ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΠΑΡΑΚΤΙΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΠΑΡΑΚΤΙΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΗΣ ΘΑΛΑΣΣΑΣ, ΤΜΗΜΑ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ, ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΓΡΑΦΙΑΣ, ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΘΑΛΑΣΣΙΩΝ ΕΡΕΥΝΩΝ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Εκτίμηση της οικολογικής κατάστασης παρακτίων περιοχών του Βορείου Αιγαίου μέσω της μελέτης βιοδεικτών ρύπανσης σε βενθικούς οργανισμούς (δίθυρα μαλάκια) ΤΣΟΜΠΑΝΑ ΣΤΑΥΡΟΥΛΑ Α.Μ. 193/0622 Επιβλέποντες: Επίκ. Καθ. Αλεξάνδρα Γώγου, Αν. Καθηγητής Δρόσος Κουτσούμπας Μυτιλήνη, Μάιος 2008

Στην οικογένειά μου 2

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μελέτη εκπονήθηκε υπό την επίβλεψη της κ. Αλεξάνδρας Γώγου, Επίκουρου Καθηγήτριας, και του κ. Δρόσου Κουτσούμπα, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Επιστημών της Θάλασσας του Πανεπιστημίου Αιγαίου. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Οικοτοξικολογίας του Ινστιτούτου Ωκεανογραφίας του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών (ΕΛΚΕΘΕ). Το υλικό της μελέτης προέρχεται από τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στις αναλύσεις του Ευρωπαϊκού προγράμματος βιοπαρακολούθησης MYTIMED - Programme Interreg III B MEDOCC - Priority 4, Measure 4.3. Επιθυμώ να εκφράσω θερμές ευχαριστίες στους επιβλέποντες για την δυνατότητα που μου προσέφεραν και την υποστήριξη που παρείχαν στην εκπόνηση της παρούσας μελέτης. Η βασική εκπαίδευση, το πειραματικό μέρος καθώς και η ανάλυση των αποτελεσμάτων της μελέτης έγιναν υπό την καθοδήγηση της κ. Κατερίνας Τσαγκάρη, Ερευνήτριας Γ του Ινστιτούτου Ωκεανογραφίας του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών. Οι κυρίες Γώγου και Τσαγκάρη με καθοδήγησαν στα πρώτα βήματά μου, παρακολούθησαν ενεργά όλες τις φάσεις εκπόνησης της παρούσας διπλωματικής εργασίας και έδωσαν λύσεις στα μεθοδολογικά και άλλα προβλήματα που ανέκυψαν στην εξέλιξη της μελέτης. Τις ευχαριστώ θερμά. Σημαντική βοήθεια στην επιτυχή ανάλυση των δεδομένων μου προσέφερε ο κ. Χατζηανέστης Ιωάννης, Ερευνητής Β του Ινστιτούτου Ωκεανογραφίας του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών, τον οποία ευχαριστώ ιδιαίτερα. Η παρούσα διπλωματική εργασία δεν θα είχε ολοκληρωθεί χωρίς τη βοήθεια και την αμέριστη συμπαράσταση της οικογένειάς μου. Μαρία, Γιάννη, Αντισθένη, Μιχάλη, η εργασία αυτή είναι αφιερωμένη σ εσάς. Μυτιλήνη, Μάιος 2008. 3

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 7 1.1 Γενικά... 8 1.2 Χημική ρύπανση Βιοδείκτες... 9 1.3 Mytilus galloprovincialis... 11 1.3.1 Ταξινομία και ανατομία του Mytilus galloprovincialis... 11 1.3.2 Βιολογία - Οικολογία του Μ. galloprovincialis.... 12 1.3.3 Χρήση του είδους Mytilus galloprovincialis σε προγράμματα βιοπαρακολούθησης.... 15 1.4 ΠΑΡΟΥΣΑ ΜΕΛΕΤΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ MYTIMED... 17 1.5 ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΗ... 19 1.5.1 Μοριακή φυσιολογία του ενζύμου... 19 1.5.2 Χρήση της καταστολής της ακετυλοχολινεστεράσης ως βιοδείκτη.... 22 1.6 ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ ΕΝΖΥΜΑ... 23 1.6.1 Παραγωγή Ενεργών Μορφών Οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS)... 23 1.6.2 Ενίσχυση της παραγωγής ROS μέσω ρύπων -αντιοξειδωτική άμυνα... 24 1.6.3 Καταλάση (CAT).... 25 1.6.4 Γλουταθειόνη-S-τρανσφεράση (GST)... 27 1.7 ΧΗΜΙΚΟΙ ΡΥΠΟΙ... 29 1.7.1 Παρασιτοκτόνα... 29 1.7.1.1 Οργανοφωσφορικά παρασιτοκτόνα... 30 1.7.1.2. Καρβαμιδικά παρασιτοκτόνα... 32 1.7.2 Οργανοχλωριωμένες ενώσεις Πολυχλωριωμένα Διφαινύλια (PCBs).. 32 1.7.3 Πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (PAHs)... 36 1.7.4 Βαρέα μέταλλα... 38 1.7.5 Τοξίνες κυανοβακτηρίων... 40 1.8 ΠΕΡΙΟΧΗ ΜΕΛΕΤΗΣ... 41 1.8.1 Θερμαϊκός Κόλπος... 41 1.8.2 Κυρα-Παναγιά, Εθνικό Θαλάσσιο Πάρκο Αλοννήσου Βορείων Σποράδων (ΕΘΠΑΒΣ).... 45 1.8.3 Λέσβος Είσοδος Κόλπου Γέρας... 47 1.9 Σκοπός της παρούσας μελέτης... 49 2. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ... 51 2.1Μεθοδολογία του προγράμματος MYTIMED.... 52 2.2 Προετοιμασία δειγμάτων αναφοράς.... 54 2.3 Προσδιορισμός της δραστικότητας της ακετυλοχολινεστεράσης (ACHE)... 54 5

2.4 Μέτρηση της ολικής συγκέντρωσης των πρωτεϊνών... 55 2.5 Προσδιορισμός της δράσης του αντιοξειδωτικού ενζύμου καταλάση (CAT).56 2.6 Προσδιορισμός της δράσης του αντιοξειδωτικού ενζύμου γλουταθειόνη S-τρανσφεράση (GST).... 59 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 61 3.1 Προσδιορισμός της δραστικότητας της ACHE.... 62 3.1.1Μέτρηση της απορρόφησης για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της ACHE.... 62 3.1.2 Oλική συγκέντρωση πρωτεϊνών... 62 3.1.3 Δραστικότητα ACHE... 63 3.1.4 Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων υπολογισμού της δραστικότητας της ACHE.... 64 3.2. Προσδιορισμός της δραστικότητας του αντιοξειδωτικού ενζύμου καταλάση... 66 3.2.1 Μέτρηση της απορρόφησης για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της καταλάσης... 66 3.2.2 Ολική συγκέντρωση πρωτεϊνών... 66 3.2.3 Δραστικότητα καταλάσης... 67 3.2.4 Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων υπολογισμού της δραστικότητας της καταλάσης... 68 3.3. Προσδιορισμός της δραστικότητας της γλουταθειόνης-s-τρανσφεράσης.. 70 3.3.1 Μέτρηση της απορρόφησης για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της GST... 70 3.3.2 Προσδιορισμός της δραστικότητας του ενζύμου GST... 71 3.3.3 Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων υπολογισμού της δραστικότητας της γλουταθειόνης-s-τρανσφεράσης... 71 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 74 4.1 Δραστικότητα της ακετυλοχολινεστεράσης.... 76 4.2 Δραστικότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων... 79 4.2.1 Δραστικότητα της καταλάσης.... 79 4.2.2 Δραστικότητα της γλουταθειόνης-s-τρανσφεράσης... 82 4.3 Συμπεράσματα... 83 4.4. Μελλοντικές προοπτικές... 85 5. ΠΕΡΙΛΗΨΗ-ABSTRACT... 87 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 92 7. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ... 101 6

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7

1.1 ΓΕΝΙΚΑ Η εισαγωγή ξενοβιοτικών χημικών ουσιών στο θαλάσσιο περιβάλλον και οι επιπτώσεις τους αποτελούν ένα πολύ σημαντικό ζήτημα που εγείρει το ενδιαφέρον σε τοπικό, εθνικό και παγκόσμιο επίπεδο. Για το λόγο αυτό και ακολουθώντας τις συστάσεις του Διεθνούς Φόρουμ για την Χημική Ασφάλεια και τις οδηγίες του Περιβαλλοντικού Προγράμματος των Ηνωμένων Εθνών (UNEP), αποφασίστηκε τον Φεβρουάριο του 1997 (Απόφαση 19/13C) η άμεση παγκόσμια δραστηριοποίηση για την μείωση ή και την εξάλειψη των εκπομπών και απορρίψεων ανθεκτικών οργανικών ρυπαντών (POPs), οι οποίοι έχουν προσδιοριστεί από την παγκόσμια κοινότητα σαν αίτια σοβαρών απειλών για το περιβάλλον και την υγεία. Έγινε σύσταση Διακυβερνητικής Επιτροπής Διαπραγματεύσεων (INC) με εντολή την προετοιμασία ενός παγκοσμίου νομικά επικυρωμένου οργάνου που θα έθετε σε ισχύ την δράση για τους POPs. Η σειρά αυτή των διαπραγματεύσεων οδήγησε στην αποδοχή της Συνθήκης της Στοκχόλμης το 2001. H Συνθήκη της Στοκχόλμης αποτελεί μια παγκόσμια συμφωνία για την προστασία του περιβάλλοντος και της δημόσιας υγείας από ανθεκτικούς οργανικούς ρύπους, PCBs, PAHs, οργανοχλωριωμένες ενώσεις και βαρέα μέταλλα 1. Τα τελευταία χρόνια οι συγκεντρώσεις των ρύπων που εισέρχονται στο θαλάσσιο περιβάλλον έχουν αυξηθεί σημαντικά λόγω της αύξησης των διεργασιών που αποδίδονται σε ανθρωπογενείς δραστηριότητες. Η υποβάθμιση της ποιότητας του νερού και του ιζήματος μπορεί να οδηγήσει σε μείωση των φυσικών πόρων. Για το λόγο αυτό υπάρχει μια αυξανόμενη ανάγκη για την ανάπτυξη μεθόδων για την αναγνώριση, τον προσδιορισμό, την συγκριτική εκτίμηση και διαχείριση των κινδύνων που δημιουργούνται από τις απορρίψεις ρύπων στο περιβάλλον 2. Σε επιβαρυμένα με ρύπανση οικοσυστήματα και ιδιαίτερα σε παράκτιες περιοχές, οι οργανισμοί συχνά εκτίθενται σε σύνθετα μείγματα χημικών ενώσεων, με αποτέλεσμα την προσαρμογή τους - έως κάποιο βαθμό - σε υποβαθμισμένες περιβαλλοντικές συνθήκες. Κατά την εξελικτική πορεία των οργανισμών, έχει αναπτυχθεί ένα σύνολο στρατηγικών σε κυτταρικό επίπεδο για την προστασία από τις τοξικές επιπτώσεις των βαρέων μετάλλων και οργανικών ρύπων 3. Οι χημικοί ρύποι αφού προσληφθούν από τους οργανισμούς, αποθηκεύονται στο σώμα τους, δηλαδή βιοσυσσωρεύονται, απεκκρίνονται, ή μεταβολίζονται με μετατροπή τους σε άλλες ενώσεις Αν και με κάποιες από τις παραπάνω διαδικασίες οι ρύποι αποτοξικοποιούνται, από την στιγμή 1 UNEP Chemicals, 2002 2 Cajaraville et al, 2000 3 Manduzio et al, 2004 8

που οι μηχανισμοί αποτοξικοποίησης υπερφορτωθούν εμφανίζονται τοξικές επιδράσεις. 1.2 ΧΗΜΙΚΗ ΡΥΠΑΝΣΗ ΒΙΟΔΕΙΚΤΕΣ Τις τελευταίες δεκαετίες, πολλές έρευνες έχουν επισημάνει την σημασία της προσέγγισης μέσω βιοδεικτών στην εκτίμηση της περιβαλλοντικής ποιότητας, για την καλύτερη κατανόηση των οδών και των μηχανισμών με τους οποίους επιδρούν οι χημικοί ρύποι στους θαλάσσιους οργανισμούς. Ο όρος βιοδείκτης (biomarker) έχει καθοριστεί σαν: μια βιοχημική, φυσιολογική μεταβολή ή μεταβολή στην συμπεριφορά που μπορεί να μετρηθεί στους ιστούς, στα υγρά του σώματος ή σε επίπεδο ολόκληρου του οργανισμού και παρέχει ένδειξη για την έκθεση σε, ή/και επιβλαβή επίδραση από χημικούς ρύπους. 4 Έχει αναγνωριστεί από διεθνείς οργανισμούς και περιβαλλοντικούς φορείς το γεγονός ότι η εκτίμηση των κινδύνων στηριζόμενη μόνο στην χημική ανάλυση των περιβαλλοντικών δειγμάτων δεν παρέχει ενδείξεις των επιπτώσεων στους οργανισμούς και δίνει έμμεσα συμπεράσματα σε επίπεδο οικοσυστήματος 5. Για το λόγο αυτό, η μέτρηση των βιολογικών επιδράσεων της ρύπανσης θεωρείται πολύ σημαντική για τον προσδιορισμό της περιβαλλοντικής ποιότητας. Πρόσφατα, η χρήση των βιοδεικτών που μετρούνται σε μοριακό ή κυτταρικό επίπεδο έχει προταθεί σαν ένα ευαίσθητο εργαλείο έγκαιρης προειδοποίησης και διάγνωσης των αιτίων για πιθανή βλάβη σε επίπεδο οικοσυστήματος. Οι βιοδείκτες μπορούν να δείξουν την έκθεση του οργανισμού σε χημικούς ρύπους (βιοδείκτες έκθεσης - exposure biomarkers) ή/ και να προσδιορίσουν ποιοτικά και ποσοτικά δυσμενείς επιδράσεις ή πίεση στους οργανισμούς (βιοδείκτες επιδράσεων ή stress - effect biomarkers). Ένα από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά των μοριακών και κυτταρικών βιοδεικτών είναι ότι δίδεται η δυνατότητα έγκαιρης επέμβασης προτού οι επιπτώσεις εμφανιστούν σε υψηλότερα επίπεδα βιολογικής οργάνωσης, για παράδειγμα σε επίπεδο πληθυσμού, κοινότητας και οικοσυστήματος. Αυτά τα εργαλεία έγκαιρης προειδοποίησης μπορούν να χρησιμοποιηθούν με τρόπο προγνωστικό και προληπτικό, επιτρέποντας την έναρξη στρατηγικών 4 AMAP Report 99:1, 1998, σελ. 5 5 Rank et al, 2007 9

εξυγίανσης πριν συμβεί ανεπανόρθωτη ζημιά στο περιβάλλον με σημαντικές οικολογικές συνέπειες 6,7. Έρευνες των τελευταίων χρόνων πάνω σε βιοδείκτες έχουν δείξει την ανάγκη συσχετισμού τους σε ένα βαθμό με την μείωση της ανάπτυξης, της αναπαραγωγικής απόδοσης ή της μεταβολικής λειτουργίας που αντιπροσωπεύει την υποβάθμιση της υγείας του οργανισμού. Επιπλέον, η συσχέτιση βιοχημικών και κυτταρικών βιοδεικτών με βιοδείκτες της συνολικής υγείας του οργανισμού είναι σημαντική για την εκτίμηση της χρησιμότητάς τους στην πρόβλεψη των επιπτώσεων στον πληθυσμό. Παρόλα αυτά, οι έρευνες πεδίου επιδεικνύουν δυσκολίες λόγω της πολύπλοκης και κυμαινόμενης φύσης του περιβάλλοντος και των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ρύπων. Οι οργανισμοί εκτίθενται in situ σε πολλούς φυσικούς παράγοντες όπως η αλατότητα, η υποξία και η θερμοκρασία. Οι παράγοντες αυτοί, μαζί με τις γενετικές διαφορές που αφορούν σε ευπάθεια σε πιέσεις (π.χ. αντοχή σε οξειδωτικό στρες), έχουν σαν αποτέλεσμα την αυξημένη ποικιλότητα στις μεταβολές που παρουσιάζουν οι βιοδείκτες 8. Οι βιοδείκτες που ελέγχονται σύμφωνα με την στρατηγική για την ανάπτυξη Δεικτών Θαλάσσιας Ρύπανσης της Μεσογείου (Marine Pollution Indicators, MPIs) του προγράμματος MEDPOL 9 είναι οι ακόλουθοι: Stress on stress (επιβίωση στον αέρα) σε μύδια Σταθερότητα λυσοσωμικής μεμβράνης σε κύτταρα μυδιών και ψαριών Συγκέντρωση λυσοσωμικής λιποφουξίνης σε κύτταρα μυδιών και ψαριών Συγκέντρωση λυσοσωμικών ουδέτερων λιπιδίων σε κύτταρα μυδιών και ψαριών Συχνότητα μικροπυρήνων σε κύτταρα μυδιών και ψαριών Αλλοιώσεις στο DNA σε κύτταρα μυδιών και ψαριών Μεταλλοθειονίνες σε κύτταρα μυδιών AChE σε μύδια Δραστικότητα EROD Οξειδωτικό στρες σε κύτταρα μυδιών και ψαριών Οι βενθικοί οργανισμοί, και ιδιαίτερα τα δίθυρα μαλάκια έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σαν είδη-δείκτες στην βιοπαρακολούθηση της χημικής ρύπανσης στο υδάτινο περιβάλλον σε πολλά ευρωπαϊκά και διεθνή ερευνητικά προγράμματα (MED-POL, Mussel Watch, OSPAR, BEEP κ.ά.) λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους. 6 Tsangaris et al, 2007 7 Moreira et al, 2005 8 Nasci et al, 2002 9 Martínez-Gómez et al, 2007 10

Πολλές μελέτες διαφορετικών βιοδεικτών στην περιοχή την Μεσογείου επικεντρώνονται στο είδος Mytilus galloprovincialis (Lamark, 1819), το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί και στην παρούσα μελέτη. Τα βιολογικά χαρακτηριστικά του είδους καθώς και οι λόγοι για τους οποίους χρησιμοποιείται ευρέως σε προγράμματα βιοπαρακολούθησης αναφέρονται στην ενότητα που ακολουθεί. 1.3 Mytilus galloprovincialis 1.3.1 Ταξινομία και ανατομία του Mytilus galloprovincialis Βασίλειο Animalia Φύλο Mollusca Κλάση Bivalvia Υποκλάση Pteriomorphia Τάξη Mytiloida Οικογένεια Mytilidae Γένος Mytilus Είδος Mytilus galloprovincialis «Μεσογειακό μύδι» 10 Το είδος Μ. galloprovincialis (Εικόνα 1.1) ανήκει στην κλάση των δίθυρων μαλακίων. Το σώμα τους είναι πλευρικά πιεσμένο και κλεισμένο μέσα σε ένα όστρακο που αποτελείται από δύο θυρίδες. Τα βράγχια, χρησιμοποιούνται όχι μόνο για την πρόσληψη του οξυγόνου, αλλά επίσης Εικόνα 1.1: Mytilus galloprovincialis για τη διήθηση και τη διαλογή μικρών σωματιδίων τροφής από το νερό. Η εσωτερική επιφάνεια του οστράκου επενδύεται από το μανδύα, έτσι ώστε όλο το σώμα του ζώου βρίσκεται μέσα στη μανδυακή κοιλότητα, που είναι ένας κενός χώρος ανάμεσα στα δύο φύλλα του μανδύα. Τα μύδια της οικογένειας Mytilidae χαρακτηρίζονται από το δίθυρο όστρακό τους που αποτελείται από δύο κόγχες ή θυρίδες, συμμετρικές και ίσες (ισόθυρα). Οι θυρίδες ενώνονται μεταξύ τους μ έναν ελαστικό σύνδεσμο. Το άνοιγμα των θυρίδων ελέγχεται από τον ελαστικό σύνδεσμο και το κλείσιμό τους από δύο μύες που 10 www.cbif.gc.ca/pls/itisca/taxastep?king=every&p_action=containing&taxa=mytilus+galloprovinciali s&p_format=&p_ifx=plglt&p_lang= 11

καλούνται προσαγωγοί μύες. Οι θυρίδες του οστράκου προστατεύουν τα μαλακά μέρη του σώματος του οργανισμού. Στην περίπτωση κάποιου κινδύνου, οι προσαγωγοί μύες κλείνουν τις θυρίδες ερμητικά, προστατεύοντας το σώμα του οργανισμού. Το όστρακο ή κέλυφος ή κοχύλι, που καλύπτει το σώμα τους, εκκρίνεται από το μανδύα. Τα κύτταρα της επιφάνειας του μανδύα σχηματίζουν χιτινώδη επιδερμίδα, που μετασχηματίζεται σε όστρακο. Το σώμα τους αποτελείται από το σπλαχνικό σάκο και το πόδι. Δεν έχουν κεφάλι, γι αυτό και λέγονται ακέφαλα. Ο σπλαχνικός σάκος περικλείει τα περισσότερα από τα σπλάχνα, όπως τον πεπτικό σύστημα, καρδιά, συκώτι, νεφρά, γενετικούς αδένες, κ.λ.π.. Ανάμεσα στο μανδύα και στα σπλάχνα υπάρχει η μανδυακή κοιλότητα στη μανδυακή κοιλότητα βρίσκονται οι πόροι των γεννητικών και ουροποιητικών οργάνων καθώς και η έξοδος του πεπτικού συστήμτος. Το αναπνευστικό σύστημα των μυδιών αποτελείται από δύο βράγχια σε σχήμα μισοφέγγαρου, που καλύπτουν τα 3/4 του μήκους του σώματος. Τα βράγχια επικοινωνούν με το εξωτερικό περιβάλλον με έναν σιφώνα που αφήνουν τα χείλη του μανδύα. Το πόδι διαθέτει ισχυρό μυϊκό σύστημα και είναι ευκίνητο όργανο που χρησιμεύει για τη μετακίνηση. Στα μύδια, το πόδι φέρει αδένες που εκκρίνουν τη βύσσο, λεπτά ανθεκτικά νήματα, με τη βοήθεια των οποίων ο οργανισμός προσκολλάται σε διάφορα αντικείμενα. Το νευρικό σύστημα των μυδιών αποτελείται από τρία ζεύγη γαγγλίων, από τα οποία ένα βρίσκεται κοντά στο στόμα, ένα στο πόδι και ένα στα σπλάχνα. Όλα τα γάγγλια ενώνονται μεταξύ τους με νευρικούς συνδέσμους. Το στόμα τους δε διαθέτει όργανα μάσησης. Περιβάλλεται από 4 φυλλοειδείς κεραίες που πάλλονται και διευκολύνουν έτσι την είσοδο του θαλασσινού νερού, που περιέχει την τροφή του. Με το ελαφρύ άνοιγμα των θυρίδων, το νερό περνάει από τα βράγχια, μέσα από τις σχισμές του μανδύα ή από το σίφωνα, πραγματοποιώντας τη διατροφή και την αναπνοή του ζώου. Η αναπνοή γίνεται μέσα στη μανδυακή κοιλότητα, και το απαραίτητο οξυγόνο προέρχεται από το θαλασσινό νερό το οποίο περνά από τα βράγχια, κυκλοφορώντας αδιάκοπα, χάρη στα συνεχή χτυπήματα των μικροσκοπικών βλεφαρίδων και βραγχίων. Η τροφή κατακρατείται από τα βράγχια, που ενεργούν στην περίπτωση αυτή σαν φίλτρο. 1.3.2 Βιολογία - Οικολογία του Μ. galloprovincialis. Το Μ. galloprovincialis είναι διηθηματοφάγος οργανισμός. Για να ικανοποιήσει τις διατροφικές του ανάγκες, προκαλεί την κυκλοφορία σημαντικής ποσότητας νερού μέσα από τα βράγχιά του. Για παράδειγμα σε ένα μύδι ανά μία ώρα, στους 25 ο C, περνούν απ τα βράγχιά του 7 λίτρα νερού. Κατά το πέρασμα αυτό πραγματοποιείται 12

διήθηση του νερού από τα βράγχια. Το μύδι κατακρατεί τα σωματίδια που βρίσκονται σε αιώρηση στο νερό αλλά και διάφορους μικροοργανισμούς. Τα βράγχια, εκτός από τη χρησιμότητά τους σαν όργανο αναπνοής, επενεργούν και σαν σύνθετος μηχανισμός διαλογής, που αποσκοπεί στο να τρέφει τα μύδια με σωματίδια κατάλληλου μεγέθους και σωστής ποιότητας. Τα σωματίδια που αιωρούνται στο νερό, συλλαμβάνονται από τις φυλλοειδείς κεραίες του στόματος και ωθούνται στη μετωπική επιφάνεια των νηματίων των βραγχίων. Εκεί δεσμεύονται από το επιθήλιο των βραγχίων τα κατάλληλα μεγέθους σωματίδια, ωθούμενα στο στόμα και στη συνέχεια στο στομάχι, ενώ τα μεγάλου μεγέθους αποβάλλονται δια μέσου της μανδυακής κοιλότητας. Τα μύδια έχουν την ικανότητα να κρατήσουν κλειστές τις θυρίδες τους για αρκετό χρόνο, περιορίζοντας έτσι στο ελάχιστο τις ανάγκες τους σε οξυγόνο και δημιουργώντας μια «οφειλή οξυγόνου» (oxygen debt) την οποία την αναπληρώνουν όταν αρχίσουν ξανά την κυκλοφορία του νερού με το άνοιγμα των θυρίδων. Κάτω από ευνοϊκές συνθήκες, διατηρούν τις θυρίδες τους ανοιχτές και διηθούν το νερό κατά το μεγαλύτερο διάστημα της μέρας. Ο βασικός ρόλος του ρεύματος του νερού είναι η διατροφή του ζώου, αλλά επίσης απομακρύνει προϊόντα του μεταβολισμού από το πεπτικό σύστημα και τα νεφρά και μεταφέρει την απαιτούμενη ποσότητα οξυγόνου. Τα μύδια αναπαράγονται με αυγά, τα οποία γονιμοποιούνται από το σπέρμα του αρσενικού. Το θηλυκό μύδι είναι πολύ γόνιμο. Γεννά 5 12 εκατ. αυγά το χρόνο. Το πόσες φορές ωοτοκεί μέσα σε μια περίοδο εξαρτάται από την ευρωστία, την θερμοκρασία του νερού και την ποσότητα της τροφής. Κατά τη διάρκεια του χειμώνα οι γονάδες δεν αναπτύσσονται, αλλά παραμένουν σε μια λανθάνουσα κατάσταση, περιμένοντας έως την άνοιξη για να αρχίσουν ξανά να αναπτύσσονται. Η γονιμοποίηση πραγματοποιείται μέσα στη βραγχιακή κοιλότητα του θηλυκού. Η επώαση διαρκεί 4 περίπου ώρες. Οι προνύμφες λίγες μέρες μετά την εκκόλαψή τους με τη βοήθεια των δονητικών βλεφαρίδων κινούνται μέσα στο θαλασσινό νερό και αναζητούν στερεά αντικείμενα για να προσκολληθούν ενώ βυθίζονται προοδευτικά. Ο χρόνος που απαιτείται για να περάσουν τα μύδια το προνυμφικό τους στάδιο, έως ότου προσκολληθούν σταθερά πάνω σε διάφορα αντικείμενα, ποικίλλει ανάλογα με τη θερμοκρασία, την αλατότητα, το ph, το φωτισμό και τους άλλους οικολογικούς παράγοντες. Συνήθως απαιτούνται 15 έως 25 μέρες 11. Αμέσως μετά την προσκόλλησή τους αρχίζουν και σχηματίζουν το όστρακό τους και αναπτύσσονται κανονικά ενώ εμφανίζεται η βύσσος, που εξασφαλίζει τη 11 Castro P. 1999. Θαλάσσια Βιολογία 13

στερέωσή τους πάνω στο αντικείμενο όπου και θα περάσουν τη ζωή τους. Τα βράγχια εμφανίζονται αρχικά σαν ξεχωριστά νημάτια, που γρήγορα αποκτούν συνδέσεις μεταξύ τους, παίρνοντας την τελική μορφή των ανεπτυγμένων βραγχίων. Ο μανδύας αρχίζει ν αναπτύσσεται και οι δυο θυρίδες αυξάνουν παράλληλα προς την επιφάνεια προσκόλλησης. Μέσα σε διάστημα 3 4 ημερών το σώμα του έχει πάρει την πλήρη κατασκευή του ενήλικου μυδιού. Στη φυσική τους κατάσταση τα μύδια απαιτούν 3 περίπου χρόνια για ν αποκτήσουν το εμπορικό τους μέγεθος. Σε τεχνητή καλλιέργεια, ο χρόνος αυτός περιορίζεται σε 15 18 μήνες. Το όστρακο των οργανισμών της διαπαλιρροιακής ζώνης παραμένει μικρό και σπάνια ξεπερνάει τα 6cm, ενώ σε βαθιά νερά το όστρακο συνήθως αποκτά μήκος 9cm, το οποίο μπορεί να φτάσει ακόμα και τα 15cm. Το Mytilus galloprovincialis μπορεί να εντοπιστεί από Μαύρη θάλασσα και τη Μεσόγειο έως και τις ακτές του Ανατολικού Ατλαντικού, στα σκληρά υποστρώματα της μεσοπαραλιακής και υποπαραλιακής ζώνης. Προσκολλάται επάνω σε βράχους, σε προβλήτες και σκοινιά με τις ίνες της βύσσου,. Αν και θεωρείται προσκολλημένος οργανισμός, στην πραγματικότητα μπορεί να μετακινηθεί, εκτείνοντας νέες κλωστές και ξεκολλώντας τις παλιές. Ζει σε προστατευμένα περιβάλλοντα, σε λιμάνια, σε παράκτια μεταβατικά οικοσυστήματα ή και ανοικτές βραχώδεις ακτές, ενώ κάτω από τις κατάλληλες συνθήκες μπορεί να σχηματίσει πολύ μεγάλους πληθυσμούς (κοινότητες), οι οποίοι καλύπτουν το υπόστρωμα και ονομάζονται «μυδώνες» Εικόνα 1.2: Τμήμα ενός «μυδώνα» του Mytilus galloprovincialis (Εικόνα 1.2). Η μέση πυκνότητα Φωτογραφία-Δ. Κουτσούμπας των πιο συνωστισμένων μυδώνων μπορεί να φτάσει τα 24000 μύδια/m² 12. Τα μύδια συναντώνται σε περιοχές μη επιβαρυμένες με ρύπανση, οι οποίες είναι εκτεθειμένες στην κυματική δράση (έντονος υδροδυναμισμός) και σε επιβαρυμένες με ρύπανση περιοχές, προφυλαγμένες από τον κυματισμό. Η διανομή των πληθυσμών του είδους Mytilus galloprovincialis σε περιοχές μη επιβαρυμένες με ρύπανση, καθορίζεται τόσο από φυσικούς όσο και από βιολογικούς παράγοντες. 12 www.fao.org/fi/website/firetrieveaction.do?dom=culturespecies&xml=mytilus_galloprovincialis.x ml 14

Όσον αφορά τους φυσικούς παράγοντες, μεγάλη ένταση υδροδυναμισμού συνεπάγεται πληθυσμούς μυδιών με μεγάλη έκταση, κυρίως στον υποπαραλιακό βράχο, όπου το ανώτερο και το κατώτερο τμήμα της ζώνης καταλαμβάνουν ενήλικα άτομα του είδους ενώ το μεσαίο νεαρά άτομα. Όταν η ένταση του υδροδυναμισμού είναι μικρή, τότε οι πληθυσμοί των μυδιών εμφανίζονται κυρίως στο μεσοπαραλιακό βράχο όπου σημαντικό ρόλο διαδραματίζει το μικρό ή το μεγάλο ύψος της παλίρροιας, οπότε και παρουσιάζεται εποχική διακύμανση στην εμφάνισή τους 13. 1.3.3 Χρήση του είδους Mytilus galloprovincialis σε προγράμματα βιοπαρακολούθησης. Η χρήση μυδιών, κυρίως του γένους Mytilus για την έρευνα και παρακολούθηση των τάσεων της χημικής ρύπανσης στο παράκτιο περιβάλλον προτάθηκε αρχικά στα μέσα της δεκαετίας του 70. Η βιοπαρακολούθηση της ρύπανσης με χρήση μυδιών βασίζεται στην ικανότητα τους να συσσωρεύουν χημικούς ρύπους στους ιστούς τους σε βαθμό ανάλογο με την βιοδιαθεσιμότητά τους. Βιοσυσσώρευση παρατηρείται στους θαλάσσιους οργανισμούς για την πλειοψηφία των δισθενών μετάλλων και οργανικών λιπόφιλων ενώσεων. Κατά τη βιοπαρακολούθηση της ρύπανσης μέσω βιοσυσσώρευσης το πρόβλημα της ημερησίας διακύμανσης (των συγκεντρώσεων των ρύπων στο νερό) εξαλείφεται και τα υψηλότερα επίπεδα των ρύπων που συσσωρεύονται από τους οργανισμούς σε σχέση με τα επίπεδα τους στο περιβάλλον μπορούν να μετρηθούν ευκολότερα. Επίσης, από οικολογικής άποψης, η βιοπαρακολούθηση οδηγεί σε πραγματική εκτίμηση της χρόνιας ρύπανσης σε περιοχές χαρακτηρισμένες σαν μετρίως επιβαρυμένες 14. Αρχικά εφαρμόστηκε η βιοπαρακολούθηση της ρύπανσης μέσω βιοσυσσώρευσης χημικών ρύπων ενώ στη συνέχεια προγράμματα παρακολούθησης της ρύπανσης περιέλαβαν και μετρήσεις βιοδεικτών στους οργανισμούς δείκτες. Το Mytilus galloprovincialis εμφανίζει ορισμένα σημαντικά χαρακτηριστικά που το καθιστούν ιδανικό οργανισμό-δείκτη σε προγράμματα βιοπαρακολούθησης της ρύπανσης στην Μεσόγειο. Σαν διηθηματοφάγος οργανισμός, βιοσυσσωρεύει τους περισσότερους περιβαλλοντικούς ρύπους, συμπεριλαμβανομένων των βαρέων μετάλλων, των οργανικών ενώσεων και των τοξινών που παράγονται από διάτομα, δινομαστιγωτά και κυανοβακτήρια, ακόμη και αν οι συγκεντρώσεις τους στο περιβάλλον είναι πολύ χαμηλές. Τα μύδια είναι ικανά να βιοσυσσωρεύουν ρύπους στο σώμα τους σε πολύ μεγαλύτερες συγκεντρώσεις από εκείνες του περιβάλλοντός 13 Γεροβασιλείου Β., Δημούδη Α. 2004 14 Auffret et al, 2006 15

τους. Είναι σχετικά ανθεκτικά σε έκθεση σε ρύπους ενώ διαθέτουν την ικανότητα να αντιδρούν στα αυξημένα επίπεδα περιβαλλοντικής ρύπανσης μεταβάλλοντας τις φυσιολογικές τους λειτουργίες. Άλλο ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό είναι ότι ο συγκεκριμένος οργανισμός έχει ευρεία γεωγραφική εξάπλωση, και είναι πολυπληθής σε παράκτια αλλά και σε μεταβατικά οικοσυστήματα, τα οποία υπόκεινται σε υψηλά επίπεδα ρύπανσης. Είναι εδραίο είδος, μια ιδιότητα ιδιαίτερα επιθυμητή για οργανισμούς-δείκτες καθώς αντικατοπτρίζουν τις αλλαγές στην κατάσταση ρύπανσης της περιοχής από την οποία συλλέχθηκαν 15. Επίσης είναι κοινός οργανισμός, ορατός και εύκολος στην συλλογή και μεταφορά, ευρύαλος και συνήθως το κυρίαρχο είδος στα ενδιαιτήματα που εντοπίζεται. Είναι οικολογικά και εμπορικά σημαντικός σε παγκόσμιο επίπεδο και έχει μελετηθεί εκτενώς. Όλοι αυτοί οι λόγοι συμβάλλουν στην ευρεία χρήση του M. galloprovincialis σε προγράμματα βιοπαρακολούθησης, όπου οι χημικές αναλύσεις συσχετίζονται με την χρήση βιοδεικτών για την ολοκληρωμένη προσέγγιση των επιπτώσεων της χημικής ρύπανσης 16,17. Οι μελέτες βιοπαρακολούθησης της ρύπανσης με χρήση μυδιών έχουν υιοθετήσει δύο διαφορετικές στρατηγικές. Κάποιοι μελετητές χρησιμοποιούν αυτόχθονους πληθυσμούς φυσικών πληθυσμών ή καλλιεργημένων μυδιών (παθητική βιοπαρακολούθηση), ενώ άλλοι βασίζονται στην μεταφορά ατόμων από μια περιοχή αναφοράς (ενεργή βιοπαρακολούθηση) στις περιοχές μελέτης. Οι τεχνικές εγκλεισμού σε κλωβούς και μεταφοράς έχουν αναπτυχθεί αρκετά τα τελευταία χρόνια. Οι τεχνικές αυτές έχουν ποικίλα πλεονεκτήματα, όπως την γενετική ομοιογένεια των ατόμων την ίδιας ομάδας πληθυσμού, μειώνοντας με τον τρόπο αυτό τη φυσική μεταβλητότητα και την ικανότητα να τοποθετούνται οι κλωβοί με τα μύδια σε περιοχές που δεν υπάρχουν φυσικοί πληθυσμοί 18. Η βιοπαρακολούθηση είναι αποτέλεσμα ενός ισοζυγίου μεταξύ της συγκέντρωσης των ρύπων στον οργανισμό και του επιπέδου τους στο περιβάλλον. Βασίζεται στις διαδικασίες απορρόφησης, απέκκρισης και συσσώρευσης. Τα επίπεδα των βιοσυσσωρευμένων ρύπων συνδέονται στενά με τον κύκλο ζωής του μυδιού και ιδιαίτερα με την ηλικία και την σεξουαλική ωριμότητα του ατόμου. Τα χαρακτηριστικά της περιοχής πόντισης, όπως η αλατότητα και η διαθεσιμότητα τροφής επηρεάζουν την βιοδιαθεσιμότητα του ρύπου, όπως επίσης και τον μεταβολισμό και την ανάπτυξη του μυδιού. Η μέθοδος της ενεργής βιοπαρακολούθησης καθιστά ικανό τον έλεγχο της πηγής, της ηλικίας και του επιπέδου σεξουαλικής ωριμότητας των δειγμάτων. 15 Manduzio et al, 2004 16 Rittschof et al, 2005 17 Bocchetti et al, 2006 18 Bodin et al, 2004 16

Παρόλα αυτά η εφαρμογή της σε μεγάλο γεωγραφικό εύρος εισάγει παράγοντες όπως οι διακυμάνσεις σε φυσικοχημικά χαρακτηριστικά και η διαθεσιμότητα τροφής στις ζώνες πόντισης 19. 1.4 ΠΑΡΟΥΣΑ ΜΕΛΕΤΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ MYTIMED Η παρούσα μελέτη είναι τμήμα του Ευρωπαϊκού προγράμματος βιοπαρακολούθησης MYTIMED - Programme Interreg III B MEDOCC - Priority 4, Measure 4.3. Ο σκοπός του προγράμματος είναι η ανάπτυξη διαπεριφερειακού δικτύου παρακολούθησης της ποιότητας του παράκτιου περιβάλλοντος μέσω βιολογικών δεικτών (οικογένεια μυδιών Mytilus galloprovincialis), για την αειφόρο προστασία της Ανατολικής Μεσογείου. Στα πλαίσια του προγράμματος εφαρμόζεται η μέθοδος της ενεργής βιοπαρακολούθησης με την χρήση μυδιών εγκλεισμένων σε κλωβούς που τοποθετούνται σε επιλεγμένες περιοχές στην Ανατολική Μεσόγειο για ένα επιθυμητό χρονικό διάστημα (περίπου 3 μηνών) κατά το οποίο τα μύδια συσσωρεύουν ρύπους. Μετά την ανάκτηση, μετρούνται τα επίπεδα των ρύπων στην σάρκα των οργανισμών. Οι μετρήσεις περιλαμβάνουν: Βαρέα μέταλλα Οργανοχλωριωμένα παρασιτοκτόνα Πολυχλωριωμένα διφαινίλια Πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες Διοξίνες και φουράνια Πολυβρωμιωμένους διφαινυλαιθέρες, οκτυλ- και εννεϋλοφαινόλες Παράλληλα με τη βιοσυσσώρευση ρύπων προσδιορίζονται βιοδείκτες σε μύδια από επιλεγμένους σταθμούς. Στόχος του προγράμματος είναι: Η εγκαθίδρυση ενός δικτύου συνεργατών με χρήση της ίδια μεθοδολογίας, με σκοπό την μείωση της ποικιλότητας των αποτελεσμάτων λόγω διαφορετικών τροφικών συνθηκών, περιλαμβάνοντας και την διάδοση ανάμεσα στους συνεργάτες στο νότιο τμήμα της Μεσογείου, και εκτιμώντας την χημική ποιότητα της Μεσογείου, όπως αυτή αναγνωρίζεται στην Ντιρεκτίβα Δικτύου στον τομέα της πολιτικής για το νερό (directive 2000/60/CE). Τα αναμενόμενα αποτελέσματα περιλαμβάνουν: 19 Andral et al, 2004 17

Την συγκριτική αξιολόγηση της χημικής ρύπανσης της Μεσογείου. Την βαθμονόμηση των πρωτόκολλων των αναλύσεων. Ένα δίκτυο μόνιμης επαγρύπνησης Την πληροφόρηση και δημοσίευση των δεδομένων. Με τον τρόπο αυτό και χάρη στις πληροφορίες που παρέχονται από το δίκτυο βιολογικής καταγραφής, οι τοπικές και εθνικές αρχές θα είναι σε θέση να λαμβάνουν προληπτικές αποφάσεις ή να δρουν άμεσα σε περιβαλλοντικές καταστροφές. Η προστιθέμενη αξία του προγράμματος συνοψίζεται στα παρακάτω: Η προστασία της ακτογραμμής και του παράκτιου περιβάλλοντος. Η προστασία των φυσικών ιχθυοκαλλιεργειών, των ιχθυοαποθεμάτων και των πόρων της υδατοκαλιέργειας. Η ανάπτυξη και βελτίωση της ασφάλειας των τροφίμων και της τουριστικής προώθησης που ήδη προσελκύεται από την ποιότητα ζωής στις παράκτιες περιοχές της Μεσογείου. Η προστιθέμενη αξία των πλεονεκτημάτων στην μεθοδολογία της ενεργούς βιοπαρακολούθησης συμπεριλαμβάνει: Ελαφρές υποδομές με χαμηλό κόστος εφαρμογής. Γνωστό χρονοδιάγραμμα έκθεσης. Τεχνητούς σταθμούς βιοπαρακολούθησης με δυνατότητα επιλογής ανεξάρτητα από τους φυσικούς πληθυσμούς και την ενόχλησή τους από την ακτή. Βελτιστοποιημένα αποτελέσματα χάρη στην χρήση ομογενών δειγμάτων σε σύγκριση με τον αρχικό πληθυσμό, την ηλικία, το μέγεθος, το περιβάλλον κτλ. Οι αναλύσεις περιλαμβάνουν μόνο ένα είδος. Συγκρίσιμα αποτελέσματα ανάμεσα στους σταθμούς, ανεξάρτητα από την γεωγραφική τους τοποθεσία. Επιπρόσθετα, η τεχνική βιοπαρακολούθησης μεταφέρεται στους συνεργάτες του προγράμματος. Το πρόγραμμα θα συγκεντρώσει για πρώτη φορά στην περιοχή εκτενή δεδομένα για την θαλάσσια ρύπανση. Η διάρκεια του προγράμματος MYTMED είναι 2,5 χρόνια (από την 01/01/2006 έως και τις 30/06/2008) και ένα μέρος του χρηματοδοτείται από το Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης 20. 20 Brochure MYTMED 18

Στην παρούσα μελέτη οι βιοδείκτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η δραστικότητα της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) και η δραστικότητα ενζύμων του οξειδωτικού στρες στο Mytilus galloprovincialis. Στην επόμενη ενότητα αναλύεται ο τρόπος με τον οποίο λειτουργούν οι συγκεκριμένοι βιοδείκτες στον οργανισμό του μυδιού. 1.5 ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΗ 1.5.1 Μοριακή φυσιολογία του ενζύμου Η ακετυλοχολινεστεράση (ACHE) είναι ένα ένζυμο (υδρολάση σερίνης) που συναντάται στην σηματοδοτική οδό μεταξύ των νευρικών κυττάρων. Για την καλύτερη κατανόηση της δράσης της θα γίνει μια σύντομη παρουσίαση του τρόπου με τον οποίο επιτυγχάνεται η μεταφορά σήματος στα κύτταρα του νευρικού συστήματος. Το ουσιαστικό έργο ενός νευρικού κυττάρου ή νευρώνα είναι να δέχεται, να καθοδηγεί και να μεταβιβάζει σήματα. Ανεξάρτητα από το νόημα του σήματος που μεταφέρει ο νευρώνας, η μορφή του είναι πάντα η ίδια: αποτελείται από αλλαγές του ηλεκτρικού δυναμικού διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης, το οποίο ονομάζεται δυναμικό ενέργειας και διαδίδεται σαν κύμα κατά μήκος του νευράξονα. Όταν το δυναμικό ενέργειας Εικόνα 1.3: Σχηματική παράσταση μια φτάσει στα άκρα του άξονα, στις νευρικές χολινεργικής σύναψης. απολήξεις, πρέπει να μεταδοθεί στα Πηγή: Stryer L., Βιοχημεία, 1997 κύτταρα-στόχους. Το σήμα μεταδίδεται σε συγκεκριμένες θέσεις επαφής που ονομάζονται συνάψεις (εικόνα 1.3). Στις περισσότερες συνάψεις, οι κυτταρικές μεμβράνες του μεταφέροντος κυττάρου και του αποδέκτη, προσυναπτικό και μετασυναπτικό κύτταρο αντίστοιχα, χωρίζονται μεταξύ τους από μια συναπτική σχισμή (500Å) την οποία δεν μπορεί να διαπεράσει ηλεκτρικό ρεύμα. Για να μεταφερθεί ένα μήνυμα από έναν νευρώνα σε άλλο, το 19

ηλεκτρικό σήμα μετατρέπεται σε χημικό με την μορφή ενός μικρού διαχυτού μορίου σηματοδότησης που ονομάζεται νευροδιαβιβαστής 21. Η ακετυλοχολίνη είναι ένας νευροδιαβιβαστής που εντοπίζεται σε συνάψεις νευρικών κυττάρων με άλλα νευρικά κύτταρα αλλά και σε νευρομυϊκές συνδέσεις, δηλαδή σε συνδέσεις μεταξύ νεύρου και γραμμωτού μυός. Τα εξωκυτταρικά σήματα όπως οι ορμόνες, οι νευροδιαβιβαστές και οι αυξητικοί παράγοντες ελέγχουν την φυσιολογική τους δράση με την πρόσδεση σε συγκεκριμένους υποδοχείς και την επακόλουθη ενεργοποίηση ενός καταρράκτη σηματοδότησης μέσα στο κύτταρο 22. Η απόληξη του προσυναπτικού κυττάρου περιέχει πλήθος συναπτικών κυστιδίων που Σχήμα 1.1 : Η αντίδραση της ακετυλοχολινεστεράσης: O O II ACHE II H 3 C C O CH 2 N (CH 3 ) 3 + H 2 O H 3 C C O - + HO CH 2 CH 2 N ( CH 3 ) 3 + H + Ακετυλοχολίνη Οξικό Χολίνη περιέχουν ακετυλοχολίνη. Η άφιξη ενός νευρικού σήματος έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση ακετυλοχολίνης στην σχισμή. Τα μόρια της ακετυλοχολίνης διαχέονται στην μετασυναπτική μεμβράνη και δεσμεύονται από τους υποδοχείς της ακετυλοχολίνης. Αυτό οδηγεί στην εκπόλωση της μετασυναπτικής μεμβράνης η οποία μεταδίδεται σαν σήμα κατά μήκος της ηλεκτρικά διεγέρσιμης μεμβράνης του δεύτερου νευρικού κυττάρου. Η ακετυλοχολίνη υδρολύεται σε οξικό και χολίνη από την ακετυλοχολινεστεράση (σύμφωνα με το σχήμα 1.1) και αποκαθίσταται η πόλωση της μετασυναπτικής μεμβράνης. Η ακετυλοχολινεστεράση έχει μέγεθος 260 kd και δομή α 2 β 2. Χαρακτηριστικό της είναι ο μεγάλος Εικόνα 1. 4: Η καταλυτική δράση της ακετυλοχολινεστεράσης. αριθμός μετατροπής που ανέρχεται σε Πηγή: Stryer L., Βιοχημεία, 1997 25.000 μόρια/sec, δηλαδή διασπά το μόριο της ακετυλοχολίνης μέσα σε 40 μsec. Ο υψηλός αυτός αριθμός μετατροπής 21 Alberts et al., Βασικές αρχές κυτταρικής βιολογίας, 2000, σελ. 463-472 22 Dailianis et al, 2003 20

είναι απαραίτητος για την ταχεία επαναφορά της πολωμένης κατάστασης της μετασυναπτικής μεμβράνης. Κατά τον μηχανισμό κατάλυσης της ακετυλοχολινεστεράσης, η ακετυλοχολίνη αντιδρά με ένα ειδικό κατάλοιπο σερίνης στο ενεργό κέντρο του ενζύμου και σχηματίζει ένα ομοιοπολικό ενδιάμεσο ακετυλοενζύμου. Η χολίνη απελευθερώνεται και το ακετυλιωμένο ενζυμικό ενδιάμεσο αντιδρά με νερό προς σχηματισμό οξικού και την αναγέννηση του ενζύμου 23 (Εικόνα 1.4). Οι χολινεστεράσες είναι υδρολάσες σερίνης ευρέως διαδεδομένες σε σπονδυλωτά και στα ασπόνδυλα. Εντοπίζονται στο πλάσμα ή στην λέμφο, στα ερυθρά αιμοσφαίρια των θηλαστικών και σε άλλα όργανα, παρόλο που η φυσιολογική λειτουργία της ακετυλοχολινεστεράσης σε ιστούς διαφορετικούς από τα νεύρα δεν είναι γνωστή. Στα σπονδυλωτά εντοπίζονται δύο μορφές, η ακετυλοχολινεστεράση της οποίας η λειτουργία προαναφέρθηκε και η βουτυρυλχολινεστεράση (BChE), που κωδικοποιούνται από δύο διαφορετικά γονίδια. Η BChE δρα κατά προτίμηση στην βουτυρυλχολίνη και έχει προταθεί ότι δρα σαν ένζυμο απομάκρυνσης στην αποτοξίνωση από φυσικές ενώσεις. Οι ChEs είναι ένζυμα που εμφανίζουν συχνά υψηλό πολυμορφισμό. Συγκεκριμένα, οι ασύμμετρες μορφές (Α) είναι ολιγομερή που περιλαμβάνουν ένα (Α4), δύο (Α8) ή τρία (Α12) προσδεμένα καταλυτικά τετραμερή μέσω μια επιμήκους ουράς κολλαγόνου στην βασική μεμβράνη. Οι σφαιρικές μορφές, μονομερείς (G1), διμερείς (G2) ή τετραμερείς (G4), μπορεί να είναι υδρόφιλες ή αμφίφιλες. Οι ακετυλοχολινεστεράσες στα σπονδυλωτά εμφανίζουν δύο κύριους τύπους καταλυτικής υπομονάδας που κωδικοποιούνται από διαφορετικά mrnas. Όσον αφορά τα ασπόνδυλα, έχουν εντοπιστεί ασύμμετρες μορφές AChE σε Κεφαλοχορδωτά, ενώ εντοπίζονται μόνο σφαιρικές μορφές σε όλα τα άλλα φύλα. Συγκεκριμένα έχει βρεθεί κυρίως μια διμερής AChE που βρίσκεται «αγκυροβολημένη» στην κυτταρική μεμβράνη μέσω φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης στα περισσότερα είδη που έχουν μέχρι τώρα μελετηθεί. Η κωδικοποίηση των υπομονάδων της AChE στα ασπόνδυλα μπορεί να γίνει από ένα ή πολλά γονίδια (τέσσερα στον Caenorhabditis), δίνοντας στο ένζυμο περίπλοκο πολυμορφισμό. Στα μαλάκια έχουν παρουσιαστεί δύο διακριτές ChEs στο Crassostrea gigas, και πολυμορφισμοί ChE στην Sepia officinalis και στο Mytilus galloprovincialis 24,25. Όσον αφορά το Mytilus galloprovincialis, υπάρχουν ιστοειδικές διαφορές στις χολινεστεράσες, καθώς η AChE είναι τυπικά πιο άφθονη στα βράγχια ενώ η ΒChE εντοπίζεται κυρίως στον πεπτικό αδένα. 23 Stryer L., Βιοχημεία 2 ος Τόμος, 1997, σελ. 1120-1127 24 Valbonesi et al, 2003 25 Talesa et al, 2001 21

1.5.2 Χρήση της καταστολής της ακετυλοχολινεστεράσης ως βιοδείκτη. Οι καταστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης αποτελούν ένα μεγάλο μέρος των σύγχρονων συνθετικών φυτοφαρμάκων, στα οποία συμπεριλαμβάνονται μέλη των οργανοφωσφορικών και καρβαμιδικών ενώσεων. Οι ενώσεις αυτές προσδένονται στην καταλυτική θέση της AChE, παρεμποδίζοντας την φυσιολογική απενεργοποίηση της ακετυλοχολίνης. Σαν αποτέλεσμα παρατηρείται μια μη φυσιολογική παρατεταμένη νευρική σηματοδότηση. Η ακετυλοχολίνη συσσωρεύεται, η μετασυναπτική μεμβράνη παραμένει υπερπολωμένη και η νευρική μεταφορά διακόπτεται. Με τον τρόπο αυτό οι νευροτοξικές ενώσεις μπορεί να προκαλέσουν σοβαρές δυσλειτουργίες, από αλλαγές στην συμπεριφορά και τέτανο σε παράλυση και θάνατο 26. Η χρήση των παρασιτοκτόνων αυτών έχει αυξηθεί παγκοσμίως αντικαθιστώντας τις πιο έμμονες οργανοχλωριωμένες ενώσεις στις γεωργικές δραστηριότητες. Αν και λιγότερο έμμονες από τις προκατόχους τους, είναι γενικά πιο τοξικές και έχουν αναφερθεί ως υπεύθυνες για θανάτους ψαριών στο παρελθόν 27. Παράλληλα, η καταπολέμηση εκτοπαρασιτικών μολύνσεων στις υδατοκαλλιέργειες συνεπάγεται την απόρριψη μεγάλων ποσοτήτων οργανοφωσφορικών ή άλλων χημικών ενώσεων στις θαλάσσιες ιχθυοκαλλιέργειες, γεγονός που μπορεί να προκαλέσει άμεσες περιβαλλοντικές επιπτώσεις 28. Από την στιγμή που οι οργανοφωσφορικές και καρβαμιδικές ενώσεις έχουν σχετικά μικρό χρόνο ημιζωής και είναι υδατοδιαλυτές, ο προσδιορισμός της καταστολής της ακετυλοχολινεστεράσης φαίνεται να είναι χρήσιμο εργαλείο για τον προσδιορισμό των περιβαλλοντικών επιπτώσεων σε υδρόβιους οργανισμούς, ακόμη κι όταν οι ενώσεις δεν είναι πια ανιχνεύσιμες σε διαλυτή μορφή 29. Πλέον έχει διαπιστωθεί η αντίδραση και καταστολή της AChE και από άλλες χημικές ομάδες, όπως είναι οι υδρογονάνθρακες, τα απορρυπαντικά, οι τοξίνες αλγών 30 αλλά και τα βαρέα μέταλλα (υδράργυρος) 31. Η καταστολή της δραστικότητας της ακετυλοχολινεστεράσης από παρασιτοκτόνα χρησιμοποιείται ευρέως σαν ειδικός βιοδείκτης έκθεσης των υδρόβιων οργανισμών στις ενώσεις αυτές, αν και η χρήση εδραίων μαλακίων συνίσταται στο πλαίσιο 26 Pfeifer et al, 2005 27 Lionetto et al, 2003 28 Pena-Llopis et al, 2002 29 Sturm et al, 1999 30 Rank et al, 2007 31 Cajaraville et al, 2000 22

προγραμμάτων βιοπαρακολούθησης στην Μεσόγειο (UNEP, 1999). 32,33,34. Η φυσική διακύμανση στην δραστικότητα της ακετυλοχολινεστεράσης δεν σχετίζεται άμεσα με την ηλικία, το φύλο ή την αναπαραγωγική περίοδο του οργανισμού, ενώ φαίνεται η θερμοκρασία να παίζει τον βασικό ρυθμιστικό ρόλο. Στα δίθυρα μαλάκια έχει εντοπιστεί εποχιακή διακύμανση στην δραστικότητα της AChE στα είδη R. decussates, M. galloprovincialis και Anodonta cygnea 35. 1.6 ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ ΕΝΖΥΜΑ 1.6.1 Παραγωγή Ενεργών Μορφών Οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) Στα κύτταρα των αερόβιων οργανισμών το μοριακό οξυγόνο μπορεί να αναχθεί μέσω ενός σχήματος τεσσάρων ηλεκτρονίων για την παραγωγή μορίων νερού, όπως συμβαίνει στο τελικό στάδιο της αλυσίδας μεταφοράς στην αντίδραση που καταλύεται από την κυτοχρωμική οξειδάση. Αυτή η μέθοδος είναι κοινή για τους περισσότερους οργανισμούς και χρησιμοποιεί πάνω από το 90% του οξυγόνου που καταναλώνεται από το κύτταρο 36. Όλοι οι οργανισμοί κατά την διαδικασία του μεταβολισμού τους παράγουν συνεχώς σαν παραπροϊόντα και Ενεργές Μορφές Οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS). Οι σημαντικές θέσεις της παραγωγής ROS είναι τα μιτοχόνδρια, τα μικροσωμάτια, τα υπεροξυσωμάτια και το κυτταρόπλασμα. Οι ROS προκαλούν αρκετές κυτταρικές αλλοιώσεις, όπως ο αποπολυμερισμός των πολυσακχαριτών και των νουκλεϊνικών οξέων, η οξείδωση των πρωτεϊνικών Εικόνα 1.5: Παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου. Πηγή: Stryer L., Βιοχημεία, 1997 σουλφυδριλικών ομάδων, η υπεροξείδωση των λιπαρών οξέων, ακόμη και ο κυτταρικός θάνατος 37. Αυτές οι ενώσεις προέρχονται από την μερική αναγωγή του 32 Magni et al, 2006 33 Dellali et al, 2001 34 Damiens et al, 2007 35 Leiniö et al, 2005 36 Lushchak 2006 37 Borković et al, 2005 23

μοριακού οξυγόνου (Εικόνα 1.5) και αποτελούνται από δραστικά και μη-δραστικά είδη, όπως το ανιόν του υπεροξειδίου ( Ο 2 ), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), η ρίζα του υδροξυλίου ( ΟΗ) 38 και η ρίζα του υπεροξυλίου ( RΟ 2 ). Η αντιδραστικότητα και οι ιδιότητές τους ποικίλουν σημαντικά. Τα Ο 2 και Η 2 Ο 2 δεν θεωρούνται ιδιαίτερα δραστικά σε υδατικά διαλύματα, αλλά πιθανόν να εμπλακούν σε αντιδράσεις τύπου Haber-Weiss και Fenton παράγοντας ΟΗ. Αυτή η ρίζα αντιδρά άμεσα με όλα τα οργανικά μόρια και θεωρείται το πιο δραστικό και καταστροφικό είδος 39. Μια διαταραχή στην ισορροπία μεταξύ της παραγωγής ROS και του αντιοξειδωτικού συστήματος άμυνας του οργανισμού σε κύτταρα ή ιστούς υπέρ του πρώτου μπορεί να οδηγήσει σε οξειδωτικό στρες. Η ισορροπία μεταξύ προ-οξειδωτικής ισχύος και αντιοξειδωτικής άμυνας είναι σημαντική για την αποφυγή κυτταρικής τοξικότητας από ρίζες, διότι όταν η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα υπερβαίνεται από την παραγωγή ROS, προκαλείται οξειδωτική βλάβη 40. 1.6.2 Ενίσχυση της παραγωγής ROS μέσω ρύπων -αντιοξειδωτική άμυνα. Έχει αποδειχθεί ότι αρκετές κατηγορίες ρύπων είναι δυνατόν να ενισχύσουν τον σχηματισμό ROS και με τον τρόπο αυτό να προκαλέσουν οξειδωτικό στρες. Πολλοί από αυτούς τους ρύπους περιλαμβάνουν πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες (PAHs), πολυχλωριωμένα διφαινίλια (PCBs), φαινόλες, τοξίνες κυανοβακτηρίων, οργανοχλωρικές ενώσεις 41 και βαρέα μέταλλα. Τα κύτταρα έχουν αναπτύξει ένα σύστημα αντιοξειδωτικής άμυνας, που αποτελείται από προστατευτικές πρωτεΐνες που απομακρύνουν τα ROS, αντιοξειδωτικά ένζυμα, μόρια που δεσμεύουν τα μεταλλικά ιόντα και ένζυμα που επιδιορθώνουν τα κατεστραμμένα κυτταρικά στοιχεία 42. Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα περιλαμβάνουν την υπεροξειδική δισμουτάση, την καταλάση, την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, την γλουταθειόνη ρεδουκτάση και την γλουταθειόνη-s-τρανσφεράση. Σε γενικές γραμμές, τα ανιόντα του υπεροξειδίου μετατρέπονται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) από την υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), το οποίο απομακρύνεται από την καταλάση (CAT) που βρίσκεται στα υπεροξυσωμάτια, ή από την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX-ΡΧ) στα μιτοχόνδρια και το κυτταρόπλασμα) 43,44. H γλουταθειόνη ρεδουκτάση αναγεννά την οξειδωμένη από την GPX-ΡΧ γλουταθειόνη 38 Stryer L., Βιοχημεία 1 ος Τόμος, 1997, σελ. 444 39 Santovito et al, 2005 40 Camus et al, 2004 41 Damiens et al, 2007 42 Niki, 2000 43 Cavaletto et al, 2002 44 Vlahogianni et al, 2007 24

(GSH) και παράλληλα, η ενζυμική δραστικότητα των γλουταθειόνη-s-τρανσφερασών (GST), μια οικογένειας πολυλειτουργικών ενζύμων που εμπλέκονται στην Φάση ΙΙ της βιομετατροπής, σχετίζεται με την κυτταρική αντιοξειδωτική άμυνα λόγω της σύζευξης ηλεκτρονιόφιλων ξενοβιοτικών και οξειδωμένων ενώσεων με την GSH 45. Τα αντιοξειδωτικά συστήματα περιλαμβάνουν επίσης μικρού μοριακού βάρους ενώσεις που παγιδεύουν οξυ-ρίζες όπως η γλουταθειόνη, οι βιταμίνες C και Ε, τα καροτενοειδή και η ουβικινόνη Οι αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί έχουν ερευνηθεί εκτενώς. Οι αντιδράσεις των μηχαμισμών αυτών ποικίλουν όσον αφορά την τάξη των χημικών, το είδος της έκθεσης, την φάση του βιολογικού κύκλου κλπ. Τα επίπεδα των αντιοξειδωτικών ενζύμων σχετίζονται επίσης με την εποχιακή διακύμανση στην μεταβολική κατάσταση των οργανισμών, δείχνοντας να ακολουθούν τις αλλαγές στην θερμοκρασία, την διαθεσιμότητα τροφής και την αναπαραγωγική κατάταση. Παρόλα αυτά, μελέτες πεδίου και εργαστηρίου σε αρκετούς υδρόβιους οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων και των μυδιών της Μεσογείου, δείχνουν ότι οι μεταβολές στα επίπεδα δραστικότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν βιοδείκτες, δυσμενών επιδράσεων της ρύπανσης 46,47. Τα ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν σαν βιοδείκτες στην παρούσα μελέτη είναι η καταλάση (CAT) και η γλουταθειόνη-s-τρανσφεράση (GST). Ακολουθεί η περιγραφή της φυσιολογίας των ενζύμων αυτών. 1.6.3 Καταλάση (CAT). Η καταλάση (συστηματική ονομασία: Οξειδωαναγωγάση του υπεροξειδίου:υπεροξειδίου του υδρογόνου, EC 1.11.1.6 ) ανήκει στην ενζυμική ομάδα των υπεροξειδασών. Οι υπεροξειδάσες είναι αιμοπρωτεΐνες που χρησιμοποιούν το Η 2 Ο 2 σαν αποδέκτη υδρογόνων με αποτέλεσμα την οξείδωση μεγάλου αριθμού υποστρωμάτων (από λιπαρά οξέα έως ανόργανα ιόντα). Οι καταλάσες είναι μια ειδική περίπτωση υπεροξειδασών που χρησιμοποιούν Η 2 Ο 2 σαν δότη και σαν αποδέκτη ηλεκτρονίων 48. Η καταλάση εντοπίζεται συνήθως αλλά όχι πάντα στα υπεροξυσωμάτια, όπου βρίσκονται αρκετά ένζυμα που παράγουν Η 2 Ο 2. Έτσι η CAT μπορεί να δρα στο παραγόμενο Η 2 Ο 2 άμεσα, πριν αυτό διασκορπιστεί σε άλλα τμήματα του κυττάρου. 45 Lima et al, 2007 46 Pampanin et al, 2005 47 Gorbi et al, 2007 48 Γεωργάτσος και συν., Ενζυμολογία, 2001 25

Είναι μια τετραμερής αιμοπρωτεΐνη. Σε κάθε μονομερές εντοπίζεται μια ομάδα αίμης που περιέχει έναν δακτύλιο πορφυρίνης με σίδηρο στην ενεργή θέση (Εικόνα 1.6). Κάθε μονομερές περιέχει εννέα κατάλοιπα μεθειονίνης και έξι κατάλοιπα τριπτοφάνης στην αλληλουχία του. Η οξείδωση μέσω Η 2 Ο 2 των καταλοίπων αυτών δημιουργεί Εικόνα 1.6: Ομάδα αίμης της καταλάσης σημαντικές αλλαγές στην διαμόρφωση Πηγή: http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/databases/cgi-bin/enzymes/ της τεταρτοταγούς δομής του ενζύμου. Στην τετραμερή δομή, η ενεργή θέση του σιδήρου της αίμης βρίσκεται θαμμένη στον υδρόφοβο πυρήνα του ενζύμου, γεγονός σημαντικό για την αποφυγή του σχηματισμού ΟΗ μέσω της αντίδρασης Fenton, αν η ενεργή θέση της αίμης μείνει εκτεθειμένη 49. Λόγω της ευρείας της κατανομής, της εξελικτικής διατήρησης και της ικανότητας να διασπά πολύ γρήγορα το Η 2 Ο 2, έχει προταθεί ότι η καταλάση παίζει σημαντικό ρόλο στα συστήματα που εξελίχθηκαν και επέτρεψαν στους οργανισμούς να ζουν σε αερόβιο περιβάλλον. Είναι ένας από τους πιο ενεργούς φυσικούς καταλύτες. Διασπά το Η 2 Ο 2 με εξαιρετικά γρήγορο ρυθμό, αντιστοιχώντας σε δραστικότητα καταλυτικού κέντρου περίπου 10 7 min -1. Ανάλογα με την συγκέντρωση του Η 2 Ο 2, εκτελεί διπλή λειτουργία. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις (<1 μm) Η 2 Ο 2, δρα «υπεροξειδικά», π.χ. μια πληθώρα δοτών υδρογόνου (αιθανόλη, ασκορβικό οξύ κτλ) μπορούν να οξειδωθούν σύμφωνα με την αντίδραση: RH 2 + H 2 O 2 CAT R + 2H 2 O Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις υποστρώματος, η καταλάση διασπά το τοξικό για τον οργανισμό υπεροξείδιο του υδρογόνου με εξαιρετικά γρήγορο ρυθμό χρησιμοποιώντας την «καταλυτική» αντίδραση στην οποία το Η 2 Ο 2 δρα και ως δότης και ως δέκτης υδρογόνων, όπως φαίνεται παρακάτω: CAT Η 2 Ο 2 + Η 2 Ο 2 2Η 2 Ο + Ο 2 Στην καταλυτική λειτουργία, το ένζυμο έχει υψηλή φαινομενική σταθερά Michaelis και για το λόγο αυτό δεν είναι εύκολο να κορεστεί με υπόστρωμα. Έτσι η 49 Gibbons et al, 2006 26

δραστικότητα του ενζύμου αυξάνεται γραμμικά σε μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων Η 2 Ο 2, διατηρώντας την ενδοκυτταρική συγκέντρωση Η 2 Ο 2 υπό έλεγχο 50. 1.6.4 Γλουταθειόνη-S-τρανσφεράση (GST) Οι γλουταθειόνες-s-τρανσφεράσες (συστηματική ονομασία : RX:γλουταθειόνη R-τρανσφεράση, E.C.2.5.1.18) είναι μια πολυλειτουργική οικογένεια ενζύμων, σημαντική της φάσης ΙΙ της διαδικασίας βιομετατροπής), που εντοπίζονται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και καταλύουν την σύζευξη μεγάλου εύρους ηλεκτρονιόφιλων υποστρωμάτων με την γλουταθειόνη 51 (GSH, Εικόνα 1.7: Γλουταθειόνη Εικόνα 1.7). Η γλουταθειόνη είναι Πηγή: Stryer L., Βιοχημεία, 1997 ένα τριπεπτίδιο αποτελούμενο από γλυκίνη, γλουταμικό οξύ και κυστεΐνη και έχει μια ελεύθερη σουλφιδρυλομάδα. Η γλουταθειόνη χρησιμεύει σαν ρυθμιστικό σουλφιδρυλομάδων, διατηρώντας τα κατάλοιπα κυστεΐνης, της αιμοσφαιρίνης και των άλλων πρωτεϊνών των ερυθρών αιμοσφαιρίων σε ανηγμένη μορφή. Μεταπίπτει συνεχώς από την ανηγμένη μορφή (GSH) σε μια οξειδωμένη μορφή (GSSG) στην οποία δύο τριπεπτίδια συνδέονται με έναν δισουλφιδικό δεσμό και αντίστροφα. Ο λόγος GSH προς GSSG στα περισσότερα κύτταρα είναι μεγαλύτερος από 500 52. Η γλουταθειόνη θεωρείται από τους πιο σημαντικούς αντιοξειδωτικούς εκπροσώπους, αφού εμπλέκεται στην προστασία της κυτταρικής μεμβράνης από λιπιδική υπεροξείδωση 53. Οι GTSs παίζουν σημαντικό ρόλο στην αποτοξικοποίηση και απέκκριση ξενοβιοτικών ουσιών, ενδογενών συστατικών και προϊόντων του οξειδωτικού στρες. Είναι μια ομάδα ενεργών ενζύμων στο αρχικό στάδιο της βιοσύνθεσης του μερκαπτουρικού οξέος, και καταλύουν την αντίδραση των διαφόρων τοξικών ουσιών με τη σουλφιδρυλική ομάδα (-SH) της γλουταθειόνης μέσω αντιδράσεων υποκατάστασης και προσθήκης για τον σχηματισμό θειοαιθέρων 54. Αναλυτικά η αντιδράση που λαμβάνει χώρα είναι η παρακάτω: 50 Scandalios, 2005 51 Fitzpatrick et al, 1995 52 Stryer L.,1997. Βιοχημεία, σελ. 461 53 Santovito et al, 2005 54 Keen et al, 1978 27

RX + HX + GSH R-S-GSH Πηγή: http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/enzymes/getpage.pl?ec_number=2.5.1.18 Αν και έχουν μελετηθεί κυρίως στα θηλαστικά, οι GSTs εντοπίζονται σε όλα τα κύτταρα όλων των ειδών που έχουν γλουταθειόνη. Τα ισοένζυμα της GST χωρίζονται σε τουλάχιστον επτά τάξεις βασισμένες στην ομοιότητα της αλληλουχίας των αμινοξέων, πέντε από τις οποίες συναντιούνται στο κυτταρόπλασμα (προσδιορισμένες σαν άλφα, μι, πι, θήτα και κάπα) και δύο προσδεμένες στην κυτταρική μεμβράνη 55. Όσον αφορά τα μαλάκια, υπάρχουν ενδείξεις ότι οι GSTs ανήκουν στην τάξη πι. Παράλληλα με την καταλυτική τους ιδιότητα, τα ένζυμα αυτά δρουν σαν ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες πρόσδεσης, δεχόμενα έναν μεγάλο αριθμό ενδογενών και ξενοβιοτικών προσδετών σε θέσεις διαφορετικές από την καταλυτική θέση. Έχει αποδειχθεί ότι κυρίως υδρόφοβοι προσδέτες όπως για παράδειγμα η αίμη, η χολερυθρίνη, τα χολικά οξέα, τα στεροειδή και διάφορες ορμόνες προσδένονται στις GSTs, ιδίως του τύπου 1 και 2, που παλαιότερα καλούνταν ligandins 56. Από την στιγμή που τα ένζυμα αυτά αντιδρούν σε αλλαγές στην κατάσταση ρύπανσης του θαλασσινού νερού, η μέτρηση των επιπέδων τους στα μύδια θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν δείκτης δραστηριοτήτων σύζευξης και έκθεσης σε ρύπους 57,58. 55 Rooseboom et al, 2004 56 Power et al, 1996 57 Moreira et al, 2005 58 Manduzio et al, 2004 28

1.7 ΧΗΜΙΚΟΙ ΡΥΠΟΙ 1.7.1 Παρασιτοκτόνα Τα παρασιτοκτόνα περιλαμβάνουν ένα μεγάλο εύρος ουσιών που χρησιμοποιούνται κυρίως για τον έλεγχο των εντόμων, των ζιζανίων και των μυκήτων σε ασθένειες των φυτών. Η παγκόσμια χρήση των παρασιτοκτόνων έχει αυξηθεί δραματικά κατά τις δύο τελευταίες δεκαετίες, αντιστοιχώντας Εικόνα 1.8: Μεταφορά, κατανομή και διαδικασίες μετασχηματισμού των στις αλλαγές των παρασιτοκτόνων στο υδάτινο περιβάλλον. ΑqB= υδρόβιοι οργανισμοί, μεθόδων καλλιέργειας και SDO=οργανισμοί στο ίζημα. Πηγή: Katagi, 2006, μερικώς τροπ. στην αυξανόμενη εντατική καλλιέργεια. Η ευρέως διαδεδομένη χρήση των παρασιτοκτόνων για γεωργικούς και μη γεωργικούς σκοπούς έχει ως συνέπεια οι ενώσεις αυτές να ανιχνεύονται σε σημαντικές ποσότητες στο παράκτιο περιβάλλον. Τα κατάλοιπα εισέρχονται στο υδάτινο περιβάλλον μέσω άμεσων απορροών, εκπλύσεων, άμεσης εφαρμογής, απρόσεκτης απόρριψης άδειων κοντέινερ, πλύση εξοπλισμού κτλ. Tα χημικά που είναι επαρκώς ανθεκτικά στην διάσπαση και αρκετά διαλυτά για να μεταφέρονται στο νερό, μπορούν να φτάσουν στους υδάτινους όγκους σε σημαντικές ποσότητες 59. Συχνά ταξινομούνται με βάση τον οργανισμό-στόχο ή τον τρόπο χρήσης ως εντομοκτόνα, ζιζανιοκτόνα, μυκητοκτόνα ή απολυμαντικά αέρια. Τα εντομοκτόνα συχνά υποκατηγοριοποιούνται με βάση τον χημικό τους τύπο σε οργανοφωσφορικά (OPs), οργανοχλωρικά, καρβαμιδικά και πυρεθροειδή. Τα άτομα συχνά εκτίθενται σε πολλά διαφορετικά παρασιτοκτόνα ή μείγματα αυτών, είτε ταυτόχρονα είτε σε σειρά. Οι εκθέσεις αυτές είναι συχνά υψηλά σχετιζόμενες, ιδιαίτερα μεταξύ λειτουργικών ή 59 Konstantinou et al, 2006 29