Η ζωή κοντά στο σηµείο βρασµού του νερού Αναστασία Βοργιά Φοιτήτρια Φαρµακευτικού 2010 Από ανθρωποκεντρική άποψη, περιβάλλοντα εχθρικά προς τον άνθρωπο, παρουσιάζονται ως ακραία. Σε αυτά τα περιβάλλοντα περιλαµβάνονται οι θερµές πηγές, τα παγωµένα νερά, τα όξινα ή αλκαλικά νερά και οι µεγάλες πιέσεις. Οι οργανισµοί που επιβιώνουν, λοιπόν, σε τέτοιες ακραίες συνθήκες (extreme conditions) ονοµάζονται ακραιόφιλοι (extremophiles). Οι ακραιόφιλοι οργανισµοί προέρχονται από τους προκαρυώτες και τα αρχαία και οι επιστήµονες κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι η συνολική µάζα των ακραιόφιλων υπερβαίνει την µάζα όλων των ανθρώπων στη Γη. Από τους ακραιόφιλους οργανισµούς θα ασχοληθούµε εκτεταµένα µε τα θερµόφιλα, που ζουν σε περιβάλλον θερµοκρασίας 60-80 ο C περίπου και µε τα υπερθερµόφιλα, που ζουν σε περιβάλλον θερµοκρασίας 80-120 o C. Τα βιοµόρια αυτών των οργανισµών είναι ενεργά σε θερµοκρασίες που κατά κανόνα υποβαθµίζουν τα συνήθη κυτταρικά µόρια, όπως τα ένζυµα, τα λιπίδια και τα νουκλεϊκά οξέα. Η µεταβολική διαδικασία και οι ειδικές βιολογικές λειτουργίες καθορίζονται από ένζυµα και πρωτεΐνες, που λειτουργούν άριστα κάτω από ακραίες συνθήκες. Θα προσπαθήσουµε να κατανοήσουµε τη δοµική, τη θερµοδυναµική και την κινητική βάση της λειτουργίας και της σταθερότητας των πρωτεϊνών κάτω από συνθήκες υψηλής θερµοκρασίας, πίεσης, αλατότητας και ακραίου ph. Επίσης θα αναφέρουµε εφαρµογές στη βιοµηχανία αυτών των ενζύµων, που έχουν την ικανότητα να επιβιώνουν σε τόσο υψηλές θερµοκρασίες µε αποτέλεσµα να φέρουν κέρδος εκατοµµυρίων δολαρίων στη βιοµηχανική αγορά. Οι επιστήµονες ανακάλυψαν πως η µεγαλύτερη θερµοκρασία στην οποία ένα υπερθερµόφιλο µπορεί να αναπτύσσεται είναι 121 ο C. Μπορεί όµως µια πρωτεΐνη να είναι σταθερή σε υψηλότερες θερµοκρασίες; Ή µήπως τα υπερθερµόφιλα είναι οι οργανισµοί που θέτουν το ανώτατο όριο θερµοκρασίας για την ύπαρξη ζωής;
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Εισαγωγή 1.1 Η ταξινόµηση των οργανισµών 1.1.1 Οι ευκαρυωτικοί οργανισµοί 1.1.2 Οι προκαρυωτικοί οργανισµοί 1.1.3 Τα αρχαία 1.2 Η γενετική καταγωγή των (υπερ)θερµόφιλών 1.3 Γενικά χαρακτηριστικά θερµοφιλικών οργανισµών 1.4 Γενικά χαρακτηριστικά υπερθερµοφιλικών οργανισµών 2. Αξιοσηµείωτα είδη θερµοφιλικών και υπερθερµοφιλικών οργανισµών 2.1 Thermus Aquanticus 2.2 Thermus Thermophilus 2.3 Pyrococcus Furiosus 2.4 Pyrolobus Fumarii 2.5 Pyrodictium Occultum (Στέλεχος 121) 3. Οι συνηθέστεροι τόποι όπου συναντώνται τα (υπερ)θερµόφιλα 3.1 Υδροθερµικές πηγές 3.2 Θερµές πηγές 3.3 Θερµοπίδακες 4. Θερµική σταθεροποίηση των κυτταρικών στοιχείων 4.1 Θερµική σταθερότητα των ενζύµων 4.1.1 Σύγκριση µεσοφιλικών και υπερθερµοφιλικών πρωτεϊνών 4.1.2 Συσχετισµός σταθερότητας µε σχηµατισµό α- έλικας και β- πτυχωτής αλυσίδας 4.1.3 Συσχετισµός σταθερότητας και δυσκαµψίας πρωτεϊνικού µορίου 4.1.4 Συσχετισµός σταθερότητας και υδροφοβικότητας 4.1.5 Συσχετισµός σταθερότητας και ζευγών ιόντων 4.1.6 Συσχετισµός σταθερότητας και του αµινοξέος προλίνη 4.1.7 Συσχετισµός σταθερότητας και σύστασης των πρωτεϊνών σε αµινοξέα 4.1.8 Συσχετισµός σταθερότητας και δέσµευσης µετάλλων 4.1.9 Μετα- µεταφραστικές τροποποιήσεις 4.1.10 συσχετισµός σταθερότητας και υποστρώµατος 4.1.11 Επιρροή της πίεσης 4.2 Θερµική σταθεροποίηση νουκλεϊκών οξέων 4.2.1 Δεοξυριβονουκλεϊκά οξέα 4.2.2 Ριβονουκλεϊκά οξέα 4.3 Θερµική σταθεροποίηση µεµβρανών 5. Θρέψη (υπερ)θερµόφιλων 6. Εφαρµογές θερµόφιλων και υπερθερµόφιλων ενζύµων 6.1 Τροποποίηση του αµύλου 6.2 DNA πολυµεράση (Pol Taq) 6.3 Εστεράσες και λιπάσες 6.4 Παραγωγή τριαλόζης 6.5 Ένζυµα που αποικοδοµούν την κυτταρίνη 6.6 Πρωτεολυτικά ένζυµα 6.7 Αλκοολικές δεϋδρογονάσες 6.8 Εστεράσες 6.9 Ένζυµα που δηµιουργούν δεσµούς C-C 6.10 Περιληπτική αναφορά εφαρµογών άλλων αξιοσηµείωτων ενζύµων 7. Επίλογος 8. Βιβλιογραφία και αναφορές
1. Εισαγωγή 1.1. Η ταξινόµηση των οργανισµών Το 1990 ο Woese πρότεινε την ταξινόµηση των οργανισµών σε τρία υπερβασίλεια: τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, τους προκαρυωτικούς και τα αρχαία. 1.1.1 Οι ευκαρυωτικοί οργανισµοί Ευκαρυωτικά ονοµάζονται τα κύτταρα τα οποία δεν έχουν πυρήνα. Από αυτό το είδος κυττάρων αποτελούνται ορισµένοι µονοκύτταροι οργανισµοί αλλά και όλοι οι πολυκύτταροι οργανισµοί. Διαθέτουν πυρήνα και οργανίδια, τα οποία είναι υπεύθυνα για τις διάφορες λειτουργίες του κυττάρου. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα εµφανίστηκαν πολύ αργότερα από τα προκαρυωτικά κύτταρα. 1.1.2 Οι προκαρυωτικοί οργανισµοί Οι προκαρυωτικοί οργανισµοί, τα γνωστά βακτήρια, είναι µικροσκοπικοί µονοκύτταροι (σπανιότατα πολυκύτταροι) οργανισµοί που συναντώνται σε κάθε είδους βιότοπο. Έχουν πολύ απλή κυτταρική δοµή, χωρίς πυρήνα και σύνθετα οργανίδια. Το γενετικό υλικό οργανώνεται σε πυρηνοειδές και πολλά βακτήρια περιέχουν επιπλέον πλασµίδια, δηλαδή µικρά αυτόνοµα κυκλικά µόρια DNA. 1.1.3 Τα αρχαία Τα αρχαία είναι µονοκύτταροι µικροοργανισµοί. Δεν διαθέτουν πυρήνα και σύνθετα οργανίδια µέσα στα κύτταρά τους. Πολλά γονίδιά τους συµπεριφέρονται όπως αυτά των ανώτερων οργανισµών. Τα αρχαία θεωρείται ότι έχουν κοινό πρόγονο µε τα βακτήρια. Στο παρελθόν µάλιστα, θεωρούνταν σαν ένα ασυνήθιστο είδος βακτηρίων που ονοµάζονταν αρχαιοβακτήρια, αλλά από τότε που τα αρχαία απέκτησαν µία ανεξάρτητη εξελικτική πορεία µε σηµαντικές διαφορές στη βιοχηµεία τους από άλλες µορφές ζωής, αποτέλεσαν ένα ξεχωριστό τοµέα. 1.2 Η γενετική καταγωγή των (υπερ)θερµόφιλων Η γενετική καταγωγή των ακραιόφιλων και κατά συνέπεια των (υπερ)θερµόφιλων είναι τα βακτήρια και τα αρχαία. Τα περισσότερα θερµόφιλα είναι αρχαία. Τα υπερθερµόφιλα είναι κυρίως αρχαία, αλλά υπάρχουν και πολλά βακτήρια που αναπτύσσονται γύρω στους 100 ο C. Σ αυτό το σηµείο όµως πρέπει να επισηµάνουµε ότι είναι λάθος να χρησιµοποιούµε τον όρο «ακραιόφιλα» για να συµπεριλάβουµε όλα τα αρχαία καθώς ορισµένα από αυτά είναι µεσοφιλικοί οργανισµοί (δηλ. οργανισµοί που ζουν σε συνήθεις συνθήκες). 1.3 Γενικά χαρακτηριστικά θερµόφιλικών οργανισµών Ένα θερµόφιλο είναι ένας τύπος ακραιόφιλου οργανισµού, ο οποίος ευδοκιµεί σε θερµοκρασίες µεταξύ 45-80 ο C. Τα θερµόφιλα βρίσκονται σε διάφορες γαιοθερµικά θερµαινόµενες περιοχές της Γης, όπως οι θερµές πηγές στο Yellowstone National Park και οι υδροθερµικές πηγές σε βαθειά σηµεία των ωκεανών. Τα θερµόφιλα περιέχουν ένζυµα που µπορούν να Τα θερµόφιλα είναι υπεύθυνα για λειτουργούν σε υψηλές θερµοκρασίες. Αυτό αποτελεί τα φωτεινά χρώµατα της πηγής Grand Prismatic στο Yellowstone βασική προϋπόθεση για την επιβίωσή τους. Τα National Park θερµόφιλα µπορεί να είναι υποχρεωτικά ή δυνητικά. Τα υποχρεωτικά θερµόφιλα απαιτούν υψηλές θερµοκρασίες για την ανάπτυξή τους, σε
αντίθεση µε τα δυνητικά που µπορούν να ευδοκιµήσουν και σε χαµηλότερες θερµοκρασίες, κάτω των 50 ο C. Τα γονίδια των θερµόφιλων οργανισµών χαρακτηρίζονται από µεγάλη περιεκτικότητα σε πουρίνες, στις αλληλουχίες που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Επίσης, παρατηρείται εναλλασσόµενη χρήση θετικά φορτισµένων και αρωµατικών αµινοξέων στις αλληλουχίες των πρωτεϊνών. 1.4 Γενικά χαρακτηριστικά των υπερθερµοφιλικών οργανισµών Τα υπερθερµόφιλα είναι οργανισµοί που ευδοκιµούν σε πολύ θερµά περιβάλλοντα από 60 ο C και άνω. Η άριστη θερµοκρασία ανάπτυξής τους είναι συνήθως άνω των 80 ο C. Τα υπερθερµόφιλα είναι υποκατηγορία των ακραιόφιλων. Πολλά υπερθερµόφιλα εκτίθενται ταυτόχρονα και σε άλλες ακραίες συνθήκες ισχυρής οξύτητας και ακτινοβολίας. Τα υπερθερµόφιλα συναντώνται σε θερµές πηγές, όπως αυτή στο Yellowstone National Park, αλλά και σε υδροθερµικές πηγές των βαθέων ωκεανών, όπου απαιτούνται θερµοκρασίες τουλάχιστον 90 ο C για την επιβίωσή τους. Ωστόσο, δεν έχει ανακαλυφθεί κάποιο υπερθερµόφιλο που να ζει σε θερµοκρασία άνω των 122 ο C. Μάλιστα, θεωρείται απίθανο να υπάρχουν µικρόβια που επιβιώνουν σε θερµοκρασίες άνω των 150 ο C, καθώς η συνοχή του DNA και άλλων ζωτικών µορίων παύει να υφίσταται. Πρόσφατες έρευνες σε υπερθερµόφιλα έδειξαν ότι το γονιδίωµά τους χαρακτηρίζεται από υψηλή περιεκτικότητα σε γουανίνη και κυτοσίνη. Ωστόσο, δεν υπάρχει ξεκάθαρη σχέση µεταξύ αυτής της περιεκτικότητας και της ικανότητας ενός υπερθερµόφιλου να αναπτύσσεται σε τόσο υψηλές θερµοκρασίες. 2. Αξιοσηµείωτα είδη θερµοφιλικών και υπερθερµοφιλικών οργανισµών 2.1 Thermus aquanticus Είναι ένα είδος θερµοφιλικού βακτηρίου. Ανακαλύφθηκε το 1969 από τον καθηγητή Thomas D. Brock, στις θερµές πηγές του Yellowstone National Park. Ευδοκιµεί στους 70 ο C, αλλά µπορεί να επιβιώσει µεταξύ των 50-80 ο C. Διεξάγει χηµειοσύνθεση προκειµένου να τραφεί. Χηµειοσύνθεση 1 : Η βιολογική µετατροπή ανθρακικών ενώσεων (συνήθως διοξείδιο του άνθρακα ή µεθάνιο) σε οργανική ύλη, χρησιµοποιώντας είτε την οξείδωση ανόργανων µορίων (υδρογόνο, υδρόθειο) είτε το µεθάνιο ως πηγή ενέργειας. CO 2 +O 2 +4H 2 S CH 2 O +4S +3H 2 O Ωστόσο, επειδή το εύρος της θερµοκρασίας στο οποίο µπορεί να αναπτυχθούν περιλαµβάνει και θερµοκρασίες στις οποίες ευδοκιµούν τα κυανοβακτήρια, πολλές φορές παρατηρείται να ζουν εξαρτώµενα από αυτά, αξιοποιώντας την φωτοσύνθεση των κυανοβακτηρίων ώστε να αποκτήσουν ενέργεια. 2.2 Thermus thermophilus Είναι ένα αρνητικό κατά Gram θερµοφιλικό βακτήριο. Η άριστη θερµοκρασία ανάπτυξης κυµαίνεται µεταξύ 65-75 ο C. Αποµονώθηκε από θερµές πηγές της Ιαπωνίας. Βρίσκει εφαρµογές στην βιοτεχνολογία ως πρότυπος οργανισµός και σε γενετικές δραστηριότητες. Επίσης χρησιµοποιείται για την αποικοδόµηση της οργανικής ύλης.
2.3 Pyrococcus furiosus Ένα υπερθερµοφιλικό αρχαίο. Είναι αξιοσηµείωτο πως αναπτύσσεται µεταξύ 70-103 ο C, µε βέλτιστη θερµοκρασία ανάπτυξης τους 100 ο C και ph 5-9. Εµφανίζει ταχύτατο χρόνο διπλασιασµού των 37 λεπτών κάτω από ιδανικές συνθήκες. Αποµονώθηκε από γαιοθερµικά θαλάσσια πετρώµατα στην Ιταλία, κάτω από αναερόβιες συνθήκες, σε θερµοκρασίες των 90-100 ο C. Είναι ένας από τους λίγους οργανισµούς που έχει διαπιστωθεί ότι τα ένζυµά του περιέχουν βολφρένιο, καθώς αυτό το στοιχείο βρίσκεται πολύ σπάνια σε βιολογικά µόρια. Μπορεί να αναπτυχθεί σε εκχύλισµα µαγιάς, µαλτόζης και αµύλου. Η ανάπτυξή του είναι πολύ αργή ή και µηδενική παρουσία αµινοξέων, οργανικών οξέων, αλκοολών και στους περισσότερους υδατάνθρακες (π.χ. γλυκόζη, φρουκτόζη, λακτόζη, γαλακτόζη). 2.4 Pyrolobus fumarii Είναι ένα υπερθερµοφιλικό αρχαίο, που ανακαλύφθηκε το 1997 σε υδροθερµικές θαλάσσιες πηγές, στην µεσοκεάνια ράχη του Ατλαντικού Ωκεανού. Ζώντας σε βάθος 3600 µ., αναπτύσσεται άριστα στην υψηλότατη θερµοκρασία των 113 ο C, τόσο σε αερόβιες όσο και σε αναερόβιες συνθήκες. 2.5 Pyrodictium occultum (Στέλεχος 121) Το ανθεκτικότερο από όλα τα βακτήρια. Ανήκει στο υπερβασίλειο των αρχαίων και ανακαλύφθηκε το 2003 στις υδροθερµικές πηγές, 300 km έξω από το Puget Sound των Η.Π.Α.. Κατάφερε να διπλασιάσει τον πληθυσµό του µέσα σε 24 ώρες σε έναν κλίβανο, στους 121 ο C. Μπορεί να µείνει ζωντανό ακόµα και στους 130 ο C και παρόλο που η ανάπτυξή του έχει ανασταλεί, µπορεί να αναπαραχθεί εκ νέου όταν µεταφερθεί σε ψυχρότερο µέσο. Η ανακάλυψη του στελέχους αυτού ήταν πολύ σηµαντική, καθώς µέχρι το 2003 πίστευαν ότι ο ιατρικός εξοπλισµός αποστειρώνονταν πλήρως σε έκθεση 15 λεπτών σε αυτή τη θερµοκρασία κλιβάνου. 3. Οι συνηθέστεροι τόποι όπου συναντώνται τα (υπερ)θερµόφιλα 3.1 Υδροθερµικές πηγές Οι υδροθερµικές πηγές αποτελούν σχισµές στην επιφάνεια του πλανήτη από τις οποίες εκρέει γεωθερµικά θερµαινόµενο νερό. Βρίσκονται κοντά σε τόπους ηφαιστειακά ενεργούς, σε τεκτονικές πλάκες που αποκλίνουν και σε λεκάνες ωκεανών. Οι υδροθερµικές πηγές συναντώνται πολύ συχνά καθώς η γη είναι γεωλογικά ενεργή και ταυτόχρονα έχει µεγάλες ποσότητες νερού τόσο στην επιφάνειά της όσο και στο εσωτερικό του φλοιού της. Το πιο διάσηµο σύστηµα υδροθερµικών πηγών βρίσκεται εντός του Yellowstone National Park στις Η.Π.Α. Οι υδροθερµικές πηγές είναι βιολογικά από τις πιο παραγωγικές περιοχές των βαθέων υδάτων των ωκεανών. Συχνά φιλοξενούν πολύπλοκους και πολυάριθµους οργανισµούς. Κάτω από τη θάλασσα, οι υδροθερµικές πηγές δηµιουργούν σχηµατισµούς που ονοµάζονται µαύροι ή λευκοί καπνιστές. ένας µαύρος καπνιστής
3.2 Θερµές πηγές Οι θερµές πηγές παράγονται από την εµφάνιση γεωθερµικά θερµαινόµενων υπόγειων υδάτων από το εσωτερικό του φλοιού της γης. Υπάρχουν σε όλα τα σηµεία της γης, σε κάθε ήπειρο, κάτω από ωκεανούς και θάλασσες. Όταν οι θερµές πηγές δεν βρίσκονται κοντά σε ηφαιστειογενείς περιοχές, το νερό που αναβλύζει από αυτές θερµαίνεται από τα πετρώµατα στο εσωτερικό της γης. Ενώ σε ηφαιστειακά ενεργές περιοχές το νερό θερµαίνεται ερχόµενο σε επαφή µε το µάγµα. Σε αυτές τις περιοχές το νερό φτάνει σε θερµοκρασία το σηµείο βρασµού. 3.3 Θερµοπίδακες Είναι πηγές από τις οποίες εκτοξεύεται νερό υπό την µορφή ατµού. Αυτό δηµιουργείται συνήθως σε ηφαιστειογενείς περιοχές όπου το νερό θερµαίνεται κάτω από την επιφάνεια της γης και φτάνοντας τους 100 ο C σχηµατίζεται ατµός και λόγω της ασκούµενης πίεσης, αυτός εκτοξεύεται µε δύναµη προς τα έξω. Υπάρχουν χίλιοι γνωστοί θερµοπίδακες σε όλο τον κόσµο, εκ των οποίων οι µισοί περίπου βρίσκονται στο Yellowstone National Park. Ένας θερµοπίδακας µπορεί να φραχτεί µε την συνεχή εναπόθεση µεγάλων ποσοτήτων ορυκτών µετάλλων, µε την δράση σεισµών και µε την ανθρώπινη παρέµβαση. Το πιο σηµαντικό είναι το συµπέρασµα του καθηγητή Thomas Brock, ο οποίος υποστηρίζει ότι η ζωή µπορεί να υπάρξει οπουδήποτε το νερό παραµένει στην υγρή κατάσταση. Πρέπει να επισηµάνουµε ότι το νερό βράζει στους 100 ο C µόνο σε κανονική ατµοσφαιρική πίεση. Εάν αυξηθεί η πίεση, το σηµείο βρασµού του νερού αυξάνει. Στις προαναφερθείσες πηγές και ιδιαίτερα όταν αυτές βρίσκονται σε βαθιά νερά, η πίεση είναι ίση µε πολλές ατµόσφαιρες. Έτσι µπορεί να παράγονται θερµοκρασίες ακόµη και 350 ο C. Οι µικροοργανισµοί ζουν κοντά σε αυτές τις περιοχές. Το νερό παραµένει υγρό σ αυτό το βάθος, ενώ στην επιφάνεια της γης θα ήταν ένας υπερβολικά θερµός ατµός.
4. Θερµική σταθεροποίηση των κυτταρικών στοιχείων 4.1 Θερµική σταθεροποίηση των ενζύµων Η θερµική σταθερότητα και η άριστη δραστηριότητα σε υψηλές θερµοκρασίες είναι έµφυτες ιδιότητες των θερµοφιλικών ενζύµων. Διάφορες έρευνες έχουν διεξαχθεί για την κατανόηση του µηχανισµού της θερµικής σταθερότητας των πρωτεϊνών, αλλά τα αποτελέσµατά τους δεν είναι ακόµα ξεκάθαρα. Οι επιστήµονες για να αποκτήσουν βαθύτερη γνώση για τη βάση της θερµικής σταθερότητας, διεξήγαγαν πειράµατα µετουσίωσης, συγκρίνοντας την εξάρτηση της θερµοκρασίας και της ελεύθερης ενέργειας (ΔG) της εκδίπλωσης των πρωτεϊνών σε πολλά υπερθερµοφιλικά και µεσοφιλικά είδη. Η ενζυµική σταθερότητα περιλαµβάνει θερµοδυναµικές και κινητικές ισορροπίες. Η θερµοδυναµική σταθερότητα καθορίζεται από την ελεύθερη ενέργεια σταθεροποίησης (ΔG σταθ. ) και την θερµοκρασία τήξης (Τ τ, η θερµοκρασία στην οποία το 50% της πρωτεΐνης έχει εκτυλιχτεί). Η κινητική σταθερότητα εξαρτάται από το φράγµα της ενέργειας εκτύλιξης (Ε α, ενέργεια ενεργοποίησης). Η κινητική σταθερότητα του ενζύµου συχνά εκφράζεται ως χρόνος ηµιζωής σε καθορισµένες θερµοκρασίες. 4.1.1 Σύγκριση µεσοφιλικών και υπερθερµοφιλικών πρωτεϊνών Με εξαίρεση τη φυλογενετική ποικιλότητα αυτό που διαφοροποιεί ουσιαστικά τα υπερθερµοφιλικά από τα µεσοφιλικά ένζυµα είναι η διακύµανση της θερµοκρασίας, όπου είναι σταθερά και ενεργά. Αλλιώς είναι πολύ παρόµοια µεταξύ τους: α) Οι αλληλουχίες των οµόλογων υπερθερµοφιλικών και µεσοφιλικών πρωτεϊνών είναι κατά 40-85% παρόµοιες β) οι τρισδιάστατες δοµές τους συµπίπτουν γ) έχουν τους ίδιους καταλυτικούς µηχανισµούς. Ταυτόχρονα, µελέτες υποστηρίζουν ότι ο τρόπος µε τον οποίο σταθεροποιούνται υπερθερµοφιλικά και µεσοφιλικά οµόλογα είναι κοινός, µε βασικό χαρακτηριστικό ότι διατηρούν τον πρωτεϊνικό πυρήνα: α) Οι υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις και το πυρηνικό τµήµα της πρωτεΐνης, που εµπλέκονται σε δευτεροταγείς δοµές είναι πιο σταθερά σε σχέση µε το επιφανειακό τµήµα του µορίου β) Πολλοί σταθεροποιητικοί υποκαταστάτες βρίσκονται σε περιοχές όπου το µόριο της πρωτεΐνης εκτίθεται σε διαλύτη. Η µεγάλη οµοιότητα που φαίνεται στους πυρήνες των µεσοφιλικών και υπερθερµοφιλικών πρωτεϊνικών οµολόγων αποδεικνύουν ότι οι µεσοφιλικές πρωτεΐνες πακετάρονται µε τον καλύτερο δυνατό τρόπο. Συνεπώς, δεν αποµένει χώρος στον πρωτεϊνικό πυρήνα των υπερθερµόφιλων για περεταίρω σταθεροποίηση. Το συµπέρασµα που εξάγεται είναι ότι οι σταθεροποιητικές αλληλεπιδράσεις στις υπερθερµοφιλικές πρωτεΐνες διεξάγονται σε λιγότερο σταθερές περιοχές του µορίου τους. 4.1.2 Συσχετισµός σταθερότητας µε τον σχηµατισµό α- έλικας και β- πτυχωτής αλυσίδας Η ιδιότητα της σταθερότητας έχει µεγαλύτερη σχέση µε τον σχηµατισµό της α-έλικας πάρα µε τον σχηµατισµό β-πτυχωτών αλυσίδων. Αυτό οφείλεται στην καλύτερη σταθεροποίηση της α-έλικας διαµέσου των ηλεκτρικών αλληλεπιδράσεων της δίπολης έλικας. Οι δίπολες έλικες µπορεί να σταθεροποιηθούν µε αρνητικά φορτισµένα αµινοξέα κοντά στο αµινοτελικό άκρο και ταυτόχρονα µε θετικά φορτισµένα αµινοξέα κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο. 4.1.3 Συσχετισµός σταθερότητας και δυσκαµψίας του πρωτεϊνικού µορίου Μια υπόθεση που πρόσφατα άρχισαν να µελετούν οι επιστήµονες είναι µεγάλη δυσκαµψία των υπερθερµοφιλικών ενζύµων σε σύγκριση µε τα µεσοφιλικά οµόλογά τους. Στους 20 ο C εναλλάσσεται ένα πολύ µικρότερο ποσοστό των αµιδικών πρωτονίων της αδενιλικής κινάσης του θερµόφιλου Sulfolobius acidocaldarius (53%) σε σχέση µε το κυτοσολικό ένζυµο ενός µεσόφιλου (83%). Αυτό µαρτυρά πως περισσότερα αµιδικά πρωτόνια εµπλέκονται στους σταθερούς δεσµούς υδρογόνου στα θερµοφιλικά ένζυµα. Θερµοκρασίες των 90 ο C χρειάζονται προτού η αδενυλική κινάση του Sulfolobius acidocaldarius εµφανίσει επίπεδο εναλλαγής συγκρίσιµο µε αυτό του καταλυτικά ενεργού µεσοφιλικού ενζύµου. Αποδείχτηκε ότι η ευκαµψία του πρωτεϊνικού µορίου µειωνόταν καθώς η θερµική σταθερότητά του
αυξανόταν. Όλες οι συγκρίσεις µέγιστης ευκαµψίας σε µεσοφιλικά και υπερθερµοφιλικά ένζυµα κατέληγαν στο εξής αποτέλεσµα: οι υπερθερµοφιλικές πρωτεΐνες είναι πιο δύσκαµπτα µόρια. Ωστόσο, µια πρόσφατη µελέτη δεν υποστήριξε αυτό το αποτέλεσµα. Η πρωτεΐνη που είχε χαρακτηριστεί ως η πιο σταθερή εµφάνισε έναν βαθµό προσαρµοστικής ευκαµψίας, συγκρίσιµο µε αυτόν των µεσοφιλικών ενζύµων. Μια επιστηµονική οµάδα, µάλιστα, υποστήριξε πως δεν υπάρχει µοναδικό πρότυπο ευκαµψίας του µορίου. Με άλλα λόγια, µια πρωτεΐνη µπορεί να είναι δύσκαµπτη στην κλίµακα των nsec και εύκαµπτη σε κλίµακα των msec. Έτσι, κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι δεν υπάρχει θεµελιώδης λόγος ώστε η σταθερότητα και η ευκαµψία να συσχετίζονται. Περισσότερες µελέτες πρέπει να γίνουν λοιπόν, σχετικά µε την ευκαµψία των υπερθερµοφιλικών ενζύµων σε διάφορες θερµοκρασίες ώστε να κατανοηθεί καλύτερα η σχέση της µε την σταθερότητα. 4.1.4 Συσχετισµός σταθερότητας και υδροφοβικότητας. Η υδροφοβική αλληλεπίδραση είναι η κυριότερη δύναµη της πρωτεϊνικής αναδίπλωσης. Οι πληροφορίες που αντλούνται από την αλληλουχία, τη δοµή και τις µεταλλαξιογενέσεις τα τελευταία 20 χρόνια, επιβεβαιώνουν ότι η υδροφοβικότητα είναι πράγµατι ο θεµελιώδης παράγων της θερµικής σταθερότητας. Η θεωρία που περιγράφει την σταθερότητα χάρη στην υδροφοβικότητα είναι η εξής: α) Το υδροφοβικό τµήµα του µορίου στρέφεται εσωτερικά σχηµατίζοντας έναν πυρήνα, όπου αποφεύγεται η επαφή µε το νερό β) υποκαταστάσεις στον υδροφοβικό πυρήνα προκαλούν µεγαλύτερη διατάραξη της δοµής από οποιαδήποτε άλλη υποκατάσταση γ) η εκτύλιξη της πρωτεΐνης προϋποθέτει µεγάλη αύξηση της θερµοχωρητικότητας. 4.1.5 Συσχετισµός σταθερότητας και ζευγών ιόντων Επειδή τα ζεύγη ιόντων βρίσκονται συνήθως σε µικρό αριθµό πρωτεϊνών δεν θεωρούνταν καθοριστική δύναµη της πρωτεϊνικής αναδίπλωσης. Ωστόσο, πρόσφατες µελέτες υποστηρίζουν ότι οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις αντιπροσωπεύουν µια σηµαντική σταθεροποιητική δύναµη στις αναδιπλούµενες πρωτεΐνες. Στα υπερθερµόφιλα έχει παρατηρηθεί πως τα δίκτυα ιονικών αλληλεπιδράσεων ενεργούν σε µεγαλύτερο εύρος από τις υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις. Ένας µόνος ιονικός δεσµός ευθύνεται για 3-5 kcal/mol σταθεροποίησης της Τ4 λυσοζύµης. Οι επιστήµονες συγκρίνοντας εξαµερείς γλουταµικές δεϋδρογονάσες που αποµονώθηκαν από το P. furiosus και το T. litiralis, εξήγαγαν το συµπέρασµα ότι η µειωµένη θερµική σταθερότητα του ενζύµου του T. litoralis ήταν αποτέλεσµα της καταστροφής µιας καίριας εσωτερικής υποµονάδας του δικτύου των ιονικών αλληλεπιδράσεων. Τέλος, δοµικές συγκρίσεις β-γλυκοσιδασών που αποµονώθηκαν από υπερθερµοφιλικούς και µεσοφιλικούς οργανισµούς έδειξαν ότι τα υπερθερµοφιλικά ένζυµα είχαν αισθητά πιο πολλά ζεύγη ιόντων στις πρωτεϊνικές επιφάνειες, γεγονός που τους προσέδιδε θερµική σταθερότητα. 4.1.6 Συσχετισµός σταθερότητας και του αµινοξέος προλίνη Οι πρωτεΐνες µπορούν να σταθεροποιηθούν µειώνοντας την εντροπία εκτύλιξής τους. Στην κατάσταση εκτύλιξης η γλυκίνη χωρίς β-άνθρακα, είναι ένα αµινοξύ µε την υψηλότερη προσαρµοστική εντροπία. Η προλίνη που µπορεί να προσαρµοστεί µόνο σε λίγες διαµορφώσεις, έχει την χαµηλότερη προσαρµοστική εντροπία. Κατ αυτόν τον τρόπο, µεταλλάξεις Gly Xaa 1 ή Xaa Pro µειώνουν την εντροπία της πρωτεϊνικής εκτύλιξης και σταθεροποιούν την πρωτεΐνη. 4.1.7 Συσχετισµός σταθερότητας και σύστασης των πρωτεϊνών σε αµινοξέα Η αµινοξική σύσταση των πρωτεϊνών σχετίζεται µε την θερµική σταθερότητα. Οι πρώτες στατιστικές αναλύσεις συγκρίνοντας τη σύσταση αµινοξέων σε µεσοφιλικές και θερµοφιλικές πρωτεΐνες, δείχνουν τάσεις υποκαταστάσεων όπως Gly Ala και Lys Arg. Μια υψηλότερη περιεκτικότητα της αλανίνης σε υπερθερµοφιλικές πρωτεΐνες, έκανε τους επιστήµονες να υποθέσουν ότι αποτελεί το καλύτερο αµινοξύ για τον σχηµατισµό της έλικας. Ακόµα,
παρατηρούµε ότι περισσότερα φορτισµένα αµινοξέα, βρίσκονται σε θερµοφιλικές πρωτεΐνες. Επίσης, οι τελευταίες περιέχουν λίγο παραπάνω υδροφοβικά και αρωµατικά αµινοξέα από τις µεσοφιλικές. Ωστόσο, αυτά τα δεδοµένα προέκυψαν από την µελέτη µικρού δείγµατος οργανισµών λόγω της πολυπλοκότητας της διαδικασίας, των υψηλών δαπανών που απαιτούνται γι αυτή και της µεγάλης διαφορετικότητας µεταξύ των ίδιων των θερµόφιλων. Τα παραπάνω συµπεράσµατα, λοιπόν, δεν µπορούν να γενικευτούν µε ακρίβεια. Πιθανόν, πιο σχετική προς την θερµική σταθερότητα, από αυτή καθ αυτή την σύσταση των πρωτεϊνών σε συγκεκριµένα αµινοξέα, να είναι η κατανοµή τους και οι αλληλεπιδράσεις τους µέσα στην πρωτεΐνη. Οι έλικες των θερµοφιλικών πρωτεϊνών είναι γενικά πιο σταθερές από αυτές των µεσόφιλων. Διάφορες ιδιότητες της αργινίνης την καθιστούν πιο εύκολα προσαρµοζόµενη σε υψηλές θερµοκρασίες από την λυσίνη. Τέλος η ευαισθησία της κυστεϊνης στην οξείδωση σε υψηλές θερµοκρασίες, δείχνει ότι τα υπερθερµοφιλικά ένζυµα περιέχουν λιγότερες κυστεϊνες από τα οµόλογα µεσοφιλικά. 4.1.8 Συσχετισµός σταθερότητας και δέσµευσης µετάλλων Τα µέταλλα είναι γνωστό ότι σταθεροποιούν και ενεργοποιούν τα ένζυµα. Η ξυλόζη δεσµεύει δύο µεταλλικά ιόντα. Το ένα κατιόν είναι άµεσα εµπλεκόµενο στην κατάλυση και το δεύτερο είναι κυρίως δοµικό. Τα δύο αυτά ιόντα έχουν διαφορετικές λειτουργίες και η αντικατάσταση ενός κατιόντος µε ένα άλλο συχνά µεταβάλλει σηµαντικά την ενζυµική σταθερότητα, την ειδικότητα του υποστρώµατος και την θερµική σταθερότητα. Έµµεσα στοιχεία που αποδεικνύουν τον ρόλο των µετάλλων στην σταθερότητα των υπερθερµοφιλικών πρωτεϊνών είναι η δυσκολία που συναντάται στην αποµάκρυνση των µετάλλων από τα ένζυµα. Οι α-αµυλάσες, ειδικότερα, δεσµεύουν Ca 2+. Το Ca 2+ είναι βασικό για την καταλυτική δραστηριότητα του ενζύµου και την θερµική σταθερότητά του. Αρχικά η εξωκυτταρική αµυλάση του P. furiosus χαρακτηρίστηκε ως ένζυµο ανεξάρτητο του Ca 2+, καθώς σε θερµοκρασία δωµατίου το EDTA δεν είχε καµιά επίδραση στην δραστηριότητα του ενζύµου. Περισσότερες µελέτες όµως αποκάλυψαν ότι το ένζυµο αυτό έχει τουλάχιστον δύο Ca 2+ που δεν µπορούν να αφαιρεθούν από το EDTA σε θερµοκρασίες κάτω των 70 ο C. Με επίδραση 30 λεπτών του EDTA στους 90 ο C, αποµακρύνεται κατά προσέγγιση το 60-70% του δεσµευµένου Ca 2+.
4.1.9 Μετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις Η πρωτεϊνική γλυκοζυλίωση είναι ευρέως διαδεδοµένη µεταξύ των ευκαρυωτικών ενζύµων και πολλών βακτηριακών εξωκυτταρικών ενζύµων. Μόνο µερικά παραδείγµατα είναι γνωστά από υπερθερµοφιλικές πρωτεΐνες που να γλυκοζυλιώνονται. Οι περισσότερες από αυτές διατηρούν τις καταλυτικές και σταθεροποιητικές τους ιδιότητες όταν εκφράζονται σε βακτήρια. Μερικές µελέτες έδειξαν ότι η γλυκοζυλίωση µπορεί να προκαλέσει σηµαντική θερµική σταθερότητα χωρίς να επηρεάσει τα στάδια της πρωτεϊνικής αναδίπλωσης. 4.1.10 Συσχέτιση σταθεροποίησης και υποστρώµατος Μόρια υποστρώµατος είναι γνωστό ότι σταθεροποιούν τα ένζυµα, κυρίως µε την σταθεροποίηση της ενεργού περιοχής τους. Η υδροφολική ρεντουκτάση του Τ. Maritima έχει αποδειχθεί ότι είναι ισχυρά κινητικά σταθεροποιηµένη από υποστρώµατα όπως το NADPH, το οποίο όµως, είναι αρκετά ασταθές σε υψηλές θερµοκρασίες. Αυτή η ισχυρή σταθεροποίηση του ενζύµου µπορεί να σχετίζεται µε ισχυρή σταθεροποίηση του συµπαράγοντα. 4.1.11 Η επιρροή της πίεσης Επειδή πολλά περιβάλλοντα υψηλής θερµοκρασίας είναι και υψηλής πίεσης, όλα τα µακροµοριακά συστατικά πρέπει να προσαρµοστούν και σε υψηλές πιέσεις. Έτσι, πολλά θερµόφιλα µπορούν να είναι ταυτόχρονα και βαρόφιλα 1. Η πίεση ευνοεί την δοµή µε τον µικρότερο δυνατό όγκο. Οι πρωτεΐνες που σταθεροποιούνται µε υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις, αναµένεται να είναι σταθερές και σε υψηλές πιέσεις δεδοµένου ότι οι πρωτεΐνες που σταθεροποιούνται από ιονικές αλληλεπιδράσεις πρέπει να αποσταθεροποιηθούν. Για παράδειγµα, η ρουβριδοξίνη του P. furiosus σταθεροποιείται περισσότερο από ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις µε αποτέλεσµα αυτό το ένζυµο να αποσταθεροποιείται σε υψηλές θερµοκρασίες. 4.2 Θερµική σταθεροποίηση νουκλεϊκών οξέων 4.2.1 Δεοξυριβονουκλεϊκά οξέα Εξαιτίας του µικρού µεγέθους των υπερθερµόφιλων (κλίµακα µm), οποιαδήποτε προστασία µόνωσης από το θερµό περιβάλλον φαίνεται απίθανη. Όπως όλα τα κυτταρικά συστατικά, έτσι και τα νουκλεϊκά οξέα αναπτύσσουν µηχανισµούς ανθεκτικότητας στη υψηλή θερµοκρασία. Η θερµική αντίσταση της διπλής έλικας του DNA φαίνεται να βελτιώνεται κατά πολύ, από µια αντίστροφη γυράση (τύπου Ι τοποϊσοµεράση) που προκαλεί θετικές αναδιπλώσεις δίνοντας µεγαλύτερη σταθερότητα στο µόριο. Επιπλέον, τα αρχαία υπερθερµόφιλα έχουν ιστόνες, που σχετίζονται φυλογενετικά µε τις ιστόνες του πυρήνα στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς. Προσθήκη ιστονών in vitro σε καθαρό DNA, έχει ως αποτέλεσµα την δραµατική αύξηση του σηµείου τήξεως του µορίου. 4.2.2 Ριβονουκλεϊκά οξέα Η δοµή των ριβονουκλεϊκών οξέων φαίνεται να σταθεροποιείται περισσότερο αφενός µε την ύπαρξη αυξηµένης περιεκτικότητας σε ζεύγη βάσεων γουανίνης- κυτοσίνης και αφετέρου µε τις µετα-µεταγραφικές τροποποιήσεις. 4.3 Θερµική σταθεροποίηση µεµβρανών Είναι σαφές ότι η σύνθεση της µεµβράνης του κυττάρου πρέπει να διατηρήσει τον απαιτούµενο βαθµό ρευστότητας για την ορθή της λειτουργία. Τα µεµβρανικά λιπίδια του βακτηριακού υπερθερµόφιλου T. maritima περιέχει ένα ασυνήθιστο γλυκερο-αιθερο-λιπίδιο. Αυτό, σε αντίθεση µε τα εστερολιπίδια που συναντώνται στα µεσόφιλα, µπορεί να αυξήσει σηµαντικά την σταθερότητα των µεµβρανών ενάντια της υδρόλυσης σε υψηλές θερµοκρασίες. Επίσης, όλα τα αρχαία περιέχουν στις µεµβράνες τους αιθερολιπίδια, που
αποτελούνται από διφυτανογλυκερόλη, η οποία προσδίδει µια αξιοσηµείωτη προστασία ενάντια της υδρόλυσης σε υψηλές θερµοκρασίες και όξινο ph. Σε θερµοκρασίες των 100 ο C ήδη αρκετά σύνθετα µόρια χαµηλού µοριακού βάρους, όπως το ATP και το NAD υδρολύονται γρήγορα (χρόνος ηµιζωής κάτω από 30 λεπτά in vitro) και θερµικά ασταθή αµινοξέα, όπως η κυστεϊνη και η γλουταµίνη αποσυντίθενται. Η επιβίωση, λοιπόν, αυτών οργανισµών που αναπτύσσονται σε υψηλές θερµοκρασίες µπορεί να διασφαλίζεται από ταχύτατη επανασύνδεση των θερµοευαίσθητων µορίων. Κατ αυτόν τον τρόπο, η διαπερατότητα των µεµβρανών σε πρωτόνια γίνεται τόσο υψηλή, ώστε διατηρούµενο το ηλεκτροχηµικό τους πρανές να αποκτάται ενέργεια. Η µέγιστη θερµοκρασία ανάπτυξης βρίσκεται µεταξύ 113-150 ο C. Μέσα σ αυτό το εύρος θερµοκρασίας τα θερµοευαίσθητα µόρια πιθανόν διατηρούνται από επανασύνθεση σε βιολογικά εφικτούς ρυθµούς. 5. Θρέψη (υπερ)θερµόφιλων Τα (υπερ)θερµόφιλα είναι προσαρµοσµένα σε ευδιάκριτους περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η σύσταση του περιβάλλοντος σε µέταλλα, τα αέρια, το ph, η θερµοκρασία, η αλατότητα. Τα περισσότερα από αυτά παρουσιάζουν χηµειο-λιθο-αυτοτροφικό τρόπο θρέψης. Σύµφωνα µε αυτόν τον τρόπο θρέψης οι ανόργανες οξειδωτικές αντιδράσεις χρησιµεύουν ως πηγή ενέργειας και το CO 2 είναι η µόνη πηγή άνθρακα που απαιτείται για να δηµιουργηθεί οργανική κυτταρική ύλη. Οι οργανισµοί αυτοί παράγουν CO 2 µέσω της χηµειοσύνθεσης. Οι αντιδράσεις αυτές γίνονται είτε υπό αερόβιες είτε υπό αναερόβιες συνθήκες. Το Η 2 χρησιµεύει ως σηµαντικός ηλεκτρονιοδότης. Εάν στο περιβάλλον υπάρχουν ηφαιστειογενή αέρια, τότε το θείο και ο σίδηρος µπορεί να λειτουργήσουν ως ηλεκτρονιοδότες. Τα (υπερ)θερµόφιλα που αναπτύσσονται υπό αναερόβιες συνθήκες βρίσκονται σε περιβάλλοντα χαµηλής συγκέντρωσης σε οξυγόνο (λιγότερο από 10ppm). Τα (υπερ)θερµόφιλα που αναπτύσσονται υπό αναερόβιες συνθήκες χρησιµοποιούν άζωτο, θείο, σίδηρο και διοξείδιο του άνθρακα. Πολλά χηµειο-λιθο-αυτότροφα (υπερ)θερµόφιλα µπορεί να είναι ταυτόχρονα και ετερότροφα. Αυτά είναι ικανά να χρησιµοποιούν υλικά εναλλακτικά των ανόργανων τροφών όποτε αυτό επιβάλλεται από το περιβάλλον τους. Τα ετερότροφα (υπερ)θερµόφιλα κερδίζουν ενέργεια µέσω αερόβιας αναπνοής, µέσω διαφορετικών τύπων αναερόβιας αναπνοής που χρησιµοποιούν οργανική ύλη ως ηλεκτρονιοδότες ή µέσω ζύµωσης. 6. Εφαρµογές των θερµόφιλων και των υπερθερµόφιλων ενζύµων Τα ένζυµα των µεσόφιλων οργανισµών δεν ταιριάζουν στις σκληρές συνθήκες που απαιτούνται στις βιοµηχανικές διαδικασίες, εξαιτίας της έλλειψης ενζυµικής σταθερότητας. Η ανακάλυψη των θερµόφιλων και των υπερθερµόφιλων οργανισµών είχε τεράστια επιρροή στον τοµέα της βιοκατάλυσης. Έτσι τα ένζυµα των οργανισµών αυτών καταλαµβάνουν προεξέχουσα θέση στην µοντέρνα βιοτεχνολογία, βελτιστοποιώντας ή ακόµα αντικαθιστώντας διαδικασίες που ήδη υπάρχουν. Βασισµένοι στην µοναδική σταθερότητα των ενζύµων σε υψηλές θερµοκρασίες, ακραίο ph και υψηλή πίεση που ταυτόχρονα συνδυάζεται µε την αλατότητα, τα οργανικά διαλύµατα και τα µέταλλα, οι επιστήµονες υπόσχονται βελτίωση των βιοµηχανικών εφαρµογών. 6.1 Τροποποίηση αµύλου Πολλά ένζυµα που προέρχονται από (υπερ)θερµοφιλικά αρχαία εµπλέκονται στον µεταβολισµό των υδατανθράκων, ειδικά αυτά που ανήκουν στην οικογένεια της γλυκοσιδικής υδρολάσης. Αυτά τα ένζυµα έχουν µεγάλο βιοµηχανικό ενδιαφέρον, καθώς µετατρέπουν το άµυλο σε πιο πολύτιµα προϊόντα, όπως η γλυκόζη και η φρουκτόζη. Στη διαδικασία τροποποίησης αµύλου απαιτούνται υψηλές θερµοκρασίες αφενός για την ρευστοποίηση του αµύλου και αφετέρου για την πραγµατοποίηση ενζυµατικής υδρόλυσης. Επίσης, η συνεργετική δράση των θερµικά σταθερών αµυλασών, πουλουλανασών και α-
γλυκοσιδασών είναι πλεονέκτηµα γι αυτές τις διαδικασίες, χαµηλώνοντας το κόστος παραγωγής του σιροπιού. Επιπρόσθετα, η χρήση τέτοιων ενζύµων µπορεί να οδηγήσει σε καινοτόµα προϊόντα βασιζόµενα στο άµυλο και έχοντας χαρακτηριστικά ζελατίνης. Αυτά τα προϊόντα ορίζονται ως γραµµικές δεξτρίνες και µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως λιπαρά υποκατάστατα, πρεβιοτικά και σταθεροποιητές αρωµάτων. Η άριστη θερµοκρασία δραστηριότητας των αµυλασών κυµαίνεται µεταξύ 80-100 ο C. H υψηλή θερµική σταθερότητα των εξωκυτταρικών α-αµυλασών του Pyrococcus sp. (διατηρεί τη δραστηριότητα του ακόµα και στους 130 ο C) καθιστά αυτά τα ένζυµα ιδανικά για την συγκεκριµένη βιοµηχανική εφαρµογή. Για τις θερµικά σταθερές πουλουλανάσες που υδρολύουν α-1,6 γλυκοσιδικούς δεσµούς στην πουλουλάνη και σε διακλαδισµένους ολιγοσακχαρίτες, έχει αναφερθεί βέλτιστη θερµοκρασία ανάπτυξης µεταξύ 90-105 ο C, ακόµα και σε απουσία του υποστρώµατος και των ιόντων ασβεστίου. Αυτά τα ένζυµα υπόσχονται βελτίωση της διαδικασίας βιοµετατροπής του αµύλου, διεκπεραιώνοντας την διαδικασία της σακχαροποίησης σε χαµηλότερο ph και υψηλότερες θερµοκρασίες. Το γονίδιο µια α-αµυλάσης του θερµοφιλικού αρχαίου Thermococcus hydrothermalis κλωνοποιήθηκε πρόσφατα και εκφράστηκε στο E. coli. Αυτή η αµυλάση είναι άριστα ενεργή στους 75-85 ο C και σε ph 5-5,5. Μια θερµικά σταθερή γλυκοσιδάση από το Thermococcus agrreans είναι ενεργή στους 90 ο C και κλωνοποιήθηκε στο E. coli. Διασπά α-1,6 και α-1,4 γλυκοσιδικούς δεσµούς παρέχοντας µίγµα µαλτοτριόζης, πανόζης, γλυκόζης, µαλτόζης. Το ένζυµο αυτό είναι επίσης ικανό να διασπά το άµυλο σε αµυλόζη και αµυλοπηκτίνη σχηµατίζοντας µαλτοτριόζη και µαλτόζη ως κύρια προϊόντα. 6.2 DNA πολυµεράση (pol Taq) Η DNA πολυµεράση του θερµόφιλου Thermus aquanticus (pol Taq) χρησιµοποιείται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR), µέθοδος για την ενίσχυση µικρών τµηµάτων DNA. Εντοπίστηκε ως ένα ένζυµο που µπορεί να αντέξει τις υψηλές θερµοκρασίες που απαιτούνται για την PCR. Έτσι, αντικατέστησε την DNA πολυµεράση του E. coli που αρχικά χρησιµοποιούνταν. Η βέλτιστη θερµοκρασία για την δραστηριότητα του ενζύµου είναι 75-80 ο C. Ο χρόνος ηµιζωής του είναι 9 λεπτά σε 97,5 ο C και µπορεί να κλωνοποιήσει DNA µήκους 1000 ζευγών βάσεων σε λιγότερο από 10 δευτερόλεπτα στους 72 ο C. Ένα µειονέκτηµα της DNA πολυµεράσης είναι η χαµηλή πιστότητα παραγωγής του, καθώς στερείται 3-5 εξωνουκλεάσης για την επιδιόρθωση. Αυτό έχει ένα ποσοστό σφάλµατος που µετράται περίπου 1 στα 9000 νουκλεοτίδια. Ορισµένες θερµικά σταθερές DNA πολυµεράσες έχουν αποµονωθεί από άλλα βακτήρια και αρχαία, όπως η pfu DNA πολυµεράση, οι οποίες όµως διαθέτουν επιδιορθωτική ικανότητα και χρησιµοποιούνται µαζί µε την Taq πολυµεράση για την ενίσχυση της πιστότητας. Η ενζυµική διαδικασία PCR χρησιµοποιείται για τον πολλαπλασιασµό τµηµάτων DNA ώστε αυτά να χρησιµοποιηθούν σε γενετικές ταυτοποιήσεις, γενετικές εξετάσεις, ιατρικές διαγνώσεις, έλεγχων γενετικών και άλλων ασθενειών. Τέλος, χρησιµοποιείται στην εγκληµατολογία για την εξακρίβωση γενετικών αποτυπωµάτων. 6.3 Εστεράσες και λιπάσες Οι εστεράσες και οι λιπάσες έχουν την πιο ευρεία χρήση ως βιοκαταλύτες σε χηµικές εφαρµογές, κυρίως χάρη στα πλεονεκτήµατα αυτών των καταλυτών για την παραγωγή οπτικά καθαρών ενώσεων. Μια λιπάση του Bacillus thermocatenulatus εκφράστηκε από το E. coli. Το ένζυµο ήταν σταθερό έως ph 11, ενώ η µέγιστη δραστηριότητά του ήταν σε ph 8-9 στους 60-70 ο C. Η συγκεκριµένη λιπάση έδειξε µεγάλη σταθερότητα σε διάφορα απορρυπαντικά και οργανικά διαλύµατα. Μια εστεράση από το Bacillus lincheniformis εκφράστηκε µε την βοήθεια του E. coli. Το ένζυµο είναι σταθερό σε ph 7-8,5. Ο χρόνος ηµιζωής είναι µια ώρα στους 64 ο C.
6.4 Παραγωγή τριαλόζης Μια άλλη πολλά υποσχόµενη εφαρµογή είναι η παραγωγή τριαλόζης, η οποία σταθεροποιεί ένζυµα, αντισώµατα, εµβόλια και ορµόνες. Η διαδικασία αναπτύχθηκε για να παράγει αυτόν τον δισακχαρίτη από δεξτρίνες χρησιµοποιώντας ένζυµα από το Sulfolobus στους 75 ο C σε ελεγχόµενο βιοαντιδραστήρα. Η θερµικά σταθερή κυκλοδεξτρίνη γλυκοτρανσφεράση (CGT) είναι ένα ένζυµο που βρίσκεται στα βακτήρια και πρόσφατα ανακαλύφθηκε και στα αρχαία. Το ένζυµο από το Thermococcus sp., που είναι άριστα ενεργό στους 100 ο C, παράγει σειρές από κυκλικές δεξτρίνες από άµυλο, αµυλόζη και άλλους πολυσακχαρίτες. Η CGT χρησιµοποιείται για την παραγωγή κυκλοδεξτρινών που χρησιµοποιούνται σαν πηκτικοί και σταθεροποιητικοί παράγοντες στα ζελώδη γλυκά, τις σάλτσες, τη ζαχαροπλαστική, τα γαλακτοκοµικά. Τέλος, οι κυκλοδεξτρίνες βελτιώνουν την διαλυτότητα των υδροφοβικών δεσµών σε υδατώδη διαλύµατα που βρίσκει εφαρµογή σε φαρµακευτικές και κοσµητικές βιοµηχανίες. 6.5 Ένζυµα που αποικοδοµούν την κυτταρίνη Η κυτταρίνη είναι το πιο άφθονο οργανικό βιοπολυµερές στη φύση, που µπορεί να υδρολυθεί σε γλυκόζη από τη δράση της ενδογλυκανάσης, της εξωγλυκανάσης και της β- γλυκοσιδάσης. Διάφορες β- γλυκοσιδάσες ανιχνεύτηκαν στα είδη Sulfolobales και συγκρίθηκαν µε τη β- γλυκοσιδάση από το P. furiosus. Η τελευταία είναι ιδιαίτερα σταθερή και έχει άριστη δραστηριότητα στους 103 ο C. Χρησιµοποιώντας ένα µίγµα από αυτές τις β- γλυκοσιδάσες, αναπτύχθηκε µια διαδικασία ενζυµατικής παραγωγής νέων πολυσακχαριτών από λακτόζη, σε πολύ υψηλή θερµοκρασία. Η θερµικά ενεργή β- γλυκοσιδάση από το Pyrococcus horikoshii είναι ενεργή σε οργανικά διαλύµατα και πρόσφατα χρησιµοποιήθηκε για τη σύνθεση ενός ετεροσακχαρίτη µε υψηλή οπτική καθαρότητα. Για την παραγωγή γλυκόζης από κυτταρίνη, αναπτύχθηκε ένα σύστηµα βιοαντιδραστήρα µε ανασυνδυασµένη β-γλυκοσιδάση από το Sulfolobus solfataricus, το οποίο εµφανίζει, µεγάλο βαθµό µετατροπής, παραγωγικότητας και λειτουργικής σταθερότητας. Εφαρµογές που απαιτούν την ύπαρξη κυτταρίνης σχετίζονται µε την παραγωγή αλκοόλ. Επίσης, η παρουσία κυτταρινών στα απορρυπαντικά ενισχύει την λάµψη του χρώµατος των υφασµάτων, προσδίδει απαλότητα και βελτιώνει την αφαίρεση των λεκέδων. 6.6 Πρωτεολυτικά ένζυµα Οι πρωτεάσες και τα πρωτεασώµατα διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στον κυτταρικό µεταβολισµό των θερµόφιλων. Βρέθηκε ότι οι πρωτεάσες των (υπερ)θερµόφιλων είναι σταθερές σε υψηλές θερµοκρασίες ακόµα και παρουσία απορρυπαντικών και µετουσιωτικών παραγόντων. Η πρωτεάση από το αρχαίο Thermococcus stetteri έχει χρόνο ηµιζωής 2,5 ώρες στους 100 ο C. Οι θερµικά σταθερές πρωτεάσες είναι χρήσιµα ένζυµα για την βιοµηχανία των απορρυπαντικών και χρησιµοποιούνται ως προσθετικά στο πλύσιµο. 6.7 Αλκοολικές δεϋδρογονάσες Οι αλκοολικές δεϋδρογονάσες εκπροσωπούν µια σηµαντική κατηγορία βιοκαταλυτών καθώς µπορεί να χρησιµοποιηθούν αποτελεσµατικά στη σύνθεση αλκοολών που είναι βασικές ενώσεις στη χηµική βιοµηχανία. Η αλκοολική δεϋδρογονάση από το ένζυµο Thermococcus litoralis καταλύει την οξείδωση των πρωτοταγών αλκοολών χρησιµοποιώντας NAPD ως συµπαράγοντα. Είναι θερµικά σταθερή µε χρόνο ηµιζωής 15 λεπτά στους 98 ο C και 2 ώρες στους 85 ο C. 6.8 Εστεράσες Οι εστεράσες βρίσκουν εφαρµογή στην βιοτεχνολογία, όσον αφορά τη βιοσύνθεση οπτικά καθαρών χηµικών ενώσεων. Η εστεράση που αποµονώθηκε από το P. furiosus είναι η πιο
θερµικά σταθερή, µε χρόνο ηµιζωής 50 λεπτά στους 126 ο C, και η πιο θερµικά ενεργή, µε ιδανική θερµοκρασία ανάπτυξης 100 ο C. 6.9 Ένζυµα που δηµιουργούν δεσµούς C-C Τα ένζυµα αυτά, όπως οι αλδολάσες και οι τρανσκετολάσες, εφαρµόζονται σε νέες στρατηγικές σύνθεσης σακχάρων. Επίσης, µε την βοήθεια των ενζύµων αυτών, οι επιστήµονες έχουν αναπτύξει νέες θεραπευτικές και διαγνωστικές µεθόδους. 6.10 Περιληπτική αναφορά εφαρµογών άλλων αξιοσηµείωτων ενζύµων Ένζυµα Καταγωγή Εφαρµογή Θερµοκρασία άριστης δραστηριότητας Ενδο-1,4-β- T. maritima Διάσπαση κυτταρίνης 95 ο C γλυκανάση Κελοβιο υδρολάση T. maritima Διάσπαση κυτταρίνης 95 ο C Ενδοξυλανάση Thermotoga sp. Καθαρισµός χαρτόµαζας 90-95 ο C β- µανάση Rhodothermus marinus Επεξεργασία καφέ, έκθλιψη β- ξυλοσιδάση Thermoanaero bacterium Saccharolyticum καφέ Σύνθεση υδατανθράκων, παραγωγή ξυλόζης Λυάση T. thermosuffurigenes Παραγωγή κρασιού, καθαρισµός χυµών φρούτων β- γαλακτοσιδάση T. maritime Παραγωγή λακτόζης και γαλακτοκοµικών προϊόντων διαίτης β- φρουκτοσιδάση T. maritime Βιοµηχανία ζαχαροπλαστικής, β 1,4 ενδογλυκανάση Χιτινάση παραγωγή ιµβερτοποιηµένης ζάχαρης 1 P. furiosus Θρέψη ζώων: για την χώνεψη β- Streptomycer thermoviolaceus γλυκάνης του κριθαριού Παραγωγή βιολογικά ενεργών ολιγοσακχαριτών α- γαλακτοσιδάση T. maritime Σύνθεση ολιγοσακχαριτών µέσω µεταφοράς γλυκοζυλοµάδων, αφαίρεση ραφινόζης από διάλυµα σουκρόζης 85 ο C 105 ο C 75 ο C 80 ο C 95 ο C 100 ο C 80 ο C 90-95 ο C Ιµβερτοποιηµένης ζάχαρης 1 : µίγµα γλυκόζης και φρουκτόζης 7. Επίλογος Τα θερµόφιλα και τα υπερθερµόφιλα αλλά και εν γένει τα ακραιόφιλα, είναι µικροοργανισµοί που πρόσφατα ανακαλύφθηκαν και γοήτευσαν τους επιστήµονες. Προερχόµενοι από τα βακτήρια και τα αρχαία, οι (υπερ)θερµοφιλικοί οργανισµοί ζουν σε µέρη που ο ανθρώπινος νους δεν µπορούσε να φανταστεί µέχρι πρόσφατα ότι µπορεί να υπάρξει ζωή. Είναι αξιοσηµείωτη η προσαρµογή αυτών των οργανισµών σε ισχυρά όξινα ή βασικά περιβάλλοντα, µε µεγάλη αλατότητα, σε περιβάλλοντα µε µέταλλα που για τον άνθρωπο είναι τοξικά, σε τοποθεσίες µε ακραίες θερµοκρασίες, πιέσεις και ακόµα µε ισχυρή ακτινοβολία. Έτσι, το ενδιαφέρον των επιστηµόνων, δικαιολογηµένα στράφηκε στην µελέτη
των µηχανισµών µε τους οποίους οι µικροοργανισµοί αυτοί προσαρµόζονται στα ακραία περιβάλλοντα. Οι έρευνες για την πλήρη κατανόηση της θερµικής προσαρµογής των πρωτεϊνών, των νουκλεϊκών οξέων και των µεµβρανών βρίσκεται ακόµα σε εξέλιξη. Ωστόσο, οι µέχρι τώρα γνώσεις, έχουν οδηγήσει σε θαυµάσιες εφαρµογές των ενζύµων στην ιατρική, στην βιοτεχνολογία, στην εγκληµατολογία και στην βιοµηχανία τις οποίες συναντάµε ακόµα και στην καθηµερινή µας ζωή. Οι εφαρµογές αυτές χαρακτηρίζονται από ταχύτητα, αποτελεσµατικότητα, ποιότητα και φυσικά οικολογική δραστηριότητα. 8. Βιβλιογραφία και αναφορές 1. Factors influencing the stability of helices and strands in thermophilic ribonuclease, Preparative Biochemistry & Biotechnology- M. Michael Gromiha 2. Discrimination of mesophilic and thermophilic proteins using machine learning algrythms- M. Michael Gromiha 3. Hyperthermophilic enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanisms for thermostability- Claire Vieille and Gregory J. Zeikus 4. Thermodynamic stability and folding of proteins from hyperthermophilic organisms- Kathryn A. Luke, Catherine L. Higgins, Pernilla Wittung- Stafshede 5. Enzymes from extremophiles- David C Demirjian, Fransisco Moris- Varas, Constance S. Cassidy 6. Industrial relevance of thermophilic Archaea- Ksenia Egorova and Garabed Antranikian 7. Proteins from hyperthermophiles: stability and enzymatic catalysis close to the boiling point of water, Advances in biochemical engineering/ biotechnology- Rudolf Ladenstein and Garabed Antranikian 8. www.nasa.gov 9. www.astrobio.net 10. www.encyclopedia.com 11. www.theguardians.com 12. www.wikipedia.com 13. www.sciencedirect.com 14. www.suite101.com 15. www.springerlink.com