Μέρος 2 ο. Το DNA και η λειτουργία του. Watson & Crick 1953

Μέρος 2 ο Το DNA και η λειτουργία του Watson & Crick 1953

Μοριακή Γενετική Το γονίδιο σαν λειτουργική µονάδα Ο Mendel ήταν ο πρώτος που διαπίστωσε την ύπαρξη του γονιδίου και οι συνεχιστές του έργου του διατύπωσαν αρχές και θεωρητικά µοντέλα σχετικά µε τις ιδιότητές του. Η δοµή όµως του γονιδίου, η µοριακή του δηλαδή βάση ήταν άγνωστη στην επιστήµη ως τη στιγµή που οι Watson και Crick δηµοσίευσαν το 1953 την πρώτη περιγραφή της διπλής έλικας του DNA. Από τότε έχουν γίνει πάρα πολλά για να ερµηνευτεί η δράση του µορίου αυτού και να διαπιστωθεί ο τρόπος µε τον οποίο η γενετική πληροφορία είναι οργανωµένη ώστε να λειτουργεί µέσα από τα γονίδια. Σήµερα υπάρχουν σηµαντικές τεχνικές µε τις οποίες διαπιστώνουµε την ύπαρξη συγκεκριµένων γονιδίων στο DNA, χάρη στις οποίες παρεµβαίνουµε και επιφέρουµε απευθείας αλλαγές στο γένωµα των οργανισµών. Στις σηµειώσεις αυτές θα παρουσιαστεί συνοπτικά η µοριακή βάση της Γενετικής. Αυτό θα γίνει µε περιεκτικό τρόπο, κυρίως όσο αφορά τη δοµή και λειτουργία του DNA και των πολυπεπτιδίων. Η γνώση αυτή θα συνδυαστεί µε τα ήδη γνωστά από τη Μενδελική Γενετική και θα αποτελέσει την ελάχιστη απαραίτητη βάση για τη µελέτη των γονιδίων στους πληθυσµούς. Η γενετική πληροφορία στο DNA Η γενετική είναι η επιστήµη της κληρονοµικότητας των βιολογικών οργανισµών, όπου πρωταρχικό ρόλο παίζει η γενετική πληροφορία. Η πληροφορία σε ένα σύστηµα θεωρείται διαφορετική από την ύλη και η µελέτη της δεν προαπαιτεί τη γνώση της δοµής της ύλης. Στην περίπτωση της Γενετικής όµως, η κατανόηση της πληροφορίας δεν µπορεί να γίνει χωρίς την εξέταση της δοµής του γενετικού υλικού. Σχηµατική απεικόνιση των µερών ενός φυτικού κυττάρου. Το DNA βρίσκεται στον πυρήνα, στους χλωροπλάστες (cp) και τα µιτοχόνδρια (mt). Το βιολογικό µακροµόριο, όπου βρίσκεται αποθηκευµένη η γενετική πληροφορία είναι το δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA). Όλοι οι ζωντανοί οργανισµοί από τα βακτήρια ως τα ζώα και φυτά χρησιµοποιούν το DNA για το σκοπό αυτό. πυρήνας Το DNA βρίσκεται κυρίως στον πυρήνα του κυττάρου, αλλά απαντάται και σε κάποια άλλα οργανίδια. Στα ανώτερα φυτά, το DNA βρίσκεται στον πυρήνα, τα µιτοχόνδρια και τους χλωροπλάστες. Είναι πολύ σηµαντικό στο σηµείο αυτό να διαχωρίσουµε τη γενετική πληροφορία του πυρήνα από αυτήν των πλαστιδίων, γιατί διαφέρουν στον τρόπο κληρονόµησης της γενετικής πληροφορίας. Το DNA του πυρήνα ενός οργανισµού κληρονοµείται από δύο γονείς µέσα από την ένωση δύο γαµετών. Η γενετική πληροφορία που περιέχει είναι προϊόν του εγγενή πολλαπλασιασµού, όπου ισχύουν όσα µάθαµε στα προηγούµενα µαθήµατα. Το DNA των πλαστιδίων προέρχεται πάντα από ένα γονέα. Στα αγγειόσπερµα, το DNA των µιτοχονδρίων και των χλωροπλαστών προέρχονται αυτούσια από το θηλυκό γαµέτη, το ωάριο. Στα κωνοφόρα ισχύει το ίδιο για το DNA των µιτοχονδρίων, αλλά το DNA των χλωροπλαστών µεταφέρεται συνήθως από τη γύρη και προέρχεται από τον αρσενικό γονέα. cp mt Τα µόρια του DNA αποτελούνται από µεγάλου µήκους αλυσίδες, που απαρτίζονται από νουκλεοτίδια. Κάθε νουκλεοτίδιο αποτελείται από µία πεντόζη (δεσοξυριβόζη), φώσφορο και µία από τις τέσσερις βάσεις: Αδενίνη (A) και Γουανίνη (G) (πουρίνες), Κυτοσίνη (C) και Θυµίνη (T) (πουριµιδίνες). Οι αλυσίδες σχηµατίζονται µε δεσµούς πεντόζης φωσφόρου ανάµεσα στα 11

Εισαγωγή στη δασική γενετική γειτονικά νουκλεοτίδια. Η γενετική πληροφορία βρίσκεται στη σειρά που είναι παραταγµένα τα νουκλεοτίδια, για την οποία υπάρχουν άπειροι συνδυασµοί. Η σειρά αυτή λέγεται ακολουθία των τεσσάρων βάσεων A, T, C και G. Η γενετική πληροφορία µοιάζει µε µία γλώσσα που έχει µόνο τέσσερα γράµµατα, τα A,T,C, και G. Η ακολουθία των βάσεων αυτών περιέχει όλη την απαραίτητη κληρονοµούµενη πληροφορία. Μοριακή δοµή του DNA µε τις τέσσερις βάσεις A, T, C, G (κατά HATTEMER et al., 1993) Αδενίνη Θυµίνη Κυτοσίνη εσοξυριβόζη Γουανίνη Νουκλεοτίδιο Το DNA δεν είναι µία αδόµητη αλυσίδα µεγάλου µήκους, αλλά έχει µια πολύπλοκη δοµή. Εδώ θα παρουσιάσουµε µόνο τη βασική δοµή. ύο αλυσίδες DNA σχηµατίζουν µια διπλή έλικα. Λόγω της µοριακής δοµής του DNA, οι δύο έλικες συνδέονται µεταξύ τους µε δεσµούς υδρογόνου, αλλά µόνο ανάµεσα σε συγκεκριµένα ζευγάρια βάσεων. Η θυµίνη (Τ) συνδέεται µόνο µε την αδενίνη (Α) και η κυτοσίνη (C) µε τη γουανίνη (G). Έτσι µόνο δύο τύποι ζευγαριών µπορούν να προκύψουν, T - A και C - G. Η ακολουθία των βάσεων στις δύο αλυσίδες της διπλής έλικας είναι συµπληρωµατικές, δηλαδή έχουµε αποθήκευση της ίδιας πληροφορίας αν και οι αλληλουχίες διαφέρουν. Ο τρόπος σύνδεσης µεταξύ των βάσεων και η συµπληρωµατική ιδιότητα του DNA είναι ιδιαίτερα σηµαντικά στοιχεία για την αντιγραφή του µορίου. 12

Μοριακή Γενετική Η διπλή έλικα του DNA και η αρχή της αντιγραφής Η αντιγραφή του µορίου του DNA σε (σχεδόν) ακριβή αντίγραφα επιτρέπει τον πολλαπλασιασµό της γενετικής πληροφορίας κατά την αναπαραγωγή των κυττάρων (µίτωση) ή κατά τη δηµιουργία των γαµετών (µείωση). Το DNA είναι ένα αυτοαντιγραφόµενο µόριο και µόνο έτσι θα µπορούσε να είναι ο φορέας της γενετικής πληροφορίας. Αν το DNA δεν αντιγράφονταν, τότε η γενετική πληροφορία δεν θα µπορούσε να µεταβιβαστεί ούτε µέσα σε έναν οργανισµό ούτε από γενιά σε γενιά. Συνδέσεις των βάσεων C - G και A - T Οι δύο αλυσίδες του DNA µπορούν να χωρίσουν είτε λόγω της έκθεσης σε υψηλές θερµοκρασίες, ή λόγω της παρουσίας εξειδικευµένων ενζύµων. Όταν συµβαίνει αυτό, τα υπάρχοντα ελεύθερα νουκλεοτίδια που υπάρχουν στο κύτταρο έρχονται και προσκολλούνται στις ελεύθερες άκρες των βάσεων και σχηµατίζουν νέους δεσµούς υδρογόνου. Τα νουκλεοτίδια αυτά σχηµατίζουν νέες αλυσίδες, συµπληρωµατικές προς τις αρχικές. Η ακολουθία δε των βάσεων των νέων αλυσίδων είναι καθορισµένη, αφού ο τρόπος σύνδεσης µεταξύ των νουκλεοτιδίων είναι καθορισµένος (Α-Τ και G-C). 13

Εισαγωγή στη δασική γενετική Το αποτέλεσµα της παραπάνω διαδικασίας είναι δύο «νέες» συµπληρωµατικές αλυσίδες, που µαζί µε τις «αρχικές» σχηµατίζουν δύο νέες διπλές έλικες µε ίδια δοµή, δηλαδή µε ίδια ακολουθία νουκλεοτιδίων. Άρα οι δύο νέες έλικες DNA περιέχουν την ίδια γενετική πληροφορία. Αυτός ο διπλασιασµός είναι απαραίτητος για την πληθυσµιακή αύξηση των µονοκύτταρων οργανισµών και για τη σωµατική και πληθυσµιακή αύξηση των ανώτερων µορφών ζωής. Βασικές αρχές Βιοχηµείας Πριν περάσουµε στην περιγραφή της λειτουργίας του DNA είναι απαραίτητο να αναφέρουµε µερικά στοιχεία σχετικά µε τη δοµή των βιοµορίων δεύτερης τάξης. Τα πολυπεπτίδια είναι όπως και το DNA σύνθετα βιολογικά µακροµόρια, που αποτελούνται από απλούστερες µονάδες. Τα πολυπεπτίδια είναι αλυσίδες αµινοξέων. Τα γειτονικά αµινοξέα συνδέονται µεταξύ τους µε πεπτιδικούς δεσµούς. Τα πιο σηµαντικά πολυπεπτίδια είναι οι πρωτείνες που ελέγχουν το µεταβολισµό των οργανισµών καταλύοντας χηµικές αντιδράσεις (ένζυµα) και οι δοµικές πρωτείνες. Στη φύση, υπάρχουν 20 διαφορετικά αµινοξέα, τα οποία φαίνονται στο παρακάτω σχήµα. Κάθε αµινοξύ έχει ένα τµήµα που είναι κοινό για όλα και µία ρίζα που το διαφοροποιεί από τα υπόλοιπα. Η ρίζα των αµινοξέων µπορεί να είναι ουδέτερη / υδρόφοβη, ουδέτερη / πολωµένη, όξινη ή βασική. Κατά τον τρόπο αυτό, κάθε πολυπεπτίδιο έχει ένα συγκεκριµένο ηλεκτρικό φορτίο, ανάλογα µε την ακολουθία των επί µέρους αµινοξέων που το αποτελούν. Η ακολουθία των αµινοξέων λέγεται πρωτοταγής δοµή. 14

Μοριακή Γενετική Συνήθως τα πολυπεπτίδια είναι πολύ µικρότερα από το DNA. Τα περισσότερα ένζυµα αποτελούνται από λιγότερα των χιλίων αµινοξέα. Τα ένζυµα είναι αναδιπλωµένα µε αρκετούς διαφορετικούς τρόπους (δευτεροταγής δοµή) και τελικά φτάνουν σε µια πολύπλοκη τρισδιάστατη µορφή (τεταρτοταγής δοµή). Μερικά ένζυµα αποτελούνται από διάφορα υποσύνολα, ώστε να µπορέσουν να πραγµατοποιήσουν τη λειτουργία τους στο µεταβολισµό (τεταρταία δοµή). Σύµφωνα µε όλα τα παραπάνω, τα πολυπεπτίδια έχουν ένα συγκεκριµένο ηλεκτρικό φορτίο και µια σύνθετη τρισδιάστατη δοµή, ανάλογα µε την ακολουθία των αµινοξέων τους. 15

Εισαγωγή στη δασική γενετική Πρωτοταγής δοµή του ενζύµου «ριβονουκλεάση» µε εµφανείς τις υποοµάδες ορισµένων αµινοξέων. Κάθε κουτάκι αντιπροσωπεύει ένα αµινοξύ. Ηλεκτροφόρηση τµηµάτων DNA και ενζύµων Η πιο σηµαντική µέθοδος για την έρευνα βιοχηµικής και µοριακής γενετικής ποικιλότητας είναι η ηλεκτροφόρηση. Πρόκειται για µία απλή εργαστηριακή διαδικασία, που διαχωρίζει τα µακροµόρια ανάλογα µε το µέγεθός τους (κυρίως τµήµατα DNA), ηλεκτρικό φορτίο και δοµή (κυρίως ένζυµα). ιαλύµατα που περιέχουν ένζυµα (επεξεργασµένοι ιστοί φυτών) ή τµήµατα DNA εκτίθενται σε ένα ηλεκτρικό πεδίο για ορισµένο χρονικό διάστηµα. Ζυµογράµµατα είγµατα ιάλυµα ηλεκτροδίων Συσκευή ηλεκτροφόρησης Συνήθη µέσα για το διαχωρισµό ενζύµων είναι πηκτές (gel) αµύλου και ακρυλαµιδίου. Για τα τµήµατα DNA χρησιµοποιούµε συνήθως gel ακρυλαµιδίου και σπανιότερα αγαρόζης. Τα gel µοιάζουν στην υφή µε ένα ζελέ και ανάλογα µε την πυκνότητα και τις διαστάσεις τους επιτρέπουν στα µόρια να κινούνται ανάµεσα από τους πόρους τους. Μεγάλα µόρια κινούνται πιο αργά από 16

Μοριακή Γενετική µικρά και µε τον τρόπο αυτό διαχωρίζονται. Το ίδιο συµβαίνει και µε τις διαφορές των µορίων σε ηλεκτρικό φορτίο και τρισδιάστατη δοµή. Τα δείγµατα προετοιµάζονται σε µορφή οµογενοποιηµένου διαλύµατος και τοποθετούνται στο ένα άκρο του gel. Το gel µε τη σειρά του τοποθετείται σε ένα ηλεκτρικό πεδίο για αρκετές ώρες. Τα µόρια κινούνται µέσα στο gel µε διαφορετική ταχύτητα ανάλογα µε το µέγεθός τους, το ηλεκτρικό τους φορτίο και την τρισδιάστατη δοµή τους. Όταν αργότερα αφαιρέσουµε την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου, αναµένουµε τα µόρια να έχουν διανύσει διαφορετικές αποστάσεις πάνω στο gel λόγω των διαφορετικών τους ταχυτήτων. Το DNA ή τα ένζυµα φαίνονται αφού πρώτα χρωµατιστούν τα gel µε τις κατάλληλες χρωστικές. ιαφορετικές γραµµές (bands) φαίνονται στα αποτελέσµατα της ηλεκτροφόρησης και κάθε γραµµή αντιστοιχεί στην ύπαρξη ενός συγκεκριµένου ενζύµου ή τµήµατος DNA στη συγκεκριµένη θέση. Παραδείγµατα τέτοιων αποτελεσµάτων δίνονται στα σχήµατα της σελίδας 17. Περισσότερα στοιχεία για το σχεδιασµό των γενετικών πειραµάτων και την αξιολόγηση αυτών των αποτελεσµάτων θα υπάρξουν στα επόµενα κεφάλαια. Αποτελέσµατα ηλεκτροφόρησης (ζυµογράµµατα) ύστερα από ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό και βιοχηµικό χρωµατισµό του ενζυµικού συστήµατος Phosphoglucose-Isomerase (PGI) σε δρυ (Quercus spp.; πάνω) και σουρβία (Sorbus torminalis; κάτω) Η αξιοποίηση της γενετικής πληροφορίας Ως τώρα εξετάσαµε τον τρόπο που το DNA δηµιουργεί αντίγραφα του εαυτού του. Πρόκειται για µια σηµαντική ιδιότητα του µορίου αυτού, αφού επιτρέπει την µεταφορά της γενετικής πληροφορίας κατά την ανάπτυξη ενός οργανισµού και το σχηµατισµό των επόµενων γενεών. 17

Εισαγωγή στη δασική γενετική Μια εξίσου σηµαντική ιδιότητα του DNA είναι η έκφρασή του σε χαρακτηριστικά στους οργανισµούς. Πρόκειται για εκείνη τη διαδικασία, όπου η γενετική πληροφορία αξιοποιείται και οδηγεί σε εκείνες τις λειτουργικές και δοµικές µονάδες, που εξασφαλίζουν την έκφραση των χαρακτηριστικών. Με λίγα λόγια είναι η ιδιότητα της έκφρασης των γονιδίων που βρίσκονται στο DNA µέσα από τον έλεγχο του µεταβολισµού ενός οργανισµού. Ένας οργανισµός αξιοποιεί τη γενετική του πληροφορία αποδεσµεύοντάς την από το DNA. Αυτή η διαδικασία οδηγεί τελικά στο σχηµατισµό πολυπεπτιδίων µε συγκεκριµένη ακολουθία αµινοξέων. Το πρώτο βήµα για τη δηµιουργία ενός πολυπεπτιδίου µοιάζει µε το πρώτο βήµα της αντιγραφής: είναι ο διαχωρισµός των δύο αλυσίδων από την έλικα του DNA. Στο σηµείο αυτό όµως, ο διπλασιασµός λαµβάνει χώρα σε ένα µικρό κοµµάτι του DNA κάθε φορά και για µία από τις δύο αλυσίδες. Επιπλέον, η νέα πεντόζη που σχηµατίζεται συµπληρωµατικά δεν είναι δεσοξυριβόζη, αλλά ριβόζη. Το νέο µακροµόριο που σχηµατίζεται δεν είναι πλέον DNA, αλλά RNA (ριβονουκλεϊκό οξύ). Η ακολουθία των βάσεων που υπάρχει στο DNA µεταφέρεται στο RNA, αφού ο σχηµατισµός του γίνεται συµπληρωµατικά προς τη µία αλυσίδα του DNA. Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης του RNA, η βάση Θυµίνη (T) αντικαθίσταται από την Ουρακίλη (U). Η διαδικασία της σύνθεσης του RNA από τµήµατα DNA λέγεται µεταγραφή και το προϊόν της αγγελιοφόρο RNA, ή mrna (m για messenger = αγγελιοφόρος). Σχηµατική απεικόνιση της µεταγραφής Tο mrna εγκαταλείπει τον πυρήνα µόλις ολοκληρωθεί ο σχηµατισµός του. Στο κυτόπλασµα προσκολλούνται στο µόριο ριβοσώµατα. Τα ριβοσώµατα είναι τα «εργαστήρια» παραγωγής των πολυπεπτιδίων. Απεικόνιση ενός µορίου trna 18

Μοριακή Γενετική Τη σύνδεση του mrna µε τα αµινοξέα αναλαµβάνει ένα άλλο νουκλεϊκό µόριο, το µεταφορικό RNA ή trna (transfer-rna). Το trna είναι µικρού µεγέθους και έχει τρεις βασικές ιδιότητες: α) έχει µια συγκεκριµένη διαδοχή βάσεων, 2) αναγνωρίζονται από µια συγκεκριµένη συνθετάση (ένζυµο) ώστε να µπορούν να προσκολλούνται σε ένα συγκεκριµένο αµινοξύ και γ) λαµβάνουν συγκεκριµένες θέσεις στο ριβόσωµα. Αυτό δηλαδή που κάνει το trna είναι να µπορεί να προσελκύει συγκεκριµένα αµινοξέα σε συγκεκριµένες ακολουθίες νουκλεοτιδίων. Ανάλογα µε την ακολουθία των αµινοξέων στο mrna, ταιριάζει µία ακολουθία trna µε ένα µόνο αµινοξύ. Τα αµινοξέα που µεταφέρονται στο ριβόσωµα από το trna, προσκολλούνται µεταξύ τους µε βάση τη συγκεκριµένη ακολουθία των νουκλεοτιδίων και ενώνονται για να σχηµατίσουν ένα πολυπεπτίδιο. Η διαδικασία αυτή λέγεται µετάφραση καθώς µεταφράζεται µια ακολουθία νουκλεοτιδίων του mrna σε ακολουθία αµινοξέων ενός πολυπεπτιδίου. Ο γενετικός κώδικας Το ερώτηµα που προκύπτει από τα παραπάνω είναι πώς οι τέσσερις βάσεις του DΝΑ καθορίζουν το είδος και τη διαδοχή των 20 αµινοξέων που βρίσκονται στα πολυπεπτίδια. Το DNA µεταγράφεται σε mrna ως ενδιάµεσο προϊόν στην όλη διαδικασία, οπότε το ερώτηµα διαµορφώνεται στο πώς οι τέσσερις βάσεις του mrna προσδιορίζουν τη διαδοχική σειρά των αµινοξέων ενός πολυπεπτιδίου; Ποια είναι η φύση του γενετικού κώδικα που συσχετίζει τη σειρά των βάσεων του mrna (ή του DΝΑ) µε τη διαδοχή των αµινοξέων; Τα αµινοξέα που παίρνουν µέρος στη σύνθεση των πρωτεϊνών είναι είκοσι, οπότε θα πρέπει κατά συνέπεια να υπάρχουν τουλάχιστον 20 διαφορετικοί «κωδικοί» για κάθε αµινοξύ. Οι βάσεις όµως των νουκλεϊκών µακροµορίων είναι τέσσερις, άρα δεν επαρκούν. Αν συνδυαστούν ανά δύο, υπάρξουν δηλαδή «κωδικοί» δύο βάσεων για κάθε αµινοξύ, τότε το σύνολο των συνδυασµών των 4 βάσεων είναι 4 2 = 16, που πάλι δεν επαρκεί. Αν τώρα, ανά τρεις βάσεις σχηµατίζουν έναν κωδικό, τότε οι δυνατοί συνδυασµοί είναι 4 3 = 64, που σηµαίνει ότι είναι πολύ περισσότεροι από τους 20 που χρειάζονται για την κωδικοποίηση όλων των αµινοξέων. Ο κώδικας των τριών βάσεων του DNA και mrna, που µεταφράζεται σε ένα συγκεκριµένο αµινοξύ από το trna, λέγεται κωδικόνιο (codon). Η συµπληρωµατική τριάδα του trna λέγεται αντικωδικόνιο (anticodon). Η πρώτη ένδειξη ότι ο γενετικός κώδικας είναι ένας κώδικας µε λέξεις τριών γραµµάτων (τρεις βάσεις για κάθε κωδικόνιο) προήλθε από τη γενετική ανάλυση µεταλλάξεων στο γονίδιο rll του βακτηριοφάγου Τ4, που έγινε από τον Crick και τους συνεργάτες του. Επιβεβαίωση της πρώτης αυτής ένδειξης έγινε γρήγορα από πολλές κατευθύνσεις. Τελικά η φύση του γενετικού κώδικα, ως ενός κώδικα µε λέξεις τριών γραµµάτων, έγινε οριστικά αποδεκτή από τα ερευνητικά δεδοµένα που έδειξαν συσχέτιση διαδοχής αµινοξέων στις πρωτεΐνες και αντίστοιχης διαδοχής κωδικονίων στο DNA. Η αποκρυπτογράφηση του γενετικού κώδικα έπρεπε να απαντήσει σε 4 ερωτήσεις: (1) Ποια κωδικόνια προσδιορίζουν Ποια αµινοξέα, (2) πόσες από τις 64 δυνατές λέξεις 19

Εισαγωγή στη δασική γενετική χρησιµοποιούνται, (3) πώς τα κωδικόνια παίρνουν σηµεία στίξης και (4) αν τα διάφορα είδη χρησιµοποιούν τα ίδια κωδικόνια. Η απάντηση στις παραπάνω ερωτήσεις εµφανίστηκε κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1960 και αποτέλεσε µια εντυπωσιακή περίοδο στην ιστορία της επιστήµης. Η πρώτη επιτυχία ήταν η ανακάλυψη της µεθόδου τεχνητής σύνθεσης mrna. Το πρώτο συνθετικό mrna που αποκτήθηκε ήταν το «πολύ U». Στη συνέχεια αποδείχτηκε ότι το κωδικόνιο U-U-U του mrna που αντιστοιχεί στο Α-Α-Α του DΝΑ κωδικοποιεί το αµινοξύ φαινυλαλανίνη. Η οριστική αποκρυπτογράφηση του γενετικού κώδικα πραγµατοποιήθηκε όταν τεχνητά τρινουκλεοτίδια αποδείχτηκε ότι οδηγούν στη σύνθεση συγκεκριµένων αµινοξέων. οκιµάστηκαν όλοι οι 64 συνδυασµοί των τριών βάσεων και βρέθηκαν αντίστοιχα τα αµινοξέα που προσδιορίζουν. Παρατηρώντας το γενετικό κώδικα, βλέπουµε ότι όλα τα αµινοξέα, µε εξαίρεση τη µεθιονίνη και τρυπτοφάνη, προσδιορίζονται από περισσότερα από ένα κωδικόνια. Αυτό το φαινόµενο ονοµάστηκε εκφυλισµός (degeneracy) του κώδικα, αν και ο όρος δεν είναι κατάλληλος. Ίσως, θα µπορούσε να ειπωθεί, ότι ο κώδικας περιλαµβάνει «συνώνυµες» λέξεις. Η ύπαρξη συνώνυµων λέξεων, φαίνεται ότι δεν είναι τυχαία αλλά εκπληρώνει κάποιο σκοπό. Μια υπόθεση που φαίνεται ότι δίνει εξήγηση στη σκοπιµότητα της ύπαρξης συνώνυµων λέξεων, είναι αυτή που υποστηρίζει ότι έτσι ελαχιστοποιούνται οι πιθανότητες µεταλλάξεων µε ουσιαστικές αλλαγές στη σύνθεση των πρωτεϊνών. Ο υδρογονικός δεσµός µεταξύ των βάσεων στο αντικωδικόνιο του trna και το κωδικόνιο του mrna, εφαρµόζεται µε ακρίβεια µόνο στις δύο πρώτες βάσεις ενώ στην τρίτη είναι λιγότερο «σφιχτός» και επιτρέπει κάποια αστάθεια. Ο γενετικός κώδικας κωδικόνια του mrna Second: U C A G First : Amino Acid Amino Acid Amino Acid Amino Acid U U U Phe U C U Ser U A U Tyr U G U Cys U U U C Phe U C C Ser U A C Tyr U G C Cys U U A Leu U C A Ser U A A TERM U G A TERM U U G Leu U C G Ser U A G TERM U G G Trp C U U Leu C C U Pro C A U His C G U Arg C C U C Leu C C C Pro C A C His C G C Arg C U A Leu C C A Pro C A A Gln C G A Arg C U G Leu C C G Pro C A G Gln C G G Arg A U U Ile A C U Thr A A U Asn A G U Ser A A U C Ile A C C Thr A A C Asn A G C Ser A U A Ile A C A Thr A A A Lys A G A Arg A U G Met A C G Thr A A G Lys A G G Arg G U U Val G C U Ala G A U Asp G G U Gly G G U C Val G C C Ala G A C Asp G G C Gly G U A Val G C A Ala G A A Glu G G A Gly G U G Val G C G Ala G A G Glu G G G Gly Φαίνεται επίσης ότι ορισµένα κωδικόνια δεν προσδιορίζουν αµινοξέα που παίρνουν µέρος στη σύνθεση των πολυπεπτιδίων. Αποδείχτηκε ότι αυτά µπορούν να θεωρηθούν ανάλογα µε τα σηµεία στίξης - έναρξη, κόµµα, τελεία - που οριοθετούν µια φράση. Τα κωδικόνια αυτά αναγνωρίζονται από πρωτεϊνικούς παράγοντες ελευθέρωσης, παρά από συγκεκριµένα trna. Μια από αυτές τις πρωτεΐνες, µε τον ορισµό RF-1 είναι συγκεκριµένη για τα κωδικόνια UAA και UAG. Η άλλη πρωτείνη RF-2, προκαλεί επίσης λήξη της µετάφρασης όταν τα κωδικόνια είναι UAA και UGA. ύο κωδικόνια, τα AUG και GUG, αναγνωρίζονται από το trna έναρξης, µόνο όταν ακολουθούν µία κατάλληλη διαδοχή νουκλεοτιδίων στην αρχή του µορίου του mrna. Έτσι, τα κωδικόνια AUG και GUG 20

Μοριακή Γενετική µπορούν να χαρακτηριστούν ως τα κεφαλαία γράµµατα έναρξης µιας φράσης. Τέλος τη θέση κόµµατος εκπληρούν τα κωδικόνια AUG και GUG που βρίσκονται στο εσωτερικό του µηνύµατος. Ο γενετικός κώδικας είναι «παγκόσµιος», ισχύει δηλαδή για όλους τους οργανισµούς, από τα βακτήρια στους ανθρώπους: τα ίδια κωδικόνια οδηγούν στα ίδια αµινοξέα. Η σύνθεση λειτουργικών πολυπεπτιδίων απαιτεί τη µεταγραφή σχετικά µικρών τµηµάτων του DNA. Η µεταγραφή ξεκινά από συγκεκριµένα κωδικόνια και τελειώνει σε άλλα επίσης σαφώς καθορισµένες τριπλέτες νουκλεοτιδίων. Όµως, παρατηρείται το φαινόµενο να παραλείπονται µεγάλα τµήµατα του DNA από τη µεταγραφή και το mrna που προκύπτει. Το mrna περιέχει µόνο πληροφορία από τα τµήµατα του DNA που λέγονται εξώνια (exons). Οι ακολουθίες των βάσεων που δεν µεταγράφονται στο mrna και φυσικά δεν µεταφράζονται σε αλληλουχίες αµινοξέων λέγονται εσώνια (introns). Έτσι, τα λειτουργικά γονίδια βρίσκονται στα εξώνια και οδηγούν στη σύνθεση πολυπεπτιδίων. Αυτή η στενή σχέση ανάµεσα στην αποθηκευµένη γενετική πληροφορία και στη σύνθεση των πολυπεπτιδίων λέγεται και αρχή ενός γονιδίου ενός πολυπεπτιδίου. Το DNA συγκεντρώνει δύο βασικές ιδιότητες, σύµφωνα µε τις οποίες είναι ο ιδανικός φορέας των γονιδίων: α) αντιγράφεται και β) εκφράζεται. Μια τρίτη ιδιότητα, η δυνατότητα να µεταλλάσσεται θα εξεταστεί στο επόµενο κεφάλαιο. Μεταλλάξεις σε επίπεδο DNA Η γενετική πληροφορία, η συχνότητα των νουκλεοτιδίων σε ένα γονίδιο, µεταφέρεται σε γενικές γραµµές αυτούσια από τους γονείς στους γαµέτες και από εκεί στην επόµενη γενιά. Αν αυτή η µεταφορά της πληροφορίας γίνονταν πάντοτε αλάνθαστα τότε δεν θα υπήρχε καθόλου γενετική ποικιλότητα στους οργανισµούς και για το λόγο αυτό δεν θα ήταν δυνατή η εξέλιξη. Σε σπάνιες περιπτώσεις συµβαίνουν µεταβολές της γενετικής πληροφορίας κατά την αντιγραφή της, που οδηγούν στη δηµιουργία νέων αλληλοµόρφων. Την αλλαγή αυτή την ονοµάζουµε µετάλλαξη. Μία µετάλλαξη µπορεί να προκύψει τυχαία σε οποιοδήποτε σηµείο και κατά οποιαδήποτε χρονική στιγµή σε έναν οργανισµό. Για να περάσει όµως µια µετάλλαξη στην επόµενη γενιά πρέπει να επηρεάσει τους γαµέτες. Στους ανώτερους οργανισµούς, η συχνότητα φυσικών µεταλλάξεων είναι 10-3 ανά γαµέτη και ανά γενεά. Στα φυτά, η συχνότητα των µεταλλάξεων στο πυρηνικό, µιτοχονδριακό και χλωροπλαστικό DNA διαφέρει πολύ. Το µιτοχονδριακό DNA έχει τη χαµηλότερη συχνότητα µεταλλάξεων και το πυρηνικό την υψηλότερη, ενώ το χλωροπλαστικό DNA λαµβάνει ενδιάµεσες τιµές. Αυτό το γεγονός 21

Εισαγωγή στη δασική γενετική είναι σηµαντικό για την επιλογή της κατάλληλης µεθοδολογίας για τη µελέτη της γενετικής ποικιλότητας. ιαχωρίζουµε τρεις κατηγορίες µεταλλάξεων: α) γονιδιακές (σε επίπεδο DNA), β) χρωµοσωµικές και γ) γενωµικές µεταλλάξεις. Στο κεφάλαιο αυτό θα εξετάσουµε κυρίως την πρώτη κατηγορία, ενώ στις άλλες δύο κατηγορίες θα αναφερθούµε σε επόµενο κεφάλαιο. Οι γονιδιακές µεταλλάξεις είναι αλλαγές στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων µέσα σε ένα γονίδιο. Αυτές µπορεί να προκύψουν µε διαφορετικούς τρόπους και ανάλογα µε αυτούς µπορεί να επιφέρουν διάφορες επιπτώσεις. Αν αντικατασταθεί ένα νουκλεοτίδιο από ένα νέο, τότε έχουµε σηµειακή µετάλλαξη και προκύπτει ένα νέο κωδικόνιο. Αν το νέο κωδικόνιο κωδικοποιεί κάποιο διαφορετικό αµινοξύ, τότε θα προκύψει µια πρωτείνη µε διαφορετική δοµή. Αν η αλλαγή αυτή του νουκλεοτιδίου γίνει στην τρίτη θέση του κωδικόνιου, τότε η µετάλλαξη αυτή συνήθως δεν επιφέρει κάποιο νέο αµινοξύ αφού όπως είδαµε και στον κώδικα, υπάρχουν πολλά «συνώνυµα» αµινοξέα που διαφέρουν στο τρίτο γράµµα του κώδικα. Αν για παράδειγµα αντικατασταθεί το κωδικόνιο ΑΑΑ από το ΑΑG δεν θα αλλάξει το αµινοξύ αφού και οι δύο τριπλέτες κωδικοποιούν το Lys. Αν όµως αντί για AAA είχαµε AAU, τότε θα άλλαζε το αµινοξύ από Lys σε Asn. Για να προκύψει λοιπόν διαφορετική πρωτείνη, πρέπει η µετάλλαξη να επιφέρει αλλαγή στο κωδικόνιο. Αν από µια τέτοια αλλαγή αµινοξέος προκύψει αλλαγή στη λειτουργία του ενζύµου, αυτό εξαρτάται την απόσταση της θέσης της αλλαγής από το ενεργό κέντρο του ενζύµου αυτού. Η σηµειακή µετάλλαξη µπορεί να επιφέρει σηµαντικότερες αλλαγές από την απλή αντικατάσταση ενός αµινοξέος στην παραγόµενη πρωτείνη αν η νέα αλληλουχία που θα προκύψει είναι κωδικόνιο τερµατισµού. Τότε η µετάφραση σταµατά πρώιµα και το νέο ένζυµο δεν θα περιέχει τα αµινοξέα από το σηµείο τερµατισµού και µετά. Για παράδειγµα αν αντί GGA έχουµε µετά από µετάλλαξη UGA, τότε το αµινοξύ gly δεν θα εκφραστεί και αντί γι αυτό θα έχουµε τερµατισµό της µετάφρασης. Σηµαντικές επιπτώσεις στους οργανισµούς έχουν οι µεταλλάξεις όπου προστίθεται ή αφαιρείται ένα (ή δύο) νουκλεοτίδια. Αυτές ονοµάζονται µεταλλάξεις µετατόπισης αφού µετατοπίζουν το πλαίσιο ανάγνωσης και όλα τα κωδικόνια από το σηµείο της αλλαγής και µετά αλλάζουν επιφέροντας πρωτείνες µε τελείως διαφορετικά αµινοξέα. Οι µεταλλάξεις του τύπου αυτού συνήθως δεν οδηγούν σε λειτουργικά ένζυµα. Από τις µεταλλάξεις προκύπτουν νέες µορφές γονιδίων που λέγονται αλληλόµορφα. ιαφορετικά αλληλόµορφα του ίδιου γονιδίου οδηγούν σε διαφορετικές µορφές του ίδιου ενζύµου. Οι διαφορετικές αυτές µορφές που λέγονται και ισοένζυµα και εµφανίζουν διαφορές στην απόδοσή τους που συχνά οδηγούν σε διαφορετικά χαρακτηριστικά µεταξύ των οργανισµών. Συχνά οι µεταλλάξεις οδηγούν σε νέα ένζυµα που είναι ανενεργά ή µειωµένης αποτελεσµατικότητας. Μηδενική µετάλλαξη λέγεται αυτή που οδηγεί σε αλληλόµορφο που δεν εκφράζεται στο φαινότυπο αφού το ένζυµο που κωδικοποιεί δεν είναι λειτουργικό (µηδενικό αλληλόµορφο). Μια άλλη µορφή µετάλλαξης είναι η σιωπηλή µετάλλαξη όπου παρά την αλλαγή στη σειρά των αµινοξέων, το νέο ένζυµο που προκύπτει λειτουργεί ακριβώς µε τον ίδιο τρόπο µε το αρχικό και δεν παρουσιάζεται καµία διαφορά στο φαινότυπο. Όταν έχουµε κυριαρχία και υποτέλεια, όπου δηλαδή ένα αλληλόµορφο κυριαρχεί σε ένα άλλο σε ετεροζυγωτούς γενότυπους, τότε το υποτελές αλληλόµορφο είναι συνήθως µια ανενεργή µετάλλαξη ενώ το κυρίαρχο παράγει τόση πρωτείνη ώστε καλύπτει και το έλλειµµα που εµφανίζεται λόγω του υποτελούς αλληλόµορφου. Όταν κυριαρχεί το ανενεργό, τότε σηµαίνει ότι για να εκφραστεί ένα χαρακτηριστικό χρειάζονται και τα δύο αλληλόµορφα να οδηγούν σε ενεργά ένζυµα. Κυρίαρχα ανενεργά αλληλόµορφα είναι πολύ σπάνια στη φύση και συνήθως εξαλείφονται από τη φυσική επιλογή, αφού συχνά η έλλειψη ενζύµων είναι µειονέκτηµα για έναν οργανισµό. Στην περίπτωση που για την έκφραση ενός χαρακτηριστικού χρειάζονται δύο ενεργά αλληλόµορφα, ενώ ένα µόνο (ετεροζυγωτός γενότυπος) δίνει ενδιάµεση µορφή τότε λέµε ότι 22

Μοριακή Γενετική έχουµε µερική κυριαρχία. Στην περίπτωση αυτή το ενεργό αλληλόµορφο από µόνο του δεν αρκεί µεν να εκφράσει πλήρως το χαρακτηριστικό, αλλά αρκεί για να φτάσει ένα ενδιάµεσο στάδιο. Στην περίπτωση που και τα δύο αλληλόµορφα είναι εξίσου ισχυρά για να εκφράσουν όµως διαφορετικού τύπου φαινότυπο, τότε λέµε ότι έχουµε συγκυριαρχία (π.χ. η οµάδα αίµατος ΑΒ) και από τον ετεροζυγωτό γενότυπο προκύπτει συνδυασµένος φαινότυπος µε έκφραση και των δύο χαρακτήρων. Οι χρωµοσωµικές µεταλλάξεις δεν αφορούν την αλλαγή νουκλεοτιδίων στην αντιγραφή του DNA αλλά αλλαγές στη δοµή των χρωµοσωµάτων κατά τις κυτταροδιαιρέσεις. Αντίστοιχα, οι γενωµικές µεταλλάξεις δεν αφορούν αλλαγές στη δοµή των χρωµοσωµάτων, αλλά αλλαγές στον αριθµό τους στο γένωµα. Τις µεταλλάξεις αυτές θα τις επεξεργαστούµε στο επόµενο κεφάλαιο. 23