ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΙΟΝΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΣΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΛΟΥΝ ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ι ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΙΟΝΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΣΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΛΟΥΝ ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ Δ. ΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ 2007

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Π.Μ.Σ στις ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ι ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΙΟΝΤΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΣΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΛΟΥΝ ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ Δ. ΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ 2007

Το πραγματικό ταξίδι της ανακάλυψης δεν απαιτεί μόνο την αναζήτηση νέων τόπων, αλλά και το να έχεις καινούργια μάτια. Marcel Proust

ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Δημήτριος Λ. Καλπαξής Διονύσιος Συνετός Γεώργιος Ντίνος Διονύσιος Δραΐνας Νικόλαος Καραμάνος Χριστόδουλος Φλωρδέλλης Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Επίκουρος Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Βιολογικής Χημείας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Βιοχημείας Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Φαρμακολογίας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Θεοδώρα Χολή-Παπαδοπούλου Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Aναπλ. Καθηγήτρια Βιοχημείας Τμήμα Χημείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Eργαστήριο Βιολογικής Χημείας του Tμήματος Ιατρικής στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών στις «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Μέρος της πραγματοποιήθηκε στην ερευνητική ομάδα του Καθηγητή Dr. Knud H. Nierhaus στο Max-Planck Institute for Molecular Genetics στο Βερολίνο. Μετά την ολοκλήρωσή της θέλω να ευχαριστήσω τους ανθρώπους που συνέβαλαν ο καθένας με το δικό του τρόπο στην προσπάθειας αυτή. Το «δάσκαλο» Καθηγητή Δρ. Δημήτριο Καλπαξή, ο οποίος με την καθοδήγησή του, την υπομονή του και τη βοήθειά του συντέλεσε ώστε να περατωθεί αυτή η διατριβή με τον καλύτερο δυνατό και παραγωγικό τρόπο. Επίσης, τον ευχαριστώ για τη μύησή μου στο χώρο της έρευνας, τη μεταφορά του τρόπου σκέψης του και για τη συνεχή υποστήριξη και αγάπη που δείχνει προς την ερευνητική του ομάδα. Τον Καθηγητή Dr. Knud Nierhaus για τη συνεργασία, καθοδήγηση, μετάδοση γνώσεων και τη δυνατότητα συμμετοχής μου στη διοργάνωση του 9 ου Workshop on «Experimental Strategies for Ribosomal Research». Επίσης, τον ευχαριστώ για τη φιλική υποστήριξη στο εργαστήριό του καθώς και για τον ιδιαίτερο τρόπο σκέψης που μου έδειξε για να προσεγγίζω και να αντιμετωπίζω επιστημονικά ερωτήματα. Τον Καθηγητή Δρ. Διονύσιο Συνετό για τις χρήσιμες παρεμβάσεις του, τη συνεργασία, την υποστήριξη και την κατανόηση καθόλη τη διάρκεια της διατριβής μου. Κυρίως όμως, τον ευχαριστώ για τις συμβουλές του, ώστε να επιτύχω να αποδόσω τη σκέψη μου με τον πιο σωστό και ακριβή τρόπο. Τον Επίκουρο Καθηγητή Δρ. Γεώργιο Ντίνο, στα βήματα του οποίου πορεύτηκα, για τη συνεργασία, την κατανόηση και την υποστήριξη όλα αυτά τα χρόνια στο εργαστήριο, καθώς και για τη μεταφορά και επεξήγηση ιδιαίτερων κινητικών πρωτοκόλλων και εννοιών.

Τον Καθηγητή Δρ. Διονύσιο Δραΐνα για τις δυναμικές παρεμβάσεις του κατά την πορεία της διατριβής μου καθώς και για τη δημιουργία νέου κλίματος στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας. Τον Καθηγητή του Τμήματος Χημείας Δρ. Νικόλαο Καραμάνο για την υποστήριξη όλα αυτά τα χρόνια με έναν ιδιαίτερο τρόπο καθώς και για τις νέες προοπτικές που δίνει στο χώρο της έρευνας, που κέντρησαν περισσότερο το ενδιαφέρον για το χώρο αυτόν. Τον Καθηγητή Φαρμακολογίας Δρ. Χριστόδουλο Φλωρδέλλη για τις παρατηρήσεις του και για τη θεώρηση της διατριβής από διαφορετικό πρίσμα, που συντέλεσε στην αρτιότερη τελική της παρουσίαση. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, Δρ. Θεοδώρα Χολή- Παπαδοπούλου για την προθυμία της και την τιμή που μου έκανε να συμμετάσχει στην Εξεταστική Επιτροπή καθώς και για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας που έχει αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια με την ερευνητική μας ομάδα. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Χημείας Δρ. Νικολέττα Παπαγεωργακοπούλου που με καθοδήγησε προς αυτήν την πορεία και την αισθανόμουνα δίπλα μου όλα αυτά τα χρόνια και τον Καθηγητή Δρ. Δημήτριο Βύνιο που το γραφείο του ήταν πάντα ανοιχτό. Την ερευνητική ομάδα του Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας: τη Δρ. Μαρία Ξαπλαντέρη για τη βοήθεια στην εκμάθηση των πρώτων τεχνικών του Εργαστηρίου, την Αικατερίνη Κούβελα που χωρίς τη βοήθεια και τη συμπαράστασή της δε θα είχε επιτευχθεί μεγάλο μέρος της μελέτης, τη Σμαράγδα Τσελίκα για τη συνεργασία και την υπομονή της, το Γεώργιο Γερμπανά και τη Σοφία Πυθαροπούλου για τη συνεργασία και την κατανόηση καθώς και τους προπτυχιακούς φοιτητές που βοήθησαν σε αυτήν τη διατριβή Αγγελική και Δανάη. Επίσης, ευχαριστώ τα μέλη ΔΕΠ του εργαστηρίου καθώς και τους Δρ. Θεόδωρο Κωνσταντινίδη, Δρ. Παναγιώτη Πανόπουλο, Δρ. Παναγιώτη Καραχάλιο, Δρ. Δήμητρα Καλαβρυζιώτη, Δρ. Παναγιώτη Ζήρο, Αναστάσιο Βουρεκά, Διονύσιο Χαρτουμπέκη, Χρυσαυγή Τουμπέκη και Βίκυ Σταματοπούλου

για τις πολλές ώρες που μοιραστήκαμε αρμονικά στο Εργαστηρίο Βιολογικής Χημείας. Την Κασσιανή Λιόπετα και τον Οδυσσέα Δημητρακόπουλο του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας καθώς και τη Μαρία Δημάκη, Βασίλη Ρούκο, Μαρία Ηλιού, Μαρία Χονδρού και Σταύρο Πολυβίου του Εργαστηρίου Βιολογίας για τη βοήθεια και την αλληλοκατανόηση κατά τη διάρκεια της διατριβής μου. Την επιστημονική ομάδα του Max-Planck Institute: Dr. Daniel Wilson για την εκμάθηση επεξεργασίας των κρυσταλλογραφικών δεδομένων, Dr. Madina Iskakova και Witold Szaflarski για τη βοήθειά τους στην κατανόηση του RTS συστήματος, την Romi Gupta που μου έδειξε τις μεθόδους γενετικής, την Daniela Wittek, τον Oliver Vesper, την Edda Einfeidt και την Zhala Karim που ήταν πάντα πρόθυμοι να βοηθήσουν καθώς και την Κατερίνα Tσαγκαλιά και τον Αλέξανδρο Κατρανίδη για τη συνεργασία. Τους χημικούς φίλους Δρ. Αντρέα Ρουσσίδη, Δρ. Χρήστο Χώχο και Θωμά Γαρνέλη για τη συμπαράσταση και συμπόρευση όλα αυτά τα χρόνια. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω τους γονείς μου και την αδελφή μου, Σοφία, για την αγάπη που μου προσφέρουν η οποία είναι απαραίτητη για κάθε βήμα της ζωής μου. Ευχαριστώ την Επιτροπή Ερευνών του Πανεπιστημίου Πατρών (Πρόγραμμα Καραθεoδωρή), το Max-Planck Institute for Molecular Genetics, τον οργανισμό FEBS, την εταιρεία Pfizer Hellas και κυρίως, τους γονείς μου για την οικονομική υποστήριξη που μου προσέφεραν, έτσι ώστε να υλοποιηθεί η διδακτορική διατριβή.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ... 14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2. ΡΙΒΟΣΩΜΑ: Το εργοστάσιο βιοσύνθεσης πρωτεϊνών 16 2.1 Δομή ριβοσώματος... 16 2.2 Λειτουργία ριβοσώματος... 19 Στάδιο έναρξης... 21 Στάδιο επιμήκυνσης... 22 Στάδιο τερματισμού... 25 3. ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ: Αναστολείς της ριβοσωματικής λειτουργίας 27 3.1 Εισαγωγικά... 27 3.2 Αντιβιοτικά που μιμούνται το CCA άκρο του αα-trna... 29 Πουρομυκίνη... 29 Βλαστισιδίνη... 31 3.3 Μακρολίδια... 32 4. ΙΟΝΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ: Επίδραση στη ριβοσωματική λειτουργία 45 5. ΣΤΟΧΟΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 53 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 6. ΥΛΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ 55 6.1 Υλικά... 55 6.2 Διαλύματα... 57 6.2.1 Ηλεκτροφόρησης και χρώσης... 57 6.2.2 Για λειτουργικές μελέτες και παρασκευαστικές μεθόδους... 58 6.2.3 Για μικροβιολογικές και μοριακές μεθόδους... 60 6.2.4 Συστατικά του in vitro συζευγμένου συστήματος μεταγραφήςμετάφρασης... 61 6.2.5 Διαλύματα αντιβιοτικών... 62 7. ΜΕΘΟΔΟΙ 62 7.1 Αναλυτικές Μέθοδοι... 62 7.1.1 Φωτομέτρηση... 62 Προσδιορισμός συγκέντρωσης ριβοσωμάτων και νουκλεϊκών οξέων... 62 Παράγοντες μετατροπής για ποσοτικοποίηση νουκλεϊκών οξέων 62 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης πουρομυκίνης... 63 7.1.2 Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών... 63 7.1.3 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης... 63 7.1.4 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου... 64 Πρωτεϊνών... 64 Νουκλεϊκών οξέων... 65 Ανάλυση αλληλουχίας... 65 7.1.5 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)... 66 7.2 Βιοχημικές παρασκευές ριβοσωματικών συστατικών... 66 7.2.1 Μεγάλης κλίμακας καλλιέργειες E. coli... 66

7.2.2 Παρασκευή S-30... 67 7.2.3 Παρασκευή κλάσματος S-100... 67 7.2.4 Παρασκευή κλάσματος S-100 ελεύθερου από trna... 68 7.2.5 Παρασκευή κλάσματος FWR... 69 7.2.6 Παρασκευή πλυμένων 70S ριβοσωμάτων... 69 7.2.7 Παρασκευή ριβοσωμάτων (70S) υψηλής καθαρότητας... 70 7.2.8 Απομόνωση 30S και 50S ριβοσωματικών υπομονάδων... 70 7.2.9 Παρασκευή επανασυζευγμένων 70S ριβοσωμάτων... 71 7.2.10 Έλεγχος καθαρότητας και λειτουργικότητας ριβοσωμάτων... 72 7.2.11 Απομόνωση των ριβοσωματικών πρωτεϊνών (TP50)... 72 7.2.12 Απομόνωση μείγματος 23S και 5S rrna... 73 7.2.13 Απομόνωση 5S rrna... 74 7.2.14 Παρασκευή AcPhe-tRNA... 75 7.3 In vitro συστήματα / Λειτουργικές μελέτες... 76 7.3.1 Πρόσδεση υποστρωμάτων στο ριβόσωμα (Binding)... 76 Ολική πρόσδεση... 77 Πρόσδεση στην Α- θέση... 77 Πρόσδεση στην Ρ- θέση... 77 7.3.2 Σχηματισμός εναρκτήριου ριβοσωματικού συμπλόκου C... 78 7.3.3 Αντίδραση πουρομυκίνης... 78 Πειραματική πορεία... 78 Κινητική ανάλυση και εύρεση των καταλυτικών παραμέτρων... 79 7.3.4 Αναστολή δημιουργίας πεπτιδικού δεσμού από αντιβιοτικά... 82 7.3.5 Πειράματα συναγωνισμού δυο αντιβιοτικών... 83 7.3.6 Πειράματα αναγέννησης συμπλόκου C... 83 7.3.7 Σύνθεση poly(phe)... 84 7.3.8 Ανασυγκρότηση της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας... 85 7.3.9 Μελέτη της μετατόπισης των υποστρωμάτων... 85 7.3.10 Συζευγμένο σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης... 87 Green Fluorescent Protein - Πλασμίδιο pivex2.2-gfpcyc3... 88 Αναστολή συζευγμένου συστήματος μεταγραφής-μετάφρασης από αναστολείς της πρωτεϊνικής σύνθεσης... 89 Ποσοτικοποίηση της συνολικής και ενεργής GFP... 89 7.4 Μέθοδοι γενετικής... 90 7.4.1 Παρασκευή E. coli δεκτικών κυττάρων... 90 7.4.2 Μετασχηματισμός κυττάρων... 91 7.4.2 Απομόνωση πλασμιδίου... 91 Μικρής κλίμακας (Mini-prep)... 91 Μεγάλης κλίμακας (Maxi-prep)... 92 7.5 Φωτοσήμανση συγγενείας... 92 7.5.1 Σύνθεση της φωτοδραστικής ABA-σπερμίνης... 93 7.5.2 Φωτοσήμανση ριβοσωματικών συστατικών... 95 Φωτοσήμανση συμπλόκου C και ριβοσωματικών υπομονάδων... 95 Φωτοσήμανση rrna... 95 7.6 Ανάλυση αποτυπώματος (Footprinting Analysis)... 95 7.6.1 Παρασκευή συμπλόκων αντιβιοτικών - ριβοσωμάτων... 96 7.6.2 Χημική Τροποποίηση... 97

7.6.3 Εκχύλιση του rrna... 101 7.6.4 Ανάλυση με προέκταση εκκινητή... 102 8. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 8.1 Μηχανισμός δράσης αντιβιοτικών (Κινητική ανάλυση)... 105 8.1.1 Βλαστισιδίνη... 105 Αναστολή πεπτιδικού δεσμού σε χαμηλές συγκεντρώσεις... 105 Αναστολή πεπτιδικού δεσμού σε υψηλές συγκεντρώσεις... 110 8.1.2 Τυλοσίνη... 112 Αναστολή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης... 112 Εύρεση κινητικών παραμέτρων... 112 Αποδέσμευση του αντιβιοτικού από το ριβόσωμα... 114 8.1.3 Ερυθρομυκίνη... 114 Πειράματα συναγωνισμού (χωρίς προεπώαση)... 115 Πειράματα προεπώασης με ερυθρομυκίνη... 116 Αποδέσμευση ερυθρομυκίνης από το ριβόσωμα...... 117 8.1.4 Αζιθρομυκίνη και Τελιθρομυκίνη... 118 8.2 Επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος στη δράση των αντιβιοτικών.. 120 8.2.1 Οι πολυαμίνες αυξάνουν την ανασταλτική δράση της βλάστισιδίνης... 120 8.2.2 Οι πολυαμίνες μειώνουν την πρόσδεση των μακρολιδίων στο ριβόσωμα... 121 8.2.3 Χαμηλή συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+ μειώνει τη δράση της βλαστισιδίνης και αυξάνει τη δράση των μακρολιδίων... 124 8.3 Ταυτοποίηση θέσεων πρόσδεσης ABA-σπερμίνης στην περιοχή πρόσδεσης των αντιβιοτικών... 125 8.4 Επιβεβαίωση μηχανισμού δράσης και επίδρασης πολυαμινών με ανάλυση αποτυπώματος... 129 8.5 Επίδραση των αντιβιοτικών σε συζευγμένο σύστημα μεταγραφήςμετάφρασης... 136 8.6 Έλεγχος της επιδράσης των πολυαμινών και των αντιβιοτικών στη λειτουργία της μετατόπισης των υποστρωμάτων... 141 9. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 9.1 Μηχανισμός δράσης της βλαστισιδίνης και επίδραση των πολυαμινών 147 9.2 Μηχανισμός δράσης μακρολιδίων και επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος... 150 Τυλοσίνη 150 Ερυθρομυκίνη 154 Αζιθρομυκίνη 156 Τελιθρομυκίνη 159 9.3 Σύγκριση της ισχύος των μακρολιδίων 160 10. ΣΥΝΟΨΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ/ SYNOPSIS OF THESIS 167 11. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 177 12. ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ 195

1. ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ Ǻ Angstrom LB- Luria-Bertani- A 260 Οπτική απορρόφηση στα 260nm MgAc Οξεικό μαγνήσιο aa-trna Αμινοακυλο-tRNA mq milliq Η 2 Ο ABA- Αζιδο-βενζαμιδινο- NaAc Οξεικό νάτριο AcPhe- Ακετυλ-φαινυλαλανίνη NH 4 Ac Οξεικό αμμώνιο β-etsh Βήτα-μερκαπτοαιθανόλη o/n overnight BSA Αλβουμίνη ορού βοός PAA Πολυακρυλαμίδιο CMCT 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluene sulphonate PCR Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης cpm counts per minute PDB Protein Data Bank Da dalton Phe Φαινυλαλανίνη dntp Δεόξυ-τριφωσφορικά νουκλεζίδια PI Προ-επώαση ddntp Δι-δεοξυ τριφωσφορικά νουκλεζίδια Poly(U) poly-uridine mrna DMS Διμεθυλ-θειϊκό PTάση Πεπτιδυλοτρανσφεράση D.r Deinococcus radiodurans Puro Πουρομυκίνη DTT Διθειοθρεϊτόλη RF Παράγοντας απελευθέρωσης E. coli Escherichia coli RNAp RNA πολυμεράση EFG Παράγοντας επιμήκυνσης G RNάση Ριβονουκλεάση EF-Ts Παράγοντας επιμήκυνσης Ts rpm rounds per minute EF-Tu Παράγοντας επιμήκυνσης Τu RRF Παράγοντας Ανακύκλωσης EtBr Βρωμιούχο αιθίδιο RTS Rapid Translation System EtOH Αιθανόλη S Μονάδα Svedberg e.u. Ισοδυναμη μονάδα SD Αλληλουχία Shine-Dalgarno fmet- Φoρμυλ-μεθειονυλο- Spd Σπερμιδίνη GFP Πράσινο-φθορίζουσα πρωτεΐνη Spm Σπερμίνη H.m Haloarcula marismortui TCA Τριχλωρο οξεικό IC 50 Συγκέντρωση αντιβιοτικού για 50% trna Met f Ειδικό trna για τη αναστολή φoρμυλο- μεθειονίνη IF Παράγοντας έναρξης UV Υπεριώδης ακτινοβολία K d Σταθερά διάστασης k eq Σταθερά ισορροπίας K i Σταθερά αναστολής KE Κεθοξάλη

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εισαγωγή Η βιοσύνθεση των πρωτεϊνών είναι αποτέλεσμα της ριβοσωματικής δραστηριότητας. Τα ριβοσώματα είναι κυτταροπλασματικά οργανίδια, αποτελούμενα από ριβοσωματικό RNA (rrna) και ριβοσωματικές πρωτεΐνες (r-proteins). Ανεξαρτήτως είδους, τα ριβοσωματικά συστατικά συγκροτούν δύο πολύπλοκες και ανόμοιες νουκλεοπρωτεϊνικές δομές, τις ριβοσωματικές υπομονάδες. Η λεπτομερής δομή και το πλήθος των ριβοσωματικών συστατικών ποικίλλει στους διάφορους οργανισμούς και η διαδικασία της μετάφρασης περιπλέκεται, όσο οι οργανισμοί ανέρχονται στις εξελικτικές βαθμίδες. Οι διαφορές αυτές αποτελούν εν μέρει τη βάση της διαφορετικής ανταπόκρισης των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων έναντι της δράσης αντιβιοτικών. Τα αντιβιοτικά ποικίλλουν στη χημική τους δομή και αναστέλλουν ειδικά βήματα της μεταφραστικής διαδικασίας (Spahn and Prescott, 1996). Η κατανόηση του μηχανισμού δράσης ενός αντιβιοτικού αναστολέα της πρωτεϊνικής σύνθεσης δεν παρέχει μόνον πληροφορίες για τη φαρμακευτική δράση της ένωσης αυτής καθ αυτής, αλλά συντελεί επίσης στη χαρτογράφηση της ριβοσωματικής περιοχής-στόχου και αποκαλύπτει σχέσεις δομής και λειτουργίας. 2. Ριβόσωμα: Τo εργοστάσιο βιοσύνθεσης πρωτεϊνών 2.1 Δομή ριβοσώματος Η μετάφραση των mrna λαμβάνει χώρα στα ριβοσώματα. Τα ριβοσώματα είναι ένα από τα κύρια υποκυτταρικά οργανίδια και στο εντεροβακτήριο Escherichia coli, στη λογαριθμική φάση ανάπτυξής του αποτελούν περίπου το 50% της συνολικής ξηρής κυτταρικής μάζας (Jinks, 1984). Το βακτηριακό ριβόσωμα είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο με μοριακή μάζα περίπου 2.6-2.8 ΜDa, διάμετρο 200-250 Å και εμφανίζει συντελεστή καθίζησης 70S. Αποτελείται από δυο ασύμμετρες ριβοσωματικές

υπομονάδες, μια μικρή (30S) και μια μεγάλη (50S). Η μικρή υπομονάδα (30S) συγκροτείται από ένα είδος rrna, το 16S rrna (1542 nt) και 21 ριβοσωματικές πρωτεΐνες (S1, S2,, S21). Αντιστοίχως, η μεγάλη υπομονάδα, 50S, αποτελείται από δυο είδη rrna, το 5S (120 nt) και το 23S rrna (2904 nt) και από 33 ριβοσωματικές πρωτεΐνες (L1, L2,, L33). (Σχήμα 2.1). Το rrna αποτελεί περίπου τα δυο τρίτα της συνολικής μάζας του ριβοσώματος και φαίνεται να παίζει τον κύριο ρόλο κατά την πρωτεϊνική σύνθεση (Moore and Steitz, 2002; Ramakrishnan and Moore, 2001). Σχήμα 2.1: Σύσταση του βακτηριακού ριβοσώματος Τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα είναι αρκετά μεγαλύτερα από τα προκαρυωτικά και περιέχουν περισσότερα συστατικά. Παρόλα αυτά, προσομοιάζουν στη δομή και στη λειτουργία των προκαρυωτικών ομολόγων τους (Dube et al., 1998; Ramakrishnan and Moore, 2001). Οι δυο ριβοσωματικές υπομονάδες διαφέρουν στη δομή και στη λειτουργία. Δομικά, η 50S υπομονάδα είναι σφαιρική με τρεις κυλινδρικές προεξοχές: την L1, την κεντρική προεξοχή και την L7/L12 (Σχήμα 2.2). Μια αξιοσημείωτη διαφορά μεταξύ των δυο υπομονάδων αφορά τη διάταξη των δευτεροταγών δομών των rrna και τη μορφολογία τους. Οι έξι τομείς (domains) της δευτεροταγούς δομής του rrna της 50S υπομονάδας περιπλέκονται μεταξύ τους και σχηματίζουν μια συμπαγή δομή. Από τη άλλη πλευρά, το rrna της 30S υπομονάδας διαχωρίζεται σε τρεις περιοχές

(κεφαλή, σώμα και πλατφόρμα). Κάθε μια από τις περιοχές περιέχει ένα από τους βασικούς τομείς της δευτεροταγούς δομής του 16S rrna: o 5 τομέας αντιστοιχεί στο σώμα, ο κεντρικός τομέας στην πλατφόρμα και ο 3 τομέας στην κεφαλή της μικρής υπομονάδας. Ο 3 τομέας του 16S rrna δημιουργεί μια εκτεταμένη έλικα (h44, σε αρίθμηση E. coli) που αλληλεπιδρά με την 50S υπομονάδα. Όλοι οι τομείς της 30S υπομονάδας ενώνονται στην στενή περιοχή που σχηματίζει το λαιμό. Τα δυο ενεργά κέντρα του ριβοσώματος (κέντρο αποκωδικοποίησης και κέντρο της PTάσης) αντικρύζουν το ένα το άλλο στη διφασική περιοχή των δυο υπομονάδων και είναι λειτουργικά ενωμένα μέσω του αμινοακυλο-trna (aa-trna) και μιας γέφυρα μεταξύ των υπομονάδων (γέφυρα Β2β). H αρχιτεκτονική διαφορά μεταξύ των υπομονάδων πιθανόν αντανακλά τη μεγάλη λειτουργική ανάγκη της μικρής υπομονάδας για ευελιξία και όχι απαραίτητα την εξελικτική πορεία των δυο υπομονάδων, όπου η μεγάλη φαίνεται να είναι παλαιότερη (Sardesai et al., 1999). Σχήμα 2.2: Δομή των 50S και 30S υπομονάδων, όπως προκύπτει από κρυσταλλογραφικές μελέτες σε 70S ριβοσώματα (Ramakrishnan, 2002). Σημειώνονται οι Α-, Ρ-, και Ε- θέσεις πρόσδεσης των trna υποστρωμάτων, η διαδρομή του mrna καθώς και διάφορα δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των δυο υπομονάδων. Κρυο-ηλεκτρονική μικροσκοπία και κρυσταλλογραφική ανάλυση των 70S ριβοσωμάτων δείχνουν έναν μεγάλο αριθμό συντηρημένων συνδέσεων

(γέφυρες) μεταξύ των δυο υπομονάδων (Cate et al., 1999; Frank et al., 1995; Gabashvili et al., 2000). Οι περιοχές που προσδένουν mrna και trna, είναι ελεύθερες πρωτεϊνών. Το trna χρησιμοποιείται από το ριβόσωμα ως προσαρμοστικό μόριο αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας που κωδικοποιείται από το mrna. Αρχικά, είχαν προταθεί δυο θέσεις πρόσδεσης των trna για το ριβόσωμα: η Α-θέση για το aa-trna και η Ρ- θέση για το πεπτιδυλο-trna (Lipmann, 1963; Watson, 1963). Λειτουργικές μελέτες, όμως, στις αρχές του 80 (Grajevskaja et al., 1982; Rheinberger et al., 1981) και μελέτες κρυοηλεκτρομικροσκοπίας καθώς και περίθλασης ακτίνων X απεκάλυψαν και μια τρίτη θέση πρόσδεσης trna, την Ε- θέση (Exit site). Μέσω της θέσεως αυτής, το αποακυλιωμένο trna εγκαταλείπει το ριβόσωμα (Agrawal et al., 2000; Korostelev et al., 2006; Nierhaus et al., 1998; Selmer et al., 2006; Wadzack et al., 1997; Yusupov et al., 2001; Yusupova et al., 2006). 2.2 Λειτουργία του ριβοσώματος Λειτουργικά, στην 30S υπομονάδα λαμβάνει χώρα η αλληλεπίδραση κωδικονίου-αντικωδικονίου μεταξύ του mrna και των trnas, δηλαδή η διαδικασία της αποκωδικοποίησης. Αντίστοιχα, στην μεγάλη υπομονάδα εδράζεται το καταλυτικό κέντρο του ριβοσώματος, η πεπτιδυλοτρανσφεράση (PTάση), όπου λαμβάνει χώρα η δημιουργία πεπτιδικού δεσμού μεταξύ της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας και του νεοεισερχόμενου aatrna. Ένα άλλο χαρακτηριστικό της μεγάλης υπομονάδας είναι το τούνελ εξόδου, απ όπου η νεοσυντιθέμενη αλυσίδα εξέρχεται από το ριβόσωμα στο κυτόπλασμα (ενδοπλασματικό δίκτυο). Το μήκος του από το κέντρο της PTάσης μέχρι την έξοδο είναι περίπου 100 Å και έχει πλάτος 10-20 Å (Ban et al., 2000; Stark et al., 1995). Επιπρόσθετα, στη μεγάλη υπομονάδα εδράζεται το κέντρο πρόσδεσης των G μεταφραστικών παραγόντων. Για τη μετατόπιση (translocation) των υποστρωμάτων (trnas) από την Α-/Ρ- στην Ρ-/Ε- θέση του ριβοσώματος, εμπλέκονται και οι δυο υπομονάδες.

Η διαδικασία της βιοσύνθεσης των πρωτεϊνών μπορεί να χωριστεί από άποψη μηχανισμού σε τρία στάδια: το στάδιο της έναρξης, της επιμήκυνσης και του τερματισμού (Σχήμα 2.3). Εν συντομία, κατά τη διάρκεια της έναρξης το mrna τοποθετείται με το AUG αρχικό κωδικόνιο στην Ρ- θέση της μικρής υπομονάδας και η μεγάλη υπομονάδα προσδένεται. Κατά την επιμήκυνση το ριβόσωμα αποκωδικοποιεί τα διαδοχικά κωδικόνια του mrna, συνθέτοντας την πρωτεΐνη μέχρι τον τερματισμό αυτής. Ο τερματισμός σηματοδοτείται, όταν ένα κωδικόνιο λήξης βρεθεί στην Α-θέση. Η λήξη της πρωτεϊνοσύνθεσης ακολουθείται από απελευθέρωση του πολυ-πεπτιδίου και διαχωρισμό των υπομονάδων. Σε κάθε στάδιο εμπλέκονται οι αντίστοιχοι μεταφραστικοί παράγοντες της έναρξης (ΙFs, Initiation Factors), της επιμήκυνσης (EFs, Elongation Factors) και του τερματισμού ή της απελευθέρωσης (RFs, Release Factors). Σχήμα 2.3: Λειτουργικές καταστάσεις του ριβοσώματος κατά την πρωτεϊνική σύνθεση Στάδιο Έναρξης Κατά το στάδιο της έναρξης της πρωτεϊνικής σύνθεσης, η μικρή υπομονάδα μαζί με το fmet-trna fmet σχηματίζει το εναρκτήριο

ριβοσωματικό σύμπλοκο (30S υπομονάδα mrna fmet-trna στην P-θέση) (Σχήμα 2.4). Η πλούσια σε πουρίνες αλληλουχία Shine-Dalgarno (SD) που προηγείται του AUG κωδικονίου, είναι συμπληρωματική της 16S rrna (αντι- SD) αλληλουχίας πλησίον του 3 άκρου του (Gualerzi and Pon, 1990) και βοηθάει στην εύρεση του αρχικού AUG κωδικονίου. Τρεις παράγοντες έναρξης (IFs) εμπλέκονται στο στάδιο αυτό: i) ο IF1 που μιμείται τη θηλειά του αντικωδικονίου του trna και όπως έχει δειχθεί προσδένεται στην Α- θέση του ριβοσώματος (Carter et al., 2001; Dahlquist and Puglisi, 2000), ii) ο IF3 που αλληλεπιδρά με την Ε-θέση της 30S υπομονάδας και ρυθμίζει τη σύζευξη των δυο υπομονάδων (Dallas and Noller, 2001) και iii) o εναρκτήριος παράγοντας, IF2 που είναι μια G-πρωτεΐνη και βοηθάει την πρόσδεση του fmet-trna στην Ρ- θέση του ριβοσώματος (Lockwood et al., 1971). Οι δυο πρώτοι παράγοντες (IF1 και IF3) φαίνεται να διευκολύνουν την επιλεκτική δέσμευση του fmet-trna στην Ρ- θέση, εμποδίζοντας την πρόσβαση στις γειτονικές Α- και Ε- θέσεις, ενώ η υδρόλυση του GTP που καταλύεται από τον IF2 και ενεργοποιείται από τον IF1 (πιθανόν με άμεση αλληλεπίδραση), συντελεί στην απελευθέρωση του IF2 από το ριβόσωμα μετά την πρόσδεση της μεγάλης υπομονάδας (Luchin et al., 1999). Ο ΙF3 είναι παράγοντας με πολλαπλές επιπρόσθετες ιδιότητες: i) συντελεί στην επιλογή του εναρκτήριου aa-trna μέσω αποσταθεροποίησης της πρόσδεσης μη-συμπληρωματικών aa-trnas (Gualerzi and Pon, 1990; La Teana et al., 1996; Meinnel et al., 1999), ii) δρα στην απελευθέρωση των υπομονάδων του 70S συμπλόκου μετά από τον τερματισμό της πρωτεϊνικής σύνθεσης (Blumberg et al., 1979), και iii) κατά την ανακύκλωση του ριβοσώματος ενεργοποιεί την απελευθέρωση του αποακυλιωμένου trna, μετά την αποσύζευξη των υπομονάδων (Karimi et al., 1999). Το στάδιο της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης ολοκληρώνεται, όταν η 50S ενωθεί με την 30S ριβοσωματική υπομονάδα και δημιουργηθεί το 70S εναρκτήριο ριβοσωματικό σύμπλοκο (Pi complex).

Σχήμα 2.4: Σχηματική αναπαράσταση της έναρξης της πρωτεϊνικής σύνθεσης (a) πρόσδεση του IF3 στην 30S υπομονάδα κενών ριβοσωμάτων και διαχωρισμός αυτών στις δυο υπομονάδες τους, (b) ο IF3 βοηθάει στην τοποθέτηση του mrna ώστε το αρχικό κωδικόνιο AUG να τοποθετηθεί στην Ρ- θέση της 30S υπομονάδας. Η SD αλληλουχία του mrna τοποθετείται πλησίον της περιοχής πρόσδεσης του IF3 και αλληλεπιδρά με την anti-sd αλληλουχία του 16S rrna της 30S υπομονάδας. (c) η πρόσδεση του εναρκτήριου fmettrna fmet (κόκκινο) γίνεται απευθείας ή μέσω δημιουργίας συμπλόκου με τον IF2 (μωβ), με αποτέλεσμα τη δημιουργία του 30S εναρκτήριου συμπλόκου, (d) πρόσδεση της 50S υπομονάδας και απελευθέρωση των παραγόντων IF1 και IF3, (e) η δραστικότητα της GTPάσης ενεργοποιείται από την 50S υπομονάδα και οδηγεί στην απελευθέρωση του IF2- GDP από το ριβόσωμα, επιτρέποντας την τελική εγκατάσταση του εναρκτήριου trna στην Ρ/Ρ θέση (Pi σύμπλοκο δηλαδή η Ρ- θέση είναι απασχολημένη και οι Α- και Ε- ελεύθερες), (f) ακολουθεί επιμήκυνση, τερματισμός και ανακύκλωση 70S κενών ριβοσωμάτων, έτοιμων να εισέλθουν σε νέο στάδιο έναρξης. Στάδιο επιμήκυνσης Το στάδιο της επιμήκυνσης που ακολουθεί είναι η κεντρική διαδικασία της πρωτεϊνικής σύνθεσης (Nierhaus et al., 1998; Spahn and Nierhaus, 1998; Wilson and Noller, 1998). O κύκλος της επιμήκυνσης εμπλέκει άμεσα δυο παράγοντες επιμήκυνσης (EFs), τον EF-Tu και τον EF-G. O EF-Tu δημιουργεί ένα τριμερές σύμπλοκο με το GTP και ένα aa-trna, διευκολύνοντας το νεοεισερχόμενο trna να εγκατασταθεί στην Α- θέση του ριβοσώματος. Μετά τη σωστή αποκωδικοποίηση των aa-trnas (decoding), δηλαδή επιλογή αυτών των trnas που είναι συμπληρωματικά των δυο πρώτων βάσεων του

mrna, λαμβάνει χώρα περιστροφή αυτών κατά 90 0 και γίνεται η τελική εγκατάστασή τους στην Α-θέση (accommodation), εφόσον είναι πλήρως συμπληρωματικά, αλλιώς απομακρύνονται (proofreading). H διαδικασία συνοδεύεται από υδρόλυση του GTP και απομάκρυνση του EF-Tu GDP. Ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού λαμβάνει χώρα στο ενεργό κέντρο του ριβοσώματος, το κέντρο της PTάσης, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2.5. Η α-αμινομάδα του προσδεδεμένου aa-trna στην Α-θέση, προσβάλλει την καρβονυλομάδα του εστερικού δεσμού που συνδέει τη νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα με το trna της P-θέσης. Έτσι, το aatrna της Α-θέση γίνεται πεπτιδυλο-trna επιμηκυσμένο κατά ένα αμινοξύ, ενώ το πρώην πεπτιδυλο-trna στην P-θέση αποακυλιώνεται. Το κέντρο της PTάσης συγκροτείται από συντηρημένα νουκλεοτίδια (Α2451, U2506, U2585, C2452 και A2602) και τρία αμινοξέα της πρωτεΐνης L27 (Rodnina et al., 2007). Όπως έδειξαν διάφορες πειραματικές προσεγγίσεις, ο μηχανισμός κατάλυσης φαίνεται να βασίζεται στην ορθή εγκατάσταση των υποστρωμάτων (template position) ή/και στην οξεοβασική δράση ειδικών ομάδων του 23S rrna και του trna. Σε πρόσφατο άρθρο ανασκόπησης (Rodnina et al., 2007), συνοψίζονται όλες οι μελέτες που έχουν γίνει για τη διαλεύκανση του μηχανισμού κατάλυσης. Το πιο πρόσφατο μοντέλο κατάλυσης του σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού υποστηρίζει ότι η βασική ομάδα που ενεργοποιεί την α-αμινοονάδα του aa-trna μέσω απόσπασης Η + είναι το 2 ΟΗ της Α76 του πεπτιδυλο-trna, το οποίο με τη σειρά του αλληλεπιδρά με άλλες ομάδες, που είχαν ταυτοποιηθεί με προηγούμενες μελέτες ότι συμμετέχουν στη δημιουργία πεπτιδικού δεσμού (Σχήμα 2.5Γ).

Σχήμα 2.5: Σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού. (Α) Σχήμα αντίδρασης. Η α- αμινοομάδα του aa-trna (κίτρινο) προσβάλλει την καρβονυλική ομάδα του πεπτιδυλοtrna στην Ρ-θέση (πορτοκαλί) για την παραγωγή ενός νέου πεπτιδυλ-trna στην Α- θέση επιμηκυσμένου κατά ένα αμινοξύ, ενώ στην Ρ-θέση απομένει το αποακυλιωμένο trna. (Β) Δομή ριβοσώματος με προσδεδεμένα τα trnas. (Γ) Μηχανισμός συγχρονισμένης γέφυρας πρωτονίου. Το υπόστρωμα trna της Ρ- θέσης και Α- θέσης δείχνεται με μπλε και κόκκινο χρώμα αντίστοιχα, τα ριβοσωματικά κατάλοιπα που λαμβάνουν μέρος στη σταθεροποίηση της γέφυρας είναι πράσινα και τα μόρια νερού που επιστρατεύονται και σταθεροποιούν το αναπτυσσόμενο φορτίο γκρι. Η προσβολή της α- αμινοομάδας στον εστερικό άνθρακα είναι αποτέλεσμα έξι μεταβατικών καταστάσεων, όπου η 2 -ΟΗ ομάδα της Α76 του υποστρώματος της Ρ- θέσης προσλαμβάνει ένα από τα αμινο-πρωτόνια, το οποίο τελικά μεταφέρεται στο γειτονικό 3 οξυγόνο. Εναλλακτικά, μπορεί και το μόριο νερού (*) να χρησιμοποιηθεί στη γέφυρα υδρογόνου (Rodnina et al., 2007). Απαραίτητες για τη βελτιστοποίηση της καταλυτικής δραστικότητας στο ριβόσωμα είναι οι πρωτεΐνες L2, L3, L4, L15 και L16 (Schulze and Nierhaus, 1982). Οι L2, L3 και L4 μπορεί να έχουν λειτουργικό ρόλο (Ban et al., 2000; Nissen et al., 2000; Shin et al., 2006), ενώ οι L15 και L16 είναι

απαραίτητες για τη διαμόρφωση του καταλυτικού κέντρου και δεν εμπλέκονται άμεσα στην κατάλυση (Franceschi and Nierhaus, 1990). Ο κύκλος της επιμήκυνσης ολοκληρώνεται με τη μετατόπιση των trnas (translocation). Στη διεργασία αυτή, ο παράγοντας EFG εμπλέκεται στην μετατόπιση του mrna πεπτιδυλο-trna συμπλόκου από την Α- θέση στην Ρ-, κατά ένα κωδικόνιο (10-15Å). Η μετατόπιση καθιστά ικανό το επόμενο EF-Tu GTP aa-trna σύμπλοκο να έχει πρόσβαση στο νέο κωδικόνιο που παρουσιάζεται στην Α- θέση. Έτσι, ο κύκλος της επιμήκυνσης συνεχίζεται. Τρία μοντέλα επιμήκυνσης έχουν προσπαθήσει να περιγράψουν τον κύκλο της επιμήκυνσης: i) το αλλοστερικό μοντέλο τριών θέσεων που βασίζεται σε λειτουργικές μελέτες και προτείνει ότι η Α- και Ε- αλληλεπιδρούν αλλοστερικά. Δηλαδή, η κατάληψη της Ε- θέσης από ένα αποακυλιωμένο trna προκαλεί μικρή συγγένεια στην Α- θέση, και αντιστρόφως (Nierhaus, 1990), ii) το υβριδικό μοντέλο που βασίζεται σε δομικές μελέτες και προτείνει ότι οι κινήσεις των trnas κατά τη μετατόπιση γίνονται σε δυο βήματα, δημιουργώντας υβριδικές Α/Ρ και Ρ/Ε θέσεις (Moazed and Noller, 1989) και iii) το αλλοστερικό μοντέλο «α-ε» που βασίζεται στην παρατήρηση ότι το aatrna διατηρεί παρόμοιο ριβοσωματικό περιβάλλον πριν και μετά τη μετατόπιση από την Α- στην Ρ- θέση, όπως συμβαίνει και με το αποακυλιωμένο trna που μετατοπίζεται από την Ρ- στην Ε- θέση (Nierhaus et al., 1995). Το κύριο χαρακτηριστικό αυτού του μοντέλου είναι η παραδοχή ενός διαμορφωτικού παλμού, ο οποίος επηρεάζει άμεσα τα trnas και μεταδίδεται παράλληλα με αυτά κατά τη διάρκεια της μετατόπισης. Κατά τη μετατόπιση το GTP υδρολύεται, επιτρέποντας στο EF-G GDP να απομακρυνθεί, αφού έχει ολοκληρώσει το ρόλο του. Στάδιο τερματισμού Η σύνθεση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας συνεχίζεται μέχρις ότου ένα κωδικόνιο λήξης (UAA, UAG ή UGA) εμφανιστεί στην Α-θέση. Πρωτεϊνικοί παράγοντες, οι παράγοντες απελευθέρωσης (RFs), εμπλέκονται στην

απελευθέρωση της αλυσίδας από το ριβόσωμα και στην ανακύκλωση του ριβοσώματος για την επόμενη έναρξη. Δύο τάξεις (Ι και ΙΙ) παραγόντων απελευθέρωσης έχουν ταυτοποιηθεί. Η τάξη Ι περιλαμβάνει παράγοντες που δεν καταναλώνουν ενέργεια και είναι υπεύθυνοι για την υδρόλυση του εστερικού δεσμού μεταξύ της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και του trna της Ρ- θέσης. Ο RF1 και ο RF2 ανήκουν σε αυτήν την τάξη και αναγνωρίζουν τα κωδικόνια UAG και UGA, αντίστοιχα, ενώ και οι δυο αναγνωρίζουν το τρίτο κωδικόνιο τερματισμού UAA. Οι RF1 και RF2 παράγοντες, έχει δειχθεί ότι έχουν μεγάλη ομοιότητα σε αμινοξέα (Caskey et al., 1984; Craigen et al., 1985; Weiss et al., 1984), γεγονός που εξηγεί την παραπλήσια δράση τους. Στους ευκαρυώτες και στα αρχαία μόνο ένας παράγοντας της τάξης Ι έχει ταυτοποιηθεί και αναγνωρίζει όλα τα κωδικόνια λήξης (Wilson and Nierhaus, 2003). Οι παράγοντες απελευθέρωσης της τάξης ΙΙ καταναλώνουν ενέργεια με υδρόλυση του GTP. Ο RF3 ανήκει σε αυτή την κατηγορία και o κύριος ρόλος του είναι να διαμεσολαβεί στην απομάκρυνση των παραγόντων της τάξεως Ι από το ριβόσωμα, αφού έχει ολοκληρωθεί η υδρόλυση του εστερικού δεσμού μεταξύ της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και του trna της Ρ- θέσης (Zavialov et al., 2001). Mε άλλα λόγια ο RF3 ενεργοποιεί την ανακύκλωση του RF1 και RF2 μετά τον τερματισμό της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Ο RF3 στα E. coli δεν είναι απαραίτητος, αφού έχει δειχθεί ότι απαλοιφή του γονίδιου του prfc που κωδικοποιεί τον RF3, δίνει βιώσιμες σειρές κυττάρων. Τέλος, οι παράγοντας ανακύκλωσης του ριβοσώματος RRF και ο EFG επιτυγχάνουν την απελευθέρωση του mrna, του αποακυλιωμένου trna και το διαχωρισμό του 70S ριβοσωματικού συμπλόκου στις υπομονάδες του (Hirashima and Kaji, 1970; Hirashima and Kaji, 1972; Kiel et al., 2003; Woodward et al., 1974).

3. Αντιβιοτικά: Αναστολείς της ριβοσωματικής λειτουργίας 3.1 Εισαγωγικά Βάσει του κλασικού ορισμού, αντιβιοτικά καλούνται τα μεταβολικά προϊόντα μικρού μοριακού βάρους, που παράγονται από μικροοργανισμούς, και αναστέλλουν σε μικρή συγκέντρωση (<200 μg/ml) την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών. Ο όρος έχει στη σύγχρονη εποχή αποκτήσει ευρύτερη έννοια, περιλαμβάνοντας συνθετικές ή ημισυνθετικές ενώσεις με κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι μικροβίων, ιών, ή και ευκαρυωτικών κυττάρων (Spahn and Prescott, 1996). Είναι σαφές, ότι ακόμη και σήμερα, την εποχή που σηματοδοτεί την έναρξη νέων Σχήμα 3.1: Στόχοι αντιβιοτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων σε γονιδιακό επίπεδο, τα αντιβιοτικά αποτελούν το κύριο θεραπευτικό μέσο έναντι λοιμώξεων. Καθώς όμως, τα φαινόμενα αντίστασης έναντι των κλασικών αντιβιοτικών πολλαπλασιάζονται ραγδαία, προβάλλεται επιτακτική η ανάγκη βελτίωσης των υπαρχόντων ή ανάπτυξης νέας γενιάς αντιβιοτικών με αναβαθμισμένες ιδιότητες. Η δραστικότητα ενός αντιβιοτικού ως φαρμακευτικού σκευάσματος εξαρτάται από τη σταθερότητά του έναντι χημικών ή ενζυμικών τροποποιήσεων και από την ικανότητά του να συσσωρεύεται ενδοκυττάρια. Για παράδειγμα, ένα από τα μεγαλύτερα μειονεκτήματα της ερυθρομυκίνης, συγκρινόμενης με την αζιθρομυκίνη ή την τελιθρομυκίνη, είναι η υψηλή ευαισθησία της σε όξινο περιβάλλον που αποτελεί αιτία εκτεταμένης απενεργοποίησής της στο στομάχι, μετά από στοματική χορήγηση (Mordi et al., 2000; Zuckerman, 2000). Όμως, ο σπουδαιότερος παράγοντας που καθορίζει τη φαρμακευτική δράση ενός αντιβιοτικού, είναι η ικανότητά του

να δεσμεύεται στην υποκυτταρική θέση-στόχο (Σχήμα 3.1)(Douthwaite et al., 2000; Walsh, 2000). Μεγάλη ποικιλία αντιβιοτικών αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των παθογόνων βακτηρίων, προσδενόμενα στα ριβοσώματά τους και παρεμποδίζοντας τη μεταφραστική διαδικασία. Τις τελευταίες δεκαετίες οι αναστολείς αυτοί είναι ευρέως διαδεδομένοι και κατατάσσονται στα πιο επιτυχημένα, από κλινικής άποψης, αντιβιοτικά. Σημαντική ώθηση στην κατανόηση της πρόσδεσης των αντιβιοτικών με το ριβόσωμα και την παρεμβολή τους στη μεταφραστική διαδικασία έδωσε η αλματώδης ανάπτυξη της κρυσταλλογραφίας. Παρόλα αυτά, πολλές σημαντικές πλευρές της δράσης τους, όπως οι παρενέργειες και οι μηχανισμοί ανθεκτικότητας παραμένουν ανεξιχνίαστοι, ακόμα και για τα πιο παλαιά και εκτενώς μελετημένα αντιβιοτικά (Tenson and Mankin, 2006). Στο Σχήμα 3.2 παρουσιάζονται μερικές κατηγορίες αντιβιοτικών που εμπλέκονται στα διάφορα στάδια της μεταφραστικής διαδικασίας. Στην παρούσα διατριβή, δίνουμε ιδιαίτερη προσοχή στους αναστολείς της PTάσης (στάδιο 2) στους οποίους συγκαταλέγονται η πουρομυκίνη, η βλαστισιδίνη και τα 16μελή μακρολίδια καθώς και οι παρεμποδιστές του τούνελ εξόδου της νεοσυντιθέμενης πρωτεϊνικής αλυσίδας, στους οποίους συγκαταλέγονται τα 14μελή και 15μελή μακρολίδια και κετολίδια.

Σχήμα 3.2: Μηχανισμός επιμήκυνσης της πρωτεϊνικής αλυσίδας σε βακτήρια και αντιπροσωπευτικά αντιβιοτικά, που αναστέλλουν εξειδικευμένες αντιδράσεις του κύκλου (Wilson, 2004). 3.2 Aντιβιοτικά που μιμούνται το -CCA άκρο του aa-trna: Πουρομυκίνη και Βλαστισιδίνη. Πουρομυκίνη Η πουρομυκίνη είναι ένα δομικό ανάλογο του 3 άκρου του φαινυλαλανυλο-trna (Phe-tRNA), στο οποίο η ομάδα που προσομοιάζει στο κατάλοιπο φαινυλαλανίνης προσδένεται στη ριβόζη μέσω αμιδικού αντί εστερικού δεσμού (Σχήμα 3.3). Δεν χρησιμοποιείται στη θεραπευτική λόγω της μεγάλης της τοξικότητας. Όμως, η σπουδαιότητά της είναι μεγάλη, αφού αποτελεί πολύτιμο εργαλείο για τη μελέτη της δομής και λειτουργίας του ριβοσώματος.

Σχήμα 3.3: Σύγκριση της δομής της πουρομυκίνης με την τελική αδενίνη (Α76) του trna που φέρει τυροσίνη (Tyr). Οι διαφορές μεταξύ της πουρομυκίνης και του φυσιολογικού trna υποστρώματος δείχνονται με κόκκινο χρώμα (Wilson, 2004). Λόγω της δομής της, προσδένεται στην Α-θέση του ριβοσώματος (Nissen et al., 2000) και έχει την ικανότητα να σχηματίζει πεπτιδικό δεσμό με το υπόστρωμα της Ρ-θέσης. Το προϊόν πεπτιδυλο-πουρομυκίνη απελευθερώνεται έχοντας μικρή ικανότητα πρόσδεσης στο ριβόσωμα (Maden, 2003) (Σχήμα 3.4). Η πουρομυκίνη αποτελεί, συνεπώς έναν αποτελεσματικό αναστολέα της PTάσης. Επίσης, χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της πρόσδεσης των υποστρωμάτων στην Α- ή Ρ- θέση, εφόσον μόνο το υπόστρωμα της Ρ- θέσης μπορεί να αντιδράσει με την πουρομυκίνη. Σχήμα 3.4: Δομή και δράση της πουρομυκίνης ως υπόστρωμα Α-θέσης (Starck et al., 2003).

Βλαστισιδίνη Σε αντίθεση με την πουρομυκίνη που μιμείται την Α76 του -CCA άκρου του aa-trna, η βλαστισιδίνη έχει δομή που προσομοιάζει στην C74 ή C75 (Σχήμα 3.5). Παρ ότι θεωρείται ισχυρός αναστολέας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης στα προκαρυωτικά αλλά και στα ευκαρυωτικά ριβοσώματα, λίγες μελέτες έχουν αναφερθεί στο μηχανισμό δράσης της (Dinos and Kalpaxis, 1997; Kalpaxis et al., 1986; Theocharis et al., 1986). Πρόσφατη κρυσταλλογραφική μελέτη, διακριτικής ικανότητας 3Å σε 50S ριβοσωματικές υπομονάδες του αρχαιοβακτηρίου H. marismortui αποκάλυψε δυο θέσεις δέσμευσης της βλαστισιδίνης στο ριβόσωμα, δίνοντας νέες πληροφορίες για τον τρόπο δράσης της (Hansen et al., 2003). Τα δύο μόρια του αντιβιοτικού προσδένονται πλησίον του καταλυτικού κέντρου της PTάσης και προσανατολίζονται έτσι, ώστε να μιμούνται την C74 (το μόριο χαμηλής συγγένειας, βλαστισιδίνη ΙΙ) και την C75 (το μόριο υψηλής συγγένειας, βλαστισιδίνη Ι) του trna της Ρ-θέσης, αναπτύσσοντας δεσμούς με νουκλεοτίδια γύρω από αυτήν (Σχήμα 3.5). Το μόριο της βλαστισιδίνης Ι δημιουργεί δεσμούs Watson-Crick με την G2251, ενώ το μόριο στη χαμηλής συγγένειας αλληλεπιδρά με την G2252. Η πρόσδεση στην θέση υψηλής συγγένειας σταθεροποιείται περαιτέρω με στερικές αλληλεπιδράσεις με τη βάση U2438 καθώς και με δεσμούς υδρογόνου με τις A2439 και Α2600. Αποκοπή ή μετατροπή της ουράς του μορίου μειώνει σημαντικά την δραστικότητά του (Lichtenthaler and Trummlitz, 1974), δηλώνοντας ότι οι αλληλεπιδράσεις αυτές (A2439, A2600) είναι σημαντικές. Πειράματα προστασίας από το χημικό τροποποιητή DMS ενισχύουν τη σημαντικότητα του κατάλοιπου Α2439 στην πρόσδεση της βλαστισιδίνης (Rodriguez-Fonseca et al., 1995), ενώ η μετάλλαξη U2438C στη γειτονική βάση βρέθηκε να προσδίδει ανθεκτικότητα στα ριβοσώματα έναντι της βλαστισιδίνης (Porse et al., 1995).

Σχήμα 3.5: (Α) Δομή και (Β) θέση πρόσδεσης βλαστισιδίνης. Η βλαστισιδίνη προσδένεται σε δυο θέσεις διαφορετικής συγγένειας. Στην ισχυρή θέση (βλαστισιδίνη Ι), η κυτιδυλο-ομάδα της βλαστισιδίνης δημιουργεί δεσμούς υδρογόνου με την G2251 μιμούμενη την C75 του trna της Ρ-θέσης, ενώ η ουρά της αλληλεπιδρά με τις U2438, A2439 και Α2600. Στην ασθενή θέση πρόσδεσης (βλαστισιδίνη ΙΙ), η κυτιδυλο-ομάδα δημιουργεί δεσμούς υδρογόνου με την G2252, μιμούμενη την C74 του πεπτιδυλο-trna. 3.3 Μακρολίδια Τα μακρολίδια αντιπροσωπεύουν μια μεγάλη κατηγορία θεραπευτικά χρήσιμων αντιβιοτικών που έχουν εκτενώς μελετηθεί. Το 1950 ανακαλύφθηκε το πρώτο μέλος, η ερυθρομυκίνη, και εισήχθη στην κλινική ιατρική. Από τότε πολλά άρθρα ανασκόπησης έχουν γραφεί που περιγράφουν βιοχημικά και κλινικά χαρακτηριστικά τους (Auerbach et al., 2002; Franceschi et al., 2004; Gale et al., 1981; Gaynor and Mankin, 2003; Jenni and Ban, 2003; Katz and Ashley, 2005; Takashima, 2003; Vazquez, 1979; Wilson, 2004). O όρος "μακρολίδια" προτάθηκε για πρώτη φορά το 1957 από τον R.B. Woodward ως συντόμευση των ενώσεων μακρολακτόνες-γλυκοσίδια. Παράγονται από τους ακτινομύκητες και δομούνται από μια μακροκυκλική λακτόνη, στην οποία προσδένονται ένα ή περισσότερα σάκχαρα. Μπορούν να ταξινομηθούν με ποικίλους τρόπους. Από χημικής άποψης, ταξινομούνται βάσει του μεγέθους του μακροκυκλικού δακτυλίου, που μπορεί να

απαρτίζεται από 12 (μεθυλομυκίνη) έως 20 (ραπαμυκίνη) άτομα. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν μακρολίδια με 14μελή (ερυθρομυκίνη, τελιθρομυκίνη), 15μελή (αζιθρομυκίνη) και 16μελή λακτονικό δακτύλιο (τυλοσίνη) (Σχήμα 3.6). Εναλλακτικά, τα μακρολίδια ταξινομούνται βάσει του αριθμού, του μεγέθους και του τύπου των σακχάρων που προσδένονται στο δακτύλιο. Για παράδειγμα, η ερυθρομυκίνη και η αζιθρομυκίνη έχουν δυο μονοσακχαρίτες στον C3 και C5 άνθρακα, ενώ η τυλοσίνη έχει ένα δισακχαρίτη στο C5 άνθρακα του δακτυλίου που εκτείνεται προς το κέντρο της PTάσης και ένα μονοσακχαρίτη στον C14 που προσανατολίζεται προς το υδρόφοβο τούνελ εξόδου (Hansen et al., 2002). Ταξινόμηση των μακρολιδίων μπορεί να γίνει και κατά χρονολογική σειρά εισαγωγής τους στη θεραπευτική. Η τελιθρομυκίνη είναι το πιο πρόσφατα παραχθέν ημισυνθετικό προϊόν τρίτης γενιάς, το οποίο παρουσιάζει βελτιωμένες ιδιότητες σε όξινο περιβάλλον και ισχυρή δράση έναντι ανθεκτικών στελεχών μικροβίων (Agouridas et al., 1998; Alarcon et al., 2000; Chu, 1999; Engler et al., 2001; Okamoto et al., 2000; Rastogi et al., 2000; Tait-Kamradt et al., 2000; Taylor, 2000; Umegaki et al., 2000; Wang and Taylor, 1998; Weisblum, 1998). Το προϊόν αυτό έρχεται να αντικαταστήσει τα ημισυνθετικά ανάλογα με αναβαθμισμένη αντίσταση κατά της υδρόλυσης (αντιβιοτικά δεύτερης γενιάς). Στα ανάλογα δεύτερης γενιάς ανήκουν η αζιθρομυκίνη, ροξιθρομυκίνη και κλαριθρομυκίνη, που υποκατέστησαν τα φυσικά αντιβιοτικά πρώτης γενιάς, ερυθρομυκίνη και 16μελή μακρολίδια (Fass, 1993; Hardy et al., 1988; Patel et al., 1996; Retsema et al., 1987; Rodvold, 1999; Steele-Moore et al., 1999; Zuckerman, 2000). Η χρήση των 16μελών μακρολιδίων, παρόλη τη δομική τους σταθερότητα και του προτερήματος να μην επάγουν την εμφάνιση ανθεκτικότητας, έχει περιορισθεί σε κτηνιατρικές εφαρμογές, επειδή εμφανίζουν σειρά τοξικών παρενεργειών (Nakayama, 1984; Rubinstein and Keller, 1998).

Σχήμα 3.6 Δομή μακρολιδίων και αλληλεπιδράσεις με το ριβόσωμα. (Α) Ερυθρομυκίνη.(Β) Τελιθρομυκίνη. (Γ) Αζιθρομυκίνη. (Δ) Τυλοσίνη. Με διαφορετικό χρώμα σημειώνονται τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της κάθε ένωσης. Με κόκκινο χρώμα δείχνονται οι βάσεις του 23S rrna που συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις των μακρολιδίων με το ριβόσωμα και με γραμμές δίνονται οι δεσμοί υδρογόνου. Το σχήμα έχει προκύψει από συνδυασμό κρυσταλλογραφικών δεδομένών, με ιδιαίτερη έμφαση σε αυτά που αναφέρονται στο βακτήριο Deinococcus radiodurance που είναι εξελικτικά πιο κοντά στο E. coli. Παλαιότερες εργασίες (Di Giambattista et al., 1987; Goldman et al., 1990) αλλά και πρόσφατες μελέτες (Lovmar et al., 2004) στηρίχθηκαν στην άποψη ότι τα μακρολίδια (Ι) αλληλεπιδρούν με το ριβόσωμα (R) μέσω της K i ισορροπίας: R + I RI Κατά συνέπεια, η ισχύς πρόσδεσης του αντιβιοτικού εκφράστηκε αποκλειστικά μέσω της τιμής της σταθεράς διάστασης Κ i. Όμως, κινητικές μελέτες κατέδειξαν ότι η πρόσδεση των μακρολιδίων ακολουθεί μηχανισμό δυο σταδίων (Dinos et al., 1993; Dinos et al., 2003; Dinos and Kalpaxis, 2000; Dinos et al., 2001; Petropoulos et al., 2004). Οι εργασίες αυτές συμφωνούν με

μελέτες TRNOE (Transfer Nuclear Overhauser Effect) (Bertho et al., 1998) που διέκριναν δυο είδη αλληλεπιδράσεων μεταξύ μακρολιδίων και ριβοσώματος, μια ισχυρή (K d =10-7 -10-9 ) και μια ασθενή (K d =10-3 -10-5 M) καθώς και με τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα (Hansen et al., 2002). Βάσει των μελετών αυτών, προκύπτει ένα νέο μοντέλο αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μακρολιδίων και ριβοσώματος: η αρχική πρόσδεση του αναστολέα στο ριβόσωμα λαμβάνει χώρα ταχέως και στη συνέχεια, μέσω επαγωγής βραδέων διαμορφωτικών αλλαγών που προάγουν την ισχυρότερη πρόσδεση του αντιβιοτικού, το ενδιάμεσο σύμπλοκο CI οδηγείται στο σχηματισμό ενός πιο σταθερού συμπλόκου, R*I. R + I K i RI k 4 R*I k 5 γρήγορο στάδιο βραδύ στάδιο Είναι σαφές ότι για την ποσοτικοποίηση της ισχύος πρόσδεσης του αντιβιοτικού στο ριβόσωμα, επιπρόσθετες κινητικές σταθερές (k 4, k 5 ) πρέπει να ληφθούν υπόψιν. Το συνολικό φαινόμενο δέσμευσης εκφράζεται με τη συνολική σταθερά αποδέσμευσης (K d ή K i *), η οποία στην περίπτωση των μακρολιδίων κυμαίνεται από 1-40 nm. Η σταθερά αυτή έχει καθοριστεί σε διάφορα in vitro συστήματα, στα οποία όμως δεν έχει ληφθεί υπ όψιν η επίδραση των ιοντικών συνθηκών και η λειτουργική κατάσταση των ριβοσωμάτων. Τα απλούστερα συστήματα είναι αυτά που χρησιμοποιούν ραδιενεργό αντιβιοτικό (Di Giambattista et al., 1986; Goldman et al., 1990; Pestka, 1974) ή φθορίζον και 70S ριβοσώματα χωρίς δεσμευμένο mrna και υποστρώματα (Brandt-Rauf et al., 1978; Langlois et al., 1977; Yan et al., 2005). Όμως, μεγαλύτερη ακρίβεια στις μετρήσεις παρέχεται από συστήματα μετρώντας την ενεργότητας της PTάσης (Dinos et al., 1993; Dinos et al., 2003; Dinos and Kalpaxis, 2000; Dinos et al., 2001; Lovmar et al., 2004; Petropoulos et al., 2004; Polacek and Barta, 1998). Προσεγγιστικά, η σταθερά αποδέσμευσης των μακρολιδίων έχει υπολογιστεί και από πειράματα προστασίας του rrna από χημικούς τροποποιητές (footprinting analysis)(douthwaite et al., 2000; Garza-Ramos et al., 2001). Οι τιμές όμως,

που προκύπτουν μέσω αυτής της πειραματικής προσέγγισης, μόνο προσεγγιστικές μπορούν να θεωρηθούν εφόσον στηρίζονται στην αλληλεπίδραση του αντιβιοτικού με ένα μόνο νουκλεοτίδιο του 23S rrna. Δυο περιοχές του 23S rrna εμπλέκονται στην πρόσδεση των μακρολιδίων: ο κεντρικός βρόγχος της περιοχής V, η έλικα 35 (H35) του τομέα II του 23S rrna, καθώς και δυο ριβοσωματικές πρωτεΐνες (L4 και L22). Mελέτες προστασίας έναντι χημικών αντιδραστηρίων έχουν δείξει ότι όλα τα μακρολίδια προστατεύουν τα νουκλεοτίδια Α2058 και Α2059 που βρίσκονται στην αρχή του τούνελ εξόδου. Oρισμένα από αυτά σταθεροποιούνται περαιτέρω με αλληλεπιδράσεις στην περιοχή ΙΙ. Στο Σχήμα 3.7 φαίνονται οι θέσεις πρόσδεσης των αντιβιοτικών, που ταυτοποιήθηκαν με πειράματα προστασίας και μεταλλάξεων συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων του rrna (Πίνακας Ι). Κρυσταλλογραφικά δεδομένα συμπλήρωσαν και έδωσαν περισσότερα στοιχεία για τις αλληλεπιδράσεις αυτές (Πίνακας ΙΙ, Σχήμα 3.9). Πίνακας Ι: Αναφορές σε μελέτες ταυτοποίησης της θέσης πρόσδεσης των μακρολιδίων στο ριβόσωμα, με ανάλυση αποτυπώματος ή μεταλλαξογένεση Βλαστισιδίνη (Rodriguez-Fonseca et al., 1995) Τυλοσίνη (Rodriguez-Fonseca et al., 1995) (Poulsen et al., 2000) (Vester and Douthwaite, 2001) Ερυθρομυκίνη (Moazed and Noller, 1987) (Hansen et al., 1999) (Xiong et al., 1999) (Douthwaite et al., 2000) (Xiong et al., 2005) (Garza-Ramos et al., 2001) (Vester and Douthwaite, 2001) Αζιθρομυκίνη --- Τελιθρομυκίνη (Hansen et al., 1999) (Xiong et al., 1999) (Douthwaite et al., 2000) (Vester and Douthwaite, 2001) (Pfister et al., 2005) (Novotny et al., 2004) (Garza-Ramos et al., 2001) (Berisio et al., 2006)

A B Ery, Tyl, Tel Γ Ery, Tyl, Tel Ery, Tyl, Tel Ery, Tyl, Azi, Tel Blast Ery, Tyl, Tel Ery, Tyl Blast, Tyl Tel Tyl, Tel Σχήμα 3.7: (A) Δευτεροταγής δομή του 23S rrna του Ε. coli, εστιασμένη στην έλικα 35 της περιοχής ΙΙ (B) και στον κεντρικό βρόχο της περιοχής V (Γ). Με κύκλο σημειώνονται οι θέσεις πρόσδεσης των αντιβιοτικών και με τελείες επισημαίνονται τα νουκλεοτίδια, των οποίων μετάλλαξη προκαλεί ανθεκτικότητα στη βλαστισιδίνη ή στα μακρολίδια. Συντμήσεις: Tyl: τυλοσίνη, Ery: ερυθρομυκίνη, Azi: αζιθρομυκίνη και Tel: τελιθρομυκίνη. Η δράση όλων των μακρολιδίων οφείλεται στην πρόσδεσή τους, στην αρχή του τούνελ εξόδου, από όπου η νεοσυντιθέμενη πρωτεϊνική αλυσίδα διέρχεται για να εξέλθει από το ριβόσωμα (Σχήμα 3.8Α). Η πρόσδεση αυτή προκαλεί απόφραξη κατά 50-70% της εισόδου του τούνελ (Schluenzen et al., 2001), γεγονός που επιφέρει στη συνέχεια δομικές διαταραχές στις θέσεις πρόσδεσης των υποστρωμάτων και πρώιμη απελευθέρωση της ημιτελούς

πρωτεϊνικής αλυσίδας (Brisson-Noel et al., 1988; Lovmar et al., 2004; Menninger and Otto, 1982; Tenson et al., 2003). Τα μακρολίδια προσδένονται στο τοίχωμα του τούνελ μέσω της υδρόφοβης πλευράς του δακτυλίου τους (τμήμα C4-C7), δημιουργώντας υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και αναπτύσσοντας δυνάμεις van der Waals με τις βάσεις C2611 έως A2059 (Σχήμα 3.7Γ). Η υδρόφιλη πλευρά τους (υδροξύλια και κετονομάδες) στρέφεται προς τον αυλό του τούνελ (Hansen et al., 2002; Tu et al., 2005). Στην περίπτωση της αζιθρομυκίνης, όπου ένα άτομο αζώτου παρεμβάλλεται στο δακτύλιο, όχι μόνο δεν επηρεάζονται οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, άλλα αντίθετα αναπτύσσονται επιπρόσθετοι δεσμοί συναρμογής μέσω ιόντων Mg 2+ (Schlunzen et al., 2003). Επίσης, η πρόσδεση της αζιθρομυκίνης δεν επηρεάζεται από τη μετάλλαξη Α2058G στο 23S rrna, όπου μια υδροφιλική ομάδα(-νη 2 ) εισέρχεται στην υδροφοβική περιοχή του τούνελ(tu et al., 2005). Α2451 B C2452 Γ Σχήμα 3.8: (Α) Θέση πρόσδεσης μακρολιδίων (κόκκινο) στην αρχή του τούνελ εξόδου και αλληλεπιδράσεις αυτών με συγκεκριμένες βάσεις του 23S rrna (πράσινες σφαίρες), στην αρχή του τούνελ εξόδου (Hansen et al., 2002). (Β) Το 16μελές μακρολίδιο (σπιραμυκίνη) δεσμευμένο σε 50S υπομονάδα της Haloarcula marismortui. Ο λακτονικός δακτύλιος που προσδένεται στην αρχή του τούνελ φαίνεται με κόκκινο, ο δισακχαρίτης στον C5 που εκτείνεται στο κέντρο της ΡΤάσης (Α2451, Α2452) με μαύρο και το επιπλέον σάκχαρο με μωβ. (Γ) Ερυθρομυκίνη δεσμευμένη σε 50S υπομονάδα του D. radiodurance. Τα χρώματα χρησιμοποιούνται όπως και στο σχήμα Β (Tenson et al., 2003).

Επίδραση των περισσότερων μακρολιδίων στην πρόσδεση των υποστρωμάτων (Dinos et al., 1993) και στην ενεργότητα της ΡΤάσης (Dinos et al., 2003; Dinos and Kalpaxis, 2000; Dinos et al., 2001) δεν είναι εφικτή, εφόσον απέχουν 10-13 Ǻ από το καταλυτικό κέντρο (Α2451, Σχήμα 3.8Γ) (Draper, 1995; Schlunzen et al., 2003; Schlunzen et al., 2001). Εξαίρεση αποτελούν τα 16μελή μακρολίδια (Σχήμα 3.8Β), όπως η τυλοσίνη, τα οποία φέρουν έναν μακρύ δισακχαριτικό βραχίονα στη θέση C5. Το δομικό αυτό χαρακτηριστικό τους δίνει την ικανότητα να αναστέλουν την ενεργότητα της ΡΤάσης. Στην περίπτωση της καρβομυκίνης, όπου στον προεκταμένο δισακχαρίτη υπάρχει μια επιπλέον ισοβουτυρική ομάδα που αγγίζει την Α- θέση του κέντρου της ΡΤάσης (αλληλεπίδραση με την Α2451 και Α2452), έχουμε ισχυρή αναστολή, ενώ παρουσία σπιραμυκίνης ή τυλοσίνης έχουμε ελαφρώς μικρότερη (Poulsen et al., 2000). Σύμφωνα με τις μελέτες αυτές, μακρολίδια με μονοσακχαρίτες στη θέση C5, όπως η ερυθρομυκίνη, αζιθρομυκίνη και τελιθρομυκίνη επιτρέπουν τη σύνθεση πεπτιδικής αλυσίδας μήκους μέχρι και 10 αμινοξέων. Αντίθετα, τα 16μελή μακρολίδια, όπως η τυλοσίνη, επιτρέπουν τη δημιουργία μόνο διπεπτιδίων. Η καρβομυκίνη προκαλεί πλήρης αναστολή της δημιουργίας πεπτιδικού δεσμού (Mao and Robishaw, 1971; Tenson et al., 2003). Ο εκτενής σακχαριτικός βραχίονας των 16μελών μακρολιδίων δίνει ένα επιπλέον πλεονέκτημα στη δράση τους, αφού αυξάνει τις αλληλεπιδράσεις με το ριβόσωμα κατά 50-75% (Tu et al., 2005; Wilson et al., 2005). Η πρόσδεση ενισχύεται και από αλληλεπιδράσεις του σακχάρου που προσανατολίζεται προς την πλευρά του τούνελ. Τέλος, η πρόσδεση σταθεροποιείται μέσω ενός ομοιοπολικού δεσμού που σχηματίζεται μεταξύ της C6 αιθυλ-αλδεϋδομάδας και του Ν6 της βάσης Α2062 (Σχήμα 3.9) (Hansen et al., 2002). Αντικατάσταση της C3 κλαδινόζης στο μόριο της ερυθρομυκίνης με μια κετομάδα οδηγεί σε μια νέα κατηγορία μακρολιδίων, τα κετολίδια (Σχήμα 3.6). Χαρακτηριστικό κετολίδιο που έχει εισαχθεί στην κλινική πράξη, είναι η τελιθρομυκίνη. Το σάκχαρο της κλαδινόζης και ιδιαίτερα 4 -ΟΗ

ομάδα του είναι απαραίτητη για την αντιμικροβιακή δράση των μακρολιδίων (Mao and Putterman, 1969). Απομάκρυνση της κλαδινόζης A PDB: 1K9X B Γ PDB:1NWY PDB:1P9X Σχήμα 3.9: Πρόσδεση αντιβιοτικών στην 50S υπομονάδα. (A) Η τυλοσίνη προσδένεται υδροφοβικά στις Α2058-Α2059 και δημιουργεί ομοιοπολικό δεσμό με την Α2062. Ο δισακχαρίτης προσανατολίζεται προς την ΡΤαση (Α2451) και ο μονοσακχαρίτης προς το τούνελ εξόδου (G748, Α752 και L22). (Β) To πρώτο μόριο αζιθρομυκίνης προσδένεται υδροφοβικά στις θέσεις Α2058, Α2059 και C2611, ενώ το δεύτερο μόριο προσανατολίζεται προς το τούνελ, όπου αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες L4, L22, καθώς και το νουκλεοτίδιο Α751. (Γ) Η τελιθρομυκίνη προσδένεται υδροφοβικά στις ίδιες θέσεις που δεσμεύται το πρώτο μόριο αζιθρομυκίνης. Ο μακρύς δισακχαρίτης κατευθύνεται προς το τούνελ εξόδου, όπου αλληλεπιδρά με τα νουκλεοτίδια Α751, Α752, Α789 και U790. Το μόριο τις ερυθρομυκίνης

προσδένεται στις ίδιες θέσεις με την τελιθρομυκίνη, χωρίς να αλληλεπιδρά τόσο ισχυρά με την περιοχή του τούνελ, εφόσον απουσιάζει ο καρβαμιδικός βραχίονας μειώνει την πρόσδεση των μακρολιδίων κατά 70 φορές (Douthwaite et al., 2000; Hansen et al., 1999). Σε αντίθεση, το κετολίδιο τελιθρομυκίνη παρουσιάζει εντυπωσιακή δράση, λόγω του ότι έχει υποστεί επιπλέον τροποποιήσεις: α) μεθυλίωση της υδροξυλ-ομάδας στη θέση C6, που εμποδίζει τη δημιουργία δεσμού με την 3-κετο-ομάδα και αυξάνει τη σταθερότητα της ένωσης σε όξινο περιβάλλον και β) εισαγωγή μιας εκτεταμένης αλκυλ-αρυλοομάδας στο 11,12-καρβαμιδικό δακτύλιο (Σχήμα 3.6). Η εκτενής αυτή ομάδα αυξάνει σημαντικά την ικανότητα πρόσδεσης της τελιθρομυκίνης στο ριβόσωμα και ιδιαίτερα στην περιοχή ΙΙ του 23S rrna (Douthwaite, 2001; Douthwaite and Champney, 2001; Xiong et al., 2005). Ετσι, ακόμη και αν η περιοχή V του 23S rrna έχει μεταλλαχθεί (σύνηθες φαινόμενο στα ανθεκτικά στελέχη μικροβίων), το αντιβιοτικό συγκρατούμενο από την περιοχή ΙΙ συνεχίζει να έχει αντιμικροβιακή δράση (Ackermann and Rodloff, 2003). Κινητική ανάλυση της πρόσδεσης τελιθρομυκίνης στο ριβόσωμα δεν έχει πραγματοποιηθεί μέχρι σήμερα, ενώ μέτρηση της σταθεράς αποδέσμευσης (K d ) με χρήση φθορίζοντος αντιβιοτικού δίνει ένα ευρύ φάσμα τιμών 6-11 nm στα 10 mm Mg 2+ (Yan et al., 2005). Με τη μέθοδο χημικής προστασίας, η K d βρέθηκε στις ίδιες ιοντικές συνθήκες ίση με 1.3-1.6 nm (Douthwaite et al., 2000; Hansen et al., 1999). Τα τελευταία πέντε χρόνια μια πληθώρα κρυσταλλογραφικών μελετών περιγράφει τη δομή της 50S υπομονάδες, ως σύμπλοκο με πολλά αντιβιοτικά, κυρίως μακρολίδια (Πίνακας II). Οι μελέτες στο βακτήριο Deinnoccus radiodurans έχουν γίνει από την ομάδα της Ada Yonah, ενώ στο αρχαιοβακτήριο Haloarcula marismortui από τον T. Steitz και τους συνεργάτες του. Ο πλούτος για τις πληροφορίες δομής που προσφέρουν οι κρυσταλλογραφικές αυτές μελέτες, μας κάνει ικανούς να κατανοήσουμε τον τρόπο δράσης των αντιβιοτικών και να μεταφράσουμε καλύτερα τη συσσωρευμένη πληροφορία από βιοχημικά και γενετικά δεδομένα.

Πίνακας ΙI: Κρυσταλλογραφικά δεδομένα για τη δομή συμπλόκων αντιβιοτικού-ριβοσώματος Αντιβιοτικό Τάξη Είδος Res. (Ǻ) PDB ID* Αναφορά Πουρομυκίνη Αναστολέας ΡΤασης D.r 3.7 1NJ0 (Bashan et al., 2003) Βλαστισιδίνη Αναστολέας ΡΤασης H.m 3.0 1FG0 (Nissen et al., 2000) H.m 3.0 1KC8 (Hansen et al., 2003) Ερυθρομυκίνη Μακρολίδια D.r 3.5 1JZY (Schlunzen et al., 2001) D.r 3.4 - (Wilson et al., 2005) H.m 2.65 1YI2 (Tu et al., 2005) Τυλοσίνη Μακρολίδια D.r 3.5 - (Wilson et al., 2005) H.m 3.0 1K9M (Hansen et al., 2002) Αζιθρομυκίνη Αζαλίδια D.r 3.2 1NWY (Schlunzen et al., 2003) H.m 3.2 1M1K (Hansen et al., 2002) H.m 2.4 1ΥΗQ (Tu et al., 2005) Τελιθρομυκίνη Κετολίδια D.r 3.4 1P9X (Berisio et al., 2003) D.r 3.4 - (Wilson et al., 2005) H.m 2.6 1YIJ (Tu et al., 2005) * Τα PDB αρχεία βρίσκονται στο http://www.rcsb.org/pdb και μπορούν να ανοιχθούν και επεξεργαστούν με τα προγράμματα Rasmol, Swiss-pdb-Viewer και το PyMOL.Συντμήσεις: D.r, Deinococcus radiodurans, H.m, Haloarcula marismortui. Παρόλο όμως, που οι κρυσταλλογραφικές αυτές μελέτες συμφωνούν στο βασικό τρόπο αλληλεπίδρασης των αντιβιοτικών με το ριβόσωμα-στόχο, υπάρχουν σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ των δομικών μοντέλων που δημοσιεύτηκαν από τις δυο ερευνητικές ομάδες, όσον αφορά τη διαμόρφωση του αντιβιοτικού per se και τις αλληλεπιδράσεις του με το ριβόσωμα. Οι βασικότερες είναι οι εξής: i) Ο εκτεταμένος βραχίονας της τελιθρομυκίνης έχει τελείως διαφορετικό προσανατολισμό στα δυο μοντέλα. Στην περίπτωση του μοντέλου που προέκυψε από τη μελέτη του D.radiodurans, ο βραχίονας προσανατολίζεται προς το τούνελ εξόδου και δημιουργεί αλληλεπιδράσεις με

την περιοχή ΙΙ του 23S rrna (Α751, Α789 και U790). Αντίθετα, στo άλλο μοντέλο, ο βραχίονας έχει αντίθετο προσανατολισμό και δημιουργεί αλληλεπίδραση με τη βάση U2609. ii) Δυο μόρια αζιθρομυκίνης βρέθηκαν να προσδένονται στο ριβόσωμα του βακτηρίου D. radiodurans (Σχήμα 3.9), σε αντίθεση με τις κρυσταλλογραφικές μελέτες στο αρχαιοβακτήριο H. marismortui, όπου ένα μόριο αζιθρομυκίνης προσδένεται ανά ριβόσωμα. Το πρώτο μόριο δεσμεύεται στην κλασική θέση πρόσδεσης των μακρολιδίων, ενώ το δεύτερο τοποθετείται δίπλα στο πρώτο, αλλά πιο βαθιά στο τούνελ, δημιουργώντας υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις και δεσμούς υδρογόνου με rrna συστατικά της περιοχής ΙΙ και αμινοξέων των πρωτεϊνών L4 και L22. Να σημειωθεί ότι στην πρόσδεση του δευτέρου μορίου αζιθρομυκίνης, ένα ιόν Mg 2+ φαίνεται να παρεμβάλλεται μεταξύ αντιβιοτικού και ριβοσώματος (Schlunzen et al., 2003). Οι παραπάνω διαφορές μεταξύ των δυο μοντέλων μπορεί να οφείλονται σε τρεις παράγοντες (Wilson et al., 2005): i) σε συγκεκριμένες διαφορές μεταξύ των ειδών, όπως στην αλληλουχία και/ή σε διαμορφωτικές αλλαγές του 23S rrna ή των πρωτεϊνών στις πρωτεΐνες του ριβοσώματος, ii) σε ιοντικούς λόγους, όπως η υψηλή περιεκτικότητα σε ιόντα των ριβοσωμάτων των αρχαιοβακτηρίων που μπορεί να επηρεάζει τη διαμόρφωσή τους, και iii) σε λανθασμένη ή ανακριβή επεξεργασία των χαρτών ηλεκτρονικών πυκνοτήτων, λόγω χαμηλής ανάλυσης ορισμένων περιοχών. Επανάληψη της κρυσταλλογραφικής ανάλυσης στο βακτήριο D. radiodurans (Wilson et a., 2005) επιβεβαίωσε την πρώτη και την τρίτη εκδοχή. Η διαφορά στον προσανατολισμό του βραχίονα της τελιθρομυκίνης φαίνεται να οφείλεται στην υψηλή κινητικότητά του, η οποία του επιτρέπει να εγκατασταθεί σε μια χαμηλή ενεργειακά θέση που είναι πιθανότατα διαφορετική μεταξύ των δυο οργανισμών. Η θέση αυτή φαίνεται να επηρεάζεται από τις διαφορές στην αλληλουχία και στη δομή της περιοχής ΙΙ του 23S rrna, που δεν είναι συντηρημένη μεταξύ των δυο οργανισμών (Hansen et al., 1999; Canu et al., 2002; Xiong et al., 1999, Tu et al., 2005)..

Ακόμα, οι διαφορές της περιοχής μπορεί να οφείλονται σε ιδιοσυγκρατικά χαρακτηριστικά των ριβοσωματικών πρωτεϊνών L4, L22 και L32, που καθορίζουν τη διατομή του τούνελ εξόδου και μπορεί να συμβάλλουν στην αποκατάσταση μιας εξατομικευμένης φυσιογνωμίας στη διαμόρφωση της περιοχής ΙΙ για κάθε οργανισμό (Chittum and Champney, 1994; Gregory and Dahlberg, 1999; Tenson and Ehrenberg, 2002; Wilson et al., 2005). Πιο πιθανή όμως, είναι η διαφοροποίηση της περιοχής λόγω του ιοντικού περιβάλλοντος μεταξύ των δυο οργανισμών (Tu et al., 2005; Yonath and Bashan, 2004), που μπορεί να επηρεάζει την τοπική διαμόρφωση. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ριβοσώματος και μακρολιδίων, όπως έχουν περιγραφεί από κρυσταλλογραφικά δεδομένα στο βακτήριο D. radiodurans που είναι εξελικτικά πιο κοντά στο βακτήριο E. coli δίνονται στο Σχήμα 3.9. Τα τελευταία χρόνια έχει γίνει γνωστό ότι ένας μεγάλος αριθμός αντιβιοτικών που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση, όπως τα μακρολίδια, έχουν διπλή δράση, εφόσον αναστέλλουν και τη συγκρότηση (assembly) της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας (Champney, 2001; Champney, 2003). Σε όλες τις περιπτώσεις μακρολιδίων που μελετήθηκαν το ανασταλτικό αποτέλεσμα της δράσης των μακρολιδίων στη μετάφραση και τη συγκρότηση της 50S υπομονάδας ήταν το ίδιο και ανέστειλε το κάθε μακρολίδιο τη συγκρότηση μόνο της 50S υπομονάδας (Chittum & Champney, 1995). Ενδελεχείς μελέτες έχουν γίνει για τα μακρολίδια ερυθρομυκίνη (Chittum and Champney, 1994; Chittum and Champney, 1995), αζιθρομυκίνη (Champney and Burdine, 1998; Champney and Miller, 2002) και τα κετολίδια (τελιθρομυκίνη και σεθρομυκίνη) (Champney and Pelt, 2002; Champney and Tober, 2003) και έχει δοθεί ακριβές μοντέλο δράσης τους (Σχήμα 3.10).

Σχήμα 3.10: Μοντέλο σχηματισμού της 50S υπομονάδας σε βακτήρια. Η ερυθρομυκίνη αναστέλλει τη συγκρότηση της υπομονάδας, δίνοντας χρόνο στις ριβονουκλεάσες να δράσουν (Champney et al., 2003). 4. Ιοντικό περιβάλλον: Επίδραση στη ριβοσωματική λειτουργία To ιοντικό περιβάλλον επηρεάζει άμεσα τη ριβοσωματική λειτουργία, εφόσον τα κατιόντα αποδεδειγμένα παρεμβαίνουν στη ριβοσωματική διαμόρφωση. Συγκεκριμένα, τα δισθενή κατιόντα, κυρίως το Mg 2+, ευνοούν μια συνεκτική ριβοσωματική δομή, σε αντίθεση με τα μονοσθενή κατιόντα που ευνοούν μια χαλαρή δομή (Allen and Wong, 1986; Klein et al., 2004). Απουσία ή ακόμη και μείωση της συγκέντρωσης των κατιόντων κατά την διαδικασία απομόνωσης ριβοσωμάτων, οδηγεί στην αδρανοποίησή τους, η άρση της οποίας απαιτεί όχι μόνον θέρμανση, αλλά και προσθήκη κατάλληλων αλάτων (Draper, 1995; Miskin et al., 1970; Zamir et al., 1971). Η επανάκτηση της ριβοσωματικής ενεργότητας υπό τις συνθήκες αυτές, αποδεικνύει ότι η λειτουργικότητα των ριβοσωμάτων σχετίζεται με δυναμικές αλλαγές διαμόρφωσης, οι οποίες είναι αποτέλεσμα μεταβολών στις αλληλεπιδράσεις των ριβοσωματικών συστατικών. Η παρέμβαση των κατιόντων σ αυτές τις αλληλεπιδράσεις είναι σε τέτοιο βαθμό καθοριστική, ώστε να θεωρούνται τα κατιόντα ως το τρίτο ριβοσωματικό συστατικό. Η παρουσία μονοσθενών (ΝΗ 4+ ) και δισθενών (Μg 2+ ) κατιόντων στην καταλυτική δράση των ριβοσωμάτων είναι ιδιαιτέρως σημαντική. Πλήθος μελετών επιβεβαιώνουν τη σημασία τους στις ιοντικές απαιτήσεις της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Klein et al., 2004; Michelinaki et al., 1997; Pestka,

1977; Spirin, 1990; Synetos and Coutsogeorgopoulos, 1989), και στην αποκατάσταση της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής του ριβοσώματος (Batey and Williamson, 1998; Draper et al., 1995; Lu and Draper, 1994; Wang et al., 1993). Η δράση των ιόντων Mg 2+ συνιστάται στα εξής: i) σταθεροποιούν τη δευτεροταγή δομή με μη εξειδικευμένη πρόσδεση, ii) σταθεροποιούν την τριτοταγή δομή του rrna με πρόσδεση σε εξειδικευμένες θέσεις, όπου δεν μπορούν να δεσμευτούν άλλα κατιόντα, και iii) εξουδετερώνουν το φορτίο σε υψηλά φορτισμένες περιοχές του rrna. Στην τελευταία περίπτωση, τα ιόντα Mg 2+ μπορούν να υποκατασταθούν και από άλλα δισθενή καθώς και μονοσθενή κατιόντα (Laing et al., 1994). Η επίδραση των ιόντων Mg 2+ στην αποκατάσταση της λειτουργικής διαμόρφωσης των ριβοσωμάτων εκτιμήθηκε αρχικά με πειράματα σταυροσύνδεσης (cross-linking), μέσω των οποίων επιβεβαιώθηκε η σημασία τους στη λειτουργία του κέντρου αποκωδικοποίησης στη 30S υπομονάδα (Noah and Wollenzien, 1998). Πρόσφατα, κρυσταλλογραφικές μελέτες χαρτογράφησαν τις περιοχές πρόσδεσής τους και έδειξαν ότι εστιάζονται στην περιοχή του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος, σε διαφασικές περιοχές μεταξύ ριβοσωματικών πρωτεϊνών και rrna καθώς και σε περιοχές που αναπτύσσουν τριτοταγείς αλληλεπιδράσεις, όπως οι περιοχές ΙΙ και V του 23S rrna (Klein et al., 2004). Συστατικό του ιοντικού περιβάλλοντος των ριβοσωμάτων αποτελεί και μια κατηγορία αλειφατικών πολυαμινών, οι οποίες σε φυσιολογικές τιμές ph συμπεριφέρονται ως πολυκατιοντικά μόρια (δι-, τρι- και τετρα- σθενή). Οι πολυαμίνες πουτρεσκίνη, σπερμιδίνη και σπερμίνη (Σχήμα 4.1) είναι βιογενή μόρια, που απαντώνται ευρέως τόσο στους προκαρυωτικούς, όσο και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Cohen, 1998). Στο εντεροβακτήριο Ε. coli απαντώνται φυσιολογικά η πουτρεσκίνη (20 mm) και η σπερμιδίνη (6 mm) (Tabor and Tabor, 1985). Μελέτες όμως δείχνουν ότι εξωγενής σπερμίνη εισέρχεται στο κύτταρο χρησιμοποιώντας τον μεταφορέα της σπερμιδίνης (Igarashi and Kashiwagi, 2000; Karahalios et al.,

1999; Karahalios et al., 1998; Tabor and Tabor, 1985). Λόγω της υψηλότερης δραστικότητάς της, η σπερμίνη σε μικρές συγκεντρώσεις, είναι ικανή να υποκαταστήσει πλήρως το βιολογικό ρόλο της πουτρεσκίνης και σπερμιδίνης στις κυτταρικές απαιτήσεις (Kakegawa et al., 1991). Πουτρεσκίνη : H 3 N NH 3 Σπερμιδίνη: Σπερμίνη: H 3 N Σχήμα 4.1: Δομή των πολυαμινών H 3 N N H2 NH 3 N H2 H 2 N NH 3 Σε σύγκριση με άλλα μονοσθενή ή δισθενή κατιόντα (Na +, K +, Mg 2+, Ca 2+ ), ο πολυβασικός χαρακτήρας των πολυαμινών προσδίδει σε αυτές ισχυρή συγγένεια προς όξινες ομάδες διαφόρων μακρομορίων, γεγονός που αποτελεί τη βάση της βιολογικής τους δράσης. Ο ρόλος τους στη ρύθμιση της ανάπτυξης, του αναπαραγωγικού κύκλου, της διαφοροποίησης και απόπτωσης των κυττάρων είναι θεμελιώδης και οφείλεται, τουλάχιστον μερικώς, στις αλληλεπιδράσεις αυτών των πολυαμινών με τα νουκλεϊνικά οξέα (Cohen, 1998; Igarashi and Kashiwagi, 2000). Η σπερμίνη, δεσμευόμενη σε αυτά, σταθεροποιεί ειδικές διαμορφώσεις του DNA και του RNA, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό των νουκλεοσωματίων, τη συγκρότηση της χρωματίνης, τη μεταγραφή, τις μετα-μεταγραφικές επεξεργασίες του mrna και την πρωτεϊνική σύνθεση (Bachrach et al., 2001; Bhattacharya et al., 2003; Childs et al., 2003; Feuerstein et al., 1990; Frydman et al., 1992; He et al., 1993; Pollard et al., 1999). Η μελέτη του βιολογικού ρόλου των πολυαμινών σε επίπεδο πρωτεϊνικής σύνθεσης έχει αποτελέσει πεδίο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας. Πολυάριθμες in vivo και in vitro μελέτες έχουν δημοσιευθεί και αφορούν την επίδραση των πολυαμινών σε ειδικά στάδια της

μετάφρασης, όπως i) στη σύνθεση του aa-trna (Takeda and Igarashi, 1969), ii) στη συγκρότηση και σύζευξη των 30S και 50S υπομονάδων (Igarashi and Kashiwagi, 2000; Kakegawa et al., 1986a; Umekage and Ueda, 2006), iii) στην πρόσδεση των υποστρωμάτων και στην πιστότητα της μεταγραφής (Abraham, 1983; Agrawal et al., 1999; Igarashi et al., 1982; Igarashi et al., 1980; Ito and Igarashi, 1986; Naranda and Kucan, 1989; Rheinberger and Nierhaus, 1987; Shimogori et al., 1996; Thompson et al., 1981), iv) στη σύνθεση ολιγοπεπτιδίων (Bartetzko and Nierhaus, 1988; Igarashi et al., 1997), και v) στη σύνθεση ριβοσωματικών πρωτεϊνών και μεταφραστικών παραγόντων (Igarashi et al., 1980). Η επίδραση των πολυαμινών κατά τον σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού έχει μελετηθεί με κινητική ανάλυση, η οποία επέτρεψε τη διευκρίνιση του μηχανισμού δράσης τους (Drainas and Kalpaxis, 1994; Kalpaxis and Drainas, 1992; Kalpaxis and Drainas, 1993; Michelinaki et al., 1997; Vester and Douthwaite, 2001). Επόμενες μελέτες προσδιόρισαν το ρόλο του φορτίου και της διαμορφωτικής ελευθερίας του μορίου της σπερμίνης στη βιολογική της δράση (Karahalios et al., 1999; Karahalios et al., 1998). Οι πολυαμίνες όπως είχε προβλεφθεί από παλαιά (Tabor and Tabor, 1985), αλλά και όπως αποκάλυψαν προσφάτως μέθοδοι ανοσοηλεκτρομικροσκοπίας, εντοπίζονται σε ελεύθερα ριβοσώματα ή σε ριβοσώματα προσδεδεμένα στο ενδοπλασματικό δίκτυο ευκαρυωτικών κυττάρων (Shin et al., 2006) (Σχήμα 4.2). Εν τούτοις, οι μελέτες για την ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσής τους στο ριβόσωμα και ιδίως στο rrna με το οποίο αλληλεπιδρούν, αν και ξεκίνησαν πριν 35 χρόνια χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της σταυροσύνδεσης (Millon et al., 1980; Stevens and Pascoe, 1972; Wower et al., 1981), δεν κατέληξαν σε θετικό αποτέλεσμα. Ταυτοποιώντας τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες που επισημαίνονται από πολυαμίνες με μεθόδους σταυροσύνδεσης, οι Kakegawa et al. (Kakegawa et al., 1986b) κατέληξαν έμμεσα στο συμπέρασμα ότι οι πολυαμίνες προσδένονται κυρίως γύρω από το καταλυτικό κέντρο. Παρά την αλματώδη ανάπτυξη της κρυσταλλογραφίας τα τελευταία

χρόνια, οι θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών στο ριβόσωμα δεν έχουν ακόμα προσδιοριστεί. Δυο φαίνονται να είναι οι λόγοι: i) η σπερμίνη όπως και οι υπόλοιπες πολυαμίνες, είναι μικρά και ευέλικτα μόρια με αποτέλεσμά να απομακρύνονται εύκολα από την περιοχή πρόσδεσης τους με την πάροδο του χρόνου, και ii) δεν έχουν επιτευχθεί τόσο μεγάλης διακριτικότητας κρύσταλλοι, για να επιτρέψουν την ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσής των πολυαμινών. Μόνο κρυσταλλογραφικές μελέτες σε σύμπλοκα trna με τη σπερμίνη έχουν αναφερθεί ως τώρα (Cohen, 1998), ενώ NMR και άλλες τεχνικές έχουν περιορισθεί στην ανίχνευση των θέσεων πρόσδεσης μετάλλων (Banatao et al., 2003; Tanaka et al., 2002). Πρόσφατα, χρήση φωτοδραστικών αναλόγων των πολυαμινών επέτρεψε την ομοιοπολική τους πρόσδεση στα ριβοσωματικά σύμπλοκα και την ταυτοποίηση αρχικά των ριβοσωματικών πρωτεϊνών που σημαίνονται (Amarantos et al., 2001) και στη συνέχεια των θέσεων πρόσδεσής τους στο trna (Amarantos and Kalpaxis, 2000), στο 16S (Amarantos et al., 2002) και στο 23S rrna (Xaplanteri et al., 2005) (Σχήμα 4.2). Η τεχνική αυτή επέτρεψε επιπρόσθετα, τη μελέτη των διαμορφωτικών αλλαγών που επάγονται στο ριβόσωμα από τη σπερμίνη, καθώς και τη διαλεύκανση σε μοριακό επίπεδο της επίδρασης της σπερμίνης σε διάφορες ριβοσωματικές λειτουργίες, όπως στη σύζευξη των υπομονάδων, στην πρόσδεση των υποστρωμάτων στην Α- και την Ρ- θέση, στη δραστικότητα της PΤάσης (Xaplanteri et al., 2005). Από κλινικής άποψης είναι ενδιαφέρον, ότι τα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από υψηλές συγκεντρώσεις πολυαμινών. Ως επακόλουθο, η συγκέντρωση των πολυαμινών στα βιολογικά υγρά αποτελεί ένα από τους μετρούμενους καρκινικούς δείκτες. Παράλληλα, παράγωγα πολυαμινών δοκιμάζονται κλινικά ως αντιπαρασιτικά και αντικαρκινικά φάρμακα (Marton and Pegg, 1995).

Α Β Γ PDB:1VOZ PDB: 1J5A Σχήμα 4.2: (Α) Θέσεις πρόσδεσης σπερμίνης, όπως ανιχνεύτηκαν από ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Εστιάζοντας, φαίνεται μια έντονη ανοσοαντίδραση με τις πολυαμίνες σε ελεύθερα (πολυσώματα) και σε δεσμευμένα στο ενδοπλασματικό δίκτυο ριβοσώματα (κόκκινα βέλη). Στον πυρήνα και στα μιτοχόνδρια δεν ανιχνεύτηκαν πολυαμίνες (Shin et al., 2006). (Β) Θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών (ροζ) στο 16S του εναρκτηρίου ριβοσωματικού συμπλόκου. Με πράσινο χρώμα σημειώνεται η έλικα h44 και με μπλε χρώμα η έλικα h27 (Amarantos et al., 2002). (Γ) Θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών (ροζ) στο 23S rrna. Με πράσινο χρώμα σημειώνεται η περιοχή του καταλυτικού κέντρου και με μπλε ανοιχτό η περιοχή πρόσδεσης μεταφραστικών παραγόντων (Xaplanteri et al., 2005). Όσον αναφορά την επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος στη δράση των αντιβιοτικών που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση φαίνεται ότι, όπως τα μονοσθενή και δισθενή κατιόντα, έτσι και οι πολυαμίνες παρεμβαίνουν στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αντιβιοτικών και

ριβοσώματος. Παρ' ότι η διερεύνηση του ρόλου των μονοσθενών και δισθενών κατιόντων έχει προσλάβει ευρείες διαστάσεις (Moore, 1995), αντίστοιχες μελέτες διαλεύκανσης του ρόλου των πολυαμινών στο μηχανισμό δράσης των αντιβιοτικών έχουν πραγματοποιηθεί σε περιορισμένη έκταση. Μελέτες σε in vitro συστήματα E. coli έδειξαν ότι αύξηση της συγκέντρωσης πολυαμινών αυξάνει τη δράση της στρεπτομυκίνης (Goldemberg and Algranati, 1981a; Teraoka and Tanaka, 1973a) και της τετρακυκλίνης (Dionne et al., 1975). Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με in vivo μελέτες, όπου στελέχη που στερούνται πολυαμίνες εμφάνισαν μειωμένη ευαισθησία έναντι στρεπτομυκίνης, νεομυκίνης, καναμυκίνης και αμικασίνης καθώς και έναντι της καζουγκαμυκίνης, χωρίς όμως αυτό να οφείλεται σε μειωμένη διέγερση του διαμεμβρανικού συστήματος μεταφοράς των αντιβιοτικών αυτών (Goldemberg and Algranati, 1981a; Goldemberg and Algranati, 1981b; Nastri and Algranati, 1988; Nastri et al., 1993). Ο ισχυρός κατιοντικός χαρακτήρας των αμινογλυκοζιτών και η αύξηση της δράσης τους παρουσία πολυαμινών οδήγησε στο συμπέρασμα, ότι απαιτείται συγκεκριμένη διαμόρφωση του ριβοσώματος για να δράσουν, η οποία πιθανότατα καθορίζεται από το ιοντικό περιβάλλον (Goldemberg and Algranati, 1981b; Nastri and Algranati, 1996). Να σημειωθεί ότι η αύξηση της δράσης της καζουγκαμυκίνης που δεν επιδρά στη πιστότητα, αλλά μπλοκάρει τo μονοπάτι του mrna (Mankin, 2006; Schluenzen et al., 2006; Schuwirth et al., 2006), μπορεί να οφείλεται και στο γεγονός ότι απουσία πολυαμινών δεν μεθυλιώνονται οι θέσεις A1518 and A1519 του 16S rrna (Igarashi et al., 1979), που είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την πρόσδεση του αντιβιοτικού στο ριβόσωμα (Helser et al., 1971; Van Buul et al., 1983). Έκπληξη αποτελεί το γεγονός, ότι η δράση του αμινογλυκοζίτη παρομομυκίνη σε in vivo σύστημα ζύμης αυξάνεται απουσία πολυαμινών. Διατυπώθηκε η υπόθεση ότι απουσία πολυαμινών. Διατυπώθηκε η υπόθεση ότι απουσία πολυαμινών διευκολύνεται η είσοδος του αντιβιοτικού στο κύτταρο ή η πρόσδεσή του στο ριβόσωμα. Βέβαια η δεύτερη ερμηνεία έρχεται σε αντίθεση με σχετικά πειράματα στο βακτήριο E. coli (Balasundaram et al., 1999).

Πρόσφατες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας διερεύνησαν με κινητικές μεθόδους την επίδραση των πολυαμινών σε ορισμένες κατηγορίες αντιβιοτικών. Έτσι, όταν ξεκίνησε η διδακτορική διατριβή ήταν γνωστό ότι οι πολυαμίνες διεγείρουν την πρόσδεση της χλωραμφαινικόλης στο ριβόσωμα (Xaplanteri et al., 2003). Πιο πρόσφατα, δείχθηκε ότι οι πολυαμίνες ευνοούν επίσης τη δράση της κλινδαμυκίνης (Kouvela et al., 2006). Επίσης, μελέτες που έγινε κατά τη διάρκεια της μεταπτυχιακής μου διατριβής έδειξαν ότι οι πολυαμίνες αναστέλλουν την πρόσδεση στο ριβόσωμα ενός επιπλέον μακρολιδίου, της σπιραμυκίνης (Petropoulos et al., 2004). Τα αποτελέσματα βρίσκονται σε συμφωνία με παλαιότερες μελέτες έχουν δείξει, ότι προεπώαση των ριβοσωμάτων με σπερμίνη προκαλεί αλλαγές στη διαμόρφωση στο ριβόσωμα που περιορίζουν την ικανότητά του να προσδένει ερυθρομυκίνη (Teraoka and Tanaka, 1973b). Πίνακας ΙV: Επίδραση των πολυαμινών στη δράση αντιβιοτικών. Αντιβιοτικά Επίδραση πολυαμινών Αναφορές Στρεπτομυκίνη + (Goldemberg and Algranati, 1981a, b; Nastri and Algranati, 1988; Nastri et al., 1993; Teraoka and Tanaka, 1973a) Τετρακυκλίνη + (Dionne et al., 1975) Νεομυκίνη + (Goldemberg and Algranati, 1981a, b) Καναμυκίνη + (Goldemberg and Algranati, 1981a, b) Αμικασίνη + (Goldemberg and Algranati, 1981b) Καζουγκαμυκίνη + (Goldemberg and Algranati, 1981a, b) Χλωραμφενικόλη + (Xaplanteri et al., 2003) Βλαστισιδίνη + Προκείμενη εργασία Κλινδαμυκίνη + (Kouvela et al., 2006) Ερυθρομυκίνη - (Teraoka and Tanaka, 1973b)/ Προκείμενη εργασία Σπιραμυκίνη - (Petropoulos et al., 2004) Τυλοσίνη - Προκείμενη εργασία Αζιθρομυκίνη - Προκείμενη εργασία Τελιθρομυκίνη - Προκείμενη εργασία

5. Στόχος Διατριβής Το ιοντικό περιβάλλον, που αποτελείται από μονοσθενή, δισθενή και πολυκατιόντα (πολυαμίνες), παρεμβαίνει στη ριβοσωματική διαμόρφωση και εμπλέκεται άμεσα στη λειτουργία του ριβοσώματος καθώς και στην πρόσδεση των υποστρωμάτων του. Στόχος της προκείμενης εργασίας είναι να διερευνηθεί ο ρόλος του ιοντικού περιβάλλοντος στο μηχανισμό δράσης και την ισχύ αναστολέων της πρωτεϊνικής σύνθεσης και να δοθεί ερμηνεία για το ρόλο αυτό σε μοριακή βάση. Με τον τρόπο αυτό θα αντληθούν πληροφορίες για έναν παράγοντα που υπεισέρχεται στις αλληλεπιδράσεις του ριβοσώματος με τους προσδέτες του και πρέπει απαραιτήτως να λαμβάνεται υπόψιν κατά το σχεδιασμό φαρμακευτικών προϊόντων. Παράλληλα, σκοπός της προκείμενης εργασίας είναι να διερευνηθεί ο μηχανισμός δράσης ορισμένων αντιβιοτικών, εφαρμόζοντας εναλλακτικές πειραματικές προσεγγίσεις και συγκρίνοντας δεδομένα από κινητική ανάλυση, με πειράματα χημικής προστασίας (πειράματα αποτύπωσης, footprinting) και κρυσταλλογραφικά δεδομένα. Πιστεύουμε, ότι η επίτευξη αυτών των στόχων συντελεί στη διαλεύκανση του μηχανισμού αλληλεπίδρασης ορισμένων αντιβιοτικών με το ριβόσωμα και στην κατανόηση αντικρουόμενων απόψεων της βιβλιογραφίας όσον αφορά την ισχύ των αντιβιοτικών αυτών, την στοιχειομετρία των αλληλεπιδράσεων, τη θέση πρόσδεσης στο ριβόσωμα, τις επιπτώσεις στις ριβοσωματικές λειτουργίες και, τέλος, τη σημασία του ιοντικού περιβάλλοντος.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

6.2 ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ 6.2.1 Διαλύματα Ηλεκτροφόρησης και Χρώσης : Διαλύματα Συστατικά Ποσότητα Πηκτή πολυακρυλαμιδίου 5% (stacking gel) Πηκτή πολυακρυλαμιδίου 15% (separating gel) Πηκτή πολυακρυλαμιδίου 10% (separating gel) Πηκτή πολυακρυλαμιδίου 6% (sequencing gel) 1.5Μ Tris-HCl, ph 6.8 30% Acrylamide, 37.5:1 10% SDS mq-h 2 O 10% APS TEMED 1.5Μ Tris-HCl, ph 8.8 30% Acrylamide, 37.5:1 10% SDS mq-h 2 O 10% APS TEMED TBE 10x Urea 40% Acrylamide 19:1 mq-h 2 O 10% APS TEMED TBE 10x Urea 50% Acrylamide 19:1 mq-h 2 O 20% APS TEMED 50% Διάλυμα ακρυλαμιδίου 19:1 Acrylamide Bis-acrylamide Πηκτή αγαρόζης Agarose TBE 1x Ethidium Bromide Coomassie blue Coomassie blue R-250 Methanol Acetic acid (glacial) mq-h 2 O 1.25ml 0.85ml 50μl μέχρι 5ml 15μl 5μl 2.5ml 5.0ml 100μl μέχρι 10ml 50μl 10μl 2.5ml 11.25g 6.25ml μέχρι 25ml 200μl 20μl 15ml 63g 18ml μέχρι 150ml 600μl 48μl 190g 10g μέχρι 400ml 0.8-2.0% w/v μέχρι 50ml 3μl 95g 240ml 50ml 210ml Toluidine blue Ρυθμιστικό διάλυμα αποχρωματισμού (Destain buffer) Toluidine blue Acetic acid (glacial) mq-h 2 O Methanol Acetic acid (glacial) mq-h 2 O 100mg 5ml μέχρι 100ml 250ml 80ml 670ml

Μη αποδιατακτικό ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (Non-denaturing loading buffer) SDS ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (SDS loading buffer) RNA ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (5x) (RNA loading buffer) Ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης για ανάλυση αλληλουχίας νουκλεοτιδίων TBE (10x) SDS ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (5x) Μη αποδιατακτικό ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (5x) Bradford (5x) 0.5M Tris ph 6.8 Glycerin 87% b-etsh Bromophenol blue 0.2% mq-h 2 O 0.5M Tris ph 6.8 Glycerin 87% SDS 10% b-etsh Bromophenol blue 0.2% mq-h 2 O 1M Tris-HCl ph 7.5 0.5M EDTA ph 8.0 Urea Xylen Cyanol Bromophenol blue mq-h 2 O TBE 1x Urea Xylen Cyanol Bromophenol blue mq-h 2 O Tris Boric acid EDTA mq-h 2 O Tris Glycin SDS mq-h 2 O Tris Glycin mq-h 2 O Brilliant Blue-G EtOH abs H 3 PO 4 mq-h 2 O 1.8ml 1.15ml 20μl 50μl μέχρι 10ml 1.8ml 1.15ml 2ml 20μl 50μl μέχρι 10ml 100μl 20μl 4.8g 5mg 5mg μέχρι 10ml 10μl 4.8g 3mg 3mg μέχρι 10ml 108g 55g 9.3g μέχρι 1lt 30g 144g 2g μέχρι 1lt 30g 144g μέχρι 1lt 0.1g 52.5ml 100ml 47.5ml 6.2.2 Διαλύματα για λειτουργικές μελέτες και παρασκευές: Διαλύματα Συστατικά C τελικές (mm) Ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (Η 20 N 150 M 4.5 SH 6 Spd 2 Spm 0.05 ) Hepes-KOH ph 7.4 Ammonium acetate Magnesium acetate b-etsh Spermidine Spermine 20 mm 150 mm 4.5 mm 6 mm 2 mm 0.05 mm

Ρυθμιστικό διάλυμα Tico (H 20 N 30 M 6 SH 4 ) Hepes-KOH ph 7.4 Ammonium acetate Magnesium acetate b-etsh Ρυθμιστικό Διάλυμα Α (ΡΔΑ) 1Μ Tris-HCl ph 7.4 Magnesium acetate KCl b-etsh Ρυθμιστικό Διάλυμα B (ΡΔB) 1Μ Tris-HCl ph 7.4 Magnesium acetate NH 4 Cl ph 7.4 b-etsh ΤΜΚ-150/200/500 Tris-HCl ph 7.4 Magnesium acetate Potassium acetate Ρυθμιστικό διάλυμα αποσύζευξης (H 20 N 200 M 1 SH 4 ) Ρυθμιστικό διάλυμα επανασύζευξης (H 20 K 30 M 20 SH 4 ) Hepes-KOH ph 7.4 Ammonium acetate Magnesium acetate b-etsh Hepes-KOH ph 7.4 KCl Magnesium acetate b-etsh Rec4 Hepes-KOH ph 7.4 Ammonium acetate Magnesium acetate EDTA b-etsh Rec4-6U Hepes-KOH ph 7.4 Ammonium acetate Magnesium acetate EDTA b-etsh Urea HM4 Hepes-KOH ph 7.4 Magnesium acetate EDTA Ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης (Extraction Buffer) Bray s Tris-HCl ph 7.8 DTT SDS NaCl PPO POPOP Naphthalene Ethylenoglycol Methanol Dioxane 20mM 30mM 6mM 4mM 10mM 10mM 60mM 6mM 10mM 10mM 500mM 6mM 10mM 10mM 150/200/500mM 20mM 200mM 1mM 4mM 20mM 30mM 20mM 4mM 20mM 400mM 4mM 0.2mM 4mM 20mM 400mM 4mM 0.2mM 4mM 6M 20mM 4mM 0.2mM 10mM 1mM 1% 100mM 8g 0.4g 120g 40ml 200ml 1760ml

6.2.3 Διαλύματα για μικροβιολογικές και μοριακές μεθόδους: Διαλύματα Συστατικά Ποσότητες LB-medium για καλλιέργειες μετασχηματισμένων E. coli κυττάρων LB-medium για E. coli Κ12 καλλιέργειες LB- άγαρ τρυβλία Buffer P1 (ρυθμιστικό διάλυμα επαναιώρησης) Buffer P2 (ρυθμιστικό διάλυμα λύσης) Buffer P3 (ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης) Buffer QBT (ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης) Buffer QC (ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης) Buffer QF (ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης) Bacto-Tryptone Yeast Extract NaCl NaOH dh 2 O + Ampicillin Peptone from meat Yeat Extract KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 Glucose dh 2 O Bacto-Tryptone Yeast Extract NaCl NaOH Agar dh 2 O + Ampicillin Tris-HCl ph 8.0 EDTA RNase A NaOH SDS CH 3 COOK ph 5.5 NaCl MOPS ph 7.0 Isopropanol Triton X-100 NaCl Tris-HCl ph 7.0 Isopropanol NaCl Tris-HCl ph 8.5 Isopropanol Buffer TE Tris-HCl ph 8.0 EDTA Δ/μα υβριδοποίησης (4.5x) Hepes-KOH 7.4 KCl Ρυθμιστικό διάλυμα προέκτασης (Extension buffer) Tris-CH 3 COOH ph 8.3 DTT MgCl 2 10g 5g 10g 1ml μέχρι 1lt 100μg/ml 17g 21.8g 5.0g 10.0g 10.0g μέχρι 1lt 10g 5g 10g 1ml 15% w/v μέχρι 1lt 100μg/ml 50mM 10mM 100μg/ml 200mM 1% w/v 3M 750mM 50mM 15% v/v 0.15% v/v 1.0M 50mM 15% v/v 1.25M 50mM 15% v/v 10mM 1mM 225mM 450mM 637.5mM 127.5mM 127.5mM

dntps Μείγμα προπέκτασης για 6 δείγματα (Extension Mix) Διάλυμα αραίωσης ενζύμου αντίστροφης μεταγραφάσης (Dilution buffer) Chase Mix Διάλυμα κατακρήμνισης Διάλυμα διακοπής της αντίδρασης DMS (DMS stop) PCR mix (2x) datp dttp dctp dgtp Extension buffer dntps [a- 32 P] datp mq-h 2 O Tris-CH 3 COOH ph 8.3 DTT 80% Glycerol σε Η2Ο datp dctp dttp dgtp mq-h 2 O EDTA CH 3 COONa Tris-CH 3 COOH ph 7.5 b-etsh CH 3 COONa EDTA Taq DNA polymerase Tris-HCl KCl MgCl 2 Gelatin dntp 0.741mM 2.856mM 2.856mM 2.856mM 8μl 4μl 2μl 10μl 50mM 2mM 50% 1mM 1mM 1mM 1mM 1mM 300mM 1M 1M 1.5M 0.1mM 1.5 units 10mM 50mM 1.5mM 0.001% 0.2mM 6.2.4 Συστατικά του in vitro συζευγμένου σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης: Συστατικά C τελικές Συστατικά C τελικές HEPES-KOH (ph 8.2) 60 mm GTP 1 mm Ammonium acetate 80 mm UTP 1 mm Potassium glutamate 230 mm PEG-8000 2% (w/v) Sodium oxalate 3 mm Methionine 2 mm DTT 2 mm Αμινοξέα (19) 2 mm c-amp 0.7 mm Phospho(enol)pyruvic acid 35 mm Folinic acid 35 μg/ml Magnesium acetate 12 mm trna 350 μg/ml T7 RNA πολυμεράση 100 μg/ml NADH 0.35 mm Κυτταρικό εκχύλισμα E. coli S30 4-6 A 260 Coenzyme A 0.3 mm Πλασμίδιο (DNA) 4 μg/60 μl ATP 1.5 mm Rifampicin 10 μg/ml CTP 1 mm

6.2.5 Διαλύματα αντιβιοτικών: Τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη διαλυτοποιήθηκαν σε Η 2 Ο όπως η πουρομυκίνη (ph: 7 με ΚΟΗ), βλαστισιδίνη, τυλοσίνη, αμπικιλλίνη, στρεπτομυκίνη και εδεΐνη, σε 50% EtOH όπως η τετρακυκλίνη (12mM) ή σε 100% EtOH όπως η ερυθρομυκίνη (10mM), αζιθρομυκίνη (10mM) και τελιθρομυκίνη (10mM). H θειοστρεπτόνη διαλυτοποιήθηκε σε 100% DMSO. Σε κάθε περίπτωση όμως, η τελική συγκέντρωση της EtOH/DMSO στο διάλυμα αντίδρασης ήταν λιγότερη του 1% v/v (μέγιστο επιτρεπτό 2.5%). 7. ΜΕΘΟΔΟΙ-ΤΕΧΝΙΚΕΣ 7.1 Αναλυτικές Μέθοδοι 7.1.1 Φωτομέτρηση Προσδιορισμός συγκέντρωσης ριβοσωμάτων και νουκλεϊκών οξέων. Η συγκέντρωση των ριβοσωμάτων, των υπομονάδων τους και των νουκλεϊκών οξέων προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση αυτών στα 260 nm σε Η 2 Ο. Μια πρώτη εκτίμηση για την καθαρότητα αυτών έδωσε ο λόγος των τιμών τους στα 260 nm και στα 280 nm (Α 260 /Α 280 ). Α 260 /Α 280 = 1.8 για το καθαρό DNA* Α 260 /Α 280 = 2.0 για το καθαρό RNA* *Αυτοί οι παράγοντες ισχύουν για μεγάλου μοριακού βάρους νουκλεϊκά οξέα (Berger, 1987). Στην περίπτωση μικρότερων αλληλουχιών (<100 βάσεων), αυτός ο λόγος μπορεί να αλλάξει ανάλογα με τη σύστασή τους. Παραδείγματος χάρη, πλούσιες σε Α αλληλουχίες έχουν λόγο πάνω από 2.2, ενώ πλούσιες σε C μικρότερο του 1.5. Παράγοντες μετατροπής για ποσοτικοποίηση νουκλεϊκών οξέων (Nierhaus, 1990a): 70S ριβοσωματικά σύμπλοκα 50S ριβοσωματικές υπομονάδες : 1 A 260 = 24 pmol : 1 A 260 = 36 pmol

30S ριβοσωματικές υπομονάδες : 1 A 260 = 72 pmol 23S rrna : 1 A 260 = 37.4 pmol 5S rrna : 1 A 260 = 986.2 pmol trna : 1 A 260 = 1500 pmol 1 A 260 διπλής αλυσίδας του DNA 50 μg 1 A 260 μονής αλυσίδας DNA ή RNA (>100 βάσεων) 40 μg 1 Α 260 μονής αλυσίδας DNA ( <25 βάσεων) 20 μg 1 Α 260 μονής αλυσίδας DNA (30-80 βάσεων) 30 μg Προσδιορισμός της συγκέντρωσης πουρομυκίνης Η συγκέντρωση της πουρομυκίνης προσδιορίστηκε με φωτομέτρησή της στα 275 nm σε διάλυμα 0.1 M KOH. Ο συντελεστής μετατροπής από Α 275 σε mm βρέθηκε ότι είναι στα 275 nm ίσος με 20.3 x 10-3 Α 275 ml -1 M -1 (πάχος φωτομετρικής κυψελίδας = 1 cm). 7.1.2 Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών H συγκέντρωση των πρωτεϊνικών παραγόντων (FWR) που απομονώθηκαν, μετρήθηκε με τη μέθοδο Bradford. Η συγκέντρωση των ριβοσωματικών πρωτεϊνών (ΤΡ, Total Protein) προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση στα 230 nm. Οι συντελεστές μετατροπής που χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίησή τους ήταν (Nierhaus, 1990a): TP50: 1A 260nm of 50S =36 pmol =1 eu TP50 TP30: 1A 260nm of 30S =72 pmol =1 eu TP30 TP70: 1A 260nm of 70S =24 pmol =1 eu TP70 1A 230nm = 220μg = 10 eu 1A 230nm = 220μg = 8 eu 1A 230nm = 220μg = 10 eu 7.1.3 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Η τεχνική αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον ποιοτικό έλεγχο του rrna των 70S ριβοσωμάτων, των ριβοσωματικών υπομονάδων 50S και 30S, του απομονωμένου 23S και 5S rrna, καθώς και για την ανάλυση του πλασμιδιακού DNA μετά από απομόνωση και πολλαπλασιασμό του με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR).

Για τον ποιοτικό έλεγχο του rrna, 0.5 g αγαρόζης διαλύθηκαν σε 50 ml TBE (τελική συγκέντρωση 1%) και θερμάνθηκαν σε φούρνο μικροκυμάτων, όχι περισσότερο από 1 min. Στην περίπτωση ανάλυσης πλασμιδιακού DNA, το ποσοστό της πηκτής αγαρόζης εξαρτήθηκε από το αναμενόμενο μέγεθος του DNA (0.8% για θραύσματα DNA ~3000 βάσεων ή 1.5-2% για θραύσματα <600 βάσεων). Το διάλυμα αγαρόζης σε κάθε περίπτωση ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου και προστέθηκαν σε αυτό 3 μl ΕtBr. Το μίγμα επιστρώθηκε σε καλούπι μικρού (9x7x0.7 cm, όγκος= 50 ml) ή μεγάλου (14x8x0.7 cm, όγκος= 80 ml) όγκου. Τα rrna δείγματα (0.5 Α 260 /δείγμα) αναμείχθηκαν με ίση ποσότητα 2x ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης RNA (95% φορμαλδεΰδη) και επωάστηκαν για 5 min στους 70 0 C πριν την ηλεκτροφόρησή τους. Στα DNA δείγματα (0.2-1 μg) προστέθηκαν 1/6 όγκοι 6x ρυθμιστικού διαλύματος επίστρωσης DNA (2% SDS) και τα μείγματα ηλεκτροφορήθηκαν απευθείας. Η ηλεκτροφόρηση έγινε στα 100 V για ~30 min και τα ηλεκτροφορήματα παρατηρήθηκαν με UV λάμπα. Το μέγεθος των νουκλεϊκών οξέων υπολογίστηκε βάσει ειδικού DNA/RNA μάρτυρα (ladder) ή βάσει μαρτύρων γνωστού μεγέθους (23S ή 16S rrna ή trna). 7.1.4 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου χρησιμοποιήθηκε για το διαχωρισμό πρωτεϊνών (παρουσία ή απουσία του αποδιατακτικού παράγοντα SDS), νουκλεϊκών οξέων (RNA) και νουκλεοτιδίων (ανάλυση αλληλουχίας). Σε κάθε περίπτωση το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε ήταν το προτεινόμενο από την εταιρεία BioRad με μικρές τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα: Για διαχωρισμό πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε πηκτή 15% πολυακρυλαμιδίου παρουσία ή απουσία 2% SDS. Για την ομαλή εισαγωγή του δείγματος παρεμβλήθηκε πηκτή 5% πολυακρυλαμιδίου (stacking gel). Στα δείγματα προστέθηκε ίσος όγκος ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης

(loading buffer) που περιείχε SDS και ακολούθησε επώαση για 5 min στους 95 0 C ή ίσος όγκος μη αποδιατακτικού ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης που και παραλήφθηκε το στάδιο της επώασης. Η ηλεκτροφόρηση έγινε στα 110 V για 3 h παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης. Η ηλεκτροφόρηση υπό μη διατακτικές συνθήκες έγινε αρχικά στα 70 V για 15 min και στη συνέχεια στα 110 V για 30 min απουσία SDS, για ήπια εισαγωγή της πρωτεΐνης στην πηκτή. Για το διαχωρισμό νουκλεϊκών οξέων διαφορετικού μεγέθους (3000 nt, 1600 nt και 120 nt) χρησιμοποιήθηκε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 10%, απουσία «stacking gel». Στα δείγματα προστέθηκε ίσος όγκος ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης 2x για RNA και ηλεκτροφορήθηκαν στα 280 V για 30 min. Η εμφάνιση των ζωνών έγινε με διάλυμα με Toluidine Blue και ακολούθως με συνεχείς πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα αποχρωματισμού (Destain buffer). Για διαχωρισμό νουκλεοτιδίων χρησιμοποιήθηκε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 6% απουσία «stacking gel». Tα ιζήματα των cdna δειγμάτων αναδιαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (10 μl) και επωάστηκαν αρχικά, στους 25 0 C για 30 min. Στη συνέχεια, τα δείγματα DNA αποδιατάχθηκαν στους 95 0 C για 2.5 min, ψύχθηκαν απότομα στους 0 0 C και ηλεκτροφορήθηκαν (συσκευή πηκτής BioRad για ανάλυση αλληλουχίας) σε προηλεκτροφορημένη πηκτή (15 ma, 20 min), αρχικά στα 15 ma, για 20 min, και στη συνέχεια, στα 25 ma για ~3.5 h. Η πηκτή τοποθετήθηκε με προσοχή σε χαρτί Whatmann, ξηράνθηκε για 30 min σε ξηραντήρα πηκτών (DrygerSr, Slab Gel Dryer, Model SE 1160, Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco) και τοποθετήθηκε σε κασετίνα αυτοραδιογραφίας για 6-24 ώρες ή σε ακτινοευαίσθητη πλάκα αναλυτή PhosphoImager (FUJIFILM FLA-3000, Berthold, AU). Στη δεύτερη περίπτωση, η πλάκα υποβλήθηκε σε σάρωση ραδιενέργειας και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν στο πρόγραμμα ανάλυσης εικόνας AIDA της Raytest, DE.

7.1.5 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για πιστοποίηση του μεγέθους του πλασμιδίου της GFP, που χρησιμοποιήθηκε στο σύστημα μεταγραφήςμετάφρασης. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια τεχνική η οποία μιμείται το φυσιολογικό μηχανισμό του κυττάρου για τον πολλαπλασιασμό ειδικών τμημάτων DNA. Το DNA στόχος πολλαπλασιάζεται in vitro μέσα σε διάλυμα λίγων ωρών σε ένα μεγάλο αριθμό αντιγράφων ανάλογα με τον αριθμό των κύκλων της αντίδρασης. Επιτυγχάνεται έτσι, σε σύντομο χρονικό διάστημα η in vitro σύνθεση ενός τμήματος DNA σε μεγάλο αριθμό αντιγράφων. Για κάθε αντίδραση PCR των 10 μl αναμείχθηκαν 5 μl PCR mix, 0.5 μl από κάθε εκκινητή (5 και 3 ), και 4 μl H 2 O, 300 ng απομονωμένου πλασμιδίου ή πάρα πολύ μικρή ποσότητα (άκρη tip) κατευθείαν από τις αποικίες. Η υβριδοποίηση των εκκινητών πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία περίπου 5 0 C πιο χαμηλά από τις θερμοκρασίες τήξης (Tm) αυτών για 25 επαναλήψεις (αποφυγή μη-ειδικών προϊόντων). Τα προϊόντα της αντίδρασης ελέγχθηκαν σε πηκτή αγαρόζης 0.8%, μετά από χρώση με EtBr. 7.2 Βιοχημικές παρασκευές ριβοσωματικών συστατικών 7.2.1 Μεγάλης κλίμακας καλλιέργειες E. coli Μεγάλης κλίμακας υγρές καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν από E. coli Κ12, CAN/20-12E (RNase I -, RNase II -, RNase D -, RNase BN -, RNase T - ) (Zaniewski et al., 1984), πραγματοποιήθηκαν σε θρεπτικό διάλυμα (LBmedium για E.coli), το οποίο περιείχε 1% γλυκόζη. Η ανάπτυξη των βακτηρίων έγινε στους 37 0 C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στο μέσο της λογαριθμικής φάσης ανάπτυξής τους (Α 560nm = 0.5-0.6) επειδή κύτταρα αυτής της φάσης περιέχουν ριβοσώματα υψηλής δραστικότητας (Dohme et al., 1976; Kalpaxis et al., 1995). Η συλλογή των κυττάρων έγινε με φυγοκέντρηση (Sorvall RC-5B, κεφαλή GSA) στις 10000 rpm, για 15 min, στους 4 0 C. Στη

συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό διάλυμα 0.9 M KCl (για να παραμένει σταθερή η ωσμωτική πίεση), συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση κάτω από τις ίδιες συνθήκες (Kalpaxis et al., 1995). Η απόδοση της βακτηριακής ανάπτυξης ήταν 1.3-1.5 g νωπών κυττάρων ανά λίτρο θρεπτικού διαλύματος. 7.2.2 Παρασκευή S-30 Η παρασκευή που ακολουθεί έγινε σύμφωνα με τo πρωτόκολλο που περιγράφεται από τους Kalpaxis et al. (Kalpaxis et al., 1995). Ποσότητα κυττάρων E. coli K12 (30 g) αναμείχθηκε με διπλάσια ποσότητα αλουμίνας και ακολούθησε θραύση αυτών με ιγδίο για 5 λεπτά. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 90 ml ρυθμιστικού διαλύματος Α (Ρ.Δ.Α) και φυγοκεντρήθηκαν (Sorvall, κεφαλή SS34) δυο φορές σε 15000 rpm (30000 g), για 30 min στους 4 0 C, ώστε να απομακρυνθούν η αλουμίνα και οι μεμβράνες. Στο υπερκείμενο προστέθηκε DNάση I (3 μg/ml) και ακολούθησε επώαση για 5 min, στους 4 0 C. Το προϊόν της πέψης φυγοκεντρήθηκε στις ίδιες συνθήκες, το ίζημα απομακρύνθηκε και το υπερκείμενο αποτέλεσε το κλάσμα S-30. Το κλάσμα αυτό χρησιμοποιήθηκε στα επόμενα στάδια για την παρασκευή του κλάσματος S-100, του FWR και των πλυμένων ριβοσωμάτων. Σημειώνεται ότι όλες οι διεργασίες πραγματοποιήθηκαν αυστηρά στους 4 0 C. 7.2.3 Παρασκευή κλάσματος S-100 Το κλάσμα S-100 περιέχει διαλυτές πρωτεΐνες και άλλους παράγοντες που βοηθούν στην πρωτεϊνοσύνθεση, όπως μεταφραστικούς παράγοντες, συνθετάσες των aa-trna, trnas κ.λ.π. Για την παρασκευή του κλάσματος S-100, το κλάσμα S-30 υπερφυγοκεντρήθηκε για 4 h στα 100000 g (40000 rpm, 4 h, κεφαλή Ti75). Τα 2/3 του υπερκειμένου μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διαπίδυσης και διαπιδύθηκαν έναντι ~20 όγκων Ρ.Δ.Α., έτσι ώστε να απομακρυνθούν μόρια μικρού μοριακού βάρους (<3000 kda). Για πιο αποδοτική διαπίδυση, το διάλυμα διαπίδυσης ανανεώθηκε 4 φορές. Η ενεργότητα του κλάσματος S-100 υπολογίστηκε σε μικρής κλίμακας πειράματα σχηματισμού Phe-tRNA. Το

κλάσμα διαχωρίστηκε σε μικρές ποσότητες, ψύχθηκε απότομα σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκε στους 80 0 C. 7.2.4 Παρασκευή κλάσματος S-100 ελευθέρου από trna Σε ορισμένες περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε περαιτέρω καθαρισμένο κλάσμα S-100 (trna-free). Αυτός ο καθαρισμός έγινε για δυο λόγους: πρώτον, για να αυξηθεί η συγκέντρωση των aa-trna συνθετασών και δεύτερον, για να μειωθεί η συγκέντρωση των ενδογενών RNA (κυρίων των trnas), των ελεύθερων αμινοξέων και άλλων διαλυτών παραγόντων που μπορούν να επηρεάσουν τη διαδικασία της αμινοακυλίωσης του trna και άλλων λειτουργικών πειραμάτων. Για τον περαιτέρω καθαρισμό του κλάσματος S-100 χρησιμοποιήθηκε DEAE-κυτταρίνης (Dubnoff and Maitra, 1971; Woodward et al., 1974), καθώς o ανιοντικός αυτός ανταλλάκτης μπορεί και δεσμεύει ισχυρά τα αρνητικά φορτισμένα RNA, επιτρέποντας έτσι την επιλεκτική έκλουση των μεταφραστικών παραγόντων και των συνθετασών. Αυτή η διαδικασία έχει το επιπρόσθετο πλεονέκτημα, ότι μαζί με τα RNA απομακρύνεται και μεγάλη ποσότητα από RNάσες. Ποσότητα 15 g από DEAΕ-κυτταρίνη αιωρήθηκε σε 300 ml διαλύματος ΤΜΚ-500, επωάστηκε για 30 min, στους 90 0 C και αφέθηκε να κατακρημνιστεί. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και προστέθηκε ίδια ποσότητα TMK-500, στην οποία επανα-αιωρήθηκε η κυτταρίνη. Η διαδικασία αιώρησηςκατακρήμνισης επαναλήφθηκε άλλες τρεις φορές, χρησιμοποιώντας διάλυμα TMK-150. Τέλος, η κυτταρίνη αφέθηκε να εξισορροπηθεί o/n, στους 4 0 C, (ph του υπερκειμένου 7.5). Αφού αποχύθηκε η περίσσεια του υπερκειμένου, 150 ml του κλάσματος S-100 αναμείχθηκαν με την κυτταρίνη και επωάστηκαν στους 0 0 C για 2 h, με ανάδευση κατά διαστήματα. Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στα 10000 g για 30 min (4 0 C) και το υπερκείμενο (SI) συλλέχθηκε. Το υπόλοιπο της κυτταρίνης επεξεργάστηκε διαδοχικά με 150 ml διαλύματος ΤΜΚ-150, ΤΜΚ-200 και ΤΜΚ-500 λαμβάνοντας τα αντίστοιχα υπερκείμενα SII, SIII, και SIV. Όλα τα υπερκείμενα διαπιδύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tico και μετά

φυγοκεντρήθηκαν στα 10000 g για 30 min, ώστε να απομακρυνθούν τυχόν προσμείξεις κυτταρίνης. Έγινε φωτομέτρηση στα 230, 260 και 280 nm για κάθε κλάσμα και ελέγχθηκε η ενεργότητα των συνθετασών με μικρής κλίμακας πειράματα δημιουργία Phe-tRNA. Τα κλάσματα SII, SIII βρέθηκε ότι ήταν τα υψηλότερα σε ενεργότητα και ελεύθερα από ενδογενή RNA και RNάσες, οπότε διαχωρίστηκαν σε μικρότερα κλάσματα και φυλάχτηκαν στους 80 0 C. 7.2.5 Παρασκευή κλάσματος FWR Το κλάσμα FWR περιέχει τους περισσότερους μεταφραστικούς παράγοντες (IFs, EFs and RRFs) που είναι απαραίτητοι για την πρωτεϊνική σύνθεση. Για την παρασκευή του ακολουθήθηκε η επόμενη διαδικασία. Το ίζημα που προέκυψε από την υπερφυγοκέντρηση σε 100000g του κλάσματος S-30 ( 7.2.3), αιωρήθηκε o/n σε 40 ml ρυθμιστικού διαλύματος Β (Ρ.Δ.Β). Στη συνέχεια, αναδεύτηκε για 10 min και υπερφυγοκεντρήθηκε (Beckman, Ti 75) στις 40000 rpm, για 6 h, στους 4 0 C. Στο ληφθέν υπερκείμενο προστέθηκε στερεό θειϊκό αμμώνιο υπό συνεχή ανάδευση, στους 4 0 C, μέχρις ότου το διάλυμα αποκτήσει περιεκτικότητα 80%. Κατά τη διάρκεια της προσθήκης, το ph διατηρήθηκε στην τιμή 7,2, προσθέτοντας 1 Ν NaOH. Ακολούθησε φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 18000 rpm, 15 min, 4 0 C) και το ίζημα (κλάσμα FWR) διαλυτοποιήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα Α (Ρ.Δ.Α). Το διάλυμα που προέκυψε διαπιδύθηκε έναντι Ρ.Δ.Α. και μετά την προσθήκη γλυκερόλης (τελική συγκέντρωση 5%), διαχωρίστηκε σε μικρά κλάσματα και διατηρήθηκε στους 80 0 C. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στο κλάσμα προσδιορίστηκε με την μέθοδο Bradford. 7.2.6 Παρασκευή πλυμένων ριβοσωμάτων Το ίζημα των ριβοσωμάτων που προέκυψε από τη δεύτερη υπερφυγοκέντρηση του κλάσματος S-30 αιωρήθηκε σε 60 ml Ρ.Δ.Β και επακολούθησε τρίτη υπερφυγοκέντρηση κάτω από τις ίδιες συνθήκες (Beckman, Ti 75, 40000 rpm, 6h, 4 0 C). Το νέο ίζημα αιωρήθηκε σε 15 ml Ρ.Δ.Α, υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 4 lt Ρ.Δ.Α για 4 h, στους 4 0 C και φυγοκεντρήθηκε ήπια (Sorvall, κεφαλή SS34, 2000 rpm, 15 min, 4 0 C) για

απομάκρυνση συσσωμάτων. Ακολούθησε φωτομέτρηση στα 260 και 280 nm για προσδιορισμό της ποσότητας και καθαρότητας των ριβοσωμάτων, και στη συνέχεια διαχωρισμός του παρασκευάσματος σε μικρά κλάσματα πριν την αποθήκευσή τους στους 80 0 C. Η απόδοση σε πλυμένα ριβοσώματα ήταν 400-500 Α 260 /g νωπών κυττάρων. 7.2.7 Παρασκευή 70S ριβοσωμάτων, υψηλής σταθερότητας (tight coupled) Σε ορισμένα πειράματα απαιτήθηκε η χρήση 70S ριβοσωμάτων υψηλής σταθερότητας. Έτσι, έγινε πλήρης διαχωρισμός των πλυμένων ριβοσωμάτων από τις ριβοσωματικές τους υπομονάδες με τη βοήθεια δυο συνεχόμενων zonal φυγοκεντρήσεων. Συγκεκριμένα, δείγμα 6000-9000 Α 260 πλυμένων ριβοσωμάτων τοποθετήθηκε σε διάλυμα διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης (6-38% σουκρόζη σε ρυθμιστικό διάλυμα Tico) και φυγοκεντρήθηκε (Beckman TiXV rotor, 21000 rpm, 16h, 4 0 C). Μετά την πρώτη «zonal» φυγοκέντρηση το κλάσμα των 70S ριβοσωμάτων συλλέχθηκε και κατακρημνίστηκε μέσω φυγοκέντρησης (24000 rpm, 24 h σε Ti45 κεφαλή). Το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε μικρή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος Tico και υπέστη δεύτερη «zonal» φυγοκέντρηση κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Έτσι προέκυψαν 70S πλυμένα ριβοσώματα ελεύθερα από 50S ριβοσωματικές υπομονάδες (που ήταν η κύρια πρόσμειξη από την πρώτη «zonal» φυγοκέντρηση). Το 70S ίζημα επαναδιαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα Tico, διαχωρίστηκε σε μικρά κλάσματα, ψύχθηκε σε υγρό άζωτο και διαφυλάχτηκε στους 80 0 C. Η επανάκτηση 70S πλυμένων ριβοσωμάτων ήταν 10-20% των συνολικών A 260 που αρχικά τοποθετήθηκαν στη «zonal». 7.2.8 Απομόνωση 30S και 50S ριβοσωματικών υπομονάδων Οι 30S και 50S υπομονάδες απομονώθηκαν μέσω υπερφυγοκέντρησης (26000 rpm, 6 h, στους 4 0 C, Beckman SW28) σε 10-30% διαβάθμιση σουκρόζης σε διάλυμα αποδιάταξης (dissociation buffer). Σε κάθε παρασκευή χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 1800 Α 260 υψηλής καθαρότητας 70S ριβοσωμάτων. Τα κλάσματα των 30S και 50S υπομονάδων συλλέχθηκαν

ξεχωριστά και κατακρημνίστηκαν με προσθήκη 0.65 όγκων EtOH, στους 20 0 C o/n, αφού ρυθμίστηκε πρώτα η συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+ στα 10 mm. Εναλλακτικά, η συλλογή έγινε με φυγοκέντρηση (35000 rpm, 22 h, 4 0 C, Beckman Ti75), αλλά η απόδοση ήταν μικρή. Το ίζημα που προέκυψε επαναδιαλύθηκε σε μικρή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος Tico ή επανασύζευξης, διαχωρίστηκε σε μικρά κλάσματα και φυλάχτηκε στους 80 0 C. Η τυπική απόδοση ξεκινώντας από 1800 Α 260 ήταν 220 Α 260 (12%) και 250 Α 260 (14%) για καθαρές 30S και 50S υπομονάδες, αντίστοιχα. 7.2.9 Παρασκευή επανασυζευγμένων 70S ριβοσωμάτων Τα 70S ριβοσώματα ( 9.2.6) περιείχαν μικρές μολύνσεις trnas και mrnas. Έτσι, για παρασκευή ριβοσωμάτων υψηλότερης καθαρότητας και ενεργότητας, απομονωμένες ριβοσωματικές υπομονάδες 30S και 50S (αναλογία 1.5:1) επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα επανασύζευξης (40-140 Α 260 /ml) για 60 min, στους 40 0 C, με ήπια ανάδευση (Blaha et al., 2002). Η περίσσεια 30S υπομονάδων βοήθησε, ώστε να ελαχιστοποιηθούν οι ελεύθερες 50S υπομονάδες (Blaha et al., 2000). Μετά την πρώτη επώαση των υπομονάδων, πριν το δείγμα φορτωθεί σε διάλυμα διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης (10-40%) και φυγοκεντρηθεί (18000 rpm, 17 h, 4 0 C, Beckman), έγινε και δεύτερη επώαση αυτών για 10 min στους 4 0 C. Το κλάσμα των επανασυζευγμένων 70S ριβοσωμάτων συλλέχθηκε με δεύτερη φυγοκέντρηση (24000 rpm, 24 h, 4 0 C, Beckman Ti45). H χρήση υψηλής ταχύτητας φυγοκέντρησης δε συνιστάται, γιατί μπορεί να προκαλέσει πιθανή αποδιάταξη των 70S ριβοσωμάτων. Το ίζημα των 70S ριβοσωμάτων επαναδιαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα (Η 20 Μ 20 K 30 SH 4 ph 7.5) και επωάστηκε ακόμη μια φορά τους 40 0 C για 20 min, διαδικασία που βοηθάει την επανασύζευξη. Τα επανασυζευγμένα 70S ριβοσώματα υποβλήθηκαν σε ήπια φυγοκέντρηση και το υπερκείμενο διαπιδύθηκε έναντι 100 όγκων ρυθμιστικού διαλύματος Tico (H 20 M 6 N 30 SH 4 ph 7.5), με 3 αλλαγές κάθε 45 min. H συγκέντρωση και καθαρότητα των ριβοσωμάτων προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση στα 260 και 280 nm. Στη συνέχεια, το παρασκεύασμα

διαχωρίστηκε σε μικρά κλάσματα, ψύχθηκε σε υγρό άζωτο και διατηρήθηκε στους 80 0 C. 7.2.10 Έλεγχος καθαρότητας και λειτουργικότητας των 70S ριβοσωμάτων Για τον έλεγχο της ποιότητας των ριβοσωμάτων που παρασκευάστηκαν χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση ορισμένα από τα παρακάτω test: i) Προσδιορισμός του λόγου Α 260 /Α 280 που δείχνει το βαθμό καθαρότητας των ριβοσωματικών σωματιδίων. ii) Ηλεκτροφόρηση των rrnas σε πηκτή αγαρόζης ή αναλυτική υπερφυγοκέντρηση των υπομονάδων και ριβοσωμάτων σε διάλυμα διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης (10-30%, SW60, 45000 rpm, 2h, 4 0 C), ώστε να ελεγχθεί η ακεραιότητα και η μοριακή τους αναλογία. iii) Πειράματα πρόσδεσης στην Α- και Ρ- θέση, που προσδιόρισαν το ποσοστό των ενεργών ριβοσωμάτων iv) Σύνθεση poly-phe, ώστε να προσδιορισθεί η πρωτεϊνοσυνθετική ικανότητα των ριβοσωμάτων v) Αντίδραση πουρομυκίνης, ώστε να εκτιμηθούν οι καταλυτικές σταθερές. 7.2.11 Απομόνωση των ριβοσωματικών πρωτεϊνών της μεγάλης υπομονάδας (TP50) Οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες της μεγάλης υπομονάδας απομονώθηκαν από E. coli CAN20 ριβοσώματα, που η περιεκτικότητά τους σε RΝάσες είναι μηδενική. Για άρση κάθε επιφύλαξης, έγινε έλεγχος της περιεκτικότητας σε RNάσες με ανάμειξη 23S rrna και παρασκευάσματος TP50, όπου η ακεραιότητα του 23S σε πηκτή αγαρόζης παρέμεινε σταθερή μετά την προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων ΤP50. Για την παρασκευή TP50, 1 ml 50S υπομονάδων σε ρυθμιστικό διάλυμα Tico (300A 260 /ml) αναμείχθηκε με 0.1 ml 1M (CH 3 COO) 2 Mg και 2.2 ml οξικό οξύ 100%. To μείγμα αναδεύτηκε ήπια για 45 min, στους 4 0 C, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 10000 g (8000rpm, HB4 rotor) για 30 min. Στο υπερκείμενο που προέκυψε προστέθηκαν 5 όγκοι ψυχρής ακετόνης. Μετά από παραμονή στους 20 0 C o/n, το μείγμα φυγοκεντρήθηκε στα 10000 g (8000

rpm, Sorvall, HB4 rotor) για 30min. Το ληφθέν ίζημα (πρωτεΐνες) υπέστη ξήρανση για 15 min, σε θερμοκρασία δωματίου και αναδιαλύθηκε σε 1ml διαλύματος Rec4-6U (300 eu/ml). Έγινε αρχικά διαπίδυση σε 100 όγκους Rec4-6U (4 0 C) o/n και μετά, άλλες 3 συνεχείς διαπιδύσεις στις ίδιες συνθήκες για 45 min σε διάλυμα Rec4 (χωρίς ουρία). Η τρίτη διαπίδυση διακόπηκε ορισμένες φορές, όταν άρχισε να σχηματίζεται ίζημα. Το διαπίδυμα φυγοκεντρήθηκε στα 5000 g για 5 min και μετρήθηκε η απορρόφηση του στα 230 nm (1:100 αραίωση). Οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε κλάσματα, ψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους 80 0 C (Nierhaus, 1990a). Η απόδοση ήταν 0.05 Α 230 TP50/Α 260 50S (10 μg ΤP50/A 260 50S). 7.2.12 Απομόνωση μείγματος 23S και 5S ριβοσωματικού RNA Το rrna (23S και 5S) που χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα ανασύστασης της 50S υπομονάδας, απομονώθηκε από E. coli K12 50S υπομονάδες και ελέγχθηκε για την ακεραιότητά του σε πηκτή αγαρόζης. Για την παρασκευή μείγματος 23S και 5S rrna, 1 ml (250 A 260 ) σε 50S υπομονάδων αιωρούμενες σε ρυθμιστικό διάλυμα Tico αναμείχθηκε με 0.1 όγκους 10% SDS και 1 όγκο φαινόλης 70%. Το μείγμα αναδεύτηκε ισχυρά (vortex) για 8 min και στη συνέχεια, φυγοκεντρήθηκε στα 10000 g (12000 rpm, σε επιτραπέζια φυγόκεντρο) για 6 min. Στην υδατική φάση προστέθηκε ίσος όγκος φαινόλης 70%, αναδεύτηκε ισχυρά για 5 min και φυγοκεντρήθηκε στις ίδιες συνθήκες. Επαναλήφθηκε αυτή η διαδικασία άλλη μια φορά και στο υδατικό υπερκείμενο που προέκυψε, προστέθηκαν 0.1 όγκοι CH 3 COONa 3M ph 5.5 και 2.5 όγκοι EtOH. Το διάλυμα αφέθηκε o/n, στους 20 0 C και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 10000 g (12000rpm, σε επιτραπέζια φυγόκεντρο) για 45 min. Το ληφθέν ίζημα πλύθηκε με 0.5 όγκους ψυχρής EtOH 70%, ώστε να απομακρυνθεί τελείως η φαινόλη. Μετά από νέα φυγοκέντρηση στα 10000 g για 30 min, το ίζημα ξηράθηκε σε spead vac για 2-3 min και επαναδιαλύθηκε σε 1 ml διαλύματος HM4 (Nierhaus, 1990a). Η απόδοση ήταν 0.5 Α 260 rrna/a 260 50S.

7.2.13 Απομόνωση 5S rrna Το 5S rrna χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα ανασύστασης της 50S υπομονάδας, στα οποία φωτοσημάνθηκε ξεχωριστά το 23S rrna. Η ακεραιότητά του ελέγχθηκε σε πηκτή αγαρόζης. Για την παρασκευή του, 300 μl μείγματος 23S και 5S rrna (50 A 260 ), που απομονώθηκε όπως δείχθηκε προηγουμένως, αναμείχθηκαν με ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (2x) για RNA. Το διάλυμα που προέκυψε τοποθετήθηκε σε πηκτή 10% πολυακρυλαμιδίου και ηλεκτροφορήθηκε για 30 min, στα 280 V. Παράλληλα ηλεκτροφορήθηκε RNA μάρτυρας και trna bulk (76nt). Στο τέλος της ηλεκτροφόρησης για την εύρεση του 5S κόπηκε μικρό τμήμα της πηκτής και βάφτηκε με διάλυμα Toluidine Blue για 30 min και ξεβάφτηκε με ρυθμιστικό διάλυμα αποχρωματισμού. Συγκρίνοντας το τμήμα αυτό με την υπόλοιπη πηκτή, ανιχνεύτηκε η περιοχή της πηκτής που περιείχε το καλά διαχωρισμένο 5S από το 23S. Η περιοχή αυτή της πηκτής πέρασε από σύριγγα 10 ml για να πολτοποιηθεί και μεταφέρθηκε σε σωλήνα φυγοκέντρου των 10 ml, όπου καλύφθηκε με διάλυμα εκχύλισης. Προστέθηκε ίσος όγκος φαινόλης (70%) και το μείγμα αναδεύτηκε o/n, στους 4 0 C. Στη συνέχεια, φυγοκεντρήθηκε (10000 rpm, SS34, 40 min, 4 0 C) και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέο σωλήνα, όπου προστέθηκε μισός όγκος ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης και αναδεύτηκε για 1 h, στους 4 0 C. H διαδικασία της εκχύλισης επαναλήφθηκε άλλη μια φορά και στο σύνολο των υπερκειμένων προστέθηκε ίσος όγκος CHCl 3. Έγινε ανάδευση για 15 min με Vortex, στους 4 0 C και μετά φυγοκέντρηση στις 10000 rpm, για 30 min. Το 5S rrna κατακρημνίσθηκε στους 20 0 C, o/n, με 1/10 όγκους CH 3 COONa 3 Μ ph 5.5 και 2.5 όγκους EtOH. Το ίζημα μετά από φυγοκέντρηση στις 10000 rpm, για 60 min, στους 4 0 C, πλύθηκε με 70% EtOH για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα φαινόλης και το νέο ίζημα μετά από φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες (10000 rpm, 60 min, 4 0 C), ξηράνθηκε σε spead vac για 2 min και αναδιαλύθηκε σε νερό ή σε HM4. To 5S rrna φωτομετρήθηκε στα 260 nm και

διαπιστώθηκε η ακεραιότητα του μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1%. Η απόδοση ήταν 1.5 Α 260 5S rrna/50 Α 260 50S υπομονάδες ή διαφορετικά 1344 pmol 5S/1800 pmol 50S. Δηλαδή το 75% του περιεχόμενου rrna στο αρχικό μείγμα. 7.2.14 Παρασκευή AcPhe-tRNA Το AcPhe-tRNA αποτέλεσε στα in vitro πειράματα, το υπόστρωμα της P θέσης του ριβοσώματος. Συντέθηκε, προσθέτοντας στο -CCA άκρο του trna Phe το αμινοξύ φαινυλαλανίνη (Phe), το οποίο στη συνέχεια ακετυλιώθηκε. Η ακετυλίωση αυτή είχε ως αποτέλεσμα ένα μόνο μόριο AcPhe-tRNA να προσδένεται ανά ριβόσωμα, κυρίως στην P θέση του ριβοσώματος. Για την παρασκευή του, 800 Α 260 trna (780 A 260 trna bulk, εμπλουτισμένο με 20 Α 260 trna Phe ) διαλύθηκαν σε 5 ml διαλύματος T 100 M 10 K 10 SH 6 και επωάστηκαν για 20 min, στους 37 0 C, πριν την προσθήκη των συστατικών: ATP (4 mm), GTP (0.1 mm), 5 nmoles 3 H-Phe, 17 nmoles L- Phe και 5-10 μl κλάσματος S-100 (8 mg/ml). H επώαση συνεχίστηκε για άλλα 30-45 min, στους 37 0 C. Η ποσότητα του κλάσματος S-100 και ο χρόνος επώασης σε κάθε παρασκευή καθορίστηκαν από πειράματα σύνθεσης [ 3 H]Phe-tRNA σε μικρή κλίμακα (20 μl). Ο έλεγχος της απόδοσης, έγινε με μετρητή β-ακτινοβολίας (Pharmacia, USA), μετά από προσρόφηση του προϊόντος σε φίλτρο κυτταρίνης (Whatman), πλύσιμο τρεις φορές σε διάλυμα 5% TCA και μια φορά σε ψυχρή EtOH και τοποθέτηση σε υγρό σπινθηρισμού. Ο καθαρισμός του προϊόντος ([ 3 H ]Phe-tRNA) έγινε με εκχύλιση του μείγματος επώασης με ίσο όγκο διαλύματος φαινόλης 90% και ισχυρή ανάδευση για 3 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από φυγοκέντρηση (3000 rpm, 10 min, 25 0 C, Sorvall SS34) η υδατική φάση συλλέχθηκε, ενώ στην φαινολική φάση προστέθηκαν 2 ml Η 2 Ο και ακολούθησαν δυο ακόμα εκχυλίσεις στις ίδιες συνθήκες. Έτσι, ανακτήθηκε η μέγιστη δυνατή ποσότητα προϊόντος. Το σύνολο των υδατικών φάσεων κατακρημνίσθηκε με 0.1 όγκους 20% CH 3 COOK ph 6.85 και 2.5 όγκους EtOH, στους 20 0 C o/n. Μετά από

φυγοκέντρηση (15000 rpm, 10 min, 4 0 C, Sorvall SS34), το ίζημα πλύθηκε με EtOH 70% και φυγοκεντρήθηκε στις ίδιες συνθήκες. Αναδιαλύθηκε σε Η 2 Ο και διαπιδύθηκε σε μεγάλο όγκο H 2 O (4 lt, 4 h, 4 0 C, με δυο αλλαγές). Για την ακετυλίωση του [ 3 H]Phe-tRNA, στο διαπίδυμα προστέθηκε ίσος όγκος CH 3 COOK ph 5, 0 0 C και στάγδην 0.15 ml ψυχρού διαλύματος οξικού ανυδρίτη/ml μείγματος επώασης, υπό συνεχή ανάδευση σε 5 δόσεις ανά 15 min, στους 0 0 C. Το AcPhe-tRNA που προέκυψε κατακρημνίστηκε με φυγοκέντρηση (15000 rpm, 15 min, 4 0 C, Sorvall SS34) μετά από προσθήκη 0.1 όγκων 20% CH 3 COOK και 2.5 όγκων EtOH και ψύξη στους 20 0 C, o/n. To ίζημα αναδιαλύθηκε και διαπιδύθηκε σε H 2 O (4 lt, 4 h, 4 0 C, με δυο αλλαγές). Φωτομετρήθηκε στα 260 nm (200-300 Α 260 /ml), υπολογίστηκε η ειδική του ραδιενέργεια (150000-200000 dpm/α 260 ) και χωρίσθηκε σε μικρά κλάσματα για να διατηρηθεί στους 20 0 C. H απόδοση ανάκτησης του trna σε προϊόν (AcPhe-tRNA) ήταν 80-85%. 7.3 In vitro πρωτεϊνικά συστήματα / Λειτουργικές μελέτες 7.3.1 Πρόσδεση του AcPhe-tRNA στο ριβόσωμα (Binding) Η πρόσδεση έγινε επωάζοντας ΑcPhe-tRNA σε poly(u) προγραμματισμένα 70S ριβοσώματα, όπου οι Ρ- θέσεις ήταν καλυμμένες (πρόσδεση στην Α- θέση) ή ελεύθερες (πρόσδεση στην Ρ- θέση) από trna Phe. Ολική πρόσδεση του AcPhe-tRNA στο ριβόσωμα Η εύρεση της ολικής πρόσδεσης του AcPhe-tRNA στο ριβόσωμα προσδιορίστηκε επωάζοντας στους 25 0 C μείγμα (200 μl) το οποίο περιείχε: 83.2 pmol poly(u)-προγραμματισμένα 70S ριβοσώματα, 83.2 pmol AcPhetRNA, 400 μg/ml FWR, 0.4 mm GTP σε ρυθμιστικό διάλυμα Τ 100 Ν 150 Μ 4.5 SH 6 ph 7.4, παρουσία ή απουσία πολυαμινών. Απουσία πολυαμινών η μέγιστη πρόσδεση παρατηρήθηκε με επώαση του μίγματος στα 5.30 min, στους 25 0 C. Παρουσία πολυαμινών, η μέγιστη πρόσδεση παρατηρήθηκε στα 27.30 min, στην ίδια θερμοκρασία. Η αντίδραση διακόπηκε, μετά την παρέλευση του

κατάλληλου χρόνου, με προσθήκη 25 μl δείγματος σε 2 ml ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος (Τ 100 Ν 150 Μ 4.5 SH 6 ±πολυαμίνες) και διήθηση αυτού σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης, που συγκρατεί ριβονουκλεο-πρωτεϊνικά σύμπλοκα. To φίλτρο πλύθηκε γρήγορα άλλες δυο φορές με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα χωρίς να διέλθει αέρας μέσω αυτού και τέλος, διαλυτοποιήθηκε σε 15 ml υγρού σπινθηρισμού Bray s. Το διάλυμα που προέκυψε, μετρήθηκε σε μετρητή σπινθηρισμού β ακτινοβολίας (Rackbeta 1290, Wallac, Pharmacia, USA). Πρόσδεση AcPhe-tRNA στην Α- θέση του ριβοσώματος Η πρόσδεση του AcPhe-tRNA στην Α- θέση του ριβοσώματος ακολούθησε την πορεία της προηγούμενης παραγράφου, με τη διαφορά ότι τα poly(u)-προγραμματισμένα ριβοσώματα είχαν προεπωασθεί με περίσσεια trna Phe (αναλογία pmoles trna Phe /pmoles ριβοσωμάτων = 1.5 : 1) για κάλυψη της Ρ- θέσης. Πρόσδεση AcPhe-tRNA στην Ρ- θέση του ριβοσώματος Η πρόσδεση του AcPhe-tRNA στην P- θέση του ριβοσώματος προσδιορίστηκε από το γινόμενο της ολικής πρόσδεσης επί το βαθμό της έκτασης της αντίδρασης πουρομυκίνης (2 mm, για 2 min, στους 25 0 C). 7.3.2 Σχηματισμός εναρκτήριου ριβοσωματικού συμπλόκου C ( C-complex) Με τον όρο «ριβοσωματικό σύμπλοκο C» καλούμε το μετά τη μετατόπιση των υποστρωμάτων σύμπλοκο των poly(u)-προγραμματισμένων 70S ριβοσωμάτων, τα οποία έχουν προσδεμένο trna Phe στην Ε-θέση και Ac[ 3 H]Phe-tRNA στην Ρ-θέση του ριβοσώματος. Το σύμπλοκο αυτό χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα κινητικής ανάλυσης της αντίδρασης πουρομυκίνης. O σχηματισμός του συμπλόκου C έγινε ακολουθώντας το πρωτόκολλο πρόσδεσης του AcPhe-tRNA στην Α-θέση του ριβοσώματος. Μετά από τη δημιουργία του πρώτου αυτού συμπλόκου προστέθηκαν 0.3 pmoles

EFG/pmol ριβοσωμάτων και GTP τελική συγκέντρωση (0.12 mm) και το μίγμα επωάστηκε για άλλα 10 min, στους 25 0 C (Dinos et al., 2004). 7.3.3 Αντίδραση πουρομυκίνης Η αντίδραση πουρομυκίνης χρησιμοποιήθηκε για την εύρεση της δραστικότητας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, προσδιορίζοντας την ταχύτητα δημιουργίας ενός πεπτιδικού δεσμού, παρουσία ή απουσία αναστολέων της. Πραγματοποιήθηκε μεταξύ του συμπλόκου C και της πουρομυκίνης η οποία προσδένεται στην Α-θέση ως ψευδο-υπόστρωμα και δημιουργεί πεπτιδικό δεσμό. Το προϊόν της αντίδρασης Ac[ 3 Η]Phe-Puro ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της ραδιενέργειάς του (Fico and Coutsogeorgopoulos, 1972). Πειραματική πορεία Σύμπλοκο C παρασκευάστηκε και προσροφήθηκε σε φίλτρα νιτρικής κυτταρίνης. Το σύμπλοκο προστέθηκε σε φιαλίδια αντίδρασης (vials), τα οποία περιείχαν 1 ml ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (Τ 100 Ν 150 Μ 4.5 SH 6 ±πολυαμίνες) και συγκεκριμένη ποσότητα πουρομυκίνης (0.1 mm, 0.2 mm, 0.4 mm ή 2 mm). Ακολούθησε επώαση στους 25 0 C, για καθορισμένο χρονικό διάστημα (15 sec-20 min). Στη συνέχεια, έγινε προσθήκη 1 ml 1Ν ΝaΟΗ, το οποίο σταμάτησε την αντίδραση λόγω υδρόλυσης των RNAs και αλλαγής του ph. Για τον υπολογισμό του ποσοστού μετατροπής του AcPhe-tRNA σε προϊόν AcPhe-Puro, 0.8 ml του μείγματος επώασης μετρήθηκαν απευθείας στο μετρητή ραδιενέργειας β ακτινοβολίας (counter), μετά την προσθήκη σπινθηριστικού υγρού (Opti-fluor, 5 ml). Οι τιμές που ελήφθησαν αντιστοιχούν στη συνολική ραδιενέργεια του μείγματος, Ν 0 (Ac[ 3 Η]Phe-Puro και Ac[ 3 Η]Phe-). Στη συνέχεια 0.8 ml του μείγματος επώασης εκχυλίστηκαν σε 2 ml οξικού αιθυλεστέρα με ισχυρή ανάδευση (vortex) για 1 min. Οι δυο φάσεις διαχωρίστηκαν με φυγοκέντρηση (4000 rpm, 1 sec, 25 0 C) και από τα 2 ml της οργανικής φάσης ελήφθησαν 1,5 ml που μετρήθηκαν σε μετρητή ραδιενέργειας. Αυτές οι τιμές έδωσαν το ποσό του προϊόντος (Ac[ 3 Η]Phe- Puro) που ως αφόρτιστο μόριο κατανεμήθηκε στην φάση του οξικού

αιθυλεστέρα (άνω οργανική φάση), ενώ η Ac[ 3 Η]Phe - παρέμεινε στην υδατική φάση. Πολλαπλασιάζοντας την προηγούμενη μέτρηση με τον διορθωτικό παράγοντα 1,33 (2 ml/1,5 ml) προσδιορίστηκε το ποσό της ραδιενέργειας που αντιστοιχεί στο προϊόν της αντίδρασης (Ν). Ο λόγος Ν/N 0 x 100 έδωσε το ποσοστό μετατροπής του AcPhe-tRNA σε προϊόν (x). Οι τιμές του x διορθώθηκαν περαιτέρω, λαμβάνοντας υπ όψιν τη διάσπαση του συμπλόκου C με την πάροδο του χρόνου (α) και την έκταση της αντίδρασης πουρομυκίνης (β). Το πηλίκο x/α β αντιστοιχεί στην τιμή που θα προέκυπτε, αν το σύμπλοκο C ήταν 100% ενεργό. Κινητική ανάλυση και εύρεση των καταλυτικών παραμέτρων Η αντίδραση πουρομυκίνης που πραγματοποιείται μεταξύ του συμπλόκου C και της πουρομυκίνης περιγράφεται με το παρακάτω κινητικό σχήμα: K s k 3 C + S CS C' + P Σχήμα 7.1: Κινητικό σχήμα της αντίδρασης πουρομυκίνης όπου: C το σύμπλοκο C, S η πουρομυκίνη, P το προϊόν (AcPhe-Puro) και C το ριβοσωματικό σύμπλοκο C, το οποίο δεν έχει AcPhe-tRNA στη θέση Ρ, με αποτέλεσμα να μην είναι δραστικό έναντι της πουρομυκίνης. Η αντίδραση πουρομυκίνης, αν και διμοριακή, ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξεως, διότι το υπόστρωμα πουρομυκίνη (S) προστίθεται σε περίσσεια ως προς το C, με αποτέλεσμα η συγκέντρωση πουρομυκίνης να παραμένει σχεδόν σταθερή κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Ό υπολογισμός των κινητικών σταθερών έγινε με τη βοήθεια του ολοκληρωμένου κινητικού νόμου της αντίδρασης πουρομυκίνης, o οποίος υπολογίστηκε ως εξής: Η ολική συγκέντρωση (C o ) του συμπλόκου C είναι: C o = C + CS + C, και επειδή C = P προκύπτει: C o - P = C + CS (1) Η ταχύτητα της αντίδρασης δίνεται από τη σχέση :

d[p] v = = [ CS] k dt 3 (2) Διαιρώντας τις σχέσεις (2) και (1) κατά μέλη, έπεται: ( 2) ( 1) [ ] v CS k3 = C P = [C] + [CS] o Η σταθερά διαστάσεως K s δίνεται από την εξίσωση: K S [ C][ S] [ ] [ ] = CS = CS [ ][ ] C S K S και με αντικατάσταση του [CS] στην (3) προκύπτει ο διαφορικός κινητικός νόμος της αντίδρασης πουρομυκίνης: [ ][ ] CS v KS C P [ ][ ] C CS k o = + K [ ] v Sk = C P K + o S S 3 [ S] 3 [ ] S v K k S = C P S o 1+ K v = ( C )[ ] K + [ S] P Sk 3 [ ] o 3 S S v = C P o [ ] S K k 3 S KS + S K S [ ] (3) Διαφορικός κινητικός νόμος Ο διαφορικός κινητικός νόμος με ολοκλήρωσή γίνεται : [ P] ( Co P) k 3[] S = dt K + [] S [ P] k 3[ S] = P K + [] S t d d d[p] k v = dt = C C P K S o S p p = o o t= 0 S [] S + [] S 3 dt [ ] [ ] ln C o = k3 S C P K + S t=k t obs o S Ολοκληρωμένος κινητικός νόμος όπου k obs είναι η φαινομενική σταθερά ψευδοπρώτης τάξεως και ισούται με:

k obs = k 3 [S] / K s +[S] (4) Ο παραπάνω ολοκληρωμένος κινητικός νόμος γράφεται και στην εξής μορφή: ln 100 kobst 100 x = (5) όπου x = P/C o 100 αντιστοιχεί στο % ποσοστό του AcPhe-tRNA που μετατρέπεται σε προϊόν. Από τη σχέση (5) συμπεραίνεται ότι η συνάρτηση του ln[100/(100-x)] έναντι του χρόνου t, είναι ευθεία γραμμή (Σχήμα 7.2α). Συνεπώς, από την κλίση της ευθείας αυτής μπορεί κανείς να υπολογίσει την τιμή της k obs για μια συγκεκριμένη συγκέντρωση πουρομυκίνης. Επαναλαμβάνοντας το πείραμα και για άλλες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης, υπολογίζονται οι αντίστοιχες k obs. Από τις τιμές αυτές σχεδιάζεται το διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου (DR-plot), δηλαδή η γραφική παράσταση του 1/k obs έναντι του 1/[S] (εξίσωση 6). 1 k obs KS = k + [ S] KS 1 1 = + [] S k3 [] S k3 3 (6 ) Τέτοια διαγράμματα (Σχήμα 7.2β) χρησιμοποιήθηκαν για υπολογισμό των σταθερών K s και k 3, που περιγράφουν την ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης κατά τη δημιουργία πεπτιδικού δεσμού (Σχήμα 7.1).

Α Β ln (100/ 100-x) 1 / k obs 1/ k 3 Κλίση = k obs Time (min) -1/K S 1/ [πουρομυκίνης] Σχήμα 7.2: (Α) Θεωρητική λογαριθμική χρονοκαμπύλη της αντίδρασης πουρομυκίνης σε μια συγκέντρωση πουρομυκίνης, (Β) Θεωρητικό διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (DR plot) για την αντίδραση πουρομυκίνης σε διάφορες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης. 7.3.4 Αναστολή δημιουργίας του πεπτιδικού δεσμού από αντιβιοτικά Το πειραματικό πρωτόκολλο ανάλυσης της αναστολής του πεπτιδικού δεσμού από τη βλαστισιδίνη ήταν παρόμοιο με εκείνο της αντίδρασης πουρομυκίνης, με τη διαφορά ότι στο διάλυμα πουρομυκίνης προστέθηκε το αντιβιοτικό σε διάφορες συγκεντρώσεις (0.2-12 μμ). Να σημειωθεί ότι η μείωση της αρχικής συγκέντρωσης του αντιβιοτικού (antibiotic depletion) λόγω πρόσδεσης σε μη ενεργά ριβοσώματα ήταν ελάχιστη διότι λιγότερο του 3% της προστιθέμενης ποσότητας αντιβιοτικού προσδέθηκε σε ριβοσώματα ενεργά ή μη. Η κινητική ανάλυση του μηχανισμού πρόσδεσης στο ριβόσωμα μακρολιδίων που αναστέλλουν το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, ήταν διαφορετική με αυτή που ήδη περιγράφηκε. Συγκεκριμένα, σύμπλοκο C προσδεδεμένο σε φίλτρο νιτρικής κυτταρίνης επωάστηκε σε 2 ml διαλύματος πρόσδεσης (Τ 100 Ν 150 Μ 4.5 SH 6 ± πολυαμίνες) παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων μακρολιδίων (0-10 μμ). Η αντίδραση έγινε στους 25 0 C, για διάφορα χρονικά διαστήματα (0-8 min) και διακόπηκε με ψύξη του συμπλόκου C που ήταν προσδεδεμένο σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης σε 15 ml παγωμένου διαλύματος πρόσδεσης. Η παραμένουσα δραστικότητα του

συμπλόκου C μετρήθηκε με αντίδραση πουρομυκίνης, στους 25 0 C (2 mm, για 2 min ή εναλλακτικά 1 mm, για 10 min), μετά την απομάκρυνση της περίσσειας αντιβιοτικού. 7.3.5 Πειράματα συναγωνισμού δυο αντιβιοτικών Η εύρεση των σταθερών πρόσδεσης των αντιβιοτικών στο ριβόσωμα που δεν αναστέλλουν άμεσα τη δραστικότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTάσης), έγινε με πειράματα συναγωνισμού. Συγκεκριμένα, στην περίπτωση μελέτης της ερυθρομυκίνης, αζιθρομυκίνης και τελιθρομυκίνης, έγιναν συναγωνιστικά πειράματα μεταξύ αυτών και του 16μελούς μακρολιδίου τυλοσίνη που αναστέλλει την PTάση και παράλληλα, συναγωνίζεται με τα εν λόγω αντιβιοτικά για τις ίδιες θέσεις πρόσδεσης στο ριβόσωμα. Συγκεκριμένα, σύμπλοκο C προεπωάστηκε (PI: Pre-Incubation) με καθένα από τα αντιβιοτικά για κατάλληλο χρόνο μέχρι να επέλθει εξισορρόπηση (οι χρόνοι εξισορρόπησης κάθε αντιβιοτικού δίνονται στον Πίνακα V, σελ 97). Στη συνέχεια, επωάστηκε με τυλοσίνη 4 μμ για διάφορους χρόνους (0, 30 sec, 1 min, 2 min) στους 25 0 C και τέλος, ακολούθησε τιτλοδότηση με πουρομυκίνη στους 25 0 C (2 mm για 2 min ή εναλλακτικά 1 mm για 10 min). Στα πειράματα χωρίς προεπώαση (-PI), όπου το σύμπλοκο C αντιδρούσε με μείγμα του εξεταζόμενου αντιβιοτικού (ερυθρομυκίνη, αζιθρομυκίνη και τελιθρομυκίνη) και τυλοσίνης 4 μμ για διάφορους χρόνους (0, 30 sec, 1 min, 2 min), στους 25 0 C. Όπως και προηγουμένως, μετά την παρέλευση συγκεκριμένου χρόνου, ακολούθησε τιτλοδότηση με πουρομυκίνη (2 mm, 2 min, 25 0 C). 7.3.6 Πειράματα αναγέννησης συμπλόκου C Η σταθερά απελευθέρωσης του αντιβιοτικού από το ριβόσωμα προσδιορίστηκε με πειράματα αναγέννησης του συμπλόκου C από τη δεσμευμένη με το αντιβιοτικό μορφή του C*I. Συγκεκριμένα, σύμπλοκο C επωάστηκε με τα υπό μελέτη αντιβιοτικά ώστε να επέλθει εξισορρόπηση. Στη συνέχεια, το σύμπλοκο C*I προστέθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης, για

μεγάλα χρονικά διαστήματα (0-60 min). Στην περίπτωση της τυλοσίνης, ο προσδιορισμός της σταθεράς αναγέννησης (k off ) έγινε με άμεση τιτλοδότηση του αναγεννημένου συμπλόκου C με πουρομυκίνη (2 mm, 2 min, 25 0 C). Στην περίπτωση των μακρολιδίων που δεν αναστέλλουν την πεπτιδυλοτρανσφεράση, έγινε πρώτα επώαση σε διάλυμα υψηλής συγκέντρωσης τυλοσίνης 30 μμ, για 3 min στους 25 0 C και στη συνέχεια, ακολούθησε τιτλοδότηση με πουρομυκίνη (2 mm, 2 min, 25 0 C). 7.3.7 Σύνθεση poly(phe) Ένας συνήθης τρόπος εκτίμησης της ενεργότητας των ριβοσωμάτων μετά από την παρασκευή τους ή ανασυγκρότησή τους, είναι η εκτίμηση της ικανότητάς τους να συνθέτουν poly(phe), αφού προγραμματιστούν με poly(u). Η poly(phe) σύνθεση πραγματοποιήθηκε σε όγκο 15 μl, προσθέτοντας 5 pmoles 70S επανασυζευγμένων ριβοσωμάτων, 40 μg poly(u), 7 nmoles Phe εμπλουτισμένης με 0.03 μci [ 14 C]-Phe και το βέλτιστο ποσό S-100 (2 μl) σε ρυθμιστικό διάλυμα H 20 Ν 150 Μ 4.5 SH 4 Spd 2 Spm 0.05, το οποίο περιείχε επίσης 3 mm ATP, 1.5 mm GTP και 5 mm ακετυλο-φωσφορικό ως πηγή ενέργειας. Το μείγμα επωάστηκε για 60 min, στους 37 0 C και στη συνέχεια 12 μl αυτού προστέθηκαν σε 2 ml 5% ψυχρό TCA (κατακρήμνιση της poly(phe) πρωτεΐνης). Το διάλυμα συμπληρώθηκε με 2 σταγόνες 1% BSA που βοηθάει στην κατακρήμνιση της πρωτεΐνης, αναδεύτηκε ισχυρά (vortex) και επωάσθηκε για 15 min, στους 90 0 C. Το μείγμα ψύχθηκε στους 0 0 C και διηθήθηκε μέσω ειδικών φίλτρων (Selecta glass filters). Ξεπλύθηκε δυο φορές με 5% TCA και μια φορά με διάλυμα διαιθυλαιθέρα/etoh (1:1), ώστε να απομακρυνθεί το TCA και να στεγνώσει το φίλτρο, πριν τη μέτρησή του σε μετρητή ραδιενέργειας β ακτινοβολίας παρουσία 5 ml Οpti-Fluor σπινθηριστικού υγρού.

7.3.8 Ανασυγκρότηση της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας (Reconstitution) Η αντίδραση ανασύστασης της 50S ριβοσωματικής υπομονάδας έγινε σύμφωνα με πρωτόκολλο που σχεδιάστηκε από τον Nierhaus (Nierhaus, 1990a), με μικρές τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα, η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε 16 μl όγκο και έλαβε χώρα σε δυο βήματα. Στο πρώτο βήμα 0.25 Α 260 μείγματος 23S και 5S rrna (9 pmoles) σε ρυθμιστικό διάλυμα Rec4, επωάστηκαν με 0.25 eu TP50 για 30 min, στους 44 0 C. Στο δεύτερο βήμα προστέθηκε 1 μl διαλύματος 260 mm (CH 3 COO) 2 Mg και το μίγμα επωάστηκε για άλλα 90 min, στους 50 0 C. Από το συνολικό όγκο (16 μl) του μείγματος επώασης, τα 10 μl (6 pmoles) αναμείχθηκαν με 12 pmoles 30S υπομονάδων (μοριακή αναλογία 50S:30S, 1:2) και επωάστηκαν στους 40 0 C για 60 min. H ικανότητα των ανασυγκροτημένων ριβοσωμάτων να πρωτεϊνοσυνθέτουν ελέγχθηκε με την αντίδραση πουρομυκίνης ή poly(phe) σύνθεση. 7.3.9 Μελέτη της μετατόπισης των υποστρωμάτων (translocation) Για τον έλεγχο της μετατόπισης των υποστρωμάτων trnas από την Α- στην Ρ- θέση χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία που περιγράφεται από τον Watanabe (1972) με μερικές τροποποιήσεις (Σχήμα 7.3). 5-10 pmoles επανασυζευγμένων ριβοσωμάτων αιωρήθηκαν σε τελικό όγκο 12.5 μl διαλύματος H 20 Ν 150 Μ 4.5 SH 4 Spd 2 Spm 0.05 και επωάστηκαν με 25 μg poly(u) και περίσσεια trna Phe (μοριακή αναλογία προς τα ριβοσώματα 1.5 : 1) για 15 min στους 37 0 C, ώστε η Ρ- θέση τους να καλυφθεί από αποακυλιωμένο trna. Διατηρώντας σταθερές τις ιοντικές συνθήκες, προστέθηκε AcPhe-tRNA σε μοριακή αναλογία 0.8-1.5 προς τα ριβοσώματα και το μίγμα επωάστηκε για 30 min στους 37 0 C. Μετά την πρόσδεση του AcPhe-tRNA στην Α- θέση του ριβοσώματος, ακολούθησε προσθήκη GTP (σε τελική συγκέντρωση 0.12 mm) και του παράγοντα EF-G (μοριακή αναλογία EF-G / ριβόσωμα= 0.1-0.4) και το μίγμα επωάστηκε για άλλα 10 min, στους 37 0 C. Το ποσό του AcPhe-tRNA Phe που δεσμεύτηκε στην Α-θέση του ριβοσώματος (pre-complex) υπολογίστηκε με διήθηση του μίγματος σε φίλτρο

νιτροκυτταρίνης και τιτλοδότηση με πουρομυκίνη. Tο ποσό του AcPhe-tRNA που μετατοπίστηκε στην P- θέση (post-complex) ανιχνεύτηκε με την αντίδραση πουρομυκίνης (2 mm για 2 min, 25 0 C). To διάλυμα πουρομυκίνης περιείχε επιπρόσθετα το αντιβιοτικό θειοστρεπτόνη σε τελική συγκέντρωση 5 mm, έτσι ώστε να αποφεύγεται περαιτέρω μετατόπιση κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Η αυθόρμητη μετατόπιση (spontaneous translocation) μετρήθηκε απουσία του παράγοντα EF-G. Τέλος, έγιναν πειράματα με αυξανόμενη συγκέντρωση EF-G, επωάζοντας το pre-σύμπλοκο με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις EF-G για 1 min, στους 37 0 C. Σχήμα 7.3: Σχηματική αναπαράσταση ελέγχου του σταδίου της μετατόπισης. (Ι) 70S προγραμματισμένα ριβοσώματα με mrna και αποακυλιωμένο trna Phe στην Ρ-θέση. (ΙΙ) Σχηματισμός Pi ή PRE-μετατοπισμένου συμπλόκου με προσθήκη AcPhe-tRNA. (III) Προσθήκη EF-G. (ΙV) Αντίδραση πουρομυκίνης. Εναλλακτικά, αντί poly(u) χρησιμοποιήθηκε MF-mRNA (οι δυο πρώτες τριπλέτες κωδικοποιούν το διπεπτίδιο fmet-phe) και η κάλυψη της Ρ- θέσης έγινε με ραδιενεργό [ 32 P] trna fmet (423 dpm/pmol). Έτσι, δόθηκε δυνατότητα να υπολογιστεί επιπρόσθετα η πρόσδεση του trna στην Ε- θέση (Qin et al., 2006). Όταν η μετατόπιση μελετήθηκε παρουσία αντιβιοτικών, τα μακρολίδια προστέθηκαν σε συγκέντρωση 2 μμ και η βιομυκίνη (control) σε 50 μμ πριν την προσθήκη EF-G.

7.3.10 Συζευγμένο σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης Σε αυτό το σύστημα η μεταγραφή και η μετάφραση λαμβάνουν χώρα ταυτόχρονα στο ίδιο μίγμα αντίδρασης. Η μεταγραφή των γονιδίων γίνεται υπό τον έλεγχο του Τ7 υποκινητή και είναι δυνατή είτε από κυκλική ή από γραμμική DNAμήτρα. Προσθήκη της DNA-μήτρας και Τ7 RNA πολυμεράσης σε ένα εκχύλισμα S30 από E. coli (ελεύθερο από DNA, mrna και trna) Σχήμα 7.4: Σύζευξη μεταγραφής-μετάφρασης (παρέχεται από τη Roche, Πίνακας 6.2.4), πυροδοτεί τη συζευγμένη μεταγραφή-μετάφραση: όταν η Τ7 RNA πολυμεράση μεταγράφει το μητρικό γονίδιο, τα ριβοσώματα που βρίσκονται στο διάλυμα ξεκινούν να μεταφράζουν το 5 άκρο του νεοσυντιθέμενου mrna. Τα πειράματα του συζευγμένου συστήματος έγιναν χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο pivex2.2-gfpcyc3 που κωδικοποιεί την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη τύπου cyc3 (GFP: Green Fluorescent Protein) (Crameri et al., 1996). Green Fluorescent Protein / Πλασμίδιο pivex2.2-gfpcyc3 H GFP είναι μια φθορίζουσα πρωτεΐνη που περιέχει 238 αμινοξέα και ανακαλύφθηκε στη μέδουσα Aequorea victoria. Η πρωτεΐνη αυτή έχει μια χαρακτηριστική δομή 11 β-πτυχωτών επιφανειών που σχηματίζουν έναν κύλινδρο. Στο κέντρο του κυλίνδρου αναπτύσσεται μια ομοαξονική α-έλικα, στην οποία λαμβάνει χώρα ο αυτοκαταλυόμενος φθορισμός από το τριπεπτίδιο Ser65-Tyr66-Gly67 (Yang et al., 1996, Ormo et al., 1996) (Σχήμα 7.5Α). Το πλασμίδιο pivex2.2-gfpcyc3 που χρησιμοποιήθηκε ως DNAμήτρα, περιείχε ένα μεταλλαγμένο γονίδιο της GFP, το GFPcyc3 (Σχήμα

7.5B). Η GFPcyc3 πρωτεΐνη χαρακτηρίζεται από τρεις μεταλλάξεις που επιτρέπουν τη γρήγορη ωρίμανση του φθοροφόρου (3-4 h) σε σχέση με του άγριου τύπου GFP που χρειάζεται περισσότερη επώαση στους 4 0 C (>8 h) (Crameri et al., 1996). Το πλασμίδιο περιείχε επιπλέον: α) το γονίδιο ανθεκτικότητας έναντι της αμπικιλλίνης, β) μια ισχυρή αλληλουχία εκκινητή της Τ7 πολυμεράσης (Studier and Moffatt, 1986), γ) το γονίδιο 10 που είναι μεταφραστικός ενισχυτής (translational enhancer) (Olins et al., 1988), δ) την προκαρυωτική Shine-Dalgarno αλληλουχία (Shine and Dalgarno, 1974) ως θέση πρόσδεσης των προκαρυωτικών ριβοσωμάτων, με βέλτιστη απόσταση από το εναρκτήριο κωδικόνιο AUG (Chen et al., 1994), ε) την Τ7 τερματική αλληλουχία (terminator) που σταματάει την μεταγραφή και παρεμποδίζει την αποικοδόμηση του 3 άκρου του mrna και στ) την αλληλουχία Strep-tagII στο Ν τελικό άκρο που βοηθάει στον καθαρισμό της πρωτεΐνης (Voss and Skerra, 1997) (Σχήμα 7.5Β). A B Σχήμα 7.5: (A) Τριτοταγής δομή της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP), (B) Χάρτης του pivex2.2-gfpcyc3 πλασμιδίου.

Αναστολή συζευγμένου συστήματος μεταγραφής-μετάφρασης από αντιβιοτικά Το συζευγμένο σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης RTS (Rapid Translation System) 100HY (High Yield) της Roche χρησιμοποιήθηκε μετά από προσαρμογή των συστατικών του σε μικρότερο όγκο (10 μl) από αυτόν που προτείνεται από την εταιρεία (50 μl), με σκoπό τη μελέτη της επίδρασης ορισμένων αντιβιοτικών στην καταλυτική του δραστικότητα και μεταφραστική πιστότητα. Σύμφωνα με το προσαρμοσμένο πρωτόκολλο, το μίγμα της αντίδρασης (50 μl) παρασκευάστηκε προσθέτοντας 12 μl S30 εκχύλισμα από E. coli, 10 μl μείγμα αντίδρασης (Reaction Mix), 12 μl μείγμα αμινοξέων, 1μl μεθειονίνη και 5 μl ρυθμιστικό διάλυμα (Reconstitution buffer). Το μίγμα χωρίστηκε σε μικρότερα κλάσματα των 8 μl, στα οποία προστέθηκαν 1 μl DNA πλασμιδίου της GFP (0.3 μg/μl) και 1 μl Η 2 Ο (control πειράματα) ή 1 μl αντιβιοτικού (πειράματα αναστολής). Τα κλάσματα τοποθετήθηκαν σε ειδική συσκευή μεταγραφής-μετάφρασης (RTS ProteoMaster Instrument από Roche, DE) και επωάστηκαν για 5 h στους 30 0 C, υπό συνεχή ανάδευση (900 rpm). Ποσοτικοποίηση της συνολικής και της ενεργής GFP Μετά το τέλος της επώασης, 1.5 μl από το μείγμα αντίδρασης ηλεκτροφορήθηκαν σε 15% πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (2% SDS), ώστε να υπολογιστεί η συνολική ποσότητα της εκφραζόμενης GFP πρωτεΐνης. Ποσοτικοποίηση της ζώνης έγινε μετά από χρώση της πηκτής με διάλυμα Commassie blue και έκπλυση με διάλυμα αποχρωματισμού (destain buffer). Η μέτρηση της έντασης των ζωνών έγινε σε μετρητή πυκνότητας (Personal Densitometer TM SI, από Amersham Biosciences, UK) χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ImageQuant TM TL (Amersham Biosciences, UK). Η ταυτοποίηση της ζώνης GFP έγινε με χρήση πρωτεϊνικών μαρτύρων γνωστού μοριακού βάρους. Η ποσοτικοποίηση της παραγόμενης ποσότητας GFP έγινε, συγκρίνοντας την ένταση της ζώνης της με εκείνη ενός μάρτυρα GFP γνωστής συγκέντρωσης.

Για τον υπολογισμό της ενεργής GFP που παρήχθηκε, 1.5 μl από το μείγμα αντίδρασης, αφού ωρίμασε τουλάχιστον για 4 h, στους 4 0 C, ηλεκτροφορήθηκε σε 15% πηκτή πολυακρυλαμιδίου, κάτω από μη-αποδιατακτικές συνθήκες. Η ποσοτικοποίηση της GFP έγινε με σάρωση της πηκτής σε FluorImager TM 595 (Amersham Biosciences, UK) και σύγκριση του φθορισμού ζώνης της με ζώνες αναφοράς (markers). O λόγος της ενεργής πρωτεΐνης προς τη συνολική πρωτεΐνη πολλαπλασιαζόμενος επί 100, παρέχει το ποσοστό της ενεργής GFP πρωτεΐνης που παράγεται. Το ποσοστό αυτό αποτελεί δείκτη της μεταφραστικής πιστότητας. 7.4 Μέθοδοι Γενετικής 7.4.1 Παρασκευή δεκτικών βακτηριακών κυττάρων E. coli (competent cells) για ηλεκτρο-ενσωμάτωση πλασμιδίου Η σειρά E. coli XL1-Blue επιτρέπει χρωστική επιλογή για τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια και είναι μια πολύ καλή σειρά ξενιστών κυττάρων (host) για συνήθεις εφαρμογές κλωνοποίησης που χρησιμοποιούνται πλασμίδια ή λάμδα οχήματα μεταφοράς. Ο γενότυπος της σειράς αυτής είναι: reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 rela1 lac [F proab laciqz.m15 Tn10 (Tetr)]. Τα κύτταρα είναι ανθεκτικά στην τετρακυκλίνη και χρησιμοποιούνται για παρασκευή επιδεκτικών κυττάρων. Ένα λίτρο καλλιέργειας E. coli XL1-Blue αναπτύχθηκαν ως Α 600 =0.5-1.0. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν στον πάγο και στη συνέχεια, φυγοκεντρήθηκαν στις 4000 rpm για 15 min, στους 4 0 C σε GSA κεφαλή. Το ίζημα των κυττάρων αναδιαλύθηκε σε έναν όγκο ψυχρού mq-h 2 O και ακολούθησαν συνεχείς φυγοκεντρήσεις και πλυσίματα σε μειωμένους όγκους ψυχρού mq-h 2 O: δυο πλυσίματα με 0.5 όγκους και τελική αναδιάλυση σε 2-3 ml αποστειρωμένου υδατικού διαλύματος γλυκερόλης (10% v/v). Τα κύτταρα διαχωρίστηκαν σε μικρά κλάσματα των 40 μl, ψύχθηκαν απότομα σε υγρό άζωτο και φυλάχτηκαν στους -80 0 C.

7.4.2 Μετασχηματισμός κυττάρων (Transformation) Επιδεκτικά κύτταρα XL1-Blue (40 μl) αναμίχθηκαν με 2 μl (~100 ng) πλασμιδίου και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε κυβέτες της BioRad, όπου έγινε η ηλεκτρομεταφορά σε ειδική συσκευή της ίδιας εταιρείας (Gene Pulser από BioRad, USA) με παλμό 25 μf, 1.8 κv, 200 Ω. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα διαλύθηκαν σε 1 ml LB-medium και επωάστηκαν για 1 h, στους 37 0 C. Ποσότητα 100-150 μl τοποθετήθηκε σε LB-άγαρ τρυβλίο με το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής (αμπικιλλίνη 100 μg/ml). Η επιλογή των κλώνων που περιέχουν το επιθυμητό πλασμίδιο έγινε σε δυο βήματα: πρώτα, μια αποικία καλλιεργήθηκε σε 3 ml LB-medium και απομονώθηκε το πλασμιδιακό DNA (mini-prep) και έγινε ταχεία εκτίμηση του μεγέθους του με PCR. Κλώνοι που περιείχαν πλασμίδιο ικανοποιητικού μεγέθους ελέγχθηκαν περαιτέρω ως προς το πλασμιδιακό DNA τους με ανάλυση της DNA αλληλουχίας. 7.4.3 Απομόνωση πλασμιδίου Μικρής κλίμακας (mini-prep) Μικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA έγινε με χρήση των QIAprep spin miniprep Kits, από βακτηριακές καλλιέργειες των 3 ml. Σύμφωνα με τις οδηγίες που συνοδεύουν τα kits, 3 ml βακτηριακής καλλιέργειας (15-20 h) φυγοκεντρήθηκαν για 10 min στις 5000 rpm. Τα κύτταρα κατακρημνίστηκαν, αναδιαλύθηκαν σε 0.3 ml διαλύματος P1 και ακολούθησε λύση αυτών για 2 min σε θερμοκρασία δωματίου με προσθήκη 0.3 ml διαλύματος P2. Μετά από προσθήκη 0.3 ml διαλύματος P3, τα δείγματα αναμίχθηκαν με σκοπό την κατακρήμνιση των πρωτεϊνών και του χρωμοσωμικού DNA. Το μείγμα φυγοκεντρήθηκε (10 min, στις 13000 rpm, 25 0 C) και το DNA (υπερκείμενο) χρωματογραφήθηκε σε στήλες που παρέχονται με το kit. Μετά από έκπλυση της στήλης με 0.75 ml διαλύματος PE, το πλασμιδιακό DNA εκλούστηκε με 50 μl διαλύματος EB. Η απόδοση ήταν 15-60 μg DNA / 2 ml καλλιέργειας.

Μεγάλης κλίμακας (maxi-prep) Μεγάλης κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA έγινε χρησιμοποιώντας τα Qiagen plasmid maxi kits. Φιάλες που περιείχαν 600 ml LB-medium, εμβολιάστηκαν με 6 ml μετασχηματισμένων E. coli κυττάρων. Mετά από 8 ώρες τα κύτταρα συλλέχθηκαν με ήπια φυγοκέντρηση (6000 rpm, 15 min, 4 0 C, σε GSA κεφαλή). Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 10 ml διαλύματος P1 και στη συνέχεια προστέθηκαν 10 ml διαλύματος P2. Μετά από ήπια ανάδευση, το μίγμα επωάστηκε για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου. Το γενομικό DNA, πρωτεΐνες και τα κύτταρα κατακρημνίστηκαν με προσθήκη 10 ml ψυχρού διαλύματος P3, επώαση 20 min στον πάγο και φυγοκέντρηση στα 20000 g (12000 rpm, 30 min, SS34, 4 0 C). Το υπερκείμενο φορτώθηκε σε Qiagen-tip 500 στήλη που είχε πριν εξισορροπηθεί με διάλυμα QBT. Η στήλη πλύθηκε 2 φορές με 30 ml διαλύματος QC και το πλασμιδιακό DNA εκλούσθηκε από τη στήλη με 15 ml διαλύματος QF. Το ανακτηθέν DNA κατακρημνίστηκε με 10.5 ml ισοπροπανόλης σε θερμοκρασία δωματίου, και αμέσως φυγοκεντρήθηκε στα 15000 g (11000 rpm, SS-34) για 30 min στους 4 0 C. Το ίζημα ξεπλύθηκε με 70% αιθανόλη και μετά φυγοκεντρήθηκε στις ίδιες συνθήκες. Το ίζημα του πλασμιδιακού DNA αφέθηκε να στεγνώσει σε ξηρό αέρα και αναδιαλύθηκε σε κατάλληλο όγκο διαλύματος TE (10 mm Tris-HCl ph 8.0, 1 mm EDTA). H απόδοση ήταν λιγότερη από 100 μg/600 ml καλλιέργειας. 7.5 Φωτοσήμανση συγγενείας (Photo-affinity labeling) Φωτοσήμανση συγγενείας ονομάζεται η τεχνική της σταυροσύνδεσης (cross-linking), που χρησιμοποιεί ως αντιδραστήριο σταυροσύνδεσης (crosslinker) ένα φωτοδραστικό μόριο (π.χ. R-Ν 3 ). Η βασική αρχή περιγράφεται στο Σχήμα 7.6. Εν συντομία, ο προσδέτης προσεγγίζει τη θέση δέσμευσής του στο μακρομόριο-στόχο και στη συνέχεια με ακτινοβόληση προσδένεται ομοιοπολικά σε αυτή. Τα πλεονεκτήματα των φωτοδραστικών αντιδραστηρίων έναντι των υπολοίπων αντιδραστηρίων σταυροσύνδεσης είναι ότι: i) αποφεύγονται ανεπιθύμητες πλευρικές αντιδράσεις, διότι

παραμένουν αδρανή μέχρις ότου δεσμευτούν εξειδικευμένα και μη ομοιοπολικά στην περιοχή-στόχο, ii) αντιδρούν εύκολα με πολλά είδη χημικών ομάδων, και iii) είναι σταθερά σε υδατικό περιβάλλον. Σχήμα 7.6: Μοντέλο φωτοσήμανσης. Χ: φωτοδραστική ομάδα, Β: διαχωριστής (spacer), S: φυσικός προσδέτης, a: μακρομόριο-στόχος Η μέθοδος της σταυροσύνδεσης αποτελεί σημαντικό εργαλείο για δομικές μελέτες στη διακριτική περιοχή 5-20 Ǻ και υπερέχει έναντι της κλασικής ανάλυσης αποτυπώματος (footprinting analysis), λόγω του ότι προσδιορίζει την ακριβή θέση πρόσδεσης του μορίου, χωρίς να επηρεάζεται από αλλοστερικά φαινόμενα ή αλλαγές διαμόρφωσης που μπορούν να περιπλέξουν την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. 7.5.1 Σύνθεση της φωτοδραστικής αζιδοβενζαμιδινο(aba)-σπερμίνης Το φωτοδραστικό μόριο που επιλέχθηκε για μελέτη των θέσεων πρόσδεσης της σπερμίνης στο ριβόσωμα, ήταν η ΑΒΑ-σπερμίνη (Σχήμα 7.7A). Η επιλογή του αρυλαζιδίου έναντι ενός αλκυλαζιδίου (RCH 2 N 3 ) έγινε διότι τα αλκυλαζίδια υπό την επίδραση UV ακτινοβολίας υφίστανται ενδομοριακούς μετασχηματισμούς (Wolf rearrangement) που οδηγούν σε αδρανή προϊόντα (Σχήμα 7.7Β). Κατάλληλη υποκατάσταση του αρωματικού δακτυλίου της αρυλομάδας μπορεί να αυξήσει κατά δυο τάξεις μεγέθους το χρόνο ημίσιας ζωής της ένωσης, ενώ ταυτόχρονα καθιστά το μόριο διεγέρσιμο σε μεγάλα μήκη κύματος (250-460nm). H σύνθεση της ABA-σπερμίνης πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται από τους Clark et al. (1991) (Σχήμα 7.7). Σημειώνεται, ότι όλες οι

απαιτούμενες εργασίες έγιναν σε σκοτεινό θάλαμο και θερμοκρασία δωματίου. Α N 3 Β (ΜΑΒΙ) C OCH 3 + SPM N 3 C NH 2 Cl RCH 2 N 3 U.V 9Ǻ 17.11Ǻ N H NH 2 Cl N H (ΑΒΑ-σπερμίνη) RCH 2 N RCH 2 NH (αδρανές) N 2 H N NH 2 R N 3 R N (δραστικό) Σχήμα 7.7: (Α) Σύνθεση ΑΒΑ-σπερμίνης από ΜΑΒΙ με προσθήκη σπερμίνης (SPM). (Β) Προϊόντα φωτόλυσης αλκυλαζιδίων και αρυλαζιδίων. Συγκεκριμένα 250 μmoles σπερμίνης διαλύθηκαν σε 5 ml 20% CH 3 CN και το ph ρυθμίστηκε στην τιμή 10 με NaOH. Στο διάλυμα αυτό προστέθηκαν 1000 μmoles ΜΑΒΙ ήδη διαλυμένα σε 30% CH 3 CN, σε 15 ισόποσες δόσεις, σε διάστημα μιας ώρας. Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης, το ph ήταν υπό συνεχή έλεγχο, ώστε η τιμή του να μη μειωθεί περισσότερο από 9. Ως γνωστό, το ΜΑΒΙ υδρολύεται εύκολα σε ουδέτερο ή όξινο περιβάλλον. Η ΑΒΑ-σπερμίνη καθαρίστηκε με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής σε στήλη sulfopropyl Sephadex G50 απουσία φωτός, στους 25 0 C με διάλυμα έκλουσης CH 3 COONH 4 διαβαθμισμένης συγκέντρωσης 0.6-1.6 Μ. Η ταυτοποίηση των κλασμάτων που περιείχαν την ΑΒΑ-σπερμίνη έγινε με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) σε πλάκες Silica gel 60F χρησιμοποιώντας ως διαλύτη ανάπτυξης διάλυμα πυριδίνης, οξικού, νερού και ισοπροπυλικής αλκοόλης σε αναλογία (1:1:2:4). Το κλάσμα που περιείχε ΑΒΑ-σπερμίνη λυοφιλοποιήθηκε και φυλάχτηκε στους 20 0 C, στο σκοτάδι.

7.5.2 Φωτοσήμανση ριβοσωματικών συστατικών Φωτοσήμανση συμπλόκου C και ριβοσωματικών υπομονάδων Η φωτοσήμανση συμπλόκου C ή ριβοσωματικών υπομονάδων με το φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης έγινε μετά από ενεργοποίηση αυτών σε διάλυμα Η 50 Ν 150 Μ 20 για 10 min, στους 37 0 C (αποφυγή Tris και β-ετsh λόγω παρουσίας πρωτοταγών αμινοομάδων αδρανοποιούν τη φωτοδραστική ομάδα). Στη συνέχεια, η συγκέντρωση του Mg 2+ μειώθηκε στα 4-5 mm. Σύμπλοκο C ή ριβοσωματικές υπομονάδες (800 pmoles/ml) επωάστηκαν παρουσία 100 μm ABA-σπερμίνης για 20 min στους 25 0 C, απουσία φωτός. Στη συνέχεια, το μείγμα ψύχθηκε στους 4 0 C και ακτινοβολήθηκε από πηγή φωτός 300 nm (UltraViolet-B, ll 40W, 12RS, Phillips) που απείχε 5 cm από το δείγμα. Η φωτοσήμανση τερματίστηκε προσθέτοντας στο διάλυμα επώασης 100 μl 60 mm β-etsh. Η συγκέντρωση Mg 2+ στο διάλυμα κανονίστηκε στα 10 mm και το προϊόν φωτοσήμανσης κατακρημνίσθηκε με 0.65 όγκους EtOH (-20 0 C, o/n). Φωτοσήμανση rrna Για τη φωτοσήμανση ελευθέρου 23S rrna, έγινε ενεργοποίηση αυτού σε διάλυμα Η 50 Ν 150 Μ 20 για 15 min, στους 37 0 C. Στη συνέχεια, μετά από ρύθμιση της συγκέντρωσης των ιόντων Mg 2+ στα 4.5 mm, προστέθηκε ΑΒΑσπερμίνη σε τελική συγκέντρωση 100 μμ, και το μείγμα ακτινοβολήθηκε, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. Το φωτοσημασμένο rrna απομονώθηκε με αιθανολική κατακρήμνιση (προσθήκη 1/10 όγκων διαλύματος 3Μ CH 3 COONa ph 5.5 και 2.5 όγκων EtOH, στους -20 0 C, o/n) 7.6 Ανάλυση αποτυπώματος (Footprinting analysis) Είναι γνωστό ότι τα περισσότερα αντιβιοτικά που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση δρουν δεσμευόμενα στο rrna. Μια πειραματική προσέγγιση για την εύρεση των θέσεων πρόσδεσης αντιβιοτικών, αλλά και

άλλων προσδετών του ριβοσώματος, είναι η τεχνική ανάλυσης αποτυπώματος (Christiansen et al., 1990). Η τεχνική βασίζεται στο γεγονός ότι τα νουκλεοτίδια του rrna, όπου δεσμεύονται (απόσταση <4.5 Ǻ) οι παραπάνω προσδέτες, προστατεύονται από χημική τροποποίηση. Ως χημικοί τροποποιητές χρησιμοποιούνται διάφορες ριβονουκλεάσες (Τ1,Τ2, CV ή V1) οι οποίες διασπούν υδρολυτικά το ριβοσωματικό κορμό, πλην της περιοχής που προστατεύεται από τον προσδέτη. Εναλλακτικά, ως χημικοί τροποποιητές μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντιδραστήρια (DMS, CMCT, KE, DEP και Pso) που τροποποιούν εκλεκτικά βάσεις του rrna, όταν οι τελευταίες βρίσκονται εκτός της περιοχής δέσμευσης του προσδέτη και είναι μονόκλωνες. Και στις δυο περιπτώσεις, οι περιοχές θραύσεως (υδρολυτικά ένζυμα) ή τροποποίησης (τροποποιητικά αντιδραστήρια) μπορούν να ταυτοποιηθούν με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή (primer extension analysis). 7.6.1 Παρασκευή συμπλόκων αντιβιοτικών-ριβοσωμάτων Τα ριβοσώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση αποτυπώματος απομονώθηκαν από Ε. coli K12 κύτταρα με τον ίδιο τρόπο, όπως αυτά που χρησιμοποιήθηκαν για τις κινητικές μελέτες. Έτσι, ήταν δυνατόν να γίνει αξιόπιστη σύγκριση των αποτελεσμάτων. Πριν από τη χρήση τους, αντικαταστάθηκε το ρυθμιστικό τους διάλυμα σε Η 50 Ν 150 Μ 4.5, διότι έχει δειχθεί ότι το HEPES είναι πιο κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (pka 7.5) για δράση των χημικών αντιδραστηρίων. Για την ταυτοποίηση του αποτυπώματος της αρχικής και τελικής θέσης πρόσδεσης του αντιβιοτικού στο ριβόσωμα, χρησιμοποιήθηκαν δυο τρόποι δημιουργίας συμπλόκου. Για την ταυτοποίηση της τελικής θέσης, δηλαδή εκείνης που αντιστοιχεί στο σύμπλοκο C*I, προεπωάσαμε σύμπλοκο C με περίσσεια αντιβιοτικού (10x ή 50xK i ) στους 25 0 C μέχρι πλήρους εξισορροπήσεως και στη συνέχεια έγινε χημική τροποποίηση του συμπλόκου, σύμφωνα με καθιερωμένα πρωτόκολλα. Οι χρόνοι εξισορρόπησης (6 x t 1/2 ) υπολογίστηκαν βάσει της σχέσης (7) και δίνονται στον Πίνακα V.

t k6[ I] = k και keq = k7 + K + [ I] 1/2 1 eq i (7) Για την ταυτοποίηση της αρχικής θέσης πρόσδεσης, δηλαδή εκείνης που αντιστοιχεί στο σύμπλοκο CI, προστέθηκε στο σύμπλοκο C το αντιβιοτικό και σχεδόν αμέσως μετά (<1 min) ο χημικός τροποποιητής. Πίνακας V: (Α) Συγκεντρώσεις (μμ) αντιβιοτικών που αντιστοιχούν σε 10x και 50x K i για κάθε αντιβιοτικό και για κάθε ιοντική συνθήκη. (Β) Χρόνοι (min) που απαιτούνται για την πλήρη εξισορρόπηση πρόσδεσης κάθε αντιβιοτικού στην τελική του θέση στο ριβόσωμα. Α. 4.5 mm Mg 2+ 150 mm NH 4 + 4.5 mm Mg 2+ 150 mm NH 4 + 100 μμ σπερμίνη Σύμπλοκο C φωτοσημασμένο με 100 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη 10K i 50K i 10K i 50K i 10K i 50K i Τυλοσίνη 23.5 117.5 11.8 59 13.7 57.5 Ερυθρομυκίνη 0.83 4.15 5.12 25.6 5 25 Αζιθρομυκίνη 0.3 1.5 0.25 1.25 0.21 1.05 Τελιθρομυκίνη 4.6 23 25 125 27 135 Β. 4.5 mm Mg 2+ 150 mm NH 4 + 4.5 mm Mg 2+ 150 mm NH 4 + 100 μμ σπερμίνη Σύμπλοκο C φωτοσημασμένο με 100 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη 10K i 50K i 10K i 50K i 10K i 50K i Τυλοσίνη 5.15 5 12.30 11.30 11 10 Ερυθρομυκίνη 146 136 130 136 176 167 Αζιθρομυκίνη 120 113 272 260 272 260 Τελιθρομυκίνη 20 18.45 81 76 54.30 50

7.6.2 Χημική Τροποποίηση Η χημική τροποποίηση και η ανίχνευση των θέσεων πρόσδεσης των αντιβιοτικών έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που έχει προταθεί από την ερευνητική ομάδα του Noller (Moazed et al., 1985, Stern et al., 1988), με μερικές τροποποιήσεις που βασίστηκαν σε πιο πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα (Christiansen et al., 1990; Rodriguez-Fonseca and Garrett, 1995; Xiong et al., 2005). Oι χημικοί τροποποιητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τρεις: το DMS που μεθυλιώνει το Ν 7 της γουανίνης, το Ν 1 της αδενίνης και το Ν 3 της κυτοσίνης, το CMCT που τροποποιεί το Ν 3 της ουρακίλης και το Ν 1 της γουανίνης και η κεθοξάλη (KE) που τροποποιεί το Ν 1 και Ν 2 της γουανίνης (Σχήμα 7.10). Πλην της τροποποίησης στη θέση Ν 7 της γουανίνης από DMS, όλες οι υπόλοιπες αναγνωρίζονται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση, το οποίο τερματίζει το σχηματισμό cdna αλυσίδας ένα νουκλεοτίδιο πριν από αυτό που έχει τροποποιηθεί. Κατά συνέπεια, ανάλυση των cdna προϊόντων της αντίστροφης μεταγραφάσης με ηλεκτροφόρηση καθιστά δυνατή την ταυτοποίηση των θέσεων τροποποίησης. Η ταυτοποίηση της Ν 7 τροποποίησης ανιχνεύεται με άλλη μέθοδο (Ehresmann et al., 1987). Η τροποποίηση του μακρομορίου-στόχου έγινε ως εξής: DMS τροποποίηση: 3 μl DMS (αραιωμένο 1:5 σε EtOH) προστέθηκε σε 100 μl διαλύματος Η 50 Ν 150 Μ 4.5 που περιείχε 3 Α 260 ελεύθερου συμπλόκου ή 6 A 260 συμπλόκου C στο οποίο είχε προσδεθεί αντιβιοτικό (CI ή C*I). Ακολούθησε επώαση στους 37 0 C, για 10 min. Η αντίδραση διακόπηκε με προσθήκη 25 μl διαλύματος DMS stop, και τα προϊόντα απομονώθηκαν με εκχύλιση με φαινόλη. CMCT τροποποίηση: Αντί DMS χρησιμοποιήθηκαν 100 μl CMCT (42 mg/ml). Ακολούθησε επώαση για 20 min, στους 37 0 C. Η αντίδραση διακόπηκε κατευθείαν με εκχύλιση με φαινόλη. ΚΕ τροποποίηση: Αντί DMS χρησιμοποιήθηκαν 5 μl KE (35 mg/ml αραιωμένη σε 20% EtOH). Ακολούθησε επώαση στους 37 0 C, για 10 min και στη συνέχεια προστέθηκαν 7 μl 500 mm βορικού οξέος. Η διακοπή της αντίδρασης έγινε με εκχύλιση με φαινόλη.

A O CH 3 CH 2 O * * H 3 COSOCH NCNCH 2 CH 2 N O * * 3 CH 3 CHCCH O CH 3 OO DMS CMCT KE Β DMS H O O 2 N N 7 CMCT N H 2 N HN 3 U 1 N HN G 9 HN 3 C N 1 N A 9 C' N N DMS KE N C' CMCT DMS N O C' H 2 N O C' Αδενίνη Ουρακίλη Γουανίνη Κυτοσίνη Γ Α U G 7.10: (Α) Χημικοί τροποποιητές. Τα άτομα που αντιδρούν είναι σημειωμένα με αστερίσκο. (Β) Τα άτομα στις βάσεις που τροποποιούνται από ένα χημικό τροποποιητή, σημειώνονται με βέλος. (Γ) Τροποποιημένη αδενική από DMS, ουρακίλη από CMCT και γουανίνη από ΚΕ (Ehresmann et al., 1987). 7.6.3 Εκχύλιση του rrna H απομόνωση του τροποποιημένου rrna έγινε με τρεις διαδοχικές εκχυλίσεις. Συγκεκριμένα, στο μείγμα τροποποίησης προστέθηκε ίσος όγκος φαινόλης και το μίγμα αφού αναδεύτηκε ισχυρά (vortex) για 2 min, στους 25 0 C, επωάστηκε για 1 min, στους 0 0 C. H ανάδευση και επώαση επαναλήφθηκε 5 φορές και το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 7000 rpm, για 5 min, στους 4 0 C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και υποβλήθηκε σε διαδοχική εκχύλιση, αρχικά με ίσο όγκο φαινόλης-χλωροφορμίου (CHCl 3 ), και στη συνέχεια με ίσο όγκο μόνο χλωροφορμίου. Το τελικό υπερκείμενο κατακρημνίσθηκε με αιθανόλη και το ίζημα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση

στις 12000 rpm, για 30 min, στους 4 0 C. Στη συνέχεια, το ίζημα αποξηράθηκε για 2 min σε Spead Vac και αναδιαλύθηκε σε 10 μl mq-h 2 O. Φωτομετρήθηκε στα 260 nm και αραιώθηκε περαιτέρω, ώστε να έχουμε τελική συγκέντρωση 3 μg/μl. 7.6.4 Ταυτοποίηση θέσεων πρόσδεσης τροποποιημένων νουκλεοτιδίων με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή (Primer extension) Για τον προσδιορισμό των τροποποιημένων νουκλεοτιδίων (είτε με την ομοιοπολικά προσδεδεμένη ΑΒΑ-σπερμίνη είτε με τους χημικούς τροποποιητές) χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της προέκτασης εκκινητή. Σύμφωνα με την αρχή της τεχνικής αυτής, η μεταγραφή του rrna σε cdna από το ένζυμο της αντίστροφης μεταγραφάσης (Reverse Transcriptase) διακόπτεται ένα νουκλεοτίδιο πριν την τροποποίηση. Η ανίχνευση της τροποποιημένης βάσης εμφανίζεται ως ζώνη στα αυτοραδιογραφήματα μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου 6%. Η εύρεση της ακριβούς θέσης της βρέθηκε με ανάλυση αλληλουχίας (sequencing) που έγινε παράλληλα. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν (17-20μερή DNA, που περιείχαν 50% GC και είχαν στο 3 άκρο G ή C) επιλέχθηκαν, έτσι ώστε να αναλυθεί όλο το καταλυτικό κέντρο και συγκεκριμένα οι δομικές περιοχές ΙΙ και V. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν είναι ο Κ3, Κ4, Κ7 και Κ16 και οι περιοχές που ανιχνεύτηκαν φαίνονται στο Σχήμα 7.11. Για κάθε δείγμα τροποποιημένου rrna παρασκευάστηκαν 9 μl διαλύματος που περιείχαν: 2 μl από τον εκκινητή (10 ng/μl), 2 μl από διάλυμα υβριδοποίησης (4.5x), 3 μl mq-h 2 O και 2 μl από το εκχυλισμένο RNA (6 μg). Το rrna αποδιατάχθηκε στους 95 0 C, για 1.5 min και στη συνέχεια, έγινε υβριδοποίηση του εκκινητή στους 65-70 0 C, για 10 min. Στο προϊόν προστέθηκαν 4 μl μείγματος προέκτασης (περιείχε dntps, a-[ 32 P] ATP), 2 μl από το ένζυμο AMV αντίστροφη μεταγραφάση (1.5 units) και 2 μl mq-h 2 O. Στην περίπτωση των δειγμάτων ανάλυσης αλληλουχίας, αντί mq- H 2 O προστέθηκαν 2 μl από ένα συγκεκριμένο ddntp. Η αντίδραση πολυμερισμού της αντίστροφης μεταγραφάσης έγινε στους 42 0 C, για 1 h και ολοκληρώθηκε με προσθήκη 3.4 μl chase mix (1 mm για κάθε dntp) και

επώαση για 30 min. To cdna που δημιουργήθηκε κατακρημνίστηκε με αιθανόλη και ψύξη στους -20 0 C, o/n. Το ίζημα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στις 12000 rpm για 40 min, αποξηράνθηκε σε spead vac για 2 min, και αφού συμπληρώθηκε με 30 μl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης, αφέθηκε για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου. Πριν ηλεκτροφορηθεί, αποδιατάχθηκε για 2 min στους 95 0 C και ψύχθηκε σε πάγο. 10 μl από το τελικό διάλυμα ηλεκτροφορήθηκαν αμέσως σε πηκτή 6% πολυακρυλαμιδίου, ενώ η υπόλοιπη ποσότητα φυλάχτηκε για επαναληπτικό πείραμα. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή τοποθετήθηκε προσεκτικά σε χαρτί Whatman, αποξηράνθηκε και υποβλήθηκε σε αυτοραδιογραφία ή ανάλυση σε Phosphoimager αναλυτή ( 7.1.4) Σχήμα 7.11: Δευτεροταγής δομή του 23S και 5S rrna. Οι περιοχές σάρωσης με ανάλυση προέκτασης εκκινητή σημειώνονται με μαύρο χρώμα. Οι περιοχές που είναι συμπληρωματικές των εκκινητών φαίνονται με κόκκινο χρώμα.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

8.1 Μηχανισμός δράσης αντιβιοτικών (Κινητική ανάλυση) Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε ο μηχανισμός πρόσδεσης των αντιβιοτικών στο ριβόσωμα, σε ιοντικές συνθήκες 4.5 mm Mg 2+ και 150 mm NH 4+, απουσία πολυαμινών. Οι τιμές των κινητικών παραμέτρων που εμπλέκονται στην πρόσδεση των αντιβιοτικών στο ριβόσωμα-στόχο, υπολογίστηκαν με κινητική ανάλυση. Η κινητική μελέτη που ακολουθεί, βασίστηκε στη δυνατότητα μέτρησης της ενεργότητας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, χρησιμοποιώντας ως εργαλείο την αντίδραση πουρομυκίνης. Στις περιπτώσεις βλαστισιδίνης και τυλοσίνης που αναστέλλουν άμεσα την PTάση, οι κινητικές παράμετροι υπολογίστηκαν απευθείας, παρακολουθώντας την ανασταλτική επίδραση των αντιβιοτικών στη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού. Αντίθετα, στις περιπτώσεις των μακρολιδίων ερυθρομυκίνη, αζιθρομυκίνη και τελιθρομυκίνη που δεν αναστέλλουν την PTάση, έγιναν πειράματα συναγωνισμού πρόσδεσης με την τυλοσίνη. Έτσι, δόθηκε η δυνατότητα να παρακολουθήσουμε την πρόσδεση των αντιβιοτικών (υπολογισμός κινητικών παραμέτρων) σε μια περιοχή που δεν επηρεάζει άμεσα ή έμμεσα το ενεργό κέντρο. 8.1.1 Μηχανισμός δράσης Βλαστισιδίνης Αναστολή πεπτιδικού δεσμού σε χαμηλές συγκεντρώσεις αντιβιοτικού ([Ι]<3Κ i ) Η μελέτη της αναστολής του πεπτιδικού δεσμού από τη βλαστισιδίνη έγινε, πραγματοποιώντας την αντίδραση πουρομυκίνης σε ρυθμιστικό διάλυμα T 100 N 100 M 6 SH 6 παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του αντιβιοτικού. Απουσία αντιβιοτικού, η ημιλογαριθμική χρονοκαμπύλη της αντίδρασης σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού (AcPhe-πουρομυκίνη) ακολουθούσε ευθεία γραμμή. Αντιπροσωπευτικό χρονοδιάγραμμα για συγκέντρωση πουρομυκίνης ίση με 200 μμ δίνεται στο Σχήμα 8.1Α (επάνω γραμμή). Όταν η αντίδραση έγινε παρουσία βλαστισιδίνης, παρατηρήθηκε

αφενός μείωση της κλίσης του χρονοδιαγράμματος, αφετέρου διφασικότητα της χρονοκαμπύλης (Σχήμα 8.1Α, κάτω καμπύλες). Το γεγονός αυτό υποστηρίζει ότι η αναστολή γίνεται ισχυρότερη μετά από κάποιο χρονικό διάστημα. Α ln[100/(100-x)] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Τεταγμένη επί 0,1 την αρχή 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Χρόνος (min) Β 1 / (k obs ) 0 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1-0,25 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1 / [πουρομυκίνη] x 10-1 (mm -1 ) Γ 12 Κλίση (Slope) 10 8 6 4 2-0,4-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 [Βλαστισιδίνη] (μμ) Σχήμα 8.1: Κινητική ανάλυση της σύνθεσης AcPhe-πουρομυκίνης σε χαμηλές συγκεντρώσεις βλαστισιδίνης ([Ι]<3Κ i ). (A) Χρονοδιάγραμμα της αντίδρασης πουρομυκίνης απουσία ( ) ή παρουσία βλαστισιδίνης σε συγκέντρωση 0.2 μμ ( ), 0.4 μμ ( ) και 0.8 μμ ( ). (Β) Διάγραμμα διπλού-αντιστρόφου (1/(k obs ) 0 έναντι 1/[S]). Οι τιμές της (k obs ) 0 υπολογίστηκαν από τις αρχικές κλίσεις χρονοδιαγραμμάτων, όπως αυτών που δείχνονται στο σχήμα Α. (Γ) Επανα-διάγραμμα κλίσεων. Οι τιμές των κλίσεων υπολογίστηκαν από τις κλίσεις των διαγραμμάτων διπλού αντιστρόφου του σχήματος Β. Ανάλυση της αρχικής κλίσης (k obs ) 0 των χρονοκαμπυλών με διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (1/(k obs ) 0 έναντι 1/[S], Σχήμα 8.1Β) και στη συνέχεια με επανα-διάγραμμα κλίσης (κλίση έναντι του [I], Σχήμα 8.1Γ),

οδήγησε στο συμπέρασμα ότι η βλαστισιδίνη συμπεριφέρεται ως συναγωνιστικός αναστολέας με σταθερά αναστολής K i ίση με 0.38 μμ. Α 1/(k obs ) s (min) 18 16 14 12 10 8 6 4 2-25 0 25 50 75 100 125 10 4 /[Πουρομυκίνη] (μμ -1 ) Β 16 Γ log [Βλαστισιδίνη] -0,8-0,6-0,4-0,2 0,0 Κλίση (slope) 14 12 10 8 6 4 2-0,2-0,4-0,6 log [(k obs ) s / ((k obs ) s -k obs )] 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 [Βλαστισιδίνη] (μμ) Σχήμα 8.2: Κινητική ανάλυση της σύνθεσης AcPhe-πουρομυκίνης σε χαμηλές συγκεντρώσεις βλαστισιδίνης ([Ι]<3Ki). (A) Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου για τις δεύτερες κλίσεις του χρονοδιαγράμματος του σχήματος 8.1Α. (Β) Επανα-διάγραμμα κλίσεων οι τιμές των κλίσεων υπολογίστηκαν από τις κλίσεις διαγραμμάτων διπλού αντιστρόφου του σχήματος Α. (Γ) Διάγραμμα Hill. Σε αντίθεση με την πρώτη κλίση των χρονοκαμπυλών, ανάλυση της δεύτερης αποκάλυψε συμπεριφορά μερικού μη-συναγωνιστικού αναστολέα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.2Α, σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού η τιμή της σταθεράς Κ s παραμένει περίπου σταθερή, ενώ οι κλίσεις στο διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου αυξάνουν «υπερβολικά», τείνοντας σε μια μέγιστη τιμή (Σχήμα 8.2Β). Για να εκτιμήσουμε πόσα μόρια βλαστισιδίνης

συμμετέχουν στη δεύτερη φάση της αντίδρασης πουρομυκίνης, χρησιμοποιήθηκε μια τροποποιημένη μορφή της εξίσωσης Hill (Kalpaxis and Drainas, 1993). Στο Σχήμα 8.2Γ δίνεται διάγραμμα αυτής της εξίσωσης για 200 μμ πουρομυκίνη. H κλίση του διαγράμματος αυτού ισούται με 0.75, έναν παράγοντα που δείχνει ότι ένα μόνο μόριο βλαστισιδίνης εμπλέκεται στο μηχανισμό αναστολής (0.6-1.0 πρόσδεση ενός μορίου). Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα για χαμηλές συγκεντρώσεις βλαστισιδίνης, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η βλαστισιδίνη (Ι) αντιδρά γρήγορα με το σύμπλοκο C για να σχηματίσει το ενδιάμεσο σύμπλοκο CI [πρώτη φάση], το οποίο ισομερειώνεται αργά σε μια πιο σταθερή μορφή, C*I [δεύτερη φάση]. Σε αντίθεση με το σύμπλοκο CI, το C*I παράγει προϊόν [μησυναγωνιστική αναστολή], αλλά σε μικρότερο βαθμό από ότι η αντίδραση πουρομυκίνης απουσία αντιβιοτικού (k 3 *<k 3 ). Το κινητικό μοντέλο το οποίο εξηγεί τα παραπάνω συμπεράσματα δίνεται στο Σχήμα 8.3. K i k 6 C + I CI C*I + k 7 + S S K * s K s CS C*IS * k 3 k 3 C' + P C*I' + P Σχήμα 8.3: Κινητικό μοντέλο αναστολής της αντίδρασης πουρομυκίνης από βλαστισιδίνη για χαμηλές συγκεντρώσεις αντιβιοτικού Οι καταλυτικές σταθερές K s *, k 3 * και ο λόγος k 6 /k 7 υπολογίστηκαν από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου 1/Δ intercept και 1/Δ slope, ακολουθώντας τις οδηγίες που αναφέρονται στη βιβλιογραφία (Segel, 1993) (Σχήμα 8.4). Οι τιμές των κινητικών παραμέτρων δίνονται στον Πίνακα VΙ.

K s * =αk s 0,25 2.5 k * 3 =βk 3 1/Δ slope (mm -1 min -1 ) 0,20 0,15 0,10 0,05 βk 3 /(1-β) 1/Δ intercept βk 3 /K s (α-β) 1/Δ slope 2.0 1.5 1.0 0.5 1/Δ intercept -2 0 2 4 6 1/[Βλαστισιδίνη] (μμ -1 ) Σχήμα 8.4: Διαγράμματα 1/Δ intercept και 1/Δ slope για σύνθεση AcPhe-πουρομυκίνη σε χαμηλές συγκεντρώσεις βλαστισιδίνης ([Ι]<3K i ). Τα δεδομένα πάρθηκαν από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου του σχήματος 8.2Α. Δ intercept και Δ slope δείχνουν τις διαφορές των κλίσεων και των τομών αντίστοιχα, ανάμεσα στα διαγράμματα διπλού αντιστρόφου παρουσία και απουσία βλαστισιδίνης (γραμμής αναφοράς για [Ι]=0). Οι τιμές του k 6 και του k 7 υπολογίστηκαν με ανάλυση μη-γραμμικής συσχέτισης (non-linear regression analysis), χρησιμοποιώντας την εξίσωση (8) (Xaplanteri et al., 2003): k eq k6[ I] = k7 + [ S] Ki (1 + ) + [ I] K s (8) Στην εξίσωση αυτή, k eq (equilibration constant) είναι η φαινομενική σταθερά εξισορρόπησης που επιτυγχάνεται μεταξύ του συμπλόκου C και του αντιβιοτικού. Η k eq υπολογίζεται από την τεταγμένη επί την αρχή (intercept) του σημείου αλλαγής της κλίσης του χρονοδιαγράμματος (Σχήμα 8.1Α). Στο σημεία αυτό, η τεταγμένη επί την αρχή σχετίζεται με την k eq μέσω της εξίσωσης 9: ( k ) 0 ( k ) Τεταγμένη επί την αρχή = k obs obs s eq (9) Η εξίσωση 9 ισχύει, όταν το σύμπλοκο C*I δεν αντιδρά με το υπόστρωμα (Morrison and Walsh, 1988; Xaplanteri et al., 2003). Έτσι, για να εφαρμόσουμε τη θεωρία των αναστολέων βραδείας δέσμευσης στην ανάλυση που έγινε, οι τιμές των (k obs ) s διορθώθηκαν απαλείφοντας την επίδραση του

k 3 * σταδίου και μετά προσαρμόστηκαν στη σχέση 9. Οι τιμές του k 6 και του k 7 που υπολογίστηκαν από τη σχέση 8, δίνονται στον Πίνακα VΙ. Αναστολή του πεπτιδικού δεσμού σε υψηλές συγκεντρώσεις βλαστισιδίνης ([Ι]>10K i ) Αύξηση της συγκέντρωσης της βλαστισιδίνης άλλαξε σταδιακά τον τύπο της αναστολής σε μεικτή μη-συναγωνιστική (Σχήμα 8.5Α). Η εύρεση των καταλυτικών σταθερών αυτού του τύπου της αναστολής έγινε μέσω του επανα-διαγράμματος της τεταγμένης επί την αρχή (1/ k max έναντι του [Ι], Σχήμα 8.5Β) και του επανα-διαγράμματος των κλίσεων (κλίση έναντι του [Ι], Σχήμα 8.5Γ) όπως περιγράφεται λεπτομερώς από το Segel (Segel, 1993). H αλλαγή στον τύπο της αναστολής φαίνεται καθαρά και από το επαναδιάγραμμα της τεταγμένης επί την αρχή, που δεν ακολουθεί μονοφασική ευθεία (Σχήμα 8.5Β). Α Β Γ k max Σχήμα 8.5: Κινητική ανάλυση της σύνθεσης της AcPhe-πουρομυκίνης, παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων βλαστισιδίνης ([Ι]>10Κ i ). (Α) Διάγραμμα διπλού-αντιστρόφου 1/k obs έναντι του 1 [S]). (Β) Επανα-διάγραμμα της τεταγμένης επί την αρχή (1/k max έναντι του [Ι]. Οι τιμές του k max υπολογίστηκαν από το Σχήμα Α. (Γ) Επανα-διάγραμμα κλίσεων. Οι κλίσεις υπολογίστηκαν από το Σχήμα Α. Επειδή η τομή της προέκτασης της τελικής ευθείας του Σχήματος 8.5Β με τον οριζόντιο άξονα δεν ισούται με 1/k 3, αλλά είναι ίση με 1/k 3 *, συμπεραίνεται ότι το σύμπλοκο που αλληλεπιδρά με την πουρομυκίνη (S) και δίνει μεικτή μη-συναγωνιστική κινητική είναι το C*I και όχι το C. Αυτό επιβεβαιώθηκε και από το επανα-διάγραμμα κλίσης (Σχήμα 8.5Γ), όπου η τομή με την τεταγμένη

ισούται με 15 mm min. Αυτή η τιμή είναι παρόμοια με αυτήν που υπολογίστηκε από το λόγο K s */k 3 *. Το σημείο, όπου η προέκταση της ευθείας του Σχήματος 8.5B τέμνει τον οριζόντιο άξονα, δίνει την τιμή της σταθεράς ισορροπίας ak i * που ισούται με 18 μm. Αυτή η τιμή είναι περίπου 2.4 φορές υψηλότερη από την K i * η οποία υπολογίστηκε από την τομή του διαγράμματος κλίσεων με τον οριζόντιο άξονα (Σχήμα 8.5Γ). Έτσι, το μοντέλο που εξηγεί συνολικά την κινητική συμπεριφορά της βλαστισιδίνης, παρουσιάζεται στο Σχήμα 8.6: K i k 6 C + I CI C*I + I C*I 2 + k 7 + + S S S K s K s * CS C*IS + I C*I 2 S k 3 * k 3 C' + P Συναγωνιστική φάση C*I' + P K i * ak i * ak s * Μεικτή μη συναγωνιστική φάση Σχήμα 8.6: Πλήρες κινητικό μοντέλο της αναστολής της αντίδρασης πουρομυκίνης από τη βλαστισιδίνη Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, η βλαστισιδίνη παρουσιάζει μια μεταβατική φάση συναγωνιστικής αναστολής που ακολουθείται από τον αργό ισομερισμό του συμπλόκου CI σε C*I. Το τελικό σύμπλοκο είναι σταθερότερο από το CI και ικανό να προσδένει πουρομυκίνη καθώς και ένα δεύτερο μόριο βλαστισιδίνης. Επειδή η τιμή της K i * είναι περίπου 75 φορές υψηλότερη από την τιμή του K i [k 7 /(k 6 +k 7 )], που εκφράζει τη συνολική σταθερά πρόσδεσης του πρώτου μορίου, συμπεραίνουμε ότι η δεύτερη θέση πρόσδεσης του αντιβιοτικού βλαστισιδίνης είναι πολύ ασθενέστερη από την πρώτη.

8.1.2 Τυλοσίνη Αναστολή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που έχουν γίνει στα 10 mm Mg 2+ (Dinos and Kalpaxis, 2000), η τυλοσίνη επανεξεταζόμενη σε διάλυμα χαμηλότερης συγκέντρωσης ιόντων Mg 2+ (T 100 N 150 M 4.5 SH 6 ), βρέθηκε ότι απενεργοποιεί το σύμπλοκο C σχεδόν μη-αντιστρεπτά. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.7A, η παραγωγή προϊόντος σταματάει τελείως μετά από μερικά λεπτά, καταλήγοντας σ ένα πλατώ. Αυτός ο τύπος αναστολής υποδηλώνει ότι η τυλοσίνη είναι ένας αναστολέας που προσδένεται βραδέως στο ριβόσωμα (σε διάστημα της τάξεως των min), αντί σε msec όπως οι κλασικοί αναστολείς. Παρατηρώντας το σχήμα 8.7A, διαπιστώνουμε ότι η αρχική κλίση των αναπτυσσόμενων καμπυλών ποικίλλει ανάλογα με τη συγκέντρωση του αναστολέα, υποστηρίζοντας ότι η πρόσδεση της τυλοσίνης στο ριβόσωμα γίνεται σε τουλάχιστον δύο στάδια. Εύρεση κινητικών παραμέτρων Η μελέτη της αναστολής της PTάσης από τυλοσίνη έγινε εκθέτοντας το σύμπλοκο C σε διάφορες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού (0.1 μμ, 0.2 μμ, 0.5 μμ, 1.0 μμ, 2.0 μμ και 10 μμ), για συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα (0, 30 sec, 1 min, 2 min). Το σύμπλοκο C που παρέμεινε ενεργό ανιχνεύτηκε μέσω τιτλοδότησης με πουρομυκίνη (2 mm, 2 min, 25 0 C). Τέτοια διαγράμματα απενεργοποίησης του συμπλόκου σε διάφορες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού φαίνονται στο Σχήμα 8.7Β. Σε κάθε συγκέντρωση τυλοσίνης, το διάγραμμα παριστάται από μια ευθεία γραμμή που τέμνει τον κάθετο άξονα σε ένα κοινό σημείο. Αυτός ο τύπος αναστολής υποδηλώνει ότι η απενεργοποίηση του συμπλόκου C από την τυλοσίνη ακολουθεί κινητική ψευδο-πρώτης τάξης. Από την κλίση κάθε ευθείας υπολογίστηκε η αντίστοιχη σταθερά απενεργοποίησης (k in ) για κάθε συγκέντρωση τυλοσίνης. Το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (1/k in έναντι 1/[τυλοσίνης]) δίνει ευθεία γραμμή που τέμνει την τεταγμένη σε ένα σημείο άνω του μηδενός (Σχήμα 8.7Γ),

επιβεβαιώνοντας ότι η απενεργοποίηση του συμπλόκου C από την τυλοσίνη ακολουθεί μηχανισμό δυο σταδίων. A ln [100/(100-x)] 2,4 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 0 1 2 3 4 5 6 Γ 1/ K i n 1/k4 10 8 6 4 2 0-1 0 1 2 3 4 5-1/Ki 0μΜ Time (min) 0,6μΜ 2μΜ 6μΜ 1/ [Τυλοσίνη] (μμ -1 ) B ln x Δ ln 100/(100-x) 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 kin 0.0 μμ 1.0 μμ 2.0 μμ 10.0 μμ 2,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,24 0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 Time (min) k5 0,00 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) Σχήμα 8.7: (A) Σύνθεση AcPhe-πουρομυκίνης απουσία και παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων τυλοσίνη, (Β) Απενεργοποίηση του συμπλόκου C σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις αντιβιοτικού. (Γ) διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (1/k in έναντι της 1/[Ι]. (Δ) Διάγραμμα αναγέννησης του συμπλόκου C από την C*I μορφή. Το κινητικό μοντέλο που περιγράφει το μηχανισμό πρόσδεσης της τυλοσίνης (CI) στο σύμπλοκο C (C), δίνεται από το ακόλουθο σχήμα: K i k 4 C + I CI C*I k 5 Με την προϋπόθεση ότι η τιμή της σταθεράς k 5 είναι πολύ μικρή (μηαντιστρεπτός αναστολέας), ισχύει η εξίσωση 10 (Dinos and Kalpaxis, 2000; Kitz and Wilson, 1962):

k in = k [ ] 4 I K + [ I] i (10) Οι τιμές των K i και k 4 υπολογίστηκαν από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου της εξίσωσης 10 (Σχήμα 8.7Γ) και δίνονται στο συγκεντρωτικό Πίνακα VΙ. Αποδέσμευση του αντιβιοτικού από το ριβόσωμα Για τον υπολογισμό των σταθερών πρόσδεσης του αντιβιοτικού στο εναρκτήριο ριβοσωματικό σύμπλοκο, υποθέσαμε ότι η αναστολή της αντίδρασης πουρομυκίνης είναι μη αντιστρεπτή. Στην πραγματικότητα όμως, αν η τιμή της k 5 είναι πάρα πολύ μικρή, είναι δύσκολο να διακρίνουμε βάσει των παραπάνω πειραμάτων τη μη αντιστρεπτή από τη αργή αντιστρεπτή αναστολή. Η αναγέννηση του συμπλόκου C από τον ισχυρά-προσδεδεμένο αναστολέα, τυλοσίνη, διαπιστώθηκε εκθέτοντας σύμπλοκο C*I σε μεγάλο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος. Η ποσότητα του αναγεννημένου συμπλόκου C που προέκυψε, υπολογίστηκε τιτλοδοτώντας την με πουρομυκίνη (Erion and Walsh, 1987). Η τιμή της σταθεράς αναγέννησης ισούται με την k 5, εφόσον αντιπροσωπεύει το αργό στάδιο αναγέννησης. Όπως υπολογίστηκε από το διάγραμμα αναγέννησης (Σχήμα 8.7Δ) η τιμή της k 5 είναι πράγματι πολύ μικρή, της τάξης των 10-3 min (Πίνακα VΙ). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η αρχική εκτίναξη των τιμών στο διάγραμμα αναγέννησης οφείλεται στην παρουσία μικρής ποσότητας συμπλόκου C που δεν είχε προσδέσει αντιβιοτικό κατά την εξισορρόπηση. Η σταθερά k 5 υπολογίστηκε από την κλίση της ευθείας που προκύπτει, όταν το συνυπάρχον σύμπλοκο C έχει πλήρως αντιδράσει με την πουρομυκίνη. 8.1.3 Ερυθρομυκίνη Πειράματα αναστολής της PTάσης από την ερυθρομυκίνη (Σχήμα 8.8Α) έδειξαν ότι το αντιβιοτικό δεν αναστέλλει άμεσα τη δημιουργία πεπτιδικού δεσμού, γεγονός που βρίσκεται σε συμφωνία με παλαιότερες κινητικές μελέτες (Dinos and Kalpaxis, 2000; Vazquez, 1979) και

κρυσταλλογραφικά δεδομένα (Schlunzen et al., 2001; Tu et al., 2005). Έτσι, για την εύρεση των κινητικών σταθερών πρόσδεσης της ερυθρομυκίνης σε ενεργό ριβοσωματικό σύμπλοκο έγιναν με πειράματα συναγωνισμού, όπου η ερυθρομυκίνη συναγωνίστηκε την τυλοσίνη για κοινές θέσεις πρόσδεσης στο ριβόσωμα. Πειράματα συναγωνισμού (χωρίς προεπώαση με αντιβιοτικό) Τα πειράματα απενεργοποίησης του συμπλόκου C από τη τυλοσίνη επαναλήφθηκαν παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων ερυθρομυκίνης. Λόγω συναγωνισμού της τυλοσίνης από την ερυθρομυκίνη, η ανασταλτική δράση της πρώτης στην ΡΤάση μειώθηκε, όπως φαίνεται στο διάγραμμα απενεργοποίησης (Σχήμα 8.8Β). Σε υψηλές συγκεντρώσεις ερυθρομυκίνης, η προστασία του συμπλόκου C έναντι της τυλοσίνης ήταν πλήρης (Σχήμα 8.8Β, πάνω γραμμή). Η κλίση των ευθειών στο σχήμα 8.8Β παρέχει τη φαινομενική σταθερά απενεργοποίησης (k in ), η οποία εξαρτάται από τη συγκέντρωση της ερυθρομυκίνης (Er) και της τυλοσίνης (Ι) μέσω της εξίσωσης 11(Dinos and Kalpaxis, 2000). k in = kk 4 er[ I] KK + K [ I] + K[ Er] i er er i (11) Από την εξίσωση 11 προκύπτει ότι: 1 Ki + [ I] Ki = + [ Er] (12) ή k k [ I] k K [ I] in 4 4 er και εναλλακτικά [ Er] Ki (1 + ) 1 1 Ker 1 = + (13) k k k [ I] in 4 4 Σχεδιάζοντας το διάγραμμα 1/k in έναντι της συγκέντρωσης της ερυθρομυκίνης για μικρούς χρόνου (t<1min) πήραμε ευθεία γραμμή (Σχήμα 8.8Δ, -προεπώαση) όπως προβλέπεται από τη σχέση (12). Τo σημείο τομής της ευθείας αυτής με τον οριζόντιο άξονα ισούται με -K er (1+ [ I ] K i ). Η τιμή αυτή δίνεται στον Πίνακας VΙΙ. Οι τιμές της K er μετρούμενες για διάφορες συγκεντρώσεις τυλοσίνης (Ι), δεν διέφεραν μεταξύ τους περισσότερο από 10%.

Α ln (100/100-x) Γ ln x 2,0 1,5 1,0 0,5 4,30 4,25 4,20 4,15 4,10 4,05 - Ερυθρομυκίνη + Ερυθρομυκίνη 0,0 0 2 4 6 8 Time (min) 0μΜ 4,00 0 10 20 30 40 50 60 Time (sec) + Τυλοσίνη Β ln x 2.0μΜ 1.0μΜ 0.5μΜ 0.25μΜ 0.1μΜ 4,30 4,25 4,20 4,15 4,10 4,05 10μΜ 5.0μΜ 2.0μΜ 1.0μΜ 0.5μΜ 0μΜ 4,00 0 15 30 45 60 Δ 1 / K in ( min ) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 Time ( sec ) + ΠΡΟΕΠΩΑΣΗ - ΠΡΟΕΠΩΑΣΗ -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 [Ερυθρομυκίνη] (μμ) Σχήμα 8.8: (Α) Επίδραση της ερυθρομυκίνης και τυλοσίνης στην ενεργότητα της ΡΤάσης. (Β) Απενεργοποίηση του συμπλόκου από σταθερή συγκέντρωση τυλοσίνης (4 μμ) παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων ερυθρομυκίνης. (Γ) Απενεργοποίηση του συμπλόκου C από τυλοσίνη μετά από προεπώαση αυτού σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις ερυθρομυκίνης. (Δ) Διαγράμματα 1/k in έναντι της συγκέντρωσης της ερυθρομυκίνης. Οι τιμές των kin υπολογίστηκαν από τις κλίσης ων διαγραμμάτων Β και Γ. Πειράματα προεπώασης με ερυθρομυκίνη Στην περίπτωση προεπώασης του συμπλόκου C με ερυθρομυκίνη πριν την προσθήκη τυλοσίνης, παρατηρήθηκε ισχυρότερη μείωση στη φαινομενική σταθερά απενεργοποίησης (Σχήμα 8.8Γ). Αυτή η συμπεριφορά μας αποκάλυψε ότι τουλάχιστον ένα από τα βήματα πρόσδεσης της ερυθρομυκίνης με το σύμπλοκο C δεν εξισορροπείται ταχέως. Η τιμή της σταθεράς K d που υπολογίστηκε κάτω από αυτές τις συνθήκες (Σχήμα 8.8Δ, +πρωεπώαση) έδωσε την ολική σταθερά K dissociation (K er *), που παρατηρείται

μετά την εξισορρόπηση της πρόσδεσης του αντιβιοτικού με το σύμπλοκο C και δίνεται από τη σχέση: K er [ C][ Er] * = ([ CEr] + [ C * Er]) (14) Γνωρίζοντας την τιμή των σταθερών K er και K er *, η σταθερά ισομερισμού k 6 /k 7 υπολογίστηκε από τη σχέση 15, η οποία ισχύει για βραδέως προσδενόμενους αναστολείς, όπως έχει διευκρινιστεί σε προηγούμενες μελέτες (Dinos and Kalpaxis, 2000; Morrison and Walsh, 1988). * k K 7 er = K er k k 7 + 6 (15) Αποδέσμευση ερυθρομυκίνης από το σύμπλοκο C*I Για να προσδιορίσουμε τις τιμές για την k 6 και k 7, σύμπλοκο C προεπωάστηκε με ερυθρομυκίνη και προσδέθηκε σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης. Η σταθερά αποδέσμευσης του αντιβιοτικού (k 7 ) υπολογίστηκε επωάζοντας το φίλτρο σε ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (T 100 N 150 M 4.5 SH 6 ) για μεγάλους χρόνους. Για να προσδιοριστεί το σύμπλοκο C που αναγεννάται, το φίλτρο εκτέθηκε σε περίσσεια τυλοσίνης (30 μμ) και τιτλοδοτήθηκε με πουρομυκίνη (2 mm, 2 min, 25 0 C). Η καμπύλη που λήφθηκε είχε δυο φάσεις (Σχήμα 8.9). Η πρώτη κλίση αντιπροσωπεύει την αντίδραση της τυλοσίνης με το προϋπάρχον σύμπλοκο C, ενώ η δεύτερη αντιστοιχεί στην αντίδραση τυλοσίνης με το σύμπλοκο C που αναγεννήθηκε από το σύμπλοκο C*Er μέσω του k 7 βήματος (αργό στάδιο) και ήταν ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση της τυλοσίνης. Γνωρίζοντας την τιμή k 7, εύκολα υπολογίστηκε η τιμή του k 6 από το λόγο k 6 /k 7 (Πίνακα VΙΙ).

ln x 0,32 0,28 0,24 0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 k 7 0,00 0 5 10 15 20 25 Time ( min ) η σταθερά k 7. Σχήμα 8.9: Αναγέννηση του συμπλόκου C από τη μορφή C*I, από όπου υπολογίζεται Βάσει των στοιχείων της κινητικής μας ανάλυσης και λαμβάνοντας υπόψιν μελέτες TRNOE (Transfer Nuclear Overhauser Effect) που διέκριναν δυο είδη αλληλεπιδράσεων μια ισχυρή (K d =10-7 -10-9 ) και μια ασθενή (K d =10-3 - 10-5 M) μεταξύ μακρολιδίων και ριβοσώματος (Bertho et al. 1998), προτείνεται το ακόλουθο κινητικό μοντέλο συναγωνισμού τυλοσίνης (I) και ερυθρομυκίνης (Ery) για πρόσδεση στο σύμπλοκο C : K i k 4 C + I CI C*I + k 5 Ery K er CEry k 7 k 6 C*Ery Σχήμα 8.10: Κινητικό μοντέλο συναγωνισμού ερυθρομυκίνης-τυλοσίνης για πρόσδεση στο σύμπλοκο C. 8.1.4 Αζιθρομυκίνη και Τελιθρομυκίνη Η αζιθρομυκίνη είναι ένα μακρολίδιο το οποίο αποτελείται από έναν 15μελή λακτονικό δακτύλιο. Παρουσία 10 mm Mg 2+ και 100 mm NH 4+, η αζιθρομυκίνη δεν αναστέλλει την αντίδραση πουρομυκίνης (Dinos et al., 2001). Όμως, δεσμεύεται στο σύμπλοκο C και φράζει την είσοδο του τούνελ

εξόδου, ακολουθώντας μηχανισμό πρόσδεσης παρόμοιο με εκείνο της ερυθρομυκίνης. Λαμβάνοντας υπόψιν αυτές τις παρατηρήσεις, επαναλάβαμε τη μελέτη σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε χαμηλή συγκέντρωση ιόντων Mg 2+ (4.5 mm Mg 2+, 150 mm NH 4+ ), ακολουθώντας το ίδιο πρωτόκολλο κινητικής ανάλυσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι η μείωση της συγκέντρωσης των ιόντων Mg 2+ δε μεταβάλλει τη συμπεριφορά της αζιθρομυκίνης στην αντίδραση πουρομυκίνης. Επίσης, ο μηχανισμός πρόσδεσης διατηρείται ο ίδιος, αλλά επηρεάζονται οι τιμές των κινητικών σταθερών. Το διάγραμμα 1/k in έναντι της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού (χωρίς και με προεπώαση), από όπου υπολογίστηκαν οι κινητικές παράμετροι Κ az και K az * δίνεται στο Σχήμα 8.11Α. H τιμή της k 7 υπολογίστηκε ύστερα από παρατεταμένη έκθεση του συμπλόκου C*I σε ρυθμιστικό διάλυμα T 100 N 150 M 4.5 SH 6 (μέχρι 8 ώρες). To διάγραμμα παρέμεινε ευθύγραμμο και μονοφασικό καθ όλη τη διάρκεια της έκθεσης (Σχήμα 8.11Β). Οι τιμές των κινητικών παραμέτρων δίνονται στον Πίνακα VΙΙ. 1/ k in 16 14 + Προεπώαση 12 10 8 6 - Προεπώαση 4 2-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 [Azithromycin] (μμ) lnx 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 2 4 6 8 Time (hours) Σχήμα 8.11: (Α) Διάγραμμα 1/k in έναντι της συγκέντρωσης της αζιθρομυκίνης, όπως προέκυψε χωρίς και με προεπώαση της αζιθρομυκίνης με το σύμπλοκο C. Άπό τα διαγράμματα αυτά υπολογίστηκαν οι σταθερές Κ az και K az *, αντίστοιχα. (Β) Διάγραμμα αναγέννησης του συμπλόκου C από την C*I μορφή, από όπου υπολογίστηκε η τιμή της k 7. Η τελιθρομυκίνη είναι ένα παράγωγο της ερυθρομυκίνης η οποία προσδένεται στην αρχή του τούνελ εξόδου. Όπως υποστηρίζουν κρυσταλλογραφικά δεδομένα, το προσδεδεμένο μόριο της τελιθρομυκίνης στο

ριβόσωμα δεν πλησιάζει στη θέση Α2451 (κέντρο PTάσης). Κινητικές μελέτες για το αντιβιοτικό αυτό δεν έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα. Για την εύρεση του μηχανισμού δράσης της και των κινητικών σταθερών που χαρακτηρίζουν την ισχύ της πρόσδεσης της, ακολουθήθηκε η κινητική ανάλυση που εφαρμόστηκε για τη μητρική της ένωση. Όπως αναμενόταν, η τελιθρομυκίνη δεν ανέστειλε την αντίδραση πουρομυκίνης. Κινητική ανάλυση του μηχανισμού πρόσδεσης έδειξε ότι η τελιθρομυκίνη ακολουθεί το ίδιο κινητικό μοντέλο πρόσδεσης, συγκρινόμενη με την ερυθρομυκίνη. Όμως, η πρόσδεσή της στη θέση-στόχο ήταν ασθενέστερη (K er *<Κ tel *). Οι τιμές των κινητικών σταθερών που προέκυψαν δίνονται στον Πίνακα VΙΙ. 8.2 Επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος στη δράση των αντιβιοτικών 8.2.1 Οι πολυαμίνες αυξάνουν την ανασταλτική δράση της βλαστισιδίνης Για να εκτιμήσουμε τη δράση των πολυαμινών στην ικανότητα πρόσδεσης της βλαστισιδίνης στο ριβόσωμα, εξετάστηκε ο μηχανισμός αναστολής της ΡΤάσης χρησιμοποιώντας σύμπλοκο C που παρασκευάστηκε και αντέδρασε με πουρομυκίνη σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε πολυαμίνες. Η προσθήκη των πολυαμινών βελτίωσε τη δραστικότητα της PTάσης, Συγκεκριμένα, η παρουσία 100 μμ σπερμίνης προκάλεσε αύξηση στην τιμή της k 3, χωρίς να μεταβάλλει ουσιαστικά την τιμή της K s (Πίνακας VΙ). Επίσης, η παρουσία σπερμίνης δεν άλλαξε τον τύπο της αναστολής που προκάλεσε η βλαστισιδίνη. Παρόλα αυτά, οι τιμές των κινητικών παραμέτρων διέφεραν από αυτές που υπολογίστηκαν απουσία πολυαμινών (Πίνακας VΙ). Συγκεκριμένα, η τιμή της σταθεράς διάστασης, K i, μειώθηκε τρεις φορές παρουσία 100 μμ σπερμίνης, η τιμή της k 6 αυξήθηκε κατά 50%, ενώ η τιμή της k 7 παρέμεινε περίπου η ίδια. Ως συνέπεια, η ολική σταθερά διάστασης του πρώτου μορίου, K i [k 7 /(k 6 +k 7 )], έγινε τέσσερις φορές μικρότερη (αύξηση πρόσδεσης βλαστισιδίνης). Ακόμα, η τιμή της k 3 * και οι τιμές K i * και ak i * μειώθηκαν, ενώ η τιμή της K s * αυξήθηκε σε μικρό βαθμό. Από τις μεταβολές στις κινητικές παραμέτρους συμπεραίνουμε ότι οι πολυαμίνες

ωθούν την ισορροπία προς την C*I 2 μορφή και μειώνουν την παραγωγή προϊόντος, γεγονός που συνεπάγεται αύξηση της αναστολής που προκαλείται. Παρόμοιες αλλαγές στις τιμές των κινητικών σταθερών παρουσιάστηκαν, όταν η σπερμίνη προσδέθηκε ομοιοπολικά με φωτοσήμανση στο σύμπλοκο C ή όταν χρησιμοποιήθηκε κοκτέιλ πολυαμινών (50 μμ σπερμίνη και 2 mm σπερμιδίνη). Στην τελευταία περίπτωση, οι αλλαγές που παρατηρήθηκαν ήταν πιο έντονες, ιδίως για τις τιμές K i και ak i *. Όμως, πάλι ο τύπος της αναστολής δεν επηρεάστηκε. ΠΙΝΑΚΑΣ VΙ: Κινητικές παράμετροι που εμπλέκονται στο μηχανισμό αναστολής της αντίδρασης πουρομυκίνης από βλαστισιδίνη, σε διάφορες ιοντικές συνθήκες. Ιοντικές Συνθήκες Κινητικοί Παράμετροι Βλαστισιδίνη 6mM Mg 2+ 100mM NH 4 + 6mM Mg 2+ 100mM NH 4 + 100μΜ SPM 6mM Mg 2+ 100mM NH 4 + Σύμπλοκο C φωτοσημασμένο με 100μΜ ABA-SPM 6mM Mg 2+ 100mM NH 4 + 50μΜ SPM 2mM SPD 10mM Mg 2+ 100mM NH 4 + k 3 (min -1 ) 2.00 2.86 2.65 2.78 2.0 K s (μμ) 625 625 620 625 300 K i (μμ) 0.38 0.14 0.16 0.08 0.20 k 6 (min -1 ) 2.29 3.75 3.60 2.27 - k 7 (min -1 ) 0.82 0.90 0.88 0.88 - K s * (μμ) 419 478 465 470 - k 3 * (min -1 ) 0.27 0.19 0.21 0.19 0.32 K i * (μμ) 7.40 3.90 4.01 4.00 - ak i * (μμ) 18.0 10.0 10.4 7.0 - α α Οι τιμές έχουν ληφθεί από δημοσιευμένη εργασία των Kalpaxis et al. (1986)

8.2.2 Οι πολυαμίνες μειώνουν την πρόσδεση των μακρολιδίων στο ριβόσωμα Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η αλληλεπίδραση των μακρολιδίων με το ριβόσωμα επηρεάζεται από το ιοντικό περιβάλλον (Teraoka and Tanaka, 1973b; Vogel et al., 1971). Συγκεκριμένα, οι Teraoka και Tanaka βρήκαν, ότι η σπερμίνη, καθώς και υψηλές συγκεντρώσεις ιόντων Mg 2+ και μονοσθενών κατιόντων, μειώνουν την πρόσδεση της ερυθρομυκίνης σε E. coli ριβοσώματα. Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν στην παρούσα μελέτη με ενδελεχή κινητική ανάλυση και επεκτάθηκαν σε ένα μεγαλύτερο εύρος αντιβιοτικών αυτής της κατηγορίας. Επαναλαμβάνοντας τα πειράματα κινητικής των μακρολιδίων παρουσία πολυαμινών, παρατηρήθηκε ότι σε όλες τις περιπτώσεις η σταθερά πρόσδεσης (k assoc ), καθώς και η ολική σταθερά σχηματισμού του C*I συμπλόκου (k assoc /k off ) μειώθηκε (Πίνακας VII). Συγκεκριμένα, η αρχική πρόσδεση της τυλοσίνης στο ριβόσωμα αυξήθηκε κατά 50% (μείωση της Κ i ) παρουσία πολυαμινών, σε αντίθεση με όλα τα άλλα μακρολίδια όπου η αρχική πρόσδεση μειώθηκε. Επίσης, η σταθερά ισομερισμού (k 6 /k 7 ) ελαττώθηκε αισθητά, γεγονός που δυσκόλεψε θερμοδυναμικά το σχηματισμό του C*I. Οι αλλαγές αυτές θυμίζουν τις αντίστοιχες αλλαγές που παρατηρήθηκαν στην κινητική συμπεριφορά της σπιραμυκίνης κάτω από την επίδραση πολυαμινών (Petropoulos et al., 2003). H ερυθρομυκίνη παρουσία πολυαμινών παρουσίασε αισθητή μείωση της αρχικής της πρόσδεσης (6 φορές αύξηση της K er ) στο ριβόσωμα. Παράλληλα, η σταθερά ισομερισμού k 6 /k 7 μειώθηκε κατά 50%. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της τιμής της ολικής σταθεράς διάστασης (K er *) κατά ~10 φορές, δείχνοντας τη μεγάλη σημασία του ιοντικού περιβάλλοντος στην πρόσδεση του αντιβιοτικού. Επίσης, η τελιθρομυκίνη, παράγωγο της ερυθρομυκίνης, έδειξε μειωμένη ικανότητα πρόσδεσης στο ριβόσωμα υπό την επίδραση της σπερμίνης. Παρουσίασε όμως, μια διαφοροποίηση ως προς τη μητρική της ένωση: η αρχική της πρόσδεση φάνηκε να επηρεάζεται λιγότερο, ενώ το στάδιο ισομερισμού περισσότερο. Να σημειωθεί, ότι η σταθερά k 7 για την τελιθρομυκίνη είναι η μόνη σε σχέση με τα άλλα μακρολίδια που

μειώνεται παρουσία πολυαμινών, δείχνοντας ότι οι πολυαμίνες σταθεροποιούν σχετικά την τελιθρομυκίνη στην τελική θέση πρόσδεσής της. Πίνακας VII: Κινητικές παράμετροι που εμπλέκονται στο μηχανισμό πρόσδεσης των μακρολιδίων στο σύμπλοκο C, σε διάφορες ιοντικές συνθήκες Ιοντικές Συνθήκες Κινητικοί Παράμετροι Τυλοσίνη 4.5mM Mg 2+ 150mM NH 4 + 4.5mM Mg 2+ 150mM NH 4 + 100μΜ SPM 4.5mM Mg 2+ 150mM NH 4 + Σύμπλοκο C φωτοσημασμένο με 100μΜ ABA-SPM 4.5mM Mg 2+ 150mM NH 4 + 50μΜ SPM 2mM SPD 10mM Mg 2+ 100mM NH 4 + K i (nμ) 2350 1180 1370 1080 2950 k 4 (min -1 ) 1.25 0.53 0.625 0.40 1.36 k 5 (min -1 ) 0.0015 0.00225 0.0023 0.0033 0.0023 Ki*(nΜ) 2.81 4.99 5.02 8.84 4.98 k assoc (μμ -1 min -1 ) 0.5326 0.4511 0.4579 0.3734 0.4618 k assoc /k 7 (μμ -1 ) 355.0 200.5 199.1 113.2 200.8 Ερυθρομυκίνη K er (nμ) 83 512 502 425 393 k 6 (min -1 ) 0.0392 0.0349 0.0277 0.0294 0.59 k 7 (min -1 ) 0.0054 0.010 0.0087 0.0098 0.060 K er * (nm) 10.1 114 120 106 36 k assoc (μm -1 min -1 ) 0.537 0.088 0.0725 0.0922 1.6539 k assoc /k 7 (μμ -1 ) 99.4 8.8 8.3 9.4 27.6 Αζιθρομυκίνη K az (nμ) 29.6 25 21.4 23.4 48 k 6 (min -1 ) 0.0493 0.0182 0.0162 0.0224 0.086 k 7 (min -1 ) 0.0051 0.00535 0.0069 0.0066 0.0150 K az * (nμ) 2.77 5.69 6.38 5.32 7.1 k assoc (μm -1 min -1 ) 1.838 0.942 1.0794 1.2393 2.1042 k assoc /k 7 (μμ -1 ) 360.4 176.1 156.4 187.8 140.3 Τελιθρομυκίνη K tel (nμ) 458 2500 2714 1714 -- k 6 (min -1 ) 0.3170 0.0780 0.1170 0.0820 -- k 7 (min -1 ) 0.00823 0.00295 0.00316 0.00379 -- K tel * (nμ) 11.6 91.4 71.4 75.7 -- k assoc (μm -1 min -1 ) 0.7101 0.0324 0.0443 0.0500 -- k assoc /k 7 (μμ -1 ) 86.3 11.0 14.0 13.2 -- α Οι τιμές έχουν ληφθεί από δημοσιευμένη εργασία των Dinos et al. (2001) α

Η αρχική πρόσδεση της αζιθρομυκίνης δεν έδειξε να επηρεάζεται από τις πολυαμίνες, πιθανότητα λόγω του πολικού ατόμου (Ν) που περιέχει στο δακτύλιό της. Όμως, η σταθερά ισομερισμού (k 6 /k 7 ) μειώθηκε, με αποτέλεσμα η ολική σταθερά διάστασης K i * να αυξηθεί 2.5 φορές. Πρέπει να σημειωθεί, ότι οι αλλαγές στις κινητικές παραμέτρους ήταν πιο έντονες παρουσία μείγματος σπερμίνης και σπερμιδίνης, αντί σπερμίνης. Επίσης, η επίδραση της σπερμίνης ήταν παρόμοια, είτε αυτή αλληλεπιδρούσε αντιστρεπτά με το ριβόσωμα (ελεύθερη σπερμίνη), είτε ήταν ομοιοπολικά προσδεδεμένη σε αυτό (ΑΒΑ-σπερμίνη). 8.2.3 Χαμηλή συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+ μειώνει τη δράση της βλαστισιδίνης και αυξάνει τη δράση των μακρολιδίων Συγκρίνοντας τα αποτελέσματά μας με προηγούμενες παρατηρήσεις που έχουν γινεί στο ίδιο in vitro πειραματικό σύστημα, αλλά σε υψηλότερη συγκέντρωση Mg 2+, βρήκαμε ότι τα ιόντα Mg 2+ επηρεάζουν γενικά κατά παρόμοιο τρόπο την πρόσδεση των αντιβιοτικών στο ριβόσωμα, όχι όμως ακριβώς τον ίδιο. Στην περίπτωση της βλαστισιδίνης, η σύγκριση των κινητικών παραμέτρων δεν είναι πλήρως εφικτή, λόγω διαφορετικής κινητικής προσέγγισης που υιοθετήθηκε σε προηγούμενες κινητικές μελέτες (Kalpaxis et al., 1986). Είναι φανερό, όμως, ότι η παρουσία πολυαμινών ή αύξηση των ιόντων Mg 2+ συνοδεύεται με αυξημένη δράση του αντιβιοτικού (Πίνακας VI). Όσον αναφορά τα μακρολίδια, αξίζει να σημειωθεί ότι αύξηση των ιόντων Mg 2+ προκαλεί αύξηση της σταθεράς πρόσδεσης k 6, ενώ οι πολυαμίνες προκαλούν μείωση της σταθεράς αυτής. Επιπρόσθετα, τα ιόντα Mg 2+ προκαλούν αύξηση της K i, σε αντίθεση με την σπερμίνη, της οποίας η επίδραση διαφοροποιείται αναλόγως του αντιβιοτικού. Κινητικές μελέτες για την τελιθρομυκίνη στα 10 mm Mg 2+ δεν έχουν αναφερθεί.

Κατάταξη μακρολιδίων κατά σειρά ισχύος για πρόσδεση στο ριβόσωμα. Ως μέτρο σύγκρισης των αντιβιοτικών, ως προς την ευκολία σχηματισμού του συμπλόκου C*I, χρησιμοποιήθηκε η σταθερά σχηματισμού (k association ) του συμπλόκου C*I. Όμως, για την εκτίμηση της συνολικής ικανότητας των μακρολιδίων να προσδένονται στο ριβόσωμα πρέπει να ληφθεί υπ όψιν και η σταθερά αποδέσμευσης k 7. Για το λόγο αυτό, η κατάταξη των μακρολιδίων κατά σειρά ισχύος βασίσθηκε στην τιμή της K i *, η οποία k7 εμπεριέχει τη σταθερά k 7 (K i *= Ki ). H τιμή της k association υπολογίστηκε k + k 6 7 μέσω της εξίσωσης 16: k association = ( k 6 +k 7 ) / K i ( 16 ) Έτσι, απουσία πολυαμινών τα μακρολίδια κατά σειρά ευκολίας πρόσδεσης στο ριβόσωμα κατατάσσονται ως εξής: αζιθρομυκίνη > τελιθρομυκίνη > ερυθρομυκίνη τυλοσίνη. Όμως, κατά σειρά ισχύος πρόσδεσης κατατάσσονται ως αζιθρομυκίνη τυλοσίνη > ερυθρομυκίνη τελιθρομυκίνη. Η παρουσία πολυαμινών αλλάζει τη σειρά κατάταξης ως εξής: αζιθρομυκίνη > τυλοσίνη > ερυθρομυκίνη > τελιθρομυκίνη για την πρώτη περίπτωση και τυλοσίνη αζιθρομυκίνη > τελιθρομυκίνη ερυθρομυκίνη για την δεύτερη περίπτωση. 8.3 Ταυτοποίηση θέσεων σταυροσύνδεσης της ABA-σπερμίνης στην περιοχή πρόσδεσης των αντιβιοτικών Για τη μοριακή ερμηνεία του φαινομένου της επίδρασης των πολυαμινών στη δράση των αντιβιοτικών, προϋπόθεση αποτελεί η ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσης της σπερμίνης στο ριβόσωμα. Μια πειραματική προσέγγιση για την ικανοποίηση αυτής της προϋπόθεσης είναι η φωτοσήμανση συγγενείας. Η φωτοδραστική πολυαμίνη, ΑΒΑ-σπερμίνη, περιέχει μια αζιδοβενζαμίδινο (ΑΒΑ-) ομάδα που συνδέεται στην Ν 1 θέση της

σπερμίνης. Η (ΑΒΑ-) προέκταση έχει μήκος ~9Ǻ και συνεπώς, τα άτομα του 23S rrna στα οποία προσδένεται ομοιοπολικά, δεν απέχουν περισσότερο του ενός νουκλεοτιδίου από την Ν 1 ομάδα της σπερμίνης. Επίσης, σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες (Amarantos and Kalpaxis, 2000; Amarantos et al., 2001; Watson, 1963), αλλά και όπως επιβεβαιώθηκε και στην παρούσα μελέτη (Πίνακας VΙ και VII), το φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, ΑΒΑσπερμίνη, συμπεριφέρεται όμοια με την ελεύθερη σπερμίνη και διατηρεί όλες τις βιοχημικές ιδιότητες της μητρικής της ένωσης. Συνεπώς, είναι λογικό να θεωρήσουμε ότι η ΑΒΑ-σπερμίνη προσδένεται σε εξειδικευμένες θέσεις του ριβοσώματος, που ταυτίζονται με εκείνες, όπου φυσιολογικά αλληλεπιδρά η ελεύθερη σπερμίνη. Ακολουθώντας την πειραματική προσέγγιση προηγουμένων μελετών (Amarantos and Kalpaxis, 2000; Amarantos et al., 2001; Amarantos et al., 2002; Xaplanteri et al., 2005), ταυτοποιήσαμε τις θέσεις πρόσδεσης της ΑΒΑσπερμίνης με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή. Η ομοιοπολική δέσμευση της ΑΒΑ-σπερμίνης στο rrna, λειτούργησε ως φράγμα κατά τη δράση της αντίστροφης μεταγραφάσης και ανιχνεύτηκε ως παύση στα αυτοραδιογραφήματα. Στην προκείμενη μελέτη τα πειράματα έγιναν σε ιοντικές συνθήκες 4.5 mm Mg 2+ και 150 mm NH + 4 και εστιάστηκαν στην περιοχή του 23S rrna γύρω από το καταλυτικό κέντρο, όπου προσδένονται τα αντιβιοτικά που μελετήθηκαν (Σχήμα 7.11). Αντιπροσωπευτικά αυτοραδιογραφήματα φαίνονται στο Σχήμα 8.13. Oι θέσεις σταυροσύνδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης συνοψίζονται σε ένα μοντέλο της δευτεροταγούς δομής του 23S rrna (Σχήμα 8.14).

A2450 U2460 G2470 C2480 U2493 U2500 C2510 + + + + + + + + + + - + + - + - + + - + - - - + + - - - + + - - + - - - - + - - U A G C 1 2 3 4 5 U A G C 1 2 3 4 5 A2560 G2570 U2580 A2590 A2600 C2610 C2440 C2250 Complex C 100 μμ ΑΒΑ-SPM DMS SPM in excess Σχήμα 8.13: Θέσεις πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνη, στην περιοχή του καταλυτικού κέντρου του συμπλόκου C, όπου προσδένονται τα υπό μελέτη αντιβιοτικά. Το σύμπλοκο C φωτοσημάνθηκε με 100 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη και στη συνέχεια αναλύθηκε με την τεχνική της προέκτασης εκκινητή. U, A, G, C είναι οι στήλες της ανάλυσης αλληλουχίας, στήλη 1: μη φωτοσημασμένο δείγμα (control), στήλη 2: δείγμα φωτοσημασμένο με ΑΒΑ-σπερμίνη, στήλη 3: δείγμα φωτοσημασμένο με ABA-σπερμίνη, παρουσία περίσσειας ελεύθερης σπερμίνης, στήλη 4: δείγμα τροποποιημένο με DMS, στήλη 5: δείγμα φωτοσημασμένο με ΑΒΑ-σπερμίνη και στη συνέχεια τροποποιημένο με DMS. Είναι προφανές ότι μερικές από τις θέσεις πρόσδεσης της σπερμίνης είναι πολύ κοντά στα νουκλεοτίδια με τα οποία αλληλεπιδρούν τα αντιβιοτικά. Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Swiss-pdb Viewer, υπολογίστηκαν οι αποστάσεις των αντιβιοτικών από τα νουκλεοτίδια που προσδένουν πολυαμίνες. Σε πολλές περιπτώσεις ήταν κάτω των 17Ǻ, δείχνοντας ότι οι πολυαμίνες που προσδένονται στις θέσεις αυτές (μήκος ελεύθερης σπερμίνης 17.11Ǻ) επηρεάζουν άμεσα την πρόσδεση των αντιβιοτικών. Με πειράματα χημικής τροποποίησης χρησιμοποιώντας DMS, εντοπίστηκαν οι αλλαγές διαμόρφωσης που προκλήθηκαν σε αυτή την περιοχή λόγω πρόσδεσης της σπερμίνης. Τρία νουκλεοτίδια έδωσαν έντονες διαφορές αυξάνοντας τη δραστικότητά τους έναντι του χημικού τροποποιητή

DMS. Αυτά είναι το A2432-33, Α2497, A2468-69, C2573 και Α2598. Έχοντας υπόψιν ότι οι δυο από τις θέσεις αυτές δεν έχουν άμεση σχέση με τις θέσεις πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης, διαπιστώθηκε ότι παρατηρούμενες αλλαγές στην δραστικότητα του DMS οφείλονται σε αλλαγές διαμόρφωσης του 23S rrna. DOMAIN V DOMAIN II Σχήμα 8.14: Θέσεις πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης και αντιβιοτικών στην περιοχή ΙΙ και V του 23S rrna. Με πράσινα βέλη σημειώνονται οι θέσεις πρόσδεσης της σπερμίνης, με μπλε κύκλους τα νουκλεοτίδια όπου προσδένεται η βλαστισιδίνη και με κόκκινους τα νουκλεοτίδια με τα οποία αλληλεπιδρούν τα μακρολίδια. Αλλαγή διαμόρφωσης του 23S rrna λόγω πρόσδεσης της σπερμίνης σημειώνεται με τετράγωνο.

8.4 Επιβεβαίωση του μηχανισμού δράσης των αντιβιοτικών και της επίδρασης των πολυαμινών, με ανάλυση αποτυπώματος Για επιβεβαίωση του μηχανισμού πρόσδεσης των μακρολιδίων καθώς και της υπόθεσης ότι οι πολυαμίνες προσδένονται σε γειτονικές θέσεις με τα αντιβιοτικά επηρεάζοντας τη δράση τους, επεκτείναμε τη μελέτη μας χρησιμοποιώντας την τεχνική της ανάλυσης αποτυπώματος. Η τεχνική αυτή μας επέτρεψε να παρατηρήσουμε αλλαγές στην ευαισθησία έναντι χημικών τροποποιητών (DMS, CMCT και KE) συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων του 23S rrna, στα οποία προσδένονται τα αντιβιοτικά. Η αρχική και η τελική θέση πρόσδεσης του αντιβιοτικού εντοπίστηκε με ανάλυση αποτυπώματος των συμπλόκων CI και C*I. Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκαν δυο δείγματα: στο πρώτο το αντιβιοτικό αντέδρασε με σύμπλοκο C και αφού έλαβε χώρα σχηματισμός του C*I (πορεία προεπώασης με το αντιβιοτικό), έγινε ανάλυση αποτυπώματος. Στο δεύτερο δείγμα, το αντιβιοτικό και ο χημικός τροποποιητής προστέθηκαν ταυτόχρονα (<1min) στο σύμπλοκο C (πειράματα χωρίς προεπώαση), με αποτέλεσμα να «αποτυπωθεί» η θέση αρχικής πρόσδεσης του αντιβιοτικού στο ριβόσωμα. Για τη μελέτη της επίδρασης των πολυαμινών στην πρόσδεση των αντιβιοτικών, σύμπλοκο C παρασκευάστηκε κάτω από τρεις ιοντικές συνθήκες: απουσία πολυαμινών (4.5 mm Mg 2+, 150 mm NH 4+ ), παρουσία ελεύθερης σπερμίνης (4.5 mm Mg 2+, 150 mm NH 4+, 100 μμ σπερμίνη) και απουσία πολυαμινών αλλά έχοντας ομοιοπολικά προσδεδεμένη ABAσπερμίνη. Η χρήση ΑΒΑ-σπερμίνης αντί ελεύθερης σπερμίνης έγινε με σκοπό να αποφευχθεί αδρανοποίηση των χημικών τροποποιητών από τις ελεύθερες αμινοομάδες. Επειδή χρησιμοποιήθηκε περίσσεια χημικών τροποποιητών, τελικά δεν προκλήθηκε ισχυρή αδρανοποίηση. Ωστόσο, οι παύσεις που ελήφθησαν παρουσία φωτοσημασμένου συμπλόκου, ήταν σαφώς πιο έντονες. Παρόλο αυτά, το φωτοσημασμένο σύμπλοκο C με ΑΒΑ-σπερμίνη χρησιμοποιήθηκε σε όλη τη σειρά των πειραμάτων για επιπρόσθετη

επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της επίδρασης των πολυαμινών στην πρόσδεση των αντιβιοτικών. Ο καθορισμός των πειραματικών συνθηκών πρόσδεσης των αντιβιοτικών και χημικής τροποποίησης των συμπλόκων CI και C*I έγινε ως εξής: Αρχικά, προσδιορίσθηκε η βέλτιστη ποσότητα ριβοσωμάτων που έπρεπε να χρησιμοποιηθεί. Μεταξύ των 12, 20, 50, 75 και 100 pmol ριβοσωμάτων που δοκιμάστηκαν ανα 100 μl διαλύματος, τα 75 pmol (~3 A 260 ) έδωσαν τα πιο ικανοποιητικά αποτελέσματα και εξάλλου μπορούσαν να φωτομετρηθούν με μεγάλη ακρίβεια. Στη συνέχεια, δείγματα των 75 pmol/100μl ριβοσωμάτων τροποποιήθηκαν με τους τρεις χημικούς τροποποιητές σε διάφορες συνθήκες (συγκέντρωση τροποποιητή, χρόνος και θερμοκρασία) βάσει οδηγιών που έχουν δημοσιευτεί από άλλα εργαστήρια (Christiansen et al., 1990; Garza- Ramos et al., 2001; Moazed and Noller, 1987; Poulsen et al., 2000; Rodriguez- Fonseca et al., 1995; Rodriguez-Fonseca and Garrett, 1995; Stern et al., 1988; Xiong et al., 2005), και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες. Συγκεκριμένα, ελέγχθηκαν δυο συγκεντρώσεις DMS (3 μl DMS αραιωμένα 1:5 σε ΕtOH και 8 μl DMS 1:1 σε EtOH) σε δυο χρόνους (5 και 10 min) και τρεις θερμοκρασίες (25, 30 και 37 0 C). Ακόμα ελέγχθηκαν δύο συγκεντρώσεις CMCT (63 mg/ml και 42 mg/ml) σε δύο διαφορετικούς χρόνους τροποποίησης (10 και 20 min), για τρεις θερμοκρασίες (25, 30, 37 0 C). Τέλος, ελέγχθηκε η τροποποίηση με 5 μl KE 35 mg/ml διαλυμένη σε 20% EtOH, στις τρεις παραπάνω θερμοκρασίες. Από τα προκαταρκτικά πειράματα καταλήξαμε στο πρωτόκολλο χημικής τροποποίησης που περιγράφτηκε στη μεθοδολογία. Έλεγχος της σωστής τροποποίησης έγινε, παρατηρώντας την προστασία συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων (με DMS τις βάσεις Α2058-59, με CMCT την U2609 και με ΚΕ την G2505). Προσπαθώντας να προσομοιάσουμε τις συνθήκες ανάλυσης αποτυπώματος με εκείνες της κινητικής ανάλυσης, πραγματοποιήσαμε τα πειράματα ανάλυσης αποτυπώματος λαμβάνοντας υπόψιν ιδιαίτερα τις συνθήκες και τους περιορισμούς της κινητικής ανάλυσης. Έτσι, η πρόσδεση του αντιβιοτικού στο σύμπλοκο C έγινε στους 25 0 C, χρησιμοποιώντας δυο

συγκεντρώσεις αντιβιοτικού, μια συγκέντρωση κορεσμού (10xK i ) και μια ιδιαίτερα μεγάλη (50xK i ). Η χημική τροποποίηση έλαβε χώρα στους 37 0 C, ενώ ο χρόνος εξισορρόπησης για το σχηματισμό του συμπλόκου C*I εξαρτήθηκε από την ταχύτητα του αντιβιοτικού να προσδένεται στο ριβόσωμα (Πίνακα V). Τα αυτοραδιογραφήματα αναλύθηκαν με το πρόγραμμα επεξεργασίας εικόνας AIDA. Tο ποσοστό προστασίας των νουκλεοτιδίων, σε κάθε περίπτωση, διορθώθηκε ως προς την ένταση μιας σταθερής ζώνης (συνήθως θέση αυτόματης παύσης της αντίστροφης μεταγραφάσης), ώστε να καταστεί ανεξάρτητο της ποσότητας του δείγματος που ηλεκτροφορείται. Τα νουκλεοτίδια που ελέγχθηκαν για αλλαγές στην προστασία τους περιελάμβαναν όλα όσα έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία βάσει προηγούμενων αναλύσεων αποτυπώματος (Πίνακας Ι, Σχήμα 3.7) και κρυσταλλογραφικών μελετών (Πίνακας ΙΙ, Σχήμα 3.6 και 3.9). Αντιπροσωπευτικά αυτοραδιογραφήματα δίνονται στο Σχήμα 8.15. Τα νουκλεοτίδια που παρουσίασαν αλλαγή στην προστασία τους έναντι χημικών τροποποιητών, δίνονται στον Πίνακα VIIΙ.

Απουσία σπερμίνης Παρουσία σπερμίνης U A G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Α2059 Α2060 Α2063 Απουσία σπερμίνης Παρουσία σπερμίνης U A G C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Α753 Σχήμα 8.14 Αντιπροσωπευτικά αυτοραδιογραφήματα ανάλυσης αποτυπώματος για πρόσδεση της τυλοσίνης και ερυθρομυκίνης στο σύμπλοκο C. Η πρόσδεση έγινε απουσία ή παρουσία 100 μμ σπερμίνης. Α, U, C, G είναι η ανάλυση αλληλουχίας, στήλη 1: σύμπλοκο C χωρίς τροποποίηση (control), στήλη 2: σύμπλοκο C τροποποιημένο με DMS, στήλη 3: σύμπλοκο C+ τυλοσίνη (-ΡΙ), τροποποιημένο με DMS (CI αποτύπωμα), στήλη 4: σύμπλοκο C + τυλοσίνη (+ΡΙ) τροποποιημένο με DMS (C*I αποτύπωμα), στήλη 5: στήλη σύμπλοκο C + ερυθρομυκίνη (-ΡΙ), τροποποιημένο με DMS (CI αποτύπωμα), στήλη 6: σύμπλοκο C + ερυθρομυκίνη (+ΡΙ) τροποποιημένο με DMS (C*I αποτύπωμα),. Στήλες 7-12: όπως οι στήλες 1-6, αλλά η πρόσδεση έγινε παρουσία 100 μμ ελεύθερης σπερμίνης.

Πίνακας VΙΙΙ: Συγκεντρωτικός πίνακας αποτελεσμάτων ανάλυσης αποτυπώματος για συγκέντρωση αντιβιοτικού ίση με 10K i, σε τρεις ιοντικές συνθήκες. α Ιοντικές συνθήκες 4.5mM Mg 2+ 150mM NH 4 + 4.5mM Mg 2+ 150mM NH 4 + 100μΜ σπερμίνη 4.5mM Mg 2+ 150mM NH 4 + 100μΜ ABA-SPM Control -PI +PI control -PI +PI control -PI +PI Τυλοσίνη A752 ++ + ± ++ + 0 ++ + 0 A788 ++ +± + +± +± +± +± +± +± A792 ++ +++ ++++ ++ ++± ++± ++ +± +± A2058 ++++ +± ++ ++++ ++ ++ ++++ ++ ++ A2059 +++ ++ ++ +++ ++± ++± +++ ++± ++± A2062 +++ +± ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ A2439 + ± ± + ± ± + + + U2506 ++ + ± + ± ± +++ ++ ++± A2572 ++ +± + + ± ± +++ +++ +++ U2609 +++ + 0 +++ ++ + +++ ++ + C2611 + ± ± 0 0 0 0 0 0 Ερυθρομυκίνη Α752 ++ ++± +++ ++ +++ +++± ++ +++ +++± Α788 +± + ± +± +± + +± +± + Α2058 ++++ + ++ ++++ ++ ++± ++++ ++ ++± Α2059 +++ ++ ++± +++ ++ ++± +++ ++ ++± Α2060 + ± + + + + + + + Α2062 +++ +++ ++++ +++ +++ +++± +++ +++ +++± Α2572 ++ ± + + ± ± +++ +++ +++ U2609 +++ 0 0 +++ + + +++ + + C2611 + ± ± 0 0 0 0 0 0 Αζιθρομυκίνη Α752 ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ Α788 ++ ++± ++ ++ ++ ++ ++ + ++ U790 ++ +++ ++ ++ ++± ++ ++ ++± ++ A2058 ++++ + +± ++++ +± ++ ++++ +± ++ A2059 +++ +± +± +++ ++± ++± +++ ++± ++± A2062 +++ +++ +++ +++ +++± +++ +++ +++± +++ G2505 +++ +++ ++± +++ +++ ++± +++ +++ ++± U2585 ++ +± +± ++ ++ ++ ++ ++ ++ U2586 + ± ± + + + + + + U2609 +++ ++± + +++ ++± ++± +++ ++± ++± Τελιθρομυκίνη Α752 ++ +± + ++ ++ ++ ++ ++ ++ Α788 ++ ++ + ++ +± +± ++ +± +± A2058 ++++ ++ +± ++++ ++ +++ ++++ ++ +++ A2059 +++ ++± ++± +++ +± ++± +++ +± ++± A2062 +++ ++++ +++++ +++ +++± ++++ +++ +++± ++++ U2609 +++ ++ + +++ +++ +++ +++ +++ +++ C2610 ++ + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ α με τέσσερις σταυρούς αποδίδεται το πιο έντονο σήμα παύσης

Από τα δεδομένα του Πίνακα VIII, βλέπουμε ότι η τυλοσίνη, προσδένεται πολύ ισχυρά στις βάσεις Α2058 και Α2059, όπως και τα υπόλοιπα μακρολίδια. Η πρόσδεσή της σε αυτές τις βάσεις είναι βαθμιαία. Δηλαδή χωρίς προεπώαση (-ΡΙ) έχουμε λιγότερη προστασία, από ότι με προεπώαση του συμπλόκου C με το αντιβιοτικό (+ΡΙ). Η βάση Α2062, με την οποία η τυλοσίνη δημιουργεί ομοιοπολικό δεσμό, προστατεύεται ισχυρά. Επίσης, η τυλοσίνη σταθεροποιείται στη θέση της με βαθμιαία πρόσδεση στις βάσεις U2609, U2506, Α2572, και Α2439. Στην περιοχή ΙΙ έχουμε ομοίως προοδευτική πρόσδεση (προστασία) στις βάσεις Α752 και Α788. Ταυτόχρονα, παρατηρείται προοδευτική ενίσχυση της επιδεκτικότητας της βάσης Α792 έναντι του τροποποιητή. Αλλαγές στην επιδεκτικότητα των δυο τελευταίων θέσεων έναντι του DMS δεν έχουν ξανά αναφερθεί στη βιβλιογραφία για την πρόσδεση της τυλοσίνης. Αξίζει να σημειωθεί ότι απουσία πολυαμινών το νουκλεοτίδιο C2611 του συμπλόκου C εκδηλώνει επιδεκτικότητα έναντι του DMS, που παρουσία του αντιβιοτικού μειώνεται. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία η θέση C2611 δεν πρέπει να αντιδρά με DMS, εφόσον βρίσκεται σε διπλή έλικα (Egebjerg et al., 1990). Παρουσία πολυαμινών, η πιο έντονη αλλαγή που παρατηρήθηκε ήταν η κατάργηση της προστασίας της βάσης Α2062, γεγονός που υποστηρίζει ότι υπό τις συνθήκες αυτές ο σχηματισμός ομοιοπολικού δεσμού με την τυλοσίνη δεν είναι επιτρεπτός. Επίσης, μειώνεται η πρόσδεση (προστασία) στις βάσεις Α2058, Α2059, και U2609, με τις οποίες αλληλεπιδρά ο λακτονικός δακτύλιος, ενώ αντίθετα παρουσία σπερμίνης αυξάνεται η πρόσδεση της τυλοσίνης στις θέσεις Α752 και Α2572. Τέλος, παρουσία πολυαμινών καταργείται η προστασία της βάσης Α788 καθώς και η επιδεκτικότητα της C2611 στο σύμπλοκο C. Για το αντιβιοτικό ερυθρομυκίνη, έκπληξη αποτελεί το γεγονός ότι, αν και προσδένεται ισχυρά στις βάσεις A2058 και Α2059, δεν ακολουθεί τη συνήθη προοδευτική προστασία, αλλά με προεπώαση μειώνεται η πρόσδεσή της στις θέσεις αυτές. Το ίδιο ισχύει και για τη θέση Α2060. Αντίθετα, οι αλληλεπιδράσεις του μορίου με την περιοχή ΙΙ του 23S rrna αυξάνονται. Συγκεκριμένα, με προεπώαση ενισχύεται η επιδεκτικότητα της βάσης Α752

και η προστασία της βάσης Α788. Επίσης, παρατηρήθηκε ενίσχυση στην επιδεκτικότητα της Α2062 και αύξηση της προστασίας στις βάσεις U2609 Α2572. Παρουσία πολυαμινών μειώθηκαν όλες οι αλληλεπιδράσεις με τις βάσεις, εκτός εκείνων που σχετίζονται με την Α752. Να σημειωθεί ότι παρά την παρουσία πολυαμινών, με προεπώαση συνεχίστηκε να ανιχνεύεται πρόσδεση του αντιβιοτικού στις βάσεις Α2058 και Α2059. Η C2611, όπως και στην περίπτωση της τυλοσίνης, δεν εμφάνισε επιδεκτικότητα έναντι του DMS παρουσία πολυαμινών. Πειράματα προστασίας δεν έχουν γίνει για την αζιθρομυκίνη στο παρελθόν. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι αλληλεπιδρά με τα ίδια νουκλεοτίδια, όπως και η ερυθρομυκίνη. Ακολουθεί την ίδια συμπεριφορά με αυτήν, δείχνοντας όμως πιο ήπιες διαφορές στα πειράματα με/χωρίς προεπώαση και παρουσία/απουσία πολυαμινών. Πιο αναλυτικά, μειώνεται η πρόσδεσή της με την Α2058 μετά από προεπώαση, με ταυτόχρονή αύξηση της ενίσχυσης της επιδεκτικότητας της βάσης Α752. Άλλα χαρακτηριστικά της πρόσδεσης είναι οι ιδιοσυγκρατικές αλληλεπιδράσεις του λακτονικού δακτυλίου με τις βάσεις G2505, U2585 και U2586 καθώς και η έντονη προστασία της U2609 μετά από προεπώαση του συμπλόκου C με το αντιβιοτικό. Προσεκτική ανάλυση της περιοχής δεν ανέδειξε επιπλέον νουκλεοτίδια να προστατεύονται. Παρουσία πολυαμινών μειώνονται οι αλληλεπιδράσεις του μορίου σχεδόν με όλες τις βάσεις που προαναφέρθησαν, τόσο στην περιοχή V, όσο και στην περιοχή ΙΙ του 23S rrna. Εξαίρεση αποτελεί η βάση Α2062, η επιδεκτικότητα της οποίας αυξήθηκε. Ανάλυση αποτυπώματος για το κετολίδιο τελιθρομυκίνη απεκάλυψε μεγάλες ομοιότητες στις αλληλεπιδράσεις του με το ριβόσωμα, σε σύγκριση με την τυλοσίνη. Επιπρόσθετα, ταυτοποιήθηκαν αλληλεπιδράσεις της τελιθρομυκίνης με τις βάσεις Α788 και C2610, που δεν έχουν αναφερθεί ξανά στη βιβλιογραφία. Με προσθήκη σπερμίνης μειώνονται όλες οι αλληλεπιδράσεις της τελιθρομυκίνης. Αξιοπρόσεκτο είναι ότι παρουσία σπερμίνης η προεπώαση δεν προκαλεί σταδιακή αύξηση της πρόσδεσης στις

Α2058 και Α2059, αλλά μείωση και μάλιστα πολύ πιο έντονη από τα υπόλοιπα αντιβιοτικά. Σαν τελικό συμπέρασμα, φαίνεται ότι η αρχική πρόσδεση των αντιβιοτικών γίνεται στην περιοχή V του 23S rrna στην είσοδο του τούνελ εξόδου. Με την πάροδο του χρόνου, όμως το μόριο του αντιβιοτικού φαίνεται να μετακινείται κάπως, αλληλεπιδρώντας με νουκλεοτίδια της περιοχής ΙΙ του 23S rrna, δηλαδή με τις θέσεις που βρίσκονται βαθιά στο τούνελ εξόδου. Εναλλακτικά, το μόριο του αντιβιοτικού μπορεί να μην μετακινείται, αλλά να προκαλεί αλλοστερικές αλλαγές της διαμόρφωσης του ριβοσώματος. Οι πολυαμίνες δείχνουν να ενισχύουν αυτή τη μετατόπιση προς το τούνελ (με εξαίρεση τη αζιθρομυκίνη), επηρεάζοντας περισσότερο την τελιθρομυκίνη, λιγότερο στην ερυθρομυκίνη και ελάχιστα στην τυλοσίνη. Γενικά όμως, μειώνονται οι αλληλεπιδράσεις με το ριβόσωμα. 8.5 Επίδραση των αντιβιοτικών σε συζευγμένο σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης του γονιδίου της GFP Για την επιβεβαίωση της σχετικής ισχύος των μακρολιδίων χρησιμοποιήθηκε το συζευγμένο σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης του γονιδίου της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP). To σύστημα αυτό που θεωρείται ένα από τα πιο αξιόπιστα in vitro συστήματα για μελέτη της πρωτεϊνικής σύνθεσης, μας έδωσε τη δυνατότητα να μετρήσουμε τη συγκέντρωση καθενός αντιβιοτικού που προκαλεί 50% αναστολή (IC 50 ) στην παραγωγή GFP πρωτεΐνης. Παράλληλα, έγινε έλεγχος της επίδρασης των αντιβιοτικών στη μεταφραστική πιστότητα. Η GFP πρωτεΐνη που παράγεται στο συζευγμένο σύστημα μεταγραφήςμετάφρασης, έχει χαρακτηριστική δομή κυλίνδρου στο κέντρο του οποίου λαμβάνει χώρα ο αυτοκαταλυόμενος φθορισμός (Ormo et al., 1996; Yang et al., 1996). Το μεταλλαγμένο γονίδιο της GFP που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή περιέχει τρεις μεταλλάξεις στις θέσεις 100, 154 και 164, που βελτιώνουν το χρόνο ωρίμανσης της εκφραζόμενης πρωτεΐνης στις 3-4 ώρες και αυξάνουν

τη σταθερότητα του ενεργού προϊόντος (Tsien, 1998). Η τελευταία παρατήρηση δείχνει, ότι η ενεργότητα της GFP μπορεί να βελτιωθεί με μεταλλάξεις στο μόριό της και αντίστοιχα, να μειωθεί λόγω μεταλλάξεων και διατάραξη της απαραίτητης δομής. Συνεπώς, ο λόγος της ποσότητας της ενεργής έναντι της συνολικής GFP αποτελεί έναν ευαίσθητο δείκτη παρακολούθησης της ενσωμάτωσης λανθασμένων αμινοξέων στο μόριό της, που συνδέεται με τη μεταφραστική πιστότητα του ριβοσώματος. Η αντίδραση έκφρασης του γονιδίου της GFP πρωτεΐνης έγινε αρχικά απουσία αντιβιοτικών σε διάφορους χρόνους, στους 30 0 C, με κυκλική ανάδευση (900 rpm) (Σχήμα 8.15). Επειδή η ζώνη της GFP δεν επικαλύπτεται από άλλες πρωτεϊνικές ζώνες του εκχυλίσματος S30 σε SDS πηκτή πολυακρυλαμιδίου, το ολικό ποσό της πρωτεΐνης που συντέθηκε in vitro προσδιορίστηκε εύκολα με ανάλυση της έντασης της GFP ζώνης, σε σύγκριση με γνωστά ποσά καθαρής GFP που έτρεξαν παράλληλα στην πηκτή. Εκτός από την ολική ποσότητα της πρωτεΐνης, προσδιορίστηκε και το ενεργό ποσό της συντιθέμενης πρωτεΐνης, μέσω φθορισμομετρίας. Συγκεκριμένα, μετά τον τερματισμό της αντίδρασης σύνθεσης, το προϊόν επωάστηκε στους 4 0 C για διάφορους χρόνους, ώστε να αποκτήσει τη λειτουργική του διαμόρφωση. Μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή και έκθεση της πηκτής σε υπεριώδη ακτινοβολία, προσδιορίστηκε ο εκπεμπόμενος φθορισμός της ενεργής GFP. Συγκρίνοντας το ποσό της ενεργής πρωτεΐνης που παράχθηκε σε σχέση με την 100% ενεργή GFP του εμπορίου, υπολογίστηκε το ενεργό ποσοστό της, που ήταν ίσο με 50% ± 20% (Σχήμα 8.15). Στη συνέχεια, το σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων κάθε αντιβιοτικού, που απαιτούνται για μείωση της πρωτεϊνικής σύνθεσης κατά 50% (IC 50 ). Από την SDS πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπολογίστηκε το συνολικό ποσό της πρωτεΐνης που παρήχθηκε παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων αντιβιοτικού, ενώ από φυσική πηκτή το αντίστοιχο ενεργό ποσό της πρωτεΐνης. Ο λόγος αυτών, έδωσε ένδειξη της επίδρασης των αντιβιοτικών στη μεταφραστική πιστότητα του ριβοσώματος (Σχήμα 8.16).

Α Γ 43kDa - 29kDa - 20kDa - 14kDa - Β Σχήμα 8.15: Χρονοεξαρτώμενη σύνθεση της GFP και υπολογισμός της ολικής και ενεργής ποσότητάς της. (Α) Το συνολικό ποσό της GFP προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση σε SDS πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Με αστέρι συμβολίζεται η ζώνη αναφοράς βάσει της οποίας έγιναν οι διορθώσεις. (Β) Το ενεργό ποσό της GFP προσδιορίστηκε μετρώντας το φθορισμό της διεγερμένης GFP με U.V. ακτινοβολία, μετά από επώαση στους 4 0 C για συγκεκριμένο χρόνο και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, απουσία αποδιατακτικού παράγοντα. (Γ) Χρονοδιάγραμμα παραγωγής ολικής (μπλε) και ενεργής GFP (πράσινο). Ως αντιβιοτικά αναφοράς για έλεγχο της τεχνικής, χρησιμοποιήθηκαν η θειοστρεπτόνη, η στρεπτομυκίνη και η εδεΐνη. Το τελευταίο αντιβιοτικό έχει μελετηθεί και στο παρελθόν με το ίδιο σύστημα (Dinos et al., 2004). Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι το ποσοστό της ενεργής GFP μειώνεται αυξανόμενης της συγκέντρωσης των αντιβιοτικών που εισάγουν λάθη κατά τη μετάφραση (στρεπτομυκίνη, εδεΐνη), ενώ παραμένει σταθερό για αντιβιοτικά που δεν την επηρεάζουν (θειοστρεπτόνη). Τα μακρολίδια, επειδή προσδένονται στην μεγάλη υπομονάδα που δεν εμπλέκεται άμεσα στη διαδικασία της αποκωδικοποίησης, δεν αναμενόταν να επηρεάζουν τη μεταφραστική πιστότητα. Όμως, πρόσφατες μελέτες έδειξαν σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς, ότι αυξημένη συχνότητα λανθασμένης ενσωμάτωσης μπορεί να

A Ερυθρομυκίνη (μm) GFP Bg 0 0.1 0.5 1 2 5 10 0.5μg 3,5 100 SDS πηκτή GFP(μg) Bg 0 0.1 0.5 1 2 5 10 0.5 1.0 GFP (μg/μl) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 IC 50 =0.796μΜ 80 60 40 20 Active amount of GFP (%) Φυσική πηκτή 0,0 0 0 2 4 6 8 10 Erythromycin (μμ) Αζιθρομυκίνη (μμ) GFP Bg 0 0.25 0.5 1 1.5 2 5 0.5μg 3,0 100 SDS πηκτή GFP(μg) Bg 0 0.25 0.5 1 1.5 2 5 0.5 1.0 GFP (μg/μl) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 IC 50 =0.645μΜ 80 60 40 20 Active amount of GFP (%) 0,0 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Φυσική πηκτή Azithromycin (μμ) Τελιθρομυκίνη (μm) GFP Bg 0 0.5 1.0 2.5 5 7.5 10 0.5μg 3,0 100 SDS πηκτή GFP(μg) Bg 0 0.5 1 2.5 5 7.5 10 0.5 1.0 GFP (μg/μl) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 IC 50 =1.55μΜ 80 60 40 20 Active amount of GFP (%) Φυσική πηκτή 0,0 0 0 2 4 6 8 10 Telithromycin (μμ)

B GFP (μg/μl) 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 IC 50 =0.433μΜ 0,0 0 2 4 Tylosin (μμ) 100 80 60 40 20 0 Active amount of GFP (%) GFP (μg/μl) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 IC 50 total=7.75μμ IC 50 active=6.15μμ 0,0 0 0 2 4 6 8 10 12 Edeine (μμ) 100 80 60 40 20 Active amount of GFP (%) GFP (μg/μl) 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 IC 50 total=429.25μμ IC 50 active=250.25μμ 0,0 0 0 100 200 300 400 500 600 Streptomycin (μμ) 100 80 60 40 20 Active amount of GFP (%) GFP (μg/μl) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 IC 50 =45.5μΜ 0,0 0 0 20 40 60 80 100 Thiostrepton (μμ) 100 80 60 40 20 Active amount of GFP (%) Σχήμα 8.16: Έκφραση της GFP σε συζευγμένο σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων αντιβιοτικών. (A) Το συνολικό ποσό της GFP ανιχνεύτηκε σε SDS πηκτή πολυακρυλαμιδίου και η ενεργή ποσότητα αυτής σε φυσική πηκτή. Στα διαγράμματα, το συνολικό και το ενεργό ποσό της GFP που παρήχθηκε, δίνεται με μπλε και πράσινο χρώμα, ενώ το ποσοστό της ενεργής πρωτεΐνης δίνεται με κόκκινο. (Β) Επίδραση της τυλοσίνης, εδεΐνης, στρεπτομυκίνης και θειοστρεπτόνης στην παραγωγή ενεργής GFP. Σε κάθε διάγραμμα δίνονται οι τιμές IC 50 που υπολογίστηκαν για το ποσό της συνολικής και ενεργής πρωτεΐνης, εκτός εάν συνέπιπταν. συνδυάζεται με μείωση της καταλυτικής ενεργότητας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (μη δημοσιευμένα αποτελέσματα ερευνητικής ομάδας Δρ. Συνετού), οπότε έγινε έλεγχος αυτής της υπόθεσης. Τα αποτελέσματά μας εισηγούνται ότι τα μακρολίδια δεν προκαλούν μείωση του ποσοστού της ενεργής GFP. Μάλιστα, σε μικρές συγκεντρώσεις ευνοούν την παραγωγή της GFP, παρά την ελαττώνουν.

8.6 Έλεγχος επίδρασης των πολυαμινών και των αντιβιοτικών στη λειτουργία της μετατόπισης των υποστρωμάτων Ο έλεγχος της μετατόπισης των υποστρωμάτων έγινε με μείγμα 2 mm πουρομυκίνης παρουσία 5 μμ θειοστρεπτόνης, για 3 min, στους 25 0 C. Υπενθυμίζεται ότι η πουρομυκίνη αντιδρά με AcPhe-tRNA, μόνο όταν το τελευταίο είναι προσδεδεμένο στην Ρ-θέση. Επίσης, υπενθυμίζεται ότι η θειοστρεπτόνη είναι ισχυρός αναστολέας της μετατόπισης, χωρίς να επηρεάζει την αντίδραση πουρομυκίνης (Brandi et al., 2004; Kutay et al., 1990). Για τον έλεγχο της επίδρασης των πολυαμινών στη διαδικασία μετατόπισης του AcPhe-tRNA από την Α- στην Ρ- θέση poly(u)- προγραμματισμένων ριβοσωμάτων, δυο σειρές πειραμάτων έλαβαν χώρα. Στην πρώτη, η μετατόπιση μελετήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα T 100 N 100 M 6 SH 6 που περιείχε 0.12 mm GTP και σπερμίνη σε τελική συγκέντρωση από 0-300, μμ, παρουσία ή απουσία EF-G. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.17Α, ο EF-G σε 0.015 μμ συγκέντρωση επάγει γρήγορη μετατόπιση, η οποία ολοκληρώνεται μέσα σε 30 sec, ανεξαρτήτως της συγκέντρωσης σπερμίνης. Απουσία EF-G, η μετατόπιση είναι πολύ βραδύτερη, δίνοντας έτσι τη δυνατότητα μελέτης της επίδρασης των πολυαμινών. Παρατηρούμε λοιπόν, ότι η αυθόρμητη μετατόπιση (-EF-G) διεγείρεται παρουσία σπερμίνης. Όπως δείχνει το ένθετο του Σχήματος 8.17Α, η βέλτιστη συγκέντρωση σπερμίνης είναι 50 μμ. Για να εξετάσουμε την επίδραση της σπερμίνης στην EF-G-καταλυόμενη μετατόπιση, ο παράγοντας EF-G προστέθηκε σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σε σταθερό ποσό ριβοσωματικού συμπλόκου προ-μετατόπισης (PRE- ριβοσωματικό σύμπλοκο, που έχει προσδεδεμένο AcPhe-tRNA στην Α θέση και trna Phe στην Ρ-), απουσία και παρουσία 50 μμ σπερμίνης. H μετατόπιση έλαβε χώρα για 1 min, στους 25 0 C. Η έκταση της μετατόπισης και στις δύο περιπτώσεις αυξήθηκε παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων EF-G και έφτασε σε κοινό πλατώ (Σχήμα 8.17Β). Οι συγκεντρώσεις όμως, του EF-G για να επιτευχθεί 50% μετατόπιση υπολογίστηκαν στα 5 και 0.58 nm, απουσία και παρουσία σπερμίνης, αντίστοιχα. Συνεπώς, η σπερμίνη μειώνει τις απαιτήσεις των ριβοσωμάτων, όσον αναφορά τη συγκέντρωση του EF-G.

Σχήμα 8.17: (Α) Διάγραμμα επίδρασης της σπερμίνης στην αυθόρμητη (, ) και EF- G-καταλυόμενη (, ) μετατόπιση απουσία (, ) και παρουσία (, ) σπερμίνης. Στο ένθετο, παρουσιάζεται η εξάρτηση της αυθόρμητης μετατόπισης από τη συγκέντρωση της σπερμίνης. (Β) Εξάρτηση της μετατόπισης από τη συγκέντρωση του EF-G, παρουσία ( ) ή απουσία ( ) 50 μμ σπερμίνης. Σε δεύτερη σειρά πειραμάτων, σύμπλοκο προ-μετατόπισης μη φωτοσημασμένο ή φωτοσημασμένο με ΑΒΑ-σπερμίνη ολικά ή σε κάθε μια από τις υπομονάδες του, ελέγχθηκε για την ικανότητά του για μετατόπιση. Η αυθόρμητη μετατόπιση βρέθηκε πάλι να βαίνει βραδέως και γραμμικά ως προς το χρόνο, τουλάχιστον μέχρι τα 8 min. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.18Α, PRE-σύμπλοκο ολικά ή μερικώς φωτοσημασμένο στην 50S υπομονάδα είναι πιο ικανό για μετατόπιση, σε σχέση με μη-φωτοσημασμένο σύμπλοκο ή σύμπλοκο φωτοσημασμένο μόνο στην 30S υπομονάδα. Επιπρόσθετα, φωτοσήμανση του ολικού ριβοσωματικού συμπλόκου ή της 50S υπομονάδας προσέδωσε ικανότητα στα ριβοσώματα να μετατοπίζουν τα υποστρώματα τους σε μικρότερη συγκέντρωση EF-G (Σχήμα 8.18Β). Συνδυασμός όλων των δεδομένων υποστηρίζει ότι τα ριβοσώματα που προσδένουν πολυαμίνες, ιδίως στις 50S υπομονάδες, είναι πιο ικανά για μετατόπιση. Είναι ενδιαφέρον, ότι ανασυσταμένα ριβοσώματα από 30S υπομονάδες, 5S rrna, ριβοσωματικές πρωτεΐνες της μεγάλης υπομονάδας (TP50) και φωτοσημασμένο 23S rrna, έδειξαν ότι είναι ανενεργά στη μετατόπιση. Για ερμηνεία του αποτελέσματος πρέπει να ληφθεί υπόψιν ότι το γυμνό 23S rrna, δεν υπάρχει ως ξεχωριστό μόριο στο κυτταρόπλασμα

εφόσον η διαδικασία της μεταγραφής του είναι στενά συνδεδεμένη με τη συγκρότηση της 50S υπομονάδας του ριβοσώματος. Έτσι, είναι πιθανόν η ΑΒΑ-σπερμίνη να σταθεροποιεί μια λανθασμένη διαμόρφωση του 23S rrna και να μην επιτρέπει την ανασύσταση μιας λειτουργικής υπομονάδας. Το αποτέλεσμα αυτό ενισχύεται από τα πειράματα ανάλυσης προέκτασης εκκινητή και προστασίας με DMS στο γυμνό και λειτουργικό 23S rrna όπου υπάρχουν έντονες διαφορές. Σχήμα 8.18: Επίδραση της πρόσδεσης της ΑΒΑ-σπερμίνης στην ικανότητα των ριβοσωμάτων για μετατόπιση. (Α) Αυθόρμητη μετατόπιση. Σύμπλοκο προ-μετατόπισης μη-φωτοσημασμένο ( ) ή φωτοσημασμένο με 100 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη ολικά ( ) ή στη μικρή υπομονάδα του ( ), στη μεγάλη υπομονάδα του ( ) ή στο 23S rrna (x) επωάστηκε για 8 min σε διάλυμα T 100 N 100 M 6 SH 6 στους 25 0 C. Το ποσό του AcPhe-tRNA που μετατοπίστηκε από την Α- στην Ρ- θέση μετρήθηκε με την αντίδραση πουρομυκίνης. (Β) Εξάρτηση της μετατόπισης από τη συγκέντρωση του EFG. Τα σύμβολα παριστούν το ίδιο είδος ριβοσωματικού συμπλόκου που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα του σχήματος Α. Αντιβιοτικά που προσδένονται στη μεγάλη υπομονάδα μπορεί να επηρεάσουν το στάδιο της μετατόπισης. Σε προηγούμενη δημοσίευση αναφέρεται ότι η ερυθρομυκίνη αναστέλλει τη λειτουργία αυτή κατά 50% (Peske et al., 2004). Στην προσπάθεια να διερευνήσουμε νέους μηχανισμούς δράσης των μακρολιδίων στην πρωτεϊνική σύνθεση, ελέγξαμε την επίδρασή τους στη μετατόπιση. Σε αυτή τη σειρά πειραμάτων, χρησιμοποιήσαμε MFmRNA (οι δυο πρώτες τριπλέτες του μεταφραζόμενου τμήματος

κωδικοποιούν τη μεθειονίνη και φαινυλαλανίνη) και [ 32 Ρ]tRNA fmet για πλήρωση της Ρ-θέσης, ώστε παράλληλα να ελέγξουμε την επίδραση των πολυαμινών στην πρόσδεση των υποστρωμάτων στην Α-, Ρ- και Ε- θέση. Παρατηρήθηκε ότι κανένα από τα μακρολίδια δεν επηρεάζει την πρόσδεση των υποστρωμάτων στις θέσεις αυτές περισσότερο από 10%. Πιθανότατα, οι μικροαλλαγές που καταγράφονται, οφείλονται σε αλληλεπιδράσεις των μακρολιδίων με την Ε- θέση (Agrawal et al., 1999). Ο έλεγχος της επίδρασης των μακρολιδίων στη μετατόπιση έγινε, προσθέτοντας στο μείγμα μετατόπισης το κάθε μακρολίδιο σε συγκέντρωση 2 μμ και τον παράγοντα μετατόπισης EF-G σε αναλογία 0.3 pmoles/pmole συμπλόκου προ-μετατόπισης. Το ποσοστό της μετατόπισης που υπολογίστηκε με την αντίδραση πουρομυκίνης, δίνεται στον Πίνακα ΙΧ. Από τις τιμές του πίνακα αυτού παρατηρούμε ότι παρουσία 2 μμ των μακρολιδίων η μετατόπιση παραμένει σταθερή, ενώ μειώνεται παρουσία του αντιβιοτικού αναφοράς βιομυκίνη. Μεγάλη μείωση στο ποσοστό της μετατόπισης παρατηρήθηκε για το αντιβιοτικό τυλοσίνη, αλλά αυτό οφειλόταν στην αναστολή της αντίδρασης πουρομυκίνης και όχι στη μετατόπιση. Όταν η πραγματική τιμή (12,9%) διορθώθηκε με τον βαθμό αναστολής, η τιμή ανήλθε στο 93,1 %, υποδηλώνοντας ότι η τυλοσίνη δεν επηρεάζει σημαντικά τη μετατόπιση. Πίνακας ΙΧ: Πίνακας αποτελεσμάτων μετατόπισης των υποστρωμάτων παρουσία 10 μμ μακρολιδίων. Ως αντιβιοτικό αναφοράς χρησιμοποιήθηκε η

βιομυκίνη σε συγκέντρωση 50 μμ, που είναι ισχυρός αναστολέας της μετατόπισης. Σε κάθε δείγμα προστέθηκαν 5 pmol ριβοσωμάτων και AcPhetRNA ειδικής ραδιενέργειας 1120 dpm/pmol. dpm Απουσία 81 ριβοσωμάτων 73 Πρόσδεση στην Α- θέση dpm (av)-bg pmol/ δείγμα Πρόσδεση % dpm Αντίδραση Πουρομυκίνης dpm (av)-bg pmol AcPhe- PM Μετατόπιση % Απουσία 3219 72 3399 3,3 66 πουρομυκίνης 3733 68 Απουσία EFG 3519 163 3449 3,3 67 3533 218 Απουσία 3394 2842 3275 3,2 64 αντιβιοτικού 3309 2762 Τυλοσίνη 3396 405 3226 3,1 63 3210 435 Ερυθρομυκίνη 3520 2770 3419 3,3 66 3472 2955 Τελιθρομυκίνη 3624 2864 3434 3,3 67 3397 2910 Αζιθρομυκίνη 3505 2788 3387 3,3 66 3423 2813 Βιομυκίνη 3628 1518 3545 3,4 69 3616 1480 121 0,1 2732 3,0 93,8 350 0,4 12,9 (93.1) α 2793 3,1 93,9 2817 3,1 94,1 2731 3,0 90,9 1429 1,57 46,3 α Η τιμή στην παρένθεση παριστά το διορθωμένο ποσοστό μετατόπισης, αν ληφθεί υπόψιν η αναστολή της αντίδρασης πουρομυκίνης από τυλοσίνη

ΣΥΖΗΤΗΣΗ -ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

9. ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Παρ ότι πολλά έχουν αναφερθεί για τη δράση των πολυαμινών στη ρύθμιση της μεταφραστικής μηχανής σε διάφορα στάδια (Agrawal et al., 1999; Bartetzko and Nierhaus, 1988; Cohen, 1998; Igarashi et al., 1982), η διαθέσιμη πληροφορία που αφορά την επίδραση των πολυαμινών στην πρόσδεση των αντιβιοτικών στα ριβοσώματα είναι περιορισμένη. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου έχουν δείξει ότι η σπερμίνη προσδένεται στα ριβοσώματα και προάγει την πρόσδεση της χλωραμφενικόλης (Xaplanteri et al., 2003), ενώ αντίθετα ελαττώνει τη συγγένεια προς το 16μελές μακρολίδιο σπιραμυκίνη (Petropoulos et al., 2004). Στην προκείμενη εργασία επεκτείναμε αυτές τις μελέτες, εξετάζοντας την επίδραση των πολυαμινών στην πρόσδεση άλλων πέντε αντιβιοτικών που προσδένονται στην Ρ- θέση της μεγάλης υπομονάδας ή στην αρχή του τούνελ εξόδου, προσπαθώντας να ερμηνεύσουμε τη διαφορετική ανταπόκριση των αντιβιοτικών έναντι του ιοντικού περιβάλλοντος και να δώσουμε μοριακή ερμηνεία του φαινομένου. Παράλληλα, ελέγξαμε νέους πιθανούς τρόπους δράσης των αντιβιοτικών στην πρωτεϊνική σύνθεση. Εκμεταλλευόμενοι την πληροφορία που πρόσφατα προέκυψε από μελέτες της κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και κρυσταλλογραφίας για τη δομή του ριβοσώματος, θα επιχειρήσουμε μια ερμηνεία των αποτελεσμάτων μας. 9.1 Μηχανισμός δράσης της βλαστισιδίνης και επίδραση των πολυαμινών Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, η βλαστισιδίνη συμπεριφέρεται ως αναστολέας βραδείας πρόσδεσης. Αυτή η κατηγορία αναστολέων έχει ονομαστεί έτσι από τους Morrison και Walsh (Morrison and Walsh, 1988) για να αποδώσει την αλληλεπίδραση ανάμεσα σε ένα ένζυμο και ένα αναστολέα του, που εξισορροπείται αργά, σε χρονική διάρκεια της τάξεως των δευτερολέπτων ή και λεπτών. Για να εξηγηθεί αυτή η συμπεριφορά, έχει υποτεθεί ότι ο αναστολέας επάγει μια αλλαγή διαμόρφωσης στο ένζυμο, η οποία επηρεάζει ταυτόχρονα την πρόσδεση και το είδος της αναστολής.

Στην περίπτωση της βλαστισιδίνης, δυο μόρια του αντιβιοτικού εμπλέκονται στο μηχανισμό αναστολής. Το πρώτο μόριο συναγωνίζεται σε ένα αρχικό μεταβατικό στάδιο την πρόσδεση της πουρομυκίνης στην Α- θέση (συναγωνιστική αναστολή). Οι αλληλεπιδράσεις αυτές του μορίου δεν κατέστη δυνατόν να ανιχνευτούν στην κρυσταλλογραφική μελέτη που έχει γίνει (Hansen et al., 2003), υποδεικνύοντας το μεταβατικό χαρακτήρα της αρχικής πρόσδεσης. Αμέσως μετά τη συναγωνιστική φάση, το αντιβιοτικό εγκαθίσταται βραδέως στην τελική του θέση (μερική-μη συναγωνιστική αναστολή). Το είδος αυτό της αναστολής και η σταθερότητα του συμπλόκου C*I μας οδήγησε στην υπόθεση ότι η θέση πρόσδεσης της βλαστισιδίνης στο C*I σύμπλοκο αντιστοιχεί σε εκείνη της βλαστισιδίνης Ι (Σχήμα 3.5), όπως έχει ταυτοποιηθεί από την κρυσταλλογραφία. Κατά συνέπεια, η βλαστισιδίνη όντας προσδεδεμένη στο σύμπλοκο C*I, αλληλεπιδρά με την G2251 του Ρ- βρόγχου και μετατοπίζει την αμινοακυλο-ομάδα του AcPhe-tRNA που προσδένεται στην Ρ- θέση σε μια λιγότερο ενεργή θέση του καταλυτικού κέντρου. Η πρόσδεση του πρώτου μορίου της βλαστισιδίνης ακολουθεί μηχανισμό δυο σταδίων. Αυτό υποστηρίζεται από το ότι η ημιλογαριθμική χρονοκαμπύλη είναι διφασική, καθώς και από το ότι η φαινομενική σταθερά της αρχικής κλίσης (k obs ) 0 μειώνεται αυξανόμενης της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού (Σχήμα 8.1). Επίσης, η συνολική σταθερά πρόσδεσης (k 6 +k 7 )/K i, είναι ίση με 1.36x10 5 Μ -1 s -1, δηλαδή μια τάξη μεγέθους μικρότερη από το ανώτατο όριο 10 6 M -1 s -1 που έχει τεθεί από τους Morrison & Walsh (Morrison and Walsh, 1988) για τον χαρακτηρισμό των αναστολέων βραδείας πρόσδεσης. Επιπρόσθετα, η τιμή της k 7 είναι μικρότερη από αυτή που μετρήθηκε για την σταθερά k 6, γεγονός που ευνοεί θερμοδυναμικά το σχηματισμό του σταθερού συμπλόκου C*I. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά μας προτείνουν ένα γρήγορο αντιστρεπτό βήμα προς ένα σταθερότερο σύμπλοκο, που εξισορροπείται σε κλίμακα μερικών λεπτών. Σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις βλαστισιδίνης ([Ι]>10K i ), το C*I σύμπλοκο μπορεί να προσδένει ένα δεύτερο μόριο αναστολέα, γεγονός που

οδηγεί σε πλήρη αναστολή του πεπτιδικού δεσμού (μεικτή μη συναγωνιστική αναστολή). Η πρόσδεση του δεύτερου μορίου της βλαστισιδίνης χαρακτηρίζεται από μια σταθερά αναστολής (K i *) ίσης με 7.4 μμ, που σημαίνει ότι η δεύτερη θέση πρόσδεσης έχει μικρότερη συγγένεια με τη βλαστισιδίνη από ότι η πρώτη. Πιθανότατα αυτή η θέση προσδένει το μόριο της βλαστισιδίνης ΙΙ, όπως αναφέρεται σε κρυσταλλογραφικές μελέτες (Hansen et al., 2003). Ταυτόχρονη πρόσδεση του αντιβιοτικού και στις δυο θέσεις, αποτρέπει την αλληλεπίδραση του υποστρώματος της Ρ- θέσης με την G2251 και την G2252, και έτσι προσανατολίζει το -CCΑ άκρο του AcPhetRNA εκτός του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος (πλήρης αναστολή). Η ικανότητα του ριβοσωματικού συμπλόκου για πρόσδεση της βλαστισιδίνης ενισχύεται 5-7 φορές παρουσία 100 μμ σπερμίνης ή όταν το σύμπλοκο C έχει φωτοσημανθεί με 100 μμ ΑΒΑ-σπερμίνη (Πίνακας VΙ). Η χρήση του πολυαμινικού διαλύματος που περιέχει 50 μμ σπερμίνη και 2 mm σπερμιδίνη (Bartetzko and Nierhaus, 1988) βελτιώνει ακόμα περισσότερο τη συγγένεια του αντιβιοτικού προς το ριβόσωμα. Η ευεργετική επίδραση των πολυαμινών είναι εντονότερη κατά την πρόσδεση του πρώτου μορίου αναστολέα. Συγκεκριμένα, παρουσία πολυαμινών η τιμή της ολικής σταθεράς πρόσδεσης, k assoc /k 7 =(k 6 +k 7 )/K i xk 7 γίνεται ~4 φορές μεγαλύτερη από την τιμή που υπολογίστηκε σε μη-πολυαμινικά διαλύματα. Αντίθετα, η τιμή K i * που αντιστοιχεί στην πρόσδεση του δεύτερου μορίου μειώνεται μόνο κατά 53%. Η ΑΒΑ-σπερμίνη προσδένεται ομοιοπολικά στις θέσεις 2249, 2439 και 2601. Το νουκλεοτίδιο U2249 είναι πολύ κοντά στην G2251 και G2252. Τα δυο τελευταία συνιστούν νουκλεοτίδια του Ρ- βρόγχου του 23S rrna, και κατέχουν σημαντικό ρόλο στην πρόσδεση του 3 -CCA άκρου του πεπτιδύλο trna στο κέντρο της ΡΤασης, δημιουργώντας Watson-Crick ζεύγη βάσεων με την C75 και C74 του trna, αντίστοιχα (Nissen et al., 2000; Samaha et al., 1995). Από την άλλη πλευρά, τα νουκλεοτίδια αυτά παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόσδεση της βλαστισιδίνης, όπως έδειξε κρυσταλλογραφική μελέτη (Hansen et al., 2003). Έτσι, υποθέτουμε ότι η σπερμίνη προσδενόμενη στην U2249 εκτείνεται ως την G2251 και G2252 θέση και επηρεάζει την

αλληλεπίδραση των δυο μορίων του αντιβιοτικού (βλαστισιδίνη Ι και ΙΙ) με τα ριβοσώματα, απευθείας ή δημιουργώντας αλλαγή τοπικής διαμόρφωσης. Η τελευταία εκδοχή φαίνεται λιγότερη πιθανή, διότι η ανάλυση αποτυπώματος της περιοχής δεν αποκάλυψε ισχυρή αλλαγή στην επιδεκτικότητα έναντι του DMS. Όσον αναφορά την Α2439, διάφορες πειραματικές προσεγγίσεις, όπως ανάλυση αποτυπώματος (Rodriguez-Fonseca et al., 1995) και μελέτες μεταλλάξεων (Triman, 1999) έχουν δείξει ότι το προεξέχον αυτό νουκλεοτίδιο στη δευτεροταγή δομή του 23S rrna καθώς και το γειτονικό του U2438, εμπλέκονται στην πρόσδεση των αμινοακυλ-αμινονουκλεοσιδίων, όπως η βλαστισιδίνη. Επίσης, τα νουκλεοτίδια αυτά είναι επιδεκτικά σε υδρόλυση από μεταλλικά ιόντα (Polacek and Barta, 1998) και πιθανόν δημιουργούν μια ισχυρά κατιονική κοιλότητα πρόσδεσης. Τέλος, κρυσταλλογραφική ανάλυση απεκάλυψε ότι η Ν-μεθυλ-γουανιδυλιωμένη προέκταση της βλαστισιδίνης προσδένεται και αλληλεπιδρά υδροφοβικά με τη βάση Α2439, δημιουργώντας παράλληλα δεσμούς υδρογόνου με το φωσφορικό σκελετό της βάσης Α2439 και Α2600. Ιδιαίτερα η τελευταία παρατήρηση, ενισχύει την υπόθεση ότι η ΑΒΑ-σπερμίνη, προσδενόμενη στις θέσεις Α2439 και C2601 επηρεάζει άμεσα την αλληλεπίδραση της βλαστισιδίνης με το ριβόσωμα. Ο συνδυασμός όλων των ευρημάτων υποστηρίζει την σπουδαιότητα που έχει το πολυαμινικό περιβάλλον και στις αλληλεπιδράσεις της βλαστισιδίνης με το ριβόσωμα και ταυτόχρονα ερμηνεύει το μηχανισμό, πρόσδεσης του αντιβιοτικού. 9.2 Μηχανισμός δράσης των μακρολιδίων και επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος Τυλοσίνη Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η τυλοσίνη προσδένεται στην περιοχή του τούνελ και δεν επιτρέπει στην πολυπεπτιδική αλυσίδα να εξέλθει, ενώ παράλληλα αναστέλλει τη δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού (Dinos and Kalpaxis, 2000; Hansen et al., 2002). Τα αποτέλεσμα της κινητικής ανάλυσης στην παρούσα μελέτη, επιβεβαιώνουν αυτή τη θεώρηση. Η παραγωγή προϊόντος ακολουθεί μια μη-γραμμική καμπύλη, που καταλήγει σε πλατώ. Η

αρχική κλίση και ο χρόνος που απαιτείται για τη μετάβαση στο πλατώ ποικίλλει ανάλογα με τη συγκέντρωση αναστολέα. Τα αποτελέσματα συνηγορούν στο ότι η τυλοσίνη συμπεριφέρεται ως βραδύς προσδενόμενος μη-αντιστρεπτός αναστολέας. Στην πραγματικότητα, μια πολύ μικρή αναγέννηση της ενεργότητας του συμπλόκου C, της τάξης 10-3 ανά λεπτό, ανιχνεύεται μετά από έκθεση του C*I συμπλόκου σε ρυθμιστικό διάλυμα (Πίνακας VΙΙ). Μεταβολές στο ιοντικό περιβάλλον έδειξαν να συνοδεύονται από αλλαγές στην αλληλεπίδραση της τυλοσίνης με το ριβόσωμα, αν και λόγω του μακρύ δισακχαρίτη που φέρει προς την πλευρά του τούνελ εξόδου, η τυλοσίνη φαίνεται πιο ανθεκτική στις μεταβολές αυτές σε σχέση με τα υπόλοιπα μακρολίδια. Μείωση της συγκέντρωσης των ιόντων Mg 2+ από 10 mm (Dinos and Kalpaxis, 2000; Poulsen et al., 2000) σε 4.5 mm (παρούσα μελέτη) οδήγησε σε αύξηση της αρχικής πρόσδεσης της τυλοσίνης κατά 30%. Αυτή η ενδυνάμωση της πρόσδεσης, που παρατηρείται και στα υπόλοιπα μακρολίδια (Πίνακας VΙΙ), μπορεί να δικαιολογηθεί υποθέτοντας ότι μείωση του κατιοντικού φορτίου προάγει την πρόσδεση του υδρόφοβου δακτυλίου τους στην περιοχή του τούνελ. Παρουσία πολυαμινών η αρχική πρόσδεση της τυλοσίνης αυξήθηκε ακόμα περισσότερο, σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις που είχαν γίνει για τη σπιραμυκίνη, ενός 16μελούς μακρολιδίου που παρουσιάζει τα ίδια δομικά χαρακτηριστικά (Petropoulos et al., 2004). Αντίθετα, τα υπόλοιπα μακρολίδια που στερούνται δισακχαρίτη στη θέση 5 έδειξαν μειωμένη ικανότητα πρόσδεσης υπό την επίδραση πολυαμινών, γεγονός που μας ωθεί να υποθέσουμε ότι η δράση των πολυαμινών στο αρχικό στάδιο πρόσδεσης σχετίζεται με τις αλληλεπιδράσεις του C5 δισακχαρίτη με το ριβόσωμα. Παρά το γεγονός ότι οι πολυαμίνες βελτιώνουν την αρχική πρόσδεση της τυλοσίνης, στη συνέχεια δυσχεραίνουν το στάδιο του ισομερισμού, εφόσον μειώνουν την k 6 και αυξάνουν την k 7. Αυτό υποδηλώνει ότι οι πολυαμίνες μειώνουν το εντροπικό κόστος της αρχικής πρόσδεσης της τυλοσίνης (CI), αλλά στη συνέχεια προκαλούν

αναστολή στο σχηματισμό του C*I, που αναιρεί την αρχικά εκδηλωμένη ενεργητική επίδραση. Το θετικό αποτέλεσμα των πολυαμινών στη δημιουργία του ενδιάμεσου συμπλόκου CI, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, πιθανόν σχετίζεται με την αλληλεπίδραση της C5-δισακχαριτικής προέκτασης στο ριβόσωμα. Παρόλο που αυτές οι αλληλεπιδράσεις είναι κυρίως υδροφοβικές, μυκαμινόζη και μυκαρόζη αλληλεπιδρούν με τις βάσεις Α2058 και G2505 δημιουργώντας δεσμούς υδρογόνου. Με ανάλυση αποτυπώματος δείχθηκε ότι η τυλοσίνη προστατεύει τις Α2572 και Α2439 από DMS τροποποίηση (Σχήμα 3.6). Οι βάσεις αυτές εντοπίζονται στερεοχημικά πλησίον του καταλυτικού κέντρου και πιθανότατα αλληλεπιδρά με τον C5-δισακχαρίτη. Το γεγονός ότι η ΑΒΑ-σπερμίνη σταυροσυνδέεται στις U2506, Α2572 και Α2439 (Σχήμα 8.14) εγείρει δικαιολογημένες υποψίες ότι οι πολυαμίνες προσδενόμενες στην περιοχή αυτή διευκολύνουν την πρόσδεση του C5-δισακχαρίτη στο ριβόσωμα. Από την άλλη πλευρά, η αρνητική επίδραση των πολυαμινών στη σταθεροποίηση του αντιβιοτικού στην τελική του θέση (C*Ι) μπορεί να σχετίζεται με καταστολή των υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων του λακτονικού δακτυλίου των μακρολιδίων με το τοίχωμα του τούνελ εξόδου. Η παρουσία ενός υδροφιλικού μορίου, όπως η σπερμίνη ή σπερμιδίνη, στην καρδιά αυτής της υδροφοβικής περιοχής θα μπορούσε να αποσταθεροποιήσει την πρόσδεση. Οργανισμοί, όπως το αρχαιοβακτήριο H. marismortui, οι οποίοι έχουν μια υδρόφιλη ομάδα στο κέντρο αυτής της περιοχής, είναι πολύ πιο ανθεκτικοί στα μακρολίδια (Tu et al., 2005; Vester and Douthwaite, 2001). Σημαντικό ρόλο φαίνεται επίσης να παίζουν οι πολυαμίνες που προσδένονται γύρω από την Α2451. Λόγω γειτνίασης με την θέση Α2062, είναι δυνατόν να επηρεάσουν τη σταθερότητα του ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ της αιθυλαλδεΰδης στη θέση C6 του δακτυλίου και της Ν6 της Α2062. Αυτός ο δεσμός είναι αντιστρεπτός και θα μπορούσε να αμινολυθεί από τις εγγύς προσκείμενες πολυαμίνες. Παρόμοιες αλλαγές στην πρόσδεση της τυλοσίνης έχει δειχθεί από άλλους ερευνητές να επιφέρει η μετάλλαξη της

βάσης Α2062 σε G στον Streptococcus pneumoniae. Τέτοια μεταλλαγμένα στελέχη εμφανίζουν ανθεκτικότητα έναντι όλων των 16μελών μακρολιδίων (Depardieu and Courvalin, 2001). Ανάλυση αποτυπώματος επιβεβαίωσε την κινητική συμπεριφορά της τυλοσίνης καθώς και το ρόλο των πολυαμινών. Οι μεταβολές στην επιδεκτικότητα των βάσεων έναντι του DMS έδειξαν ότι το μόριο της τυλοσίνης προσεγγίζει αρχικά την είσοδο του τούνελ στην περιοχή V του 23S rrna και στη συνέχεια, στρέφεται προς το εσωτερικό του αλληλεπιδρώντας με βάσεις της περιοχής ΙΙ του 23S rrna. Παρουσία σπερμίνης ελαττώνεται η προστασία των περισσότερων θέσεων πρόσδεσης, με αποτέλεσμα να μειώνονται οι δυνάμεις συγκράτησης της τυλοσίνης στο ριβόσωμα (K i * (+SPM) > K i * (-SPM) ). Συγκεκριμένα, καταργείται ο ομοιοπολικός δεσμός με τη βάση Α2062, μειώνεται η πρόσδεση του υδροφοβικού δακτυλίου με το ριβοσωματικό τούνελ, ενώ αυξάνεται η πρόσδεση στην περιοχή ΙΙ (Α752) και στην Α2572, δηλαδή στις βάσεις που σχετίζονται με τους σακχαριτικούς υποκαταστάτες. Η σπερμίνη βελτιώνει την αλληλεπίδραση της τυλοσίνης με τις βάσεις U2506 και στο Α2572 στο CI σύμπλοκο και ίσως εκεί οφείλεται το κινητικό αποτέλεσμα K i(-spm) > K i(+spm). Αξίζει να σημειωθεί ότι σε χαμηλές συγκεντρώσεις Mg 2+ και απουσία πολυαμινών, βρέθηκε το νουκλεοτίδιο C2611 να αντιδρά με DMS, όχι όμως σε αυξημένο κατιοντικό περιβάλλον. Το γεγονός αυτό μας προτρέπει να υποθέσουμε ότι το ζευγάρωμα των βάσεων C2611-G2057 σε χαμηλή αλατότητα δεν είναι εφικτό, ενώ αποκαθίσταται σε κατάλληλο ιοντικό περιβάλλον (10 mm Mg 2+ ή 4.5 mm παρουσία πολυαμινών). Η ακεραιότητα του ζεύγους βάσεων C2611-G2057 φαίνεται να μην επηρεάζει δραστικά την πρόσδεση της τυλοσίνης, γεγονός που έχει πιστοποιηθεί και από άλλες μελέτες (Pfister et al., 2005). Χαρακτηριστικό της επίδρασης των πολυαμινών είναι ότι σε συνθήκες χωρίς προεπώαση, προκαλείται μια διαταραχή στην περιοχή της υδροφοβικής πρόσδεσης (ελάττωση της πρόσδεσης κατά 25%), αλλά βελτιώνεται σημαντικά η πρόσδεση στο U2506 και Α2572 (αύξηση της πρόσδεσης >50%), γεγονός που καθιστά την τιμή K i μικρότερη παρουσία

πολυαμινών. Αντίθετα, με προεπώαση οι πολυαμίνες προκαλούν μεγαλύτερη διαταραχή στην περιοχή Α2058 (ελάττωση της πρόσδεσης κατά 75%) και πιθανότατα αυτή είναι η αιτία που προκαλεί ελάττωση της συγγένειας του αντιβιοτικού προς το ριβόσωμα. Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα για την τυλοσίνη, προτείνουμε ότι το μόριο ακολουθεί βαθμιαία πρόσδεση στο ριβόσωμα. Αρχικά, προσδένεται ο δισακχαρίτης στην περιοχή V και στη συνέχεια, ο υδρόφοβος λακτονικός δακτύλιος του αντιβιοτικού και ο μονοσακχαρίτης του στρέφονται προς το εσωτερικό του τούνελ. Παρουσία πολυαμινών αυξάνεται σημαντικά η αρχική πρόσδεση του δισακχαρίτη, αλλά ο υδρόφοβος δακτύλιος δεν εγκαθίσταται «αναπαυτικά» στη θέση του γεγονός που δυσχεραίνει το σχηματισμό του συμπλόκου C*I. Ερυθρομυκίνη Η ερυθρομυκίνη, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες και κρυσταλλογραφικά δεδομένα, δεν αναστέλλει τη δημιουργία πεπτιδικού δεσμού. Συνεπώς, για την κινητική μελέτη της πρόσδεσης του αντιβιοτικού στο ριβόσωμα, έγιναν πειράματα συναγωνισμού μεταξύ της ερυθρομυκίνη και της τυλοσίνης για κοινές θέσεις πρόσδεσης στο ριβόσωμα. Η κινητική ανάλυση ολοκληρώθηκε μέσω τριών σειρών πειραμάτων. Στην πρώτη σειρά, το σύμπλοκο C αντέδρασε με μείγμα που περιείχε τυλοσίνη σε σταθερή συγκέντρωση και ερυθρομυκίνη σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις. Τα πειράματα αυτά έδωσαν τη δυνατότητα υπολογισμού της σταθεράς αρχικής πρόσδεσης του μορίου (K er ). Στη δεύτερη σειρά πειραμάτων έγινε προεπώαση του αντιβιοτικού με το ριβόσωμα πριν τη προσθήκη τυλοσίνης. Με τη βοήθεια αυτών των πειραμάτων υπολογίστηκε η συνολική σταθερά πρόσδεσης (K er *) που αντιστοιχεί στο συνολικό φαινόμενο πρόσδεσης. Τέλος, στην τρίτη σειρά πειραμάτων, προσδιορίστηκε η σταθερά αναγέννησης (k 7 ) του C από C*I. Οι τιμές των κινητικών παραμέτρων επιβεβαίωσαν ότι η ερυθρομυκίνη όπως και η τυλοσίνη, συμπεριφέρεται ως αναστολέας βραδείας πρόσδεσης που ακολουθεί μηχανισμό δυο σταδίων.

Παρουσία πολυαμινών παρατηρήθηκε μείωση στις τιμές των σταθερών (Πίνακας VII, σελ. 123) που ευνοούν την πρόσδεση, γεγονός που οδήγησε σε αύξηση της τιμής της συνολικής σταθεράς διάστασης (Ki*) κατά 10 φορές. Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκονται σε πλήρη συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις (Teraoka and Tanaka, 1973b). Συγκρίνοντας τα δεδομένα της παρούσας μελέτης με εκείνα που έχουν προκύψει σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ιόντων Mg 2+ (10 mm Mg 2+, 100 mm NH 4+ ) (Dinos and Kalpaxis, 2000), παρατηρούμε ότι αύξηση της συγκέντρωσης των ιόντων Mg 2+ προκαλεί μείωση της πρόσδεσης, αλλά σε μικρότερο βαθμό από αυτή που προκλήθηκε παρουσία πολυαμινών. Συνεπώς, αντιφατικές τιμές που έχουν δημοσιευτεί και αφορούν την πρόσδεση της ερυθρομυκίνης (Lovmar et al., 2004), μπορούν να ερμηνευτούν λαμβάνοντας υπόψιν το ιοντικό περιβάλλον και την ενεργότητά των εκάστοτε χρησιμοποιούμενων ριβοσωμάτων. Συγκρίνοντας την επίδραση των πολυαμινών στην ικανότητα της ερυθρομυκίνης και τυλοσίνης να προσδένονται στο ριβόσωμα, παρατηρούμε ότι η επίδραση αυτή είναι ισχυρότερη για το πρώτο αντιβιοτικό. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στο ότι επηρεάζονται δυσμενώς υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις του λακτονικού δακτυλίου της ερυθρομυκίνης με το τούνελ εξόδου, χωρίς να ενισχύονται οι υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις της C5- δισακχαριστικής προέκτασης, αφού τέτοιες προεκτάσεις που σταθεροποιούν την πρόσδεση λείπουν στο μόριο της ερυθρομυκίνης (Σχήμα 8.19). Πειράματα ανάλυσης αποτυπώματος επιβεβαίωσαν τις υποθέσεις μας για την επίδραση των πολυαμινών και παράλληλα αποκάλυψαν νέα στοιχεία για το μηχανισμό της δράσης της. Συγκεκριμένα, μετά από προεπώαση του αντιβιοτικού με το ριβόσωμα παρατηρήθηκε μείωση της πρόσδεσης του αντιβιοτικού στις αρχικές θέσεις πρόσδεσής του (Α2058, Α2059 και Α2060), ενώ ισχυροποιήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις με την περιοχή ΙΙ του 23S rrna (αύξηση της επιδεκτικότητας της βάσεως Α752 έναντι αντιδραστηρίου DMS και αύξηση της προστασίας της βάσης Α788). Οι παρατηρήσεις αυτές σε συνδυασμό με κρυσταλλογραφικά δεδομένα μας οδήγησαν στην παραδοχή του ακόλουθου υποθετικού μηχανισμού πρόσδεσης της ερυθρομυκίνης: Το

μόριο της ερυθρομυκίνης προσδένεται αρχικά με την υδρόφοβη πλευρά του λακτονικού δακτυλίου της μέρος του δακτυλίου στην είσοδο του τούνελ εξόδου. Στη συνέχεια, εισχωρεί πιο βαθιά προς το τούνελ ενισχύοντας τις αλληλεπιδράσεις με νουκλεοτίδια της περιοχής ΙΙ. Ο μηχανισμός αυτός θυμίζει το αντίστοιχο μοντέλο πρόσδεσης της τυλοσίνης, με τη διαφορά ότι στην προκειμένη περίπτωση οι αλλαγές στο «αποτύπωμα» της ερυθρομυκίνης από το CI στo C*I σύμπλοκο ήταν εντονότερες, πιθανότατα λόγω μικρότερης ελεύθερης ενέργεια πρόσδεσης που έχει το μόριο. Σχήμα 8.19: Αλληλεπιδράσεις της ερυθρομυκίνης με νουκλεοτίδια της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Η ερυθρομυκίνη στερείται C5-δισακχαριτικής προέκτασης Η μείωση γενικώς της προστασίας των βάσεων του 23S rrna από την ερυθρομυκίνη, που προκαλείται από την παρουσία της σπερμίνης, συμφωνεί με το κινητικό αποτέλεσμα ότι (K er * (-SPM) <K er * (+SPM) ). Μοναδική εξαίρεση αποτελούν οι αλληλεπιδράσεις της βάσεως Α752 που ενισχύονται. Το τελευταίο γεγονός έδειξε για άλλη μια φορά ότι οι πολυαμίνες διευκολύνουν τη μετάβαση των μακρολιδίων σε μια πιο σταθερή θέση πρόσδεσης εντός του υδρόφοβου τούνελ. Αζιθρομυκίνη Η αζιθρομυκίνη μοιάζει δομικά με το μόριο της ερυθρομυκίνης, αλλά έχει ενσωματωμένο στο λακτονικό της δακτύλιο ένα υδρόφιλο άτομο, το οποίο φαίνεται να έχει μεγάλη σημασία στην πρόσδεση του μορίου στο ριβόσωμα, δεδομένου ότι η ισχύς πρόσδεσης της αζιθρομυκίνης είναι τουλάχιστον πέντε φορές μεγαλύτερη από εκείνη της μητρικής ένωσης (Dinos et al., 2001). Στο D. radiodurans βρέθηκαν δυο μόρια αζιθρομυκίνης

προσδεδεμένα ανά ριβόσωμα, το οποίο έρχεται σε αντίθεση με μελέτες στο αρχαιοβακτήριο H. marismortui, στο οποίο βρέθηκε να προσδένεται μόνο ένα (Σχήμα 8.20). Α Β Σχήμα 8.20: (Α) Πρόσδεση ενός μορίου αζιθρομυκίνης στο ριβόσωμα του αρχαιοβακτηρίου H. marismortui (Hansen et al., 2002). (B) Πρόσδεση δυο μορίων αζιθρομυκίνης στο ριβόσωμα του βακτηρίου D. radiodurans (Schlunzen et al., 2003). Μια πιθανή ερμηνεία για αυτή την αντίφαση δίνεται στο άρθρο ανασκόπησης των Wilson et al. (2005). Οι συγγραφείς αυτού του άρθρου υποθέτουν ότι δυο αιτίες μεταξύ άλλων μπορεί να έχουν προκαλέσει αυτή τη διαφοροποίηση των ευρημάτων: α) το αυξημένο ιοντικό περιβάλλον που χρησιμοποιήθηκε κατά την κρυστάλλωση των ριβοσωμάτων από H. marismortui και β) η υψηλή συγκέντρωση αντιβιοτικού που χρησιμοποιήθηκε κατά την κρυστάλλωση ριβοσωμάτων από D. radiodurans. Βασιζόμενοι σε αυτήν την υπόθεση ελέγξαμε με ενδελεχή κινητική ανάλυση τον αριθμό των μορίων αζιθρομυκίνης που προσδένονται ανά ριβόσωμα σε διάφορες ιοντικές συνθήκες, καθώς και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αντιβιοτικού. Η κινητική ανάλυση έδειξε ότι το αντιβιοτικό αυτό, όπως και τα προηγούμενα, συμπεριφέρεται ως αναστολέας βραδείας πρόσδεσης, που ακολουθεί