Μοριακή Αναγνώριση Ηλίας Ηλιόπουλος Εργαστήριο Γενετικής, Τμήμα Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών 1
Μοριακή Αναγνώριση Με τον όρο μοριακή αναγνώριση περιγράφουμε την αλληλεπίδραση μεταξύ δύο ή περισσότερων (βιο)μορίων. Η αναγνώριση βασίζεται σε ένα σύνολο στοιχειωδών αλληλεπιδράσεων που δημιουργούν ένα πολύπλοκο σύστημα, όπως μεταξύ ενζύμου και υποστρώματος, ορμόνης και υποδοχέα, αντιγόνου και αντισώματος, πρωτεΐνης και νουκλεϊνικού οξέος. 2
Μοριακή Αναγνώριση Την μοριακή αναγνώριση μπορούμε να την προσεγγίσουμε με δύο διαφορετικές κλίμακες μέτρησης: Η κλίμακα του χρόνου. Για να μιλάμε για αναγνώριση μεταξύ μορίων, αυτά πρέπει να αλληλεπιδρούν ένα χρονικό διάστημα μεγαλύτερο από το χρόνο επαφής κατά την δυναμική σύγκρουση. Ο χρόνος αυτός είναι της τάξης των μικροδευτερολέπτων (μsec). Η κλίμακα του χώρου. Τα μόρια που αλληλεπιδρούν αποτελούν ένα σύμπλοκο στο χώρο αν και συντηρούν την αυτοδυναμία τους ακόμα και όταν συμμετέχουν στην κατάλυση. 3
Συνάφεια και Εξειδίκευση Εξειδίκευση ενός μορίου (specificity) μπορεί να θεωρηθεί η ικανότητα ενός μορίου να αναγνωρίζει ή να αλληλεπιδρά με κάποιο άλλο από μία ομάδα μορίων. Για παράδειγμα μία φαρμακευτική ουσία αλληλεπιδρά με ένα υποδοχέα καλλίτερα από μία ομάδα παραγώγων χημικών ενώσεων ή ένα αντίσωμα αναγνωρίζει ένα αντιγόνο από όλα τα αντισώματα που υπάρχουν στον οργανισμό. Συνάφεια (affinity) ονομάζουμε την δυνατότητα δύο μορίων να αναγνωρίζονται και να αλληλεπιδρούν. 4
Σταθερές σύνδεσης και αποχωρισμού. Η συνάφεια μεταξύ δύο βιομορίων Ρ και Α μετρείται από την σταθερά σύνδεσης για την αντίδραση αλληλεπίδρασης στην ισορροπία: Όσο μεγαλύτερη είναι η η τιμή της σταθεράς σύνδεσης τόσο μεγαλύτερη είναι η συνάφεια μεταξύ των δύο μορίων. 5
Σταθερά αποχωρισμού Σταθερά αποχωρισμού είναι η αντίστροφη της σταθεράς σύνδεσης και εκφράζεται σε μονάδες συγκέντρωσης. Σε συγκεντρώσεις του υποστρώματος κάτω από την Kd δεν υπάρχει αντίδραση σύνδεσης. Σε συγκεντρώσεις ίσες με Kd το 50% των βιομορίων έχουν συνδεθεί με το υπόστρωμα. Εάν [Α]=1 και [Β] =1, [ΑΒ]=10 ( Ένα στα δέκα αποχωρίζεται) τότε K d =10-1, [ΑΒ]=10 3 ( Ένα στα χίλια αποχωρίζεται) τότε K d =10-3 (mμ), [AB]=10 6 ( Ένα στο εκατομμύριο αποχ.) τότε K d =10-6 (μμ). Πολλές αλληλεπιδράσεις που δεν είναι πολύ εξειδικευμένες έχουν Kd στην περιοχή των mm (π.χ. πολλές μη εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις πρωτεινών-dna) ενώ ένα φάρμακο χωρίς παρενέργειες θα έχει ως προς τον υποδοχέα που προσδένεται Kd στην περιοχή των μμ. 6
Εξιδείκευση της δέσμευσης Η υπεροχή της δέσμευσης ενός βιομορίου-υποστρώματος από μία πρωτεΐνη έναντι ενός άλλου στον ίδιο χώρο δέσμευσης εξαρτάται από την σχετική τους συνάφεια. Εάν τα δύο βιομόρια βρίσκονται στην ίδια συγκέντρωση (π.χ. 10-5 Μ) αλλά έχουν διαφορετικά Kd (π.χ. 10-3 Μ και 10-6 Μ) τότε μόνο το βιομόριο με την χαμηλότερη Kd θα δεσμεύεται σημαντικά. Αν και τα δύο βιομόρια βρίσκονται σε συγκέντρωση 10-2 τότε το βιομόριο με την μεγαλύτερη συνάφεια θα δεσμεύεται σε μεγαλύτερο ποσοστό. 7
Ενέργεια σύνδεσης Η ενέργεια σύνδεσης δίνεται από τον παραπάνω τύπο όπου R= 8 Joule Κ -1 mol -1 Έτσι για Τ=300 και Κ α =10 6 ΔG=-331 kjmol ΔG310 kjmol -1 17.80 11.86 5.93-5.93-11.86-17.80 Κα 10-3 10-2 10-1 1 10 10 2 Για σύγκριση: η θερμική ενέργεια 2.5 KJmol -1 αντιστοιχεί σε Κα=0.37 η ενέργεια ενός απλού δεσμού -400KJmol-1 αντιστοιχεί σε Κα=10 67 8
Διαφορά ελεύθερης ενέργειας Η διαφορά της ελεύθερης ενέργειας μεταξύ της πρωτεΐνης χωρίς υπόστρωμα και της πρωτεΐνης με υπόστρωμα δίνεται ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του ελεύθερου υποστρώματος: 9
Σχετικές συνάφειες Η σχετική συνάφεια δύο συγγενών υποστρωμάτων Α και Β για την ίδια πρωτεΐνη μπορεί να υπολογιστεί από τον τύπο: που συνδέει την διαφορά της ελεύθερης ενέργειας σύνδεσης με τις σταθερές σύνδεσης και αποχωρισμού. 10
Η συνάφεια σε σύνθετες αλληλεπιδράσεις Δεν υπάρχει μία αθροιστική σχέση μεταξύ της ενέργειας σύνδεσης και των σταθερών σύνδεσης και αποχωρισμού. 11
Η μη αθροιστική φύση της συνάφειας Ο λόγος της μη αθροιστικής φύσης των σταθερών συνάφειας φαίνεται αν αναλύσουμε την αντίδραση σε δύο μέρη. 12
Έτσι η συμβολή στην ελεύθερη ενέργεια σύνδεσης του ατόμου θείου στη βιοτίνη μπορεί να υπολογιστεί από τις σχετικές συγγένειες των δύο πρώτων βιομορίων που συνδέονται στην αβιδίνη. 13
Συμμετοχές διαφόρων χημικών ομάδων στην συνάφεια υποστρωμάτων σε πρωτεΐνες 14
Κινητικά στοιχεία της αναγνώρισης Ο ρυθμός δέσμευσης και αποδέσμευσης ενός υποστρώματος ορίζεται από τις ανάλογες σταθερές: Ο λόγος τους ορίζει την σταθερά σύνδεσης Η ka δίνει ένα μέτρο του μοριακού βάρους του υποστρώματος και διαφοροποιείται πολύ λίγο μεταξύ συστημάτων παρεμφερούς μοριακού βάρους. Ο χρόνος ημιζωής του συμπλόκου δίνεται από το τύπο: t1/2= 0.7/kd Παράδειγμα: Η αλλαγή του ph από 7.5 σε 4 για ένα αντίσωμα τροποποιεί την σταθερά σύνδεσης Κα από 1.8*10 9 Μ -1 σε 6*10 5 Μ -1. Η αλλαγή κατά 3000 στην Κα οφείλεται στο ότι η ka μειώνεται κατά 1.7 και η kd αυξάνει κατά 1600. 15
Η σχέση συγγένειας και εξειδίκευσης Η ελεύθερη ενέργεια του συμπλόκου ορίζεται : G0 = ΔG01 + ΔG02 + ΔG03 <0 >0 <0 >0 η εντροπία της η ενέργεια η ενέργεια συμπλοκοποίησης αλληλεπίδρασης παραμόρφωσης Η σύνδεση συγγένειας και εξειδίκευσης δεν μπορεί να ορισθεί ποσοτικά. Μία υψηλή συγγένεια επιτρέπει μεγαλύτερες διαφοροποιήσεις στον βαθμό συγγένειας και με αυτό τον τρόπο σύνδεση συγγένειας και εξειδίκευσης. Ο ενεργειακός όρος που συμμετέχει περισσότερο στην εξειδίκευση είναι ο ΔG02 δηλαδή ο όρος αλληλεπίδρασης. 16
Παράδειγμα Μοριακής Αναγνώρισης Οι πρωτεάσες της σερίνης (τρυψίνη, χυμοτρυψίνη, ελαστάση κλπ. είναι ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα μοριακής αναγνώρισης. 17
Οι πρωτεάσες της σερίνης Η πρόσδεση του υποστρώματος (πολυπεπτιδίου) στις πρωτεάσες της σερίνης. Με κόκκινη γραμμοσκίαση υποδηλώνονται οι υδρογονικοί δεσμοί μεταξύ πρωτεΐνης και υποστρώματος. 18
Το ενεργό κέντρο Υπάρχει μία διαφοροποίηση στην υδρόφοβη εσοχή μεταξύ των ποικίλων πρωτεασών της σερίνης. 19
Λεπτομέρειες στην διαφοροποίηση των ενεργών κέντρων (Α) της α-χυμοθρυψίνης και (Β) ελαστάσης 20
Η επαγωγή του φορτίου και η κατάλυση της αντίδρασης. 21
22
Τρόποι σταθεροποίησης εγκλεισμένων ιοντικών φορτίων Οι παράγοντες που κατευθύνουν τις αλληλεπιδράσεις των εγκλεισμένων ιοντικών φορτίων είναι: Η ύπαρξη υδρογονικών δεσμών εφόσον δεν υπάρχουν αντισταθμιστικά φορτία, ιόντα ή μόρια νερού. Οι υδρογονικοί δεσμοί δημιουργούνται κυρίως με C=O και ΝΗ των πεπτιδικών ομάδων. Ο εγκλεισμός του φορτίου της Αργινίνης151 της πρωτεΐνης που δεσμεύει αραβινόζη. 23
Τρόποι σταθεροποίησης εγκλεισμένων ιοντικών φορτίων Η δέσμευση του επαμφοτερίζοντος ιόντος (zwitterion) λευκίνης από την πρωτεΐνη που την δεσμεύει, με την χρήση υδρογονικών δεσμών. 24
Τρόποι σταθεροποίησης εγκλεισμένων ιοντικών φορτίων Τα αλληλεπιδρώντα πεπτίδια συμμετέχουν σε ομάδες υδρογονικών δεσμών με την ίδια κατεύθυνση (όπως αυτοί των α-ελίκων). Έτσι δημιουργείται ένα μερικό αντισταθμιστικό φορτίο που εξουδετερώνει το ιοντικό φορτίο. Ο εγκλεισμός της ομάδας SO4= από την πρωτεΐνη που την δεσμεύει χωρίς την χρήση ιοντικών φορτίων αλλά με την χρήση επαγωγικών φορτίων από 4 α-έλικες με κατεύθυνση την περιοχή δέσμευσης. 25
Εντροπικοί όροι στην δημιουργία συμπλόκων Αυτοί περιλαμβάνουν αλλαγές σε βαθμούς ελευθερίας μετατόπισης και περιστροφής, αλλαγές στην ευελιξία στερεοδομής και σταθερές ταλάντωσης όπως και καταστάσεις τάξης-αταξίας στο περιβάλλον διαλύτη ( υδρόφοβη αλληλεπίδραση). Όταν δύο μόρια συνενώνονται για να δημιουργήσουν ένα σύμπλοκο οι τρεις βαθμοί ελευθερίας μετατόπισης χάνονται. Αυτό είναι ισοδύναμο σε ΤΔS περίπου -15Kcal/mol πού έρχεται σε αντίθεση με την δημιουργία του συμπλόκου. Νέες σταθερές ταλάντωσης στο σύμπλοκο μπορεί αντίθετα να προσφέρουν 1 Kcal/mol περίπου. Όταν δύο μη πολικές (υδρόφοβες) επιφάνειες μορίων έρχονται σε επαφή και διώχνουν το νερό (ή άλλο πολικό διαλύτη) που τους περιβάλλει, τα μόρια του νερού που αλληλεπιδρούσαν με αυτές τις επιφάνειες είναι τώρα μέρος του γενικότερου διαλύτη και έχουν μεγαλύτερη αταξία. Έτσι η προσέγγιση δύο υδρόφοβων επιφανειών προσφέρει ένα θετικό εντροπικό όρο πού υπολογίζεται σε 20 cal/mole ανά τετραγωνικό Å υδρόφοβης επιφάνειας που απομακρύνεται από τον διαλύτη. Ένας αρωματικός δακτύλιος έχει εμβαδόν περίπου 100 τετρ. Å ήτοι η απομάκρυνση του από τον διαλύτη προσφέρει -2 kcal/mol. Επομένως μία συνολική ελεύθερη ενέργεια σύνδεσης -5 kcal/mol μπορεί εύκολα να προέρχεται από τον συνδυασμό ενθαλπικών (ΔG) και εντροπικών (TΔS) όπως με διαφορετικά πρόσημα. 26
Η σημασία της σωστής στερεοδομής, τοποθέτησης και διεύθυνσης του υποστρώματος. Λάβετε υπ' όψη σας την παρακάτω απλή περίπτωση από την οργανική χημεία. Υπάρχει μια τεράστια διαφορά στον ρυθμό κυκλοποίησης μεταξύ Α και Β (ΚΒ/ΚΑ=0.5x10 11 ). Αυτό συμβαίνει γιατί στο Β οι αντιδρούσες ομάδες που παρεμποδίζονται από τούς περιορισμούς στους βαθμούς ελευθερίας (περιστροφές γύρω από τους απλούς ομοιοπολικούς δεσμούς) έχουν ενεργειακά την καλλίτερη θέση κοντά στο σημείο που γίνεται η κυκλοποίηση. Στην περίπτωση του Α οι θέσεις αυτές είναι ενεργειακά ισοδύναμες με εκατομμύρια άλλες. 27
Μιά αντίστοιχη περίπτωση από την ενζυμική δράση της χυμοθρυψίνης και την διάσπαση του ακετυλιομένου συμπλόκου. Δεδομένα για το βήμα της διάσπασης του συμπλόκου για μερικά ανάλογα του υποστρώματος μας δίνουν τους παρακάτω ρυθμούς διάσπασης. 28
Βαθμοί Μοριακής Αναγνώρισης- Αναγνώριση Υψηλής Πιστότητας Οι πρωτεάσες της σερίνης είναι ένα παράδειγμα ενζύμων με καλλίτερη από τον μέσο βαθμό αναγνώρισης σε σχέση με άλλα ένζυμα. Ένα άλλο τέτοιο παράδειγμα είναι η αφυδρογονάση της αλκοόλης που δρα μόνο σε αλκοόλες με προτίμηση την αιθανόλη αλλά μπορεί και να δρα σε άλλες αλκοόλες με μεγαλύτερο μήκος αλλά με χαμηλότερη απόδοση. 29
Υπάρχουν όμως παραδείγματα όπου απαιτείται πολύ υψηλότερη πιστότητα. Τέτοιες περιπτώσεις περιλαμβάνουν συστήματα αλυσιδωτών αντιδράσεων με ένζυμα όπως αυτό της πήξεως του αίματος και των πεπτικών ενζύμων. Στην περίπτωση των τελευταίων η θρυψίνη ενεργοποιεί τα προένζυμα των άλλων πρωτεασών για την δημιουργία χυμοθρυψίνης, καρβοξυπεπτιδάσης, ελαστάσης και φωσφολιπάσης. Και η θρυψίνη όμως παράγεται σε μορφή προενζύμου του θρυψινογόνου. Ο ενεργοποιητής του θρυψινογόνου είναι η εντεροπεπτιδάση που βρίσκεται στην επιφανειακή μεμβράνη των επιθηλίων κυττάρων στο στομάχι. Αυτό το ένζυμο δεν υδρολύει κάθε πεπτιδικό δεσμό παρά μόνο αυτούς που ακολουθούν την αμινοξική ακολουθία ασπαρτικό-ασπαρτικό-ασπαρτικό-ασπαρτικό-λυσίνη όπως τον πεπτιδικό δεσμό λυσίνη6-ισολευκίνη 7 το θρυψινογόνου. Επειδή η πιθανότητα του να παρατηρηθεί αυτή η ακολουθία είναι μικρότερη από 20 5 γίνεται αντιληπτή η πιστότητα της δράσης της εντεροπεπτιδάσης και της αλυσιδωτής αντίδρασης δημιουργίας πεπτιδικών ενζύμων. 30
Παράδειγμα εξειδικευμένης αναγνώρισης Μια κοινή περίπτωση εξαιρετικά υψηλής εξειδίκευσης ενζύμων είναι αυτών που αναγνωρίζουν τα μόρια trna. Για κάθε αμινοξύ υπάρχει και ένα trna. Το μόριο του trna έχει μία περιοχή του αναγνωρίζει τον κώδικα του mrna (το αντικωδικόνιο) και μία περιοχή που προσδένεται 31 το αμινοξύ.
Για να κατανοήσουμε το πρόβλημα της αναγνώρισης παίρνουμε το ένζυμο trna συνθετάση που αναγνωρίζει την αλανίνη. Η διαφορά μεταξύ αλανίνης και γλυκίνης είναι ένα μεθύλιο. Αυτό ενεργειακά σημαίνει 15kJ ενέργεια σύνδεσης που αντιστοιχεί περίπου σε 100-200 Μ -1 διαφορά στην σταθερά σύνδεσης. Είναι ικανή αυτή η διαφορά για την σύνθεση πρωτεϊνών; 32
Μία τυπική πρωτεΐνη του E.coli περιέχει περίπου 1000 αμινοξέα. Χωρίς έναν εξειδικευμένο μηχανισμό με 100-200 διαφορά στην σταθερά σύνδεσης θα έχουμε 10 έως 100 λάθη ανά πρωτεΐνη. Στις 3000 πρωτεΐνες του βακτηρίου ανά γενεά όπου μία γλυκίνη θα αντικαθιστά μια αλανίνη, μία αλανίνη θα αντικαθιστά μια βαλίνη, μία σερίνη θα αντικαθιστά μία θρεονίνη, μία βαλίνη θα αντικαθιστά μια ισολευκίνη τα λάθη θα συσσωρεύονται σε μεγάλο βαθμό. Στην πραγματικότητα όμως μόλις 1 στα 10.000 αμινοξέα είναι λάθος στην σύνθεση πρωτεϊνών στο βακτήριο E.coli. Αντίστοιχα στην μεταγραφή του DNA είναι γνωστός ένας ρυθμός λαθών της τάξεως 10-8 -10-10 ενώ ενεργειακοί υπολογισμοί μας δίνουν μόλις 10-4 -10-5. 33
Η σύνδεση του αμινοξέος στο trna από την trna συνθετάση 34
Η περίπτωση της trna συνθετάσης Υπάρχει ένα διαφορετικό trna για κάθε αμινοξύ. Για κάθε όμως αμινοξύ υπάρχει και ένα ένζυμο η αμινοξική trna συνθετάση που συνδέει το αμινοξύ στο trna. Αυτό που δεν πρέπει να συμβεί είναι να τοποθετηθεί το λάθος αμινοξύ στο t-rna και δι αυτού στην συντιθέμενη πρωτεϊνική ακολουθία. Η σύνδεση του αμινοξέος στο t-rna είναι μία αντίδραση δύο βημάτων. 35
Η επιλογή του σωστού αμινοξέος Ei + i + ATP ==> Ei.i-AMP + PPi Ei.i-AMP + trnai ==> i-trnai + AMP + Ei Το ένζυμο θα συνδέσει και λάθος αμινοξέα σύμφωνα με την αντίδραση Ei + j + ATP ==> Ei.j-AMP + PPi αλλά η αντίδραση με το trnai για την δημιουργία του συμπλόκου j-trnai δεν σχηματίζεται. Ei.j-AMP + trnai ==> j + trnai + AMP + Ei Το ότι η τελευταία αντίδραση δεν πραγματοποιείται οφείλεται στο ότι η σύνδεση του trna με το ένζυμο τροποποιεί την στερεοδομή του ενζύμου ετσι ώστε η υδρόλυση του λάθους αμινοξέος να γίνεται πολύ πιο εύκολα από αυτό του σωστού με την χρήση στερεοχημικής παρεμπόδισης. 36
Η διπλή δράση της trna συνθετάσης της βαλίνης Παράλληλα τα λάθος συνδεδεμένα i-trnaj σύμπλοκα υδρολύονται από τα ίδια ένζυμα που διαθέτουν και άλλες περιοχές πρόσδεσης. Το φαινόμενο αυτό τού διπλού ελέγχου αυξάνει την πιστότητα της πρωτεϊνοσύνθεσης στους ρυθμούς που αναφέρθηκαν προηγούμενα. Στην περίπτωση ισοστερικών αμινοξέων, όπως βαλίνης και θρεονίνης η δημιουργία ενός υδρογονικού δεσμού αντικαθιστά τις στερικές αλληλεπιδράσεις και αυξάνει τον ρυθμό υδρόλυσης. 37
Ρυθμοί δημιουργίας συμπλόκου trna συνθετάσης και trna 38