مجله زارعت و اصالح نباتات جلد 8 شماره 2 تابستان 1391 صفحات 173-183 بررسی تکرارپذیری یک نشانگر مولکولی پیوسته با ژن مقاومت به ریزومانیا و غربال ژنوتیپهای مقاوم هموزیگوت در چغندرقند Repitability of a molecular marker linked with rhizomania resistance gene and screening for resistant homozygote genotypes in sugar beet 2 صدیقه هراسانی 1 پیمان نوروزی 2 خداداد مصطفوی 3* محسن آقایی زاده چکیده حضور يك نشانگر مولكولي ناجفت رپید موسوم به AM2 پيوسته با ژن مقاومت به ريزومانيا بر روي DNA تك بوتههاي يك توده اصالحی بدست آمده از تالقی گونه وحشی بتا ماریتیما )دارای ژن مقاومت )Rz2 با چغندرقند موسوم به توده F2BC1 بررسي گردید. براي اين كار ابتدا حدود 1160 بذر از توده مورد نظر در گلخانه كشت شد و پس از تهيه گياهان يك ماهه حدود 100 گیاهچه به منظور ارزیابی مقاومت فنوتیپی به خاک آلوده به ریزومانیا در گلخانه منتقل شد و به مدت دو ماه در این خاک نگهداری شدند. سپس تعيين كميت و كيفيت DNAهاي استخراجي با روش اسپكتروفتومتري انجام شد. سپس آزمون RAPD-PCR بر روي نمونههاي گياهي با آغازگر مربوطه انجام گرفت. پس از الكتروفورز محصوالت واكنش در ژل آگارز و رنگ آميزي ژل و مشاهدهی الگوی باندی حضور و عدم حضور نشانگر در تك بوتهها مشخص گردید. در مرحله بعد ميزان مقاومت گیاهان کشت شده در خاک آلوده بر اساس غلظت ویروس در داخل ریشه گیاه با آزمون سرولوژيكي االيزا در آزمایشگاه تعیین گردید. سپس رابطه و ميزان همبستگي و درجه توافق بين نشانگر )بر اساس دادههای مولکولی( و مقاومت )بر اساس دادههاي االيزا( در تك بوتههاي توده مورد نظر مشخص شد. نتایج نشان داد که میانگین مقادیر جذب االیزای ژنوتیپهای هتروزیگوت و هموزیگوت غالب فاقد تفاوت معنیدار میباشد. همچنین نتایج مقایسه میانگین برای صفت درصد حضور نشانگر بصورت طرح کامال تصادفی متعادل در چهار ژنوتیپ شامل توده F2BC1 )دارای ژن مقاومت )Rz2 رجینا )رقم شاهد حساس به ریزومانیا( پائولتا )رقم شاهد مقاوم به ریزومانیا( و توده اصالحی S1 )دارای ژن مقاومت )Rz1 نشان داد که اختالف معنیداری بین ژنوتیپها وجود ندارد و تکرارپذیری نشانگر ناجفت AM2 در ژنوتیپهای مختلف تأیید گردید. واژههای کلیدی: چغندر قند ریزومانیا نشانگر مولکولی رپید. 1- دانشجوی سابق کارشناسی ارشد اصالح نباتات دانشگاه آزاد اسالمی واحد کرج گروه زراعت و اصالح نباتات کرج البرز ایران 2- موسسه تحقیقات اصالح و تهیه بذر چغندر قند 3- دانشگاه آزاد اسالمی واحد کرج گروه زراعت و اصالح نباتات کرج ایران. * مکاتبه کننده: mostafavi@kiau.ac.ir
مجله زارعت و اصالح نباتات جلد 8 شماره 2 تابستان 1391 و همكاران نام Rz1 را براي ژن Holly و نام Rz2 را براي ژن )هاي( WB42 پيشنهاد نمودند 1999) al., 1997,.(Scholten et اميري گزارش نمود كه مقاومت در منبع WB42 با يك ژن غالب Holly در منبع كنترل ميشود و فاصله آن از ژن Rz1 )Rz2( حدود 35 سانتي مورگان ميباشد )امیری 1382(. امیری و همكاران با بررسي وراثت مقاومت به بيماري ريزومانياي چغندرقند دريافتند كه ژنهاي مقاومت در منابع Hol- ly و WB42 غير آللي و بهصورت پيوسته ميباشند 2003) al.,.(amiri et اميري )1382( با استفاده از تكنيك RAPD در جمعيت F2 حاصل از تالقي رگههاي نرعقيم 261 و چغندر يك ساله با منابع مقاومت Holly و WB42 موفق گرديد يك نشانگر ناجفت با پيوستگي شديد )با فاصله 3/6 سانتي مورگان( براي مكان ژني Rz2 حاصل از منبع WB42 و يك نشانگر جفت با پيوستگي كم براي مكان ژني Rz1 حاصل از منبع Holly بدست آورد )امیری 1382(. نوحی و همکاران نيز با استفاده از روشي مشابه و با استفاده از نشانگر RAPD موفق به شناسايي دو نشانگر بنامهاي OF-09 با اندازه 1150 جفت باز در وضعيت جفت و فاصله 27 سانتي مورگان از ژن Rz1 و ديگري OP-AN9 با اندازه 600 جفت باز در وضعيت ناجفت و با فاصله 13/7 سانتي مورگان از ژن Rz1 شدند )2008 al.,.)nouhi et نتايج مشابهی توسط مصباح و همكاران )1386( نيز گزارش شده است. نوروزي )1387( و نوروزی و فقهی )1388( با استفاده از تكنيك RAPD موفق به شناسائي نشانگرهای R1 و R2 به ترتیب در فواصل 2/32 و 8/3 سانتی مورگان از ژن Rz1 در فاز ناجفت و نشانگرهای C4 وC1 به ترتیب در فواصل 21/4 و 27/5 سانتی مورگان از ژن Rz1 در فاز جفت شدند. هدف از اين تحقيق بررسی تکرار پذیری وتایید یک نشانگر مولکولی موسوم به (2009 al., AM2 (Amiri et پيوسته با ژن مقاومت به ريزومانياي چغندرقند از منبع بتا ماریتیما از طريق مقايسه نتايج نشانگر با نتايج آزمون االيزا و تعیین درصد حضور نشانگر در تودههای اصالحی و ارقام تجاری مقاوم و 174 مقدمه 1 مهمترين بيماري كه گياه چغندرقند را تهديد ميكند ريزومانيا ميباشد كه زراعت اين گياه را مختل نموده است. اين بيماري كه از مخرب ترين بيماريهاي چغندرقند است ميتواند حتي تا صد در صد محصول اين گياه را از بين ببرد. اين بيماري اولين بار در ايران در سال 1375 از فارس گزارش شد )ايزدپناه و همكاران 1375(. متعاقب آن بیماری از اکثر مناطق چغندرکاری کشور گزارش گردید )توده فالح و همکاران 1379(. ويروس عامل بيماري ريزومانيا يا BNY- (1975 (Tamada, VV توسط قارچي بنام پلي ميكسا بتا كسكين 2 منتقل ميشود )1964.)Keskin., تنها راه حفاظت محصول چغندر قند در مزرعة آلوده به BNYVV كشت ارقام مقاوم است. عمدتا دو ژن مقاومت به ريزومانيا در چغندر قند شناسايي شدهاند كه از منابع مختلف منشأ گرفتهاند و بصورت.)Scholten & Lange, 2000( نامگذاري شدهاند و Rz2 Rz1 با توجه به آنكه روشهاي ارزيابي كالسيك گزينش مقاومت به بيماري از نوع فنوتيپي بوده و وابسته به شرايط محيطي و يكنواختي عامل آلوده كننده هستند و در فصل خاصي از سال انجام ميگيرند و نيز بعضي گياهان از عامل آلوده كننده به نحوي ميگريزند و به ظاهر مقاوم تلقي ميشوند از اين رو با استفاده از روشهاي مولكولي به عنوان روش تكميلي و يا جايگزين ميتوان گياهان در بردارنده ژن مقاومت را در سطح ژنوتيپي شناسايي نمود. بنابراين نشانگرهاي مولكولي DNA ميتوانند ابزاري مفيد براي انتخاب ژنوتيپهاي مقاوم باشند و باعث صرفه جويي در زمان ارزيابي و افزايش دقت انتخاب گردند )نوروزی 1387(. پلسي و مردينوگلو از روش BSA براي شناسايي نشانگرهاي RAPD پيوسته با ژن مقاومت به ريزومانيا در منبع Holly استفاده نمودند 1996) Merdinoglu,.(Pelsy and از 160 آغازگر استفاده شد كه 19 آغازگر 44 نشانگر چندشكل توليد نمودند كه در 9 گروه پيوستگي طبقه بندي شدند. شولتن 1- Rhizomania 2- Polymyxa beta keskin
چغندرقند در هموزیگوت مقاوم ژنوتیپهای غربال و ریزومانیا به مقاومت ژن با پیوسته مولکولی نشانگر یک تکرارپذیری بررسی 175 بود. پالسم ژرم سریع ارزیابی برای چغندرقند حساس روشها و مواد موسسه گلخانه در گیاهی نمونههای بذور گیاهی: مواد در شد. کشت کرج قند جغندر بذر تهيه و اصالح تحقیقات Rz2 ژن با پیوسته ناجفت نشانگر یک حضور تحقیق اين DNAی روي بر AM2 به موسوم ریزومانیا به مقاومت بدست اصالحی توده يك ي بوته تك 1160 در شده استخراج مقاومت ژن )دارای ماریتیما بتا وحشی گونه تالقی از آمده شاهد )رقم رجینا F2BC1 توده به موسوم چغندرقند با )Rz2 و ریزومانیا( به مقاوم شاهد )رقم پائولتا ریزومانیا( به حساس گردید. بررسي )Rz1 مقاومت ژن )دارای S1 اصالحی توده توده از گیاهچه 109 ماهه يك گياهان تهيه از پس همچنین پائولتا و رسول و رجینا ژنوتیپ چهار از گیاهچه 76 و F2BC1 به فنوتیپی مقاومت ارزیابی منظور به S1 اصالحی توده و ماه دو مدت به و شد منتقل گلخانه در ریزومانیا به آلوده خاک گیاهان مقاومت ميزان سپس شدند. داری نگه خاک این در داخل در ویروس غلظت اساس بر آلوده خاک در شده کشت تعیین آزمایشگاه در االيزا سرولوژيكي آزمون با گیاه ریشه گردید. ویروس غلظت گیری اندازه برای )ELISA( االیزا آزمون گردید. تهیه زیر بافرهای ابتدا :BNYVV را )Na2co3( سدیم کربنات گرم 1/59 پوششی: بافر تهیه - هیدروژن کربنات گرم 2/93 سپس کرده حل مقطر آب در بیشتر ماندگاری جهت شد. اضافه آن به )NaHCO3( سدیم ریخته محلول داخل آزید سدیم گرم 0/2 مقدار محلول این با ph سپس رسانده لیتر یک به نزدیک را بافر کل حجم شد. حجم به محلول انتها در گردید. تنظیم 9/8 در HCl از استفاده بسیار )NaN3( آزید سدیم ماده توجه: شد. رسانده لیتر یک است. زا سرطان و خطرناک گرم 2 )NaCl( سدیم کلرید گرم 80 :PBS10X بافر تهیه - کلرید گرم 2 و 2H2O Na2HPO4 گرم 29 KH2PO4 مقطر آب مقداری سپس و ریخته بشر یک در را )KCl( پتاسیم آزید سدیم گرم 0/2 مقدار شدن حل از پس شد. اضافه آن به ph تنظیم از پس کرده اضافه آن به بیشتر ماندگاری جهت شد. رسانده لیتر یک به محلول حجم 7/4 در محلول 700 در را PBS10X بافر از لیتر میلی 100 نمونه: بافر تهیه - اضافه آن به PVP گرم 20 سپس کرده حل مقطر آب لیتر میلی 0/5 همزن از استفاده با PVP کامل شدن حل از پس گردید. به محلول حجم انتها در کرده اضافه Tween20 از لیتر میلی شد. رسانده لیتر یک میلیلیتر 0/5 و PBS10X از لیتر میلی 100 شستشو: بافر تهیه - رسانده لیتر یک حجم به مقطر آب از استفاده با Tween20 شد. را آمین اتانول دی لیتر میلی 9/7 : 1 آمین اتانول دی بافر تهیه - رسانده لیتر میلی 100 حجم به نزدیک مقطر آب از استفاده با انتها در و تنظیم 9/8 در HCl از استفاده با محلول ph سپس شد. رسانده لیتر میلی 100 به محلول حجم در ویروس غلظت گیری اندازه :DAS-ELISA انجام مراحل ساندویچ روش به االیزا آزمون از استفاده با گیاهان چه ریشه معمول روش مطابق )DAS-ELISA( آنتیبادی طرفه دو گیاهپزشکی آزمایشگاه در که )1977( 3 آدامز و 2 کالرک بهینهسازی کرج چغندرقند بذر تهیه و اصالح تحقیقات موسسه عصاره و آنتیسرمها.)Amiri et al., )2003 شد انجام بود شده به BNYVV به آلوده Chenopodium quinoa برگهای تهیه شیراز دانشگاه کشاورزی دانشکده از 4 مثبت کنترل عنوان از پس گرفت: انجام زیر شرح به االیزا روش جزئیات گردید. شستشوی و آلوده خاک مخلوط از گیاهچهها سازی خارج اب همراه گیاه هر ریشهچه از گرم 0/1 آنها ریشهچههای کامل خوبی به گیری عصاره دستگاه در نمونه بافر از لیتر میلی یک داخل در االیزا آزمون زمان تا شده تهیه نمونه عصاره و شده له 1- Diethanolamine 2- Clark 3- Adams 4- Positive control
مجله زارعت و اصالح نباتات جلد 8 شماره 2 تابستان 1391 خشک شدن پلیتها به هر چاهک 100 میکرلیتر بافر تازه دی اتانول آمین حاوی یک mg/ml سوبسترا اضافه گردیده و در ردیفهای خارجی پلیتها نیز هر چاهک با 100 میکرولیتر بافر نمونه پر شد. سپس پلیتها در دمای اتاق و تاریکی نگهداری شدند. واکنش آنزیمی با دستگاه پلیت خوان (ELISA Reader, Labsystem,Multiskan EX-355) در 405 nm خوانده شد. در نهایت دو برابر میانگین مقادیر جذب نمونههای سالم به عنوان آستانه تفکیک گیاهان مقاوم از حساس در نظر گرفته شد. (Amiri et al., 2003) استخراج :DNA از گیاهان یکماهه استخراج DNA ژنومی با روش تییر یافته دالپورتا و همکاران انجام شد 1983( al.,.)dellaporta et سپس DNAي استخراج شده در بافر TE حل شد و در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری گردید. کمیت و کیفیت DNA استخراجی با استفاده از دو روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز در ژل آگارز مشخص شد. آزمون :RAPD واکنش زنجیره پلی مراز برای انجام RAPD در حجم نهایی 25 میکرولیتر برای هر واکنش انجام گرفت. حجم مورد نیاز DNA در یک واکنش 1/5 میکرولیتر با غلظت ng/ 2/5 2 میکرولیترdNTP 10x buffer 2/5 میکرولیتر 50 μl میلی موالر 1/8 میکرولیتر MgCl2 با غلظت 25 میلی موالر 1 میکرولیتر با غلظت 30 ng/μl از آغازگر AM2 0/2 میکرولیتر )یک واحد( آنزیم SmarTaq پلی مراز بود. واکنش زنجیره پلی مرازبرای آزمون RAPD در دستگاه ترموسایکلر با مراحل زیر صورت گرفت: 5 دقیقه واسرشت سازی اولیه درC 40 94 چرخه شامل واسرشته سازی به مدت 40 ثانیه در دمای 94 C اتصال به مدت 40 ثانیه در دمای 35 C توسعه به مدت 90 ثانیه در دمای 72 C و یک مرحله 10 دقیقهای توسعه نهایی در دمای 72 C برای تکمیل طول قطعات تکثیر شده در واکنش. سپس الکتروفورز در ژل آگارز 1 درصد با ولتاژ 100 رنگ آمیزی ژل در اتیدیوم بروماید و عکس برداری در دستگاه مستند ساز 176 لولههای 1/5 میلی لیتری دربدار داخل فریزر 20- درجه سانتی گراد نگهدای گردید. برای انجام آزمون االیزا ابتدا آنتی بادی با نسبت یک در هزار در بافر پوششی رقیق شده و به میزان 100 میکرولیتر از بافر رقیق آنتی بادی به هر یک از چاهکهای پلیت االیزا اضافه گردید. برای کاهش اثرهای حاشیهای ردیف خارجی پلیتها با بافر پوششی پرگردید و فقط از 60 چاهک داخلی پلیتها برای آزمون االیزا استفاده شد )امیری 1382, al., 1992.)Paul at سپس پلیتها به مدت 3/5 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد نگهدای شدند. پس از این مدت بافر پوششی موجود در پلیتها بهطور کامل خالی شده و هر پلیت سه بار و هر بار به مدت سه دقیقه توسط بافر شستشو شتسشو گردید. سپس پلیتها به مدت 4-5 دقیقه بهصورت در باز در دمای اتاق نگهداری شدند تا داخل چاهکها خشک شوند. برای آماده سازی عصاره نمونهها از فریزر 20- درجه سانتی گراد به یخچال منتقل شده و پس از باز شدن یخ آنها 100 میکرولیتر از عصاره هر نمونه به چاهکهای مربوطه اضافه گردید. در هر پلیت شش چاهک برای کنترل منفی )عصاره گیاه سالم( یک چاهک برای کنترل مثبت )عصاره برگهای Chenopodium quinoa آلوده به )BNYVV و دو چاهک برای نمونه فاقد عصاره گیاهی )Blank( در نظر گرفته شد. در این مرحله به ردیفهای خارجی پلیتها 100 میکرولیتر بافر نمونه اضافه گردید. پس از اضافه نمودن نمونهها )آنتی ژن( پلیتها در طی شب در یخچال در دمای چهار درجه سانتی گراد نگهداری شدند. در روز بعد بافر موجود در پلیتها بهطور کامل خالی شده و هر پلیت سه بار و هر بار به مدت سه دقیقه با بافر شستشو شسته شد. در این مرحله بعد از 4-5 دقیقه آنتی بادی کانژوگیت 1 با نسبت یک در هزار در بافر نمونه رقیق شده و 100 میکرولیتر از بافر رقیق آنتی بادی کانژوگیت به هر چاهک اضافه گردید. سپس پلیتها به مدت 3/5 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد نگهداری شده و متعاقب آن یه بار با بافر شستشو شسته شدند. پس از 1- Conjugate
بررسی تکرارپذیری یک نشانگر مولکولی پیوسته با ژن مقاومت به ریزومانیا و غربال ژنوتیپهای مقاوم هموزیگوت در چغندرقند ژل انجام گرفت. در نهایت الگوی نواربندی ژنوتیپها روی ژل مشخص شد. محاسبات آماري برای تعیین درصد توافق نتایج االیزا با دادههای مولکولی از رابطه زیر استفاده گردید: همچنین براي مقايسه نسبت مشاهده شده نشانگر با نسبت موردانتظار مندلی در توده اصالحی از آزمون مربع كاي تصحیح شده استفاده گردید. برای تعیین اثر دز ژن RZ1 در ژنوتیپهای مقاوم از طرح کامال تصادفی نامتعادل بر اساس مقایسه دادههای االیزا ونتایج مولکولی استفاده گردید. دادههای مربوط به این آزمون جهت تجزیه و تحلیل وارد نرم افزار Excel شد. به دلیل نرمال نبودن دادهها و وجود همبستگی بین میانگین و واریانس ابتدا به تمامی دادهها عدد یک اضافه شد سپس از تمامی دادهها لگاریتم طبیعی گرفته شد بدین ترتیب از غیر یکنواختی دادهها به میزان زیادی کاسته شد سپس دادهها با استفاده از نرم افزار SAS مورد آنالیز و تجزیه واریانس بهصورت طرح کامال تصادفی نامتعادل قرار گرفت. TE به میزان 30-250 میکرولیتر انجام شد. واکنش :RAPD-PCR برای ایجاد شرایط مناسب واکنش RAPD-PCR ابتدا غلظت مناسب نمک منیزیم آغازگر و DNA با استفاده از آزمون شیب غلظت تعیین گردید که غلظت مطلوب برای نمک منیزیم 1/8 میلی موالر بود. بیش از این مقدار باعث ایجاد باندهای Smear و کمتر از آن منجربه عدم تکثیر برخی قطعات در چرخه اولیه واکنش و در نتیجه از دست رفتن برخی چند شکلیهای احتمالی شد. حجم DNA مورد نیاز در یک واکنش 25 میکرولیتری 1/5 میکرولیتر با غلظت 50 نانوگرم در میکرولیتر بود. بیش از این مقدار اثر کم و غلظتهای باالتر اثر بازدارنده در تکثیر داشتند. همچنین غلظتهای پایین تر منجربه از دست رفتن برخی چندشکلیها شد. دو میکرولیتر dntp و حجم مورد نیاز از آغازگر 1 میکرولیتر با غلظت 30 نانوگرم در میکرولیتر 0/2 میکرولیتر و 2/5 میکرولیتر یارب 10Xbuffer Taq DNA Polymerase هر واکنش بهینه شد. الکتروفورز محصوالت RAPD-PCR در ژل آگارز 1 درصد رنگ آمیزی ژل در اتیدیوم بروماید و عکس برداری در دستگاه مستند ساز ژل انجام گرفت )شكل 1(. سپس درصد حضور نشانگر در تک بوتهها به تفکیک هر ژنوتیپ محاسبه شد. 177 نتایج و بحث استخراج DNA: DNA ژنومی استخراجی در ژل آگارز 0/8 درصد با ولتاژ 60 ولت اسمیر کمی داشت. بنابراین میتوان نتیجه گرفت که روش استفاده شده برای استخراج DNA از بافت برگی روشی ساده سریع و مناسب بوده و DNA استخراج شده از کیفیت مطلوبي برخوردار است. کمیت DNA نیز برای تعدادی از تک بوتهها با دستگاه اسپکتروفوتومتر اندازه گیری شد که پس از تایید بهینه بودن شرایط استخراج به دلیل تعداد زیاد نمونهها بسته به حجم رسوب DNA رقیق سازی در بافر
1391 تابستان شماره 2 8 جلد نباتات اصالح و زارعت مجله ستونها مابقی و DNA اندازه تعیین نشانگر معرف چپ سمت از سی و ده ستون ناجفتAM2 نشانگر از شده تهیه نیمرخ شکل 1 - F2BC1 توده ژنوتیپهای دهنده نشان Fig 1- profile from Am2 marker, 10 and 30 column from left display size marker, others indicating for F2BC2 geotypes االیزا: با AM2 نشانگر نتایج توافق بررسی موفق RAPD تکنیک از استفاده با 1382 سال در امیری فاصله )با شدید پیوستگی با AM2 ناجفت نشانگر گردید منبع از حاصل RZ2 ژنی مکان برای را مورگان( سانتی 3/6 بوته تک 185 ابتدا نشانگر تأیید برای آورد. بدست WB42 رجینا )Rz2 مقاومت ژن )دارای F2BC1 توده ژنوتیپهای با به مقاوم شاهد )رقم پائولتا ریزومانیا( به حساس شاهد )رقم و )Rz1 مقاومت ژن )دارای S1 اصالحی توده و ریزومانیا( قرار مولکولی موردآزمون ریزومانیا( به حساس )رقم رسول آن از بعد شد مشخص نشانگر حضور درصد سپس گرفت. اساس بر آلوده خاک در شده کشت گیاهان مقاومت ميزان سرولوژيكي آزمون با گیاه ریشه داخل در ویروس غلظت مقاوم بوتههای ترتیب بدین گردید. تعیین آزمایشگاه در االيزا درجه و همبستگي ميزان و رابطه سپس شد. مشخص حساس و )بر مقاومت و مولکولی( دادههای اساس )بر نشانگر بين توافق نرم با موردنظر توده بوتههاي تك در االيزا( دادههاي اساس 1(. )جدول شد مشخص Excel افزار در االیزا با نشانگر توافق درصد میشود مشاهده که همانطور S1 اصالحی تودهی و پائولتا و رسول و رجینا ژنوتیپهای بدین میباشد. درصد 98 مقدار F2BC1 توده در و صد در صد مختلف جمعیتهای در مذکور نشانگر تکرارپذیری ترتیب میگردد. تایید چغندرقند نشانگر حضور درصد و االیزا با AM2 نشانگر توافق درصد جدول 1 - Table 1- Agreement percent between AM2 marker with ELISA and marker presence نشانگر حضور درصد Marker presence (%) 96% توافق درصد الایزا با نشانگرAM2 بررسی بوته تعداد شده Plant No 28 ژنوتیپ نام ردیف Row 1 Genotype name رجینا حساس AM2 and ELISA agreement (%) 2 3 4 رسول حساس پاي ولتا مقاوم F 2 BC 1 توده 4 26 109 98% 92% 90% 5 S1 توده 18 178
بررسی تکرارپذیری یک نشانگر مولکولی پیوسته با ژن مقاومت به ریزومانیا و غربال ژنوتیپهای مقاوم هموزیگوت در چغندرقند غربال بوتههای هموزیگوت غالب در توده اصالحی بر اساس نشانگر ناجفت :AM2 پس از تایید نشانگر مذکور از آن جهت غربال بوتههای هموزیگوت غالب در توده F2BC1 استفاده شد. بدین ترتیب که بوتههای فاقد نشانگر ناجفت به منزله عدم آلل حساس و در نتیجه هموزیگوت غالب بودند. درصد بوتههای هموزیگوت غالب بر اساس نشانگر با درصد مورد انتظار در جامعه مذکور که معادل یک شانزدهم بود مورد مقایسه آماری با آزمون مربع کای شدند که نتایج آن در جدول 2 آمده است. جدول 2- نتیجه کای اسکور برای درصد حضور نشانگر در توده F2BC1 Table 2- chi square results for marker presence in F2BC1 نسبت مورد انتظار تعداد مورد انتظار تعداد مشاهده شده Expected Ratio Expected No Observed No 1:16 72 58 کاي اسکور تعداد گیاهان Plant No 1160 Χ 2 2.53ns ns: not significant :ns غیر معنی دار سانتی مورگان از ژن Rz1 در فاز ناجفت و نشانگرهای C4 وC1 به ترتیب در فواصل 21/4 و 27/5 سانتی مورگان از ژن Rz1 در فاز جفت شدند. اما هیچیک از محققان فوق الذکر نشانگرهای بدست آمده را به منظور تایید و تکرار پذیری آنها بر روی تعداد زیادی تک بوته از تودههای مختلف مورد بررسی قرار ندادند. بنابراین در تحقیق حاضر عمده نشانگرهای ذکر شده در منابع علمی داخلی و خارجی که پیوستگی آنها با ژن RZ1 قبال گزارش شده بود بررسی تکرارپذیری آنها در چندین توده اصالحی و رقم تجارتی حساس و مقاوم به ریزومانیا انجام گرفت که برخی از آنها تایید ولی عمده آنها بجای نشانگر ذکر شده در منبع اولیه تولید نشانگر )های( دیگری نمودند. علت این موضوع شاید بر طبق نظر محققان زیر قابل توجیه باشد. برای مثال گیوریو و همکاران al., 1997 (Giorio et برای تایید 10 نشانگر RAPD پیوسته با ژن مقاومت هولی که قبال توسط بارزن و همکاران (1997 al., (Barzen et شناسایی شده بود از یک توده در حال تفکیک برای ژن هولی استفاده و ثابت نمودند که تنها شش نشانگر از 10 نشانگر مذکور در توده آنها تایید میشود و تکرارپذیری دارد. همچنین گریمر و همکاران )2007 al., )Grimmer et در بررسی تکرارپذیری و تایید 10 نشانگر RAPD پیوسته با ژن مقاومت به ریزومانیا که قبال توسط سایر محققان گزارش شده بود نتیجه گرفتند که تنها 179 کایاسکور نشان داد که بین نسبت مورد انتظار برای وراثت صفت مونوهیبریدیسم و نسبت ژنوتیپ هموزیگوت غالب )Rz2Rz2( مشاهده شده تفاوت معنی داری وجود ندارد. لذا جامعه آماری بررسی شده دارای تعادل هاردی واینبرگ میباشد و نسبت تفکیک نشانگر AM2 با نسبت تفکیک ژن RZ2 مطابقت دارد. یعنی نوترکیبی بین نشانگر و ژن کم میباشد. اميري )1382( با استفاده از نشانگر RAPD و تكنيك BSA اقدام به شناسايي نشانگرهاي مولكولي پيوسته با ژن )هاي( مقاومت به ريزومانيا نمود. وي براي منبع مقاومت Holly يك نشانگر جفت با پيوستگي كم و براي منبع مقاومت WB42 يك نشانگر ناجفت با پيوستگي شديد شناسايي كه فاصله آن از مكان ژني Rz2 در منبع مقاومت WB42 حدود 3/6 سانتي مورگان بدست آمد. نوحی و همکاران نيز با استفاده از روشي مشابه و با استفاده از نشانگر RAPD موفق به شناسايي دو نشانگر بنامهاي OF-09 با اندازه 1150 جفت باز در وضعيت جفت و فاصله 27 سانتي مورگان از ژن Rz1 و ديگري OP- AN9 با اندازه 600 جفت باز در وضعيت ناجفت و با فاصله 13/7 سانتي مورگان از ژن Rz1 شدند 2008) al.,.(nouhi et نوروزي و فقهی )1388( با استفاده از تكنيك RAPD موفق به شناسائي نشانگرهای R1 و R2 به ترتیب در فواصل 2/32 و 8/3
مجله زارعت و اصالح نباتات جلد 8 شماره 2 تابستان 1391 یک نشانگر در توده ایشان تکرارپذیری داشته و مورد تایید قرار میگیرد و سایر نشانگرها با فواصلی که قبال گزارش شده بود تایید نشدند. ایشان علت این عدم تایید را تکرارپذیری کم برخی از باندهای RAPD و نیز تفاوت در زمینه ژنتیکی تودههای به کار رفته در تحقیقات افراد مختلف دانستند که این تنوع میتواند بر الگوی باندهای RAPD موثر باشد. بهر حال نتیجه تحقیق حاضر منجر به معرفی تعداد زیادی نشانگر جفت و ناجفت پیوسته با ژن RZ1 شده است که در تودههای اصالحی و ارقام تجارتی موجود در موسسه تحقیقات چغندرقند قابل استفاده میباشند. اثر دز ژن مقاومت به ریزومانیا: در نشانگرهای ناجفت گیاه مقاوم هموزیگوت )Rz1Rz1( با عدم حضور باند و گیاه مقاوم هتروزیگوت )Rz1rz1( و گیاه حساس )rz1rz1( بهصورت حضور باند مشخص میشوند. با مقایسۀ بین نتایج آزمون االیزا و آزمون مولکولی میتوان گیاهان حساس )rz1rz1( را از گیاهان مقاوم هتروزیگوت )Rz1rz1( تشخیص داد. نشانگر ناجفت AM2 برای ژن Rz2 شناسایی شده که از ترکیب اطالعات مربوط به این نشانگر و نتایج آزمون االیزا امکان تفکیک ژنوتیپهای Rz2 Rz2 و Rz2 rz2 از یکدیگر فراهم شد. بر این اساس از تعداد کل بوتههای مقاومی که به وسیله این نشانگر مورد بررسی قرار گرفتند 5 بوته هموزیگوت غالب و 75 بوته هتروزیگوت بودند. که نتایج آن در جدول 3 ارائه شده است. همان طوری که مالحظه میگردد میانگین مقادیر جذب االیزای ژنوتیپهای هتروزیگوت و هموزیگوت غالب فاقد تفاوت معنیدار میباشد. جدول 3 - نتایج تجزیه واریانس اثر دز ژنی Table 3- Analysis of variance for gene dose effect میانگین مربعات MS 0.0041ns 0.0049ns درجه آزادي df 1 78 79 منابع تغییرات S. O. V. ژنوتیپ Genotype خطا Error کل Total ns: not significant :ns غیر معنی دار شولتن و همکاران اثر ژن هولی را بهصورت غالبیت کامل بدست آوردند بهطوری که پس از تهیه گیاهان F1 حاصل تالقی یک گیاه کامال حساس با یک گیاه هموزیگوت مقاوم نتیجه گرفتند که از نظر مقدار تجمع ویروس تحت شرایط آلوده گیاهان F1 هتروزیگوت با گیاهان هموزیگوت غالب جذب ویروس یکسانی دارند و بدین ترتیب اثر دز ژن را تایید نکردند 1996( al.,.)scholten et نوحی و همکاران با استفاده از دادههای یک نشانگر ناجفت و مقادیر جذب االیزا در یک توده F2 توانستند ژنوتیپهای هموزیگوت غالب را از هتروزیگوت تفکیک نمودند و میانگین جذب االیزای مشابهای برای این دو ژنوتیپ بدست آوردند. ایشان نتیجه گرفتند که دز ژن Rz1 تاثیری در میزان مقاومت به ریزومانیا ندارد )2009 al.,.)nouhi et با این حال به نظر میرسد به علت آنکه در تحقیق ایشان تعداد افراد هموزیگوت غالب بر خالف انتظار حدود دو برابر افراد هتروزیگوت بود )انتظار میرفت در یک جامعه F2 تعداد افراد هموزیگوت غالب نصف افراد هتروزیگوت باشد( شاید نتیجه گیری ایشان ناشی از این مسئله بوده باشد. تشکر و قدردانی نویسندگان بر خود الزم میدانند از مدیریت مؤسسه تحقیقات اصالح و تهیه بذر چغندرقند به خاطر فراهم نمودن امکانات این تحقیق تشکر و قدردانی نمایند. 180
بررسی تکرارپذیری یک نشانگر مولکولی پیوسته با ژن مقاومت به ریزومانیا و غربال ژنوتیپهای مقاوم هموزیگوت در چغندرقند References فهرست منابع امیری ر. 1382. وراثت ژن )های( عامل مقاومت به ریزومانیا و شناسایی نشانگرهای DNAی پیوسته با آنها در چغندر قند. پایان نامه دکتری تخصصی اصالح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز. ايزدپناه ك. هاشمي پ. كامران ر. پاك نيت م. سهندپور آ. و معصومي م. 1375. وجود گسترده بيماري ريشه ريشي )شبه )Rhizomania در فارس. مجله بيماري گياهي جلد 32 صفحات: 200-206. توده فالح م. ارجمندی ن. و محمودی ب. 1379. بررسی وضعیت آلودگی و پراکنش بیماری ریزومانیا )ریشه گنایی( چغندر قند در ایران. 1379. خالصه مقاالت چهاردهمین کنگره گیاهپزشکی ایران دانشگاه صنعتی اصفهان. اصفهان. جلد دوم صفحه 72. قنبری م. امیری ر. محمودی س.ب. نوروزی پ. محمدی ع. 1386. مطالعه اثر دز ژن مقاومت به بیماری ریزومانیا )RZ2( در چغندرقند. خالصه مقاالت پنجمین همایش ملی بیوتکنولوژی ایران. صفحه 368. مصباح م. 1386. شناسايي نشانگرهاي مولكولي پيوسته با ژنهاي مقاومت به ريزومانيا جهت ارزيابي سريع ژرم پالسم چغندرقند. گزارش نهايي طرح. مؤسسه تحقيقات اصالح و تهيه بذر چغندرقند. 44 صفحه. نوروزي پ. 1387. شناسائي نشانگرهاي مولكولي پيوسته با ژن يا ژنهاي مقاومت به ريزومانيا از منبع.Holly گزارش نهايي طرح تحقيقاتي. موسسه تحقيقات اصالح و تهيه بذر چغندرقند. شماره ثبت 67 87/354. صفحه. نوروزی پ. و فقهی. س. م. ا. 1388. شناسایی چند نشانگر مولکولی RAPD پیوسته با ژن مقاومت به ریزومانیا در چغندرقند. ششمین همایش ملی بیوتکنولوژی جمهوری اسالمی ایران )22-24 مرداد 1388(. Amiri, R., Moghaddam, M., Mesbah, M., Sadeghian, S. Y., Ghannadha, M. R. & Izadpanah, K. 2003. The inheritance of resistance to beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) in B. vulgaris subsp. maritima, accession WB42: Statistical comparisons with Holly-1-4. Euphytica 132: 363-373. Barzen E, Mechelke W, Ritter E, Seitzer JF, Salamini F.1992. RFLP markers for sugar beet breeding: chromosomal linkage maps and location of major genes for rhizomania resistance, monogermy and hypocotyl colour. Plant J. 2:601 611. Barzen E, Stahl R, Fuchs E, Borchardt DC, Salamini F.1997. Development of coupling-repulsion-phase SCAR markers diagnostic for the sugar beet Rr1 allele conferring resistance to rhizomania. Mol Breed 3:231 238 Clark, M. F. & Adams, A. N. 1977. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology 34: 475-483. Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB.1983. A plant DNA minipreparation version II. Plant Molecular Biology Reporter. 1: 19-21. Draycott, A.P. 2006. Sugar beet. Blackwell, London. Giorio, G. Gallitelli, M. and Cerrioro, F. 1997. Molecular markers linked to rhizomania resistance in sugar beet, Beta vulgaris, from two different sources map to the same linkage groups. Plant Breeding 116: 401-408. Grimmer, M. K., S. Trybush, S. Hanley, S. A. Francis, A. Karp, M. J. C. Asher. 2007. An anchored linkage map for sugar beet based on AFLP, SNP and RAPD markers and QTL mapping of a new source of resistance to Beet 181
مجله زارعت و اصالح نباتات جلد 8 شماره 2 تابستان 1391 necrotic yellow vein virus. Theor Appl Genet. 114:1151 1160. Keskin, B., 1964. Polymyxa betae n. sp., ein Parasit in den Wurzeln von Beta vulgaris Tournefort, besonders während der Jugendentwicklung der Zuckerrübe. Arch Mikrobiol 49: 348 374. Lein, J.C., Asbach, K. Tian, Y. Schulte, D. Li, C., Koch, G., Jung C. and Cai, D. 2007. Resistance gene analogues are clustered on chromosome 3 of sugar beet and cosegregate with QTL for rhizomania resistance. Genome vol 50: 61-71. Nouhi, A., Amiri, R., Haghnazari. A., Saba, J. and Mesbah, M. 2008. Tagging of resistance gene (s) to rhizomania disease in sugar beet (Beta vulgaris L.). African Journal of Biotechnology Vol. 7 (4), pp. 430-433. Nouhi A. A., R. Amiri., A. Hagh Nazari., J. Saba and M. Mesbah. 2009. Use of molecular marker for assay gene dosage resistant gene to rhizomania disease (Rz1) in sugar beet (Beta vulgaris L.). Asian Journal of Biotechnology. 1 (1): 37-41. Paul H, Henken B, Alderlieste MFJ (1992). A greenhouse test for screening sugar beet (Beta vulgaris L.) for resistance to Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV). Neth. J. Plant Pathol. 98:65 75. Pelsy, F. & Merdinoglu, D. 1996. Identification and mapping of random amplified polymorphic DNA markers linked to a rhizomania resistance gene in sugar beet (Beta vulgaris L.) by bulked segregant analysis. Plant Breeding 115, 371-377. Scholten, O. E., Jansen, R. C., Paul Keizer, L. C., De Bock, Th. S. M. & Lang, W. 1996. Major genes for resistance to beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) in Beta vulgaris. Euphytica 91: 331-339. Scholten, O. E, Klein-Lankhosrst, R. M. Esselink, D. G. De Boek, S. M. and Lange W. 1997. Identification and mapping of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers linked to resistance against beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) in Beta accessions. Theor. Appl. Genet. 94:123-130. Scholten, O.E., De Bock, T.S.M., Klein-Lankhorst, R.M. & Lange, W. 1999. Inheritance of resistance to beet necrotic yellow vein virus in Beta vulgaris, conferred by a second gene for resistance. Theor. Appl. Genet. 99, 740-746. Scholten, O. E. & Lange, W. 2000. Breeding for resistance to rhizomania in sugar beet: A review. Euphytica 112: 219-231. Tamada T (1975). Beet Necrotic Yellow Vein Virus. C.M.I./ A.A.B. Descriptions of plant viruses, No. 144 Wisler, G. C., Lewellen, R. T., Sears, J. L., Liu, H. Y. & Duffus, J. E. 1999. Specificity of TAS-ELISA for beet necrotic yellow vein virus and its application for determining rhizomania resistance in field grown sugar beets. Plant Dis. 83: 864-870. Amiri, R., M. Mesbah, M. Moghaddan, M. R.. Bihamta, S.A. Mohammadi and P. Norouzi. (2009). A new RAPD marker for beet necrotic yellow vein virus resistance gene in Beta vulgaris. Biologia Plantarum. 53 (1): 112-119. Amiri R., Moghaddam M., Mesbah M., Sadeghian SY., Ghannadha MR. and Izadpanah K. 2003. The inher- 182
بررسی تکرارپذیری یک نشانگر مولکولی پیوسته با ژن مقاومت به ریزومانیا و غربال ژنوتیپهای مقاوم هموزیگوت در چغندرقند itance of resistance to beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) in B. vulgaris subsp. maritima, accession WB42: Statistical comparisons with Holly-1-4. Euphytica. 132: 363-373. Amiri, R. 1382a. Genetic studies on resistance to Rhizomania in S1, S2 and BC generations. Final report of research project. Sugar beet seed institute, Karaj, Iran. 21pp. Amiri, R. 1382b. Identification of molecular markers linked to Rhizomania resistance gene for rapid screening of beet germplasm. Final report of research project. Sugar beet seed institute, Karaj, Iran. 32pp. Barzen, E., R. Stahal, E. Fuchs, D. C. Borchardt & F. Salamini. 1997. Development of coupling- repulsionphase SCAR markers diagnostic for the sugar beet Rr1 allele conferring resistance to rhizomania. Mol.Breeding 3: 231-238. Giorio, G., M. Gallitelli, and F. Cerrioro. 1997. Molecular markers linked to rhizomania resistance in sugar beet, Beta vulgaris, from two different sources map to the same lnkage group. Plant Breeding. 116:401-408. Norouzi, P. 1387. Identification of molecular markers linked to Rhizomania resistance gene (s) from Holly. Final report of research project. Sugar beet seed institute, Karaj, Iran. 67pp. Nouhi A. A., R. Amiri., A. Hagh Nazari., J. Saba and M. Mesbah. 2009. Use of molecular marker for assay gene dosage resistant gene to rhizomania disease (Rz1) in sugar beet (Beta vulgaris L.). Asian Journal of Biotechnology. 1 (1): 37-41. Pelsy, F., and D. Merdinoglu. 1996. Identification and mapping of random amplified polymorphic DNA markers linked to a rhizomania resistance gene in sugar beet ( Beta vulgaris) by bulked segregant analysis. Plant Breeding. 115:371-377. Scholten, O.E., Th.S.M.De Bock,Klein Lankhorst & W.Lange. 1999. Inberitance of resistance to beet necrotic yellow vein virus in Beta Vulgaris conferred by a second gene for resistance. Theor. Appl.Genet.99:740-746. Scholten, O,E., R.M. Klein Lankhorst, D.G. Esselink, Th.S.M.De Bock & W. Longe. 1997. Identification and mapping of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers linked to resistance against beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) in Beta accessions. Theor. Appl. Genet. 94:123-130. Steel, R.G.D. & Torrie, J.H. 1980. Principles and Procedures of Statistics, A Biometrical Approach. McGraw- Hill, Inc., New York. 183