Фенотипска детекција производње бета- -лактамаза код ентеробактерија

DOI: 10.2298/SARH1408457C ОРИГИНАЛНИ РАД / ORIGINAL ARTICLE UDC: 615.33.015.8 457 Фенотипска детекција производње бета- -лактамаза код ентеробактерија Ивана Ћирковић 1, Љиљана Павловић 2, Неда Константиновић 1, Катарина Костић 1, Снежана Јовановић 3, Слободанка Ђукић 1 1 Институт за микробиологију и имунологију, Медицински факултет, Универзитет у Београду, Београд, Србија; 2 Институт за јавно здравље Србије Др Милан Јовановић Батут, Београд, Србија; 3 Служба за микробиологију, Клинички центар Србије, Београд, Србија КРАТАК САДРЖАЈ Увод Бе та-лак там ски ан ти би о ти ци су нај че шће ко ри шће ни ан ти бак те риј ски ле ко ви. Ме ђу тим, мно ге бак те ри је су раз ви ле ре зи стен ци ју на ове ан ти би о ти ке, а нај че шћи вид ре зи стен ци је је ства ра ње ен зи ма бе та-лак та ма за. Број ни чла но ви по ро ди це En te ro bac te ri a ce ae про из во де раз ли чи те ти по ве ових ен зи ма. Циљ ра да Циљ ис тра жи ва ња су би ле фе но тип ска де тек ци ја про из вод ње и иден ти фи ка ци ја ти па бе та-лак та ма за код ен те ро бак те ри ја изо ло ва них из раз ли чи тих кли нич ких узо ра ка од бо ле сни ка хо спи та ли зо ва них у Кли нич ком цен тру Ср би је. Ме то де ра да Кли нич ки изо ла ти ен те ро бак те ри ја са ку пља ни су у ла бо ра то ри ји Кли нич ког цен тра Ср би је од но вем бра 2011. до ја ну а ра 2012. го ди не. Изо ла ти су иден ти фи ко ва ни до ни воа вр сте кон вен ци о нал ним ме то да ма бак те ри о ло шке ди јаг но сти ке и на ауто ма ти зо ва ном си сте му VI TEK 2. Осе тљи вост на ан ти би о ти ке је ис пи та на диск-ди фу зи о ном ме то дом, а фе но тип ска де тек ци ја произ вод ње и иден ти фи ка ци ја бе та-лак та ма за ура ђе не су у скла ду с опи са ним ме то до ло ги ја ма. Ре зул та ти У овом ис тра жи ва њу изо ло ва на су 172 со ја ен те ро бак те ри ја. У да ље ис пи ти ва ње укључе но је 54/145 (37,2%) со је ва ен те ро бак те ри ја ко је су по ка за ле ре зи стен ци ју и ин тер ме ди јар ну осе тљи вост на бе та-лак там ске ан ти би о ти ке: 13/85 (15,3%) со је ва Esche ric hia co li, 31/46 (67,4%) со јева Kleb si el la pne u mo ni ae и 10/14 (71,4%) со је ва Pro te us mi ra bi lis. Ме ђу њи ма 40/145 (27,6%) со је ва је про из во ди ло бе та-лак та ма зе про ши ре ног спек тра (енгл. ex ten ded-spec trum be ta-lac ta ma ses ESBLs), 9/145 (6,2%) AmpC, 1/145 (0,7%) К1 бе та-лак та ма зу и 4/145 (2,8%) кар ба пе не ма зе. Кар ба пе не ма зе нај че шће је про из во ди ла вр ста K. pne u mo ni ae (75%). За кљу чак Ен те ро бак те ри је ства ра ју раз ли чи те ти по ве бе та-лак та ма за, а нај че шће де тек то ва ни тип су ESBL. Пре те ћи про блем је и про из вод ња кар ба пе не ма за код ен те ро бак те ри ја. Кључ не ре чи: бе та-лак та ма зе; ен те ро бак те ри је; ре зи стен ци ја УВОД Ре зи стен ци ја ми кро ор га ни за ма на ан тими кроб не ле ко ве је ме ди цин ски про блем од оп штег зна ча ја [1]. Бе та-лак там ски анти би о ти ци су нај че шће ко ри шће ни ан тибак те риј ски ле ко ви због њи хо ве ре ла тив но ви со ке ефи ка сно сти, до ступ но сти и рет ких не же ље них деј ста ва [2]. Нај че шћи вид ре зистен ци је на ове ан ти би о ти ке је про из вод ња ен зи ма бе та-лак та ма за [3]. До да нас је опи са но ви ше од 950 бе талак та ма за [4]. Ови ен зи ми се мо гу класи фи ко ва ти на два на чи на. Пре ма пр вој мо ле ку лар ној или Ам бле ро вој (Am bler) кла си фи ка ци ји, за сно ва ној на при мар ној струк ту ри ен зи ма, по сто је че ти ри кла се бета-лак та ма за. Кла са ма A, C и D при па да ју ен зи ми ко ји хи дро ли зу ју суп стра те ствара њем аци лен зи ма пре ко се ри на из свог ак тив ног ме ста, док кла су B чи не тзв. мета ло ен зи ми, ко ји за хи дро ли зу бе та-лак тама ко ри сте бар је дан јон цин ка из ак тив ног ме ста. Пре ма дру гој функ ци о нал ној или Буш Џеј ко би Ме де и ро со вој (Bush Ja coby Me de i ros) кла си фи ка ци ји, за сно ва ној на функ ци о нал ним од ли ка ма ен зи ма, по сто је че ти ри гру пе: це фа ло спо ри на зе (гру па 1), се рин бе та-лак та ма зе (гру па 2), ме та ло-бета-лак та ма зе (гру па 3) и не кла си фи ко ва ни ен зи ми (гру па 4) [5]. Број ни чла но ви по ро ди це En te ro bac te ria ce ae ства ра ју раз ли чи те бе та-лак та ма зе. Ове бак те ри је мо гу има ти пла змид ски детер ми ни са не бе та-лак та ма зе (TEM1, TEM2 и SHV1), ко је их чи не ре зи стент ним на пени ци ли не, али не и на це фа ло спо ри не проши ре ног спек тра деј ства. Осам де се тих годи на два де се тог ве ка код ен те ро бак те ри ја је от кри ве на но ва гру па ен зи ма ко ји инакти ви ра ју све пе ни ци ли не и це фа ло спо ри не, укљу чу ју ћи и це фа ло спо ри не про ши ре ног спек тра де ло ва ња (це фо так сим, це фтри аксон, цеф та зи дим) и ок си ми но мо но бак там (азтре о нам), али не хи дро ли зу ју це фа ми цине (це фок си тин, це фо те тан) и кар ба пе не ме [6, 7]. Ови ен зи ми на зва ни су бе та-лак та мазе про ши ре ног спек тра (енгл. ex ten ded-spectrum be ta-lac ta ma ses ESBLs). По сто ји око 500 раз ли чи тих ESBLs [7], а сва ка од њих је Correspondence to: Ivana ĆIRKOVIĆ Institut za mikrobiologiju i imunologiju Medicinski fakultet Dr Subotića 1, 11000 Beograd Srbija cirkoviciv@yahoo.com

458 Ћирковић И. и сар. Фенотипска детекција производње бета-лактамаза код ентеробактерија на ста ла му та ци ја ма ге на за TEM1, TEM2 и SHV1 [8]. Ове му та ци је та ко ђе по ве ћа ва ју осе тљи вост ен зи ма на де ло ва ње ин хи би то ра бе та-лак та ма за [9]. Ве ли ку гру пу ESBL чи не CTX-M ен зи ми (кла са A), ко ји хи дроли зу ју це фо так сим, а не цеф та зи дим, и по ка зу ју бо љу осе тљи вост на та зо бак там не го на кла ву лан ску ки сели ну [10]. AmpC тип бе та-лак та ма за (кла са C, гру па 1) код ен те ро бак те ри ја, раз ли ку је се од ESBLs по то ме што су ре зи стент не на ин хи би то ре бе та-лак та ма за и што хи дро ли зу ју це фа ми ци не, али не и це фа ло спори не че твр те ге не ра ци је. Ге ни за AmpC су нај че шће на ђе ни на хро мо зо ми ма, ма да се и пла змид ски де терми ни са ни AmpC мо гу на ћи код не ких ен те ро бак те ри ја, као што су Esche ric hia co li, Kleb si el la spp., Pro te us spp. и Sal mo nel la spp. К1 бе та-лак та ма за је ко ди ра на од стране ге на ко ји је на ђен на хро мо зо му бак те ри је Kleb si el la spp. Овај ен зим је, пре све га, пе ни ци ли на за, али мо же да хи дро ли зу је и азтре о нам, це фу рок сим и це фтриак сон. Има сла бу ак тив ност пре ма це фо так си му и цеф та зи ди му. Не дав но су код со је ва ен те ро бак те ри ја опи са не кла се A, B и D кар ба пе не ма за, ко је хи дро лизу ју све бе та-лак там ске ан ти би о ти ке, укљу чу ју ћи и кар ба пе не ме [7]. ЦИЉ РАДА Циљ ис тра жи ва ња су би ле фе но тип ска де тек ци ја и иден ти фи ка ци ја ти па про из ве де них бе та-лак та ма за код ен те ро бак те ри ја изо ло ва них из раз ли чи тих клинич ких узо ра ка код бо ле сни ка хо спи та ли зо ва них у Кли нич ком цен тру Ср би је. МЕТОДЕ РАДА Испитивање осетљивости на антибиотике диск-дифузионом методом Со је ви са ку пље ни у овој сту ди ји осве же ни су пре сеја ва њем на трип ти ка за-со ја агар (bi oméri e ux, Фран цуска). За се ја не под ло ге су ин ку би ра не 24 ча са на 35 C. По том су пра вље не бак те риј ске су спен зи је у су спензи о ном ме ди ју му (bi oméri e ux, Фран цу ска). Гу сти на су спен зи ја је пре ци зно по де ше на на ден зи то ме тру (bi oméri e ux, Фран цу ска), да би од го ва ра ла Мак фарлан до вом (McFar land) стан дар ду од 0,5. До би је не суспен зи је су ино ку ли са не на по вр ши ну Ми лер Хин тоно вог (Mu el ler Hin ton MH) агра (bi oméri e ux, Францу ска) у Пе три је вим шо ља ма преч ни ка 150 mm. Диско ви ан ти би о ти ка су за тим по ре ђа ни по по вр ши ни за се ја ног MH ага ра по од ре ђе ном рас по ре ду (Схе ма 1). Ко ри шће ни су сле де ћи ан ти би о ти ци: амок си ци лин са кла ву лан ском ки се ли ном (20/10 µg), азтре о нам (30 µg), цеф та зи дим (30 µg), цеф та зи дим са кла ву лан ском ки се ли ном (30/10 µg), це фо так сим (30 µg), це фо так сим са кла ву лан ском ки се ли ном (30/10 µg), це фок си тин (30 µg), це фтри ак сон (30 µg), це фе пим (30 µg), ер та пе нем (10 µg), ими пе нем (10 µg) и ме ро пе нем (10 µg) (Bi o Rad, САД). Ино ку ли са не пло че су по том ин ку би ра не у термо ста ту на 35 C то ком 24 ча са. Идентификација типа бета-лактамаза Иден ти фи ка ци ја ти па бе та-лак та ма за оба вље на је у скла ду с опи са ним ме то до ло ги ја ма [10-14]. 1. Де тек ци ја ESBL ко ри сте се ди ско ви цеф та зи дима и це фо так си ма са кла ву лан ском ки се ли ном и без ње [11]: Бактеријски сојеви Кли нич ки со је ви ен те ро бак те ри ја изо ло ва ни из хемо кул ту ра, пи о кул ту ра и ури но кул ту ра са ку пља ни су у ми кро би о ло шкој ла бо ра то ри ји Кли нич ког центра Ср би је (КЦС) од но вем бра 2011. до ја ну а ра 2012. го ди не. Со је ви су иден ти фи ко ва ни до ни воа вр сте кон вен ци о нал ним ме то да ма бак те ри о ло шке ди јаг ности ке. По твр да иден ти фи ка ци је кли нич ких со је ва енте ро бак те ри ја из вр ше на је у ауто ма ти зо ва ном си сте му VI TEK 2 (bi oméri e ux, Фран цу ска) ко ри шће њем кар тица GN у скла ду с пре по ру ка ма про из во ђа ча. Ис пи ти вање осе тљи во сти на ан ти бак те риј ске ле ко ве је из вр шено диск-ди фу зи о ном ме то дом ан ти би о гра ма у скла ду с пре по ру ка ма аме рич ког Ин сти ту та за кли нич ке и ла бо ра то риј ске стан дар де (енгл. Cli ni cal and La bo ra tory Stan dard In sti tu te CLSI) из 2011. го ди не [11]. У да ље ис тра жи ва ње би ли су укљу че ни са мо со је ви ен те робак те ри ја ко ји су би ли ре зи стент ни и ин тер ме ди јар но осе тљи ви на бе та-лак там ске ан ти би о ти ке. Са ку пљени со је ви су чу ва ни у трип ти ка за-со ја бу јо ну (TSB; bioméri e ux, Фран цу ска) са гли це ро лом у кон цен тра ци ји од 12,5% на тем пе ра ту ри од -80 C. Схе ма 1. Ша блон за диск-ди фу зи о ну ме то ду от кри ва ња бе та-лакта ма за Schema 1. Template for disk potentiation method for detecting betalactamases 1 цефотаксим + клавуланска киселина; 2 азтреонам; 3 цефепим; 4 цефтриаксон; 5 меропенем; 6 цефтазидим + клавуланска киселина; 7 цефокситин; 8 ертапенем; 9 имипенем; 10 цефотаксим; 11 амоксицилин + клавуланска киселина; 12 цефтазидим 1 cefotaxime + clavulanate; 2 aztreonam; 3 cefepime; 4 ceftriaxone; 5 meropenem; 6 ceftazidime + clavulanate; 7 cefoxitin; 8 ertapenem; 9 imipenem; 10 cefotaxime; 11 amoxicillin + clavulanate; 12 ceftazidime doi: 10.2298/SARH1408457C

459 a) ако је зо на ин хи би ци је ра ста око ди ско ва са додат ком кла ву лан ске ки се ли не ве ћа за 5 mm или ви ше у по ре ђе њу са зо ном ин хи би ци је око ди ска без кла вулан ске ки се ли не, сој ства ра ESBL; b) ако се уочи де фор ма ци ја зо не ин хи би ци је ра ста из ме ђу би ло ко јег це фа ло спо рин ског ди ска и ди ска који са др жи кла ву лан ску ки се ли ну, про из вод ња ESBL се мо же пред ви де ти. Овај фе но мен се на зи ва фе но мен кљу ча о ни це и ука зу је на ства ра ње ESBL. 2. Де тек ци ја CTX-M бе та-лак та ма зе ко ри сте се диско ви цеф та зи ди ма и це фо так си ма. Со је ви ко ји ствара ју CTX-M су ре зи стент ни на це фо так сим и осе тљи ви на цеф та зи дим [10]. 3. Де тек ци ја AmpC бе та-лак та ма зе ко ри сте се диско ви це фе пи ма и це фок си ти на. Со је ви ко ји про из воде AmpC ре зи стент ни су на це фа ми ци не (нпр. це фокси тин), а осе тљи ви на це фе пим. Со је ви ко ји ства ра ју овај ен зим у ве ли кој ко ли чи ни ре зи стент ни су на све це фа ло спо ри не пр ве, дру ге и тре ће ге не ра ци је, ин хиби то ре бе та-лак та ма за и мо но бак та ме [12]. 4. Де тек ци ја К1 бе та-лак та ма зе ко ри сте се ди скови азтре о на ма, цеф та зи ди ма, це фо так си ма, це фтриак со на и це фок си тин. Со је ви ко ји про из во де К1 бета-лак та ма зу су осе тљи ви на це фок си тин (AmpC-нега тив ни), це фо так сим и цеф та зи дим, а ре зи стент ни на це фри ак сон и азтре о нам [13]. 5. Де тек ци ја кар ба пе не ма за ко ри сте се ди ско ви ер та пе не ма, ими пе не ма и ме ро пе не ма. Со је ви ко ји про из во де овај ен зим по ка зу ју сма ње ну осе тљи вост или ре зи стен ци ју на ер та пе нем, ими пе нем и/или меро пе нем [14]. Сли ка 1. Де тек ци ја ESBL фе но мен кљу ча о ни це око ди ска са клаву лан ском ки се ли ном Esche ric hia co li Figure 1. Detection of ESBL keyhole formation around clavulanic containing disk Escherichia coli Фенотипска потврда карбапенемаза Ра ди фе но тип ске по твр де про из вод ње кар ба пе не ма за, из ве ден је мо ди фи ко ван Хоџов (Hod ge) тест [14]. Сли ка 2. Де тек ци ја AmpC бе та-лак та ма за Pr o te us mi ra bi lis Figure 2. Detection of AmpC beta-lactamase - Proteus mirabilis РЕЗУЛТАТИ У по сма тра ном пе ри о ду изо ло ва на су 172 со ја ен те робак те ри ја: 85 (49,4%) со је ва Esche ric hia co li, 46 (26,7%) со је ва Kleb si el la pne u mo ni ae, 14 (8,1%) со је ва Pro te us mira bi lis, 11 (6,4%) со је ва En te ro bac ter clo a cae, осам (4,7%) со је ва Ser ra tia mar ce scens, пет (2,9%) со је ва Mor ga nel la mor ga nii и три (1,8%) со ја Ci tro bac ter fre un dii. У да ље ис тра жи ва ње би ла су укљу че на 54/145 (37,2%) со ја енте ро бак те ри ја ко ја су по ка за ла ре зи стен ци ју или интер ме ди јар ну осе тљи вост на бе та-лак там ске ан ти био ти ке: 13/85 (15,3%) со је ва E. co li, 31/46 (67,4%) со је ва K. pne u mo ni ae и 10/14 (71,4%) со је ва P. mi ra bi lis. Про из вод ња раз ли чи тих ти по ва бе та-лак та ма за де тек то ва на је код ана ли зи ра них со је ва ен те ро бак тери ја. Ме ђу њи ма 40/145 (27,6%) со је ва је про из во ди ло ESBL (Сли ка 1), 9/145 (6,2%) AmpC (Сли ка 2), 1/145 (0,7%) К1 бе та-лак та ма зу и 4/145 (2,8%) кар ба пе не ма зе (Сли ка 3). Код свих кар ба пе не ма за-по зи тив них со је ва мо ди фи ко ван Хоџов тест је био по зи ти ван. Сли ка 3. Де тек ци ја кар ба пе не ма за Kleb si el la pne u mo ni ae Figure 3. Detection of carbapenemase Klebsiella pneumoniae Уче ста лост раз ли чи тих ти по ва бе та-лак та ма за код ис пи ти ва них со је ва ен те ро бак те ри ја при ка за на је у табе ла ма 1 и 2. У на шем ис тра жи ва њу от кри ве ни су со је ви ен теро бак те ри ја ко ји су исто вре ме но про из во ди ли два раз ли чи та ти па бе та-лак та ма за: два со ја P. mi ra bi lis www.srp-arh.rs

460 Ћирковић И. и сар. Фенотипска детекција производње бета-лактамаза код ентеробактерија Та бе ла 1. Уче ста лост бе та-лак та ма за про ши ре ног спек тра (ESBL) код ис пи ти ва них изо ла та ен те ро бак те ри ја Table 1. Frequency of extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) among tested Enterobacteriaceae isolates Изо ла ти ен те ро бак те ри ја Enterobacteriaceae isolates Укупан број изолата (%) Total number of isolates ESBL-позитивни изолати ESBL-positive isolates CTX-M ензим CTX-M enzyme Остали ESBL типови ензима Others ESBL enzyme types Бактерија Bacterium Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis 85 46 14 3 4 1 3.5 8.7 7.1 37.5 50.0 12.5 10 17 5 11.8 36.9 35.7 31.2 53.1 15.7 Та бе ла 2. Уче ста лост дру гих ти по ва бе та-лак та ма за код ис пи ти ва них изо ла та ен те ро бак те ри ја Table 2. Frequency of other type of beta-lactamase among tested Enterobacteriaceae izolates Изо ла ти ен те ро бак те ри ја Enterobacteriaceae isolates Укупан број изолата Total number of isolates AmpC-позитивни изолат AmpC positive isolates К1 бета-лактамаза позитивни изолати K1 beta-lactamase positive isolates Карбапенемазапозитивни изолати Carbapenemase positive isolates Бактерија Bacterium Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis 85 46 14 0 6 3 0.0 13.0 21.4 0.0 66.7 33.3 0 1 0 0.0 2.2 0.0 0.0 100.0 0.0 0 3 1 0.0 6.5 7.1 0.0 75.0 25.0 ства ра ла су ESBL и AmpC, је дан сој P. mi ra bi lis ства рао је AmpC и кар ба пе не ма зе, а је дан сој K. pne u mo ni ae про из во дио је ESBL и К1. ДИСКУСИЈА Ен те ро бак те ри је се да нас сма тра ју глав ним бак те ријским узроч ни ком мор би ди те та и мор та ли те та у болнич ким сре ди на ма и јед ним од нај зна чај ни јих па тоге на у оп штој по пу ла ци ји ши ром све та [15]. По се бан ме ди цин ски, али и еко ном ски про блем је сте ре зи стенци ја ових бак те ри ја на бе та-лак там ске ан ти бак те ријске ле ко ве [3]. Са вре ме на са зна ња из обла сти кли ничке бак те ри о ло ги је нам ука зу ју на то да ни је до вољ но са мо in vi tro ис пи та ти осе тљи вост ен те ро бак те ри ја на бе та-лак там ске ан ти би о ти ке, већ је по треб но от кри ти про из вод њу бе та-лак та ма за од стра не ана ли зи ра ног со ја и утвр ди ти тип ен зи ма ра ди тач ног из да ва ња резул та та и епи де ми о ло шког над зо ра. У скла ду с пре по ру ка ма за ту ма че ње ан ти би о грама [16, 17], уве де на су но ва пра ви ла пре ма ко ји ма се ре зул та ти ис пи ти ва ња осе тљи во сти ен те ро бак те ри ја на це фа ло спо ри не тре ће и че твр те ге не ра ци је и карба пе не ме из ве шта ва ју она ко ка ко су очи та ни, јер су гра нич не вред но сти за на ве де не ан ти би о ти ке про мење не. Ме ђу тим, у свр ху епи де ми о ло шког над зо ра и да ва ња пре по ру ка ле ка ри ма, ва жно је от кри ти да ли ис пи ти ва ни сој ства ра ESBL, од но сно кар ба пе не ма зу или не [18]. Ле че ње ин фек ци је иза зва не ESBL-по зитив ном бак те ри јом це фа ло спо ри ни ма тре ће и че твр те ге не ра ци је мо же би ти не у спе шно. Код со је ва ен те робак те ри ја ко ји про из во де AmpC бе та-лак та ма зу ре зулта те ан ти би о гра ма за це фа ло спо ри не тре ће ге не ра ције не тре ба ко ри го ва ти, али је нео п ход но у ре зул та ту пре по ру чи ти да се ови ан ти би о ти ци не ко ри сте као doi: 10.2298/SARH1408457C

461 мо но те ра пи ја. Та ко ђе се пре по ру чу је да се на кон триче ти ри да на по но во по ку ша с изо ла ци јом и по нов ним те сти ра њем изо ла та због мо гућ но сти на стан ка ре зистен ци је то ком ле че ња це фа ло спо ри ни ма тре ће ге нера ци је [17, 18]. Из све га на ве де ног се мо же за кљу чи ти да је нео п ход но де тек то ва ти ти по ве бе та-лак та ма за ко је про из во де ен те ро бак те ри је. У овом ра ду при каза на је јед но став на и ла ка ме то да за от кри ва ње ових ен зи ма, ко ју мо же у свом ру тин ском ра ду при ме ни ти сва ка ми кро би о ло шка ла бо ра то ри ја у на шој зе мљи. Ре зул та ти на шег ис тра жи ва ња су по ка за ли да енте ро бак те ри је изо ло ва не из кли нич ких узо ра ка код бо ле сни ка хо спи та ли зо ва них у КЦС нај че шће про изво де ESBL. Укуп на пре ва лен ци ја ESBL-по зи тив них енте ро бак те ри ја ва ри ра из ме ђу раз ли чи тих ге о граф ских ре ги о на: нај ве ћа је у Ин ди ји (77,4%) [19], а нај ма ња у Хо лан ди ји (2%) [20]. По ред то га, уче ста лост изо ло вања ESBL-по зи тив них ен те ро бак те ри ја по ве ћа ва се из го ди не у го ди ну ши ром све та [3]. Пре ма ре зул та тима на ше сту ди је, ме ђу ана ли зи ра ним со је ви ма 27,6% про из во ди ESBL. Ка да се упо ре де до би је ни ре зул та ти с ре зул та ти ма из 2006. го ди не (28,6%) и 2008. го ди не (26,1%) [21], за кљу чу је се да у по след њих шест го ди на у КЦС ни је до шло до сма ње ња бро ја ESBL-по зи тив них со је ва. То нам по ка зу је да ме ре кон тро ле и пре вен ци је бол нич ких ин фек ци ја ко је се при ме њу ју у КЦС ни су за до во ља ва ју ће, јер ни су до ве ле до сма ње ња пре ва ленци је ових бак те ри ја. Ре зул та ти на ше сту ди је, ко ји су у скла ду с по да ци ма из број них прет ход них ис тра жи ва ња [3, 20, 22], по ка зали су да: 1) K. pne u mo ni ae, E. co li и P. mi ra bi lis про из во де ESBL; 2) нај зна чај ни ји про дук тор је K. pne u mo ni ae, и 3) ме ђу ESBL ен зи ми ма де тек то ван је и CTX-M ен зим. Оно што је по себ но зна чај но је упра во до ка зи ва ње прису ства овог ен зи ма код на ших со је ва, ко ји мо же про ћи нео т кри вен ако се у ан ти би о гра му не ко ри сте за јед но ди ско ви цеф та зи ди ма и це фо так си ма, што мо же би ти ре ал на мо гућ ност у ру тин ском ра ду. Уче ста лост де текци је CTX-M ен зи ма код E. co li и K. pne u mo ni ae је све ве ћа у Фран цу ској, Ве ли кој Бри та ни ји и Ру си ји [20], а ре зул та ти на ше сту ди је нам го во ре да се овај ен зим на ла зи и код ен те ро бак те ри ја у на шој зе мљи. До дат ни сег мент на шег ис тра жи ва ња је до ка зи вање при су ства и дру гих ти по ва бе та-лак та ма за, по ред ESBL. По се бан про блем пред ста вља ју сте че не AmpC це фа ло спо ри на зе. Иако су у гло бал ном кон тек сту ови ен зи ми знат но ре ђи код ен те ро бак те ри ја од ESBL, сматра ју се да нас дру гим нај зна чај ни јим ти пом бе та-лакта ма за [23]. На шим ис тра жи ва њем је по ка за но да је AmpC ен зим про из во ди ло 13% со је ва K. pne u mo ni ae и 21,4% P. mi ra bi lis. Слич на уче ста лост по ка за на је и сту ди ја ма из ве де ним у Евро пи [24] и Ин ди ји [25], у ко ји ма је уче ста лост про из вод ње AmpC би ла 10 30% код K. pne u mo ni ae и 15 22% код P. mi ra bi lis. На ша студи ја је ука за ла и на сла бу про из вод њу К1 ен зи ма, што је у скла ду с по да ци ма из ли те ра ту ре [7]. По се бан кли нич ки и епи де ми о ло шки про блем сву да у све ту је сте по ја ва со је ва ен те ро бак те ри ја ко ји ствара ју кар ба пе не ма зе. Пре ва лен ци ја кар ба пе не ма за код ен те ро бак те ри ја у Евро пи ва ри ра од зе мље до зе мље; нај ви ша уче ста лост је у зе мља ма на ју гу Евро пе Кипру, Ита ли ји и Грч кој (15,7 49%), а нај ма ња у зе мљама на се ве ру скан ди нав ским др жа ва ма, Есто ни ји и Ли тва ни ји (0%) [26]. Уче ста лост ен те ро бак те ри ја ко је про из во де кар ба пе не ма зе у на шој сту ди ји би ла је ма ла (2,8%), има ју ћи у ви ду да је реч о со је ви ма изо ло ва ним у бол ни ци тер ци јар ног ни воа за шти те, у ко јој се очеку је ви ша сто па ре зи стен ци је у по ре ђе њу с на ци о налним про се ком. Јед но од мо гу ћих об ја шње ња до би је ног ре зул та та мо же би ти ви ше го ди шња изо ла ци ја на ше зе мље то ком де ве де се тих го ди на два де се тог ве ка, као и огра ни че на пу то ва ња на ших др жа вља на у дру ге зе мље из еко ном ских раз ло га. Ме ђу ен те ро бак те ри ја ма K. pne u mo ni ae је нај че шћи и, мо же се ре ћи, нај по зна ти ји про дук тор кар ба пе нема за. Слич не ре зул та те смо до би ли и у на шем ис тражи ва њу. У на шој сту ди ји про из вод ња кар ба пе не ма за је по твр ђе на и мо ди фи ко ва ним Хоџовим те стом. Међу тим, иден ти фи ка ци ја кла се кар ба пе не ма за (A, B и D) ни је би ла мо гу ћа, јер сви ди јаг но сти ку ми ко ји се ко ри сте у ову свр ху још ни су ре ги стро ва ни у на шој зе мљи и не могу се на ба ви ти на тр жи шту. ЗАКЉУЧАК Пре ма са зна њи ма ко ја су нам би ла до ступ на, ово је прва сту ди ја у на шој зе мљи ко ја се ба ви ла фе но тип ском де тек ци јом про из вод ње раз ли чи тих ти по ва бе та-лакта ма за код ен те ро бак те ри ја и њи хо вом иден ти фи каци јом. До би је ни ре зул та ти ис тра жи ва ња су утвр ди ли че ти ри раз ли чи та ти па ен зи ма: ESBL, AmpC, К1 и карба пе не ма зе. Нај че шће де тек то ва ни тип бе та-лак та ма за би ле су ESBL. Кар ба пе не ма зе је нај че шће про из во ди ла вр ста K. pne u mo ni ae. НАПОМЕНА Рад је на стао у окви ру про јек та ОН 175039, ко ји финан си ра Ми ни стар ство про све те, на у ке и тех но ло шког раз во ја Ре пу бли ке Ср би је. www.srp-arh.rs

462 Ћирковић И. и сар. Фенотипска детекција производње бета-лактамаза код ентеробактерија ЛИТЕРАТУРА 1. Levy SB. Factors impacting on the problem of antibiotic resistance. J Antimicrob Chemoth. 2002; 49:25-30. 2. Wilke MS, Lovering AL, Strynadka NCJ. β-lactam antibiotic resistance: a current structural perspective. Curr Opin Microbiol. 2005; 8:525-33. 3. Coque TM, Baquero F, Canton R. Increasing prevalence of ESBLproducing Enterobacteriaceae in Europe. Euro Surveill. 2008; 13:1-11. 4. Bush K. Alarming β-lactamase-mediated resistance in multidrugresistant Enterobacteriaceae. Curr Opin in Microbiol. 2010; 1 3:558-64. 5. Bush K, Jacoby GA. Minireview updated functional classification of β-lactamases. Antimicob Agents Chemother. 2010; 54:969-76. 6. Knothe H, Shah P, Kremery V, Antal M, Mitsuhashi S. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. Infection. 1983; 11:315-7. 7. Schreckenberg P, Rekasius V. Detecting resistance to beta lactams in gram-negative bacilli. Clin Microbiol Inf Dis. 2011; 56:251-3. 8. Emery CL, Weymouth LA. Detection and clinical significance of extended-spectrum β-lactamases in a tertiary-care medical center. J Clin Microbiol. 1997; 35:2061-7. 9. Jacoby GA, Munoz-Price LS. The new beta-lactamases. N Engl J Med. 2005; 352:380-91. 10. Pournaras S, Ikonomidis A, Kristo I, Tsakris A, Maniatis AN. CTX-M enzymes are the most common extended-spectrum betalactamases among Escherichia coli in a tertiary Greek hospital. J Antimicrob Chemother. 2004; 54:574-5. 11. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement. CLSI document M100-S21. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011. 12. Ruppe E, Bidet P, Verdet C, Arlet G, Bingen E. First detection of the Ambler Class C1 AmpC beta lactamase in Citrobacter freundii by a new simple double disk synergy test. J Clin Microbiol. 2006; 44:4204 7. 13. Livermore DM, Winstanley TG, Shannon KP. Interpretative reading: recognizing the unusual and inferring resistance mechanisms from resistance phenotypes. J Antimicrob Chemother. 2001; 48:87-102. 14. Cohen Stuart J, Leverstein-Van Hall MA, Dutch Working Party on the Detection of Highly Resistant Microorganisms. Guideline for phenotypic screening and confirmation of carbapenemases in Enterobacteriaceae. Int J Antimicrob Agents. 2010; 36:205-10. 15. Denton M. Enterobacteriaceae. Int J Antimicrob Agents. 2007; 29:S9-S22. 16. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. 2013; Version 3.1. Available from: http://www.eucast.org. 17. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-second informational supplement. CLSI document M100-S22. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2012. 18. Livermore DM, Andrews JM, Hawkey PM, Ho PL, Keness Y, Doi Y, et al. Are susceptibility tests enough, or should laboratories still seek ESBLs and carbapenemases directly? J Antimicrob Chemother. 2012; 67:1569-77. 19. Hawser SP, Bouchillon SK, Hoban DJ, Badal RE, Hsueh PR, Paterson DL. Emergence of high levels of extended-spectrumbeta-lactamase-producing gram-negative bacilli in the Asia- Pacific region: data from the Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends (SMART) program, 2007. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53:3280-4. 20. Luzzaro F, Mezzatesta M, Mugnaioli C, Perilli M, Stefani S, Amicosante G, et al. Trends in production of extended-spectrum beta-lactamases among enterobacteria of medical interest: report of the second Italian nationwide survey. J Clin Microbiol. 2006; 44:1659-64. 21. Jovanović S, Ćirković I, Švabić Vlahović M. Učestalost izolacije sojeva enterobakterija koji produkuju beta-laktamaze proširenog spektra (ESBLs) iz kliničkih uzoraka pacijenata sa osam klinika Kliničkog centra Srbije. Proceedings of the VIII kongres mikrobiologa Srbije; 2010 Jun 3-5; Belgrade, Serbia [CD-ROM]. Belgrade: Mikromed; 2010. 22. Dhillon RH, Clark J. ESBLs: a clear and present danger? Crit Care Res Pract. 2012; 625170. 23. Empel J, Baraniak A, Literacka E, Mrówka A, Fiett J, Sadowy E, et al. Molecular survey of beta-lactamases conferring resistance to newer beta-lactams in Enterobacteriaceae isolates from Polish hospitals. Antimicrob Agents Chemother. 2008; 52:2449-54. 24. Goossens H, Grabein B. Prevalence and antimicrobial susceptibility data for extended-spectrum β-lactamase- and AmpC-producing Enterobacteriaceae from the MYSTIC Program in Europe and the United States (1997-2004). Diagn Microb Inf Dis. 2005; 53:257-64. 25. Sasirekha B, Shivakumar S. Occurrence of plasmid-mediated AmpC β-lactamases among Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae clinical isolates in a tertiary care hospital in Bangalore. Indian J Microbiol. 2012; 52:174-9. 26. Cantón R, Akóva M, Carmeli Y, Giske CG, Glupczynski Y, Gniadkowski M, et al. Rapid evolution and spread of carbapenemases among Enterobacteriacea doi: 10.2298/SARH1408457C

463 Phenotypic Detection of Beta-Lactamases Production in Enterobacteriaceae Ivana Ćirković 1, Ljiljana Pavlović 2, Neda Konstantinović 1, Katarina Kostić 1, Snežana Jovanović 3, Slobodanka Djukić 1 1 Institute of Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Belgrade, Belgrade, Serbia; 2 Institute of Public Health of Serbia Dr Milan Jovanović Batut, Belgrade, Serbia; 3 Department of Microbiology, Clinical Center of Serbia, Belgrade, Serbia SUMMARY Introduction Beta-lactam antibiotics are the most commonly used antibacterial drugs. However, many bacteria have developed resistance to these antibiotics, and the most common form of resistance is the production of beta-lactamase enzymes. Many members of the Enterobacteriaceae family produce different types of these enzymes. Objective The aim of this study was to perform phenotypic detection of production and identification of beta-lactamase type in Enterobacteriaceae isolated from different clinical specimens from patients hospitalized in the Clinical Center of Serbia. Methods The strains of Enterobacteriaceae were collected between November 2011 and January 2012 in the laboratory of the Clinical Center of Serbia. The isolates were identified according to the standard microbiology procedures and confirmed by the Vitek2 automated system. Antimicrobial susceptibility testing was performed by the disk diffusion method, and the phenotypic detection of production and identification of betalactamases was performed according to previously described methodologies. Results In this study, a total of 172 Enterobacteriaceae strains were isolated. Further testing was performed on 54/145 (37.2%) strains showing decreased susceptibility to beta-lactam antibiotics: 13/85 (15.3%) Escherichia coli, 31/46 (67.4%) Klebsiella pneumoniae and 10/14 (71.4%) Proteus mirabilis. Among them, 40/145 (27.6%) strains produced extended spectrum betalactamases (ESBLs), 9/145 (6.2%) - AmpC, 1/145 (0.7%) - K1 beta-lactamase and 4/145 (2.8%) carbapenemases. Carbapenemases were predominantly detected in K. pneumoniae (75%). Conclusion Enterobacteriaceae produce different types of betalactamases, and the most common type in our study was ESBLs. Production of carbapenemases detected in Enterobacteriaceae is also an associated problem. Keywords: beta-lactamases; enterobacteria; resistance Примљен Received: 01/04/2013 Ревизија Revision: 17/01/2014 Прихваћен Accepted: 29/04/2014 www.srp-arh.rs