ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και οι εφαρμογές της...
Γενετική Μηχανική o Περιλαμβάνει όλες τις τεχνικές με τις οποίες μπορούμε να επεμβαίνουμε στο γενετικό υλικό των οργανισμών. o Μία από τις τεχνικές αυτές είναι η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA με την οποία παράγονται μόρια DNA τα οποία είναι προϊόντα συνένωσης γενετικού υλικού από διαφορετικούς οργανισμούς.
Μεταφορά γενετικού υλικού από οργανισμό-δότη σε βακτήρια Στάδια: 1. Κατασκευή του ανασυνδυασμένου DNA. 2. Μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων. 3. Επιλογή και απομόνωση μετασχηματισμένων βακτηρίων. Από αυτά, επιλογή και απομόνωση των κλώνων στους οποίους ο φορέας κλωνοποίησης φέρει ανασυνδυασμένο DNA. 4. Εντοπισμός κλώνου με επιθυμητή αλληλουχία DNA.
«Εργαλεία» της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA 1. Περιοριστικές ενδονουκλεάσες 2. Φορείς κλωνοποίησης: o Πλασμίδια που είναι κατάλληλα για την ενσωμάτωση μορίων DNA μικρού μήκους. o DNA βακτηριοφάγων για την ενσωμάτωση μορίων DNA μεγάλου μήκους.
Περιοριστικές ενδονουκλεάσες o Ένζυμα που παράγονται από βακτήρια. o Ο φυσιολογικός τους ρόλος είναι να καταστρέφουν το DNA των βακτηριοφάγων που έχουν εισέλθει σε αυτά. o Αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων και τις κόβουν σε συγκεκριμένα σημεία. o Ο τρόπος δράσης τους επιτρέπει τη χρησιμοποίησή τους ως «μοριακών μαχαιριών».
Πλασμίδια ως φορείς κλωνοποίησης o Αντιγράφονται ανεξάρτητα από το κύριο γενετικό υλικό του βακτηρίου. o Διαθέτουν ειδικές θέσεις αναγνώρισης για διάφορες περιοριστικές ενδονουκλεάσες, στις οποίες μπορεί να παρεμβληθεί το τμήμα του DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί. o Περιέχουν τουλάχιστον ένα γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό.
Μετασχηματισμός βακτηρίων Για να μπορέσουν τα βακτήρια να μετασχηματιστούν, πρέπει: o να είναι κατάλληλα δηλαδή ευαίσθητα σε αντιβιοτικά, o να έχουν υποστεί προετοιμασία ώστε τα τοιχώματά τους να γίνουν διαπερατά στο ανασυνδυασμένο DNA.
Επιλογή και απομόνωση μετασχηματισμένων βακτηρίων o Τα μετασχηματισμένα βακτήρια, ανεξάρτητα από το αν έχουν λάβει ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ή όχι, επιβιώνουν σε θρεπτικό μέσο παρουσία αντιβιοτικού, καθώς περιέχουν το σχετικό γονίδιο ανθεκτικότητας. o Από τα μετασχηματισμένα βακτήρια, αυτά που έχουν λάβει ανασυνδυασμένα πλασμίδια δεν παράγουν χρωστική ή δεν επιβιώνουν μετά την προσθήκη δεύτερου αντιβιοτικού στο θρεπτικό μέσο διότι το σχετικό γονίδιο έχει καταστραφεί από την παρεμβολή του ξένου γενετικού υλικού.
Η γονιδιωματική βιβλιοθήκη o Η τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA επιτρέπει την κοπή του γονιδιώματος ενός οργανισμού και την εισαγωγή καθενός από τα τμήματα που προκύπτουν σε βακτήρια με τη μεσολάβηση πλασμιδίων. o Με την καλλιέργεια αυτών των βακτηρίων προκύπτουν κλώνοι βακτηρίων. o Το σύνολο των κλώνων αποτελεί τη γονιδιωματική βιβλιοθήκη.
Προβλήματα γονιδιωματικής βιβλιοθήκης Η γονιδιωματική βιβλιοθήκη παρέχει την πλήρη εικόνα του γονιδιώματος ενός οργανισμού, αλλά: o δεν δίνει πληροφορίες για το ποια γονίδια εκφράζονται σε κάθε ιστό του οργανισμού. o δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την κλωνοποίηση ασυνεχών γονιδίων με σκοπό την παραγωγή των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν δεδομένου ότι τα εσώνια δεν μπορούν να εντοπιστούν και να αποκοπούν από τα βακτήρια.
Η cdna βιβλιοθήκη Η cdna βιβλιοθήκη επιλύει τα προβλήματα της γονιδιωματικής διότι αποτελείται από κλώνους βακτηρίων που περιέχουν μόρια DNA συμπληρωματικά ώριμων μορίων mrna, τα οποία απομονώνονται από συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους.
Κατασκευή cdna βιβλιοθήκης 1. Απομονώνεται το ολικό mrna του κυττάρου συγκεκριμένου κυτταρικού τύπου και υφίσταται την επίδραση της αντίστροφης μεταγραφάσης. 2. Το υβριδικό μόριο που παράγεται αποδιατάσσεται. 3. Το cdna που αποσπάται υφίσταται την επίδραση της DNA πολυμεράσης για να συντεθεί η συμπληρωματική αλυσίδα. 4. Το δίκλωνο DNA ενσωματώνεται σε πλασμίδια και μεταφέρεται σε βακτήρια.
Ανίχνευση κλώνων o Ο εντοπισμός συγκεκριμένης αλληλουχίας νουκλεοτιδίων γίνεται με τη βοήθεια των μορίων ανιχνευτών. o Οι ανιχνευτές είναι μονόκλωνες αλυσίδες DNA ή RNA που έχουν επισημανθεί με ραδιενέργεια ή φθορίζουσες χρωστικές. o Η σύνδεση με τη συμπληρωματική αλληλουχία ονομάζεται υβριδοποίηση και έπεται της αποδιάταξης των δίκλωνων μορίων DNA.
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) H παραγωγή πολυάριθμων αντιγράφων μιας αλληλουχίας DNA επιτυγχάνεται: 1. Με την κλωνοποίησή της στη γονιδιωματική και cdna βιβλιοθήκη. 2. Με την τεχνική PCR που επιτρέπει την επιλεκτική αντιγραφή μιας αλληλουχίας DNA εκατομμύρια φορές, χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανών κυττάρων.
Εφαρμογές PCR o Διάγνωση ασθενειών o Αύξηση ευαισθησίας γενετικών αναλύσεων o Εγκληματολογία o Απολιθώματα