9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Η ΣΥΝΟΛΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΒΙΟΔΕΙΚΤΩΝ ΣΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΜΕ ΤΗ ΒΙΟΣΥΣΣΩΡΕΥΣΗ ΡΥΠΩΝ ΩΣ ΕΡΓΑΛΕΙΟ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΡΥΠΑΝΣΗΣ: ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΜΥΔΙΑ ΤΟΠΟΘΕΤΗΜΕΝΑ ΣΕ ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΠΑΡΑΚΤΙΑ ΝΕΡΑ Τσαγκάρη A. 1, Χατζηανέστης Ι. 1, Κατσίκη Α. 1, Στρογγυλούδη Ε. 1, Galgani F. 2, Andral B. 2 1 Ινστιτούτο Ωκεανογραφίας, Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών, ctsangar@ath,hcmr.gr 2 Laboratoire Cotier de Toulon-La Seyne, IFREMER, Περίληψη Η συνολική αντίδραση βιοδεικτών (Integrated Biomarker Response, IBR index) εφαρμόστηκε ως δείκτης περιβαλλοντικής έντασης σε μύδια εγκατεστημένα για 3 μήνες σε δίκτυο σταθμών στα ελληνικά παράκτια ύδατα που περιλάμβανε περιοχές που επηρεάζονται από ανθρωπογενείς δραστηριότητες και περιοχές μακρυά από πηγές ρύπανσης. Για τον υπολογισμό του δείκτη χρησιμοποιήθηκαν μετρήσεις τεσσάρων βιοδείκτών, της ακετυλοχολινεστεράσης (ACHE), της καταλάσης (CAT), της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST) και της μεταλλοθειονείνης (MT). Ο δείκτης IBR διέκρινε διαφορές ανάμεσα στις περιοχές που επηρεάζονται από ανθρωπογενής δραστηριότητες και σε αυτές που θεωρήθηκαν περιοχές αναφοράς. Η σύγκριση του βαθμού ομοιότητας διαγραμμάτων αστέρων του δείκτη ΙΒR και των συγκεντρώσεων ρύπων στους ιστούς των μυδιών έδειξε σχέση μεταξύ του δείκτη IBR και των συγκεντρώσεων πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (PAHs), οργανοχλωριωμένων ενώσεων (PCBs, DDTs) ενω δεν βρέθηκαν σχέσεις του δείκτη με τις συγκεντρώσεις βαρέων μετάλλων (Cu, Ni, Fe, Mn). Ο δείκτης IBR αποδείκτηκε χρησιμο εργαλείο για μια ολοκληρωμένη προσέγγιση στην εκτίμηση των επιδράσεων ρύπανσης στα μύδια και τη διάκριση μεταξύ επιβαρυμένων και μη επιβαρυμένων με ρύπανση περιοχών. Λέξεις κλειδιά: δείκτης IBR, Μytilus galloprovincialis, βιοπαρακολούθηση, βιοδείκτες, χημικοί ρύποι. INTEGRATED BIOMARKER RESPONSE COMBINED WITH BIOACCUMULATION OF POLLUTANTS AS A TOOL FOR POLLUTION ASSESSMENT: APPLICATION IN TRANSPLANTED MUSSELS IN GREEK COASTAL WATERS Tsangaris C. 1, Hatzianestis I. 1, Catsiki V.A. 1, Strogyloudi E. 1, Galgani F. 2, Andral B. 2 1 Institute of Oceanography, Hellenic Centre for Marine Research, ctsangar@ath,hcmr.gr 2 Laboratoire Cotier de Toulon-La Seyne,, IFREMER, Abstract The integrated biomarker response (IBR) index was applied to evaluate environmental stress in mussels transplanted for 3 months at several stations on the Greek coastline including areas influenced by anthropogenic activities and areas away from known pollution sources. Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAHs), organochlorine compounds (PCBs, DDTs) and heavy metal (Cu, Ni, Fe, Mn) concentrations were measured in the tissues of the transplanted mussels. Four biomarkers were measured and used for the calculation of the IBR index, acetylcholinesterase (ACHE), catalase (CAT), glutathione S-transferase (GST) and metallotheionein (MT). The IBR index discriminated areas influenced by anthropogenic activities from those regarded as reference sites. Star plots of the IBR index and pollutant concentrations were visually compared and showed accordance of the IBR index with PCBs, DTTs and PAHs concentrations but not heavy metal concentrations. The IBR index proved a useful tool for integrating pollution effects in mussels and differentiating between polluted and non-polluted areas. Keywords: IBR index, Mytilus galloprovincialis, biomonitoring, biomarkers, chemical pollutants. 1. Εισαγωγή Οι βιοδείκτες (biomarkers) αντικατοπτρίζουν επιδράσεις περιβαλλοντικών παραγόντων έντασης στους οργανισμούς και χρησιμοποιούνται ευρέως τις τελευταίες δεκαετίες ως εργαλεία για την εκτίμηση και παρακολούθηση των επιπτώσεων της ρύπανσης (Walker et al., 2006). Για μια ολοκληρωμένη προσέγγιση στην εκτίμηση της ρύπανσης εφαρμόζονται συνδυασμένες μετρήσεις βιοδει- -1318-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ κτών που δείχνουν διαφορετικές επιδράσεις ή/και αντιδρούν σε συγκεκριμένα είδη ρύπων. Ωστόσο, επειδή οι μετρήσεις των μεμονωμένων βιοδεικτών δε δίνουν μια γενική εικόνα της κατάστασης της ρύπανσης σε μια περιοχή, έχουν προταθεί μεθοδολογίες που ολοκληρώνουν τις αντιδράσεις των βιοδεικτών σε ενιαίους δείκτες (Broeg & Lehtonen, 2006). Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Integrated Biomarker Response (συνολική αντίδραση βιοδεικτών) ή αλλιώς IBR που προτάθηκε από τους Beliaeff & Burgeot (2002) για να συνοψίσει τα αποτελέσματα μετρήσεων βιοχημικών βιοδεικτών σε μύδια Mytilus galloprovincialis τοποθετημένα σε παράκτιες περιοχές στον ελληνικό χώρο. Η χρήση μυδιών τοποθετημένων σε κλωβούς που ποντίζονται στις περιοχές μελέτης επιτρέπει τον έλεγχο του μεγέθους και της αναπαραγωγικής κατάστασης των οργανισμών-δεικτών και εφαρμόζεται συχνά σε μελέτες βιοπαρακολούθησης (Andral et al., 2004). Οι βιοχημικοί βιοδείκτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: ακετυλοχολινεστεράση (ACHE) ως δείκτης νευροτοξικότητας, καταλάση (CAT) ως δείκτης οξειδωτικής έντασης, τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) ως δείκτης της φάσης ΙΙ βιομετατροπής οργανικών ρύπων και μεταλλοθειονίνη (MT) ως δείκτης έκθεσης σε βαρέα μέταλλα. Η συνολική αντίδραση βιοδεικτών συσχετίστηκε με τα επίπεδα ρύπων (ΠΑΥs, PCBs, DDTs, βαρέων μετάλλων) στους ιστούς των μυδιών. Σκοπός της μελέτης ήταν να συνδυάσει τα αποτελέσματα των μετρήσεων διαφορετικών βιοδεικτών και των επίπεδων βιοσυσσώρευσης ρύπων σε μύδια για την εκτίμηση της ρύπανσης σε διαφορετικές περιοχές στα ελληνικά παράκτια. 2. Μεθοδολογία Το Μάιο 2007, μύδια μεγέθους 5-6cm προερχόμενα από μυδοτροφείο του Β.Δ. Σαρωνικού τοποθετήθηκαν σε κλωβούς και ποντίστηκαν για τρεις μήνες στα 6 m από την επιφάνεια σε δίκτυο 14 σταθμών βάθους 20-30 m στα ελληνικά παράκτια. Επιλέχθηκαν σταθμοί σε περιοχές που δέχονται διαφορετικά είδη ρύπανσης κοντά σε αστικά κέντρα, βιομηχανικές μονάδες, εκβολές ποταμών, καθώς και σταθμοί μακρυά από πηγές ρύπανσης ως περιοχές αναφοράς (Εικ. 1). Οι ιστοί των μυδιών αφαιρέθηκαν αμέσως μετά τη συλλογή τους: τα βράγχια και οι πεπτικοί αδένες 25 ατόμων (5 ομαδοποιημένα δείγματα) που προορίζονταν για τις αναλύσεις βιοδεικτών ψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και φυλλάχθηκαν στους 70º C ενώ οι μαλακοί ιστοί 150 περίπου ατόμων που προορίζονταν για τις χημικές αναλύσεις φυλλάχθηκαν στους 20º C. Εικ. 1: Σταθμοί όπου τοποθετήθηκαν οι κλωβοί των μυδιών σε διαφορετικές περιοχές στα ελληνικά παράκτια. -1319-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ 2.1. ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΒΙΟΔΕΙΚΤΩΝ Οι ενζυμικές δραστικότητες προσδιορίστηκαν φασματοφωτομετρικά σε microplate reader (Dιgiscan reader 340, Assys), οι δραστικότητες CAT και GST στους πεπτικούς αδένες και η δραστικότητα ACHE στα βράγχια. Η δραστικότητα CAT προσδιορίστηκε όπως περιγράφουν οι Cohen et al. (1996). Η δραστικότητα GST προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Habig et al. (1974) προσαρμοσμένη σε microplate reader όπως περιγράφουν οι Mc Farland et al. (1999). Η δραστικότητα ACHE προσδιορίστηκε όπως περιγράφουν οι Bocquené et al. (1993). Τα επίπεδα MT προσδιορίστηκαν στους πεπτικούς αδένες σύμφωνα με τη φασματοφωτομετρική μέθοδο των Viarengo et al. (1997). 2.2. ΧΗΜΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ Ο προσδιορισμός των πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (ΠΑΥ) έγινε με αέρια χρωματογραφία φασματομετρία μαζών ύστερα από σαπωνοποίηση του ιστού και καθαρισμό με χρωματογραφία στήλης (Hatzianestis et al., 2000). Προσδιορίστηκαν συνολικά 25 υποκατεστημένοι και μη ΠΑΥ. Ο προσδιορισμός των οργανοχλωριωμένων ενώσεων έγινε με αέρια χρωματογραφία με ανιχνευτή συλλήψεως ηλεκτρονίων (ECD) ύστερα από εκχύλιση του ιστού και καθαρισμό με χρωματογραφία στήλης (Hatzianestis et al., 2000). Προσδιορίστηκαν 11 πολυχλωριωμένα διφαινύλια (PCBs) το DDT και οι δύο κύριοι μεταβολίτες του DDD και DDE. Ο προσδιορισμός των μετάλλων στα μύδια πραγματοποιήθηκε σε 4 ανεξάρτητα δείγματα των 20 ατόμων για κάθε σταθμό και περιελάμβανε λυοφίληση, ομογενοποίηση και χώνευση υπό πίεση με ΗΝΟ3. Ο προσδιορισμός των μετάλλων Cu, Ni, Fe, Mn πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της φασματοφωτομετρίας ατομικής απορρόφησης με φλόγα σε συσκευή VARIAN AA 175. 2.3. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΣΥΝΟΛΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΒΙΟΔΕΙΚΤΩΝ (ΔΕΙΚΤΗΣ IBR) Εφαρμόστηκε ο δείκτης IBR, μέθοδος που συνοψίζει τις αντιδράσεις βιοδεικτών γραφικά με τη χρήση διαγραμμάτων αστέρων (star plots) (Beliaeff and Burgeot, 2002). Συνοπτικά ο δείκτης IBR υπολογίζεται ως εξης: Υπολογίζεται κατ αρχάς για κάθε βιοδείκτη η μέση τιμή (x) και η τυπική απόκλιση (s) των τιμών όλων των σταθμών. Στη συνέχεια υπολογίζεται για κάθε σταθμό η τυποποιημένη τιμή βάσει του τύπου : x i = (x i μέσο x)/s όπου xi η μέση τιμή κάθε σταθμού. Η τιμή x i παίρνει θετικό πρόσημο (+ x i ) αν ο βιοδείκτης επάγεται και αρνητικό πρόσημο (-x i ) αν αυτός καταστέλεται υπό την επίδραση ρύπανσης. Σε αυτήν προστίθεται η απόλυτη τιμή του ελάχιστου x για όλους τους σταθμούς που δίνει την τιμη Β που χαρακτηρίζει κάθε σταθμό. Στη συνέχεια υπολογίζεται ο δείκτης IBR για κάθε σταθμό από τις τιμές Β i των τεσσάρων βιοδεικτών που μελετήσαμε : IBR= {[(Β 1 ΧΒ 2 )/2] + [(Β 2 ΧΒ 3 )/2] +. [(Β n-1 ΧΒ n )/2] + [(Β n ΧΒ 1 )/2] και αντιστοιχεί στο εμβαδόν διαγράμματος αστέρων (star plot) όπου απεικονίζονται οι τιμές Β 1 - Β n. 2.4. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Οι σχέσεις μεταξύ δείκτη IBR και συγκεντρώσεων ΠΑΥs, PCBs, DTTs και βαρέων μετάλλων στους ιστους των μυδιών εξετάστηκαν βάσει του συντελεστή συσχέτισης r (Spearman s correlation coefficient) με χρήση του προγράμματος SPSS. 3. Αποτελέσματα Οι τυποποιημένες τιμές Β που χρησιμοποιήθηκαν στον υπολογισμό του δείκτη IBR διέφεραν ανάμεσα στους σταθμούς (Πίν. 1) όπως και τα αρχικά δεδομένα των βιοδεικτών. Σημειώνεται ότι οι μηδενικές τιμές του Β αντιστοιχούν στην ελάχιστη αντίδραση κάθε βιοδείκτη και οι υψηλότερες τιμές στη μέγιστη αντίδραση. -1320-
5,00 3,00 1,00 7,00 6,00 5,00 3,00 1,00 9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Πίνακας 1: Τυποποιημένες τιμές (Β) των βιοδεικτών που χρησιμοποιήθηκαν στον υπολογισμό του δείκτη IBR. Σταθμός Περιοχή ACHE CAT GST MT Σαρωνικός κόλπος (Αγ. Κοσμάς) 1,30 2,53 1,90 2,80 Θερμαϊκός κόλπος (Θεσσαλονίκη) 2,84 3,86 1,87 Θερμαϊκός κόλπος (εκβολές Αξιού) 2,35 2,35 2,39 0,24 Μαλιακός κόλπος 2,43 2,21 2,30 1,71 Κορινθιακός κόλπος 2,17 2,85 1,85 1,30 Βόρειος Ευβοϊκός κόλπος 1,80 1,31 1,66 0,46 Εκβολές Ασωπού ποταμού 1,67 2,49 3,52 0,02 Σαντορίνη (ναυάγιο Sea Diamond) 0,26 3,57 0,89 2,94 Παγασητικός κόλπος (Μηλίνα) 2,47 2,29 0,15 0,07 Εκβολές Νέστου ποταμού 1,94 0,02 0,62 Λέσβος 0,52 1,35 0,04 Ρόδος 0,51 1,93 0,24 Αλόννησος 0,48 2,08 1,81 0,35 Γαύδος 0,26 3,38 2,02 0,98 IBR PCBs 1 8,00 15,00 6,00 1 5,00 DDTs PAHs 1 1 8,00 80 60 6,00 40 20 0 Cu Ni Εικ. 2: Διαγράμματα αστέρων του δείκτη IBR και των συγκεντρώσεων PCBs (ng/g), PAHs (ng/g), DDTs (ng/g), Cu (μg/g) και Ni (μg/g) στους ιστούς μυδιών από 14 σταθμούς στα ελληνικά παράκτια. Ο δείκτης ΙΒR φαίνεται να απεικονίζει την κατάσταση ρύπανσης στο θαλάσσιο περιβάλλον, αφού, όπως δείχνει το αντίστοιχο διαγραμμα αστέρα στην Εικόνα 2, εμφάνισε υψηλότερες τιμές -1321-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ στους σταθμούς των περιοχών που δέχονται ρύπανση (, GR 25,,,,, ). Το μήκος κάθε ακτίνας αντιστοιχεί στην τιμή IBR κάθε σταθμού και οι σταθμοί σε περιοχές που δέχονται ρύπανση απεικονίζονται στο δεξιό τμήμα του αστέρα. Ωστόσο αυξημένες τιμές IBR βρέθηκαν και στους σταθμούς στη Γαύδο και στη Σαντορίνη. Προκειμένου να δοθούν στοιχεία για την κατάσταση ρύπανσης των διαφόρων περιοχών που μελετήθηκαν, απεικονίζονται επίσης στην Εικόνα 2 σε διαγράμματα αστέρων οι συγκεντρώσεις PCBs, DTTs, ΠΑΥs, Cu και Ni στους ιστούς των μυδιών σε σχέση με το δείκτη ΙΒR ώστε να είναι δυνατή η σύγκριση του βαθμού ομοιότητας ή διαφοράς. Από τα διαγράμματα της Εικόνας 2 φαίνεται σημαντικός βαθμός ομοιότητας μεταξύ των διαγραμμάτων ΙΒR και PCBs (με εξαίρεση τους σταθμούς και ) ενώ τα διαγράμματα ΙΒR και DDTs όπως και ΠΑΥs συμφωνουν σε μικρότερο βαθμό. Αντίθετα τα διαγράμματα Cu και Ni διαφέρουν από το διάγραμμα ΙΒR, αφού δεν παρουσιάζουν διαφορές ανάμεσα σε σταθμούς που δεχονται ρύπανση και σε σταθμούς μακρυά από πηγές ρύπανσης. Αντίστοιχα η στατιστική ανάλυση έδειξε σημαντική συσχέτιση βάσει του συντελεστή r μεταξύ δείκτη ΙΒR και PCBs, μικρότερη αλλά επίσης σημαντική συσχέτιση μεταξύ δείκτη ΙΒR και DDTs και IBR και ΠΑΥs ενώ συσχέτιση μεταξύ δείκτη ΙΒR και Cu, Fe, Νι, Mn δεν παρατηρήθηκε (Πίν.2). Πίνακας 2: Συντελεστης συσχέτισης r (Spearman s correlation coefficient) μεταξύ δεικτη IBR και συγκεντρώσεων PCBs, DDTs, ΠAYs, Cu, Fe, Zn στους ιστούς των μυδιών. **p<0,01, * p<0,05 IBR PCBs 0.745** DDTs 0.502* ΠAYs 0.477* Cu -0.106 Fe -0.187 Νi 0.116 Μn 0.174 4. Συμπεράσματα - Συζήτηση Η συνολική αντίδραση βιοδεικτών χρησιμοποιείται ως γενικός δείκτης περιβαλλοντικής έντασης που σε συνδυασμό με τα επίπεδα χημικών ρύπων μπορεί να δώσει πληροφορίες για σχέσεις αιτίου (χημικού ρύπου) και αποτελέσματος (βιολογικών επιδράσεων) (Beliaeff & Burgeot, 2002). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει καλή σχέση του δείκτη IBR με τα επίπεδα βιοσυσσώρευσης χημικών ρύπων σε μύδια (Bocquene et al., 2004; Damiens et al., 2007; Pytharopoulou et al., 2008). Στην παρούσα μελέτη η συνολική αντίδραση βιοδεικτών έδειξε συνθήκες έντασης σε μύδια τοποθετημένα σε παράκτιες περιοχές που δέχονται ρύπανση (Σαρωνικός, Θερμαϊκός, Μαλιακός, Κορινθιακός, Β. Ευβοϊκός, εκβολές Ασωπού) και σχετίστηκε με τα επίπεδα PCBs, DDTs και ΠΑΥs στους ιστούς αυτών. Η επιλογή των βιοδεικτών έγινε ώστε να περιλαμβάνει αντιδράσεις σε διαφορετικούς τύπους ρύπων (ΜΤ: βαρέα μέταλλα, GST: οργανικοί ρύποι, ACHE: οργανοφωσφορικά και καρβαμιδικά φυτοφάρμακα, CAT: βαρέα μέταλλα και οργανικοί ρύποι) αλλά και διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες ή επιδράσεις (ΜΤ: αποτοξικοποίηση βαρέων μετάλλων, GST:αποτοξικοποίηση οργανικών ρύπων, ACHE: νευροτοξικότητα, CAT: οξειδωτική ένταση) ώστε να μην υπερεκτιμηθεί η σημασία κάποιου τύπου ρύπων ή λειτουργίας/επίδρασης στην τιμή του γενικού δείκτη IBR (Broeg & Lehtonen, 2006). Η χρήση συνδυασμού βιοδεικτών για την εκτίμηση επιπτώσεων ρύπανσης είναι σημαντική ώστε να αποφεύγονται εσφαλμένες εκτιμήσεις που θα μπορούσε να δώσει η χρήση ενός μόνο βιοδείκτη (Beliaeff & Burgeot, 2002). Για παράδειγμα, στην παρούσα μελέτη η χρήση του -1322-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ δείκτη MT θα έδειχνε σημαντικά αυξημένες τιμές μόνο σε 4 από τους 8 σταθμούς όπου βρέθηκε ένταση βάσει του δείκτη IBR. Αξίζει να σημειωθεί ότι βάσει του δείκτη IBR, ένταση βρέθηκε στους σταθμούς στη Γαύδο και στη Σαντορίνη όπου τα επίπεδα χημικών ρύπων ήταν χαμηλά, αποτέλεσμα που τονίζει τη σημασία της συνδυασμένης μέτρησης βιοδεικτών και χημικής ανάλυσης για την εκτίμηση της ρύπανσης σε μια περιοχή. Η ένταση στους παραπάνω σταθμούς πιθανόν σχετίζεται με φυσικούς περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως οι τροφικές συνθήκες αφού σε αυτές τις περιοχές στο Ν. Αιγαίο δεν υπάρχουν φυσικοί πληθυσμοί μυδιών. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη έδειξε επιπτώσεις ρύπανσης στα ελληνικά παράκτια σε σταθμούς κοντά σε αστικά κέντρα και βιομηχανικές μονάδες που συνδέθηκαν με τα επίπεδα βιοσυσσώρευσης PCBs, DDTs και ΠΑΥs και επιβεβαίωσε την χρησιμότητα της συνολικής αντίδρασης βιοδεικτών (δείκτης IBR) ως εργαλείου για μια ολοκληρωμένη προσέγγιση στην εκτίμηση των επιδράσεων ρύπανσης. 5. Ευχαριστίες H μελέτη πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του προγράμματος Interreg III B MEDOCC, MY- TIMED -Développement d un réseau interrégional de surveillance de la qualité des eaux côtières par des bio-intégrateurs pour la protection durable de la Méditerranée Orientale. 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Andral, B, Stanisiere, J.Y., Sauzade, D., Damier, E., Thebault, T., Galgani, F. & Boissery, P., 2004. Monitoring chemical contamination levels in the Mediterranean based on the use of mussel caging. Marine Pollution Bulletin, 49: 704 712. Belliaeff, B. & Burgeot. T., 2002. Integrated Biomarker Response: A useful tool for ecological risk assessment. Environmental Toxicology and Chemistry, 21: 1316 1322. Bocquené, G, Galgani, F., Burgeot, T., Le Dean., L. & Truquet, P., 1993. Acetylcholinesterase levels in marine organisms along French coasts. Marine Pollution Bulletin, 26: 101-106. Bocquené, G., Chantereau, S., Clérendeau, C., Beausir, E., Ménard1, D., Raffin, B., Minier, C., Burgeot, T., Leszkowicz, A. P., & Narbonne J-F., 2004. Biological effects of the Erika oil spill on the common mussel (Mytilus edulis) Aquatic Living Resources, 17: 309 316. Broeg, K. & Lehtonen, K. K., 2006. Indices for the assessment of environmental pollution of the Baltic Sea coasts: Integrated assessment of a multi-biomarker approach. Marine Pollution Bulletin, 53: 508 522. Cohen, G., Kim, M. & Ogwu V., 1996. A modified catalase assay suitable for a plate reader and for the analysis of brain cell cultures. Journal of Neuroscience Methods, 67: 53-56. Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., & Salbert V., 2007. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. Chemosphere, 66: 574 583. Habig, W.H., Pabst, M.J. & Jakoby, W.B, 1974. Glutathione S-Transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry, 249: 7130-7139. Hatzianestis, I., Sklivagou, E. & Georgakopoulou, E., 2000. Organic contaminants in sediments and mussels from Thermaikos gulf, Greece. Toxicological and Environmental Chemistry, 74: 203-215. McFarland, V.A., Inouye, L.S., Lutz, C.H., Jarvi.s A.S., Clarke, J.U. & McCant, D.D., 1999. Biomarkers of oxidative stress and genotoxicity in livers of field-collected brown bullhead, Ameiurus nebulosus. Archeives of Environmental Contamination and Toxicology, 37: 236 241. Pytharopoulou, S., Sazakli, E., Grintzalis, K.,.Georgiou, C. D, Leotsinidis, M. & Kalpaxis, D. L,.2008. Translational responses of Mytilus galloprovincialis to environmental pollution:integrating the responses to oxidative stress and other biomarker responses into a general stress index. Aquatic Toxicology, 89: 18 27. Viarengo, A., Ponzano, E., Dondero, F. & Fabbri R., 1997. A Simple Spectrophotometric Method for Metallothionein Evaluation in Marine Organisms: Application to Mediterranean and Antartic Molluscs. Marine Environmental Research, 44: 69-84. Walker, C.H,.Hopkin, S.P., Sibly, R.M &. Peakal, D. B, 2006, Principles of Ecotoxicology, CRC Presss, Taylor & Francis Group, Boca Raton, 315 p. -1323-