Γενετικά Τροποποιημένα Τρόφιμα

Γενετικά Τροποποιημένα Τρόφιμα 2 1

Γενετική Τροποποίηση Η γενετική τροποποίηση περιλαμβάνει τεχνολογίες που τροποποιούν τη γενετική δομή και τις αλληλουχίες ζωντανών οργανισμών όπως ζώα, φυτά ή βακτήρια. 2

Γενετικά τροποποιημένοι οργανισμοί (ΓΤΟ) Genetically modified organisms (GMOs) Oι οργανισμοί των οποίων η αλλαγή στο γενετικό τους υλικό (DNA) δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί με φυσικό τρόπο. Η γενετική τροποποίηση πραγματοποιείται είτε τροποποιώντας το DNA ενός συγκεκριμένου γονιδίου, είτε εισάγοντας το γενετικό υλικό ενός οργανισμού (δότη) σε έναν άλλο οργανισμό (δέκτη). Ο οργανισμός δότης μπορεί να ανήκει σε μια διαφορετική ποικιλία του ίδιου ή διαφορετικού είδους. Έτσι, ο οργανισμός δέκτης αποκτά μία συγκεκριμένη ιδιότητα που αρχικά δεν είχε. Κατά τη μεταφορά γονιδίων με τη γενετική μηχανική από έναν οργανισμό σε έναν άλλο, παύουν να υφίστανται οι φυσικοί φραγμοί που υπάρχουν μεταξύ των ειδών. 3

Κλασική βελτίωση / Γενετική τροποποίηση Γενετική τροποποίηση Επιθυμητό γονίδιο Εμπορική ποικιλία Νέα ποικιλία (μόνο το επιθυμητό γονίδιο μεταφέρεται) = (εισαγωγή γονιδίου) Επιθυμητό γονίδιο 4

Τι είναι γονίδιο Τα γονίδια καθορίζουν τα χαρακτηριστικά ή τη γενετική σύνθεση, κάθε ζωντανού οργανισμού. Δηλαδή, στα γονίδια υπάρχουν οι πληροφορίες για όλα τα χαρακτηριστικά που μπορεί να κληρονομήσει ένας οργανισμός. Τα γονίδια αποτελούνται από DNA. Δομική μονάδα του DNA είναι τα νουκλεοτίδια. Ο αριθμός των νουλεοτιδίων και η διάταξή τους καθορίζουν την ταυτότητα ενός γονιδίου. Η διάταξη των νουκλεοτιδίων στο γονίδιο έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή μίας συγκεκριμένης πρωτεΐνης, η οποία δημιουργεί ποικίλα χαρακτηριστικά στο κύτταρο και κατ επέκταση στον οργανισμό. Δομική μονάδα των πρωτεϊνών είναι τα αμινοξέα. 5

Κλωνοποίηση (gene cloning) Κλωνοποίηση είναι ο πολλαπλασιασμός ενός τμήματος DNA μέσα στον ίδιο ή σε διαφορετικό ξενιστή και η μεταφορά του στην επόμενη γενιά. Τα βασικά βήματα στην κλωνοποίηση περιλαμβάνουν: Ένα τμήμα DNA, που περιέχει το γονίδιο προς κλωνοποίηση, τοποθετείται σ έναν φορέα και προκύπτει μια χίμαιρα ή αλλιώς ένα μόριο ανασυνδυασμένου DNA. Ο φορέας τοποθετείται στο κύτταρο ενός οργανισμού (συνήθως κάποιο βακτήριο), όπου μπορεί να πολλαπλασιαστεί παράγοντας αντίγραφα του εαυτού του. Όταν το κύτταρο του οργανισμού πολλαπλασιάζεται, αντίγραφα του φορέα μεταβιβάζονται στην επόμενη γενιά, όπου συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται. Μετά από αλλεπάλληλες διαιρέσεις δημιουργείται μια αποικία ή κλώνος από όμοια κύτταρα του οργανισμού, που όλα περιέχουν ένα ή περισσότερα αντίγραφα του ανασυνδυασμένου DNA. 6

Σημασία της κλωνοποίησης Επιτρέπει την παραγωγή ενός γονιδίου απομονωμένου από όλα τα υπόλοιπα γονίδια του οργανισμού Έτσι είναι δυνατή η μελέτη του γονιδίου, όπως Ο καθορισμός της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του και ο καθορισμός της αλληλουχίας των αμινοξέων, δηλαδή της παραγόμενης πρωτεΐνης 7

Απαιτήσεις για την κλωνοποίηση Ένας φορέας του DNA ικανός να εισέρχεται στο κύτταρο ενός οργανισμού ξενιστή, όπου να αναπαράγεται. Τέτοιοι φορείς είναι τα πλασμίδια και οι βακτηριοφάγοι ιοί. Τα πλασμίδια είναι κυκλικά μόρια DNA που βρίσκονται μέσα σε βακτήρια και μπορούν να πολλαπλασιάζονται ανεξάρτητα μέσα σε αυτά. Οι βακτηριοφάγοι ιοί προσβάλουν βακτήρια εισάγοντας το DNA τους στο κύτταρο του βακτηρίου, όπου πολλαπλασιάζεται. Εξειδικευμένα «εργαλεία» και τεχνικές για την απομόνωση (τεμαχισμός) του επιθυμητού DNA και την τοποθέτησή (επανένωση) του DNA στον φορέα. 8

Περιοριστικά ένζυμα (restriction enzymes) Τα περιοριστικά ένζυμα ή ενδονουλεάσες προέρχονται από βακτήρια και αποτελούν μέρος ενός συστήματος που επιτρέπει στα βακτήρια να ελέγχουν εισερχόμενο DNA και να το καταστρέφουν - περιορίζουν Οι ενδονουλεάσες ταξινομούνται σε 4 κυρίως ομάδες, ανάλογα με την αλληλουχία αναγνώρισης και τομής, τον αριθμό των υπομονάδων, την αναγκαιότητα παροχής ενέργειας και συνεζύμων. Οι περιοριστικές ενδονουλεάσες της ομάδας ΙΙ είναι τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται στους γονιδιακούς χειρισμούς. Αναγνωρίζουν μια συγκεκριμένη αλληλουχία και κόβουν τη δίκλωνη αλυσίδα του DNA δημιουργώντας διακριτά τμήματα DNA ορισμένου μεγέθους και αλληλουχίας άκρων. 9

Ενδονουκλεάσες της ομάδας ΙΙ Η ονοματολογία τους βασίζεται στο βακτήριο από το οποίο προέρχονται με το πρώτο γράμμα του γένους και τα δύο πρώτα του είδους. Για κάθε νέο περιοριστικό ένζυμο δίνεται μετά τα γράμματα ένας αριθμός με λατινική μορφή. πχ το ένζυμο AluI, είναι το πρώτο που απομονώθηκε από το βακτήριο Arthrobacter luteus Αν προέρχεται από συγκεκριμένο στέλεχος τότε παρεμβάλλεται μεταξύ των τριών γραμμάτων και του λατινικού αριθμού ένα γράμμα ή ένας αριθμός που υποδηλώνει το συγκεκριμένο βακτηριακό στέλεχος πχ το ένζυμο EcoRI, E Escherichia γένος co coli είδος R RY13 στέλεχος I το πρώτο που απομονώθηκε από το στέλεχος R του βακτηρίου 10

Ενδονουκλεάσες της ομάδας ΙΙ Αναγνωρίζουν μια συγκεκριμένη αλληλουχία που αποτελείται από τέσσερα, έξι, οκτώ ή δέκα νουλεοτίδια, συνήθως παλίνδρομα. Η αλληλουχία αυτή λέγεται θέση αναγνώρισης (restriction site). Η αλληλουχία είναι παλίνδρομη: είναι ίδια και στις δύο αλυσίδες του DNA όταν διαβάζεται στην ίδια κατεύθυνση. 11

Θέση περιορισμού συμμετρική ως προς τον άξονα που περνά από το μέσο της. Στην εικόνα φαίνεται η θέση αναγνώρισης της EcoRI. Η αλληλουχία είναι παλίνδρομη: ίδια και στις δύο αλυσίδες του DNA όταν διαβάζεται στην ίδια κατεύθυνση (στο παράδειγμα αυτό είναι 5 GAATTC 3 ). ΕΙΚΟΝΑ 16.1 igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 12

13

Παραδείγματα του τρόπου με τον οποίο τα ένζυμα περιορισμού κόβουν το DNA. (α) To SmaI δημιουργεί λεία άκρα (blunt ends). (β) To BamHI δημιουργεί προεξέχοντα 5 μονόκλωνα (κολλώδη) άκρα (sticky ends). (γ) To PstI δημιουργεί προεξέχοντα 3 μονόκλωνα (κολλώδη) άκρα. ΕΙΚΟΝΑ 16.2 igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 14

Τεμαχισμός ή πέψη του DNA (digestion) Τέλεια (ολική-πλήρης) πέψη: DNΑ Α Β Γ Δ Α Μερική πέψη: Β Β Γ Γ Δ DNΑ Α Β Γ Δ Α Α Α Β Β Β Γ Γ Γ Δ Δ Δ 15

Μονάδα ενζύμου (Unit) Η ποσότητα ενζύμου, που χρειάζεται για να κοπεί πλήρως 1μg υποστρώματος DNA σε μία ώρα και σε όγκο 50μl στην κατάλληλη θερμοκρασία (συνήθως 37 0 C) in vitro. Τα ένζυμα για να δράσουν χρειάζονται βέλτιστες συνθήκες, π.χ. θερμοκρασία, ph, συγκέντρωση γλυκερόλης, κλπ. Ισοσχιζομερή ένζυμα Διαφορετικά ένζυμα που αναγνωρίζουν και κόβουν την ίδια αλληλουχία 16

5 AG CT 3 3 TC GA 5 AluI (Arthrobacter luteus) 5 G GATCC 3 3 C CTAG G 5 BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) 5.G AATTC 3 3.CTTAA G 5 EcoRI (Echerichia coli R) 5 TTAATT AA 3 3 AATT AATT 5 Pacl (Pseudomonas alcaligenes) 5 TCATCG AATTCGAGATGAAGAG CTCTTGCAATTG GATCCGGCCGAA 3 3 AGTAGCTTAA GCTCT ACTT CTC GAGAACGTTAACCTAG GCCGGCTT 5 TCATCG AATTCGAGATGAAGAG CTCTTGCAATTG GATCCGGCCGAA AGTAGCTTAA GCTCT ACTT CTC GAGAACGTTAACCTAG GCCGGCTT 17

Διαχωρισμός τμημάτων DNA με ηλεκτροφόρηση (DNA electrophoresis) Προετοιμασία δίσκου (tray) Πηχτή αγαρόζης (agarose gel) Τοποθέτηση χτένας (comb) για δημιουργία πηγαδιών (wells) 18

Προσθήκη κατάλληλου υγρού (buffer) Γέμισμα πηγαδιών με το DNA (loading) Ηλεκτροφόρηση DNA (electrophoresis) 19

20

Σήμανση DNA με βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) και τοποθέτηση πηχτής σε επιφάνεια με φως UV Μέγεθος 21

22

igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 23

igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 24

igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 25

Μέγεθος τμημάτων DNA Εξαρτάται από τον αριθμό βάσεων της θέσης περιορισμού 5 AG CT 3 3 TC GA 5 AluI (Arthrobacter luteus) μια θέση ανά 256 βάσεις (1/4) 4 Κατά μ.ο. τεμάχια των 256 βάσεων 5 G GATCC 3 3 C CTAG G 5 BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) μια θέση ανά 4096 βάσεις (1/4) 6 Κατά μ.ο. τεμάχια των 4096 βάσεων 26

Ένωση τμημάτων DNA Ένζυμο: Τ4 DNA λιγάση (DNA ligase) ενώνει ανεξάρτητα με το μέγεθος και την προέλευση άκρα από την περιοχή αναγνώρισης ή τεχνητά άκρα, αν προεξέχουν πρέπει να είναι συμβατά 27

Ένωση με T4 DNA λιγάση Τυφλά (λεία) άκρα: 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 xίμαιρα DNA Προεξέχοντα συμβατά άκρα: 5 3 3 CTAG 5 5 GATC 3 3 5 5 3 GATC CTAG 3 5 xίμαιρα DNA 28

Φορείς κλωνοποίησης - Πλασμίδια Πλασμίδια DNA πλασμίδιο βακτήριο 29

Πλασμίδιο Θέση αναγνώρισης περιοριστικού ενζύμου αρχή αντιγραφής γονίδιο μάρτυρας 30

Ανασυνδυασμένο μόριο DNA (recombinant) Θέση αναγνώρισης περιοριστικού ενζύμου G A T A A T T C T A C G Πέψη με ένζυμο περιορισμού A A T G T A A T T C G C πλασμίδιο ανοιχτό πλασμίδιο A A T T C G T T A A T T A A C G T T A A ξένο γονίδιο ανασυνδυασμένο DNA 31

Μεταμόρφωση βακτηρίου (transformation) DNA R πλασμίδιο βακτήριο 32

Ο πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης puc19. Το πλασμίδιο αυτό φέρει μια θέση έναρξης της αντιγραφής (ori), τον δείκτη επιλογής amp R και έναν πολυσυνδέτη που εδράζεται στο τμήμα άλφα του γονιδίου της β- γαλακτοζιδάσης, lacz +. ΕΙΚΟΝΑ 16.4 igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 33

Ένθεση ενός τμήματος DNA στον πλασμιδιακό φορέα κλωνοποίησης puc19 και δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου μορίου DNA. ΕΙΚΟΝΑ 16.5 igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 34

Έλεγχος μεταμόρφωσης (screening) Άγαρ Αμπικιλλίνη X-gal Αποικίες βακτηρίων μόνο με το πλασμίδιο Αποικίες μεταμορφωμένων βακτηρίων 35

Μέγεθος εισαγόμενου DNA Θέση αναγνώρισης περιοριστικού ενζύμου CTGCAG GACGTC αρχή αντιγραφής γονίδιο μάρτυρας Μέγεθος εισαγόμενου «ξένου» DNA μερικών δεκάδων έως χιλιάδων βάσεων Όσο μικρότερο τόσο ευκολότερο να μετασχηματίσει ένα βακτήριο (10-100 φορές μεγαλύτερη πιθανότητα για το μικρότερο) Σε ετερογενή πληθυσμό τα μικρά ανασυνδυασμένα εισέρχονται ευκολότερα 36

Γονιδιωματική βιβλιοθήκη (Gene bank) Στη γονιδιωματική βιβλιοθήκη το σύνολο του γενώματος του φυτού, αφού τεμαχιστεί με κατάλληλα περιοριστικά ένζυμα, μέσω ανασυνδυασμένων πλασμιδίων διατηρείται σε μεταμορφωμένα βακτήρια. Στόχος: Τεμαχισμός του γονιδιώματος σε τμήματα με κατάλληλο μέγεθος και άκρα Μειονεκτήματα: Ένα τμήμα που μας ενδιαφέρει ή ένα γονίδιο μπορεί να κόβεται Μεγάλες περιοχές χωρίς θέσεις αναγνώρισης από το ένζυμο Θέσεις αναγνώρισης πολύ κοντά 37

Μέγεθος τμημάτων DNA : εξαρτάται από τον αριθμό βάσεων της θέσης περιορισμού περιοριστική θέση 6 βάσεων περιοριστική θέση 4 βάσεων Χρησιμοποιούνται ένζυμα 4 βάσεων με μερική πέψη για να εξασφαλιστεί αντιπροσώπευση των ενδιαφερόμενων τμημάτων 38

Γονιδιωματική Βιβλιοθήκη Απαιτούμενος αριθμός κλώνων: Arabidopsis thaliana Μέγεθος γονιδιώματος: Μέσο μέγεθος κλώνου: 1,2 x 10 8 βάσεις 15.000 βάσεις Ελάχιστος αριθμός κλώνων: n=1,2 x 10 8 / 15.000 = 8 x 10 3 Πρακτικά, για να μη παραληφθεί κανένα τμήμα του γενώματος ο αριθμός των απαιτούμενων κλώνων είναι πενταπλάσιος 39

Μέγεθος γονιδιώματος και απαιτούμενος αριθμός κλώνων Οργανισμός Μέγεθος γονιδιώματος (αρ. βάσεων) Μέσο μέγεθος κλώνου (αρ. βάσεων) Αντιπροσώπευση (τουλάχιστο) Αριθμός κλώνων που αντιπροσωπεύουν τη βιβλιοθήκη Ζύμη 1,35 x 10 7 4.500 Arabidopsis thaliana 1,2 x 10 8 40.000 Drosophila 1,8 x 10 8 60.000 Καπνός 1,6 x 10 9 500.000 Ποντικός 2,3 x 10 9 15.000 x 5 750.000 Άνθρωπος 2,8 x 10 9 950.000 Xenopus 3,0 x 10 9 1.000.000 Σιτάρι 5,5 x 10 9 1.800.000 Καλαμπόκι 1,5 x 10 10 5.000.000 40

cdna βιβλιοθήκη γονίδιο intron exon pre-mrna μεταγραφή mrna αποκοπή introns cdna αντίστροφη μεταγραφή 41

ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ mrna ΑΑΑΑΑΑ υβριδισμός με ολιγοθυμίνη ΤΤΤΤΤΤΤ ΑΑΑΑΑΑ αντίστροφη μεταγραφάση ΤΤΤΤΤΤΤ ΑΑΑΑΑΑ απομάκρυνση του mrna ΤΤΤΤΤΤΤ cdna DNA πολυμεράση ΤΤΤΤΤΤΤ ΑΑΑΑΑΑ 42

cdna ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Σε δεδομένη φάση και συγκεκριμένο ιστό από το σύνολο των γονιδίων εκφράζονται περίπου το 30%. Από το σύνολο των μηνυμάτων στο κύτταρο (αριθμό mrna): το 40% με μικρή συχνότητα (15 αντίγραφα mrna/κύτταρο) το 25% με μέση συχνότητα (300-3.000 αντίγραφα mrna/κύτταρο) το 35% με μεγάλη συχνότητα περίπου (10.000-100.000 αντίγραφα mrna/κύτταρο) 43

Απαιτούμενος αριθμός κλώνων: Arabidopsis thaliana cdna ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ Από το σύνολο των 20.000 γονιδίων εκφράζονται περίπου 6.000: 5.000 με μικρή συχνότητα 50-1000 με μέση συχνότητα 1-20 με υψηλή συχνότητα Ελάχιστος αριθμός: n=5.000 / 0,40 = 12.500 Απαιτούμενος αριθμός: n= ln(1-p) ln(1-0,99) = = 57.500 ln(1-1/n) ln(1-1/12.500) 44

Αναλογική cdna βιβλιοθήκη (περιέχει όλα τα cdna στην ίδια αναλογία cdna υβριδίζεται με γονιδιωματικό μονόκλωνο DNA cdna που υβριδίζονται γίνονται δίκλωνα κλωνοποίηση σε φορέα Απαιτούμενος αριθμός: n= ln(1-p) ln(1-1/n) ln(1-0,99) = = 27.630 ln(1-1/6.000) 45