρηθούν ως ζώνες στις διαδρομές των φιαλιδίων του πηκτώματος. 1. Η άνω και κάτω ζώνη ελέγχου πρέπει να είναι καθαρά ορατή σε όλα τα δείγματα (βλ. Εικόνα 1). 2. Καμία διαδρομή δεν θα πρέπει να έχει υπερβολικό επίχρισμα και φωσφορισμό υποβάθρου. 3. Η θέση των άνω και κάτω ζωνών ελέγχου θα πρέπει να δείχνει το σωστό μοριακό μέγεθος, (βλ. Εικόνα 1). 4. Το αρνητικό υλικό ελέγχου θα πρέπει να δείχνει ζώνες στην περιοχή που ορίζεται από την πάνω και κάτω ζώνη ελέγχου. Μία διαγνωστική ζώνη δεν θα πρέπει να ερμηνεύεται αν παρουσιάζεται μια παρόμοια ζώνη στο αρνητικό υλικό ελέγχου για την ίδια εκτέλεση PCR, διότι αυτό είναι ενδεικτικό μόλυνσης με γενομικό DNA. Αν οποιοδήποτε από τα ανωτέρω δεν συμβεί, τα αποτελέσματα δεν θα πρέπει να ερμηνευτούν και η εξέταση θα πρέπει να επαναληφθεί. 5. Ένα άτομο έχει δύο αντίγραφα του γονιδίου CFTR. Όπου αυτά τα αντίγραφα έχουν την ίδια αλληλουχία σε οποιοδήποτε δεδομένο σημείο, ένα άτομο περιγράφεται ως ομόζυγο για αυτό το σημείο. Όπου αυτά τα αντίγραφα έχουν διαφορετική αλληλουχία σε ένα δεδομένο σημείο, ένα άτομο περιγράφεται ως ετερόζυγο για αυτό το σημείο. 6. Η παρουσία του προϊόντος PCR που προκλήθηκε από τον φυσιολογικό εκκινητή ΔF508 στο φιαλίδιο B υποδεικνύει ότι το δείγμα περιέχει την φυσιολογική αλληλουχία για αυτό το σημείο. Το φυσιολογικό προϊόν PCR θα παρατηρηθεί στην διαδρομή του φιαλιδίου Β του πηκτώματα στα 60bp και ταυτοποιείται με σύγκριση της θέσης της ζώνης με μια διπλανή ζώνη-δείκτη. 7. Τα προϊόντα PCR από ένα άτομο που φέρει οποιαδήποτε από τις μεταλλάξεις D1152H, 1717-1G>A, G542X, W1282X, N1303K, ΔF508 και 3849+10kbC>T θα παρατηρηθούν στη διαδρομή του φιαλιδίου Α του πηκτώματος και ταυτοποιούνται με σύγκριση της θέσης της ζώνης με μια διπλανή διαδρομήδείκτη. Τα μεγέθη των ζωνών του προϊόντος στα ζεύγη βάσεων φαίνονται στην Εικόνα 1. Μόνο οι σωστού μεγέθους ζώνες του προϊόντος θα πρέπει να ερμηνεύονται. 8. Τα προϊόντα PCR από ένα άτομο που φέρει οποιαδήποτε από τις μεταλλάξεις 394delTT, 621+1G>T, S1251N, G551D, R117H, R1162X καιr334w θα παρατηρηθούν στη διαδρομή του φιαλιδίου Β του πηκτώματος και ταυτοποιούνται με σύγκριση της θέσης της ζώνης με μια διπλανή διαδρομή-δείκτη. Τα μεγέθη των ζωνών του προϊόντος στα ζεύγη βάσεων φαίνονται στην Εικόνα 1. Μόνο οι σωστού μεγέθους ζώνες του προϊόντος θα πρέπει να ερμηνεύονται. 9. Τα προϊόντα PCR από ένα άτομο που φέρει οποιαδήποτε από τις μεταλλάξεις A455E, 2183AA>G, 3659delC, 1078delT, ΔI507, R347P, R553X και E60X θα παρατηρηθούν στη διαδρομή του φιαλιδίου C του πηκτώματος και ταυτοποιούνται με σύγκριση της θέσης της ζώνης με μια διπλανή διαδρομήδείκτη. Τα μεγέθη των ζωνών του προϊόντος στα ζεύγη βάσεων φαίνονται στην Εικόνα 1. Μόνο οι σωστού μεγέθους ζώνες του προϊόντος θα πρέπει να ερμηνεύονται. CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 10 από 13

10. Τα προϊόντα PCR από ένα άτομο που φέρει οποιαδήποτε από τις μεταλλάξεις 3120+1G>A, 2789+5G>A, 1898+1G>A, 711+1G>T, G85E, 2184delA και R560T θα παρατηρηθούν στη διαδρομή του φιαλιδίου D του πηκτώματος και ταυτοποιούνται με σύγκριση της θέσης της ζώνης με μια διπλανή διαδρομή-δείκτη.τα μεγέθη των ζωνών του προϊόντος στα ζεύγη βάσεων φαίνονται στην Εικόνα 1. Μόνο οι σωστού μεγέθους ζώνες του προϊόντος θα πρέπει να ερμηνεύονται. Σημείωση: Λόγω της πολυπλοκότητας των μειγμάτων εκκινητών σε κάθε φιαλίδιο, ενδέχεται να εμφανιστούν τεχνητά προϊόντα εκκινητών που αντιστοιχούν στο μέγεθος <97 ζευγών βάσεων στις διαδρομές φιαλιδίων των δειγμάτων εξέτασης και υλικών ελέγχου. Η Εικόνα 1 δείχνει διαγραμματικά το μέγεθος στα ζεύγη βάσεων και την σχετική τοποθεσία των προϊόντων PCR σε ένα πήκτωμα για όλες τις μεταλλάξεις που εξετάστηκαν. Αν και δεν αξιολογήθηκαν όλοι συνδυασμοί μεταλλάξεων, είναι δυνατό να ανιχνευθούν σύνθετα ετεροζυγωτά χρησιμοποιώντας το κιτ Elucigene CF29v2. Εικόνα 1 CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 11 από 13

Επικύρωση εξέτασης Δείγματα ολικού αίματος και αποξηραμένων κηλίδων αίματος με γνωστό γενότυπο εξετάστηκαν με μια εσωτερική μελέτη. Το DNA παρασκευάστηκε σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται στις παρούσες Οδηγίες Χρήσης. Σύνθετα ετεροζυγωτά ανιχνεύθηκαν με επιτυχία από το κιτ και όλα τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με το γνωστό γενότυπο που λαμβάνεται με εναλλακτικές μεθόδους. Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα Κατά τη διάρκεια δημιουργίας της δοκιμασίας ελήφθησαν μέτρα για αποφυγή επηρεασμού της λειτουργίας της δοκιμασίας από παρουσία άλλων αναφερόμενων πολυμορφισμών και μεταλλάξεων στο γονίδιο CFTR (8). Οι ακόλουθες σπάνιες μεταλλάξεις αξιολογήθηκαν για διασταυρούμενη αντιδραστικότητα και δεν ανιχνεύτηκαν από το κιτ Elucigene CF29v2: R1283M, 1717-2A>G, R117C, 621+2T>C, R117L, I506V. Επιπλέον, η δοκιμασία δεν ανίχνευσε τους παρακάτω πολυμορφισμούς: 3617G/T, 1655T/G (F508C), 1651A/G. Η αξιολόγηση των γνωστών μεταλλάξεων και πολυμορφισμών στο γονίδιο CFTR πρόβαλε τις εξής επιδράσεις στα αποτελέσματα του κιτ Elucigene CF29v2: 1. Το ΔI507 σε συνδυασμό με το dup1716+51>61 θα παράγουν ένα προϊόν PCR 233bp στο φιαλίδιο Γ αντί το αναμενόμενο 222bp. 2. Παρατηρήθηκε ελαφρά διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του εκκινητή R347P στο φιαλίδιο Γ με την σπάνια μετάλλαξη R347H που προκύπτει σε εξασθενημένο προϊόν PCR ορατό στην θέση R347P στο φιαλίδιο Γ. 3. Μία μετάλλαξη που αναφέρθηκε πρόσφατα, η 2184insG (12), θεωρητικά θα αντιδράσει διασταυρωμένα με τον εκκινητή 2183AA>G στο φιαλίδιο Γ. Μια διαγνωστική ζώνη 2183AA>G ενδέχεται να υποδεικνύει ότι η μετάλλαξη 2184insG είναι παρούσα. 4. Ο εκκινητής 2184delA θα αντιδράσει διασταυρωμένα με την μεταλλαγμένη αλληλουχία DNA 2183AA>G και θα προκύψει σε ορατή «διαγνωστική» ζώνη στο πήκτωμα από το φιαλίδιο Δ. Συνεπώς, η μετάλλαξη 2184delA θα καταλήξει μόνο σε μία διαγνωστική ζώνη από το φιαλίδιο Δ, ενώ η μετάλλαξη 2183AA>G καταλήγει σε διαγνωστική ζώνη και στη Γ και στο Δ φιαλίδιο. 5. Οι ακόλουθες μεταλλάξεις, που δεν ελέγχθηκαν λόγω μη διαθεσιμότητας των σχετικών δειγμάτων, ενδέχεται να επηρεάσουν τη λειτουργία της δοκιμασίας: R117P, 621+2T>G, R553G, R553Q, R347L, I506T, I506S και ο σπάνιος συνδυασμός ΔI507 με τον πολυμορφισμό 1651A/G. 6. Μια μετάλλαξη που αναφέρθηκε προσφάτως F316L (12), θα έρθει σε διασταυρούμενη αντίδραση με τον εκκινητή 1078delT. Μια διαγνωστική ταινία στη θέση 1078delT στο μείγμα C μπορεί να φανερώσει παρουσία της μετάλλαξης F316L. CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 12 από 13

Περιορισμοί της διαδικασίας 1. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από αυτό ή κάποιο άλλο διαγνωστικό κιτ θα πρέπει να χρησιμοποιούνται και να ερμηνεύονται λαμβάνοντας πάντα υπόψη τη συνολική κλινική εικόνα του ασθενούς. Η Elucigene Diagnostics δεν είναι υπεύθυνη για οποιαδήποτε κλινική απόφαση λαμβάνεται. 2. Η ανίχνευση της απουσίας των μεταλλάξεων από αυτό το κιτ δεν είναι εγγύηση ότι δεν είναι παρούσες άλλες παραλλαγές του γονιδίου CFTR. Είναι δυνατόν να υπάρχουν και πολλές άλλες μεταλλάξεις και δεν ανιχνεύονται από αυτό το κιτ. 3. Η συχνότητα των μεταλλάξεων ποικίλει μεταξύ διαφορετικών πληθυσμών. Τα δεδομένα για την συχνότητα των μεταλλάξεων σε πληθυσμούς διατίθενται από την The Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium (8). Ο χρήστης αυτού του κιτ θα πρέπει να δώσει έμφαση σε αυτά τα σημεία όταν αναφέρει τα αποτελέσματα στον κλινικό ιατρό ή τον σύμβουλο επί της γενετικής. Αναφορές 1. Welsh MJ et al. In Scriver CR et al (eds), The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. McGraw-Hill, New York: 3799-3876 (1995). 2. Elborn JS et al. Cystic Fibrosis: current survival and population estimates to the year 2000. Thorax 46: 881-885 (1991). 3. Riordan JR et al. Identification of the Cystic Fibrosis Gene. Cloning and Characterization of Complementary DNA. Science 245: 1066-1073 (1989). 4. Rommens JM et al. Identification of the Cystic Fibrosis Gene. Chromosome Walking and Jumping. Science 245: 1059-1065 (1989). 5. The Cystic Fibrosis Mutation Database website at: http://www.genet.sickkids.on.ca 6. Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: 2503-2516 (1989). 7. Estivill X et al. Geographic distribution and regional origin of 272 cystic fibrosis mutations in European populations. Hum Mut 10:135-154 (1997). 8. The Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium. Hum Mutat 4: 167-177 (1994). Πληροφορίες διατίθενται επίσης στον ιστότοπο: http://www.genet.sickkids.on.ca 9. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343: 1509-1510 (1994). 10. de Vries HG et al. Validation of the determination of ΔF508 mutations of the CF gene in over 11000 mouthwashes. Hum Genet 97: 334-336 (1996). Το ELUCIGENE είναι σήμα κατατεθέν της Delta Diagnostics (UK) Ltd. Το ARMS είναι σήμα κατατεθέν της AstraZeneca UK Ltd. Το NUSIEVE είναι σήμα κατατεθέν της Lonza. Το AMPLITAQ GOLD είναι σήμα κατατεθέν της Roche Molecular Systems Inc. Copyright 2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd CF029BYEN 001 Sep-2014 Σελίδα 13 από 13