ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ. Γεωγραφική διαφοροποίηση και. γενετική ποικιλότητα πληθυσμών χερσόβιων ισοπόδων.

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ Γεωγραφική διαφοροποίηση και γενετική ποικιλότητα πληθυσμών χερσόβιων ισοπόδων. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μαρία Καμηλάρη Βιολόγος, M.Sc. ΠΑΤΡΑ, ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ 2015

UNIVERSITY OF PATRAS DEPARTMENT OF BIOLOGY DIVISION OF ANIMAL BIOLOGY Geographic differentiation and genetic diversity of terrestrial isopods populations PhD Thesis Maria Kamilari Biologist, MSc. Patras, September 2015

Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο 202. 4

Η εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής χρηματοδοτήθηκε μερικώς από το πρόγραμμα Καραθεοδωρή C567 της Επιτροπής Ερευνών του Πανεπιστημίου Πατρών, για το χρονικό διάστημα από 7/2010 έως 12/2011. 5

Σε όλους όσους με βοήθησαν, ταλαιπωρήθηκαν και χάρηκαν μαζί μου... 6

ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Science never solves a problem without creating ten more. GEORGE BERNHARD SHAW Επιστήμη... ποτέ δε λύνει ένα πρόβλημα χωρίς να δημιουργήσει 10 καινούρια. GEORGE BERNHARD SHAW 7

Θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, κα Έλενα Κλώσσα- Κίλια, κ. Γιώργο Κίλια και κ. Σπύρο Σφενδουράκη για την εμπιστοσύνη που μου έδειξαν και την ελευθερία με την οποία μου επέτρεψαν να εργάζομαι στο εργαστήριο, να οργανώσω την έρευνά μου και να φέρω εις πέρας το θέμα της διατριβής μου. Επίσης ευχαριστώ τους Δρ. Σίνο Γκιώκα, Δρ. Βασίλη Χονδρόπουλο, Δρ. Άρη Παρμακέλη και Δρ. Νίκο Πουλακάκη που δέχτηκαν να συμμετέχουν στην 7μελή εξεταστική μου επιτροπή. Στο πλαίσιο της ερευνητικής μου εργασίας είχα την τύχη να εργάζομαι τόσο στο εργαστήριο Ζωολογίας όσο και στο εργαστήριο Γενετικής. Ως εκ τούτου είχα την ευκαιρία να συνεργαστώ με πολλούς ανθρώπους διαφορετικών αντικειμένων, να μάθω πολλά από αυτούς και να περάσουν πολύ ευχάριστα όλα αυτά τα χρόνια... Ελπίζοντας λοιπόν να μην ξεχνώ κανέναν, ευχαριστώ για το ευχάριστο κλίμα, τα αμέτρητα γέλια, τα ομαδικά ξενύχτια στο εργαστήριο και όλες τις στιγμές που περάσαμε μαζί το Μιχάλη Ροβάτσο, το Στέφανο Μαρτιμιανάκη, το Γιώργο Τρυφωνόπουλο, τη Χαρά Παπαϊωάννου, τη Χριστίνα Κασσάρα, την Εβίτα Πίττα, τον Ονούφριο Μεττούρη, την Όλγα Τζωρτζακάκη, τη Σπυριδούλα Κράιτσεκ, το Γιάννη Τσιρώνη, την Ανδριάννα Σταμοπούλου, τη Γωγώ Γουβη, την Άρτεμις Μιχαήλ, τον Περικλή Παγκάνο. Ευχαριστώ θερμά για την εμπιστοσύνη και τη συνεργασία σε ερευνητικά προγράμματα και εργασίες τους Δρ. Στέφανο Νταϊλιάνη, Δρ. Σίνο Γκιώκα, Δρ. Βασίλη Χονδρόπουλο, Δρ. Στέλλα Φραγγεδάκη, Δρ. Κώστα Φλυτζάνη και τη Δρ. Ιωάννα Ντάικου. Ένα μόνο ευχαριστώ δεν είναι αρκετό για τη Δρ. Νίνα Φραγκοπούλου και Δρ. Κώστα Φλυτζάνη που σε διαφορετικές χρονικές αλλά πολύ σημαντικές στιγμές ήταν συνεχώς παρόντες με τις συμβουλές και την καθοδήγηση τους σε πληθώρα προβληματισμών και διλλημάτων όλα αυτά τα χρόνια. Ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω τον Dr. Jerome Murienne και Mr. Pierre Solbes για πολύτιμες συμβουλές στο πλαίσιο της ανάλυσης των δεδομένων της διατριβής μου, καθώς και για την απομακρυσμένη πρόσβαση στις εγκαταστάσεις πληροφορικής και υπολογιστών του εργαστηρίου Laboratoire Evolution et Diversite Biologique στην Τουλούζη της Γαλλίας. Χωρίς την πολύτιμη βοήθειά τους ένα σημαντικό μέρος των αναλύσεων δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τον Dr. Stefano Taiti για την αποστολή δειγμάτων Trachelipus από την Ιταλία. Ευχαριστώ από καρδιάς τη συντονίστρια κα Ελένη Κουμούτσου και τον Δρ. Γρηγόρη Ιατρού πρόεδρο του Φορέα Διαχείρισης Χελμού-Βουραϊκού όπου εργάζομαι από τον Απρίλιο του 2013, για την εξαιρετική συνεργασία και την κατανόησή τους 8

όλο αυτό το διάστημα, που συνέβαλλαν ουσιαστικά στην ολοκλήρωση του Διδακτορικού μου. Δε θα μπορούσα να παραλείψω τους γονείς μου Θανάση και Ευαγγελία, την αδερφή μου Ελένη και φυσικά τη γιαγιά μου Μαίρη που τόσα χρόνια με στηρίζουν ηθικά, ψυχολογικά και οικονομικά. Ξέρω πως κάνουν τα θέλω μου θέλω τους ακόμα και όταν δεν το πολυθέλουν Τέλος θέλω να ευχαριστήσω το Δημήτρη Δόγανο που χωρίς τη βοήθεια και την αμέριστη συμπαράστασή του από το ξεκίνημα της διατριβής μου τίποτα δε θα ήταν δυνατό! Η βοήθειά του στις δειγματοληψίες ανά την Ελλάδα, οι πολύτιμες συζητήσεις και προτάσεις και η συνεχής του στήριξη ήταν κάτι περισσότερο από καθοριστικά για το οτιδήποτε έχω καταφέρει τα τελευταία έξι και πλέον χρόνια. Ο καλός του λόγος και η ανοιχτή του αγκαλιά ήταν όλα αυτά τα χρόνια το αγχολυτικό μου. 9

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ...15 ABSTRACT...19 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ...23 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ...23 1. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ...24 1.1. Εξελικτική Ταξινομική (Evolutionary Taxonomy)...24 1.2. Φαινετική ή Αριθμητική Ταξινομική (Phenetic or Arithmetic Taxonomy)...25 1.3. Φυλογενετική ή Κλαδιστική Ταξινομική (Phylogenetic or Cladistic Taxonomy)...25 2. ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΤΗΣ ΟΜΑΔΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ...27 Είδος...27 Βιολογικός ορισμός του είδους (Biological species concept) (Mayr 1942)....27 Εξελικτικός ορισμός του είδους (Evolutionary species concept) (Meglitsch 1954, Simpson 1961)...27 Φυλογενετικός ορισμός του είδους (Phylogenetic species concept) (Cracraft 1989)....28 Μορφολογικός ορισμός του είδους (Simpson 1961)...28 3. ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΤΗΣ ΦΥΛΟΓΕΝΕΣΗΣ...29 Χαρακτήρας...29 Ομοπλασία...29 Πλησιομορφία...29 Απoμορφία...29 Μονοφυλετική ομάδα / μονοφυλετικός κλάδος...30 Παραφυλετική ομάδα...30 Αδελφά είδη...30 Φυλογενετικό δένδρο...30 Κλαδόγραμμα...30 10

4. ΦΥΛΟΓΕΝΕΣΗ - ΦΥΛΟΓΕΩΓΡΑΦΙΑ - ΓΕΩΓΡΑΦΙΚΗ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ...31 4.1. Μοριακοί δείκτες...34 4.1.1.Το μιτοχρονδιακό DNA...35 4.1.2. Πυρηνικοί δείκτες...38 4.2. Μοριακό ρολόι - Χρονολόγηση κλάδων...40 5. ΠΑΛΑΙΟΓΕΩΓΡΑΦΙΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΓΕΩΛΟΓΙΑΣ ΠΑΛΑΙΟΚΛΙΜΑ.43 5.1. Γεωδυναμική και γεωτεκτονική εξέλιξη του αλπικού συστήματος στον ελληνικό χώρο...47 5.1.1. Παλαιογεωγραφική εξέλιξη των Ελληνίδων ζωνών...48 5.2. Διαμόρφωση του ελλαδικού χώρου...50 5.2.1. Η περιοχή της Ροδόπης...50 5.2.2 Ανατολική ηπειρωτική Ελλάδα, δυτικές Κυκλάδες, Εύβοια....50 5.2.3. Νότιο Αιγαίο - Πελοπόννησος...52 5.2.4. Η περιοχή του Αιγαίου...61 5.3. Διαμόρφωση του ελλαδικού χώρου κατά το Πλειστόκαινο (2,58 0,0117 mya)...62 5.4. Παλαιοκλίμα...67 6. ΓΕΝΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΞΗ ΤΩΝ ΙΣΟΠΟΔΩΝ...70 6.1. Ιστορικά στοιχεία και στοιχεία εξέλιξης...70 6.2. Τα Χερσαία Ισόποδα...70 6.2.1. Εξωτερική μορφολογία...72 6.3. Γενικά περί Οικολογίας Και Βιολογίας του γένους Trachelipus Budde- Lund, 1908...73 6.3. Γενικά περί Οικολογίας Και Βιολογίας του γένους Trachelipus Budde- Lund, 1908...74 6.3.1. Οικολογία...74 6.3.2. Αναπαραγωγή Ανάπτυξη...75 6.4. Συστηματική - γεωγραφική κατανομή...77 6.5. Διαγνωστικοί Χαρακτήρες Του Γένους Trachelipus...81 11

6.5.1. Κυριότεροι διαγνωστικοί χαρακτήρες μεταξύ των ειδών Trachelipus....81 7. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΠΡΟΒΛΗΜΑ...86 Β. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ...89 1. ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ...90 2. ΤΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΑ ΓΟΝΙΔΙΑ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ...96 2.1. Τα μιτοχονδριακά γονίδια της μελέτης...96 2.2. Το πυρηνικό γονίδιο της μελέτης...97 3. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ...99 3.1. Πειραματική Πορεία...99 3.1.1. Εξαγωγή Ολικού DNA...99 3.1.2. Ηλεκτροφόρηση Ολικού DNA...101 3.1.3. Πολλαπλασιασμός συγκεκριμένων τμημάτων DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)...102 3.1.4. Καθαρισμός του πολλαπλασιασμένου τμήματος των γονιδίων COI, 16S rrna και NaK ATPase...106 3.1.5. Καθορισμός της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων των επιλεγμένων τμημάτων των μιτοχονδριακών γονιδίων (Sanger sequencing)...107 4. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ...109 4.1. Στοίχιση Αλληλουχιών...109 4.2. Επεξεργασία των Στοιχισμένων Αλληλουχιών...110 4.3. Έλεγχος Δεδομένων για Ομοπλασία και Κορεσμό...111 4.4. Υπολογισμός Γενετικής Ποικιλότητας και Καθορισμός Απλοτύπων...113 4.4.1. Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων...113 5. ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΑΙΝΕΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ...115 5.1. Επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης...115 5.2. Ανεξάρτητη ή συνδυασμένη ανάλυση...116 5.3. Η μέθοδος της Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony)...120 5.4. Η μέθοδος της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood)...121 5.5. Μπεϊεσιανή συμπερασματολογία...122 12

6. ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΧΡΟΝΩΝ ΑΠΟΣΧΙΣΗΣ...125 6.1. Ανάλυση μοριακού ρολογιού...125 6.2. Υπολογισμός χρόνου απόσχισης κλάδων...125 6.2.1. H περίπτωση του Αιγαίου (Kamilari et al. 2014)...125 6.2.2. Το γένος Trachelipus στην ηπειρωτική και νησιωτική Ελλάδα...127 6.3. Σύγκριση και επιλογή του πιθανότερου σεναρίου...129 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...131 1. Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΟΥ ΑΙΓΑΙΟΥ...132 Γενικά στοιχεία...132 1.2. Γενετικές αποστάσεις...136 1.3. Φυλογενετικές αναλύσεις...138 1.4. Εκτίμηση χρόνων απόσχισης...138 2. ΤΟ ΓΕΝΟΣ TRACHELIPUS ΣΤΗΝ ΗΠΕΙΡΩΤΙΚΗ ΚΑΙ ΝΗΣΙΩΤΙΚΗ ΕΛΛΑΔΑ...145 2.1. Γενικά στοιχεία...145 2.1.1. Μιτοχονδριακό και πυρηνικό DNA...145 2.2. Γενετικές αποστάσεις...154 2.3. Φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των μελετηθέντων ειδών και σύγκριση των προτύπων των φυλογενετικών αναλύσεων...157 2.3.1. Μιτοχονδριακό DNA...157 2.3.2. Πυρηνικό DNA...164 2.3.3. Συνδυασμένη ανάλυση πυρηνικού και μιτοχονδριακών γενετικών τόπων...170 2.4. Εκτίμηση χρόνων απόσχισης...177 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ...183 1. ΠΛΗΘΟΣ ΑΠΛΟΤΥΠΩΝ...184 2. ΚΟΡΕΣΜΟΣ ΚΑΙ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΩΝ ΚΑΙ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ...185 3. ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ...187 3.1. Διαφοροποίηση του γενετικού τόπου 16S rrna...187 3.2. Διαφοροποίηση του γενετικού τόπου COI...188 13

3.3. Διαφοροποίηση του γενετικού τόπου NaK ATPase...189 4. ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ...191 4.1. Σύγκριση των προτύπων του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού DNA...191 4.2. Φυλογενετικές σχέσεις...193 5. ΦΥΛΟΓΕΩΓΡΑΦΙΚΟ ΠΡΟΤΥΠΟ ΚΑΙ ΧΡΟΝΟΙ ΑΠΟΣΧΙΣΗΣ ΕΞΕΛΙΚΤΙΚΩΝ ΚΛΑΔΩΝ...196 5.1. Trachelipus squamuliger...197 5.2. Trachelipus aegaeus - Trachelipus cavaticus...198 5.3. Trachelipus n. sp...202 5.4. Trachelipus palustris και Trachelipus arcuatus...203 5.4.1. Η περίπτωση της βόρειας Εύβοιας και της χερσονήσου της Μαγνησίας....206 5.4.2. Η περίπτωση της ευρύτερης περιοχής του Χελμού (Βουραϊκός Σόλος-Μανεσαίικος-Χελμός-Πλανητέρο- Φενεός)...208 5.5. Trachelipus camerani...211 5.6. Διαφοροποίηση εντός των βασικών φυλογενετικών κλάδων...212 6. ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...214 Ε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...221 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I...250 14

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα χερσόβια ισόποδα (Oniscidea) αντιπροσωπεύουν έναν μονοφυλετικό κλάδο της τάξης ισοπόδων (Crustacea, Malacostraca, Peracarida). Είναι η μόνη ομάδα καρκινοειδών που έχουν πλήρως προσαρμοστεί να ζουν στη στεριά, με εξάπλωση σε όλα τα ενδιαιτήματα. Εμφανίζονται από το επίπεδο της θάλασσας έως και σε ψηλά υψόμετρα, από τα δάση μέχρι και στις ερήμους, με εξαίρεση τις πολικές περιοχές. Η πλειοψηφία των χερσόβιων ισοπόδων χρειάζεται ένα υψηλό βαθμό υγρασίας του αέρα για την επιβίωσή της, εξαιτίας της περιορισμένης δυνατότητάς τους να διατηρήσουν το νερό. Το γένος Trachelipus περιλαμβάνει σχετικά στενόοικους οργανισμούς οι οποίοι διαβιούν σε οικοτόπους που υπόκεινται σε απειλή λόγω των ανθρώπινων δραστηριοτήτων, όπως τα υγρά δάση και οι παρόχθιες διαπλάσεις. Περιλαμβάνει περί τα 50 είδη που εξαπλώνονται σε όλη την Παλαιαρκτική, με 8 είδη να έχουν καταγραφεί στην Ελλάδα, 4 εκ των οποίων είναι ενδημικά στη χώρα (ελληνικά ενδημικά: Τ. palustris, Τ. aegaeus, Τ. cavaticus, Τ. n. sp., ευρωπαϊκά είδη: Τ. camerani Τ, Τ. squamuliger, Τ. razzauti, Τ. arcuatus). Η κατανομή των ειδών είναι ασυνεχής λόγω του αυξανόμενου κατακερματισμού των ενδιαιτημάτων τους και της επέκτασης της γεωργικής γης και της αποψίλωσης των δασών. Η επίδραση της προϊούσας κλιματικής αλλαγής ενδέχεται να περιορίσει περαιτέρω τη ροή γονιδίων μεταξύ των πληθυσμών Trachelipus, καθώς τα ξηρά ενδιαιτήματα αναμένεται να αυξηθούν στην Ελλάδα. Οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ αυτών των οργανισμών είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστες καθώς πιο συστηματικές αναλύσεις έχουν αρχίσει να διενεργούνται σχετικά πρόσφατα. Η διάκριση μεταξύ των ειδών έχει γίνει βάσει περιορισμένου αριθμού δευτερευόντων φυλετικών μορφολογικών χαρακτήρων των αρσενικών ατόμων, ωστόσο οι πρόσφατες αναλύσεις με μοριακούς δείκτες καταδεικνύουν ότι η ταξινόμηση των ειδών με βάση τη μορφολογία μπορεί να υποτιμά τα πραγματικά επίπεδα της απόκλισης μεταξύ των πληθυσμών. Επιπλέον, μέσα σε διάφορα γένη ή ομάδες ειδών, οι 15

χρησιμοποιούμενοι μορφολογικοί χαρακτήρες δεν παρέχουν σαφή ταξινομική ανάλυση, κι έτσι έχουν παρουσιαστεί πολλές αλλαγές στην ονοματολογία των περιγεγραμμένων ειδών στη βιβλιογραφία. Ο κύριος στόχος της διατριβής ήταν η μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των ειδών, η διαπίστωση κάποιου ενδεχόμενου γεωγραφικού ή/και παλαιογεωγραφικού προτύπου και η αποσαφήνιση της κατανομής κάθε είδους εντός της ελληνικής επικράτειας, προκειμένου να εκτιμηθεί καλύτερα μια πιθανή γεωγραφική δομή στα πρότυπα της απόκλισης μεταξύ των πληθυσμών, και να επανεξεταστεί η συστηματική τους. Μετά την απομόνωση ολικού DNA, χρησιμοποίησα τρεις μοριακούς δείκτες: τους μιτοχονδριακούς δείκτες 16S rrna και την υπομονάδα Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης, οι οποίοι χρησιμοποιούνται ευρέως για τις φυλογενετικές μελέτες στο διαειδικό και ενδοειδικό επίπεδο, και τον πυρηνικό γενετικό τόπο της α υπομονάδας της αντλίας NaK (NaK ATPase a-subunit), η οποία είναι μία Ρ-τύπου αντλία, συμμεταφορέας ιόντων για τη διατήρηση της διαφοράς του ηλεκτροχημικού δυναμικού μεταξύ των κυτταρικών μεμβρανών, και είναι απαραίτητη για την κυτταρική σηματοδότηση και τη δευτερογενή μεταφορά. Λόγω της κακής συντήρησης αρκετών δειγμάτων, προτείνω ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο απομόνωσης DNA, το οποίο έδωσε πολύ θετικά αποτελέσματα αναφορικά με την ποιότητα του απομονωμένου DNA. Μετά τον πολλαπλασιασμό των τριών γενετικών δεικτών με τη μέθοδο της PCR, υπολόγισα τις γενετικές αποστάσεις εντός και μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών και ειδών, καθώς και τις μεταξύ τους φυλογενετικές σχέσεις. Για τη φυλογενετική ανασύσταση χρησιμοποίησα τις μεθόδους της Μέγιστης Φειδωλότητας (MP), της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML) και της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (BI) για κάθε γενετικό τόπο και για τις συνδυασμένες αναλύσεις. Προκειμένου να αξιολογηθεί η βιογεωγραφική ιστορία και να εκτιμηθεί η χρονολόγηση των γεγονότων διαφοροποίησης μεταξύ των ειδών και των πληθυσμών, εφάρμοσα ένα βαθμονομημένο μοριακό ρολόι εξετάζοντας 12 16

εναλλακτικές υποθέσεις με το πρόγραμμα BEAST [α: παλαιογεωγραφικά γεγονότα (όπως η διαμόρφωση της Μεσαιγαιακής Τάφρου 12-9 εκ. χρόνια πριν και η κρίση αλατότητας κατά το Μεσσήνιο 5,971-5,33 εκ. χρόνια πριν), β: διαφορετικές παραμέτρους δέντρων (tree priors: διαδικασία της γέννησηςθανάτου, διαδικασία Yule), γ: διαφορετικά ρολόγια (σταθερό μοριακό ρολόι, μη συσχετιζόμενο λογαριθμικό μοντέλο μη σταθερού ρυθμού εξέλιξης, μη συσχετιζόμενο εκθετικό μοντέλο μη σταθερού ρυθμού εξέλιξης) και δ: διαφορετικούς ρυθμούς υποκατάστασης για τoυς μιτοχονδριακούς δείκτες COI και 16S rrna (COI = 1,56% -1,72% Poulakakis & Sfenthourakis 2008, 16Sr RNA = 0,14% Held 2001). Οι διαφορετικές υποθέσεις που δοκιμάστηκαν κατατάχθηκαν με βάση τους οριακούς εκτιμητές πιθανοφάνειας που υπολογίστηκαν με τις μεθόδους Path Sampling και Stepping Stone. Όλες οι φυλογενετικές μέθοδοι (MP, ML, BI) - κατέληξαν σε δέντρα με κοινές τοπολογίες κλάδων και καταδεικνύουν ασυμφωνία με την ισχύουσα ταξινόμηση. Ορισμένοι πληθυσμοί που θεωρούνται πως ανήκουν στο ίδιο είδος παρουσιάζουν μεγάλες γενετικές αποστάσεις και ομαδοποιούνται σε διακριτούς κλάδους. Το πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι αυτό των πληθυσμών του είδους Τ. palustris που ομαδοποιούνται σε τρεις διαφορετικούς κλάδους με πολύ μεγάλη γενετική απόσταση (Kimura 2-P) και στους τρεις γενετικούς δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν (COI = 27,2%, 16S rrna = 15,2%, NaK ΑΤΡ = 4,3%). Σε γενικές γραμμές, οι γενετικές αποστάσεις που καταγράφονται στην παρούσα μελέτη είναι αρκετά μεγάλες σε σύγκριση με εκείνες που έχουν αναφερθεί για τα διάφορα είδη και γένη, ακόμη και σε άλλες μελέτες χερσόβιων ισοπόδων. Από την άλλη πλευρά, διαφορετικοί πληθυσμοί από την Κρήτη που ανήκουν στα είδη Τ. cavaticus και Τ. aegaeus, ομαδοποιούνται μαζί και παρουσιάζουν μικρές γενετικές αποστάσεις (COI: 12,3%, 16S rrna: 6,4%, NaK: 2,9%). Υπό το φως αυτών των αποτελεσμάτων, κρίνεται απαραίτητη η αναθεώρηση της ταξινόμησης των ειδών Trachelipus που απαντώνται στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματα της διατριβής μου προτείνουν την ύπαρξη δύο ενδεχομένων κρυπτικών ειδών αφενός για τους πληθυσμούς T. palustris που 17

ομαδοποιούνται στον κλάδο της δυτικής ηπειρωτικής Ελλάδας και της βόρειαςβορειοδυτικής Πελοποννήσου και αφετέρου για του πληθυσμούς που ομαδοποιούνται στον κλάδο της βόρειας Εύβοιας και της χερσονήσου της Μαγνησίας Αντίθετα, με βάση τα αποτελέσματα της διατριβής προτείνω τη συγχώνευση των κρητικών πληθυσμών Τ. cavaticus και Τ. aegaeus σε ένα μόνο είδος (αυτό θα ήταν Τ. aegaeus δεδομένου ότι έχει προτεραιότητα). Τα φυλογενετικά δέντρα με την ισχυρή στατιστική υποστήριξη συμφωνούν με την παλαιογεωγραφική ιστορία της ελληνικής περιοχής από την εποχή του Μειόκαινου (23,03 εκ. χρόνια πριν). Οι γεωγραφικές κατανομές των ειδών φαίνεται να ακολουθούν την τεκτονική και κινηματική ανασυγκρότηση της περιοχής της ηπειρωτικής Ελλάδας, του Αιγαίου και της δυτικής Τουρκίας απεικονίζοντας τη σχέση μεταξύ των ορογενετικών διεργασιών, της ηπειρωτικής επέκτασης και της ανύψωσης των μεταμορφωμένων πετρωμάτων στις κινήσεις των τεκτονικών πλακών στην περιοχή. Τα αποτελέσματα της χρονολόγησης των κλάδων επιβεβαιώνουν τόσο τα γεωλογικά γεγονότα όσο και την ανασυγκρότηση του ελλαδικού χώρου που ευθύνονται για την σημερινή γεωγραφία και γεωλογία της περιοχής. Η Διατριβή μου αποτελεί την πρώτη ολοκληρωμένη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων σε πληθυσμούς χερσόβιων καρκινοειδών στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματα κατέληξαν στην οριοθέτηση της γεωγραφικής εξάπλωσης των ειδών και την ανασύσταση των φυλογενετικών τους σχέσεων υπό το πρίσμα της παλαιογεωγραφικής ιστορίας και της σύγχρονης γεωγραφίας της νησιωτικής και ηπειρωτικής περιοχής. Τόσο οι φυλογενετικές σχέσεις όσο και οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών φαίνεται να συνηγορούν στην περαιτέρω διερεύνηση της συστηματικής των ειδών του γένους. Η Διατριβή μου καταδεικνύει ότι η μορφολογία περιγράφει ανεπαρκώς την πραγματική ποικιλότητα μεταξύ των ειδών. Ως εκ τούτου, η ταξινόμηση των ειδών με βάση τους διαγνωστικούς χαρακτήρες και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα για τα είδη Trachelipus θα πρέπει να επανεξεταστεί υπό το φως των νέων αυτών μοριακών φυλογενετικών αναλύσεων. 18

ABSTRACT Terrestrial isopods (Oniscidea) represent a monophyletic suborder of the order Isopoda (Crustacea, Malacostraca, Peracarida). They are the only group of crustaceans fully adapted to live on land and occur in all the ecosystems from sea level to high mountains, from forests to deserts, excluding the polar areas. The majority of terrestrial isopods need a high degree of air humidity for survival, due to their limited ability to preserve water. The genus Trachelipus comprises of relatively stenoecious animals living in habitats generally threatened by human activities, such as humid forest sites and riparian habitats. It includes some 50 species distributed around the Palaearctic, with 8 species recorded from Greece, 4 endemic to the country (i.e. Greek endemics: T. palustris, T. aegaeus, T. cavaticus, T. n. sp.; European species: T. camerani, T. squamuliger, T. ratzauti, T. arcuatus). The distribution of species is discontinuous due to the increasing fragmentation of its habitats and the expansion of agricultural land and dry woodland. Projected climatic change will restrict further gene flow between Trachelipus populations, as dry habitats are expected to expand in Greece. The phylogenetic relationships among these animals are still largely unknown because robust analyses have started to appear only relatively recently. Species-level taxonomy has been based mainly on a few secondary sexual characters of males, although recent analyses based on molecular markers have indicated that species definitions based on morphology may underestimate the true levels of divergence among populations. Furthermore, within several genera or species groups, morphological characters do not provide clear-cut taxonomic resolution, so that many changes in the interpretation of nominal species have appeared in the literature. In my PhD Thesis I performed a phylogenetic analysis of Trachelipus spp. distributed in Greece using a population by population approach. I have sampled 123 populations from several sites in mainland and insular Greece and 19

I have also incorporated samples of European origin in order to check both for the morphological and the genetic homology. My main goal was to study the phylogeny of these species, to reveal any possible geographical and/or palaeogeographical pattern and to particularize the distribution of each species within the Greek territory in order to better estimate possible geographic structure in the patterns of divergence among populations, and to throw new light in their systematics. After total DNA extraction, I employed three DNA markers; the mitochondrial 16S rrna and the Cytochrome Oxidase subunit I, that are widely used for the phylogenetic studies at the species and the population level, and the nuclear sodium potassium ATPase a-subunit, which is a P-type ATPase ion co-transporter responsible for maintaining electrochemical potential differences across cell membranes, and is essential for cell signalling and secondary transport. Due to the poor preservation of several specimens, I propose a modified DNA extraction protocol, which returned highly positive results in terms of the quality of the total extracted DNA. After PCR amplification of the gene markers I calculated the genetic divergence within and among the populations and species studied, as well as their phylogenetic relationships. The methods for phylogenetic reconstruction that I used were Maximum Parsimony (MP), Maximum Likelihood and Bayesian Inference (BI) for each sequence data and the concatenated datasets. In order to evaluate the biogeographic history and to estimate the chronology of diversification events among the species and their populations I have implement a calibrated molecular clock using 12 alternative scenarios in BEAST [(i.e. palaeogeographical events such as the formation of the Mid- Aegean Trench 12-9 mya and the Messinian Salinity Crisis 5,971 5,33 mya), different tree priors (i.e. birth-death process; Yule process), different clocks (strict, Uncorrelated Exponential Relaxed Clock and Uncorrelated Lognormal relaxed clock) and different rates of substitution for COI and 16S rrna markers (COI = 1.56% 1.72% after Poulakakis & Sfenthourakis 2008; 16Sr RNA = 0,14% 20

after Held 2001)]. The different scenarios implemented where tested and ranked using the Maximum Likelihood Estimators as they were calculated using the path sampling and stepping stone analyses. Αll phylogenetic methods (MP, ML, BI) - produced trees with quite congruent topologies that reveal incongruence with current taxonomy. Some populations that are considered conspecific exhibit large genetic distances and cluster in different clades. The most prominent example is that of T. palustris populations that cluster into three different clades that exhibit very large genetic divergence (Kimura 2-p) in all three genetic markers used (COI= 27.2%; 16S rrna=15.2%; NaK ATPase=4.3% ). In general, it can be argued that the genetic distances recorded in the present study are quite large compared with those reported for different species and even genera in other studies of terrestrial isopods. On the other hand, the Cretan populations that belong to T. cavaticus and T. aegaeus are clustered together and exhibit low genetic distances (COI: 12.3%, 16S rrna: 6.4%, NaK: 2.9%). Under the light of these results, a revision of the Greek Trachelipus species taxonomical status is in need. The results of my Thesis corroborate the possibility of probably two cryptic species for the T. palustris populations; one would include the populations distributed to N. Evia and the peninsula of Magnisia and the second would apply to the populations distributed to the N- NW Peloponnese and Western Greece area. On the other hand the results of my Thesis point to the merger of Cretan populations of Τ. cavaticus and T. aegaeus to a single species (this would be T. aegaeus since it has priority). The highly-structured phylogenetic trees agree with the palaeogeographic history of the Greek territory since the Miocene (23,03 mya). The distribution of the species seem to follow the tectonic and kinematic reconstruction of the Aegean region of Greece and western Turkey depicting the linkage between the subduction-related mountain building, continental extension, and the resulting formation and exhumation of metamorphic rocks to plate motions and mantle dynamics in the area. The chronology results of the clades also corroborate to the geological events and the reconstruction of the 21

Greek territory that account for the today s geography and geology of the region. My Thesis comprises the first comprehensive phylogenetic study of terrestrial crustacean populations in Greece with positive results concerning the delineation of both the distributional range and the phylogeography of these animals with respect to the palaeogeographic history and the current geography of insular and mainland Greece. Both the phylogeny presented in my Thesis and the genetic distances separating the populations appear to justify the necessity of further investigation into the systematics of the Greek Trachelipus species. My study brought evidence that morphology inadequately describes the real variation inside and among species. Hence, diagnoses based on the morphological characters used so far for the delineation of Trachelipus species should be reconsidered under the light of these more extensive molecular phylogenetic analyses. 22

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Science is wonderfully equipped to answer the question - How? - But it gets terribly confused when you ask the question -Why? - ERWIN CHARGAFF Η επιστήμη είναι θαυμάσια προικισμένη στο να απαντά στο ερώτημα Πώς- Όμως γίνεται τρομερά δυσνόητη όταν τίθεται το ερώτημα Γιατί;... ERWIN CHARGAFF 23

Εισαγωγή 1. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ Η πρώτη προσπάθεια ομαδοποίησης των Ως ταξινομική (taxonomy) ορίζεται το σύνολο των θεωριών και των πρακτικών οργανισμών ανάγεται στην μεθόδων που χρησιμοποιούνται για την κλασική αρχαιότητα, όπου ο περιγραφή της ποικιλομορφίας των Αριστοτέλης με βάση τη μορφολογική ομοιότητά τους διαμόρφωσε το «φυσικό σύστημα κατάταξης». οργανισμών. Η ταξινομική κατατάσσει αυτήν την ποικιλομορφία σε ένα σύστημα λέξεων που μεταφέρει πληροφορίες σχετικά με το είδος και τις σχέσεις μεταξύ των οργανισμών. Με άλλα Τον 18 ο αιώνα ο Linnaeus λόγια, η ταξινομική περιλαμβάνει την ανέπτυξε το πρώτο ολοκληρωμένο ταξινομικό σύστημα με την καινοτομία της διπλής ονοματολογίας, περιγραφή και την κατάταξη των οργανισμών σε ταξινομικές κατηγορίες καθώς και τη θεωρία και την ιστορία της κατάταξης αυτής (Wiley 1981). που δημοσίευσε το 1758 στην δεύτερη έκδοση του έργου Η ταξινόμηση περιλαμβάνει την του «Systema Naturae» και αποτέλεσε το θεμέλιο λίθο της σύγχρονης ταξινόμησης. κατάταξη και την ονοματολογία. Κατάταξη (classification) ονομάζεται η κατηγοριοποίηση των οργανισμών σε ομάδες μέσα σε ένα οργανωμένο ταξινομικό σύστημα, ενώ ονοματολογία (nomenclature) ονομάζεται η χρήση συγκεκριμένων χαρακτηριστικών ονομάτων για κάθε ομάδα που διακρίνει η ταξινόμηση (Simpson 1961). Η ταξινόμηση βασίστηκε σε ποικίλες μεθοδολογικές προσεγγίσεις. 1.1. Εξελικτική Ταξινομική (Evolutionary Taxonomy) Η μέθοδος αυτή βασίστηκε στην ιεραρχική απεικόνιση των τάξων (π.χ. βασίλειο, φύλο, τάξη, οικογένεια, γένος, είδος) με διακλαδιζόμενα φυλογενετικά δένδρα ή δενδρογράμματα προτύπων καταγωγής (phylogenetic 24

Εισαγωγή trees), έτσι ώστε να αντικατοπτρίζουν το πρότυπο της καταγωγής από κοινό πρόγονο και τον βαθμό της διαφοροποίησης (απόκλισης). Καθώς όμως τα πρότυπα καταγωγής και ο βαθμός διαφοροποίησης δεν ακολουθούν τους ίδιους ρυθμούς εξέλιξης η μέθοδος αυτή αποδείχτηκε ανεπαρκής (Avise 2000). 1.2. Φαινετική ή Αριθμητική Ταξινομική (Phenetic or Arithmetic Taxonomy) Η βασική παραδοχή της φαινετικής είναι ότι όσο περισσότεροι ανεξάρτητοι χαρακτήρες δύο οργανισμών μοιάζουν μεταξύ τους τόσο πιο συγγενικοί θα είναι αυτοί, καθώς από στατιστική σκοπιά είναι απίθανο να έχει συμβεί σύγκλιση ή παράλληλη εξέλιξη σε πολλούς χαρακτήρες ταυτοχρόνως. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί το σύνολο των χαρακτήρων των οργανισμών, εκφρασμένων με κάποιο είδος ποσοτικής μαθηματικής κωδικοποίησης και βασίζει τις φυλογενετικές σχέσεις στη συνολική ομοιότητα των οργανισμών όπως αυτή υπολογίζεται μέσω στατιστικών μεθόδων (τεχνικών ομαδοποίησης)(avise 2000). 1.3. Φυλογενετική ή Κλαδιστική Ταξινομική (Phylogenetic or Cladistic Taxonomy) Η ταξινομική ιεράρχηση βασίζεται στην εξελικτική θεωρία και έχει συγκεκριμένη δομή. Η ταξινομική ιεράρχηση έχει τέτοια δομή, ώστε να απεικονίζει την αλυσίδα των σύγχρονων και των προγονικών ειδών. Η εξελικτική αλληλουχία των οργανισμών λέγεται φυλογένεση (phylogeny). Η φυλογενετική συστηματική είναι μια προσέγγιση της συστηματικής η οποία αφενός προσπαθεί να ανακτήσει τις φυλογενετικές (γενεαλογικές) σχέσεις μεταξύ ομάδων οργανισμών και αφετέρου παράγει ταξινομήσεις οι οποίες αντανακλούν ακριβώς αυτές τις γενεαλογικές σχέσεις (Avise 2000). 25

Εισαγωγή Η ιστορία της φυλογενετικής Η κλαδιστική ανάλυση διακρίνει συστηματικής είναι σχετικά μικρή, τους χαρακτήρες σε προγονικούς αν και οι απαρχές της θα πρέπει να (πλησιόμορφους) και παράγωγους αναζητηθούν ήδη από τον Δαρβίνο. (απόμορφους). Μόνον οι απόμορφοι Μέχρι όμως τη διατύπωση ενός ολοκληρωμένου πλαισίου αρχών από το Γερμανό εντολολόγο Willi χαρακτήρες που μοιράζονται μεταξύ τους κάποια τάξα (συναπομορφίες) χρησιμεύουν Hennig στη δεκαετία του 1950, και στην κατασκευή κλαδογραμμάτων στην ουσία μέχρι τη μετάφραση του έργου του στην αγγλική γλώσσα το 1966 (Phylogenetic systematics), η συστηματική των οργανισμών (cladograms) ή φυλογενετικών δέντρων. Ένα κλαδόγραμμα αποτελεί μία υπόθεση που αφορά τις φυλογενετικές σχέσεις, άρα είναι αξιόπιστο μόνο όταν είναι αξιόπιστες βασιζόταν σε έναν συνδυασμό οι υποθέσεις, τα δεδομένα και οι αντικειμενικών δεδομένων και της αναλυτικές μέθοδοι κατασκευής του. εμπειρίας του κάθε ειδικού στην υπό εξέταση ομάδα. Επίσης, η κλαδιστική μέθοδος προϋποθέτει διακλαδισμένο και όχι «δικτυωτό» πρότυπο εξελικτικής διαφοροποίησης, αν και σε κάποιους οργανισμούς, όπως τα φυτά, ο υβριδισμός είναι κοινό φαινόμενο. Τέλος, το κλαδόγραμμα συνήθως περιλαμβάνει αρτίγονους οργανισμούς και παρουσιάζει γεγονότα ειδογένεσης, αλλά όχι εξαφανίσεων, με συνέπεια να αποτελεί μια υπεραπλουστευμένη απεικόνιση του προτύπου της εξέλιξης (Avise 2000). 26

Εισαγωγή 2. ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΤΗΣ ΟΜΑΔΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Είδος Η δομική μονάδα της ταξινόμησης και της συστηματικής κατάταξης είναι το είδος (ετυμολογικά προκύπτει από το ρήμα είδω = γνωρίζω, διακρίνω). Στο είδος, ως έννοια των βιολογικών επιστημών, έχουν αποδοθεί διαχρονικά αρκετοί ορισμοί, ανάλογα με τα κριτήρια που χρησιμοποιούσαν οι εκάστοτε ερευνητές, για να προσεγγίσουν την ποικιλότητα των οργανισμών (Avise & Ball 1990, Templeton 2001, De Queiroz 2007). Το κριτήριο του βιολογικού είδους δεν μπορεί να εφαρμοστέι για οργανισμούς που αναπαράγονται μονογονικά ή παρθενογενετικά. Ο ορισμός δεν ισχύει όταν αναφερόμαστε σε αλλοπάτριους πληθυσμούς που δεν διασταυρώνονται στη φύση επειδή δεν έρχοπνατι σε επαφή, αν και δυνητικά μπορούν (π.χ. όταν βρεθούν στο εργαστήριο). Επίσης, δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε απολιθωμένα είδη. Βιολογικός ορισμός του είδους (Biological species concept) (Mayr 1942). Ομάδες φυσικών πληθυσμών, οι οποίες διασταυρώνονται μεταξύ τους δίνοντας γόνιμους απογόνους και είναι αναπαραγωγικά απομονωμένες από παρόμοιες ομάδες και καταλαμβάνουν ένα συγκεκριμένο οικολογικό θώκο στη φύση. Ο ορισμός αυτός βασίζεται σε ένα καθαρά βιολογικό κριτήριο, δηλαδή την αναπαραγωγική απομόνωση. Εξελικτικός ορισμός του είδους (Evolutionary species concept) (Meglitsch 1954, Simpson 1961). Ομάδα ατόμων που ανήκουν σε μία ανεξάρτητη εξελικτική γραμμή προγονικών και απογονικών πληθυσμών που διατηρεί την ταυτότητά της από άλλες παρόμοιες γραμμές και η οποία έχει τις δικές τις εξελικτικές τάσεις. 27

Εισαγωγή Φυλογενετικός ορισμός του είδους (Phylogenetic species concept) (Cracraft 1989). Η μικρότερη διακριτή ομάδα οργανισμών που μπορεί να διαγνωσθεί ως ξεχωριστή από άλλες τέτοιες ομαδοποιήσεις και μέσα στην οποία υπάρχει πρότυπο προέλευσης και καταγωγής. Η έννοια αυτή εφαρμόζεται τόσο σε αμφιγονικά όσο και σε μονογονικά αναπαραγόμενους οργανισμούς. Μορφολογικός ορισμός του είδους (Simpson 1961) Μία ομάδα ατόμων που διακρίνεται μορφολογικά από άλλες. Τα κριτήρια για την αναγνώριση μορφολογικών ειδών διαφέρουν από ομάδα σε ομάδα. Η έννοια αυτή έχει περιορισμένη εφαρμογή καθώς παρεμβάλλεται η υποκειμενικότητα του ερευνητή και συχνά γίνονται λάθη εξαιτίας συγκλίνουσας ή αποκλίνουσας εξέλιξης. 28

Εισαγωγή 3. ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ ΤΗΣ ΦΥΛΟΓΕΝΕΣΗΣ Ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων γίνεται στη βάση των προτύπων των χαρακτήρων που εμφανίζονται στους Χαρακτήρας Ως χαρακτήρας εννοείται οποιοδήποτε χαρακτηριστικό ενός οργανισμού μπορούμε να περιγράψουμε με τον οποιονδήποτε τρόπο. Πρόκειται για γενική έννοια, η οποία μπορεί σύγχρονους οργανισμούς ή και να περιλαμβάνει από μορφολογικά σε παλαιοντολογικά ευρήματα. χαρακτηριστικά μέχρι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες, ή ακόμα και στοιχεία συμπεριφοράς και κοινωνικής οργάνωσης. Στη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων αξιοποιούνται μόνο οι χαρακτήρες κοινής προέλευσης (εξελικτικής και οντογενετικής) που ονομάζονται ομόλογοι. Οι ομόλογοι χαρακτήρες που εμφανίζονται σε ποικιλία καταστάσεων (πολυμορφικοί) συνιστούν το βασικό εργαλείο της φυλογενετικής ανάλυσης. Χαρακτήρες οι οποίοι προέρχονται από οικολογική σύγκλιση ή παράλληλη εξέλιξη ονομάζονται ανάλογοι. Ομοπλασία Η λανθασμένη θεώρηση ενός χαρακτήρα ως ομόλογου. Μπορεί να οφείλεται σε ανάλογους χαρακτήρες ή σε απώλεια χαρακτήρα που εκλαμβάνεται και κωδικοποιείται ως διαφορετικός χαρακτήρας. Πλησιομορφία Κατάσταση που έχει διατηρηθεί αμετάβλητη από τον τελευταίο, τουλάχιστον, κοινό πρόγονο των μελετηθέντων τάξων. Απoμορφία Κατάσταση που μεταβάλλεται μεταξύ δύο κόμβων (σημείων διακλάδωσης ενός κλαδογράμματος). 29

Εισαγωγή Μονοφυλετική ομάδα / μονοφυλετικός κλάδος Μια ομάδα οργανισμών που περιλαμβάνει όλους τους απογόνους του πιο πρόσφατου κοινού προγόνου όλων των κλάδων που ανήκουν σε αυτήν. Παραφυλετική ομάδα Μια ομάδα οργανισμών που δεν περιλαμβάνει όλους τους απογόνους του πιο πρόσφατου κοινού προγόνου των μελών της ομάδας. Πολυφυλετικές ομάδες, Οι ομάδες που περιλαμβάνουν αντιπροσώπους διαφορετικών κλάδων (δηλαδή. δεν αποτελούνται από απογόνους του πλέον πρόσφατου κοινού προγόνου όλων των μελών τους). Αδελφά είδη Είδη, συνήθως με συμπατρική εξάπλωση, αλλά αναπαραγωγικά απομονωμένα, με παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά σε βαθμό που είναι δύσκολος ο διαχωρισμός τους. Φυλογενετικό δένδρο Αφορά ένα διακλαδισμένο διάγραμμα που αποδίδει τις φυλογενετικές σχέσεις των ακραίων τάξων και οι αποστάσεις μεταξύ των διακλαδώσεων αντιστοιχούν σε συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Κλαδόγραμμα Aφορά ένα διακλαδισμένο διάγραμμα που αποτυπώνει μια υπόθεση για τις φυλογενετικές σχέσεις των ακραίων τάξων βάσει ενός συνόλου χαρακτήρων και του οποίου τα μήκη, καθώς και οι οριζόντιες αποστάσεις, των κλάδων δεν αποδίδουν κάτι. 30

Εισαγωγή 4. ΦΥΛΟΓΕΝΕΣΗ - ΦΥΛΟΓΕΩΓΡΑΦΙΑ - ΓΕΩΓΡΑΦΙΚΗ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ Η φυλογένεση αφορά τη μελέτη της συγγένειας διαφορετικών οργανισμών όπως αυτή αντικατοπτρίζεται στην εξελικτική ιστορία τους. Βασικό στοιχείο της φυλογενετικής έρευνας είναι οι λεγόμενες «ομολογίες», δηλαδή οι κληρονομούμενες ιδιότητες, και οι λεγόμενες «αναλογίες» που αφορούν όμοιους τρόπους και κοινές προσαρμογές σε συνθήκες ζωής. Συνεπώς, τα συστήματα φυλογενετικής ταξινόμησης βασίζονται κυρίως σε βιολογικά χαρακτηριστικά των οργανισμών εξετάζοντας κοινά γνωρίσματα, όπως οι ακολουθίες βιομορίων (αμινοξέα, νουκλεοτίδια, πρωτεΐνες, DNA κτλ.). Η φυλογεωγραφία είναι το πεδίο έρευνας που ασχολείται με τις αρχές και τις διαδικασίες που καθορίζουν τα γεωγραφικά πρότυπα κατανομής των γενεαλογικών γραμμών εντός του είδους καθώς και μεταξύ στενά συγγενικών ειδών. Λαμβάνει υπόψη το σύνολο των ιστορικών και φυλογενετικών παραγόντων της χωρικής κατανομής των γονιδιακών γενεαλογικών γραμμών (Avise 2000). Ο όρος «φυλογεωγραφία» ήταν σύλληψη των Avise et al. (1987) προκειμένου να περιγράψουν μια αρχή με τεχνικές και θεωρητικές ρίζες που συνδέονται με το πεδίο της μοριακής γενετικής.. Με τον όρο αυτόν προσπάθησαν να ενοποιήσουν τα επιστημονικά πεδία της φυλογένεσης και της γενετικής πληθυσμών. Ωστόσο, ο de Candolle (1820) ήταν ο πρώτος που πρότεινε πως η τρέχουσα γεωγραφική εξάπλωση των ζωντανών οργανισμών οφείλεται τόσο σε οικολογικούς όσο και σε ιστορικούς παράγοντες. Η προσέγγιση της επιρροής των ιστορικών παραμέτρων πραγματοποιείται μέσω των ερευνών της ιστορικής βιογεωγραφίας (Wiley 1988α, 1988b, Morrone & Crisci 1995, Edwards 1996). Οι περισσότερες μελέτες τέτοιου τύπου συγκρίνουν τη γεωγραφική εξάπλωση τάξων στο επίπεδο του είδους ή πάνω από αυτό. Με την ανάπτυξη των μοριακών μεθόδων είναι πλέον εφικτό να διερευνηθούν πρότυπα γεωγραφικής ποικιλότητας με τη χρήση μοριακών δεικτών και να συναχθούν 31

Εισαγωγή ενδοειδικά φυλογεωγραφικά πρότυπα. Υπ αυτήν την έννοια, είναι δελεαστικό να εφαρμοστούν οι μέθοδοι της ιστορικής βιογεωγραφίας και κάτω από το επίπεδο του είδους, συγκρίνοντας έτσι ενδοειδικά φυλογεωγραφικά πρότυπα διαφόρων τάξων που εξαπλώνονται στην ίδια περιοχή. Ο κύριος στόχος τέτοιων μελετών είναι η διερεύνηση σύμφωνων προτύπων γεωγραφικής εξάπλωσης μεταξύ γενεαλογικών γραμμών ανάμεσα σε διαφορετικά είδη, τα οποία (γεωγραφικά πρότυπα) θα καταδείκνυαν την επιρροή ενός κοινού ιστορικού παράγοντα (Avise et al. 1987, Taberlet 1998). Τα περισσότερα είδη εμφανίζουν σε κάποιο βαθμό πληθυσμιακή δομή που μπορεί να ερμηνευτεί με γεωγραφικά και χρονολογικά πρότυπα. Κύριοι στόχοι της φυλογεωγραφίας είναι η αποκρυπτογράφηση των χωρικών και χρονικών συνιστωσών της δομής των πληθυσμών και η ερμηνεία των εξελικτικών και οικολογικών διαδικασιών που ευθύνονται για την εκάστοτε δομή (Beheregaray 2008). Η φυλογεωγραφία είναι ένα συνδυαστικό επιστημονικό πεδίο που χρησιμοποιεί τη γενετική πληροφορία προκειμένου να ερευνήσει τη γεωγραφική κατανομή των γενεαλογικών γραμμών (Avise 2000). Με βάση την προσεκτική δειγματοληψία σε άτομα και την προσεκτική επιλογή των γενετικών τόπων, οι φυλογεωγράφοι μπορούν να ελέγξουν βιογεωγραφικές υποθέσεις, να περιγράψουν την εξέλιξη αναπαραγωγικά απομονωμένων πληθυσμών και να καταλήξουν σε συμπεράσματα αναφορικά με την προέλευση, την κατανομή και τη διατήρηση της βιοποικιλότητας. Δεδομένου ότι η δομή των γενεαλογιών των πληθυσμών επηρεάζεται από τη δημογραφική τους ιστορία, μπορούν να διατυπωθούν υποθέσεις και πιθανά σενάρια για τις αλλαγές που συντελούνται συν τω χρόνω στο φυσικό περιβάλλον των πληθυσμών, χρησιμοποιώντας τη σημερινή γενετική τους πληροφορία (Beheregaray 2008). Ως εκ τούτου, η φυλογεωγραφία έχει συνεισφέρει σημαντικά σε πολλά πεδία της βιολογίας και των γεωεπιστημών, όπως η ειδογένεση (Avise et al. 2000, Moritz et al. 2000, 2006, Hewitt 2001, Kohn 2005), η ιστορική βιογεωγραφία (Avise 2000, Riddle & Hafner 2006), η ανθρώπινη εξέλιξη (Torroni et al. 1996, Beaumont 2004, Olivieri 2006, Templeton 2007), η 32

Εισαγωγή εξελικτική βιολογία (Avise & Ball 1990, O Brien & Mayr 1991, Riddle 1996, Moritz & Faith 1998, Richards et al. 1998, Eizirik et al. 2001, Fraser & Bernatchez 2001), η μελέτη και η ταξινόμηση της βιοποικιλότητας (Avise & Ball 1990, Tamberlet 1998, Beheregaray & Caccone 2007), η παλαιοοικολογία (Cruzan & Templeton 2000), η παλαιοκλιματολογία (Hewitt 2000) και η ηφαιστειολογία (Emerson 2002, Beheregaray 2003). Οι φυλογεωγραφικές μελέτες έρχονται αντιμέτωπες με δύο βασικές δυσκολίες: την τυχαιότητα των γενετικών διαδικασιών και την ενδεχομένως πολύπλοκη ιστορία των μελετώμενων τάξων (Knowles & Maddison 2002, Knowles 2004). Η ανάλυση και η επεξήγηση της κατανομής των γενεαλογιών απαιτούν συνήθως εκτενή δεδομένα από τη γεωλογία, τη μοριακή και την πληθυσμιακή γενετική, την ηθολογία, τη φυλογένεση, τη δημογραφία, την παλαιοντολογία, τη γεωλογία και την ιστορική γεωγραφία (Avise 2000). Γίνεται κατανοητό, λοιπόν, πως η φυλογεωγραφία εδράζεται σε ένα κρίσιμο σταυροδρόμι μεταξύ μικροεξελικτικών και μακροεξελικτικών αρχών, τις οποίες και προσπαθεί να συγκεράσει. Οι φυλογεωγραφικές μελέτες προσπαθούν να ερμηνεύσουν τον τρόπο και το βαθμό στον οποίο οι διάφορες ιστορικές διαδικασίες που σχετίζονται με τη δημογραφία των πληθυσμών έχουν αφήσει τα εξελικτικά τους αποτυπώματα στη σύγχρονη γεωγραφική κατανομή των γονιδιακών γραμμών των οργανισμών (Avise 2000). Η φυλογεωγραφία καλύπτει ποικίλα εναλλακτικά σενάρια σχετικά με την ερμηνεία των χωρικών διευθετήσεων των οργανισμών και των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους. Παραδείγματος χάριν, ο βικαριανισμός και η διασπορά είναι συχνά ανταγωνιστικοί παράγοντες που καθορίζουν, ο καθένας με τον δικό του τρόπο, την προέλευση του χωρικού διαχωρισμού των ταξινομικών μονάδων. Κατά το βικαριανισμό, οι πληθυσμοί ή άλλες ανώτερες ταξινομικές μονάδες, διαχωρίζονται όταν η λίγο έως πολύ συνεχής κατανομή της προγονικής μορφής κατακερματίζεται από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως φαινόμενα ορογένεσης, αποχωρισμός ηπειρωτικών μαζών, ευστατικές ή ισοστατικές μεταβολές κτλ. (Croizat 1982, Nelson & Ladiges 1991, Avise 2000). Κατά τη διασπορά, μια ταξινομική μονάδα αποκτά τη σημερινή της κατανομή 33

Εισαγωγή μέσω ενεργητικής ή παθητικής διασποράς από ένα ή περισσότερα προγονικά κέντρα προέλευσης (Briggs 1989, 1992, 2000). Ο βικαριανισμός και η διασπορά είναι ιστορικά φαινόμενα, ο σχετικός ρόλος των οποίων στις διάφορες περιπτώσεις μπορεί να σταθμιστεί στο πλαίσιο της φυλογενετικής ανάλυσης. 4.1. Μοριακοί δείκτες Η φυλογεωγραφία (Avise 2000), αναλύει τη γεωγραφική εξάπλωση των γενεαλογικών γραμμών. Σταθμός στην ανάπτυξή της υπήρξε η μεγάλη ανάπτυξη νέων τεχνικών κατά τη δεκαετία του 1980, η οποία κατέστησε δυνατό τον προσδιορισμό της ποικιλότητας του DNA μεταξύ ατόμων ενός είδους, και με αυτόν τον τρόπο επέτρεψε την ανασύσταση της γενεαλογίας τους. Οι χωρικές σχέσεις τέτοιων γενεαλογιών μπορούν να απεικονιστούν γεωγραφικά και να αναλυθούν προκειμένου να εξαχθεί η εξελικτική ιστορία πληθυσμών, υποειδών και ειδών. Συγκεκριμένα, η δυνατότητα ανάλυσης των μιτοχονδριακών αλληλουχιών τροφοδότησε κατά κύριο λόγο αυτές τις νέες έρευνες. Σήμερα το εύρος των τεχνικών DNA, σε συνδυασμό με άλλες αναλυτικές μεθόδους, καθώς και παλαιοκλιματολογικές και γεωλογικές μελέτες, παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για τη γενετική ποικιλότητα και την εξέλιξη των πληθυσμών (Hewitt 2001, Emerson & Hewitt 2005). Οι φυλογενετικές μελέτες που αφορούν σε ζωικούς οργανισμούς ή βασίζονται κυρίως στη μελέτη του μιτοχονδιακού DNA, ενώ αντίστοιχα οι μελέτες που αφορούν σε φυτικούς οργανισμούς από το DNA του χλωροπλάστη (Avise 2000). Και στις δύο περιπτώσεις, ωστόσο, υπάρχει πληθώρα άλλων διαθέσιμων μοριακών δεικτών. Φυλοεξαρτώμενοι δείκτες μπορούν να ανιχνεύσουν τις ιστορικές διαφορές στη δημογραφία μεταξύ των φύλων, πράγμα που, για παράδειγμα, υπήρξε ιδιαίτερα πληροφοριακό στη μελέτη της ανθρώπινης φυλογεωγραφίας. Για ανίχνευση βαθύτερων φυλογενετικών σχέσεων χρειάζονται πιο αργοί μοριακοί δείκτες ενώ, από την άλλη, για πρόσφατα γεγονότα, πιθανότατα μόλις λίγων δεκάδων χιλιάδων ετών, 34

Εισαγωγή απαιτούνται αλληλουχίες πιο μεταβλητές ή πιο γρήγορα εξελισσόμενες (Emerson & Hewitt 2005). 4.1.1.Το μιτοχρονδιακό DNA Την τελευταία εικοσαετία, οι μιτοχονδριακοί δείκτες έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε μελέτες που αφορούν στη δομή των πληθυσμών και τη γονιδιακή ροή, τον υβριδισμό, τη βιογεωγραφία και τις φυλογενετικές σχέσεις (Moritz et al. 1987, Avise 2000), αφού το μιτοχονδριακό γονιδίωμα διαθέτει μια σειρά από χαρακτηριστικά που το καθιστούν ιδιαίτερα χρήσιμο σύστημα για την ανίχνευση γενετικών διαφορών σε διαειδικό και ενδοειδικό επίπεδο. To mtdna των ζώων αποτελεί το καλύτερα μελετημένο τμήμα ευκαρυωτικού DNA. Αυτό οφείλεται στην ευκολία απομόνωσής του σε σχέση με οποιοδήποτε τμήμα του πυρηνικού DNA. Η ευκολία αυτή έγκειται στην ασυνήθιστα μικρή πυκνότητά του σε κλίση CsCl, στο μεγάλο αριθμό αντιγράφων του και στην παρουσία του σ ένα οργανίδιο διαφορετικό του πυρήνα. Επιπλέον, εξαιτίας του μικρού μεγέθους του και της απουσίας των πολύπλοκων χαρακτηριστικών του ndna, όπως τα εσώνια, οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, τα μεταθετά στοιχεία, είναι εύκολος ο χαρακτηρισμός του (εύρεση γονιδίων και σειράς αυτών, αλληλούχηση). Από τη μεριά της συγκριτικής ανάλυσης, το mtdna έχει το πλεονέκτημα να υπάρχει σε όλο το ζωικό βασίλειο και να έχει εξαιρετικά παρόμοιο γονιδιακό περιεχόμενο (όλα τα μετάζωα και ορισμένα πρωτόζωα έχουν την ίδια ομάδα 37 γονιδίων) (Wilson et al. 1985). Το περιεχόμενο και το μέγεθος του μορίου έμεινε σχετικά σταθερό για περισσότερο από 800 εκατομμύρια χρόνια, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα χαρακτηριστικά αυτά αποτελούν επιλέξιμο εξελικτικό πλεονέκτημα. 35

Εισαγωγή Οι εξελικτικές μεταλλακτικές αλλαγές του ζωικού mtdna είναι σχετικά απλές και είναι κυρίως υποκαταστάσεις βάσεων και μεταλλάξεις μήκους, με τις τελευταίες να συγκεντρώνονται κυρίως στις μικρές μη κωδικές περιοχές. To μόριο του mtdna αποτελεί το πιθανότερο εύρημα σε οργανικά κατάλοιπα ζωικών ειδών που έχουν εξαφανιστεί. Ο μεγάλος αριθμός μορίων ανά κύτταρο σε σχέση με οποιοδήποτε τμήμα του ndna αυξάνουν την πιθανότητα εύρεσης τμημάτων του ικανών για ανάλυση αλληλουχίας (Wilson et al. 1985). Το μιτοχονδριακό DNA (mtdna) εμφανίζει πολλά πλεονεκτήματα τόσο από εξελικτική όσο και από τεχνική άποψη (Hurst & Jiggins 2005), τα οποία μπορούν να συνοψιστούν στα ακόλουθα: 1. Το mtdna εμφανίζεται σε μεγάλο αριθμό αντιγράφων στα κύτταρα (Futuyma 1991) και ο μητρικός, κυρίως, τρόπος κληρονομικότητας (Zhao et al. 2004) δεν αφήνει περιθώρια για ανασυνδυασμό, με ελάχιστες εξαιρέσεις (Zouros et al. 1994, Ladoukakis & Zouros 2001a,b, Rokas et al. 2003). Έτσι, οι διαφοροποιήσεις που παρατηρούνται είναι καθαρά αποτέλεσμα μεταλλαγών (Hagelberg et al. 1994, 1999). 2. Είναι πολύ καλά χαρακτηρισμένο μόριο σε σχέση με το πυρηνικό γονιδίωμα (Hagelberg et al. 1994, 1999) 3. Είναι απλοειδές, οπότε δεν απαιτείται κλωνοποίηση πριν από τον προσδιορισμό της αλληλουχίας (Hurst & Jiggins 2005). 4. Απουσιάζουν ψευδογονίδια και εσώνια από το μιτοχονδριακό DNA (Avise et al. 1987). 5. Ο γρήγορος ρυθμός εξέλιξης του mtdna το καθιστά πολύτιμο εργαλείο για εξελικτικές και φυλογενετικές μελέτες τόσο στο διαειδικό όσο και στο ενδοειδικό επίπεδο (Avise et al. 1987). Ο ρυθμός εξέλιξης, βέβαια, δεν είναι σταθερός για όλες τις ομάδες οργανισμών. Μέχρι σήμερα έχουν διατυπωθεί διάφορες υποθέσεις για την ερμηνεία των διαφορών που παρατηρούνται στον ρυθμό αντικατάστασης μεταξύ των διαφόρων εξελικτικών γραμμών. Οι παράγοντες που συχνά επιστρατεύονται για τον σκοπό αυτό, διακρίνονται σε 2 κατηγορίες: 36

Εισαγωγή 1. Τους εξαρτώμενους από τη γενεά, όπως η διάρκεια γενεάς, η αδυναμία επιδιόρθωσης λαθών κατά την αντιγραφή (που οδηγεί στη συσσώρευση μεταλλάξεων) και 2. Τους ανεξάρτητους από τη γενεά, όπως ο μεταβολικός ρυθμός (τα εξώθερμα έχουν χαμηλότερο ρυθμό από τα ενδόθερμα) και το μέγεθος του σώματος. Ωστόσο υπάρχουν και τα μειονεκτήματα της χρήσης του mtdna, τα οποία συνοψίζονται ακολούθως: 1. Η πλαστικότητα στην οργάνωση αλλά και στους τρόπους αλληλεπίδρασης με το συνεξελισσόμενο ndna μέσω της μεγάλης ποικιλομορφίας των κύριων μη κωδικών και άλλων ρυθμιστικών περιοχών (Saccone et al. 1999, 2000, 2002). 2. Η ετεροπλασμία, δηλαδή η πιθανή πατρική κληρονόμηση ή κάποια μετάλλαξη η οποία μπορεί να δημιουργήσει ή να αυξήσει την πιθανότητα της παρουσίας δυο ή περισσότερων γενοτύπων σ ένα άτομο (Avise 2000). 3. Η ομοπλασία. Ένας ιδανικός μοριακός χαρακτήρας δεν ακολουθεί αντίστροφη, παράλληλη ή συγκλίνουσα εξέλιξη. Δυστυχώς το mtdna δεν ικανοποιεί αυτή τη συνθήκη αφού σε διάφορες μελέτες εμφανίζονται να «ενεργοποιούνται» και να «απενεργοποιούνται» πολυάριθμες θέσεις περιορισμού κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, φαινόμενο που πιθανόν οφείλεται σε παροδικές μεταπτώσεις νουκλεοτιδίων. Αν ορισμένες θέσεις του mtdna θεωρηθούν χαρακτήρες και οι εξελικτικές αλλαγές στις θέσεις αυτές είναι ιδιαίτερα γρήγορες σε σχέση με τον χρόνο διαχωρισμού των εξεταζόμενων τάξων, τότε ο μικρός αριθμός εναλλακτικών χαρακτήρων που ενδεχομένως εμφανίζονται οφείλεται σε ομοπλαστικές αλλαγές. 37

Εισαγωγή 4. Η χρονική κλίμακα. Ορισμένες νουκλεοτιδικές θέσεις στο mtdna είναι εξελικτικά περισσότερο ευμετάβλητες σε σχέση με άλλες, πιθανόν εξαιτίας χαλαρότερων επιλογικών πιέσεων. 5. Ενσωμάτωση του mtdna στο πυρηνικό γονιδίωμα. Οι περιοχές που ενσωματώνονται συχνότερα είναι εκείνες που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (Cytb, COI, COII) και rrna, μη κωδικές περιοχές δηλαδή περιοχές που «χρησιμοποιούνται» περισσότερο από το mtdna. Oι ενσωματωμένες περιοχές εμφανίζουν ποικίλο βαθμό ομολογίας με τα μιτοχονδριακά τους αντίστοιχα, ανάλογα με το τάξον και την περιοχή που έχει ενσωματωθεί στον πυρήνα. Οι ενσωματωμένες στον πυρήνα περιοχές, ευρισκόμενες κάτω από διαφορετικούς μεταλλακτικούς περιορισμούς, εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα εξέλιξης σε σχέση με τις αυθεντικές μιτοχονδριακές αλληλουχίες. Χαρακτηριστικά, όπως η μεταλλακτική πιέση στα μιτοχόνδρια, δεν ισχύουν στα πυρηνικά αντίγραφα. Γενικά, οι μελέτες έχουν δείξει ότι οι ενσωματωμένες περιοχές συμπεριφέρονται ως μοριακά «απολιθώματα», εξελισσόμενες με πολύ βραδύτερο ρυθμό σε σχέση με τα μιτοχονδριακά τους ομόλογα, και ότι βρίσκονται πλησιέστερα στις προγονικές μορφές των ομολόγων αυτών σε νουκλεοτιδικό επίπεδο (Zhang & Hewitt 1996). 4.1.2. Πυρηνικοί δείκτες Τα πυρηνικά γονίδια χρησιμοποιούνται τα τελευταία χρόνια ως μοριακοί δείκτες για φυλογενετικές μελέτες, συνήθως σε συνδυασμό με μιτοχονδριακά γονίδια. Οι γενετικοί τόποι που αρχικά χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ριβοσωμικά γονίδια που κωδικοποιούν τη μεγάλη (28S) και τη μικρή υπομονάδα (18S) του ριβοσώματος, τα οποία αξιοποιήθηκαν κυρίως για την επίλυση των φυλογενετικών σχέσεων σε ανώτερες ταξινομικές βαθμίδες (Olsen 38

Εισαγωγή & Woese 1993). Καθώς όμως η στοίχιση αυτών των γονιδίων αποδεικνύεται ιδιαίτερα δύσκολη και αμφιλεγόμενη, σε κάποιες περιπτώσεις τα τελευταία χρόνια επιλέγονται πυρηνικά γονίδια τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες (Steppan et al. 2004). Αυτοί οι γενετικοί τόποι έχουν το πλεονέκτημα της πολύ ευκολότερης στοίχισης και επιπλέον διαφέρουν μεταξύ τους στους εξελικτικούς ρυθμούς με αποτέλεσμα να μπορούν να αξιοποιηθούν για την επίλυση σχέσεων σε διαφορετικά ταξινομικά επίπεδα. Ωστόσο και στους πυρηνικούς δείκτες εμφανίζονται μειονεκτήματα: Ο χαμηλός αριθμός αντιγράφων σε σύγκριση με τα ριβοσωμικά πυρηνικά και τα μιτοχονδριακά γονίδια που μπορεί να οδηγήσει σε προβλήματα στον πολλαπλασιασμό του επιθυμητού γονιδίου μέσω της PCR. Ο εκφυλισμός της τρίτης θέσης στα κωδικόνια, που δυσκολεύει το σχεδιασμό εκκινητών. Το μεγάλο μήκος των εσωνίων που μπορεί να καταστήσει εξαιρετικά δύσκολο ή ακόμα και αδύνατο τον πολλαπλασιασμό (PCR) του επιθυμητού γονιδίου. Η εξαγωγή φυλογεωγραφικών συμπερασμάτων βασίζεται στη μελέτη της αναδομημένης γενεαλογικής ιστορίας των γονιδίων (γονιδιακών δένδρων) από διαφορετικούς πληθυσμούς. Επειδή όμως στο παρελθόν είναι δυνατόν να έχουν λάβει χώρα πολλά γεγονότα, όπως επέκταση πληθυσμών, φαινόμενα στενωπού, μετανάστευση κτλ, και πολλές γενεαλογικές γραμμές ενδέχεται να έχουν χαθεί τυχαία, η ιστορία των ειδών πιθανότατα να μην ταυτίζεται με την ιστορία του γονιδιακού δένδρου. Με άλλα λόγια ένα δέντρο βασισμένο σε ένα γονίδιο (gene tree) δεν αντιστοιχεί στο πραγματικό δέντρο των ειδών αλλά αποδίδει την εξελικτική πορεία/ιστορία αυτού του γονιδίου. Για το λόγο αυτόν, και για να αποφευχθεί η εξαγωγή λανθασμένων συμπερασμάτων, απαιτείται ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων των υπό εξέταση ταξινομικών μονάδων να βασίζεται, όχι σε ένα, αλλά σε περισσότερα γονίδια. Κάθε αλληλουχία DNA έχει τη δική της γενεαλογία και η εξελικτική ιστορία κάθε οργανισμού είναι το σύνολο των διαφορετικών γονιδιακών γενεαλογιών. 39

Εισαγωγή Η συνδυασμένη χρήση τόσο μιτοχονδριακών όσο και πυρηνικών δεικτών έχει αναδείξει τα πιθανά παραπλανητικά συμπεράσματα στα οποία μπορεί να καταλήξει μια έρευνα όταν χρησιμοποιεί μόνο έναν δείκτη. Επιπροσθέτως, κάθε αναλυτική μέθοδος προσφέρει διαφορετικές οπτικές γωνίες στη μοριακή και τη χωρική ιστορία των μελετώμενων τάξων. Ως εκ τούτου, στην προσπάθεια να ανασυσταθεί η φυλογεωγραφική ιστορία ενός είδους, θα ήταν ιδανικό να χρησιμοποιήσει κάποιος πληθώρα αλληλουχιών που θα περιλάμβαναν μιτοχονδριακές, πυρηνικές, φυλοεπηρεαζόμενες, αυτοσωματικές, συντηρητικές, καθώς και ουδέτερες, χρησιμοποιώντας δείκτες με υψηλούς αλλά και χαμηλούς ρυθμούς μεταλλακτικότητας. Φυλογεωγραφικές μελέτες που χρησιμοποιούν γενεαλογικά δεδομένα από διαφορετικούς και ανεξάρτητους μεταξύ τους τόπους θα έχουν ως αποτέλεσμα μια πιο πλήρη και αξιόπιστη ιστορία του εν λόγω τάξου (Posada & Crandall 2001, Zink 2002, Gillespie 2004, Hewitt 2004, Emerson & Hewitt 2005). 4.2. Μοριακό ρολόι - Χρονολόγηση κλάδων Το μοριακό ρολόι είναι μια τεχνική στη μοριακή εξέλιξη που χρησιμοποιεί δεδομένα από απολιθώματα ή/και ρυθμούς μοριακών υποκαταστάσεων προκειμένου να προσδιορίσει τον χρόνο απόκλισης μεταξύ δύο τάξων / γενεαλογικών γραμμών στη γεωλογική ιστορία. Χρησιμοποιείται για να εκτιμηθεί ο χρόνος εμφάνισης των γεγονότων ειδογένεσης ή εξάπλωσης. Τα μοριακά δεδομένα που χρησιμοποιούνται για τέτοιους υπολογισμούς είναι συνήθως αλληλουχίες νουκλεοτιδίων ή αμινοξικές αλληλουχίες πρωτεϊνών. Μερικές φορές ονομάζεται και γονιδιακό ή εξελικτικό ρολόι. Η έννοια του μοριακού ρολογιού αποδίδεται στους Emile Zuckerkandl και Linus Pauling οι οποίοι, το 1962, παρατήρησαν ότι η γενετική απόσταση δύο αλληλουχιών που κωδικοποιούσαν την ίδια πρωτεΐνη, αλλά είχαν απομονωθεί από διαφορετικά είδη, αυξάνονταν γραμμικά με το χρόνο. Καθώς το πρότυπο αυτό επαναλαμβανόταν σε διαφορετικές πρωτεΐνες, οι ερευνητές 40

Εισαγωγή υπέθεσαν πως ο ρυθμός εξέλιξης για μια δεδομένη πρωτεΐνη είναι σταθερός στο χρόνο. Κάτι τέτοιο οδηγούσε στην ύπαρξη ενός μοριακού ρολογιού το οποίο «χτυπούσε» γρηγορότερα ή πιο αργά για διαφορετικά γονίδια αλλά παράμενε σε σταθερό ρυθμό για το ίδιο γονίδιο μεταξύ διαφορετικών φυλογενετικών γραμμών. Ωστόσο, το μοριακό ρολόι από μόνο του μπορεί απλά να λειτουργήσει συγκριτικά και δεν μπορεί να αποτυπώσει συγκεκριμένα συμβάντα ή ημερομηνίες. Για να επιτευχθεί κάτι τέτοιο θα πρέπει το μοριακό ρολόι να βαθμονομηθεί σε σχέση με ανεξάρτητα στοιχεία, χρησιμοποιώντας το αρχείο των απολιθωμάτων, γεωλογικά γεγονότα κτλ. Σε γενικές γραμμές η υπόθεση του μοριακού ρολογιού έχει γίνει αντικείμενο έντονων αντιπαραθέσεων. Πολλοί επιχειρηματολογούν ενάντια στην υπόθεση, επειδή η εισήγηση του σταθερού ρυθμού δεν φαίνεται να ταιριάζει με τον ακανόνιστο ρυθμό εξέλιξης σε μορφολογικό και φυσιολογικό επίπεδο. Η υπόθεση συνάντησε πολύ έντονη αντίδραση όταν ο σταθερός ρυθμός εξέλιξης οδήγησε στην εκτίμηση ότι ο χρόνος απόσχισης του κλάδου των ανθρώπων από τα άλλα αφρικανικά πρωτεύοντα είναι 5 εκατομμύρια χρόνια πριν από σήμερα (Sarich & Wilson 1967), κάτι που ερχόταν σε πλήρη αντίθεση με την προγενέστερη άποψη που επικρατούσε μεταξύ των παλαιοντολόγων, δηλαδή ότι ο χρόνος αυτός ήταν τα 15 εκατομμύρια χρόνια. Μεγαλύτερη αμφισβήτηση ακολούθησε όταν ο σχετικά σταθερός ρυθμός παρατηρήθηκε σε πρωτεϊνικές αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν για την υποστήριξη της θεωρίας της ουδετερότητας (Kimura 1969). Η εγκυρότητα της υπόθεσης του μοριακού ρολογιού έχει αντικρουστεί και από πολλούς εξελικτικούς βιολόγους. Πιο συγκεκριμένα, ο Goodman (1981α, β) και οι Czelusniak et al. (1982) υποστήριξαν ότι ο ρυθμός εξέλιξης συχνά επιταχύνεται αμέσως έπειτα από γονιδιακό διπλασιασμό. Για παράδειγμα, αναφέρουν χαρακτηριστικά ότι παρατήρησαν εξαιρετικά υψηλό ρυθμό αμινοξικής υποκατάστασης στο γονιδιακό διπλασιασμό που έδωσε γένεση στα γονίδια των α και β αιμοσφαιρινών και ότι αυτοί οι υψηλοί ρυθμοί οφείλονται στις επωφελείς μεταλλάξεις που βελτίωσαν τη λειτουργία των 41

Εισαγωγή αλυσίδων των σφαιρινών. Επιπλέον, οι Goodman et al. (1974, 1975) αντιτίθενται στην ίδια υπόθεση με την αιτιολογία ότι η ταχύτητα εξέλιξης των πρωτεϊνικών αλληλουχιών είναι μεγαλύτερη την περίοδο που παρατηρείται προσαρμοστική διάσπαση σε σχέση με την περίοδο που δεν έχουμε φαινόμενα ειδογένεσης. Για παράδειγμα, οι Goodman et al. (1974, 1975) και ο Goodman (1981) αναφέρουν ότι στις πρωτεΐνες του κυτοχρώματος c και στις α- και β- σφαιρίνες παρατηρήθηκε αύξηση του ρυθμού της αμινοξικής υποκατάστασης τουλάχιστον 3 φορές κατά τη διάρκεια της εξέλιξής τους. Έχει παρατηρηθεί πως ο ρυθμός εξέλιξης του ίδιου γονιδίου μεταξύ πολύ απομακρυσμένων εξελικτικά οργανισμών διαφέρει κατά πολύ (Hebert et al. 2003, Ratnasingham & Hebert 2007, Lim et al. 2012), με αποτέλεσμα να μη μπορεί να υπολογιστεί ένα «παγκόσμιο» μοριακό ρολόι. Ωστόσο, το μοριακό ρολόι ενός δοθέντος γονιδίου θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως «τοπικό» για συγγενικούς οργανισμούς μιας δεδομένης μελέτης. Εάν ισχύει μοριακό ρολόι και ο ρυθμός εξέλιξης ενός γονιδίου μπορεί να υπολογιστεί, τότε είναι πιθανή η χρονολόγηση άγνωστων χρονικά αποσχίσεων δύο γενεαλογικών γραμμών μέσω σύγκρισης των πρωτεϊνικών ή των νουκλεοτιδικών τους αλληλουχιών. Αντιστρόφως, εάν ο χρόνος απόκλισης δύο ειδών είναι γνωστός, τότε μπορεί να συναχθεί και ο ρυθμός μοριακής εξέλιξης ενός γονιδίου ενώ δεν πρέπει να αμφισβητείται ότι η ανασύσταση μιας φυλογένεσης είναι ευκολότερη και πιο ακριβής αν ληφθεί υπόψη το μοριακό ρολόι (Posada 2003). Η εφαρμογή ενός τοπικού ρολογιού, παρά τις όποιες ατέλειες, επιτρέπει τον συσχετισμό της φυλογενετικής και της βιογεωγραφικής ιστορίας με την κλίμακα του χρόνου, παρέχοντας εξελικτική πληροφορία που σε άλλη περίπτωση θα έμενε ανεκμετάλλευτη. Συνεπώς, η χρονολόγηση των γεγονότων απόκλισης είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί ως κριτήριο ελέγχου ανεξάρτητων βιογεωγραφικών (και παλαιογεωγραφικών) υποθέσεων και να βοηθήσει στην ερμηνεία των σημερινών κατανομών και στην κατανόηση των ιστορικών προτύπων εξάπλωσης (Avise 1994). 42

Εισαγωγή 5. ΠΑΛΑΙΟΓΕΩΓΡΑΦΙΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΓΕΩΛΟΓΙΑΣ ΠΑΛΑΙΟΚΛΙΜΑ Είναι γνωστό πως στο γεωλογικό χρόνο, νησιά βυθίζονται ή/και αναδύονται ως αποτέλεσμα των κινήσεων των τεκτονικών πλακών, ιδίως σε περιοχές όπου συγκρούονται οι πλάκες και όπου εμφανίζονται «νησιωτικά τόξα». Τέτοια παραδείγματα κατά το Τριτογενές (65-2,6 mya) αποτελούν τα τόξα του Παναμά και του δυτικού Ειρηνικού, καθώς και το Ελληνικό Τόξο. Το Ελληνικό Τόξο, που αναφέρεται επίσης και ως Αιγαιακό Τόξο, είναι δημιούργημα σύνθετων φαινομένων που προέρχονται από τη σύγκλιση των λιθοσφαιρικών πλακών Ευρώπης και Αφρικής. α β γ Εικόνα A1: H σχετική κίνηση των τεκτονικών πλακών μεταξύ Αφρικής- Ευρασίας και Β. Αμερικής από τα 60 εκ. χρόνια έως σήμερα αναφορικά με τρία σημεία α) Απουλία στη Ν.Ιταλία 39.7"N, 18.3"E, β) Ιεράπετρα Κρήτης 35.0"N, 25.8"E και γ) νότια του Bey Dagları της Τουρκίας 36.4"N, 30.2"E. Η Ευρασιατική πλάκα έχει θεωρηθεί σταθερή για το εύληπτο του σχήματος (van Hinsbergen & Schmid 2012). 43

Εισαγωγή Η διεύθυνση της βύθισης της Αφρικανικής πλάκας υπολογίζεται ότι είναι ΒΒΑ, ενώ η ταχύτητα της βύθισης 2,5-3,5 cm/έτος. Με τη σύγκλιση αυτή λαμβάνει χώρα βύθιση της πλάκας της Αφρικής κάτω από την Ευρώπη, το ενεργό περιθώριο της οποίας συνιστά τον ελληνικό χώρο. Η βύθιση πιστεύεται ότι είναι αμφιθεατρική και στο γεγονός αυτό οφείλεται το "τοξοειδές" σχήμα του Ελληνικού Τόξου. Η συνεχής κίνηση της Αφρικανικής πλάκας προς το βορρά είχε ως αποτέλεσμα την έντονη ορογένεση που παρήγαγε σύνθετη γεωμορφολογία, με μεγάλες οροσειρές (Άλπεις, Δειναρίδες, Ελληνίδες και τα βουνά του Ταύρου) και πολυάριθμα νησιά (van Hinsbergen & Schmid 2012). Εικόνα A2: Απεικόνιση του ηφαιστειακού τόξου (volcanic arc) και του τόξου των Ελληνίδων οροσειρών (ή τόξο ιζηματογενών πετρωμάτων Ιόνια νησιά, Κρήτη, Ρόδος, ΝΔ Τουρκία - Hellenic orogenic arc). Η μεταξύ τους απόσταση ανέρχεται στα 120 km. Επιπλέον διακρίνεται το ρήγμα της Ανατολικής Μεσογείου (Eastern Mediterranean Ridge), καθώς και το ρήγμα της Β. Ανατολίας (North Anatolian Fault), το οποίο μετακινείται προς τα δυτικά. Με τα κόκκινα βέλη διακρίνονται οι κινήσεις των επιμέρους τεκτονικών πλακών. 44

Εισαγωγή Οι ελληνικές οροσειρές που ανήκουν στο Δειναρικό κλάδο του Αλπικού συστήματος αλύσεων ορέων, υποδιαιρούνται σε γεωτεκτονικές ζώνες η κάθε μία από τις οποίες συνίσταται από ορισμένη στρωματογραφική διαδοχή των ιζημάτων της, από τους ιδιαίτερους λιθολογικούς χαρακτήρες της και από την ιδιαίτερη τεκτονική της συμπεριφορά, στοιχεία που εξαρτώνται από την παλαιογεωγραφική της θέση. Οι ελληνικές γεωτεκτονικές ζώνες, οι οποίες συνηθίστηκε να λέγονται απλά "Ελληνίδες ζώνες", είναι από τα Ανατολικά προς τα Δυτικά οι εξής (Εικόνα Α3, Mountrakis et al. 1983): 1) Η μάζα της Ροδόπης 2) Η Σερβομακεδονική μάζα 3) Η Περιροδοπική ζώνη 4) Η ζώνη Παιονίας 5) Η ζώνη Πάικου 6) Η ζώνη Αλμωπίας 7) Η Πελαγονική ζώνη Οι τρεις αυτές ζώνες είναι περισσότερο γνωστές με το κοινό όνομα Ζώνη Αξιού. 8) Η Αττικοκυκλαδική ζώνη 9) Η Υποπελαγονική ζώνη ή ζώνη Ανατολικής Ελλάδας 10) Η ζώνη Παρνασσού-Γκιώνας 11) Η ζώνη Ωλονού-Πίνδου 12) Η ζώνη Γαβρόβου-Τρίπολης 13) Η Αδριατικοϊόνιος ζώνη 14) Η ζώνη Παξών ή Προαπουλία 45

Εισαγωγή Εικόνα. Α3: Γεωτεκτονικό σχήμα των Ελληνίδων ζωνών. Rh: Μάζα της Ροδόπης, Sm: Σερβομακεδονική μάζα, CR: Περιροδοπική ζώνη, (Pe: Ζώνη Παιανίας, Pa: Ζώνη Πάικου, Al: Ζώνη Αλμωπίας) = Ζώνη Αξιού, ΡΙ: Πελαγονική ζώνη, Αc: Αττικό- Κυκλαδική ζώνη, Sp: Υποπελαγονική ζώνη, Pk: Ζώνη Παρνασσού - Γκιώνας, P: Ζώνη Πίνδου, G: Ζώνη Γαβρόβου - Τρίπολης, Ι: Ιόνιος ζώνη, Px: Ζώνη Παξών ή Προαπούλια, Au: Ενότητα Ταλέα όρη - πλακώδεις ασβεστόλιθοι πιθανόν της Ιονίου ζώνης. (Mountrakis et al. 1983) 46

Εισαγωγή Εκτός από τις παραπάνω δεκατέσσερις ζώνες, αναφέρονται ακόμη ως διακριτές γεωτεκτονικές μονάδες η Ενότητα "Ταλέα όρη - πλακώδεις ασβεστόλιθοι" που μάλλον ανήκει στην Αδριατικοϊόνιο ζώνη, καθώς και η Ενότητα Βοιωτίας, που πιθανόν είναι τμήμα της Υποπελαγονικής ζώνης. Από τις γεωτεκτονικές ζώνες της Ελλάδας οι μάζες Ροδόπης και Σερβομακεδονικής θεωρούνται ότι αποτελούν την "Ελληνική Ενδοχώρα", οι ζώνες Περιροδοπική, Παιονίας, Πάικου, Αλμωπίας, Πελαγονική, Αττικοκυκλαδική και Υποπελαγονική ονομάζονται "Εσωτερικές Ελληνίδες" και οι ζώνες Παρνασσού-Γκιώνας, Ωλονού-Πίνδου, Γαβρόβου-Τρίπολης, Αδριατικοϊόνιος και Παξών ονομάζονται "Εξωτερικές Ελληνίδες". 5.1. Γεωδυναμική και γεωτεκτονική εξέλιξη του αλπικού συστήματος στον ελληνικό χώρο Η γεωτεκτονική θέση της Ελλάδας στο γεωλογικό παρελθόν, όπως άλλωστε και σήμερα, βρίσκονταν στον ευρύτερο χώρο όπου λάμβαναν χώρα οι τεκτονικές διεργασίες στα όρια των λιθοσφαιρικών πλακών Λαυρασίας και Γκοντβάνας. Ο ελληνικός χώρος είναι δημιούργημα του Αλπικού γεωτεκτονικού κύκλου, όπως και ολόκληρη η Νότια Ευρώπη (Νέα Ευρώπη). Οι οροσειρές της Νέας Ευρώπης ανήκουν στην αλυσίδα ορέων που αρχίζει από τα Πυρηναία και καταλήγει στα Ιμαλάια και την Κίνα, και περιλαμβάνει τις οροσειρές των Άλπεων, τα Καρπάθια, τα όρη Βαλκάν, την Ποντιακή άλυσο, τον Καύκασο, τις Δειναρίδες, Ελληνίδες, Ταυρίδες οροσειρές, τα όρη Ζάγκρος του Ιράν, τα όρη του Αφγανιστάν κλπ. Οι οροσειρές της Νότιας Ευρώπης μαζί με τις οροσειρές της Βόρειας Αφρικής (Άτλας, όρη της Αλγερίας και της Τυνησίας) είναι δημιουργήματα του Αλπικού γεωτεκτονικού κύκλου ή απλά της Αλπικής ορογένεσης που έλαβε χώρα στο Μεσοζωικό και στο Τριτογενές. Ο μηχανισμός της Αλπικής ορογένεσης οφείλεται στην σύγκρουση των δύο ηπειρωτικών λιθοσφαιρικών πλακών, της Ευρασίας και της Γκοντβάνας, σύγκρουση που 47

Εισαγωγή προκάλεσε την πτύχωση των ιζημάτων που αποτέθηκαν στον ωκεανό της Τηθύος, ο οποίος χώριζε τις δύο ηπείρους. Τα πτυχωμένα νέα ιζήματα μαζί με τμήματα του κατεστραμμένου ωκεάνιου φλοιού της Τηθύος συγκολλήθηκαν στον ηπειρωτικό φλοιό των περιθωρίων των δύο λιθοσφαιρικών πλακών και σχημάτισαν τις αλυσίδες ορέων του Αλπικού ορογενετικού συστήματος στα περιθώρια των πλακών. Το Αλπικό ορογενετικό σύστημα αναφέρεται και ως ορογενετικό σύστημα της Τηθύος (Mountrakis et al. 1983, Robertson and Mountrakis 2006). 5.1.1. Παλαιογεωγραφική εξέλιξη των Ελληνίδων ζωνών Κατά το Τριαδικό η ιζηματογένεση θεωρείται σχετικά ομοιόμορφη νηριτική για ολόκληρο τον ελληνικό χώρο που βρισκόταν κάτω από τη στάθμη της θάλασσας της Τηθύος. Από το Ύστερο Τριαδικό αρχίζει η διαμόρφωση των χώρων βαθύτερης ιζηματογένεσης που ήταν η αύλακα της ζώνης Παιονίας και η αύλακα της ζώνης Ωλονού-Πίνδου, όπου και αποτίθενται ιζήματα πελαγικά. Στο Λιάσιο (Πρώιμο Ιουρασικό) διαμορφώνονται σε χώρους πελαγικής ιζηματογένεσης η ζώνη Αλμωπίας και η Αδριατικοϊόνιος ζώνη, όπου από το Δογγέριο (Μέσο Ιουρασικό) αποτίθενται πελαγικά-ημιπελαγικά ιζήματα (σχιστοκερατολιθική διάπλαση, πελαγικοί ασβεστόλιθοι), όπως και στις ζώνες Παιονίας και Πίνδου. Αντίθετα, στις υπόλοιπες ισοπικές ζώνες εξακολουθεί η νηριτική ανθρακική ιζηματογένεση (ασβεστόλιθοι, δολομίτες κτλ). Την περίοδο Ύστερου Ιουρασικού - Πρώιμου Κρητιδικού εκδηλώνεται η ονομαζόμενη πρώιμη ορογενετική δράση που πλήττει τις εσωτερικές ελληνικές ζώνες και προκαλεί πτύχωση των σχηματισμών τους. Ταυτόχρονα προκαλείται απόσυρση της θάλασσας και προσωρινή ανάδυση των εσωτερικών ζωνών και χέρσωση αυτών κατά το Πρώιμο Κρητιδικό. Η διακοπή αυτή της ιζηματογένεσης που μεταφράσθηκε σε συγκεκριμένο στρωματογραφικό κενό κατά το Πρώιμο Κρητιδικό στις εσωτερικές ζώνες, δεν έλαβε χώρα στις εξωτερικές ζώνες, όπου η 48

Εισαγωγή ιζηματογένεση συνεχίσθηκε αδιάκοπη χωρίς στρωματογραφικό κενό (Robertson and Mountrakis 2006, Jolivet and Brun 2010, Kafousia et al. 2011). Στο Μέσο Κρητιδικό η στάθμη της θάλασσας ανήλθε και κάλυψε και πάλι το χώρο των Εσωτερικών Ελληνίδων με τη λεγόμενη Μέσο - Υστερο Κρητιδική επίκλυση της θάλασσας ή «επίκλυση του Κενομανίου», η οποία απέθεσε τα Μέσο-Ύστερο Κρητιδικά στρώματα με ασυμφωνία πάνω στους πτυχωμένους προ-κρητιδικούς σχηματισμούς. Σε πολλές περιοχές η έναρξη της επίκλυσης σημαδεύεται από την απόθεση ως πρώτου στρώματος ενός κροκαλοπαγούς επίκλυσης (κροκαλοπαγές βάσης) το οποίο παρατηρείται μόνο στις εσωτερικές ζώνες και όχι στις εξωτερικές, όπου η ιζηματογένεση συνεχίσθηκε αδιατάρακτη. Στο Ύστερο Κρητιδικό η ιζηματογένεση συνεχίζεται πελαγική, κυρίως με πυριτικούς πλακώδεις ασβεστόλιθους, στις αύλακες και ανθρακική νηριτική στις ζώνες-υβώματα. Στο Ύστερο Κρητιδικό αρχίζει κατά ζώνες η απόθεση του τελικού φλύσχη που διήρκησε κατά ζώνη μέχρι το Μειόκαινο. Σχεδόν ταυτόχρονα, δηλαδή στο τέλος του Κρητιδικού - αρχές Τριτογενούς αρχίζει η τελική ορογενετική διεργασία των Ελληνίδων που οδηγεί στην οριστική τους ανάδυση. Το ορογενετικό κύμα αρχίζει από τα ανατολικά από το όριο ενδοχώρας - εσωτερικών ζωνών και σταδιακά προωθείται προς τα δυτικά στις εξωτερικές ζώνες. Η ανάδυση των ισοπικών ζωνών 1 γίνεται η μια μετά την άλλη και ακολουθεί την απόθεση του φλύσχη που αποτίθεται σε κάθε ζώνη από τα ανατολικά προς τα δυτικά σταδιακά αργότερα. Για τον λόγο αυτόν ο φλύσχης θεωρείται για τον ελληνικό χώρο ως το τελευταίο αλπικό ίζημα. Έτσι η ανάδυση των εσωτερικών ζωνών γενικά τοποθετείται στο τέλος Κρητιδικού - αρχές Παλαιοκαίνου, ενώ η Υποπελαγονική ζώνη πιστεύεται ότι αναδύθηκε στο Ύστερο Ηώκαινο, όπως και η ζώνη Παρνασσού-Γκιώνας. Η ανάδυση της Πίνδου έγινε στο πρώιμο Ολιγόκαινο, της ζώνης Γαβρόβου-Τρίπολης στο ύστερο Ολιγόκαινο, της Αδριατικοϊονίου στο πρώιμο Μειόκαινο και της ζώνης Παξών στο τέλος 1 Οι ισοπικές ή γεωτεκτονικές ζώνες είναι μεγάλες γεωλογικές ενότητες, που η κάθε μια από αυτές έχει τους δικούς της λιθολογικούς, παλαιογεωγραφικούς, τεκτονικούς χαρακτήρες και έχουν την ίδια τεκτονο-ιζηματογενή εξέλιξη στη διάρκεια του Αλπικού ορογενετικού κύκλου. 49

Εισαγωγή Μειόκαινου - πρώιμου Πλειόκαινο (Robertson and Mountrakis 2006, Jolivet and Brun 2010, Kafousia et al. 2011). 5.2. Διαμόρφωση του ελλαδικού χώρου 5.2.1. Η περιοχή της Ροδόπης Η διαμόρφωση της περιοχής της Ροδόπης φαίνεται να έχει πραγματοποιηθεί σε δύο στάδια. Στις αρχές του Ηώκαινου ξεκίνησε μια επέκταση ξηράς (ανάδυση φλοιού) της περιοχής η οποία επηρέασε στα βορειοδυτικά το τεκτονικό βύθισμα της περιοχής Mesta ενώ στα ανατολικά τη λεκάνη της Θράκης. Αυτή η επέκταση ήταν το συνδυαστικό αποτέλεσμα δύο αντίστροφων περιστροφικών κινήσεων, όπως απεικονίζονται στα σημεία Α (δεξιόστροφη περιστροφή) και A (αριστερόστροφη περιστροφή) του χάρτη (Εικόνα Α4, van Hinsbergen & Schmid 2012). Κατά το δεύτερο στάδιο κυρίως μετά τα 17 mya- συντελέστηκε ευρεία επέκταση (περί τα 150 km) η οποία εντοπίζεται κατά μήκος της λεγόμενης «αποκόλλησης του Στρυμόνα» και περιλαμβάνει μια επιπλέον δεξιόστροφη περιστροφή 25 ο του πόλου Α στον κατακόρυφο άξονα της χερσονήσου της Χαλκιδικής (σημείο Α στο χάρτη) και των περιοχών στα δυτικά και νότια. Η εκκίνηση αυτού του σταδίου χρονολογείται στα 25 mya, οπότε και σταμάτησε η επέκταση της Θρακικής λεκάνης. Η περιοχή της περιστροφής οριοθετείται από μια δομή στα δυτικά της Λέσβου και της χερσονήσου Biga (van Hinsbergen & Schmid 2012). 5.2.2 Ανατολική ηπειρωτική Ελλάδα, δυτικές Κυκλάδες, Εύβοια. Το δυτικό όριο του «ρήγματος απόσχισης» που διατρέχει την ανατολική ηπειρωτική Ελλάδα εντοπίζεται περίπου 60 km βόρεια του Ολύμπου, συνεχίζει 50

Εισαγωγή στη δυτική πλευρά του Ολύμπου, της Όσσας και του Πηλίου, και καταλήγει στις ανατολικές ακτές της Εύβοιας. Στη νότιο Εύβοια, αυτό το «ρήγμα απόσχισης» μεταφέρεται στα νοτιοδυτικά κατά μήκος του ρήγματος μετασχηματισμού της Αττικής Εύβοιας σε μια θέση μεταξύ της Πελοποννήσου και των δυτικών Κυκλάδων. Με δεδομένη την απουσία αντίστοιχων σημαντικών ρηγμάτων μετασχηματισμού που να οριοθετούν μια περιοχή επέκτασης της ξηράς στα βορειοδυτικά, η επέκταση ξηράς που πραγματοποιήθηκε αποδίδεται σε μια περιστροφή στον κάθετο άξονα της ηπειρωτικής Ελλάδας σε σχέση με τη Χαλκιδική. Το σημείο περιστροφής εντοπίζεται στα 60 km βόρεια του Ολύμπου, που είναι και το δυτικό όριο του ρήγματος απόσχισης όπως αναφέρθηκε παραπάνω (Εικόνα Α5-Πόλος B). Η περιστροφή αυτή υπολογίζεται στις 15 ο κατά τη διάρκεια του Μειόκαινου και καταλήγει στην ευθυγράμμιση του εν λόγω ρήγματος απόσχισης στα δυτικά του Ολύμπου και της Όσσας με το νοτιοδυτικό όριο της χερσονήσου της Χαλκιδικής. Η κάθετη περιστροφή της δυτικής Ελλάδας είναι το συνδυασμένο αποτέλεσμα των περιστροφών στην ΒΔ Ροδόπη (Εικόνα Α5-Πόλος Α) και βόρεια του Ολύμπου (Εικόνα Α5-Πόλος Β). Συνολικά, η περιστροφή που πραγματοποιήθηκε υπολογίζεται στις 40 ο τα τελευταία 25 mya. Αξίζει επίσης να σημειωθεί η μεγάλη μετακίνηση, λόγω της επέκτασης ξηράς, της Εύβοιας τα τελευταία 25 mya. Ενώ στα 25 mya η Εύβοια εντοπίζεται πλησίον της Χαλκιδικής και παράλληλη και γειτνιάζουσα με τη Λέσβο και τη χερσόνησο Biga, στη συνέχεια λόγω της περιστροφής στον άξονα της Χαλκιδικής (Εικόνα Α5-Πόλος Β) η Εύβοια αρχίζει να μετακινείται προς τα ΝΔ δηλαδή προς της σημερινή γνωστή γεωγραφική της θέση. Σημαντικότατο ρόλο σε όλη αυτή τη μετακίνηση έπαιξε η κίνηση της πλάκας της Ανατολίας προς δυσμάς. Την τελική σύγχρονη γεωγραφική της θέση λαμβάνει μετά τα 15-10 mya (Μέσο Μειόκαινο) με μια τελική μετατόπισή της εξαιτίας των συνδυαστικών περιστροφών στους άξονες Β και C (Εικόνα Α5 και Α6). Στην περιοχή που καλύπτεται από τις βορειοδυτικές Κυκλάδες καθώς και τη θαλάσσια περιοχή βορειοανατολικά των δυτικών Κυκλάδων, 51

Εισαγωγή παρατηρήθηκαν επεκτάσεις ξηράς ως αποτέλεσμα των περιστροφών γύρω από τους δύο άξονες (Α και Β). Το σύνολο της επέκτασης κατά μήκος του μεσοκυκλαδικού ρήγματος (Εικόνα Α5, Mid-Cycladic lineament MCD) υπολογίζεται στα 300 km (Εικόνα Α5). Το μεσο-κυκλαδικό ρήγμα οριοθετεί και την περιοχή που υποβλήθηκε σε ΒΑ-ΝΔ επέκταση ξηράς. 5.2.3. Νότιο Αιγαίο - Πελοπόννησος Στο νότιο Αιγαίο τα εκτατικά μεταμορφωμένα πετρώματα διατρέχουν τη νότιο Πελοπόννησο, τα Κύθηρα Αντικύθηρα και μέσω της Κρήτης φτάνουν στην Κάσο. Όπως και στην περίπτωση των Κυκλάδων, δύο κύριες διαγραμμίσεις μπορούν να διακριθούν στο «παράθυρο του Νότιου Αιγαίου»: στην Πελοπόννησο και τα Κύθηρα επικρατούν ΒΑ-ΝΔ προς ΒΑ-ΔΝΔ εκτατικές τάσεις ενώ στην Κρήτη εμφανίζονται σταθερά Β-Ν τάσεις. Τα όρια του εκτατικού συμπλέγματος μεταμορφωμένων πετρωμάτων του νοτίου Αιγαίου μπορεί να οριοθετηθεί μόνο: Α) στην Πελοπόννησο, όπου το τεκτονικό παράθυρο του Χελμού τέμνει το κάλυμμα επωθήσεων των ζωνών Πίνδου και Τρίπολης και Β) στη νοτιοανατολική Πελοπόννησο και την Κρήτη, όπου διαπερνά τα οφιολιθικά πετρώματα της δυτικής Ελλάδας (χρονολογούνται στο Ιουρασικό) και της Τουρκίας (χρονολογούνται στο άνω Κρητιδικό). Στην περίπτωση της Πελοποννήσου, το μήκος του παραθύρου βαθμιαία μειώνεται στα ΒΔ. Το βορειότερο σημείο όπου υπάρχει έκθεση της μονάδας Φυλλιτών-Χαλαζίτη είναι στο παράθυρο του Χελμού. Το βορειότερο άκρο του συμπλέγματος μεταμορφωμένων πετρωμάτων του νότιου Αιγαίου πιθανώς σχηματίζεται από το ρήγμα της Ιτέας-Άμφισσας στο βόρεια του Κορινθιακού κόλπου (Εικόνα A6-Πόλος C). Πρόκειται για ένα ρήγμα με διεύθυνση Α-Δ και με σχετικά ταυτόχρονη μικρή επέκταση γης 9 km που δημιουργεί μια ρηχή λεκάνη (18-8 mya). Στην Ιτέα-Άμφισσα εντοπίζεται και ο πόλος της περιστροφής (Εικόνα Α6) που οδήγησε σε επέκταση ξηράς 55 km «δημιουργώντας» το μεσαίο πόδι της Πελοποννήσου. Η λήξη αυτής της 52

Εισαγωγή περιστροφής χρονολογείται στα 9 mya. Η Πελοπόννησος παρέμενε ενωμένη με την υπόλοιπη ηπειρωτική Ελλάδα τουλάχιστον μέχρι τα 5 mya. Από τα 4 mya και έπειτα ξεκίνησε η δημιουργία του Κορινθιακού κόλπου (van Hinsbergen 2005, Jolivet & Brun, 2010, Hinsbergen & Schmid 2012). Τέλος, στη διαμόρφωση τόσο της ηπειρωτικής Ελλάδας όσο και της περιοχής του Αιγαίου συνετέλεσε και μια ακόμη περιστροφή εκτός ελλαδικού χώρου. Η αριστερόστροφη αυτή περιστροφή έλαβε χώρα στην περιοχή της δυτικής Ανατολίας (πόλος D, στο Μεντερέ της Τουρκίας) μεταξύ 15 mya και 5 mya και το μέγεθός της υπολογίζεται σε 27,6 ο ±5,0 ο. Η περιστροφή αυτή συνέβαλε στον αποχωρισμό του βόρειου Αιγαίου από το νότιο Αιγαίο-δυτική Ανατολία (Εικόνα Α7 και Α8). Σημαντικό σημείο στην ανασύσταση του ελλαδικού χώρου είναι το γεγονός πως η Κεφαλονιά σε καμιά φάση δεν αποτελούσε μέρος του όλου «ελλαδικού» συστήματος αλλά η Πελοπόννησος και συνολικά η Δυτική Ελλάδα, με τις περιστροφές και την επέκταση της μάζας ξηράς που συντελέστηκαν, προσέγγισε τελικώς τη νήσο της Κεφαλονιάς (Εικόνα Α8). 53

Εισαγωγή 45 mya Εικόνα A4: Σχηματική απεικόνιση της διαμόρφωσης της περιοχής της Ροδόπης 25 mya 5 mya για την περίοδο από τα 45 mya έως σήμερα. Απεικονίζονται οι δύο πόλοι με αντίθετη περιστροφή. Αρχικά συντελείται μια μικρή επέκταση ξηράς περί τα 15 km, λόγω της περιστροφικής κίνησης του πόλου Α ( 60 km ΒΔ της Χαλκιδικής) και πόλου Α (νοτιανατολικά της Ροδόπης) κατά 2 ο. Ωστόσο, αργότερα η επέκταση αυτή ήταν πολύ μεγαλύτερη (λόγω της ευρείας περιστροφής του πόλου Α κατά 25 ο ) και υπολογίζεται ότι το εύρος της ήταν περί τα 150km. (van Hinsbergen & Schmid 2012).

Εισαγωγή 25 mya Εικόνα A5: Σχηματική απεικόνιση της κίνησης των μεταμορφωμένων πετρωμάτων που επηρεάζουν την ανατολική ηπειρωτική Ελλάδα και τις δυτικές Κυκλάδες από τα 25 mya, σε σχέση με τη μάζα της Μοεσίας (η οποία θεωρείται σταθερή). Στη δεύτερη (κάτω) εικόνα 5 mya πραγματοποιείται υπέρθεση αυτών των κινήσεων συνδυαστικά με τις κινήσεις της διαμόρφωσης της Ροδόπης (βλέπε. και Εικόνα Α3). AETF = Attica Evvia Transfer Fault; EMGD = Eastern Mainland Greece Detachment; MCL = Mid Cycladic Lineament; SD = Strymon Detachment; WBD = West Biga Detachment; WMGD = Western Mainland Greece Detachment. (van Hinsbergen & Schmid 2012). 55

Εισαγωγή 20 mya Εικόνα Α6: Σχηματική απεικόνιση των εκτατικών μεταμορφωμένων πετρωμάτων της Πελοποννήσου, ως αποτέλεσμα και της περιστροφής στον πόλο C (=Ιτέα Άμφισσα), από τα 20 mya σε σχέση με την πλάκα της Μοεσίας (θεωρείται σταθερή/αμετακίνητη). Οι κινήσεις παρατίθενται συνδυαστικά με τις κινήσεις 5 mya στον πόλο βόρεια της Χαλκιδικής (Α) και του Ολύμπου (Β). AETF = Attica-Evvia Transfer Fault; CD = Cretan Detachment; EMGD = Eastern Mainland Greece Detachment; KKD = Kea-Kythnos Detachment; MCL = Mid-Cycladic Lineament; SD = Strymon Detachment; WBD = West Biga (van Hinsbergen & Schmid 2012). 56

Εισαγωγή 25 mya 15 mya Εικόνα Α7: Σχηματική απεικόνιση των νοτιοανατολικών Κυκλάδων, της Κρήτης και της περιοχής Μέντερες στην ΝΔ Τουρκία από τα 25 mya σε σχέση με την πλάκα της Μοεσίας (θεωρείται σταθερή/αμετακίνητη) και τη νοτιοδυτική Τουρκία. Οι κινήσεις αυτές παρατίθενται συνδυαστικά με τις προαναφερθείσες κινήσεις του δυτικού και νότιου Αιγαίου. AD = Alaşehir Detachment; AETF = Attica Evvia Transfer Fault; BMD = Büyük Menderes detachment; CD = Cretan Detachment; EMGD = Eastern Mainland Greece Detachment; EMTF = East Menderes 5 mya Transfer Fault; KKD = Kea Kythnos detachment; MCD = Mid Cycladic Detachment; SD = Strymon Detachment; SiD = Simav Detachment; WBD = West Biga Detachment; WMTF = West Menderes Transfer Fault. (van Hinsbergen & Schmid 2012). 57

Εισαγωγή 25 mya 15 mya Present Εικόνα Α8: Σχηματική απεικόνιση σε τρία «στιγμιότυπα» της εξέλιξης του ελλαδικού χώρου. Την περίοδο από 25-15 mya η επέκταση μάζας ξηράς προκαλείται από δύο συνδυαστικές δεξιόστροφές περιστροφές της δυτικής Ελλάδας: Πόλος Α =Βόρεια του τεκτονικού βυθίσματος του Νέστου (Mesta graben) και Πόλος Β= 60 km βόρεια του όρους Όλυμπος Μετά τα 15 mya, η επέκταση της μάζας ξηράς προκύπτει από τη δεξιόστροφη περιστροφή της δυτικής Ελλάδας και την αριστερόστροφη περιστροφή της νοτιοδυτικής Ανατολίας Πόλος D= Η Μεσοκυκλαδική τάφρος διαχωρίζει τις δύο αντίρροπα περιστρεφόμενες περιοχές. Η επέκταση ξηράς κάθετα στο ρήγμα/τάφρο και με ΒΒΑ-ΝΝΔ κατεύθυνση ανέρχεται σε συνολικά 400 km (110 km την περίοδο 25-15 mya και 290 km από τα 15 mya έως σήμερα) και συσχετίζεται με την επέκταση ξηράς 650 km παράλληλα του ρήγματος μεταξύ της ΒΔ Πελοποννήσου και της Ρόδου (van Hinsbergen & Schmid 2012). 58

Εισαγωγή 5 mya Εικόνα Α9: Ανασυγκρότηση του ελλαδικού χώρου στα 5 mya, με απεικόνιση των δομών που διαμόρφωσαν την περιοχή του Αιγαίου-Δύσης. Παρατίθενται οι ηλικίες και η φορά της μετακίνησής τους (van Hinsbergen and Schmid 2012). 59

Εισαγωγή Συνοψίζοντας, κατά την περίοδο 25 15 mya, η επέκταση γης στο Αιγαίο και τη δυτική Ανατολία υπήρξαν ανισοκατανεμημένες με μικρές δεξιόστροφες περιστροφές (4 ο ) σε πόλους (βλέπε Εικόνα Α7) κυρίως στη ΒΔ Ελλάδα (πόλοι Α, Β, C). Ωστόσο, μετά τα 15 mya το σύστημα Αιγαίου-δυτικής Ανατολίας υπήρξε περισσότερο συμμετρικό, με την ανατολική και δυτική πλευρά να υφίστανται περιστροφές ξηράς τόσο στη ΒΔ Ελλάδα όσο και στην Ανατολία με αντίστροφη φορά (βλέπε Εικόνα Α7, πόλος D). Οι μελέτες ανασύστασης των γεωλογικών γεγονότων ευθυγραμμίζουν τα ρήγματα των μεταμορφωμένων συμπλεγμάτων που συνετέλεσαν στην επέκταση της ξηράς του Αιγαίου και σε μια αρχική ΒΒΑ- ΝΝΔ κατεύθυνση και παρουσιάζουν δεξιόστροφη περιστροφή 40 ο στη δυτική Ελλάδα τα τελευταία 25 mya, εκ των οποίων οι 30 ο χρονολογούνται να πραγματοποιήθηκαν τα τελευταία 17 mya. Αντίστοιχα, στη ΝΔ Τουρκία, τις ΝΑ Κυκλάδες και την Κρήτη οι μελέτες προσδιορίζουν αριστερόστροφη περιστροφή (σε σχέση με την Ανατολία) 28 ο. Αποτέλεσμα των δύο αντίθετων περιστροφών ήταν και ο αποχωρισμός των δύο περιοχών στο σημείο του Μεσο-Κυκλαδικού ρήγματος. Η επέκταση γης (κάθετα με το Μεσο-Κυκλαδικό ρήγμα) ανέρχεται συνολικά στα 400 km τα τελευταία 25 mya (110 km κατά τα 25-15 mya και 290 km κατά τα 15-0 mya) σε ΒΒΑ-ΝΝΔ διεύθυνση και σχετίζεται με ταυτόχρονη επέκταση ξηράς παράλληλη με το μεσο-κυκλαδικό ρήγμα μεταξύ της Ρόδου και της ΝΔ Πελοποννήσου η οποία ανέρχεται στα 650 km. Αποτέλεσμα του αποχωρισμού των δύο αντιστρόφως περιστρεφόμενων περιοχών ήταν και η δημιουργία της Μεσαιγαιακής Τάφρου η οποία είχε κατεύθυνση ΒΔ. Η δημιουργία της Μεσαιγαιακής Τάφρου (Mid-Aegean Trench- Μειόκαινο, 12-9 mya) ξεκίνησε με την εισροή νερού μεταξύ της σημερινής Κρήτης και του συγκροτήματος Κάσου- Καρπάθου. Η τάφρος διαχώρισε τα νησιά του ανατολικού Αιγαίου από τις Κυκλάδες και την Κρήτη. Ταυτόχρονα με τη δημιουργία της τάφρου, πραγματοποιήθηκε εισροή υδάτων και μεταξύ της Κρήτης και των Κυκλάδων απομονώνοντας την Κρήτη για πρώτη φορά (Lymberakis & Poulakakis 2010). Η δημιουργία της τάφρου διήρκησε περί τα 3 my και είχε βόρεια κατεύθυνση. Στο Τορτόνιο (10,5-7,5 mya), η λεκάνη του Κρητικού Πελάγους καθιζάνει με 60

Εισαγωγή αποτέλεσμα την εισροή θαλάσσιων υδάτων και την απαρχή της δημιουργίας του Αιγαίου Πελάγους. Παρατηρείται βάθυνση του Κρητικού Πελάγους αλλά και ανύψωση ορεινών όγκων (Ίδη). Η εισροή των γλυφών ή/και θαλάσσιων νερών οδηγεί στον κατακερματισμό της Κρήτης και την αποκοπή της, για πρώτη φορά, από την ενιαία μάζα ξηράς. Εν συνεχεία, βορειότερα, η θάλασσα που διεισδύει χωρίζει τις Κυκλάδες από τα νησιά του Αν. Αιγαίου και την Πελοπόννησο. Ωστόσο η σύνδεση των Κυκλάδων διατηρείται τόσο με την Αττική όσο και με τη νότιο Εύβοια αυτή την περίοδο. 5.2.4. Η περιοχή του Αιγαίου Επιπρόσθετα με τις περιστροφικές κινήσεις και τις επεκτάσεις της μάζας ξηράς υπήρξαν και άλλα γεγονότα τα οποία διαμόρφωσαν την ιστορία του αιγαιακού χώρου (κυρίως μετά τα 15 mya). Κατά το Μεσσήνιο (5,971 5,33 mya, Manzi et al. 2013), λόγω σύγκρουσης της βορειοδυτικής Αφρικής με την Ιβηρική χερσόνησο, τα στενά του Γιβραλτάρ έκλεισαν με αποτέλεσμα η επικοινωνία της Μεσογείου με τον Ατλαντικό ωκεανό να διακοπεί. Το γεγονός αυτό οδήγησε στην αποστράγγιση της περιοχής και στη γνωστή «κρίση αλατότητας». Χαρακτηριστικά της κρίσης ήταν η ανύψωση πολλών περιοχών και οι εκτεταμένες γέφυρες ξηράς που αποτέλεσαν διαδρόμους επικοινωνίας και μετακίνησης πολλών πανιδικών και χλωριδικών στοιχείων, καθώς και η δημιουργία μεγάλων και αλμυρών λιμνών και κλειστών θαλασσών στην περιοχή του Αιγαίου, οι οποίες όμως θα πρέπει να ήταν «νεκρές» εξαιτίας της υψηλής αλατότητας (Dermitzakis 1990). Κατά το Μεσσήνιο το κλίμα δεν άλλαξε σημαντικά, όμως η κρίση αλατότητας οδήγησε σε πιο άνυδρες συνθήκες. Η κρίση αλατότητας έλαβε τέλος κατά το κατώτερο Πλειόκαινο και συγκεκριμένα στο τέλος του Μεσσήνιου (5,33 mya), μετά την αποκατάσταση της επικοινωνίας της Μεσογείου με τον Ατλαντικό (στενά Γιβραλτάρ) και την άνοδο της στάθμης της θάλασσας. Σε αυτήν την περίοδο αρχίζει να 61

Εισαγωγή μορφοποιείται το Αιγαίο πέλαγος. Η Κρήτη αποχωρίζεται από την ηπειρωτική Ελλάδα (Dermitzakis & Papanikolaou 1981, Hinsberger and Schmid 2012 και αναφορές που περιλαμβάνονται εκεί). Η ανατολική Κρήτη ενώνεται με τη δυτική και παρατηρείται ο σχηματισμός των κόλπων Ηρακλείου και Μεσσαράς, οι νότιες και κεντρικές Κυκλάδες «απομονώνονται» αποτελώντας ενιαία ξηρά, και οι βόρειες Κυκλάδες ενώνονται μέσω της Εύβοιας με την ηπειρωτική Ελλάδα. Ακολουθεί αύξηση του ρυθμού ανύψωσης των τεκτονικών πλακών κατά το Πλακέντιο (Ύστερο Πλειόκαινο 4,5-3,5 mya) που οδηγεί σε αλλαγές κυρίως στο σχήμα των νησιών και των ηπειρωτικών περιοχών. Για παράδειγμα, στην Κρήτη σημειώνεται ανύψωση ορεινών όγκων άνω των 2000 m με ταυτόχρονη υποχώρηση του θαλάσσιου βυθού. Οι νότιες περιοχές της Κρήτης καταβυθίζονται (καταβύθιση Γαύδου, Παξιμαδιών που οδηγεί σε σημαντική μείωση του μεγέθους τους). Κατά αυτή την περίοδο δημιουργείται ο νότιος Ευβοϊκός, ο οποίος χωρίζει τη νότιο Εύβοια από την Αττική. 5.3. Διαμόρφωση του ελλαδικού χώρου κατά το Πλειστόκαινο (2,58 0,0117 mya) Με την έναρξη του Πλειστοκαίνου (2,58 0,0117 mya) ξεκινούν οι παγετώδεις και οι μεσοπαγετώδεις περίοδοι που χαρακτηρίζονται από έντονο ευστατισμό 2 αλλά και από ισοστατικές 3 κινήσεις. Οι παγετώνες κατά το Πλειστόκαινο προκάλεσαν μείωση τη στάθμης της θάλασσας από 100 έως 140 m σε σχέση με σήμερα. Οι μεταβολές της θαλάσσιας στάθμης καθ όλη τη διάρκεια της περιόδου αυτής οδήγησαν άλλες φορές σε συνένωση περιοχών και άλλες φορές σε αποχωρισμό τους. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την δημιουργία διόδων, 2 Ευστατικές αλλαγές: παγκόσμιες αυξομειώσεις της στάθμης της θάλασσας εξαιτίας της τήξης και πήξης των παγετώνων. 3 Ισοστατικές αλλαγές: συμβαίνουν όταν τμήματα του φλοιού της Γης αναδύονται ή βυθίζονται προκαλώντας τοπικές ή σχετικές αλλαγές στη στάθμη της θάλασσας (μέχρι και 300 μέτρα), ακόμη και όταν η παγκόσμια στάθμη δεν έχει αλλάξει. 62

Εισαγωγή για τη μετακίνηση και διακίνηση των πληθυσμών και τη μετέπειτα καταστροφή τους. Κατά το μέσο Πλειστόκαινο (0,80 0,126 mya) οι Κυκλάδες αποχωρίζονται από την Εύβοια και κατακερματίζονται. Οι μεταβολές αυτές της Αιγιακής περιοχής κατά το Πλειστόκαινο, συμπληρώνονται και περιπλέκονται από τις πολύ μεγάλες σε αριθμό και ένταση τεκτονικές κινήσεις. Οι μεταβολές αυτές του Αιγαίου κατά το Πλειστόκαινο συμπληρώνονται και περιπλέκονται από τις πολύ μεγάλες σε αριθμό και ένταση τεκτονικές κινήσεις. Οι τεκτονικές διεργασίες, παρά το ότι ήταν περιορισμένες σε γεωγραφική έκταση, έδρασαν καθοριστικά στην παλαιογεωγραφική εξέλιξη πολλών νησιών και δορυφορικών νησίδων (Van Andel & Shakleton 1982). Τα νησιά του Αν. Αιγαίου παραμένουν ενωμένα με τη Μικρά Ασία (με εξαίρεση τη Νίσυρο) μέχρι και το Ολόκαινο ενώ τα Κύθηρα είναι ακόμα συνδεδεμένα με την νότια Πελοπόννησο (Dermitzakis & Papanikolaou 1981). Την ίδια περίοδο (Ολόκαινο: 0,0117 mya σήμερα) σχηματίστηκε και ο βόρειος Ευβοϊκός κόλπος, διαχωρίζοντας έτσι την Εύβοια από τη Στερεά Ελλάδα. Οι μελέτες αναφορικά με τις ανακατατάξεις στεριάς και θάλασσας στη διάρκεια του ανώτερου Τεταρτογενούς (Ύστερο Πλειστόκαινο Ολόκαινο) καταδεικνύουν ότι κατά τη διάρκεια των παγετωδών περιόδων, η βόρεια Ελλάδα και η βόρεια Αδριατική σχημάτιζαν μεγάλες παραθαλάσσιες πεδιάδες που τις διέσχιζαν πολλά ποτάμια. Ευρείες πεδιάδες υπήρχαν στον Κορινθιακό Κόλπο. Πολλά νησιά, όπως η Εύβοια, η Κέρκυρα και οι Β. Σποράδες, συνδέονταν με την ηπειρωτική Ελλάδα, και τα περισσότερα νησιά των Κυκλάδων ήταν ενωμένα σχηματίζοντας την λεγόμενη «Κυκλαδική ημιχερσόνησο» (Van Andel & Shakleton 1982). Σημαντικό στοιχείο για τη μετακίνηση των ειδών αποτελεί η κατά περιόδους ανάδυση νησιών ως αποτέλεσμα της πτώσης της στάθμης της θάλασσας και της αποκάλυψης υποθαλάσσιων ορέων. Τα νησιά αυτά λειτουργούσαν ως ενδιάμεσοι σταθμοί. Το Αιγαίο πέλαγος χαρακτηρίζεται από έντονες ορογενετικές κινήσεις και ως εκ τούτου είναι ελάχιστες οι περιπτώσεις που υπήρξαν νησιά πλήρως απομονωμένα. Η πλειονότητα των νησιών είχαν ενωθεί μεταξύ τους ή/και με κάποια ηπειρωτική περιοχή. 63

Εισαγωγή Τα πλέον εντυπωσιακά γεωλογικά γεγονότα της Παλαιολιθικής και Μεσολιθικής περιόδου ήταν αυτά της ένωσης της Πελοποννήσου και της Εύβοιας με την υπόλοιπη ηπειρωτική Ελλάδα, η κυκλαδική ημι-χερσόνησος και η ύπαρξη αρκετών μεγάλων λιμνών. Πριν από 18.000 ya, μια ευμεγέθης ενιαία πεδιάδα, στη θέση της σημερινής Αδριατικής, συνέδεε την Ιταλία με την πρώην Γιουγκοσλαβία (Εικόνα Α10). Η πεδιάδα αυτή συνέχιζε από τα δυτικά παράλια της Αλβανίας και έφτανε μέχρι τα νοτιοδυτικά παράλια της Πελοποννήσου και τον Κορινθιακό Κόλπο, διακοπτόμενη μόνο από μια ορεινή ζώνη βόρεια της Κέρκυρας. Η Κεφαλονιά και η Ζάκυνθος ήταν ενωμένες σχηματίζοντας ένα ενιαίο νησί που απείχε μόλις 10-15 km από την ηπειρωτική Ελλάδα (Dermitzakis 1990, Westaway 1996). Στη διάρκεια της τελευταίας παγετώδους περιόδου, η Πελοπόννησος ήταν ενωμένη με την κεντρική Ελλάδα τόσο στα βορειοδυτικά της όσο και στα βορειοανατολικά μέσω του Ισθμού της Κορίνθου ενώ ο Κορινθιακός Κόλπος σχημάτιζε αλμυρή λίμνη. Μεταξύ της Αργολίδας και της Αττικής εκτεινόταν μια πεδιάδα στην οποία τα σημερινά νησιά πρόβαλαν ως απομονωμένοι λόφοι. Τα στενά μεταξύ Εύβοιας και ηπειρωτικής περιοχής ήταν ξηρά (Hinsbergen and Schmid 2012). Πολλά από τα νησιά του Αιγαίου ήταν ενωμένα μεταξύ τους. Οι Σποράδες, με εξαίρεση τη Σκύρο, σχημάτιζαν μια μεγάλη χερσόνησο, η οποία ενδεχομένως διακοπτόταν με δύο πολύ ρηχά στενά που απείχαν μόλις μερικά χιλιόμετρα. Πολλά από τα κυκλαδίτικα νησιά είχαν και αυτά ενωθεί σχηματίζοντας ενιαία περιοχή, η οποία σύμφωνα με τις περισσότερες απόψεις χωριζόταν από την ηπειρωτική Ελλάδα με μια ρηχή «τάφρο» πλάτους 10 km αλλά ενδέχεται να ήταν και ενωμένη με αυτή. Οι θαλάσσιες περιοχές μεταξύ Μικράς Ασίας και Ελλάδας, αλλά και μεταξύ της Κρήτης και της ευρωπαϊκής και της ασιατικής ενδοχώρας, είχαν κατά πολύ μειωθεί σε εύρος. Συνολικά, θα μπορούσαμε να θεωρήσουμε πως η γεωγραφία στα τέλη της Παλαιολιθικής περιόδου χαρακτηρίζεται από εκτεταμένες παραλιακές πεδιάδες, ιδιαίτερα στα βορειοδυτικά και βορειοανατολικά της χώρας, μια μεγάλη κυκλαδική χερσόνησο και μια συνολική μεγέθυνση της ελλαδικής ηπειρωτικής περιοχής με 64

Εισαγωγή ταυτόχρονη μείωση του πλάτους του Αιγαίου. Θα μπορούσαμε να πούμε πως η ελληνική χερσόνησος είχε πολύ πιο «λεία» ακτογραμμή από τη σημερινή και πως το μέγεθός της ήταν αρκετά μεγαλύτερο. Εικόνα A10: Παλαιογεωγραφικός χάρτης του ελλαδικού χώρου 18.000 ya. Απεικονίζονται τα όρια της ηπειρωτικής περιοχής και των νήσων κατά τη διάρκεια της χαμηλότερης στάθμης της θάλασσας στο τέλος της τελευταίας παγετώδους περιόδου. Η ακτογραμμή έχει χαραχτεί στην ισοβαθή των 130m (Van Andel & Shakleton 1982). 65

Εισαγωγή Η ανύψωση της στάθμης της θάλασσας που ξεκίνησε περί τα 15.000 ya, με την έναρξη της μεταπαγετώδους περιόδου, αποκατέστησε γύρω στα 9.000 ya την ακτογραμμή του ελλαδικού χώρου περίπου όπως είναι διαμορφωμένη και σήμερα (Εικόνα Α11). Μετά τα 9.000 ya, η στάθμη της θάλασσας ανέβηκε κατά ακόμα 30m και η εναπόθεση υλικών και ιζημάτων σχημάτισε τα δέλτα ποταμών και παραλιακές πεδιάδες. Σε γενικές γραμμές, τα όρια των ακτών μεταβλήθηκαν πολύ λίγο (Van Andel & Shakleton 1982,1993, Shakleton et al. 1984, Dermitzakis 1990, Westaway 1996). Εικόνα A11: Παλαιογεωγραφικός χάρτης του ελλαδικού χώρου 9.000 ya. Απεικονίζονται τα όρια της ηπειρωτικής περιοχής και των νήσων περί την περίοδο της ταχείας ανόδου της στάθμης της θάλασσας κατά την τελευταία μεσοπαγετώδη περίοδο. Η ακτογραμμή έχει χαραχτεί βάσει της ισοβαθούς των 130m (Van Andel & Shakleton 1982). 66

Εισαγωγή 5.4. Παλαιοκλίμα Οι έντονες κλιματικές αλλαγές έπαιξαν πολύ σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της εξελικτικής και βιογεωγραφικής ιστορίας των οργανισμών της περιοχής μελέτης, καθώς κλιματικές περιοδικές μεταβολές μεταξύ υγρών και ξηρών συνθηκών προκάλεσαν επανειλημμένες αλλαγές σε ενδιαιτήματα και σε βιοκοινότητες (Prentice & Jolly 2000, Douady et al. 2003). Το Ύστερο Νεογενές αποτελεί σημαντική περίοδο της κλιματικής ιστορίας της Γης. Σε αυτό το διάστημα παρατηρείται μεγάλη επέκταση ξηρών ζωνών και αντικατάσταση δασών από λιβάδια, ιδιαίτερα στα μέσα γεωγραφικά πλάτη (Crowley & North 1991, Potts & Behrensmeyer 1992). Τα αίτια αυτού του παγκόσμιου φαινομένου «ερημοποίησης» (aridification) δεν είναι πλήρως κατανοητά, αλλά σε γενικές γραμμές πιστεύεται ότι συνδέεται με μια παγκόσμια κλιματική τάση προς χαμηλότερες θερμοκρασίες, αφού η ατμοσφαιρική υγρασία μειώνεται όσο μειώνεται η ατμοσφαιρική θερμοκρασία. Οι μεταβάσεις σε πιο ψυχρές και σε πιο ξηρές συνθήκες πραγματοποιούνται σχεδόν πάντα παράλληλα, με μερικές εξαιρέσεις που σχετίζονται με την παλαιοτοπογραφία και τη θέση των ηπείρων. Κατά το Ύστερο Μειόκαινο (11,6-5,3 mya), παρατηρείται έντονη τάση προς πιο ξηρές καταστάσεις και ανοιχτά περιβάλλοντα. Σε αυτό το χρονικό διάστημα έχουν καταγραφεί δύο «περιστατικά» απότομης μετάβασης προς πιο ψυχρές (και ξηρές) συνθήκες, περίπου στα 10 mya και στα 5,5 mya. Παρόλα αυτά, τα δύο πιο σημαντικά «ψυχρά περιστατικά» του Ύστερου Καινοζωικού έγιναν λίγο νωρίτερα και λίγο αργότερα, στα 14 mya και στα 2,5 mya (Frakes et al. 1992, Zachos et al. 2001, van Dam 2006). Από τα 13 mya έως περίπου τα 9 mya, μελέτες που βασίζονται σε δεδομένα οικοφυσιολογίας αμφίβιων και ερπετών, καταδεικνύουν πως υπήρξε εξέλιξη του κλίματος από μια μακρά περίοδο ξηρασίας (13-11 mya) σε μια έντονα υγρή περίοδο (Washhouse climate) περί τα 10,2 9,8 mya, η οποία χαρακτηρίζεται από παγκοσμίως θερμές συνθήκες και σε πολλές περιπτώσεις πιο υγρές από τις σημερινές. Η ακόλουθη μετάβαση από αυτό το υγρό και θερμό κλίμα σε ξηρότερες συνθήκες που πραγματοποιήθηκε περί τα 9,7 9,5 67

Εισαγωγή mya, ταυτόχρονα με ένα παγκόσμια θερμό επεισόδιο φαίνεται να προκάλεσαν ένα σοβαρό γεγονός γνωστό και ως κρίση της Vallesian, στη διάρκεια του οποίου εξαφανίστηκαν τα ανθρωποειδή (Hominoidea) στη Δυτική Ευρώπη (Böhme et al. 2008). Συγκεκριμένα, αυτό που οδήγησε στην εξαφάνισή τους ήταν το γεγονός πως λόγω της δραματικής αλλαγής του κλίματος τα αειθαλή υποτροπικά δάση αντικαταστάθηκαν από διαπλάσεις στις οποίες κυριαρχούσαν λιβάδια και φυλλοβόλα είδη καλύτερα προσαρμοσμένα στις νέες συνθήκες (ψυχρότεροι χειμώνες και ξηρότερα καλοκαίρια). Ως αποτέλεσμα, είδη πανίδας που ήταν οπωροφάγα δεν ήταν δυνατό να καλύψουν τις τροφικές τους ανάγκες μετά την αντικατάσταση της βλάστησης από τα φυλλοβόλα είδη. Με αυτόν τον τρόπο μια σειρά ειδών όπως χοίροι, ποντίκια κτλ. μειώθηκαν δραματικά σε αριθμό. Φυσικό επακόλουθο ήταν και οι πληθυσμοί των σαρκοφάγων θηρευτών αυτών των ειδών να μειωθούν καθώς δεν μπορούσαν πλέον να ικανοποιηθούν οι ενεργειακές τους ανάγκες (Agustí et al. 2003). Μια δεύτερη έντονα υγρή περίοδος (Washhouse climate) καταγράφεται στα 9-8,5 mya, ταυτόχρονη με ένα παγκόσμιο θερμό επεισόδιο η οποία ήταν ιδιαίτερα δριμεία στη νοτιοδυτική Ευρώπη αλλά λιγότερο έντονη στην κεντρική. Από τα 8 mya και εντεύθεν, η νοτιοδυτική Ευρώπη παραμένει πιο υγρή ενώ η κεντρική πιο ξηρή από τις σημερινές συνθήκες (Böhme et al. 2008). Τα τελευταία 3 my έχουν καταγραφεί περίπου 30 παγετώδεις περίοδοι, κατά τη διάρκεια των οποίων οι πάγοι κάλυπταν το μεγαλύτερο μέρος της Βόρειας Αμερικής και της Ευρασίας (van Andel 1994). Αν και οι σημερινές περιοχές που έχουν μεσογειακό κλίμα δεν καλύφθηκαν από πάγους, η μέση θερμοκρασία τους μειώθηκε από 2 έως 7 ο C (Dallman 1998). Οι περιοχές της ανατολικής Μεσογείου και της κεντρικής Ασίας διαδραμάτισαν σημαντικό ρόλο ως καταφύγια βιοποικιλότητας κατά τους παγετώδεις κύκλους του Τεταρτογενούς. Περιοχές με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά γεωμορφολογίας, που διατηρούσαν ιδιαίτερο και ευνοϊκό, για κάποιους οργανισμούς, μικροκλίμα, συντηρούσαν κατά τις παγετώδεις περιόδους πληθυσμούς οι οποίοι μετακινούνταν από εκεί κατά τις μεσοπαγετώδεις περιόδους (Hewitt 68

Εισαγωγή 2001). Αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν την ανατολική Μεσόγειο μια περιοχή υψηλής βιοποικιλότητας που έπαιξε σημαντικό ρόλο στη διατήρηση και στη δημιουργία της ποικιλότητας σε φυτά και ζώα. Πριν από 15.000 χρόνια η απότομη άνοδος της θερμοκρασίας στον πλανήτη προκάλεσε την τήξη των παγετώνων και τη σταδιακή αύξηση της στάθμης της θάλασσας μέχρι τη σταθεροποίησή της στα σημερινά επίπεδα, περί τα 6.000 ya. Ωστόσο, η θερμοκρασία τόσο στις παγετώδεις όσο και στις μεσοπαγετώδεις περιόδους, παρουσιάζει επιμέρους διακυμάνσεις με ψυχρά και θερμά γεγονότα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το ψυχρό γεγονός στην τελευταία μεσοπαγετώδη περίοδο που ονομάζεται Νεότερη Δρυάς, 12.000-10.000 ya. Οι μεταβολές στη στάθμη της θάλασσας, ανάμεσα στα ψυχρά και τα θερμά γεγονότα είχαν ως αποτέλεσμα άλλοτε τη συνένωση και άλλοτε τον διαχωρισμό γειτονικών περιοχών δημιουργώντας προσωρινούς βιολογικούς διαδρόμους που οδήγησαν διαδοχικά αρχικά στη μετακίνηση και κατόπιν στην απομόνωση πληθυσμών. Η τήξη των παγετώνων απελευθέρωσε τεράστιες ποσότητες νερού, σχηματίζοντας ορμητικά ποτάμια που διάβρωσαν το ηπειρωτικό ανάγλυφο, ενώ η εναπόθεση υλικών και ιζημάτων σχημάτισε τα δέλτα στις εκβολές των ποταμών και τις λιμνοθάλασσες δίνοντας τη σημερινή ακτογραμμή του ελλαδικού χώρου. 69

Εισαγωγή 6. ΓΕΝΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΞΗ ΤΩΝ ΙΣΟΠΟΔΩΝ 6.1. Ιστορικά στοιχεία και στοιχεία εξέλιξης Η εμφάνιση των ισοπόδων τοποθετείται στο Δεβόνιο, ενώ το αρχείο των απολιθωμάτων διαθέτει μορφές που τοποθετούνται στο Παλαιοζωικό (ανώτερο Λιθανθρακοφόρο - περί τα 300 mya). Απολιθωμένα Oniscidea συναντώνται για πρώτη φορά στο Ηώκαινο, δηλαδή περίπου πενήντα εκατομμύρια χρόνια πριν. Τα παλαιότερα απολιθώματα ανήκουν στην υπόταξη Phreatoicidea που θεωρείται και ο παλαιότερος κλάδος των ισοπόδων. Τα ισόποδα έχουν αποικίσει σχεδόν το σύνολο των ενδιαιτημάτων. Απαντώνται από τις ακτές έως τις αβύσσους των θαλασσών, τα γλυκά νερά, καθώς και στη χέρσο (Schmalfuss 1983). Ο εποικισμός της χέρσου συνέβη, σύμφωνα με εκτιμήσεις, περίπου εκατό εκατομμύρια χρόνια πριν και έγινε σταδιακά από βενθικούς προγόνους που μετακινήθηκαν στην παραλιακή ζώνη και μετά ένα στάδιο κατά το οποίο ζούσαν ως αμφίβιοι, κατάφεραν να υπερπηδήσουν τις δυσκολίες της χερσαίας διαβίωσης και να παραμείνουν μόνιμα στη χέρσο. Η ονομασία ισόποδα προέρχεται από τη δομική ομοιομορφία των επτά ζευγών θωρακικών άκρων που χαρακτηρίζει αυτή την παλαιά και διαφοροποιημένη ομάδα των Καρκινοειδών (Wilson & Edgecombe 2003). Η τάξη των Ισοπόδων είναι η πλέον διαφοροποιημένη και πλούσια σε είδη ομάδα Καρκινοειδών της υπέρταξης Peracarida. Απαριθμούν περί τα 10.000 περιγεγραμμένα είδη τα οποία ταξινομούνται σε δέκα τάξεις. Το μέγεθός τους κυμαίνεται από 1 έως 500 mm (Bathynomus giganteus). 6.2. Τα Χερσαία Ισόποδα Τα χερσαία ισόποδα (Oniscidea) είναι μια ευρέως εξαπλωμένη ομάδα οργανισμών με ένα σημαντικό ιδιαίτερο χαρακτηριστικό: είναι η καλύτερα 70

Εισαγωγή προσαρμοσμένη ομάδα καρκινοειδών στο χερσαίο περιβάλλον. Η μετάβαση των ισοπόδων στη χέρσο συνοδεύτηκε από μια σειρά μορφολογικών και φυσιολογικών προσαρμογών καθώς και αλλαγών στη συμπεριφορά ώστε να αντιμετωπιστούν τα προβλήματα που προέκυψαν από αυτόν τον νέο τύπο διαβίωσης. Οι σημαντικότερες από αυτές αφορούσαν την επαρκή στήριξη του σώματος στις νέες συνθήκες, ένα νέο τρόπο αναπνοής και κυρίως την προστασία από την αφυδάτωση, το σημαντικότερο πρόβλημα στη χερσαία διαβίωση. Τα χερσαία ισόποδα αντιμετώπισαν επιτυχώς όλες αυτές τις δυσκολίες. Το γεγονός αυτό αποδεικνύεται εξάλλου από την ευρεία τους εξάπλωση σε όλα σχεδόν τα χερσαία οικοσυστήματα πλην αυτών των αρκτικών περιοχών και των πολύ μεγάλων υψομέτρων (Σφενδουράκης 1994). Η υπόταξη Oniscidea περιλαμβάνει σχεδόν αποκλειστικά χερσόβια είδη, και για τον λόγο αυτόν αποκαλείται «η χερσαία ομάδα» των ισοπόδων. Λίγα είναι γνωστά σχετικά με αυτήν: ο Λινναίος αναγνώρισε μόλις ένα είδος το 1758 ενώ ο Bouffon επτά είδη 34 χρόνια αργότερα (Michael Salzat & Bouchon 2000). Επόμενες μελέτες αύξησαν τον αριθμό των ειδών αυτής της ομάδας σε 2000 περί το 1943 ενώ ο Schmalfuss (2003) προσδιόρισε τον αριθμό των χερσαίων ισοπόδων ανά τον κόσμο στα 3637 είδη περίπου. Πρόσφατη ταξινομική ανάλυση των Oniscidea δίνει 3710 είδη μέχρι το 2014 (Sfenthourakis & Taiti 2015). Η πρώτη φαινετική ταξινόμηση της υπόταξης των Ονισκίδων έγινε με βάση κυρίως τη μορφολογία του αρσενικού γενετικού συστήματος. Το 1946, καθορίστηκαν δύο υπερτάξεις, τα Tylomorpha και τα Ligiamorpha. Η πρώτη υπέρταξη περιελάμβανε την οικογένεια Tylidae, που αποτελείτο από 25 είδη του γένους Tylos και ένα μόνο είδος του γένους Helleria (Michael Salzat & Bouchon 2000). Η υπέρταξη Ligiamorpha υποδιαιρέθηκε σε τρία τμήματα: 1. τα Diplocheta, με περίπου 80 είδη τα οποία ανήκουν στις οικογένειες Ligiidae και Mesoniscidae 2. τα Synocheta, με περίπου 200 είδη τα οποία ανήκουν στις υπεροικογένειες Styloniscidea και Trichoniscidea 71

Εισαγωγή 3. τα Crinocheta, που περιλαμβάνουν τις υπεροικογένειες Armadilloidea και Oniscoidea. Πιο πρόσφατα η οικογένεια Mesoniscidae τοποθετήθηκε σε ένα νέο «τμήμα» (section) τα Microcheta (Schmalfuss 1989). Αυτή η κατάταξη είναι αποδεκτή επί σειρά ετών με μερικές μικρές τροποποιήσεις. Ωστόσο, δεν βασίζεται σε φυλογενετικά δεδομένα με αποτέλεσμα νέες μελέτες αναφορικά με τη φυλογένεση αυτών των οργανισμών να προτείνουν και αλλαγές στις ισχύουσα ταξινόμηση. Στην Ελλάδα απαντώνται 19 οικογένειες, 47 γένη (τα 7 ενδημικά) και 238 είδη (161 ενδημικά - τα 37 εξ αυτών τρωγλόβια) (Alexiou & Sfenthourakis 2013). 6.2.1. Εξωτερική μορφολογία Το σώμα των ισοπόδων είναι νωτοκοιλιακώς πεπλατυσμένο, με εμφανή τη μεταμέρεια εξωτερικά αφού δεν υπάρχει θυρεός. Το μέγεθός τους δεν ξεπερνά συνήθως τα 5 cm. Όπως και στα περισσότερα Καρκινοειδή, το σώμα των ισοπόδων είναι διαχωρισμένο σε τρεις διακριτές περιοχές: Κεφάλι Θώρακας (περαίον) Κοιλιά (πλέον) Στο κεφάλι φέρουν σύνθετα, άμισχα μάτια αποτελούμενα από ποικίλο αριθμό ομματιδίων, δύο ζεύγη μονοσκελών κεραιών, δύο ζεύγη γνάθων και ένα ζεύγος γναθοποδίων. Το πρώτο ζεύγος κεραιών έχει χημειοδεκτική λειτουργία, είναι υποπλασμένο και δυσδιάκριτο, ενώ το δεύτερο είναι ανεπτυγμένο και αντιλαμβάνεται απτικά ερεθίσματα. Το πρώτο θωρακικό μεταμερές είναι συντηγμένο με το κεφάλι και τα εξαρτήματά του έχουν διαφοροποιηθεί σε γναθοπόδια. Τα υπόλοιπα επτά θωρακικά μεταμερή συναποτελούν το περαίον και φέρουν, πρωτογενώς, από ένα ζεύγος μονοσκελών αρθρωτών εξαρτημάτων, τα περαιοπόδια. Τα περαιοπόδια είναι παρόμοιας μορφολογίας και 72

Εισαγωγή διαφοροποιημένα για βάδιση (Εικόνα A12α). Η κοιλιακή περιοχή (Εικόνα A12β) αποτελείται από έξι μεταμερή εκ των οποίων τα πέντε είναι ελεύθερα ενώ το έκτο έχει συντηχθεί με το μη μεταμερικό τέλσον σχηματίζοντας το πλεοτέλσον. Καθένα από αυτά τα μεταμερή φέρει ένα ζεύγος δισκελών, αρθρωτών εξαρτημάτων, τα πλεοπόδια (ονομάζονται ουροπόδια εκείνα του συντηγμένου με το τέλσον μεταμερούς) και αποτελούνται από τον ενδοποδίτη (εσωτερικά), τον εξωποδίτη (εξωτερικά) και το βασιποδίτη στη βάση. Στους εξωποδίτες των πλεοποδίων των περισσότερων χερσαίων ισοπόδων, ιδίως εκείνων που εξελίχθηκαν με τρόπο ώστε να εποικίσουν ξηρά περιβάλλοντα, έχουν αναπτυχθεί ειδικές αναπνευστικές δομές, κοιλότητες που ονομάζονται τραχειακοί πνεύμονες, πλεοποδικοί πνεύμονες ή ψευδοτραχείες. Στα χερσαία ισόποδα που δεν διαθέτουν τέτοιους πνεύμονες, χρησιμοποιείται για την ανταλλαγή των αερίων ολόκληρη η επιφάνεια των εξωποδιτών, η οποία και πρέπει να διατηρείται διαρκώς υγρή (Sutton 1972, Σφενδουράκης 1994). Εικόνα Α12: Εξωτερική μορφολογία χερσόβιου ισοπόδου. α. ραχιαία άποψη, β. κοιλιακή άποψη (τροποποιημένες από Sutton 1972). 73

Εισαγωγή 6.3. Γενικά περί Οικολογίας Και Βιολογίας του γένους Trachelipus Budde-Lund, 1908 6.3.1. Οικολογία Οι αντιπρόσωποι του γένους Trachelipus είναι υγρόφιλα είδη που συχνά ζουν κοντά σε τρεχούμενο ή στάσιμο νερό, σε δενδρώδεις καλλιέργειες, μακκία βλάστηση ή δάση, πάντα σε σημεία που υπάρχει πολλή υγρασία. Συνήθως εντοπίζονται κάτω από πέτρες αλλά πολλές φορές και μέσα στη φυλλοστρωμνή, όταν αυτή είναι πλούσια και υγρή. Όπως όλα τα χερσαία ισόποδα, είναι φυτοσαπροφάγα (Σφενδουράκης 1994), ωστόσο δεν είναι γνωστό επακριβώς με τι τρέφονται. Στην Εικόνα A13 απεικονίζονται οι τροφικές σχέσεις των χερσόβιων ισοπόδων εν γένει. Εικόνα A13: Τροφικές σχέσεις χερσόβιων ισοπόδων. Τα βέλη καταδεικνύουν τη ροή της οργανικής ύλης (τροποποιημένες από Sutton 1972) 74

Εισαγωγή 6.3.2. Αναπαραγωγή Ανάπτυξη Όπως όλα τα χερσαία ισόποδα, έτσι και τα είδη του γένους Trachelipus είναι γονοχωριστικά, με τα θηλυκά άτομα να είναι συνήθως μεγαλύτερα σε μέγεθος από τα αρσενικά, αν και αυτό δεν είναι απόλυτο. Η γονιμοποίηση είναι εσωτερική και η ανάπτυξη άμεση χωρίς προνυμφικά στάδια. Στα αρσενικά άτομα υπάρχουν και εξωτερικά δευτερογενή όργανα αναπαραγωγής (Εικόνα Α14). Συγκεκριμένα, τα δύο πρώτα ζεύγη πλεοποδίων των αρσενικών είναι διαφοροποιημένα για τη μεταφορά σπέρματος και αποτελούν διαγνωστικούς χαρακτήρες, όπως και στα περισσότερα ισόποδα. Πέος Εικόνα A14: Εξωτερικά γεννητικά όργανα αρσενικού ατόμου (Τροποποιημένη από Sutton 1972). 75

Εισαγωγή Οι εξωποδίτες είναι λιγότερο διαφοροποιημένοι από τους ενδοποδίτες, οι οποίοι επιμηκύνονται προς τα πίσω σχηματίζοντας στύλο με τον οποίο το σπέρμα μεταφέρεται στο γενετικό πόρο του θηλυκού. Το γονιμοποιημένο θηλυκό αναπτύσσει ειδικό σχηματισμό γεμάτο με υγρό ανάμεσα στα θωρακικά πόδια, το μάρσιπο, όπου και αποθηκεύει τα αυγά. Μετά την εκκόλαψή τους τα νεαρά άτομα παραμένουν στο μάρσιπο για μικρό χρονικό διάστημα. Από εκεί εξέρχονται ως ανήλικα (mancas) των οποίων τα μεταμερή υπολείπονται σε αριθμό σε σχέση με τα ενήλικα άτομα (Sutton 1972). Το φύλο μπορεί να καθοριστεί γενετικά, κυτταροπλασματικά ή από περιβαλλοντικούς παράγοντες. Στην πρώτη περίπτωση, ο φυλοκαθορισμός γίνεται από δύο τύπους φυλετικών χρωμοσωμάτων, X και Y, ή Z και W. Στη δεύτερη περίπτωση το φύλο καθορίζεται από κυτταροπλασματικά μεταβιβαζόμενους μικροοργανισμούς. Στην τρίτη περίπτωση, ανάλογα με το είδος, ο καθορισμός εξαρτάται από διάφορους παράγοντες, όπως π.χ. η θερμοκρασία, η φωτοπερίοδος, η συναθροιστικότητα κτλ (Thierry et al. 1997, Hidding et al. 2003). Η σύζευξη των χερσαίων ισοπόδων συμβαίνει στο απόλυτο σκοτάδι και μπορεί να διακοπεί από την ελάχιστη παρουσία φωτός. Στα χερσαία ισόποδα, εμφανίζεται τόσο η μονοτοκία (αναπαραγωγή μόνο μία φορά σε όλη τους τη ζωή) όσο και η πολυτοκία (περισσότερες από μια αναπαραγωγικές περίοδοι στη διάρκεια της ζωής), η οποία συχνά διαπιστώνεται από μελέτη της δομής των ωοθηκών. Στα μονότοκα είδη οι ωοθήκες περιέχουν μία ή δύο σειρές ισομεγεθών ωοκυττάρων ενώ στα πολύτοκα υπάρχουν μεγάλα, ώριμα ωοκύτταρα που θα δώσουν ζυγωτά στην τρέχουσα αναπαραγωγική περίοδο και μικρότερα που θα ωριμάσουν σε επόμενες αναπαραγωγικές περιόδους. Ως προς την αναπαραγωγική περίοδο, τα διάφορα είδη ισοπόδων μπορεί να αναπαράγονται την άνοιξη ή στις αρχές του καλοκαιριού, το φθινόπωρο ή οποτεδήποτε μέσα στο έτος. Κάποια είδη γεννούν περισσότερες από μία φορές κατά τη διάρκεια μιας ευρύτερης περιόδου, όπως π.χ. από την άνοιξη ως το φθινόπωρο, ανάλογα με τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Η ενεργοποίηση της αναπαραγωγικής περιόδου καθορίζεται από παράγοντες 76

Εισαγωγή όπως: i) η φωτοπερίοδος, ii) η θερμοκρασία, iii) βιοτικοί παράγοντες, όπως το είδος της τροφής, και iv) άλλοι, όπως π.χ. τα βαρέα μέταλλα που επιδρούν αρνητικά σε ορισμένες συνθήκες (Sutton 1972). 6.4. Συστηματική - γεωγραφική κατανομή Φύλο: Αρθρόποδα Υπόφυλο: Καρκινοειδή Ομοταξία: Μαλακόστρακα Υφομοταξία: Ευμαλακόστρακα Υπέρταξη: Peracarida Τάξη: Isopoda Υπόταξη: Oniscidea Τμήμα: Crinocheta Οικογένεια: Trachelipodidae Γένος: Trachelipus Budde Lund, 1908 Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, τα χερσαία ισόποδα έχουν ευρεία εξάπλωση σε ολόκληρο τον κόσμο και ο αριθμός των ειδών τους ανέρχεται στα 3710 (Sfenthourakis & Taiti 2015). Σύμφωνα με την τρέχουσα ταξινόμηση, το γένος Trachelipus περιλαμβάνει περί τα 50 είδη που κατανέμονται σε όλη την Παλαιαρκτική (Εικόνα A15) (Schmidt 2007). Με βάση την τελευταία βιβλιογραφική αναθεώρηση της παγκόσμιας λίστας των χερσαίων ισοπόδων (Schmalfus 2003) και τη μελέτη των Parmakelis et al. (2008), στην Ελλάδα απαντώνται 8 είδη εκ των οποίων τα 4 είναι ενδημικά (Εικόνα A16). Συγκεκριμένα, τα είδη που απαντώνται στην Ελλάδα (Εικόνα A16) είναι τα: T. palustris, T. aegaeus,, T. cavaticus και T. n.sp, Τ. camerani, T. arcuatus, T. squamuliger και T. razzauti. Από αυτά, τα T. palustris, T. aegaeus,, T. cavaticus και T. n.sp. είναι ελληνικά ενδημικά, με το T. palustris να εμφανίζει τη μεγαλύτερη εξάπλωση. Στον ελλαδικό χώρο έχει αναφερθεί και ένα ακόμα είδος το T. buddelundi (Strouhal, 1937), για το οποίο υπάρχει μία και μόνο καταγραφή στη Χίο, η εγκυρότητά του αμφισβητείται και θεωρείται πως 77

Εισαγωγή πιθανότατα πρόκειται για συνώνυμο του Τ. aegaeus ή πιθανόν η αρχική καταγραφή να ήταν λανθασμένη αναγνώριση των συλλεγμένων ατόμων Το ενδημικό είδος T. aegaeus (Verhoeff, 1907) που εξαπλώνεται στο Αιγαίο και τα αιγαιακά παράλια της ηπειρωτικής χώρας εμφανίζει πολύ μεγάλη ομοιότητα με ένα άλλο ενδημικό της Ελλάδας, το T. kytherensis (Strouhal, 1929) το οποίο εξαπλώνεται στη δυτική Ελλάδα, την Πελοπόννησο, τα Κύθηρα και την Κρήτη. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη τόσο προκαταρκτικές αναλύσεις των Parmakelis et al. (2008) όσο και τα αποτελέσματα από την περιοχή του Αιγαίου (Kamilari et al. 2014) τα άτομα των Κυθήρων και της Κρήτης αποδείχθηκε πως ανήκουν στο είδος Τ. aegaeus. Ως εκ τούτου, το όνομα T. kytherensis δεν είναι πλέον έγκυρο καθώς χρησιμοποιήθηκε για την περιγραφή ατόμων από τα Κύθηρα. Ο Schmalfuss (2003) είχε θεωρήσει ως συνώνυμα τα είδη T. kytherensis και Τ. palustris (Strouhal, 1936) (το είδος που εξαπλώνεται στην Πελοπόννησο και τη δυτική ηπειρωτική Ελλάδα, το οποίο είχε περιγραφεί από το όρος Παναχαϊκό), διατηρώντας το T. kytherensis λόγω προτεραιότητας. Με βάση όμως τα σύγχρονα αποτελέσματα (Parmakelis et al. 2008, Kamilari et al. 2014) το είδος T. kytherensis δεν είναι πλέον έγκυρο, καθώς στα Κύθηρα αποδείχτηκε πως εξαπλώνεται το είδος T. aegaeus. Προκειμένου λοιπόν να διατηρηθεί η μονοφυλετικότητα του κλάδου του Αιγαίου θα πρέπει να επανέλθει το όνομα T. palustris για τα άτομα της ηπειρωτικής περιοχής (Πελοπόννησο και δυτική ηπειρωτική Ελλάδα).. Η εγκυρότητα αυτών των μορφολογικά προσδιορισμένων ειδών τελεί υπό αμφισβήτηση. Για τον προσδιορισμό τους κρίνεται ιδιαίτερα χρήσιμη η ενδελεχής μελέτη αυτών των πληθυσμών με τη χρήση μοριακών μεθόδων. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε το όνομα T. palustris για τους πληθυσμούς της δυτικής ηπειρωτικής Ελλάδας και της Πελοποννήσου και το όνομα T. aegaeus για τα άτομα των Κυθήρων και της Κρήτης. 78

Εισαγωγή Εικόνα A15: Η παγκόσμια κατανομή του γένους Trachelipus. 79

Εισαγωγή T. arcuatus T camerani T razzautii T. squamuliger T. kutherensis T. aegaeus T. nsp T. cavaticus Εικόνα Α16 : Οι θέσεις εμφάνισης των ειδών Trachelipus στην Ελλάδα βάσει βιβλιογραφικών αναφορών (Schmidt 1997 και Schmalfus 2003). 80

Εισαγωγή 6.5. Διαγνωστικοί Χαρακτήρες Του Γένους Trachelipus (Σύμφωνα με Schmidt 1997) Σχήμα σώματος ελλειψοειδές (οβάλ), χωρίς διακοπή μεταξύ του κεφαλοθώρακα και της κοιλιάς. Νωτοκοιλιακά πεπλατυσμένο χωρίς τη δυνατότητα σφαιροποίησης. Οι τεργίτες φέρουν φύματα. Στο κεφάλι υπάρχει καλά αναπτυγμένη μετωπιαία γραμμή, η οποία είναι πλευρικά επιμηκυμένη προκειμένου να σχηματιστούν οι πλευρικοί λοβοί. Ο μεσαίος κεφαλικός λοβός μπορεί να είναι παρών ή να απουσιάζει. Τα επιμερή στο πλέον είναι πολύ καλά ανεπτυγμένα και κυρτώνουν με κατεύθυνση προς το πλεοτέλσον, το οποίο είναι οξύληκτο. Τα σύνθετα μάτια αποτελούνται από 20 25 ομματίδια. Ο μέγιστος αριθμός που έχει καταγραφεί σε αντιπρόσωπο του γένους είναι τα 31 ομματίδια. Τα τρωγλόβια είδη δε φέρουν πάνω από 2-4 υποπλασμένα ομματίδια. 6.5.1. Κυριότεροι διαγνωστικοί χαρακτήρες μεταξύ των ειδών Trachelipus. 1. Το σχήμα των λοβών της κεφαλής 2. Το σχήμα του πρώτου (Ι) εξωποδίτη του πλεοποδίου. 3. Η σχετική θέση των αδενικών πόρων στους τεργίτες. Ακολουθούν εικόνες ολόκληρων ατόμων του κάθε είδους καθώς και του πρώτου εξωποδίτη του πλεοποδίου, του οποίου το σχήμα αποτελεί βασικό διαγνωστικό χαρακτήρα μεταξύ των ειδών. 81

Εισαγωγή 1. Trachelipus arcuatus (Budde-Lund, 1885), με εξάπλωση στη ΒΔ Ελλάδα. 2. T. camerani (Tua, 1900), με εξάπλωση στην Κέρκυρα και τη ΒΔ Ελλάδα. 82

Εισαγωγή 3. T. cavaticus (Schmalfuss et al. 2004), εντοπισμένο κυρίως σε σπήλαια στη δυτική Κρήτη. 4. T. razzautii (Arcangeli, 1933), με μία καταγραφή στη Λέσβο. 83

Εισαγωγή 5. T. squamuliger (Verhoeff, 1907), που εξαπλώνεται στην ανατολική Ελλάδα και τη Σαμοθράκη, τη Λήμνο και τη Μυτιλήνη. 6. T. aegaeus (Verhoeff, 1907), με εξάπλωση στα νησιά του Αιγαίου και τα αιγαιακά παράλια της ηπειρωτικής Ελλάδας. 84

Εισαγωγή 7. T. palustris (Strouhal, 1936), με εξάπλωση στην Πελοπόννησο και την ηπειρωτική Ελλάδα. 8. T. n.sp. (υπό περιγραφή), που εντοπίστηκε στα Στουρονήσια (νησίδες μεταξύ Αττικής και Εύβοιας βλ Parmakelis et al. 2008 και Καμηλάρη 2010). 85

Εισαγωγή 7. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΠΡΟΒΛΗΜΑ Οι αντιπρόσωποι του γένους Trachelipus στην Ελλάδα παρουσιάζουν μεγάλη μορφολογική και γενετική ποικιλότητα (Parmakelis et al. 2008, Kamilari et al. 2014). Ο ελλαδικός χώρος αποτελεί ένα εργαστήρι της φύσης όπου ποικίλα πειράματα έλαβαν χώρα καθοδηγούμενα από την παλαιογεωγραφία και την παλαιοοικολογία της περιοχής, οι οποίες λόγω των έντονων ανακατατάξεων θάλασσας ξηράς, επηρέασαν καθοριστικά τόσο την κατανομή όσο και τη διαφοροποίηση πολλών τάξων από διάφορες ταξινομικές βαθμίδες. Τόσο οι ανακατατάξεις κατά τους προϊστορικούς χρόνους όσο και οι πλέον πρόσφατες των τελευταίων 10.000 ετών, οι οποίες διαμόρφωσαν τόσο την έκταση της σημερινής ηπειρωτικής περιοχής όσο και τις συνδέσεις των επιμέρους γεωγραφικών διαμερισμάτων, χρήζουν ιδιαίτερης προσοχής και μελέτης προκειμένου να διερευνηθεί το αποτύπωμα που ακόμα και τόσο νωρίς -στον εξελικτικό χρόνο- ενδέχεται να έχουν αφήσει στο γονιδίωμα ή/και το φαινότυπο των οργανισμών. Ο ελλαδικός χώρος παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την ιστορική και την οικολογική βιογεωγραφία, αφού από τη μια πλευρά ο πρόσφατος διαχωρισμός των νησιών του Αιγαίου έχει οδηγήσει πολλά τάξα σε μεγάλη διαφοροποίηση και από την άλλη η περιοχή περιλαμβάνει πλήθος νησιών διαφόρων μεγεθών προσφέροντας έτσι πλούσιο έδαφος για εφαρμογή των αρχών της νησιωτικής βιογεωγραφίας (MacArthur & Wilson 1967). Έτσι, η φυλογεωγραφία του Αιγαίου και των γύρω περιοχών έχει αποτελέσει αντικείμενο πολλών ερευνών σε πλήθος άλλων οργανισμών (βλέπε. Poulakakis et al. 2015). Η παρούσα εργασία έχει στόχο να συνεισφέρει στην έρευνα αυτή, συμπληρώνοντας τη μελέτη των ειδών του γένους Trachelipus (Parmakelis et al. 2008, Kamilari et al. 2014). H επιλογή του συγκεκριμένου γένους ως πειραματικού υλικού για την παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε με βάση το ότι εμφανίζει τουλάχιστον 4 ενδημικά είδη στη νησιωτική και την ηπειρωτική περιοχή της 86

Εισαγωγή ελληνικής επικράτειας που παρουσιάζουν ευρεία εξάπλωση (από το επίπεδο της θάλασσας έως τις κορυφές των βουνών). Σημαντική παράμετρος στην επιλογή των οργανισμών αυτών αποτέλεσαν και οι ιδιαιτερότητες των βιοτόπων όπου ζουν. Πρόκειται για οργανισμούς που διαβιούν σε υγρά ενδιαιτήματα, άμεσα απειλούμενα από την ανθρώπινη δραστηριότητα (παρόχθια βλάστηση ρεμάτων και ποταμών, υγρά δάση κτλ). Ως εκ τούτου, τα ξηρά περιβάλλοντα αποτελούν φράγματα στη διασπορά των συγκεκριμένων οργανισμών. Ο συνεχώς αυξανόμενος κατακερματισμός των βιοτόπων οδηγεί σε αύξηση της απομόνωσης των φυσικών πληθυσμών και, συνεπώς, σε μείωση της γενετικής ροής μεταξύ τους. Όπως προαναφέρθηκε, η περιγραφή του είδους στηρίζεται σε περιορισμένο αριθμό μορφολογικών χαρακτήρων και δεν είναι βέβαιο ότι αντανακλά την πραγματική φυλογένεση. Η παρούσα εργασία έχει ως αντικείμενα μελέτης: 1. Τον προσδιορισμό των διαφορετικών ειδών του γένους καθώς και των ορίων εξάπλωσης αυτών στον ελλαδικό χώρο. 2. Τη μελέτη της γενετικής δομής και ποικιλότητας των πληθυσμών και των ειδών. 3. Την εκτίμηση του βαθμού της γενετικής διαφοροποίησης/απόστασης μεταξύ των πληθυσμών του κάθε είδους στα όρια της γεωγραφικής του εξάπλωσης. 4. Τον προσδιορισμό της φυλογενετικής ιστορίας των αντίστοιχων πληθυσμών και ειδών ώστε να αναπλασθεί το ιστορικό της απομόνωσής τους. 5. Τη χρονολόγηση της απόσχισης των φυλογενετικών κλάδων μεταξύ των ειδών. 6. Το συνδυασμό των παραπάνω αποτελεσμάτων ώστε να εκτιμηθεί η επίδραση των ιστορικών (παλαιογεωγραφικών, οικολογικών κτλ) παραγόντων στη διαμόρφωση της σύγχρονης εξάπλωσης των αντιπροσώπων του γένους στον ελλαδικό χώρο. 87

Εισαγωγή Το κεντρικό ερώτημα λοιπόν που τίθεται είναι πώς σχετίζεται ο βαθμός διαφοροποίησης μεταξύ των πληθυσμών και των ειδών με τη γεωγραφική τους κατανομή στο χώρο. Συνοψίζοντας όλα τα παραπάνω, στόχος της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση των διεργασιών διαφοροποίησης των πληθυσμών των ειδών του γένους Trachelipus στην Ελλάδα, ώστε να προσδιοριστεί η επίδραση της απομόνωσης των πληθυσμών, της γεωγραφικής τους κατανομής αλλά και των παλαιογεωγραφικών γεγονότων που διαμόρφωσαν τη γενετική τους σύσταση στον ελλαδικό χώρο. 88

Β. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ Β. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ I am among those who think that science has great beauty. A scientist in his laboratory is not only a technician: he is also a child placed before natural phenomena which impress him like a fairy tale. MARIE CURIE Είμαι μεταξύ αυτών που πιστεύουν πως η επιστήμη έχει τεράστια ομορφιά. Ένας επιστήμονας στο εργαστήριό του δεν είναι απλά ένας τεχνικός: είναι κι ένα παιδί μπροστά σε φυσικά φαινόμενα που τον εντυπωσιάζουν όπως ένα παραθύθι... MARIE CURIE 89

Μεθοδολογία-Υλικά 1. ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Η συλλογή των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με γνώμονα την κάλυψη του ελλαδικού χώρου και προκειμένου να συλλεχθούν όλα τα είδη που έχουν αναφερθεί βιβλιογραφικά ότι απαντώνται στην ελληνική επικράτεια. Στόχος ήταν να καλυφθεί όσον το δυνατόν καλύτερα η περιοχή μελέτης, αλλά και να αντιπροσωπευθεί με τον καλύτερο δυνατό τρόπο η ενδοπληθυσμιακή και διαπληθυσμιακή γενετική ποικιλότητα των μελετηθέντων ειδών του εξεταζόμενου γένους. Επιπλέον των δειγματοληψιών που πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της παρούσας διατριβής, αξιοποιήθηκαν και δείγματα που είχαν συλλεχθεί στη διάρκεια προηγούμενων μελετών (Σφενδουράκης 1994, Parmakelis et al. 2008, Καμηλάρη 2010). Η συλλογή πραγματοποιήθηκε με το χέρι και τα άτομα θανατώνονταν άμεσα σε αιθανόλη 95%. Κατόπιν μεταφέρονταν στο εργαστήριο, όπου ταυτοποιούνταν μορφολογικά και αποθηκεύονταν μέχρι τη χρήση τους. Η ταυτοποίηση των οργανισμών στο επίπεδο του είδους έγινε με βάση τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά, όπως αυτά περιγράφονται στην κλείδα του Schmidt (1997), και προσδιορίστηκαν ως αντιπρόσωποι των ειδών T. palustris, T aegaeus, T. cavaticus, T camerani, T. squamuliger, T. n. sp. Τέλος, προκειμένου να γίνει σύγκριση και ταυτοποίηση τόσο στο μορφολογικό όσο και στο μοριακό επίπεδο, χρησιμοποιήθηκαν άτομα από τα είδη T. camerani, T squamuliger, T. rathkii, T. ratzeburgii και Τ. arcuatus από περιοχές εκτός Ελλάδας, τα οποία είχαν ταυτοποιηθεί από τον Dr. Stefano Taiti, ειδικό στην ταξινόμηση των χερσαίων ισοπόδων. Από τη βάση δεδομένων Genbank (NCBI - National Center of Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), ανασύρθηκαν όλες οι διαθέσιμες αλληλουχίες των ειδών της μελέτης (για τα γονίδια στόχους - 16S rrna, COI) καθώς και αλληλουχίες ατόμων συγγενικών ειδών ισοπόδων για το γενετικό τόπο 16S rrna [Porcelio laevis, Armadillidium lobocurvum (EF027622), Porcellionides pruinosus (AJ275211)] και για το γενετικό τόπο της υπομονάδας Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης (COI) [Armadillidium lobocurvum 90

Μεθοδολογία-Υλικά (AJ275211]), προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως εξωτερική ομάδα αναφοράς (εξωομάδα, outgroup) στη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Το σύνολο των τοποθεσιών και των δειγμάτων που μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή παρατίθενται στον Πίνακα Β1 και απεικονίζεται στους χάρτες των Εικόνων Β1 και Β2. Πίνακας Β1: Οι πληθυσμοί που μελετήθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, το είδος στο οποίο ανήκουν και ο κωδικός κάθε περιοχής δειγματοληψίας (βλέπε και Εικόνες Β1, Β2). Για τα. άτομα Armadillidium lobocurvum και Porcellionides pruinosus παρατίθεται σε παρένθεση ο κωδικός πρόσβασης στη Genbank. Τα χρώματα αντιστοιχούν σε είδη (nominal species). A/A Είδος Κωδικός Χάρτη Περιοχή δειγματοληψίας Αριθμός δειγμάτων 1 T. aegaeus AND Άνδρος 6 2 T. aegaeus ANF Ανάφη 1 3 T. aegaeus EPD Επίδαυρος 3 4 T. aegaeus MYK Μύκονος 6 5 T. aegaeus NAX Νάξος 3 6 T. aegaeus PAR Πάρος 5 7 T. aegaeus STO Στουρονήσι 1 8 T. aegaeus TIN Τήνος 3 9 T. aegaeus IKR Ικαρία 7 10 T. aegaeus SAM Σάμος 3 11 T. aegaeus KEA Κέα 3 12 T. aegaeus CRE Κρήτη 4 13 T. aegaeus KTN Κύθνος 2 14 T. aegaeus KYT Κύθηρα 4 15 T. aegaeus MIL Μήλος 1 16 T. aegaeus PRN Πάρνηθα 4 17 T. aegaeus SER Σέριφος 3 18 T. aegaeus SIF Σίφνος 2 19 T. aegaeus SYR Σύρος 2 20 T.cavaticus Tcav Σπήλαιο Κουρνά, Χανιά 2 21 T.nsp STN Στουρονήσι 2 22 T.nsp AGA Άγιος Ανδρέας 2 23 T. squamuliger BULG Plodviv 2 24 T. squamuliger ARD Άρδας 2 25 T. squamuliger KYPR Φράγμα Κυπρίνου 2 26 T. squamuliger GIAN Γιαννούλη (Σουφλί) 2 27 T. squamuliger NYMF Νυμφαίο 1 28 T. squamuliger NSAN Νέα Σάντα 2 29 T. squamuliger DAD Δαδιά 2 30 T. squamuliger STHR Σαμοθράκη 3 31 T. squamuliger STAV Σταυρούπολη 2 32 T. squamuliger KAV Καβάλα 4 33 T. squamuliger DRAM Δράμα 4 34 T. squamuliger XAGN Ξάγναντο (Παρανέστι) 2 35 T. squamuliger VROD Βροντού 2 36 T. squamuliger VLV Βόλβη 2 37 T. squamuliger CHLK Χαλκιδική_Ποταμός Χαβριάς 1 91

Μεθοδολογία-Υλικά 38 T. squamuliger AgO Άγιο Όρος 4 39 T. squamuliger ARID Αριδαία 2 40 T. squamuliger PRSM Μεγάλη Πρέσπα 1 41 T. squamuliger GAB Γάβρος 3 42 T. squamuliger KAT Κατάρα 4 43 T. squamuliger AgDN Αγιος Διανύσιος _Όλυμπος 4 44 T. squamuliger KAR Καρυές_ Όλυμπος 4 45 T. squamuliger TEMP Τέμπη 3 46 T. squamuliger CML Χρυσομηλιά 3 47 T. squamuliger FNR Φανάρι 1 48 T. squamuliger VEL Βελούχι 3 49 T. squamuliger KLAF Κλαύσιο 3 50 T. squamuliger AgNIK Άγιος Νικόλαος 1 51 T. squamuliger DAM Μονή Δαμάστας 3 52 T. squamuliger KIS Κισσός 3 53 T. squamuliger LBN Λαμπηνού 3 54 T. squamuliger STE Στενή 4 55 T. camerani TcameIT Poggiardo, ITALY 1 56 T. camerani KERK Κέρκυρα 4 57 T. camerani ZRL Λίμνη Ζηρού 1 58 T.arcuatus KON Κόνιτσα 2 59 T.arcuatus VOI Βοϊδομάτης 4 60 T.arcuatus SSN Σωσνίτσα 4 61 T.arcuatus Tarc_CAMP Campania, ITALY 1 62 T.arcuatus Tarc_Tosc Toscana, ITALY 1 63 T. palustris DRM Δρυμώνας 4 64 T. palustris PAP Παπάδες 4 65 T. palustris LBN Λαμπηνού 4 66 T. palustris KIS Κισσός 3 67 T. palustris MKRN Μακρυνίτσα 2 68 T. palustris ONF Αγ. Ονούφριος 3 69 T. palustris KLAF Κλαύσιο 3 70 T. palustris AgNIK Αγιος Νικόλαος 3 71 T. palustris DAM Μονή Δαμάστας 3 72 T. palustris KRN Κρανιά 2 73 T. palustris VOI Βοϊδομάτης 1 74 T. palustris GRP Γκρόπα 4 75 T. palustris ATR Αγία Τριάδα 4 76 T. palustris PER Περτούλι 4 77 T. palustris TPT Τριπόταμα 3 78 T. palustris VTS Βίτσα 3 79 T. palustris KLM Καλαμάς 4 80 T. palustris BEL Βέλλα 4 81 T. palustris FRX Φράξος 4 82 T. palustris ZRL Λίμνη Ζηρού 8 83 T. palustris ART Άρτα 1 84 T. palustris PRZ Πρέβεζα 1 85 T. palustris LEK Μεγανήσι (Λευκάδα) 4 86 T. palustris AIN Αίνος 4 87 T. palustris PAN Παναχαϊκό 11 88 T. palustris ΜΙΚ Μικρουλέικα 6 89 T. palustris KAL Καλέτζι 3 90 T. palustris LAMB Λάμπεια 6 92

Μεθοδολογία-Υλικά 91 T. palustris MNS Μανεσσαίικος 2 92 T. palustris VLA Βλασία 3 93 T. palustris MKL Μακελαριά 2 94 T. palustris BOU Βουραϊκός 12 95 T. palustris CH Χελμός (Αισθητικό Δάσος Καλαβρύτων 1000-1600μ 10 96 T. palustris SOL Σόλος 3 97 T. palustris FEN Φενεός 3 98 T. palustris PLAN Πλανητέρο 6 99 T. palustris THEO Θεόκτιστο 4 100 T. palustris FLA Φλαμπουρίτσα 1 101 T. palustris ZIR Ζήρια 3 102 T. palustris SFK Σοφικό 3 103 T. palustris KFL Κεφαλάρι 4 104 T. palustris MAIN Μαίναλο 1 105 T. palustris LIB Λιμποβίσι 5 106 T. palustris LOU Λούσιος 1 107 T. palustris ELTa Ελάτη 4 108 T. palustris ELTb Ελάτη 3 109 T. palustris LAG Λαγκάδια 1 110 T. palustris KRT Κουρούτα 4 111 T. palustris ALF Αλφειός 5 112 T. palustris AMG Αμυγδαλιές 3 113 T. palustris NED Νέδα 3 114 T. palustris PMS Πάμισος 3 115 T. palustris VLK Βελίκα 3 116 T. palustris PRR Παρόρι 4 117 T. palustris TAYa Ταΰγετος (1600μ) 3 118 T. palustris TAYb Ταΰγετος (1200μ) 3 119 T. palustris TAYc Ταΰγετος (1000μ) 2 120 T. palustris MBA Μονεμβασιά (ρέμα Μπαμπάνη) 3 121 T. palustris MKA Μονεμβασιά (Κουλέντια) 4 122 T. palustris GER Γεράκι 3 123 T. palustris CAS Καστάνιτσα 5 124 T. palustris MOU Μουστός 5 125 T. razeburgii SLO Bled, SLOVENIA 6 126 T. razeburgii Trat_Trent Trentino, ITALY 2 127 T. rathkii TR_SLZ Salzburg 5 outgroup Armadillidium Πελοπόννησος, A.lobo lobocurvum Παναχαϊκό 1 Porcellionides outgroup pruinosus P.pru Πελοπόννησος, Πάτρα 1 Σύνολο 127 πληθυσμοί 412 άτομα 93

Μεθοδολογία-Υλικά Εικόνα Β.1: Οι πληθυσμοί ατόμων Trachelipus sp. που μελετήθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής. Οι κωδικοί των τοποθεσιών επεξηγούνται στον Πίν.1. Εικόνα Β1: Οι πληθυσμοί Trachelipus spp. που συλλέχθηκαν για τις αναλύσεις της παρούσας διατριβής. Οι κωδικοί των τοποθεσιών επεξηγούνται στον Πίνακα Β1. 94

Μεθοδολογία-Υλικά Εικόνα Β2: Οι πληθυσμοί Trachelipus spp. που συλλέχθηκαν στην ελληνική επικράτεια για τις αναλύσεις της παρούσας διατριβής. Οι κωδικοί των τοποθεσιών επεξηγούνται στον Πίνακα Β1. 95

Μεθοδολογία-Υλικά 2. ΤΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΑ ΓΟΝΙΔΙΑ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 2.1. Τα μιτοχονδριακά γονίδια της μελέτης Για τη διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων των ειδών του γένους Trachelipus που μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η αλληλουχία δύο μιτοχονδριακών γονιδίων: της υπομονάδας Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης (Cytochrome Oxidase subunit I COI) και της μεγάλης υπομονάδας του μιτοχονδριακού ριβοσώματος (16S rrna). Η υπομονάδα Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης αποτελεί ένα ταχέως εξελισσόμενο γονίδιο του μιτοχονδριακού γονιδιώματος, είναι πολύ καλός μοριακός δείκτης και έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε μελέτες της γενετικής διαφοροποίησης και της εύρεσης φυλογεωγραφικών προτύπων τόσο σε ενδοειδικό επίπεδο όσο και μεταξύ συγγενικών ειδών (Maslov et al. 1999, Avise 2000, Lewis et al. 2005, Klossa-Kilia et al. 2005, 2006, Ros & Breeuwer 2007, Parmakelis et al. 2008). Σύμφωνα μάλιστα με τους υποστηρικτές του DNA-Barcoding, το γονίδιο αυτό φέρει μεγαλύτερο εύρος φυλογενετικού σήματος σε σύγκριση με τα υπόλοιπα μιτοχονδριακά γονίδια και με τη βοήθεια αυτού του γονιδίου μπορεί να ταυτοποιηθεί σε επίπεδο είδους το 98% των ζωικών ειδών (Hebert et al. 2003, Kerr et al. 2007). Επιπρόσθετα, η αλληλουχία του γενετικού τόπου COI έχει χρησιμοποιηθεί με μεγάλη επιτυχία από το εργαστήριό μας σε προηγούμενες φυλογεωγραφικές μελέτες ισοπόδων (Klossa-Kilia et al. 2005, 2006, Parmakelis et al. 2008). Ο γενετικός τόπος 16S rrna είναι ένας από τους πιο ευρέως χρησιμοποιούμενους δείκτες σε μελέτες φυλογένεσης, ανεξάρτητα από ζωική ομάδα ή ταξινομική βαθμίδα, κυρίως γιατί φέρει περιοχές που εξελίσσονται ταχύτατα και εξυπηρετεί τη διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ πρόσφατα διαχωρισμένων ειδών, αλλά παράλληλα φέρει και περιοχές αρκετά συντηρημένες που εξυπηρετούν στη διερεύνηση σχέσεων μεταξύ τάξων που έχουν διαχωριστεί έως και 200 mya (DeSalle 1987, 1992). Το συγκεκριμένο γονίδιο δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη και έτσι παίρνουμε χρήσιμες πληροφορίες 96

Μεθοδολογία-Υλικά για τις σχέσεις μεταξύ των πληθυσμών από τις ενθέσεις ή/και τις ελλείψεις νουκλεοτιδίων που μπορεί να παρατηρούνται σε διάφορες θέσεις μεταξύ των εξεταζόμενων αλληλουχιών. 2.2. Το πυρηνικό γονίδιο της μελέτης Επιπλέον των δύο μιτοχονδριακών γονιδίων χρησιμοποιήθηκε και ο πυρηνικός δείκτης της υπομονάδας α της αντλίας NaK (NaK ATPase). Το εν λόγω γονίδιο είναι μία Ρ-τύπου ATPase, συμμεταφορέας ιόντων η οποία απαντάται στις κυτταρικές μεμβράνες των μεταζώων. Το ένζυμο είναι υπεύθυνο για τη διατήρηση της διαφοράς του ηλεκτροχημικού δυναμικού στην κυτταρική μεμβράνη και είναι απαραίτητο για τη σηματοδότηση και τη δευτερογενή μεταφορά μηνυμάτων. Η NaK ATPase είναι ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από α και β υπομονάδες. Η α-υπομονάδα απαρτίζεται από ένα καλά συντηρημένο πολυπεπτίδιο που δρα καταλυτικά στη σηματοδότηση ενώ η λειτουργικότητα της γλυκοζυλιωμένης β-υπομονάδας παραμένει άγνωστη. Παρόλο που στα σπονδυλωτά και οι δύο υπομονάδες έχουν εξελιχθεί σε πολλαπλά αντίγραφα, στα ασπόνδυλα η αντλία παραμένει ως μοναδιαίο αντίγραφο στα κύτταρα των οργανισμών (Tsang et al. 2008). Το εν λόγω ένζυμο, σε συνδυασμό με την αντλία Η-ATPase θεωρείται πως παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των μηχανισμών ρύθμισης ιόντων και μάλιστα πως αποτελεί εξελικτική προσαρμογή για την εποίκιση της στεριάς, όπου η διατήρηση του νερού και των ιόντων καθίστανται ιδιαιτέρως σημαντικά. Τέτοιου είδους ρυθμιστικές λειτουργίες οδηγούνται ενεργητικά από ένζυμααντλίες ATP τα οποία είναι διάσπαρτα σε όλα τα επίπεδα οργάνωσης της ζωής (βακτήρια,αρχαία και ευκαρυωτικούς οργανισμούς). Από αυτά τα ένζυμα, η εξέλιξη της αντλίας NaK ATPase θεωρείται πως ήταν κρίσιμη για την εποίκιση των γλυκών νερών και της στεριάς για πολλούς οργανισμούς (Lee et al. 2011). 97

Μεθοδολογία-Υλικά Εικόνα Β3: Η NaK ATPase είναι μια αντλία που μεταφέρει ενεργητικά το Νάτριο και το Κάλιο. Εδράζεται στη βασεοπλευρική μεριά του κυττάρου και απομακρύνει από το κύτταρο το Na (3Να+) ενώ προσλαμβάνει και μεταφέρει στο εσωτερικό του κυττάρου το Κ (2Κ+). Συγκεκριμένα στα ισόποδα, το ένζυμο της NaK ATPase θεωρείται πως είναι αυτό που καθορίζει και ρυθμίζει την ενεργό ηλεκτρογενή πρόσληψη του NaCl, ενώ οι ωσμωρυθμιστικές λειτουργίες εντοπίζονται στα πλεοπόδια (στα κοιλιακά μεταμερή). Μετρήσεις που έχουν πραγματοποιηθεί για την ενεργότητα της αντλίας NaK, καταδεικνύουν πως η ωσμωρυθμιστική λειτουργία της πρόσληψης ιόντων εντοπίζεται στους ενδοποδίτες των τελευταίων κοιλιακών μεταμερών. Η μικροδομή των ενδοποδιτών διαφόρων ισοπόδων που ζουν σε γλυκά και υφάλμυρα περιβάλλοντα καθώς και στη στεριά αποκαλύπτουν χαρακτηριστικά σύμφωνα με τυπικούς ιοντοανταλλάκτες ιστούς που ομοιάζουν με αυτούς των βραγχίων άλλων καρκινοειδών (Postel et al. 2000 και αναφορές που περιλαμβάνονται εκεί). 98

Μεθοδολογία-Υλικά 3. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ 3.1. Πειραματική Πορεία Η τυπική πειραματική διαδικασία μετά τη συλλογή των δειγμάτων, περιέλαβε τα ακόλουθα στάδια: Επεξεργασία των ιστών και εξαγωγή ολικού γονιδιωματικού DNA Πολλαπλασιασμός των τμημάτων-στόχων του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Καθαρισμός του προϊόντος της PCR Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (Sanger sequencing) 3.1.1. Εξαγωγή Ολικού DNA Στη μελέτη αυτή, η απομόνωση Για την παρασκευή του διαλύματος TE9 απαιτούνται του ολικού DNA, από τα δείγματα που ήταν διατηρημένα σε 90-100% αιθανόλη, 500mM TrisHCl πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του συστήματος αντιδράσεως απομόνωσης 20mM EDTA DNA Nucleospin Tissue της εταιρείας 10mM NaCl ph=9 Macherey-Nagel. Το παραπάνω σύστημα αντιδράσεων περιλαμβάνει το αναλυτικό πρωτόκολλο απομόνωσης, στο οποίο περιγράφεται σταδιακά η διαδικασία εξαγωγής του DNA, καθώς και τα απαραίτητα διαλύματα και αντιδραστήρια. Στις περιπτώσεις που το παραλαμβανόμενο DNA ήταν κακής ποιότητας αλλά και γενικότερα πολλές φορές για τη βελτιστοποίηση του εξαγόμενου DNA, έγινε επανάληψη της πειραματικής διαδικασίας αφού προηγήθηκαν επώαση και ξεπλύματα (2-3 φορές) του ιστού για 24 ώρες με διάλυμα ΤΕ9 σε ανακινούμενο υδατόλουτρο και σε θερμοκρασία 56 ο C προκειμένου να 99

Μεθοδολογία-Υλικά απομακρυνθεί στο μέγιστο δυνατό βαθμό η εναπομείνασα αλκοόλη όπου ήταν συντηρημένα τα δείγματα. Η απομόνωση ολικού DNA στα δείγματα των νησιωτικών περιοχών που ήταν διατηρημένα είτε σε <70% αιθανόλη είτε είχαν συλλεχθεί σε παγίδες παρεμβολής που περιείχαν αιθυλενογλυκόλη, παρουσίασε πληθώρα προβλημάτων και πολύ χαμηλή συγκέντρωση (έως και μηδενική) εξαγόμενου ολικού DNA όταν χρησιμοποιήθηκε το σύστημα αντιδράσεων της Macherey- Nagel. Γι αυτόν τον λόγο επιλέχτηκε να χρησιμοποιηθεί το πρωτόκολλο εξαγωγής DNA με CTAB των Winnepenninckx et al. (1993), το οποίο έπειτα από σειρά διαφορετικών δοκιμών τροποποιήθηκε ως εξής (Kamilari et al. 2014): 1. Επώαση του ιστού (2-3 περαιοπόδια) σε 800 μl διαλύματος ΤΕ9 για 1-2 ώρες στους 56 ο C. Ανανέωση του διαλύματος ΤΕ9 για 2-3 φορές κατά τη διάρκεια της επώασης. 2. Επώαση του ιστού (12 ώρες) σε 300 μl διαλύματος CTAB στους 56 ο C. 3. Ομογενοποίηση του ιστού και προσθήκη 2 μl Proteinase K (20 mg/ml). 4. Επώαση των δειγμάτων για 30-60 min. 5. Προσθήκη 400 ml διαλύματος CTAB (προθερμασμένου στους 60 ο C). 6. Επώαση για 1.5 ώρες. 7. Προσθήκη 700 μl χλωροφορμίου. 8. Φυγοκέντρηση 15 min σε 11.000 g. 9. Απομάκρυνση και μεταφορά της υπερκείμενης φάσης σε νέο eppendorf και προσθήκη 700 μl χλωροφορμίου. 10. Φυγοκέντρηση για 15 min σε 11.000 g και μεταφορά της υπερκείμενης φάσης σε νέο eppendorf. 11. Προσθήκη 1.000 μl ισοπροπανόλης. 12. Αποθήκευση στους -20 ο C για 30 min. 13. Φυγοκέντρηση για 20 min σε 1.000 g. 14. Απόρριψη της υπερκείμενης φάσης και προσθήκη 1.000 μl αιθανόλης 70% (-20 ο C). 15. Φυγοκέντρηση για 15 min σε 11.000 g. 100

Μεθοδολογία-Υλικά 16. Επανάληψη της φυγοκέντρησης (προκειμένου να απομακρυνθεί πλήρως η αιθανόλη). 17. Τοποθέτηση στους 37 ο C έως ότου εξατμισθεί πλήρως η αιθανόλη. 18. Προσθήκη 50 μl Nanopure water και αναμονή 4 ωρών σε θερμοκρασία δωματίου. 19. Αποθήκευση του ολικού DNA στους -20 ο C. 3.1.2. Ηλεκτροφόρηση Ολικού DNA Ο έλεγχος της επιτυχίας της απομόνωσης, της ποσότητας και ποιότητας του εξαγόμενου DNA γινόταν με ηλεκτροφόρηση ζώνης. Η παρουσία DNA σε ικανοποιητική συγκέντρωση, χωρίς προσμίξεις RNA και πρωτεϊνών, δηλωνόταν με την παρουσία μιας μόνο ευκρινούς ζώνης. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείτο σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% που παρασκευαζόταν διαλύοντας με βρασμό την αγαρόζη σε διάλυμα ΤΒΕ (διάλυμα Trizma Base, Η 3ΒΟ 3, και EDTA). Το πήκτωμα περιείχε και 5-7% βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) το οποίο δεσμεύεται ανάμεσα σε διαδοχικές βάσεις του ίδιου κλώνου των νουκλεϊκών οξέων, απορροφά υπεριώδη ακτινοβολία (UV) και εκπέμπει ακτινοβολία στο ορατό για τον άνθρωπο φάσμα. Εικόνα Β4: Το πρότυπο ζωνών από απομόνωση ολικού DNA. Παρατηρείται μια φωτεινή ζώνη η οποία αντιστοιχεί στο ολικό DNA. Η εμφάνιση των πηκτωμάτων γίνεται με την επίδραση υπεριώδους φωτός. Εικόνα Β5: Το πρότυπο ζωνών των προϊόντων μιας αντίδρασης PCR. Στο τελευταίο πηγαδάκι του πηκτώματος διακρίνεται ο μάρτυρας (gelpilot low range ladder) που χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί το μέγεθος, η ποσότητα και η ποιότητα των προϊόντων. Η εμφάνιση των πηκτωμάτων γίνεται με την επίδραση υπεριώδους φωτός 101

Μεθοδολογία-Υλικά 3.1.3. Πολλαπλασιασμός συγκεκριμένων τμημάτων DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) Για τον πολλαπλασιασμό κάθε γενετικού τόπου χρησιμοποιήθηκε ένα ζεύγος εκκινητών (primers) που με τη μεγαλύτερη πιστότητα πολλαπλασίαζε το ζητούμενο κάθε φορά γονίδιο. Οι αλληλουχίες των εκκινητών και το μέγεθος του προϊόντος που παράγουν δίνονται στον Πίνακα B2. Τα πρωτόκολλα παρασκευής των διαλυμάτων της PCR παρατίθενται στους Πίνακες B3, B4 και Β5. Πίνακας B2: Τα γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν, το μέγεθος των προϊόντων τους και η αντίστοιχη βιβλιογραφική αναφορά. (F = forward, R = reverse). Γονίδιο στόχος Όνομα εκκινητή Αλληλουχία εκκινητή Μέγεθος προϊόντος Βιβλιογραφική Αναφορά 16S rrna 16Sar (F) 5 -CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3 Palumbi 1996 16Sbr (R) 5 -CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3 430-360 Palumbi 1996 16Sar-int-sf (F) 5 -GCC GCA GTA THC TRA CTG TGC T-3 bps Parmakelis et al. 2008 16Sbr-sf (R) 5 -CCG GTT TGA ACT CAG ATC ATG-3 Palumbi 1996 COI COIF (F) 5'- TCW CAN AAY CAY AAR GAY ATT GG- 3' Folmer et al. 1994 COIR (R) 5'- ACY TCN GGR TGN CCR AAR ARY CA-3' Folmer et al. 1994 700 520 Modified from Folmer et COIF (F) 5 -CCG GTT TGA ACT CAG ATC ATG-3 bps al. 1994 COIF-int (F) 5 -GGG ACA GCH CTK AGV RTA AT-3' Parmakelis et al. 2008 COIR-int (R) 5 -GCY CCY GCY AAW ACA GGK ARD-3 Parmakelis et al. 2008 NaK ATPase NaK for-a (F) NaK for-b (F) NaK rev2 (R) GTG TTC CTC ATT GGT ATC ATT GT ATG ACA GTT GCT CAT ATG TGG TT ATA GGG TGA TCT CCA GTR ACC AT 1000 650 bps Tsang et al. 2008 102

Μεθοδολογία-Υλικά Εικόνα Β6: Σχηματική αναπαράσταση του κυκλικού μορίου του μιτοχονδριακού DNA ισοπόδου. Σχεδιασμένο από τα δεδομένα των Kilpert & Podsiadlowski (2006) με το πρόγραμμα OGDRAW v1. (Lohse et al. 2007). 103

Μεθοδολογία-Υλικά Πίνακας B3: Πρωτόκολλο παρασκευής διαλύματος PCR για το μιτοχονδριακό γονίδιο της υπομονάδας Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης (COI). 0,5 μl από το διάλυμα ολικού DNA 2,5 μl ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης 10x (PCR buffer) 2 μl διαλύματος 10 mm MgCl 2 0,25 μl διαλύματος 20 pmol/lt για κάθε ολιγονουκλεοτίδιο εκκινητή 0,5 μl διαλύματος 10 mm dntp που περιέχει σε ίσες επιμέρους συγκεντρώσεις τα τέσσερα dntps 1 μl BSA (αλβουμίνη ορού βοός) 0,25 μl διαλύματος 5u/λ Taq πολυμεράσης 17,75 μl απεσταγμένο και αποστειρωμένο Η 2Ο, τελικός όγκος δείγματος 25 μl. Πίνακας Β4: Πρωτόκολλο παρασκευής διαλύματος PCR για το μιτοχονδριακό γονίδιο 16S rrna. 0,5 μl από το διάλυμα ολικού DNA 2,5λ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης 10x (PCR buffer) 1,75λ διαλύματος 10mM MgCl 2 0,3λ διαλύματος 20pmol/lt για τον ολιγονουκλεοτίδιο εκκινητή 16Sar-int-sf 0,2λ διαλύματος 10μΜ για τον ολιγονουκλεοτίδιο εκκινητή 16Sbr-sf 0,5λ διαλύματος 10mM dntp που περιέχει σε ίσες επιμέρους συγκεντρώσεις τα τέσσερα dntps 0,25λ διαλύματος 5u/λ Taq πολυμεράσης 19λ απεσταγμένο και αποστειρωμένο Η 2Ο, τελικός όγκος δείγματος 25λ. Πίνακας B5: Πρωτόκολλο παρασκευής διαλύματος PCR για το πυρηνικό γονίδιο NaK ATPase. 0,5λ από το διάλυμα ολικού DNA 2,5λ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης 10x (PCR buffer) 1,5λ διαλύματος 10mM MgCl 2 0,4λ διαλύματος 20pmol/lt για κάθε ολιγονουκλεοτίδιο εκκινητή 0,5λ διαλύματος 10mM dntp που περιέχει σε ίσες επιμέρους συγκεντρώσεις τα τέσσερα dntps 2λ BSA (αλβουμίνη ορού βοός) 0,25λ διαλύματος 5u/λ Taq πολυμεράσης 16,95λ απεσταγμένο και αποστειρωμένο Η 2Ο, τελικός όγκος δείγματος 25λ. 104

Μεθοδολογία-Υλικά Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον πολλαπλασιασμό των μιτοχονδριακών τμημάτων COI και 16S rrna σύμφωνα με την εργασία των Klossa-Kilia et al. (2006), με μικρές τροποποιήσεις ώστε να έχουμε το καλύτερο δυνατό αποτέλεσμα. Η συνθήκες της PCR για καθένα από τα γονίδια περιγράφεται στον ακόλουθο Πίνακα Β6. Πίνακας B6: Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν για τον πολλαπλασιασμό του κάθε γονιδίου με την μέθοδο PCR. Περιγραφή 16S r RNA COI NaK ATPase Στάδιο (Σχόλια) oc Χρόνος Κύκλοι oc Χρόνος Κύκλοι oc Χρόνος Κύκλοι Denaturation (αρχικό στάδιο αποδιάταξης/προεπώαση) Denaturation (στάδιο αποδιάταξης) Annealing (στάδιο υβριδισμού) Extension (στάδιο επιμήκυνσης) Extension (τελικό στάδιο επιμήκυνσης) End (στάδιο ολοκλήρωσης της αντίδρασης και διατήρησης των δειγμάτων) 94 3 min 1 94 3 min 1 94 3 min 1 94 15 sec 94 30 sec 94 15 sec 50 30 sec X 35 48 55 1 min Χ 37 52 58 30 sec 72 1 min 72 1 min 72 1 min 72 10 min 1 72 10 min 1 72 10 min 1 4 4 4 X 35 Τα προϊόντα της PCR ελέγχονταν κατόπιν ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης, όπως και στην περίπτωση του απομονωμένου ολικού DNA που περιγράφηκε προηγουμένως. Τα δείγματα-προϊόντα της PCR διατηρούνταν σε θερμοκρασία -20 o C. 105

Μεθοδολογία-Υλικά 3.1.4. Καθαρισμός του πολλαπλασιασμένου τμήματος των γονιδίων COI, 16S rrna και NaK ATPase. Η διαδικασία καθαρισμού πραγματοποιήθηκε για την απομάκρυνση των κατάλοιπων ουσιών, όπως ένζυμα, απορρυπαντικά, άλατα ή ολιγονουκλεοτίδια που παραμένουν μέσα στο διάλυμα των νουκλεϊκών οξέων μετά το πέρας της απομόνωσής τους ή/και της PCR. Το τελικό προϊόν πρέπει να καθαρίζεται από τα κατάλοιπα αυτά, τα οποία μειώνουν τη συγκέντρωση του DNA στο διάλυμα και είναι πηγή θορύβου σε πολλές μεθόδους. Στην περίπτωση που ένα τμήμα γενετικού υλικού πολλαπλασιάζεται με σκοπό την ανάλυση της αλληλουχίας του, ο καθαρισμός του προϊόντος της PCR είναι απαραίτητος εξαιτίας της μεγάλης ευαισθησίας που έχουν οι αναλυτές αλληλουχίας στις προσμίξεις. Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στη χρήση μεμβράνης με βασικό συστατικό το πυρίτιο, ή άλλων πηκτωμάτων που έχουν σχεδιαστεί ειδικά ώστε να προσδένουν και να συγκρατούν τα νουκλεϊκά οξέα. Η πρόσδεση των νουκλεϊκών οξέων στη μεμβράνη γίνεται παρουσία διαλύματος υψηλής αλατότητας ενώ τα κατάλοιπα που υπήρχαν στο αρχικό προϊόν διαπερνούν τη μεμβράνη και ξεπλένονται από το αρχικό διάλυμα. Τα νουκλεϊκά οξέα επαναδιαλύονται με διάλυμα Tris-HCl ή διπλά απεσταγμένο νερό. Στο τελικό διάλυμα παίρνουμε 90-95% της αρχικής ποσότητας νουκλεϊκών οξέων μεγάλης καθαρότητας. Στην παρούσα μελέτη ο καθαρισμός πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος αντιδράσεων Nucleospin Extract II της εταιρίας Macherey Nagel, βάσει του πρωτοκόλλου της εταιρίας. Η έκλουση του DNA γίνεται σε τελικό όγκο 20 μl, και διατηρείται στους -20 C. 106

Μεθοδολογία-Υλικά 3.1.5. Καθορισμός της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων των επιλεγμένων τμημάτων των μιτοχονδριακών γονιδίων (Sanger sequencing) Η ανάγκη για τη γνώση της αλληλουχίας του DNA έγινε απαραίτητη για τη βασική βιολογική έρευνα. Έτσι αναπτύχθηκαν μέθοδοι με τη βοήθεια των οποίων μπορεί κανείς να «διαβάσει» πλέον οποιαδήποτε αλληλουχία DNA. Η κλασική μέθοδος απαιτεί ένα μονόκλωνο μόριο DNA ως μήτρα, έναν DNA εκκινητή, μια DNA πολυμεράση, ραδιενεργά σημασμένα ή σημασμένα με χρωστική νουκλεοτίδια και τροποποιημένα νουκλεοτίδια τα οποία θα τερματίσουν την επιμήκυνση της αλυσίδας του DNA. Το δείγμα του DNA διαχωρίζεται σε τέσσερις ξεχωριστές αντιδράσεις αλληλούχησης (Εικόνα B7), στις οποίες περιλαμβάνονται τα τέσσερα βασικά dntps και η DNA πολυμεράση. Η αλληλούχηση των δειγμάτων στη συγκεκριμένη εργασία πραγματοποιήθηκε από την εταιρεία VBC Biotech με έδρα τη Βιέννη και την εταιρεία Macrogen στην Ολλανδία. Μετά την αποστολή των δειγμάτων, καθώς και μιας ποσότητας του ενός εκ των δύο εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την PCR, η εταιρεία πραγματοποιεί την αλληλούχηση χρησιμοποιώντας το μοντέλο ABI Prism 3100 Capillary Sequencer και τα αποτελέσματα αποστέλλονται μέσω ηλεκτρονικού ταχυδρομείου. 107

Μεθοδολογία-Υλικά Εικόνα Β7: Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου Sanger. Απεικονίζονται τα συστατικά των τεσσάρων ξεχωριστών αντιδράσεων (A, B, C, D) και η τελική τους εμφάνιση στο πήκτωμα. Κάθε ζώνη αποτελεί τμήμα DNA διαφορετικού μεγέθους. Οι σχετικές θέσεις των διαφορετικών ζωνών μεταξύ των τεσσάρων γραμμών χρησιμοποιούνται για το διάβασμα της αλληλουχίας με φορά από κάτω προς τα πάνω. 108

Μεθοδολογία-Υλικά 4. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ 4.1. Στοίχιση Αλληλουχιών Η στοίχιση αποσκοπεί στον προσδιορισμό των ομόλογων θέσεων των αλληλουχιών, αφού βάσει αυτών των διαφορών υπολογίζονται οι εξελικτικές σχέσεις των μελετηθέντων αλληλουχιών. Συνεπώς, η στοίχιση των αλληλουχιών είναι διαδικασία ζωτικής σημασίας για την εύρεση των πραγματικών φυλογενετικών σχέσεων των υπό εξέταση ταξινομικών μονάδων (Gatesy et al. 1993, Collins et al. 1994a, Wheeler et al. 1995, Baker & DeSalle 1997, Simmons & Ochoterenam 2000). Τα τμήματα των δύο μιτοχονδριακών γονιδίων (COI και 16S rrna) τα οποία αναλύθηκαν δεν είχαν τον ίδιο αριθμό βάσεων σε όλα τα άτομα. Το γεγονός αυτό οφείλεται σε παράγοντες όπως η μικρή συγκέντρωση του DNA σε ορισμένα δείγματα που δυσχεραίνει την ανάγνωση των βάσεων κατά την εφαρμογή της μεθόδου των Sanger et al. (1977), και η δέσμευση των ολιγονουκλεοτιδίων εκκινητών σε συμπληρωματικές αλληλουχίες που βρίσκονται σε διαφορετικές θέσεις κατά μήκος του τμήματος της περιοχής ελέγχου. Ενθέσεις ή ελλείψεις βάσεων μεταβάλλουν το μήκος των τμημάτων που μελετούνται. Για την αποκάλυψη αυτών των πολυμορφισμών οι αλληλουχίες στοιχίζονται. H στοίχιση των αλληλουχιών που εξετάστηκαν στην παρούσα μελέτη για τα άτομα Trachelipus και τα άτομα της εξωομάδας, έγινε με το πρόγραμμα CLUSTAL W [version 1.4 (Thompson et al. 1994)] που περιλαμβάνεται στο πρόγραμμα BioEdit Sequence Alignment Editor, version 7.0.5.2. (Hall 1999). Η διαδικασία της στοίχισης γίνεται αρχικά με βάση την αντιστοιχία όσο το δυνατόν περισσότερων ομόλογων περιοχών και εν συνεχεία γίνεται και η στοίχιση των νουκλεοτιδικών θέσεων που δεν χαρακτηρίζονται από την ίδια αλληλουχία βάσεων. Η διαδικασία που αφορά τη στοίχιση τμημάτων DNA περισσότερων από δύο δειγμάτων, ονομάζεται πολλαπλή στοίχιση (multiple alignment) και γίνεται 109

Μεθοδολογία-Υλικά προοδευτικά, αρχίζοντας με τη στοίχιση ανά ζεύγος αλληλουχιών. Αρχικά ομαδοποιούνται οι αλληλουχίες που μοιράζονται τις περισσότερες ομολογίες και σταδιακά προστίθενται όσες είναι περισσότερο διαφοροποιημένες. Σε κάθε στάδιο εξετάζεται η ορθότητα της στοίχισης μέσω της σύγκρισης πινάκων που δημιουργεί το πρόγραμμα και οι οποίοι καταγράφουν τον αριθμό των νουκλεοτιδίων που ταίριαξαν, όσων διαφοροποιήθηκαν και το βαθμό των ενθέσεων και ελλείψεων που παρουσιάζει η στοίχιση. Η διαδικασία συνεχίζεται μέχρι να μεγιστοποιηθεί ο αριθμός των νουκλεοτιδίων που είναι ομόλογα και ταυτόχρονα να ελαχιστοποιηθούν οι τιμές των άλλων τριών παραμέτρων (Feng & Doolittle 1987, Thompson et al. 1994). 4.2. Επεξεργασία των Στοιχισμένων Αλληλουχιών Για το γενετικό τόπο 16S rrna την αρχική στοίχιση των αλληλουχιών ακολούθησε και η στοίχιση λαμβάνοντας υπόψη τη δευτεροταγή δομή του μορίου με χρήση του προγράμματος RNASalsa (Stocsits et al. 2009) και χρησιμοποιώντας ως δομή-οδηγό αυτή του είδους Apis mellifera η οποία περιλαμβάνεται στο πακέτο του προγράμματος RNAsalsa. Στη συνέχεια, με τη χρήση του προγράμματος Gblocks (Castresana 2000) απομακρύνθηκαν ασαφείς, αμφιλεγόμενες και προβληματικές ως προς τη στοίχισή τους περιοχές. Συγκεκριμένα για τους δύο γενετικούς τόπους (COI και NaK ATPAse) οι οποίοι κωδικοποιούν πρωτεΐνη, προηγήθηκε η μετάφραση των αλληλουχιών κάθε ατόμου στην αμινοξική τους αλληλουχία με το πρόγραμμα MEGA v6.0 (Tamura et al. 2013), με το οποίο ελέγχθησαν αν εμφανίζουν κωδικόνια λήξης. Το αποτέλεσμα της στοίχισης μετά την επεξεργασία με το πρόγραμμα GBlocks αποτέλεσε την τελική μορφή των αλληλουχιών για τις περαιτέρω αναλύσεις. 110

Μεθοδολογία-Υλικά 4.3. Έλεγχος Δεδομένων για Ομοπλασία και Κορεσμό Ο αριθμός των αλλαγών σε μια νουκλεοτιδική θέση είναι πεπερασμένος. Όσο μεγαλύτερη είναι η γενετική απόσταση δύο τάξων (δηλαδή όσο πιο απομακρυσμένα εξελικτικά είναι δύο είδη) τόσο μεγαλύτερη είναι και η πιθανότητα να συμβεί αλλαγή σε μια θέση στην οποία είχε ήδη συμβεί μια αλλαγή. Όταν συμβεί κάτι τέτοιο, τότε υπάρχει κορεσμός των νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων (substitution saturation), οπότε σταματά να ισχύει η γραμμική σχέση του χρόνου και της απόστασης δύο αλληλουχιών, με αποτέλεσμα να αλλοιώνεται ποιοτικά η φυλογενετική πληροφορία που θα έδιναν οι αλληλουχίες (Tamura & Nei 1993, Page & Holmes 1998). Ένας από τους τρόπους με τους οποίους μπορεί να ελεγχθεί η ομοπλασία των δεδομένων, είναι ο έλεγχος του Xia που χρησιμοποιεί το δείκτη κορεσμού υποκατάστασης (Xia et al. 2003) και περιλαμβάνεται στο πρόγραμμα Dambe (Xia & Xie 2001). Η μεταβλητότητα σε κάθε νουκλεοτιδική θέση i μετράται ως εντροπία με την εξίσωση: και 4 p j log 2 p j όπου, j 1 j= 1,2,3,4 αντιστοιχούν στα νουκλεοτίδια A, T, G και C αντίστοιχα p j = η σχετική συχνότητα του νουκλεοτιδίου j στη θέση i. Αν όλα τα νουκλεοτίδια στη θέση i είναι ίδια τότε προφανώς H i = 0. Οι υποκαταστάσεις οδηγούν σε πολυμορφικές θέσεις στις οποίες η τιμή H θα είναι μεγαλύτερη του μηδενός. 111

Μεθοδολογία-Υλικά Ο δείκτης των Xia et al. (2003) αποδίδεται από τη σχέση: I / SS H H FSS όπου, H = η παρατηρούμενη τιμή της εντροπίας H FSS = η τιμή της εντροπίας για πλήρη κορεσμό υποκαταστάσεων Σημειώνεται ότι FSS = Full substitution saturation (πλήρης κορεσμός υποκαταστάσεων) Θεωρητικά, ο έλεγχος του κορεσμού υποκατάστασης μπορεί να πραγματοποιηθεί απλά ελέγχοντας αν η παρατηρούμενη τιμή του H είναι στατιστικώς σημαντικά μικρότερη από την τιμή H FSS. Αν η H δεν είναι στατιστικώς σημαντικά μικρότερη από την H FSS, τότε οι αλληλουχίες παρουσιάζουν κορεσμό. Αυτός ο συλλογισμός όμως είναι καθαρά θεωρητικός καθώς οι αλληλουχίες αποτυγχάνουν να αποδώσουν την πραγματική φυλογένεση πολύ πριν φτάσουν στον πλήρη κορεσμό, οπότε και θα ισχύει I 1 δηλαδή H = H FSS. Γι αυτόν τον λόγο προσδιορίζεται η κρίσιμη τιμή SS I SS. C του δείκτη I SS στην οποία οι αλληλουχίες ξεκινούν να αποτυγχάνουν να ανασυστήσουν το πραγματικό φυλογενετικό δέντρο. Όταν η τιμή του I SS. C είναι γνωστή, μπορεί εύκολα να υπολογιστεί και η I SS και να γίνει η μεταξύ τους σύγκριση. Στο πρόγραμμα Dambe (Xia & Xie 2001) η σύγκριση των δύο τιμών πραγματοποιείται με two tailed t-test. Αν η I SS δεν είναι μικρότερη (στατιστικώς σημαντικά) τότε συμπεραίνεται πως οι αλληλουχίες είναι κορεσμένες και δεν θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν για φυλογενετικές αναλύσεις. 112

Μεθοδολογία-Υλικά 4.4. Υπολογισμός Γενετικής Ποικιλότητας και Καθορισμός Απλοτύπων Ο προσδιορισμός των πολυμορφισμών που εμφανίζονται μεταξύ των εξεταζόμενων αλληλουχιών έγινε με το πρόγραμμα MEGA v6.0 (Tamura et al. 2013). Mε το πρόγραμμα αυτό υπολογίστηκε η ενδοπληθυσμιακή, η διαπληθυσμιακή και η καθαρή διαπληθυσμιακή νουκλεοτιδική ποικιλότητα. Με το ίδιο πρόγραμμα έγινε και ο υπολογισμός των βάσεων που διαφοροποιούνταν και προσδιορίστηκαν και οι πληροφοριακές θέσεις φειδωλότητας σε κάθε σύνολο αλληλουχιών που αναλυόταν κάθε φορά. Τέλος ο προσδιορισμός των απλοτύπων πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πρόγραμμα DnaSP v4.10 (Rozas et al. 2003). 4.4.1. Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων Η απλούστερη μέτρηση της απόστασης δύο νουκλεοτιδικών αλληλουχιών είναι η καταμέτρηση του αριθμού των νουκλεοτιδικών θέσεων στις οποίες οι δύο αυτές αλληλουχίες διαφέρουν (απόσταση d), η οποία εκφράζεται ως ποσοστό p των νουκλεοτιδικών θέσεων στις οποίες οι δύο αλληλουχίες είναι διαφορετικές. Όμως στις περιπτώσεις που ο εξελικτικός ρυθμός είναι μεγάλος η απόσταση d υποεκτιμά ουσιαστικά την απόσταση μεταξύ των δύο αλληλουχιών (Page & Holmes 1998). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι όσο αυξάνεται ο βαθμός διαφοροποίησης μεταξύ των αλληλουχιών τόσο αυξάνει και η πιθανότητα η ίδια νουκλεοτιδική θέση να έχει υποστεί πολλαπλές μεταλλάξεις και να έχει επανέλθει στην αρχική της κατάσταση. Με αυτόν τον τρόπο έχει μείνει κρυφός ο πραγματικός αριθμός αλλαγών στη συγκεκριμένη νουκλεοτιδική θέση άρα και o πραγματικός βαθμός διαφοροποίησης της εν λόγω αλληλουχίας (Kumar et al. 2004). Αυτό οδήγησε στο να αναπτυχθούν μέθοδοι γνωστές ως «τεχνικές διόρθωσης» των αποστάσεων που έχουν ως στόχο να ανάγουν τις παρατηρούμενες 113

Μεθοδολογία-Υλικά αποστάσεις σε πραγματικούς εκτιμητές των εξελικτικών αλλαγών. Αυτό πραγματοποιείται με την εκτίμηση του ποσοστού της γενετικής διαφοροποίησης που έχει καλυφθεί λόγω πολλαπλών αλλαγών σε μια νουκλεοτιδική θέση. Ο υπολογισμός των νουκλεοτιδικών αποστάσεων έγινε με βάση το μοντέλο 2 παραμέτρων του Kimura (Kimura 2-parameter model - K2P) (1980). Σύμφωνα μ αυτό, οι συχνότητες υποκατάστασης των μεταπτώσεων 4 διαφέρουν από εκείνες των μεταστροφών 5, γεγονός που ισχύει στις αλληλουχίες του mtdna των ζώων. Οι νουκλεοτιδικές αποστάσεις υπολογίζονται από την εξίσωση: 1 2P Q 1 2Q d loge loge όπου, 2 4 P=n s/n και Q= n v/n, με n s και n v ο αριθμός των διαφορών μεταστροφών και μεταπτώσεων μεταξύ δυο αλληλουχιών. 4 Μετάπτωση: τύπος σημειακής μετάλλαξης βάσεων κατά την οποία μία πουρίνη (A,G) αντικαθίσταται και πάλι από πουρίνη και αντιστοίχως μια πυριμιδίνη αντικαθίσταται και πάλι από μια πυριμιδίνη (C,T). 5 Μεταστροφή: σημειακή μετάλλαξη βάσεων κατά την οποία μία πουρίνη (A,G) αντικαθίσταται από μια πυριμιδίνη (C,T). 114

Μεθοδολογία-Υλικά 5. ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΑΙΝΕΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ 5.1. Επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης Το αποτέλεσμα των διαφόρων φυλογενετικών μεθόδων που χρησιμοποιούνται, προκειμένου να αποκωδικοποιηθούν οι σχέσεις μεταξύ των μελετώμενων κάθε φορά τάξων, εξαρτάται άμεσα από το μοντέλο που αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούν για την εκτίμηση των εξελικτικών αποστάσεων μεταξύ των μελετηθέντων αλληλουχιών. Αυτό συμβαίνει καθώς κάθε φορά αυτές οι μέθοδοι κάνουν και διαφορετικές παραδοχές σε ό,τι αφορά τις νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις των αλληλουχιών (Felsestein 1988a, b). Για να υπάρχει λοιπόν αξιοπιστία στα συμπεράσματα των φυλογενετικών αναλύσεων, είναι αναγκαία πρωτίστως και η αξιοπιστία του μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης (Goldman 1993). Γι αυτόν το λόγο θα πρέπει να εξεταστούν οι φυλογενετικές μέθοδοι που βασίζονται σε μοντέλα νουκλεοτιδικής υποκατάστασης προκειμένου να επιλεγεί το μοντέλο που ταιριάζει καλύτερα στο σύνολο δεδομένων που αναλύεται κάθε φορά ώστε να δικαιολογείται και η χρήση του (Huelsenbeck & Crandall 1997, Posada & Crandall 1998, 2001). Για τις αναλύσεις Μέγιστης Πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood - ML) και Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (Bayesian Inference - BI) απαιτείται η επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης, για κάθε τμήμα (partition). Η επιλογή αυτή έγινε με τη βοήθεια του προγράμματος jmodeltest v.2.0 (Posada 2008), με το κριτήριο ΑIC (Akaike Information Criterion, Akaike 1974). Μεταξύ των στατιστικών ελέγχων που έχουν προταθεί για την επιλογή του καλύτερου μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης, το AIC θεωρείται από τα πλέον αξιόπιστα καθώς υπολογίζει την πιθανότητα των προτεινόμενων μοντέλων επιβάλλοντας «ποινή» ανάλογη με τον αριθμό των παραμέτρων που 115

Μεθοδολογία-Υλικά χρησιμοποιούν τα ίδια τα μοντέλα (Akaike 1981, Bozdogan 2000, Bos & Posada 2004). Οι αναλύσεις για την επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης πραγματοποιήθηκαν στον διαδικτυακό τόπο Phylemon 2 (Sanchez et al. 2011). 5.2. Ανεξάρτητη ή συνδυασμένη ανάλυση Στις φυλογενετικές αναλύσεις εν γένει, η ασυμφωνία μεταξύ των δεδομένων ή ακόμα και μεταξύ τμημάτων των δεδομένων μπορεί να εξηγηθεί από πραγματικές διαφορές στην εξελικτική ιστορία αλλά και από παραπλανητικά φυλογενετικά σήματα (θόρυβος ή ομοπλασία). Αυτά τα «λανθασμένα» σήματα μπορεί να υπερκεράσουν το έγκυρο φυλογενετικό σήμα. Κάτι τέτοιο ενδέχεται να είναι αποτέλεσμα ανεπαρκούς δειγματοληψίας, πειραματικού λάθους ή της επίδρασης του διαχωρισμού των δεδομένων σε υποσύνολα. Η ανίχνευση λοιπόν σημαντικής ασυμφωνίας μεταξύ των υπό ανάλυση δεδομένων είναι ένα πολύ σημαντικό βήμα στις φυλογενετικές αναλύσεις με δεδομένα DNA (Planet & Sarkar 2005) Όταν λοιπόν έχουμε πολλαπλά σύνολα δεδομένων, όπως στην παρούσα μελέτη, ανακύπτει το ερώτημα αν αυτά τα δεδομένα μπορούν να συνδυαστούν σε μια ενιαία ανάλυση ή αν πρέπει τα δεδομένα αυτά να αναλυθούν μόνο ανεξάρτητα. Οι απόψεις των ερευνητών ως προς αυτό το ζήτημα διίστανται. Υπάρχει η «προσέγγιση όλων των δεδομένων» (total evidence approach) του Kluge (1989), ο οποίος υποστηρίζει ότι: τα δεδομένα πρέπει πάντοτε να συνδυάζονται δεν υπάρχουν «κακά» δεδομένα 116

Μεθοδολογία-Υλικά το συνδυασμένο σήμα που λαμβάνεται αποκαλύπτει λύσεις και σχέσεις που τα ανεξάρτητα δεδομένα δεν μπορούν μόνα τους να αποδώσουν. Άλλοι ερευνητές όμως υποστηρίζουν πως αυτή η διαδικασία μπορεί να οδηγήσει σε λανθασμένες τοπολογίες (Bull et al. 1993), και προτείνουν πως τα δεδομένα πρέπει να αναλύονται ανεξάρτητα και τα παραγόμενα δέντρα να συνδυάζονται σε συναινετικά δέντρα (consensus trees) (Miyamoto and Fitch 1995). Μια τρίτη προσέγγιση είναι αυτή του «συνδυασμού υπό προϋποθέσεις» (conditional combination, Bull et al. 1993, Huelsenbeck et al. 1996a, 1996b, Cunningham 1997b). Η προσέγγιση αυτή προτείνει ότι: τα δεδομένα πρέπει να εξετάζονται ως προς τη συμφωνία μεταξύ τους να συνδυάζονται εάν συμφωνούν στατιστικώς σημαντικά η μικρή ασυμφωνία δεν αποτελεί σημαντικό πρόβλημα η έντονη ασυμφωνία των δεδομένων χρήζει περαιτέρω διερεύνησης Σήμερα υπάρχει πληθώρα στατιστικών ελέγχων που έχουν αναπτυχθεί προκειμένου να ανιχνεύουν ασυμφωνίες φυλογενετικών χαρακτήρων που είναι «εξελικτικά» σημαντικές. Ένας από τους πλέον χρησιμοποιούμενους τέτοιους ελέγχους είναι αυτός της «ασυμφωνίας διαφοράς μήκους» των μελετώμενων αλληλουχιών (Incongruence Length Difference ILD, Μickevich & Farris 1981, Farris et al. 1994, Barker & Lutzoni 2002) ο οποίος περιγράφεται από τη σχέση: ILD L C i n 1 L i όπου L C= ο αριθμός των βημάτων στο πιο φειδωλό δέντρο που προκύπτει όταν όλα τα υποσύνολα των δεδομένων συνδυάζονται σε ενιαία ανάλυση. L i= ο αριθμός των βημάτων του πιο φειδωλού δέντρου που βρέθηκε στο υποσύνολο δεδομένων i μεταξύ του n αριθμού υποσυνόλων. 117

Μεθοδολογία-Υλικά Στο δ ILD αποδίδεται μια τιμή p συγκρίνοντάς το με την κατανομή τυχαίων τιμών δ ILD που υπολογίζονται από υποσύνολα ίσα σε μέγεθος με τα πραγματικά, τα οποία προκύπτουν από τυχαία επαναλαμβανόμενη δειγματοληψία χαρακτήρων (δηλαδή στήλες ενός φυλογενετικού πίνακα) μεταξύ όλων των υποσυνόλων. Ο ILD καθορίζει αν ο βαθμός της ασυμφωνίας μεταξύ των δεδομένων υπάρχει απλώς και μόνο εξαιτίας της διαίρεσής αυτών σε υποσύνολα για ανεξάρτητη ανάλυση, καταδεικνύοντας πότε αυτή η ασυμφωνία δεν είναι στατιστικά σημαντικότερη από αυτή που παρατηρείται μέσα σε κάθε μεμονωμένο σύνολο δεδομένων. Ο Cunningham (1997a) δοκίμασε τρία τεστ ως προς την ικανότητά τους να προβλέπουν πότε τα δεδομένα μπορούν να συνδυαστούν σε μια ανάλυση. Επιπλέον απομάκρυνε τους μη πληροφοριακούς χαρακτήρες πριν πραγματοποιήσει τη συνδυασμένη ανάλυση καθώς υπογραμμίζει ότι είναι πολύ σημαντικό το κατά πόσο τα σύνολα των δεδομένων έχουν διαφορετικό αριθμό φυλογενετικών πληροφοριακών χαρακτήρων. Συγκρίνοντας εμπειρικά τον ILD με άλλους δείκτες (Templeton, Rodrigo) κατέληξε στο ότι ο συνδυασμός των γονιδίων που δεν συμφωνούν, αύξησε την ακρίβεια σε κάθε περίπτωση και πως ο ILD είναι ο καλύτερος έλεγχος στο να ανιχνεύει σημαντική ασυμφωνία μεταξύ των δεδομένων. Υπογραμμίζει δε πως μόνο όταν ILD < 0,001 η συνδυασμένη ανάλυση δεδομένων μείωνε την ακρίβεια. Στην παρούσα μελέτη ελέγχθηκε η σημαντικότητα του ILD με τον έλεγχο ομοιογένειας των δεδομένων (Partition Homogeneity Test) στο πρόγραμμα PAUP* v4.0 beta10 (Swofford 2002). Αφενός συνδυάστηκαν τα γονίδια του μιτοχονδριακού DNA και στη συνέχεια και τα τρία γονίδια μαζί. Ο έλεγχος και στις δύο περιπτώσεις ήταν θετικός (P mito=0,67, P all=0,32). Ως εκ τούτου οι φυλογενετικές και λοιπές αναλύσεις της παρούσας διατριβής δεν πραγματοποιήθηκαν για κάθε έναν δείκτη ξεχωριστά. Οι νουκλεοτιδικές αποκλίσεις των αλληλουχιών των ατόμων των μελετηθέντων πληθυσμών χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή δεντρογραμμάτων που απεικονίζουν τις σχέσεις συγγένειας των πληθυσμών 118

Μεθοδολογία-Υλικά αυτών. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή των δεντρογραμμάτων ήταν: α) μέθοδοι φαινετικής ανάλυσης που στηρίζονται στην ομαδοποίηση ανάλογα με το βαθμό της γενετικής απόστασης χωρίς να λαμβάνουν υπόψη την εξελικτική συγγένεια μεταξύ των οργανισμών, και β) μέθοδοι κλαδιστικής ανάλυσης που στηρίζονται στην ομαδοποίηση με βάση τη φυλογενετική συγγένεια (λαμβάνοντας υπόψην τις συναπομορφίες των χαρακτήρων). Η πρώτη κατηγορία μεθόδων βασίζεται σε έναν απλό αλγόριθμο που προκύπτει από πίνακες γενετικών αποστάσεων μεταξύ των αλληλουχιών. Αυτός ο αλγόριθμος είναι που οδηγεί στον καθορισμό του δέντρου. Οι απλές αλγοριθμικές μέθοδοι υπολογιστικά είναι πολύ ταχύτερες διότι προχωρούν άμεσα στην τελική λύση, χωρίς να καθυστερούν συγκρίνοντας εναλλακτικά ανταγωνιστικά σενάρια. Ωστόσο δεν θεωρούνται πολύ αξιόπιστες, καθώς χάνεται μεγάλο ποσό εξελικτικής πληροφορίας κατά τον υπολογισμό των γενετικών αποστάσεων. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν η μέθοδος UPGMA (Sneath & Sokal 1973), Neighbor-Joining (Saitou & Nei 1986, 1987) κ.α. Στις μεθόδους κλαδιστικής ανάλυσης, η διαδικασία που ακολουθείται χαρακτηρίζεται από δυο βήματα. Αρχικά ορίζεται ένα κριτήριο βελτιστοποίησης (optimality criterion) που θα χρησιμοποιηθεί για την αποτίμηση ενός συγκεκριμένου δένδρου. Συνήθως, αφού οριστεί το κριτήριο, σε κάθε δένδρο αποδίδεται μια τιμή (score) και πλέον τα εναλλακτικά δένδρα συγκρίνονται ως προς αυτήν την τιμή. Στο δεύτερο βήμα χρησιμοποιείται συγκεκριμένος αλγόριθμος για τον υπολογισμό της τιμής του κριτηρίου και για την ανεύρεση των δένδρων που έχουν τη βέλτιστη τιμή για αυτό το κριτήριο. Έτσι αναζητούνται ανάμεσα σε όλα τα πιθανά δέντρα εκείνα με τη μέγιστη τιμή του κριτηρίου βελτιστοποίησης. Χαρακτηριστικό παράδειγμα της κλαδιστικής ανάλυσης είναι η μέθοδος της μέγιστης φειδωλότητας (Maximum Parsimony). 119

Μεθοδολογία-Υλικά 5.3. Η μέθοδος της Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony) Η εν λόγω μέθοδος πραγματοποιεί την ανασυγκρότηση των δέντρων χρησιμοποιώντας νουκλεοτιδικές αλληλουχίες και αξιοποιώντας μόνο εκείνες τις νουκλεοτιδικές θέσεις που διαφοροποιούνται μεταξύ των αλληλουχιών. Αυτές οι θέσεις χαρακτηρίζονται ως πληροφοριακές θέσεις φειδωλότητας (parsimony informative sites). Όσο πιο πολλές είναι αυτές οι θέσεις τόσο πιο αξιόπιστο αναμένεται να είναι το αντίστοιχο δένδρο που θα προκύψει. Ωστόσο, όταν ο βαθμός ομοπλασίας (παράλληλες και ανάστροφες αντικαταστάσεις) είναι μεγάλος, αυτό αναιρείται. Η μέθοδος υπολογίζει τον ελάχιστο αριθμό νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων που απαιτούνται προκειμένου να εξηγηθεί το παρατηρούμενο πρότυπο στην τοπολογία του δέντρου. Ο αριθμός των αλλαγών μεταξύ των θέσεων αθροίζεται και υπολογίζεται μια τιμή (τιμή φειδωλότητας) για κάθε τοπολογία δέντρου. Η τοπολογία που φέρει την ελάχιστη τιμή (δηλαδή φέρει τις λιγότερες διαφορές) είναι και ο εκτιμητής της φυλογένεσης, γνωστή και ως το πλέον φειδωλό δέντρο (Felsenstein, 1978, Collins et al. 1994b, Edwards 1996). Η μέθοδος στηρίζεται στη φιλοσοφική ιδέα που διατυπώθηκε από τον William of Occam πως «δοθεισών δύο πιθανών εξηγήσεων των δεδομένων, με όλους τους άλλους παράγοντες ίδιους, είναι προτιμητέα η πιο απλή εξήγηση» (Blumer et al. 1987). Η μέθοδος της μέγιστης φειδωλότητας είχε αρχικά προταθεί από τους Edwards & Cavalli-Sforza (1965) και Cavalli-Sforza & Edwards (1967) για ανάλυση δεδομένων γονιδιακών συχνοτήτων και από τους Camin & Sokal (1965) για την ανάλυση μορφολογικών χαρακτήρων. Η εφαρμογή της μεθόδου για μοριακά δεδομένα αποδίδεται στους Zuckerkandl & Pauling (1965), ενώ τον αλγόριθμο της μεθόδου ανέπτυξαν οι Fitch (1971) και Hartigan (1973). Υπήρξαν πολλές αντικρουόμενες απόψεις αναφορικά με τη μεθοδολογία που ακολουθεί η μέθοδος (Farris 1973, Felsenstein 1988a, b), ως προς το ότι δεν κάνει σαφείς υποθέσεις σχετικά με το μηχανισμό εξέλιξης που ακολουθεί. Έτσι η τοπολογία του πιο 120

Μεθοδολογία-Υλικά φειδωλού δένδρου ενδέχεται να είναι λανθασμένη όταν ο εξελικτικός ρυθμός διαφέρει από κλάδο σε κλάδο (Felsenstein 1978), ακόμα και στην περίπτωση που μελετώνται αλληλουχίες πολύ μεγάλου μήκους. Από την άλλη είχε προταθεί ότι η μέθοδος θα ήταν προτιμότερο να μην κάνει καμία υπόθεση σχετικά με το ρυθμό εξέλιξης των αλληλουχιών και να αφήνεται «ελεύθερη» να υπολογίσει το φειδωλότερο δέντρο με το δεδομένα των αλληλουχιών που υπόκεινται σε ανάλυση (Yang 1996). Στην παρούσα μελέτη η κατασκευή του δέντρου με τη μέθοδο της μέγιστης φειδωλότητας πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του προγράμματος PAUP* v4.0 beta10 (Swofford 2002). 5.4. Η μέθοδος της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood) Η μέθοδος της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood, ML) ανήκει στις μεθόδους διερεύνησης δένδρων (tree-searching methods) (Graur & Li 2000, Hall 2001, Felsenstein 2004) για την εύρεση της καλύτερης φυλογενετικής υπόθεσης. Αυτές οι μέθοδοι ορίζουν ένα κριτήριο βελτιστοποίησης βάσει του οποίου θα συγκριθούν τα διαφορετικά φυλογενετικά σενάρια και θα αποφασιστεί ποιο από αυτά είναι το πιο πιθανό. Στην ML υπολογίζεται η πιθανότητα που έχει το συγκεκριμένο σύνολο δεδομένων (αλληλουχιών) να παρατηρηθεί μέσα από τις σχέσεις που περιγράφει το αξιολογούμενο δένδρο, όταν οι αλληλουχίες εξελίσσονται σύμφωνα με ένα εξαρχής ορισμένο μοντέλο νουκλεοτιδικής υποκατάστασης (Nei & Kumar 2000). Το δένδρο με τη μεγαλύτερη τιμή πιθανοφάνειας (ο λογάριθμος της τιμής αυτής, lnl) είναι αυτό το οποίο τελικά προτείνεται ως το πλησιέστερο προς το πραγματικό. Στην περίπτωση χρήσης αλληλουχιών η μέθοδος της Μέγιστης Πιθανοφάνειας χρησιμοποιεί όλη την πληροφορία που διατίθεται. Δηλαδή χρησιμοποιεί ως πληροφορίας τόσο τον απόλυτο αριθμό των διαφορών των 121

Μεθοδολογία-Υλικά βάσεων μεταξύ 2 αλληλουχιών όσο και την διαφορετική κατάσταση ενός χαρακτήρα (μιας βάσης) στην ίδια θέση μεταξύ των αλληλουχιών. Στην παρούσα διατριβή η ανάλυση της μέγιστης πιθανοφάνειας πραγματοποιήθηκε στο διαδικτυακό τόπο CIPRES Science Gateway με το πρόγραμμα RAXML-HPC BLACKBOX (7.6.3) (Stamatakis 2006). 5.5. Μπεϊεσιανή συμπερασματολογία Το όνομα της μεθόδου προέρχεται από το στατιστικό του 18 ου αιώνα Thomas Bayes (1702-1761) που εισήγαγε το Μπεϊεσιανό θεώρημα στο οποίο και βασίζονται κάποιες από τις βασικές έννοιες της μεθόδου. Η Μπεϊεσιανή συμπερασματολογία είναι μια στατιστική συμπερασματολογία στην οποία στοιχεία ή παρατηρήσεις χρησιμοποιούνται για την ανανέωση ή για την εκ νέου εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με το τι είναι ήδη γνωστό για βασικές παραμέτρους ή υποθέσεις (Dempster 1968). Η Μπεϊεσιανή συμπερασματολογία είναι μια προσέγγιση που χρησιμοποιείται στη φυλογένεση προκειμένου να απαντήσει στο ερώτημα: «Με δεδομένη μια μήτρα αποστάσεων και ένα μοντέλο εξελικτικών μεταβολών ποια είναι η πιθανότητα να είναι σωστό ένα δέντρο;» (Rubin 1978, Wade 2000, Huelsenbeck et al. 2002). Η Μπεϊεσιανή πιθανότητα ερμηνεύει την έννοια της πιθανότητας ως ένα «μέτρο της κατάστασης της γνώσης» και όχι ως τη συχνότητα ή μια άλλη φυσική ιδιότητα ενός μελετώμενου συστήματος. Πρόκειται για μια από τις πλέον δημοφιλείς ερμηνείες της έννοιας της πιθανότητας. Η εν λόγω ερμηνεία μπορεί να θεωρηθεί ως επέκταση της λογικής σκέψης που υποστηρίζει την επιχειρηματολογία στηριζόμενη σε αβέβαιους ισχυρισμούς. Προκειμένου να εκτιμηθεί η πιθανότητα μιας υπόθεσης, η μέθοδος προσδιορίζει μια εκ των προτέρων πιθανότητα που ολοένα και ανανεώνεται με την εισροή νέων δεδομένων. Περιλαμβάνει τη συλλογή ενδείξεων, οι οποίες είναι είτε σύμφωνες είτε ασύμφωνες με μια δεδομένη υπόθεση. Καθώς 122

Μεθοδολογία-Υλικά συγκεντρώνονται οι ενδείξεις, ο βαθμός στον οποίο πιστεύουμε την αρχική υπόθεση αλλάζει. Με αρκετές ενδείξεις η αξιοπιστία της αρχικής υπόθεσης θα πρέπει είτε να μειωθεί αρκετά είτε να αυξηθεί (Huelsenbeck & Ronquist 2001, Ronquist & Huelsenbeck 2003, Nylander 2004). Η μέθοδος αξιολογεί δέντρα ξεκινώντας από κάποιες τυχαίες τοπολογίες τις οποίες και βελτιστοποιεί σταδιακά, και επιλέγει τις πλέον πιθανές, δηλαδή εκείνες που δεν επιδέχονται περαιτέρω βελτίωση. Θεωρείται ιδιαιτέρως αξιόπιστη μέθοδος για μοριακά δεδομένα. Το μοντέλο των μεταβολών απαιτεί προσδιορισμό της σχετικής συχνότητας των μεταστροφών και των μεταπτώσεων, καθώς και έναν εξελικτικό ρυθμό. Πρόκειται για μια γρήγορη μέθοδο που παρέχει ταυτόχρονα και τη στατιστική υποστήριξη των κλάδων στο δέντρο. Η εφαρμογή της σε μορφολογικούς χαρακτήρες δεν έχει μελετηθεί ικανοποιητικά (Lewis 2001). Η μέθοδος χρησιμοποιεί μια σημαντική αρχή η οποία ονομάζεται εκ των υστέρων πιθανότητα (posterior probability) και στηρίζεται στο θεώρημα του Bayes (Bayes & Price 1763), σύμφωνα με το οποίο : P( D H ) P( H ) P( H D) P( D) όπου, Η = η υπόθεση D = τα δεδομένα P(H) = η εκ των προτέρων πιθανότητα του Η, δηλ. η πιθανότητα η Η να είναι αληθής προτού αναλυθούν τα δεδομένα P(D) = η οριακή πιθανότητα των D P(D/H) = η υπό όρους πιθανότητα, δηλ. η πιθανότητα επιβεβαίωσης των D υπό την προϋπόθεση ότι η H είναι αληθής. P(H/D) = η εκ των υστέρων πιθανότητα, δηλ η πιθανότητα ότι η Η είναι αληθής δεδομένης τόσο της προηγούμενης εκτίμησης για την υπόθεση όσο και των υπό ανάλυση δεδομένων (Huelsenbeck & Ronquist 2001). 123

Μεθοδολογία-Υλικά Η Μπεϊεσιανή Συμπερασματολογία χρησιμοποιεί τον αλγόριθμο που είναι γνωστός ως Αλυσίδα Μαρκόφ Μόντε Κάρλο (Markov Chain Monte Carlo MCMC). Ο αλγόριθμος χρησιμοποιεί την τυχαιότητα προκειμένου να βρει τυχαίους εκτιμητές των παραμέτρων, όπως γίνεται με τα τυχερά παιχνίδια στα καζίνο, από όπου πήρε και το όνομά του. Καθορίζει μια περιοχή στην οποία κάνει δειγματοληψίες ομοιογενώς και, καθώς κάθε δείγμα λαμβάνεται με την ίδια πιθανότητα, το ολοκλήρωμα είναι ο μέσος όρος των δειγμάτων. Το κάθε δείγμα λαμβάνεται ανεξάρτητα. Ο αλγόριθμος παράγει στατιστικά συνεπή δείγματα από την κατανομή-στόχο χωρίς να χρησιμοποιεί άλλες κατανομές και χωρίς να απορρίπτει αυθαίρετα δείγματα. Το αποτέλεσμα υπολογίζεται με δειγματοληψίες που χρησιμοποιούνται από περιοχές με υψηλότερη πυκνότητα δεδομένων. Η διαδικασία ξεκινά επιλέγοντας ένα τυχαίο σημείο εκκίνησης. Καθώς οι νέες τιμές γίνονται αποδεκτές από την ανάλυση, τα δείγματα που προκύπτουν γίνονται ανεξάρτητα του αρχικού σημείου εκκίνησης. Προκειμένου να αποφευχθεί η όποια μεροληψία που θα οφείλεται στο σημείο εκκίνησης, μετά το πέρας της ανάλυσης ένας συγκεκριμένος αριθμός των αρχικών επαναλήψεων απορρίπτεται (burn-in - Larget & Simon 1999, Huelsenbeck & Ronquist 2001, Huelsenbeck et al. 2002). Ο αριθμός των επαναλήψεων που απορρίπτονται υπολογίζεται ως το 25% των δειγμάτων που τελικά έχουν συλλεγεί. Αν είχε επιλεγεί η δειγματοληψία των δειγμάτων (δέντρων) να πραγματοποιείται κάθε 100 γενιές σε σύνολο π.χ. 2.000.000 γενεών, τότε στο τέλος προκύπτουν 20.000 δέντρα. Οπότε ως burn-in θα απορριφθούν οι 5.000 επαναλήψεις (δέντρα) (Ronquist et al. 2005 - MrBayes 3.1 Manual, http://mrbayes.csit.fsu.edu/manual.php). 124

Μεθοδολογία-Υλικά 6. ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΧΡΟΝΩΝ ΑΠΟΣΧΙΣΗΣ 6.1. Ανάλυση μοριακού ρολογιού Ο έλεγχος για το εάν οι υπό ανάλυση αλληλουχίες υπακούουν σε σταθερό ρυθμό μοριακού ρολογιού πραγματοποιήθηκε με τον έλεγχο του λόγου των πιθανοτήτων (Likelihood Ratio Test, LRT), συγκρίνοντας την πιθανοφάνεια του φυλογενετικού δένδρου της ανάλυσης ML με αυτήν από ένα δένδρο που προέκυψε από την υπόθεση σταθερού ρυθμού νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων (Felsenstein 1981), με τη βοήθεια του φυλογενετικού προγράμματος PAUP [ χ 2 = -2(lnL CLOCK lnn UNCONSTRAINED), df = ο αριθμός των αλληλουχιών (τάξων) 2]. Η υπόθεση του σταθερού μοριακού ρολογιού απορρίφθηκε και για τους τρεις γενετικούς τόπους (P << 0,05). 6.2. Υπολογισμός χρόνου απόσχισης κλάδων 6.2.1. H περίπτωση του Αιγαίου (Kamilari et al. 2014) Διαφορετικά γεωλογικά και παλαιογεωγραφικά γεγονότα έχουν χρησιμοποιηθεί προκείμενου να γίνει η βαθμονόμηση μοριακών ρολογιών (molecular clock calibration) σε πολλές βιογεωγραφικές μελέτες. Στον ελλαδικό χώρο τα γεγονότα που έχουν χρησιμοποιηθεί κατά κύριο λόγο εντοπίζονται στο χώρο του Αιγαίου και στην πλούσια γεωλογική του ιστορία. Τα παλαιογεωγραφικά γεγονότα αφορούν συχνότερα τον σχηματισμό της Μεσαιγαιακής Τάφρου (12-9 mya) και την κρίση αλατότητας κατά το Μεσσήνιο (5,971 5,33 mya). Προκειμένου να προσδιοριστεί ποιο από τα δύο αυτά γεγονότα επηρέασε και διαμόρφωσε την εξάπλωση των ατόμων του γένους Trachelipus στον αιγαιακό χώρο, πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικές αναλύσεις που 125

Μεθοδολογία-Υλικά συμπεριλάμβαναν μόνο τους πληθυσμούς του Trachelipus aegaeus, το οποίο είναι και ενδημικό της περιοχής, για τους δύο μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους. Εξετάστηκαν τρία διαφορετικά σενάρια απομόνωσης των πληθυσμών καθώς και ο μεταξύ τους συνδυασμός: Α) Η δημιουργία της Μεσαιγαιακής Τάφρου (Mid-Aegean Trench MAT, 12 9 mya) Αποχωρισμός Ικαρίας Σάμου από τις υπόλοιπες νησιωτικές περιοχές. Β) Η δημιουργία της Μεσαιγαιακής Τάφρου. Η Κρήτη απομονώνεται για πρώτη φορά από τις Κυκλάδες και το συγκρότημα Κάσου-Καρπάθου (Lymberakis & Poulakakis 2010) Γ) Η Κρίση αλατότητας στο Μεσσήνιο (5,971-5,33 mya, Manzi et al. 2013). Μόνιμος αποχωρισμός της Κρήτης από την υπόλοιπη νησιωτική και ηπειρωτική Ελλάδα. Επιπλέον, η χρονολόγηση της απόσχισης των κύριων φυλογενετικών κλάδων του είδους εξετάστηκε και εφαρμόζοντας του ρυθμούς υποκατάστασης που έχουν προταθεί από τη βιβλιογραφία για τους δύο μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους: Δ) 16S rrna = 0,14% (Held 2001), Ε) COI = 1,25% (Ketmaier et al. 2003) για το γένος Stenasellus και ΣΤ) COI = 1,56 1,72% για το γένος Orthometopon (Poulakakis & Sfenthourakis 2008). Συνολικά εξετάστηκαν οκτώ (8) διαφορετικά πιθανά σενάρια με το πρόγραμμα BEAST v1.7.5, χρησιμοποιώντας την παράμετρο συγχώνευσης (coalescence) καθώς είναι και η ενδεδειγμένη μέθοδος για διαπληθυσμιακές αναλύσεις στο επίπεδο του είδους (Stadler 2009, Heled & Drummond 2012). Πραγματοποιήθηκαν 4 «τρεξίματα» με μήκος αλυσίδας 2 x 10 7 επαναλήψεις και αγνοήθηκαν 2 x 10 6 επαναλήψεις. Τα 4 «τρεξίματα» αναλύθηκαν με το 126

Μεθοδολογία-Υλικά πρόγραμμα Tracer για να ελεγχθεί η σταθερότητα της ανάλυσης (ESS>200) και συνδυάστηκαν στο πρόγραμμα LogCombiner. Το πρόγραμμα TreeAnnotator χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του χρονογράμματος (δένδρο με μήκη κλάδων που αντιστοιχούν σε χρόνους απόσχισης). 6.2.2. Το γένος Trachelipus στην ηπειρωτική και νησιωτική Ελλάδα. Για την εκτίμηση του χρόνου απόσχισης μεταξύ των κλάδων όλων των ειδών του γένους Trachelipus που απαντώνται στον ελλαδικό χώρο, συγκρίθηκαν μια σειρά από διαφορετικά μοντέλα προκειμένου να χρησιμοποιηθούν όλες οι παράμετροι και οι πληροφορίες που ήταν διαθέσιμες για τα δεδομένα (διαφορετικά γεωλογικά γεγονότα, διαφορετικά μοντέλα νουκλεοτιδικής υποκατάστασης, διαφορετικές εκ των προτέρων παραμέτρους δέντρων κτλ.). Στις διάφορες υποθέσεις που εξετάστηκαν εφαρμόστηκαν διαφορετικές παράμετροι οι οποίες διαφοροποιούνταν ως ακολούθως: 1. Μοριακό ρολόι (έλεγχος 3 διαφορετικών καταστάσεων) o Strict Clock: ένα σταθερό μοριακό ρολόι στο οποίο ο ρυθμός υποκατάστασης κάθε κλάδου είναι σταθερός. o Uncorrelated Lognormal Relaxed Clock (Drummond et al. 2006): μη συσχετιζόμενο λογαριθμικού μοντέλο μη σταθερού ρυθμού εξέλιξης, στο οποίο οι ρυθμοί υποκατάστασης που συνδέονται με κάθε κλάδο του δέντρου είναι ανεξάρτητοι και καθορίζονται από μία διακριτή λογαριθμοκανονική κατανομή. o Uncorrelated Exponential Relaxed Clock (Drummond et al. 2006): μη συσχετιζόμενο εκθετικό μοντέλο μη σταθερού 127

Μεθοδολογία-Υλικά ρυθμού εξέλιξης στο οποίο ο ρυθμός υποκατάστασης κάθε κλάδου έχει εκθετική κατανομή. 2. Παράμετροι δέντρων -Tree priors (έλεγχος 2 διαφορετικών μοντέλων) o Speciation: Birth-Death process, Ειδογένεση: Διαδικασία γέννησης θανάτου. o Speciation: Yule process, Ειδογένεση: Διαδικασία του Yule Και τα δύο μοντέλα είναι κατάλληλα για διαειδικές αναλύσεις. Πρόκειται για στοχαστικά μοντέλα που χρησιμοποιούν σταθερό ρυθμό ειδογένεσης (λ) και εξαφάνισης (μ) στη διαδικασία της ενσωμάτωσης των κλάδων του δέντρου. Στη περίπτωση του μοντέλου Yule ο ρυθμός εξαφάνισης ισούται με μηδέν (μ=0) (Gernhard 2008). 3. Τοπολογία και μονοφυλετικότητα κλάδων (έλεγχος δύο καταστάσεων) o Fixed: Καθορισμένη. Χρησιμοποιώντας ως αρχική τοπολογία για τους κομβικούς/βαθείς κλάδους την τοπολογία της ανάλυσης της μέγιστης πιθανοφάνειας και ορίζοντας ως μονοφυλετικούς αυτούς του κλάδους στο πρόγραμμα BEAST. o Free: Ελεύθερη. Δεν ορίστηκαν μονοφυλετικοί κλάδοι (με εξαίρεση τον κλάδο της Σάμου-Ικαρίας και της Κρήτης προκειμένου να εφαρμοστούν τα σημεία βαθμονόμησης). Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο πρόγραμμα BEAST v1.7.5, με 4 ανεξάρτητα «τρεξίματα» και με μήκος αλυσίδας 2 x 10 7 επαναλήψεων, ενώ τελικά αγνοήθηκαν 2 x 10 6 επαναλήψεις (burn-in). Τα 4 «τρεξίματα» αναλύθηκαν στο πρόγραμμα Tracer για να ελεγχθεί η σταθερότητα της ανάλυσης (ESS>200) και συνδυάστηκαν στο πρόγραμμα LogCombiner. Το πρόγραμμα TreeAnnotator χρησιμοποιήθηκε για την 128

Μεθοδολογία-Υλικά κατασκευή του χρονογράμματος (δένδρο με μήκη κλάδων που αντιστοιχούν σε χρόνους απόσχισης). 6.3. Σύγκριση και επιλογή του πιθανότερου σεναρίου Στο πλαίσιο της Μπεϊεσιανής ανάλυσης η σύγκριση μεταξύ των διαφορετικών μοντέλων που εξετάζονται πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας τους παράγοντες Bayes (Bayes factors), οι οποίοι υπολογίζονται ως ο λόγος των οριακών πιθανοτήτων των δύο υπό εξέταση μοντέλων (Kass and Raftery 1995). Υπό το πρίσμα της φυλογένεσης, ο υπολογισμός των οριακών εκτιμητών είναι υπολογιστικά δύσκολος και θα πρέπει ο υπολογισμός τους να γίνεται από τα δεδομένα. Η μέθοδος που επιλεγόταν για χρόνια στις φυλογενετικές μελέτες ήταν ο υπολογισμός των Bayes Factors μέσω του Harmonic Mean Estimator (HME διαθέσιμο στο πρόγραμμα Tracer). Η εν λόγω μέθοδος είναι υπολογιστικά γρήγορη καθώς λαμβάνει δείγματα μόνο από την εκ των υστέρων κατανομή. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες (Baele et al. 2012a,b, 2013) που σύγκριναν 4 διαφορετικές μεθοδολογίες για την επιλογή του βέλτιστου μοντέλου, κατέληξαν πως η μέθοδος του Harmonic Mean Estimator είναι η λιγότερο αξιόπιστη και θα πρέπει να αποφεύγεται. Στην περίπτωση της μελέτης των πληθυσμών του Αιγαίου, προκειμένου τα διαφορετικά «σενάρια» που εφαρμόστηκαν να συγκριθούν μεταξύ τους ώστε να γίνει η επιλογή του πλέον πιθανού, χρησιμοποιήθηκαν οι «οριακοί εκτιμητές πιθανοφάνειας» (Marginal Likelihood Estimators - MLEs), οι οποίοι υπολογίστηκαν με τη μέθοδο Path Sampling (Xie et al. 2011, Baele et al. 2012a,b, 2013). Για τις αναλύσεις με το σύνολο των δεδομένων από τα διαφορετικά είδη του γένους Trachelipus στον ελλαδικό χώρο, προκειμένου να συγκριθούν οι διαφορετικές υποθέσεις, χρησιμοποιήθηκαν οι «οριακοί εκτιμητές πιθανοφάνειας» (Marginal Likelihood Estimators - MLEs), οι 129

Μεθοδολογία-Υλικά οποίοι υπολογίστηκαν με τις μεθόδους Path Sampling και Stepping Stone (Xie et al. 2011, Baele et al. 2012a,b, 2013). Παρά τις αυξημένες απαιτήσεις τους σε υπολογιστική ισχύ, οι συγκεκριμένες μέθοδοι θεωρούνται οι πλέον αξιόπιστες και ενδεδειγμένες για φυλογενετικές αναλύσεις. Όλες οι αναλύσεις με το πρόγραμμα BEAST v1.7.5 πραγματοποιήθηκαν με απομακρυσμένη σύνδεση στις εγκαταστάσεις πληροφορικής και υπολογιστών του εργαστηρίου Laboratoire Evolution et Diversite Biologique, στην Τουλούζη της Γαλλίας (High Performance Computing system consisting of a subset of a Dell PowerEdge R710 server with 20 logical cores of Intel Xeon CPU E5645 westmere at 2.40 GHz running on Debian 6.0 squeeze operating system). 130

Αποτελέσματα Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Whoever, in the pursuit of science, seeks after immediate practical utility may generally rest assured that he will seek in vain. HERMANN VON HELMHOLTZ Όποιος, στο κυνήγι της επιστήμης, αναζητά την άμεση πρακτική εφαρμογή, μπορεί να είναι βέβαιος ότι ψάχνει μάταια.. HERMANN VON HELMHOLTZ 131

Αποτελέσματα 1. Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΟΥ ΑΙΓΑΙΟΥ Γενικά στοιχεία Τα δεδομένα από τους 17 πληθυσμούς του Trachelipus aegaeus στην περιοχή του Αιγαίου (Εικόνα Γ1) περιελάμβαναν 75 αλληλουχίες για τον γενετικό τόπο 16S (κοινό μήκος 316 bps) και 66 αλληλουχίες για τον γενετικό τόπο COI (κοινό μήκος 520 bps). Το συνολικό μήκος των συνδυασμένων αλληλουχιών του μιτοχονδριακού DNA ήταν 836 bps. Οι αλληλουχίες του T. aegaeus ομαδοποιήθηκαν σε 19 και 21 απλοτύπους για τους γενετικούς τόπους του 16S rrna και της COI αντίστοιχα. Για συγκριτικούς λόγους, στις αναλύσεις συμπεριελήφθησαν και 5 πληθυσμοί από την ηπειρωτική Ελλάδα του συγγενικού είδους T. palustris. Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν και άτομα του είδους T. ratzeburgii λειτουργώντας ως κοντινή εξωομάδα, και άτομα των ειδών Armadillidium lobocurvum και Porcellionides pruinosus ως πιο μακρινές εξωομάδες για τις φυλογενετικές αναλύσεις (Πίνακας Γ1). Το τελικό σύνολο δεδομένων της συνδυαστικής ανάλυσης των δύο μιτοχονδριακών γενετικών τόπων (COI και 16S rrna) περιελάμβανε 35 απλοτύπους (27 για το είδος T. aegaeus, πέντε για το είδος T. palustris, έναν για το είδος T. ratzeburgii, έναν για το είδος A. lobocurvum και έναν για το είδος P. pruinosus) τελικού μήκους αλληλουχίας 836 bps. Για το T. aegaeus ο αριθμός των μεταβλητών θέσεων ήταν 255 (30,5%) εκ των οποίων οι 183 (21,9%) ήταν πληροφοριακές, με βάση το κριτήριο της φειδωλότητας. Οι αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν αποκλειστικά με τους πληθυσμούς της περιοχής του Αιγαίου χρησιμοποιήθηκαν ως προκαταρκτικές, προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της δημιουργίας της Μεσαιγαιακής Τάφρου (12-9 mya) και της κρίσης αλατότητας κατά το Μεσσήνιο (5,971-5,33 mya) στην απόσχιση των κλάδων εντός του είδους Τ. aegaeus. Η επιλογή αυτή έγινε καθώς περιορίζοντας τις αναλύσεις μόνο σε αυτούς τους πληθυσμούς κατέστη δυνατό να χρονολογηθεί η «ρίζα» του δέντρου (constrained root tree) και όχι μόνο η απόσχιση κάποιου εσωτερικού κλάδου με βάση ένα γεωλογικό γεγονός. Με αυτόν τον τρόπο περιορίστηκε το εύρος της χρονολόγησης των 132

Αποτελέσματα κλάδων της φυλογένεσης δίνοντας πιο ορθά, σαφή και αυστηρά αποτελέσματα (Drummond et al. 2006). Τα αποτελέσματα από τις διαφορετικές υποθέσεις που εξετάστηκαν σε αυτό το σύνολο δεδομένων (πληθυσμοί του T. aegaeus) χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια ως δεδομένα για την ανάλυση του συνόλου των πληθυσμών και ειδών Trachelipus spp. της παρούσας διατριβής. 133

Αποτελέσματα Εικόνα Γ1: Οι πληθυσμοί των ειδών Trachelipus spp. στην ελληνική επικράτεια. Οι κωδικοί των τοποθεσιών συλλογής αναλύονται στον Πίνακα Γ1. Τα διαφορετικά χρωματικά μοτίβα απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης (βλέπε Εικόνα Γ2). Mε διακεκομμένες γραμμές απεικονίζεται ο σχηματισμός της Μεσαιγαιακής Τάφρου (12-9 mya) με βόρεια κατεύθυνση. 134

Αποτελέσματα Πίνακας Γ1: Κατάλογος των πληθυσμών και ειδών που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση της περίπτωση του Αιγαίου. Αναγράφονται ο αριθμός των ατόμων που αναλύθηκαν και οι κωδικοί των απλοτύπων που προέκυψαν για κάθε μιτοχονδριακό γενετικό τόπο και για τη συνδυασμένη ανάλυση. Είδος Κωδικός Πληθυσμού Τοποθεσία (Αρ. ατόμων) Κωδικός απλοτύπου (16S rrna) Κωδικός απλοτύπου (COI) Κωδικός απλοτύπου (συνδυασμένη ανάλυση) AND Άνδρος (4) S1,S2,S3,S4 C1,C2 Η1,H2,H3 ANF Ανάφη(1) S5 - - EPD Επίδαυρος (3) S4,S6 C3 H4,H5 MYK Μύκονος (6) S4 C12 H14 NAX Νάξος (3) S4 C13 H15 PAR Πάρος (5) S4,S13 C13,C14 H15,H16,H17 STO Στουρονήσι (1) S4 C20 H25 TIN Τήνος (3) S4 C12 H14 Trachelipus aegaeus IKR Ικαρία (7) S7,S8 C4 H6 SAM Σάμος (3) S8 C16 H20 KEA Κέα (3) S9 C5 H7 CRE Κρήτη (4) S10 C6 H8 KTN Κύθνος (2) S4 C7,C8 H9,H10 KYT Κύθηρα (4) S4,S11 C9,C10 H11,H12 MIL Μήλος (1) S12 C11 H13 PRN Πάρνηθα (4) S14 C15 H19 SER Σέριφος (3) S15,S16,S17 C17 H21,H22 SIF Σίφνος (2) S17 C18,C19 H23,H24 SYR Σύρος (2) S18,S19 C21 H26,H27 PAN Πελοπόννησος, Παναχαϊκό (2) S20 C22 H28 LAMB Πελοπόννησος, Λάμπεια (2) S20 C23 H29 Trachelipus palustris ALF Πελοπόννησος, Αλφειός (1) S20 C24 H30 MBA Πελοπόννησος, Μονεμβασιά S21 C25 H31 MKA Πελοπόννησος, Μονεμβασιά S21 C26 H32 Trachelipus ratzeburgii SLO Σλοβενία (3) S22 C27 H33 Armadillidium lobocurvum A.lobo Πελοπόννησος, Παναχαϊκό (1) S23 C28 H34 Porcellionides pruinosus P.pru Πελοπόννησος, Πάτρα (1) S24 C29 H35 135

Αποτελέσματα 1.2. Γενετικές αποστάσεις Οι γενετικές αποστάσεις (Kimura 2-p) μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών, κυμαίνονταν γα το Τ. aegaeus από 0% έως 19% για τον γενετικό τόπο της COI και από 0% έως 20,3% για τον γενετικό τόπο 16S rrna. Σε κάθε περίπτωση η μεγαλύτερη γενετική απόκλιση αντιστοιχούσε σε πληθυσμούς μεταξύ του ανατολικού και δυτικού Αιγαίου. Οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των κύριων κλάδων που διαμορφώθηκαν από την ανάλυση των συγκεκριμένων πληθυσμών φαίνονται στον Πίνακα Γ2. Οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ όλων των εξετασθέντων πληθυσμών παρατίθενται αναλυτικά στον Πίνακα Γ3. Πίνακας Γ2: Μέσες γενετικές αποστάσεις (Kimura 2-p) μεταξύ και εντός των κύριων φυλογενετικών κλάδων, όπως προέκυψαν από τη φυλογενετική ανάλυση. Οι τιμές κάτω από τη διαγώνιο αναφέρονται στον γενετικό τόπο COI και πάνω από τη διαγώνιο στον γενετικό τόπο 16S rrna. Στις δύο τελευταίες σειρές αναγράφονται οι τιμές εντός των κύριων φυλογενετικών κλάδων. Οι κωδικοί των πληθυσμών όπως αναγράφονται στην Εικόνα Γ2. EAST KYKL CRE PEL T. rat A. lob P.pru EAST 0,153 0,173 0,164 0,228 0,253 0,268 KYKL 0,036 0,174 0,098 0,154 0,223 0,238 CRE 0,056 0,077 0,184 0,233 0,249 0,215 PEL 0,024 0,073 0,094 0,163 0,229 0,239 T. rat 0,113 0,136 0,129 0,142 0,205 0,267 A. lob 0,232 0,245 0,258 0,271 0,245 0,251 P. pru 0,219 0,213 0,280 0,244 0,260 0,246 COI 0,085 0,079 n/c 0,065 n/c n/c n/c 16S rrna 0,093 0,052 n/c 0,019 n/c n/c n/c 136

Αποτελέσματα Πίνακας Γ3: Μέσες γενετικές αποστάσεις (Kimura 2-p) μεταξύ και εντός των αναλυθέντων πληθυσμών. Κάτω από τη διαγώνιο οι τιμές για τον γενετικό τόπο 16S rrna. Πάνω από τη διαγώνιο οι τιμές για τον γενετικό τόπο COI. Στις δύο τελευταίες σειρές αναγράφονται οι ενδοπληθυσμιακές γενετικές αποστάσεις. Οι κωδικοί κάθε πληθυσμού αναλύονται στον Πίνακα Γ1. AND ANF EPD IKR KEA CRE KTN KYT MIL MYK NAX PAR PRN SAM SER SIF STO SYR TIN PAN LAMB ALF MON SLO Alobo Ppru AND 0,039 0,190 0,145 0,180 0,065 0,054 0,051 0,047 0,047 0,049 0,141 0,166 0,137 0,096 0,135 0,106 0,047 0,179 0,179 0,184 0,193 0,249 0,284 0,287 ANF 0,086 EPD 0,006 0,084 0,176 0,156 0,189 0,057 0,054 0,043 0,008 0,008 0,009 0,153 0,161 0,148 0,077 0,147 0,106 0,008 0,178 0,178 0,183 0,182 0,244 0,279 0,287 IKR 0,092 0,092 0,091 0,141 0,176 0,155 0,160 0,175 0,176 0,176 0,174 0,142 0,079 0,142 0,154 0,132 0,119 0,176 0,117 0,117 0,113 0,134 0,168 0,222 0,241 KEA 0,090 0,072 0,090 0,067 0,162 0,140 0,126 0,147 0,156 0,156 0,159 0,051 0,141 0,054 0,103 0,015 0,075 0,156 0,149 0,149 0,153 0,172 0,206 0,223 0,237 CRE 0,090 0,092 0,090 0,103 0,067 0,172 0,187 0,182 0,178 0,189 0,186 0,159 0,171 0,170 0,164 0,163 0,139 0,178 0,173 0,173 0,178 0,197 0,233 0,249 0,215 KTN 0,005 0,082 0,002 0,089 0,089 0,088 0,056 0,065 0,057 0,049 0,051 0,127 0,135 0,114 0,087 0,136 0,082 0,057 0,142 0,142 0,147 0,150 0,210 0,261 0,277 KYT 0,008 0,086 0,005 0,085 0,085 0,092 0,003 0,062 0,054 0,046 0,048 0,132 0,141 0,118 0,095 0,117 0,100 0,054 0,148 0,158 0,153 0,152 0,222 0,238 0,267 MIL 0,077 0,134 0,073 0,136 0,140 0,135 0,072 0,068 0,047 0,047 0,049 0,152 0,170 0,157 0,096 0,137 0,114 0,047 0,173 0,173 0,178 0,188 0,238 0,261 0,280 MYK 0,005 0,082 0,002 0,089 0,089 0,088 0,000 0,003 0,072 0,008 0,009 0,143 0,161 0,139 0,069 0,147 0,097 0,000 0,178 0,178 0,183 0,182 0,244 0,273 0,281 NAX 0,005 0,082 0,002 0,089 0,089 0,088 0,000 0,003 0,072 0,000 0,002 0,153 0,156 0,139 0,077 0,147 0,106 0,008 0,173 0,173 0,178 0,177 0,239 0,273 0,287 PAR 0,039 0,051 0,037 0,092 0,084 0,092 0,035 0,038 0,099 0,035 0,035 0,155 0,154 0,141 0,079 0,149 0,108 0,009 0,171 0,171 0,176 0,175 0,236 0,270 0,290 PRN 0,090 0,067 0,090 0,077 0,019 0,062 0,089 0,085 0,135 0,089 0,089 0,082 0,151 0,023 0,075 0,043 0,043 0,143 0,159 0,159 0,163 0,182 0,238 0,228 0,242 SAM 0,101 0,113 0,099 0,030 0,093 0,109 0,098 0,094 0,140 0,098 0,098 0,106 0,104 0,137 0,151 0,132 0,110 0,161 0,083 0,083 0,079 0,061 0,140 0,223 0,236 SER 0,132 0,073 0,131 0,138 0,102 0,121 0,129 0,129 0,158 0,129 0,129 0,106 0,090 0,160 0,081 0,046 0,043 0,139 0,140 0,140 0,145 0,168 0,222 0,223 0,259 SIF 0,178 0,092 0,176 0,186 0,162 0,163 0,174 0,178 0,174 0,174 0,174 0,139 0,151 0,203 0,083 0,095 0,066 0,069 0,164 0,164 0,168 0,177 0,236 0,256 0,265 STO 0,005 0,082 0,002 0,089 0,089 0,088 0,000 0,003 0,072 0,000 0,000 0,035 0,089 0,098 0,129 0,174 0,075 0,147 0,144 0,144 0,149 0,167 0,206 0,223 0,236 SYR 0,130 0,057 0,129 0,135 0,116 0,140 0,127 0,129 0,176 0,127 0,127 0,099 0,110 0,154 0,113 0,140 0,127 0,097 0,113 0,122 0,117 0,130 0,207 0,239 0,242 TIN 0,005 0,082 0,002 0,089 0,089 0,088 0,000 0,003 0,072 0,000 0,000 0,035 0,089 0,098 0,129 0,174 0,000 0,127 0,178 0,178 0,183 0,182 0,244 0,273 0,281 PAN 0,107 0,028 0,105 0,113 0,082 0,114 0,103 0,107 0,157 0,103 0,103 0,071 0,077 0,141 0,085 0,097 0,103 0,082 0,103 0,008 0,004 0,099 0,163 0,217 0,230 LAMB 0,107 0,028 0,105 0,113 0,082 0,114 0,103 0,107 0,157 0,103 0,103 0,071 0,077 0,141 0,085 0,097 0,103 0,082 0,103 0,000 0,011 0,108 0,172 0,217 0,230 ALF 0,107 0,028 0,105 0,113 0,082 0,114 0,103 0,107 0,157 0,103 0,103 0,071 0,077 0,141 0,085 0,097 0,103 0,082 0,103 0,000 0,000 0,103 0,167 0,223 0,236 MON 0,088 0,007 0,086 0,097 0,074 0,095 0,085 0,088 0,137 0,085 0,085 0,052 0,069 0,118 0,070 0,084 0,085 0,060 0,085 0,021 0,021 0,021 0,155 0,243 0,250 SLO 0,147 0,140 0,147 0,160 0,134 0,129 0,145 0,149 0,191 0,145 0,145 0,145 0,129 0,173 0,187 0,227 0,145 0,179 0,145 0,162 0,162 0,162 0,142 0,205 0,267 Alobo 0,260 0,264 0,258 0,271 0,258 0,258 0,258 0,263 0,284 0,258 0,258 0,263 0,252 0,271 0,314 0,368 0,258 0,315 0,258 0,291 0,291 0,291 0,271 0,245 0,251 Ppru 0,257 0,240 0,255 0,240 0,240 0,280 0,253 0,252 0,265 0,253 0,253 0,250 0,253 0,233 0,300 0,350 0,253 0,285 0,253 0,260 0,260 0,260 0,247 0,260 0,246 COI 0,003 0,000 0,000 0,000 0,000 0,004 0,002 n/c 0,000 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,133 0,000 0,000 0,000 0,000 0,004 0,000 16S rrna 0,005 n/c 0,003 0,030 0,000 0,000 0,000 0,002 n/c 0,000 0,000 0,052 0,000 0,000 0,121 0,000 n/c 0,072 0,000 0,000 0,000 n/c 0,005 0,000 n/c n/c 137

Αποτελέσματα 1.3. Φυλογενετικές αναλύσεις Όλες οι φυλογενετικές αναλύσεις (ML, MP, BI) κατέληξαν στην ίδια τοπολογία κλάδων, διαχωρίζοντας τις ίδιες μονοφυλετικές ομάδες με κάποιες πολύ μικρές διαφορές στους ρηχούς κλάδους ή/και στη στατιστική υποστήριξη των μεταξύ τους σχέσεων (Εικόνα Γ2). Όλες οι αναλύσεις (ML, MP, BI) διέκριναν σαφώς τα τρία είδη Trachelipus που μελετήθηκαν. Ο πιο βασικός κλάδος είναι αυτός του T. ratzeburgii από τη Σλοβενία, με τους υπόλοιπους πληθυσμούς να ομαδοποιούνται σε ένα μονοφυλετικό κλάδο. Ο επόμενος φυλογενετικός κλάδος που διαμορφώνεται περιλαμβάνει τους πληθυσμούς του T. palustris από την ηπειρωτική Ελλάδα ενώ οι σχέσεις των πληθυσμών εντός αυτού του κλάδου έχουν πολύ υψηλή στατιστική υποστήριξη. Συγκεκριμένα, εντός αυτού του κλάδου διαμορφώνονται δύο ομάδες: η μία περιλαμβάνει τους πληθυσμούς από το νοτιοανατολικό άκρο της Πελοποννήσου ενώ η δεύτερη περιλαμβάνει τους πληθυσμούς από το βορειοδυτικό τμήμα της Πελοποννήσου (συμπεριλαμβανομένης και της terra typica του είδους T. palustris). Ο επόμενος φυλογενετικός κλάδος που διαμορφώνεται είναι ο κλάδος του T. aegaeus, ο οποίος σε όλες τις αναλύσεις είχε την απόλυτη στατιστική υποστήριξη. Το συγκεκριμένο αποτέλεσμα επιβεβαιώνει τα ευρήματα των Parmakelis et al. (2008), με πιο σημαντικό στοιχείο την ενσωμάτωση των πληθυσμών της Κρήτης και των Κυθήρων στον κλάδο του T. aegaeus και όχι στον κλάδο του T. palustris ( T. kytherensis ), όπως είχε αρχικά προταθεί για τα είδη που εξαπλώνονταν σε αυτές τις δύο περιοχές (βλέπε Εισαγωγή 6.4). 1.4. Εκτίμηση χρόνων απόσχισης Ο έλεγχος του λόγου των πιθανοτήτων (LRT) απέρριψε την υπόθεση του σταθερού μοριακού ρολογιού για τους πληθυσμούς του Τ. aegaeus και για τους δύο μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους (COI και 16S rrna). Γι αυτόν το λόγο 138

Αποτελέσματα εφαρμόστηκε το μη συσχετιζόμενο μοντέλο λογαριθμικού ρυθμού εξέλιξης (Uncorrelated Lognormal Relaxed Clock, Drummond et al. 2006), κατά το οποίο οι ρυθμοί υποκατάστασης που συνδέονται με κάθε κλάδο του δέντρου είναι ανεξάρτητοι και καθορίζονται από μια διακριτή λογαριθμοκανονική κατανομή. Εικόνα Γ2: Οι φυλογενετικές σχέσεις από τη συνδυασμένη ανάλυση των δύο μιτοχονδριακών γενετικών τόπων, όπως προκύπτουν από τις αναλύσεις MP, BI και ML. Οι αριθμοί στους κλάδους αντιπροσωπεύουν τη στατιστική υποστήριξη κάθε ανάλυσης (MP/BI/ML). Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. Οι κωδικοί κάθε πληθυσμού αναλύονται στον Πίνακα Γ1. 139

Αποτελέσματα Μεταξύ των 8 διαφορετικών υποθέσεων που εξετάστηκαν, το επικρατέστερο σενάριο (μετά τον υπολογισμό των Οριακών Εκτιμητών Πιθανοφάνειας, MLEs με τη μέθοδο path sampling) ήταν αυτό στο οποίο οι χρόνοι απόσχισης μεταξύ των φυλογενετικών κλάδων υπολογίστηκαν εφαρμόζοντας τον ρυθμό νουκλεοτιδικής υποκατάστασης για τον γενετικό τόπο της COI από τους Poulakakis & Sfenthourakis (2008). Τα αποτελέσματα της χρονολόγησης των κλάδων για καθένα σενάριο που εξετάστηκε συνοψίζονται στον Πίνακα Γ5. Επιπλέον, στον Πίνακα Γ6 συνοψίζονται οι ρυθμοί υποκατάστασης κάθε κύριου κλάδου της φυλογένεσης. Το χρονόγραμμα όπως προέκυψε από το πρόγραμμα BEAST v1.7.5 για το επικρατέστερο σενάριο παρατίθεται στην Εικόνα Γ3. Η διαφοροποίηση του T. aegaeus φαίνεται να ξεκινά στο Σερραβάλιο και συνεχίζεται μέχρι και τη σύγχρονη εποχή (η μέση χρονολόγηση των ρηχών κλάδων κυμαίνεται από 1,15-0,08 mya). Ο πρώτος κλάδος που διαφοροποιείται είναι αυτός της Ικαρίας - Σάμου (κλάδος ανατολικού Αιγαίου-EAST), ο οποίος χρονολογείται περί τα 10,98 mya (13,53-8,24 mya). Ο επόμενος κλάδος περιλαμβάνει τον πληθυσμό της Κρήτης και χρονολογείται περί τα 9,3 ΜΥΑ (12,18-6,16 mya). Ο επόμενος κλάδος στο φυλογενετικό δέντρο περιλαμβάνει πληθυσμούς απομακρυσμένους γεωγραφικά που προέρχονται από τις Κυκλάδες, τα παράλια της ηπειρωτικής Ελλάδας και τα Κύθηρα. Η διαφοροποίηση αυτού του κλάδου φαίνεται να ξεκίνησε περί τα 6,85 mya και διήρκησε έως και πολύ πρόσφατα (0,5 mya). 140

Αποτελέσματα my Εικόνα Γ3. Το χρονόγραμμα που προέκυψε από το πρόγραμμα BEAST στο οποίο παρουσιάζονται οι φυλογενετικές σχέσεις και οι εκτιμώμενοι χρόνοι απόσχισης των εξελικτικών γραμμών του T. aegaeus, βάσει της επικρατέστερης υπόθεσης R2. Οι αριθμοί πάνω από τους κλάδους με την έντονη γραφή αντιστοιχούν σε χρόνους υπολογισμένους σε εκατ. χρόνια, ενώ οι ράβδοι δείχνουν τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95%. Οι αριθμοί σε παρένθεση κάτω από τους κλάδους αντιστοιχούν στη στατιστική υποστήριξη των κλάδων από τις τρείς αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν (MP/BI/ML) - παρατίθενται τιμές bootstrap 50 and pp 0.50. Οι αστερίσκοι στους κλάδους υποδεικνύουν τα σημεία χρονολόγησης που χρησιμοποιήθηκαν στα διαφορετικά σενάρια που εξετάστηκαν (βλέπε Πίνακα Γ4). Τέλος, παρατίθεται το χρονικό πλαίσιο των δύο γεωλογικών γεγονότων (σχηματισμός Μεσαιγαιακής Τάφρου, ΜΑΤ και κρίση αλατότητας στο Μεσσήνιο, MSC). Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. Οι κωδικοί των πληθυσμών αναλύονται στον Πίνακα Γ1. 141

Αποτελέσματα Πίνακας Γ4: Κατάταξη των υποθέσεων που εξετάστηκαν με βάση τα διαφορετικά σημεία χρονολόγησης και τους ρυθμούς νουκλεοτιδικής υποκατάστασης. Παρατίθενται οι Οριακοί Εκτιμητές Πιθανοφάνειας (MLEs) όπως υπολογίστηκαν με το μοντέλο συγχώνευσης και το μη συσχετιζόμενο λογαριθμικό μοντέλο μη-σταθερού ρυθμού εξέλιξης (Uncorrelated Lognormal Relaxed Clock). Στον τριγωνικό πίνακα παρατίθενται οι παράγοντες Bayes όπως προέκυψαν από τη σύγκριση των διαφορετικών σεναρίων με τη μέθοδο path sampling. Σε γκρίζο φόντο αναφέρεται το επικρατές σενάριο. Τα γεωλογικά γεγονότα που χρησιμοποιήθηκαν είναι: MAT = 12-9 mya και MSC= 5,3 ±0,3 mya. Οι κόμβοι όπου εφαρμόστηκε η χρονολόγηση αριθμούνται και επισημαίνονται με αστερίσκους στο χρονόγραμμα της Εικόνας Γ3. ~0.14% Κόμβος 1 Κόμβος 1 MLE_PS Σημεία χρονολόγησης/ (16S Κατάταξη Κωδικός Κόμβος Κόμβος Κόμβος (MAT) + (MAT) + (4 runs ρυθμοί νουκλεοτιδικής rrna, Σεναρίου Σεναρίου 1 (MAT) 2 (MSC) 2 (MAT) Κόμβος 2 Κόμβος 2 mean) υποκατάστασης Held (MSC) (MAT) 2001) 4 C1-4230,4 Κόμβος 1 (MAT) 5 C2-4231,1 Κόμβος 2 (MSC) 0,7 7 C3-4233,6 Κόμβος 2 (MAT) 3,2 5,9 6 C4-4232,1 Κόμβος 1 (MAT) + Κόμβος 2 (MSC) 1,7 1 1,5 2 C5-4228,5 Κόμβος 1 (MAT) + Κόμβος 2 (MAT) 1,9 2,6 5,1 3,6 8 R1-4279,1 ~0.14% (16S rrna, Held 2001) 48,7 48 45,5 47 50,6 1.56% 1.72% 1 R2-4228,15 (COI, Poulakakis & Sfenthourakis 2008) 2,25 2,95 5,45 3,95 0,35 50,95 1.56%-1.72% (COI, Poulakakis & Sfenthourakis 2008) 3 R3-4229,05 ~1.25% (COI, Ketmaier et al. 2003) 1,35 2,05 4,55 3,05 0,55 50,05 0,9 142

Αποτελέσματα Πίνακας Γ5: Εκτιμώμενοι χρόνοι απόσχισης σε mya (και όρια εμπιστοσύνης 95%) των κλάδων της φυλογένεσης (που προέκυψαν από όλες τις επαναληπτικές αναλύσεις), για καθένα από τα σενάρια που εξετάστηκαν με βάση τα διαφορετικά γεωλογικά γεγονότα (MAT=12-9 mya; MSC=5,3 ±0,3 mya) και τους διαφορετικούς ρυθμούς νουκλεοτιδικής υποκατάστασης. Το επικρατές σενάριο (μετά τον έλεγχο path sampling) παρατίθεται σε γκρίζο φόντο. Οι κόμβοι όπου εφαρμόστηκε η χρονολόγηση αριθμούνται και επισημαίνονται με αστερίσκους στο χρονόγραμμα της Εικόνας Γ3. Κόμβος Σημεία χρονολόγησης Ρυθμοί νουκλεοτιδικής υποκατάστασης C1 C2 C3 C4 C5 R1 R2 R3 Κόμβος 1 Κόμβος 1 (MAT) 1,56% 1,72% ~1,25% Κόμβος 1 Κόμβος 2 Κόμβος 2 (MAT) + ~0,14% + Κόμβος 2 (COI, Poulakakis & (COI, Ketmaier (MAT) (MSC) (MAT) Κόμβος 2 (16S rrna, Held 2001) (MAT) Sfenthourakis 2008) et al. 2003) (MSC) 1 10,95 53,08 105,08 9,61 11,33 16,26 10,98 11,34 [8,23-13,67] [4,65-128,38] [5,14-106,46] [6,72-12,48] [9,05-13,63] [13,86-18,67] [8,24-13,53] [8,76-13,86] 2 9,28 38,6 73,51 5,44 10,06 15,83 9,3 9,92 [6,05-12,55] [4,22-91,09] [4,25-76,6] [4,87-6,01] [7,85-12,22] [13,34-18,26] [6,16-12,18] [7,06-12,72] 3 6,97 26,83 53,22 4,41 7,72 14,19 6,85 7,63 [4,07-10,03] [3,19-62,02] [3,09-51,16] [3,33-5,4] [4,9-10,43] [11,8-16,62] [4,19-9,64] [5,0-10,29] 4 4,95 [2,51-7,61] 16,37 [2,15-34,73] 43,88 [2,09-34,41] 3,32 [2,14-4,47] 3,89 [1,72-6,59] 12,29 [9,96-14,75] 4,92 [2,81-7,14] 5,67 [3,54-7,96] 143

Αποτελέσματα Πίνακας Γ6: Εκτιμώμενοι ρυθμοί νουκλεοτιδικής υποκατάστασης (και όρια εμπιστοσύνης 95%) των κλάδων της φυλογένεσης (που προέκυψαν από όλες τις επαναληπτικές αναλύσεις), για καθένα από τα σενάρια που εξετάστηκαν με βάση τα διαφορετικά γεωλογικά γεγονότα (MAT=12-9 mya; MSC=5,3 ±0,3 mya). Το επικρατές σενάριο (μετά τον έλεγχο path sampling) παρατίθεται σε γκρίζο φόντο. Οι κόμβοι όπου εφαρμόστηκε η χρονολόγηση αριθμούνται και επισημαίνονται με αστερίσκους στο χρονόγραμμα της Εικόνας Γ3. Κόμβος Σημεία χρονολόγησης Ρυθμοί νουκλεοτιδικής υποκατάστασης C1 C2 C3 C4 C5 R1 R2 R3 2 Κόμβος 1 (MAT) 1,11 [0,0 3,12] Κόμβος 2 (MSC) 0,5 [0-1,69] Κόμβος 2 (MAT) 0,55 [0-1,83] Κόμβος 1 (MAT) + Κόμβος 2 (MSC) 0,71 [0,06-1,61] Κόμβος 1 (MAT) + Κόμβος 2 (MAT) 1,19 [0,02-3,49] ~0,14% (16S rrna, Held 2001) 0,18 [0-0,7] 1,56% 1,72% (COI, Poulakakis & Sfenthourakis 2008) 1,16 [0,02-3,24] ~1,25% (COI, Ketmaier et al. 2003) 1,04 [0,03-2,87] 3 1,62 [0,26 4,02] 0,77 [0-2,4] 0,81 [0-2,49] 3,25 [0,58-7,59] 1,54 [0,25-3,79] 1,4 [0,62-1,9] 1,78 [0,26-4,4] 1,67 [0,26-3,96] 4 1,73 [0,27-4,27] 0,94 [0-2,71] 0,9 [0-2,59] 2,87 [0,56-6,76] 2,36 [0,34-6,26] 1,32 [0,57-1,9] 2,48 [0,39-6,23] 2,22 [0,42-5,09] 144

Αποτελέσματα 2. ΤΟ ΓΕΝΟΣ TRACHELIPUS ΣΤΗΝ ΗΠΕΙΡΩΤΙΚΗ ΚΑΙ ΝΗΣΙΩΤΙΚΗ ΕΛΛΑΔΑ 2.1. Γενικά στοιχεία 2.1.1. Μιτοχονδριακό και πυρηνικό DNA Τα δεδομένα από τους 124 πληθυσμούς αντιπροσώπων του γένους Trachelipus από την ηπειρωτική και νησιωτική Ελλάδα καθώς και από επιλεγμένες τοποθεσίες του εξωτερικού (Εικόνα Γ4) περιελάμβαναν 396 αλληλουχίες για τον γενετικό τόπο 16S (κοινό μήκος 293 bps), 351 αλληλουχίες για τον γενετικό τόπο COI (κοινό μήκος 504 bps) και 269 αλληλουχίες για τον πυρηνικό γενετικό τόπο NaK ATPase (κοινό μήκος 539 bps). Το συνολικό μήκος των συνδυασμένων αλληλουχιών του μιτοχονδριακού DNA ήταν 797 bps ενώ για τη συνδυασμένη ανάλυση και των τριών γενετικών τόπων ήταν 1298 bps. Οι αλληλουχίες ομαδοποιήθηκαν σε 142, 211 και 219 απλοτύπους για τους γενετικούς τόπους του 16S rrna, της COI και της NaK ATPase αντίστοιχα. Επισημαίνεται πως για το τελικό πακέτο δεδομένων της συνδυασμένης ανάλυσης των δύο μιτοχονδριακών γενετικών τόπων (COI και 16S rrna) αλλά και των δεδομένων για τη συνδυασμένη ανάλυση και των τριών γενετικών τόπων (16S, COI, NaK ATPase) έγινε αυστηρή επιλογή των απλοτύπων προκειμένου να μην υπάρχουν ελλιπή δεδομένα αλληλούχησης (πχ διπλές κορυφές στα χρωματογραφήματα) που θα μπορούσαν να καταλήξουν σε αμφιλεγόμενα αποτελέσματα στις φυλογενετικές αναλύσεις. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα της συνδυασμένης ανάλυσης για τα μιτοχονδριακά γονίδια περιελάμβαναν 216 απλοτύπους ενώ τα δεδομένα για τη συνδυασμένη ανάλυση των μιτοχονδριακών και του πυρηνικού γενετικού τόπου περιελάμβαναν 219 απλοτύπους (συμπεριλαμβανομένων και των εξωομάδων). 145

Αποτελέσματα Στη συνδυασμένη ανάλυση των μιτοχονδριακών γενετικών τόπων ο αριθμός των μεταβλητών θέσεων ήταν 408 (51%), από τις οποίες οι 356 (44,7%) ήταν πληροφοριακές βάση του κριτηρίου της φειδωλότητας. Αντίστοιχα, στη συνδυασμένη ανάλυση και των τριών γενετικών τόπων ο αριθμός των μεταβλητών θέσεων ήταν 542 (41,8%), εκ των οποίων οι 404 (31%) ήταν πληροφοριακές. 146

Αποτελέσματα Πίνακας Γ7: Κατάλογος των πληθυσμών και ειδών που μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Αναγράφονται ο αριθμός των ατόμων που αναλύθηκαν και οι κωδικοί των απλοτύπων που προέκυψαν για κάθε γενετικό τόπο και για τις συνδυασμένες αναλύσεις. Κωδικός Κωδικός Απλότύπου Κωδικός Απλότύπου Κωδικός Απλότύπου Κωδικός Απλότύπου Απλότύπου Είδος Κωδικός (16S rrna) (COI) (NaK) Συνδυασμένες αναλύσεις (Mt DNA) (Mt +n DNA) AND S15,S16,S17,S18 (6) C5,C6 (5) N6,N7,N8,N9 (6) M21,M22,M23 (5) H6,H7,H8,H9 (6) ANF S19 (1) - -- -- - EPD S20,S21 (3) C7 (3) N10,N11 (3) M24,M25 (3) H10,H11 (3) MYK S18 (6) C19,C20 (6) N20,N21 (6) M37,M38 (6) H20,H21 (6) NAX S18 (3) C21 (3) -- M39 (3) - PAR S18,S31 (5) C22,C23 (4) N22,N23,N24,N25,N26 H22,H23,H24,H25,H26 M40,M41,M42,M43 (4) (5) (5) STO S18 (1) C29 (1) -- M50 (1) - TIN S18 (3) C31 (3) -- M53 (3) - T. aegaeus IKR S22,S23,S24 (3) C8,C9 (3) N12,N13 (3) M26,M27 (3) H12,H13 (3) SAM S24 (3) C25 (3) N31 (3) M45 (3) H31 (3) KEA S25 (3) C10,C11 (3) N14,N15 (3) M28,M29 (3) H14,H15 (3) CRE S26 (4) C12,C13 (4) N16,N17 (4) M39,M31 (4) H16,H17 (4) KTN S27 (2) C14,C15 (2) N18,N19 (2) M32,M33 (2) H18,H19 (2) KYT S28,S29 (4) C16,C17 (4) -- M34,M35 (4) - MIL S30 (1) C18 (1) -- M36 (1) - PRN S32 (4) C24 (3) N27,N28,N29,N30 (4) M44 (4) H27,H28,H29,H30 (4) SER S33,S34,S35 (3) C26 (2) N32,N33,N34 (3) M46,M47 (2) H32,H33,H34 (3) SIF S35 (2) C27,C28 (2) -- M48,M49 (2) - SYR S36,S37 (2) C30 (2) -- M51,M52 (2) - T.cavaticus Tcav S39 (2) C33,C34 (2) Ν36,Ν37 (2) M19,M20 (2) H36,H37 (2) T.nsp STN S41,S42 (2) C36,C37 (3) N40,N41 (2) M56,M57 (2) H40,H41 (2) AGA S40 (2) C35,C36 (3) Ν38,Ν39 (3) M55 (1) H38,H39 (3) 147

T. squamuliger Αποτελέσματα BULG S120,S121 (2) C172,C173 (2) Ν157,Ν158 (2) M192,M193 (2) H157,H158 (2) ARD S118,S119 (2) C170,C171 (2) Ν155,Ν156 (2) M189,M190 (2) H155,H156 (2) KYPR S119,S127 (2) C171,C184 (2) Ν176,Ν177 (2) M190,M202 (2) H176,H177 (20 GIAN S118,S125 (2) C170,C179 (2) Ν167,Ν168 (2) M189,M198 (2) H167,H168 (2) NYMF S129 (1) C189 (1) Ν183 (1) M207 (1) H183 (1) NSAN S119 (2) C187,C188 (2) Ν181,Ν182 (2) M205,M206 (2) H181,H182 (2) DAD S118,S123 (2) C170,C176 (2) Ν161,Ν162 (2) M195,M189 (2) H161,H162 (2) STHR S132 (3) C192,C193 (2) Ν186 (1) M210 (1) H186 (1) STAV S130,S131 (2) C190,C191 (2) Ν184,Ν185 (2) M208,M209 (2) H184,H185 (2) KAV S126 (4) C180,C181 (2) Ν169,Ν170 (2) M199 (1) H169,H170 (2) DRAM S124 (4) C178 (2) Ν166 (2) M197 (2) H166 (2) XAGN S136 (2) C199 (2) Ν195,Ν196 (2) M216 (2) H195,H196 (2) VROD S135 (4) C198 (2) Ν193,Ν194 (2) M215 (2) H193,H194 (2) VLV S55,S134 (2) C196,C197 (2) Ν191,Ν192 (2) M213,M214 (2) H191,H192 (2) CHLK S122 (1) C174,C175 (2) Ν159,Ν160 (2) M194 (1) H159,H160 (2) AgO S3 (4) C200, C201 (4) Ν201,Ν202 (4) M9,M10 (4) H201,H202 (4) ARID -- -- -- -- -- PRSM S92 (1) C137 (1) Ν117 (1) M153 (1) H117 (1) GAB S65 (3) C74,C75 (2) Ν72,Ν73,Ν74 (3) M93,M93 (2) H72, H73,H74 (3) KAT S70,S71,S72,S73 (4) C80,C81 (3) Ν78,Ν79,Ν80,Ν81 (4) M98,M99,M100 (3) H78,H79,H80,H81 (4) AgDN S1,S2 (4) C1,C2,C3 (3) Ν197,Ν198,Ν199,Ν200 H197,H198,H199,H200 M6,M7,M8 (3) (4) (4) KAR S5,S6,S7,S8 (4) -- Ν207,Ν208,Ν209,Ν210 (4) -- H207,H208,H209,210 (4) TEMP S133 (3) C194 (3) Ν187,N188 (3) M211 (1) H187,H188 (3) CML S53,S54,S55 (3) -- N56,N57,N58 (3) -- H56,H57,H58 (3) FNR S55 (1) C71 (1) N68 (1) M88 (1) H68 (1) VEL S55,S106 (2) C182,C195 (2) N189,N190 (2) M200,M212 (2) SQUAHULIGER LATHOS ARI KLAF S55,S106 (2) C182 (2) N173,N174,N175 (3) M200 (2) H173,H174,H175 (30) AgNIK S117 (1) C168,C169 (2) N153,N154 (2) M191 (1) H153,H154 (2) DAM S117 (3) C177 (2) N163,N164,N165 (3) M196 H163,H164,H165 (3) KIS S106 (3) C182,C183 (3) N171,N172 (3) M200,M201 (3) H171,H172 (3) LBN S117,S128 (3) C185,C186 (3) N178,N179,N180 (3) M203,M204 (3) H178,H179,H180 (3) STE S142 (4) C209 (4) N217,N218 (4) M18 (4) H217,H218 (4) 148

Αποτελέσματα T. camerani T.arcuatus T. palustris TcameIT S38 (1) C32 (1) -- M54 (1) H35 (1) KERK S9,S10,S11 (4) C4 (4) N2,N3,N4 (4) M2,M3,M4 H2,H3,H4 (4) ZRL S114 (1) C161 (1) N219 (1)??? H219 (1) KON S76 (2) -- N89,N90 (2) -- H89,H90 (2) VOI S108,S109 (2) C155 (1) N133,N134,N135 (3) M176 (1) H133,H134,H135 (3) SSN S97,S98,S99 (4) C141 (3) N123,N124,N125,N12 H123,H124.,H125.,H126 M159,M160,M161 (3) 6 (4) (4) Tarc_CAMP S13 (1) --- N5 (1) -- H5 (1) Tarc_Tosc S14 (1) --- -- -- -- DRM S137,S138 (3 N203,N204,N205,N20 C64,C202,C203,C204 (4) 6 (4) M11,M12,M13 (3) H203,H204,H205,H206 (4) PAP S138,S141 (3) C202,C207,C208 (3) N213,N214,N215,N21 6 (4) M15,M16,M17 (3) H213,H214,H215,H216 (4) LBN S75 (4) C99,C100, C205 (3) N96,N97,N211 (3) M118,M119 (2) H96,H96,H211 (3) KIS S75 (4) C83,C84 (2) N82,N83 (2) M102,M103 (2) H83,H84 92) MKRN S86 (2) C114 (2) N104,N105 (2) M133 (2) H104,H105 (2) ONF S75,S86 (3) C123,C121 (3) N110,N111,N112 (3) M138,M139 (3) H110,H111,H112 (3) KLAF S64 (4) C85,C86 (2) N84,N85 (2) M104,M105 (2) H84,H85 (2) AgNIK S43 (1) C38 (1) N42,N43 (2) M65 (1) H42,H43 (2) DAM S56,S57 (3) C63 (1) N59,N60,N61 (3) M81 (1) H59,H60,H61 (3) KRN S45 (2) C90,C91 (2) Ν91,Ν92 (2) M109,M110 (2) H91,H92 (2) VOI S107 (1) C154 (1) N132 (1) M175 (1) H132 (1) GRP S67,S68 (4) -- -- -- -- ATR S48 (4) -- N49 (1) -- H49 (1) PER S45,S90,S91 (4) C130,C131 (2) N113,N114 (2) M145,M146 (2) H113,H114 (2) TPT S45,S71 (3) C150 (3) N127,N128,N129 (3) M171,M172 (30 H127,H128,H129 (3) VTS S50 (3) C156,C157 (4) N136,N137,N138 (4) M177,M178 (3) H136,H137,H138 (4) KLM S50 (4) C87,C88,C89 (4) N86,N87,N88 (4) M106/M107,M108 (4) H86,H87,H88 (4) BEL S49,S50 (4) C48,C49,C50,C51 (4) N50,N51,N52,N53 (4) M66,M67,M68,M69 (4) H50,H51,H52,H53 (4) FRX S62,S63,S64 (4) C72,C73 (4) N69,N70,N71 (4) M89,M90,M91 (4) ZRL S45,S111,S112, N142,N143,N144,N14 C160,C162 (4) S113 (8) 5 (4) M181,M182,M183 (3) H142,H143,H144,H145 (4) ART S47 (1) C45,C46,C47 (3) N46,N47,N48 (3) M64 (1) H46,H47,H48,H49 (4) PRZ -- -- -- -- -- LEK S139,S140 (4) C101,C206 (2) N98,N212 (2) M14,M184 (2) H98,H212 (2) AIN S44,S45 (4) C39,C40 (4) N44,N45 (4) M58,M59 (4) H44,H45 (4) 149

Αποτελέσματα PAN S45,S56,S89 (11) C125,C126,C127,C128, C129 (11) -- M140,M141,M142,M143,144 (9) -- MIK S46,S85 (6) C107,C108,C109,C110,C111 (6) -- M127,M128,M129,130,M131 (6) -- KAL S58,S69 (3) C77,C78,C79 (3) N76,N77 (2) M95,M96,M97 (3) H77,H78 (2) LAMB S45 (6) C95,C96,C97,C98 (6) -- M114,M115,M116,M117 (6) -- MNS S51 (2) C115 (2) N106 (2) M134 (2) H106 (2) VLA S45 (2) C151,C152 (3) -- M173 (2) -- MKL S45 (1) C113 (1) -- -- -- BOU S51 (12) C52,C53,C54,C55 (12) N54,N55 (2) M70,M71,M72,M73 (12) H54,H55 (2) CH S45, S51,S52 (10) C56,C57,C58,C59,C60,C61, M74,M75,M76,M77,M78,M79,M80 -- C62 (11) (10) -- SOL S51,S95,S96 (3) C140 (3) N120,N121,N122 (3) M156,M157,M158 (3) H120,H121,H122 (3) FEN S46,S58 (3) C67,C68,C69 (3) -- M84,M85,M86 (3) -- PLAN S45,S58 (6) C132,C133,C134,C135 (6) -- M147,M148,149,150 (6) -- T. palustris THEO S58,S100,S101 (4) C134,C144,C145 (4) -- M149,M164,M165 (4) -- FLA S60 (1) C70 (1) -- M87 (1) -- ZIR S46,S82,S110 (3) C158,C159 (2) N139,N140,N141 (3) M179,M180 (2) H139,H40,H141 (3) SFK S93,S94 (3) C139 (3) N118,N119 (3) M154,M155 H118,H119 (3) KFL S74 (4) C82 (4) -- M101 (4) -- MAIN S83 (1) C105 (1) N99 (1) M125 (1) H99 (1) LIB S79,S80,S81,S46 (5) C102,C103,C104 (5) -- M120,M121,M122,M123,M124 (5) -- LOU S82 (1) -- -- -- -- ELTa S58 (4) -- N62,N63 (4) --- H62,H63 (4) ELTb S59 (3) C65,C66 (3) N64,N65,N66,N67 (4) M82,M83 (2) H64,H65,H66,H67 (4) LAG S78 (1) C94 (1) N95 (1) M113 (1) H95 (1) KRT S45,S77 (4) C92,C93 (4) N93,N94 (4) M111,M112 (4) H93,H94 (4) ALF S45 (5) C41 (6) -- M60 (4) -- AMG S46 (3) C42,C43,C44 (3) -- M61,M62,M63 (3) -- NED S87,S88 (3) C120,C121,C122 (3) N107,N108,N109 M135,M136.,137 (3) H107,H108,H109 (3) PMS S87 (3) C136 (4) N115,N116 (3) M151 (3) H115,H116 (3) VLK S87,S101 (2) C136,C153 (2) N130,N131 (2) M151,M174 (2) H130,H131 (2) PRR S87 (4) C138 (4) -- M152 (4) -- 150

Αποτελέσματα TAYa S87 (3) C142,C143 (3) M162,M163 (3) TAYb S87 (3) C142,C143 (3) M162,M163 (3) TAYc S87 (2) C143 (2) M162,M163 (2) T. palustris MBA S84 (3) C106 (4) N100,N101 (4) M126 (3) H100,H101 (4) MKA S74 (4) C112 (3) N102,N103 (4) M132 (3) H102,H103 (4) GER S66 (3) C76 (3) N75 (3) m94 (3) H75 (3) CAS MOU C116,C117,C118,C119 (4) N146,N147,N148,N149 SLO S115 (6) C163,C164 (6) T. razeburgii (6) m185,m186 (6) H146,H147,H148,H149 (6) Trat_Trent S115 (2) C165 (2) N150 (2) m187 (2) H150 (2) T. rathkii TR_SLZ S116 (2) C166,C167 (2) N151,N152 (2) m188 (1) H151,H152 (2) Armadillidium lobocurvum Porcellionides pruinosus A.lobo S23 (1) C210 (1) N1 (1) M1 (1) H34 (1) P.pru S24/KF891444 (1) C211/KF891466 (1) H35 (1) 151

Αποτελέσματα Εικόνα Γ7: Οι πληθυσμοί των ειδών Trachelipus spp. που μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Οι κωδικοί των τοποθεσιών αναλύονται στον Πίνακα Γ7. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. 152

Αποτελέσματα Εικόνα Γ8: Οι πληθυσμοί των ειδών Trachelipus spp. που μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή στην ελληνική επικράτεια. Οι κωδικοί των τοποθεσιών αναλύονται στον Πίνακα Γ7. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. 153

Αποτελέσματα 2.2. Γενετικές αποστάσεις Οι γενετικές αποστάσεις για τους τρεις γενετικούς τόπους υπολογίστηκαν τόσο μεταξύ των μελετηθέντων ειδών (nominal species) όσο και μεταξύ των φυλογενετικών κλάδων που προέκυψαν από τη φυλογενετική ανάλυση. Η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ του συνόλου των απλοτύπων του γένους Trachelipus εκφρασμένη με τη μορφή γενετικών αποστάσεων με βάση το διπαραμετρικό μοντέλο του Kimura (1980), κυμάνθηκαν από 0,0% έως 34,9% για την COI, από 0,0% έως 24,3% για το 16S rrna και από 0,0% έως 7,4% για την NaK ATPase. Οι τιμές των γενετικών αποστάσεων, όπως υπολογίστηκαν με το πρόγραμμα MEGA v06 (Tamura et al. 2013), μεταξύ των διακριτών ειδών και κλάδων του γένους Trachelipus που αναλύθηκαν, καθώς και οι τιμές εντός κάθε ομάδας φαίνονται στους ακόλουθους Πίνακες Γ8-Γ11. Πίνακας Γ8: Μέσες γενετικές αποστάσεις (Kimura 2-p) για τους δύο μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους (COI-κάτω από τη διαγώνιο, 16S rrna-πάνω από τη διαγώνιο) μεταξύ των μελετηθέντων ειδών (nominal species). Στις δύο τελευταίες σειρές αναφέρονται οι μέσες τιμές της διαφοροποίησης καθενός από τους δύο γενετικούς τόπους (COI και 16S rrna) εντός του κάθε είδους. Με έντονη γραφή επισημαίνονται οι μέγιστες και ελάχιστες τιμές. Tcamerani Taegaeus Tcav Tnsp Tsquamuliger Tpalustris Trathkii Tratzeburgii Tarcuatus Ppruinosus Alobocurvum Tcamerani 0,078 0,063 0,071 0,079 0,062 0,061 0,126 0,086 0,234 0,167 Taegaeus 0,165 0,064 0,087 0,096 0,091 0,099 0,149 0,121 0,206 0,174 Tcav 0,168 0,123 0,057 0,080 0,068 0,081 0,142 0,091 0,194 0,156 Tnsp 0,191 0,168 0,159 0,094 0,082 0,089 0,124 0,100 0,196 0,174 Tsquamuliger 0,203 0,175 0,170 0,119 0,078 0,081 0,155 0,105 0,201 0,163 Tpalustris 0,189 0,178 0,172 0,130 0,155 0,078 0,145 0,074 0,221 0,170 Trathkii 0,187 0,165 0,140 0,164 0,175 0,174 0,149 0,101 0,209 0,186 Tratzeburgii 0,222 0,262 0,246 0,202 0,257 0,232 0,249 0,149 0,209 0,202 Tarcuatus 0,201 0,252 0,261 0,166 0,214 0,161 0,264 0,240 0,249 0,196 Ppruinosus 0,224 0,245 0,250 0,232 0,223 0,257 0,231 0,263 0,340 0,233 Alobocurvum 0,219 0,248 0,234 0,269 0,251 0,286 0,257 0,280 0,312 0,262 COI 0,084 0,109 0,000 0,000 0,077 0,127 0,163 0,000 0,011 n/c n/c 16S 0,012 0,082 n/c 0,004 0,06 0,058 n/c n/c 0,01 n/c 154n/c

Αποτελέσματα Πίνακας Γ9: Μέσες γενετικές αποστάσεις (Kimura 2-p) για τους δύο μιτοχονδριακούς γενετικούς τόπους (COI-κάτω από τη διαγώνιο, 16S rrna-πάνω από τη διαγώνιο) μεταξύ βασικών φυλογενετικών κλάδων (βλέπε και Εικόνα Γ11). Στις δύο τελευταίες σειρές αναφέρονται οι μέσες τιμές της διαφοροποίησης καθενός από τους δύο γενετικούς τόπους (COI και 16S rrna) εντός του κάθε κλάδου. Με έντονη γραφή επισημαίνονται οι μέγιστες και ελάχιστες τιμές. Taegaeus Taegaeus Tcavaticus T squamuliger T squamuliger2 Tcamerani Tnsp TpEvvVolos TpWest TpPEL Trathkii T Tarcuatus Ppru Alobo West East CRE ratzeburgii Tcamerani 0,070 0,082 0,076 0,084 0,092 0,065 0,063 0,073 0,047 0,067 0,137 0,090 0,234 0,167 TaegaeusWest 0,163 0,08 0,065 0,09 0,099 0,088 0,089 0,098 0,075 0,098 0,151 0,121 0,212 0,177 TaegaeusEast 0,187 0,151 0,071 0,102 0,103 0,098 0,09 0,105 0,086 0,099 0,168 0,120 0,169 0,161 TcavaticusCRE 0,195 0,144 0,143 0,081 0,1 0,095 0,092 0,095 0,072 0,099 0,146 0,109 0,198 0,164 Tnsp 0,208 0,185 0,109 0,18 0,108 0,094 0,089 0,093 0,085 0,095 0,136 0,106 0,196 0,174 Tsquamuliger 0,173 0,146 0,148 0,173 0,168 0,096 0,094 0,088 0,084 0,09 0,176 0,115 0,197 0,161 Tsquamuliger2 0,188 0,174 0,17 0,192 0,156 0,176 0,089 0,091 0,073 0,088 0,143 0,112 0,222 0,171 TpEvvVolos 0,191 0,168 0,123 0,176 0,136 0,153 0,153 0,071 0,054 0,069 0,151 0,097 0,180 0,173 TpWest 0,186 0,177 0,157 0,186 0,166 0,188 0,191 0,16 0,061 0,085 0,159 0,074 0,224 0,176 TpPEL 0,169 0,171 0,115 0,16 0,133 0,159 0,173 0,134 0,145 0,071 0,147 0,081 0,222 0,159 Trathkii 0,175 0,173 0,164 0,192 0,167 0,167 0,186 0,16 0,173 0,148 0,153 0,098 0,209 0,186 Tratzeburgii 0,252 0,226 0,157 0,211 0,164 0,2 0,241 0,193 0,207 0,177 0,2 0,153 0,209 0,202 Tarcuatus 0,206 0,206 0,178 0,208 0,187 0,22 0,234 0,176 0,127 0,162 0,196 0,212 0,249 0,196 Ppruinosus 0.472 0.243 0.193 0.203 0.193 0.161 0.154 0.203 0.388 0.415 0.219 0.997 0.448 0,233 Alobo 0,269 0,232 0,209 0,236 0,201 0,237 0,27 0,22 0,239 0,23 0,236 0,213 0,25 0.193 COI 0,029 0,084 0.000 0.000 0.000 0.071 0,088 0,028 0.071 0,058 0,129 0.000 0,007 n/c n/c 16S 0,012 0,079 0,024 0,068 0,004 0,048 0,058 0,011 0,068 0,024 n/c n/c 0,01 n/c n/c 155

Αποτελέσματα Πίνακας Γ10: Μέσες γενετικές αποστάσεις (Kimura 2 p) για τον πυρηνικό γενετικό τόπο NaK ATPase μεταξύ των μελετηθέντων ειδών. Στην τελευταία γραμμή παρατίθενται οι τιμές της γενετικής διαφοροποίησης εντός κάθε είδους. Με έντονα γράμματα επισημαίνονται οι μέγιστες και ελάχιστες τιμές. Tcamerani Taegaeus Tcav Tnsp Tsquamuliger Tpalustris Trathkii Tratzeburgii Tarcuatus Tcamerani Taegaeus 0,037 Tcav 0,063 0,029 Tnsp 0,044 0,011 0,036 Tsquamuliger 0,054 0,021 0,038 0,029 Tpalustris 0,045 0,012 0,032 0,019 0,019 Trathkii 0,044 0,010 0,027 0,017 0,013 0,009 Tratzeburgii 0,054 0,019 0,026 0,026 0,020 0,017 0,009 Tarcuatus 0,051 0,017 0,035 0,024 0,020 0,014 0,009 0,017 NaK ATPase 0,070 0,004 0,054 0,012 0,014 0,013 0,000 0,000 0,011 Πίνακας Γ11: Μέσες γενετικές αποστάσεις (Kimura 2 p) για τον πυρηνικό γενετικό τόπο NaK ATPase μεταξύ βασικών φυλογενετικών κλάδων. Στην τελευταία γραμμή παρατίθενται οι τιμές της γενετικής διαφοροποίησης εντός κάθε κλάδου. Με έντονα γράμματα επισημαίνονται οι μέγιστες και ελάχιστες τιμές. Taegaeus Taegaeus Tcavaticus T T Tcamerani West East CRE Tnsp squamuliger squamuliger2 TpEvvVolos TpWest TpPEL Trathkii Tratzeburgii Tarcuatus Tcamerani TaegaeusWest 0,035 TaegaeusEast 0,050 0,017 TcavaticusCRE 0,049 0,014 0,031 Tnsp 0,044 0,009 0,026 0,022 Tsquamuliger 0,055 0,021 0,036 0,030 0,030 Tsquamuliger2 0,040 0,004 0,022 0,018 0,013 0,025 TpEvvVolos 0,049 0,017 0,025 0,026 0,026 0,021 0,021 TpWest 0,048 0,012 0,030 0,023 0,021 0,019 0,017 0,016 TpPEL 0,037 0,002 0,019 0,015 0,011 0,020 0,006 0,018 0,013 Trathkii 0,044 0,009 0,026 0,018 0,017 0,013 0,013 0,009 0,008 0,009 Tratzeburgii 0,054 0,017 0,035 0,022 0,026 0,019 0,022 0,018 0,016 0,018 0,009 Tarcuatus 0,051 0,015 0,033 0,025 0,024 0,021 0,020 0,017 0,012 0,016 0,009 0,017 NaK ATPase 0,070 0,000 0,023 0,027 0,012 0,012 0,009 0,008 0,012 0,004 0,000 0,000 0,011 156

Αποτελέσματα 2.3. Φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των μελετηθέντων ειδών και σύγκριση των προτύπων των φυλογενετικών αναλύσεων Σε καθένα από τα τρία διαφορετικά σύνολα δεδομένων που αναλύθηκαν (μιτοχονδριακά γονίδια, πυρηνικό γονίδιο και ο συνδυασμός των τριών γενετικών τόπων) παρατηρείται ότι οι πληθυσμοί ομαδοποιούνται σε μεγάλο βαθμό στους ίδιους κλάδους με κάποιες εξαιρέσεις ανάλογα με τον γενετικό τόπο που μελετάται κάθε φορά. Οι εξαιρέσεις αυτές αφορούν κυρίως στην περίπτωση του πυρηνικού γενετικού τόπου, και μπορούν να δικαιολογηθούν εξαιτίας της συντηρητικότητας του συγκεκριμένου δείκτη που από μόνος του δεν μπορεί να επιλύσει και να αποτυπώσει τις ακριβείς φυλογενετικές σχέσεις των μελετηθέντων πληθυσμών. Ωστόσο το γενικό πρότυπο που προκύπτει συμφωνεί τόσο μεταξύ των διαφορετικών γενετικών τόπων που αναλύθηκαν όσο και μεταξύ των διαφορετικών φυλογενετικών μεθόδων (ML,MP,BI) που εφαρμόστηκαν. Στη συνέχεια παρατίθενται τα φυλογενετικά δέντρα που προέκυψαν από την κάθε επιμέρους ανάλυση με τις τρεις φυλογενετικές μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν. 2.3.1. Μιτοχονδριακό DNA Στα φυλογενετικά δέντρα που προέκυψαν από τις αναλύσεις της Μέγιστης Φειδωλότητας και Μέγιστης Πιθανοφάνειας, παρατηρείται πως η μονοφυλετικότητα κάποιων κλάδων δεν εμφανίζει ισχυρή στατιστική υποστήριξη (τιμές bootstrap 75) και μάλιστα κάποιοι κόμβοι εμφανίζουν στατιστικώς μη σημαντική υποστήριξη (τιμές bootstrap 50) (Εικόνα Γ9). Αντίστοιχα στην περίπτωση της ανάλυσης BI παρατηρείται πως οι σχέσεις των κλάδων δεν επιλύονται και παρατηρείται μια πολυτομία με την υποστήριξη των κλάδων να είναι ικανοποιητική (pp 75) ενώ άλλων χαμηλή (pp 75). Εντούτοις οι ομαδοποίηση των πληθυσμών ακολουθεί μια γεωγραφική δομή. 157

Αποτελέσματα Οι τρεις διαφορετικές φυλογενετικές αναλύσεις (ML, MP, BI) για τους γενετικούς δείκτες του 16S rrna και της COI διαχώρισαν τους ίδιους εξελικτικούς κλάδους με διαφορά στην τοπολογία του κλάδου που περιλαμβάνει τους απλοτύπους του T. cavaticus μαζί με τους απλοτύπους της Κρήτης. Ο εν λόγω κλάδος στην περίπτωση των αναλύσεων της ΜL και MP (Εικόνες Γ9, Γ10) ενσωματώνεται στον ευρύτερο κλάδο των απλοτύπων του T. aegaeus από το δυτικό Αιγαίο, ενώ στην περίπτωση της ανάλυσης της BI (Εικόνες Γ11, Γ12) οι απλότυποι αποκλίνουν από τα υπόλοιπα άτομα του T. aegaeus σχηματίζοντας έναν ξεχωριστό κλάδο στην ευρεία πολυτομία που προκύπτει. Οι 10 κοινοί κλάδοι που σχηματίζονται και στις τρεις αναλύσεις (Ml, MP, BI- Εικόνες Γ9, Γ10,Γ11, Γ12) είναι οι ακόλουθοι: 1. Ο κλάδος που περιλαμβάνει τους πληθυσμούς του είδους T. palustris, οι οποίοι προέρχονται αποκλειστικά από την Πελοπόννησο. 2. Ο κυρίως κλάδος του είδους T. squamuliger που περιλαμβάνει σχεδόν το σύνολο των πληθυσμών του είδους με εξάπλωση σε κεντρική και ανατολική Μακεδονία, Θράκη και κεντρική Ελλάδα (ανατολικά της οροσειράς της Πίνδου). 3. Ένας δεύτερος κλάδος του είδους T. squamuliger, ο οποίος περιλαμβάνει τρεις (3) πληθυσμούς από την ανατολική Μακεδονία και τη Θράκη καθώς και τον πληθυσμό από την κεντρική Εύβοια. 4. Ο κλάδος που περιλαμβάνει πληθυσμούς του T. palustris από τη βόρεια Εύβοια και τη χερσόνησο της Μαγνησίας. 5. Ο κλάδος που περιλαμβάνει τους αντιπροσώπους του είδους T. rathkii από το Salzburg της Αυστρίας. 6. Ο κλάδος που περιλαμβάνει πληθυσμούς του είδους T. n. sp. από δύο βραχονησίδες μεταξύ Αττικής και Εύβοιας (Νότιος Ευβοϊκός κόλπος). 7. Ο κλάδος που περιλαμβάνει τους πληθυσμούς του είδους T. ratzeburgii από την Ιταλία και τη Σλοβενία. 8. Ο κλάδος που περιλαμβάνει τους πληθυσμούς του είδους T. aegaeus εκτός από τους απλοτύπους του ανατολικού Αιγαίου. 158

Αποτελέσματα 9. Ο κλάδος του είδους T. camerani με πληθυσμούς που προέρχονται από την Ιταλία, την Κέρκυρα και τη λίμνη Ζηρού (δυτική Ελλάδα). 10. Ο κλάδος που περιλαμβάνει τους πληθυσμούς του είδους T. aegaeus ο οποίος περιλαμβάνει τους απλοτύπους του ανατολικού Αιγαίου. 159

Αποτελέσματα Εικόνα Γ9: Κλαδόγραμμα στο οποίο απεικονίζονται οι φυλογενετικές σχέσεις όπως προέκυψαν από τη συνδυασμένη ανάλυση των δύο μιτοχονδριακών γενετικών τόπων (16S rrna και COI), με τη χρήση των αναλύσεων της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML) και Μέγιστης Φειδωλότητας (MP). Οι αριθμοί στους κλάδους αντιπροσωπεύουν τη στατιστική υποστήριξη κάθε ανάλυσης (ML/MP). Παρατίθενται μόνο οι τιμές 50%. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. 160

Αποτελέσματα Εικόνα Γ10: Το πλήρες ανάπτυγμα του φυλογενετικού δέντρου που προέκυψε από τη συνδυασμένη ανάλυση των δύο μιτοχονδριακών γενετικών τόπων (16S rrna, COI), με τη χρήση της ανάλυσης της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML). Η ανάλυση της Μέγιστης Φειδωλότητας κατέληξε σε παρόμοια ομαδοποιήση των απλοτύπων. Οι αριθμοί στους κλάδους αντιπροσωπεύουν τις τιμές bootstrap >50%. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. Οι κωδικοί των απλοτύπων αναλύονται στον Πίνακα Γ6 και η γεωγραφική τους εξάπλωση απεικονίζεται στις Εικόνες Γ7 και Γ8. 161

Αποτελέσματα Εικόνα Γ11: Κλαδόγραμμα στο οποίο απεικονίζονται οι φυλογενετικές σχέσεις όπως προέκυψαν από τη συνδυασμένη ανάλυση των δύο μιτοχονδριακών γενετικών τόπων (16S rrna, COI), με τη χρήση της ανάλυσης Μπεϊσιανής Συμπερασματολογίας (ΒΙ). Οι αριθμοί στους κλάδους αντιπροσωπεύουν τις τιμές των εκ των υστέρων πιθανοτήτων της ανάλυσης. Παρατίθενται μόνο τιμές pp 0,5. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. 162

Αποτελέσματα Εικόνα Γ12: Το πλήρες ανάπτυγμα του φυλογενετικού δέντρου που προέκυψε από τη συνδυασμένη ανάλυση των δύο μιτοχονδριακών γενετικών τόπων (16S rrna, COI), με τη χρήση της ανάλυσης της Μπεϊσιανής Συμπερασματολογίας (ΒΙ). Οι αριθμοί στους κλάδους αντιπροσωπεύουν τις τιμές των εκ των υστέρων πιθανοτήτων της ανάλυσης. Παρατίθενται μόνο τιμές pp 0,5. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. Οι κωδικοί κάθε πληθυσμού αναλύονται στον Πίνακα Γ7 και η γεωγραφική τους προέλευση απεικονίζεται στις Εικόνες Γ7 και Γ8. 163

Αποτελέσματα 2.3.2. Πυρηνικό DNA Ο πυρηνικός γενετικός τόπος (ένζυμο NaK ATPase) που επιλέχθηκε για τις φυλογενετικές αναλύσεις της παρούσας διατριβής, κατάφερε σε ικανοποιητικό βαθμό να διακρίνει τους εξελικτικούς κλάδους των ειδών και πληθυσμών του γένους Trachelipus. Αξίζει να σημειωθεί πως είναι η πρώτη φορά που ο εν λόγω δείκτης χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ ειδών και πληθυσμών, καθώς στη βιβλιογραφία έχει αξιοποιηθεί μέχρι σήμερα για την επίλυση φυλογενετικών σχέσεων σε ανώτερο ταξινομικό επίπεδο και συγκεκριμένα μεταξύ οικογενειών (Tsang et al. 2008, Ma et al. 2009). Ενδεχομένως, αυτός να είναι και ο λόγος (η συντηρητικότητα του μορίου) της «οριακά ικανοποιητικής» στατιστικής υποστήριξης των επιμέρους κλάδων των δέντρων που προέκυψαν καθώς και των πολυτομιών που εμφανίζονται στην περίπτωση της ανάλυσης της Μπεϊσιανής Συμπερασματολογίας. Οι τρεις διαφορετικές αναλύσεις (ML, MP, BI) κατέληξαν σε όμοια ομαδοποίηση των μελετηθέντων πληθυσμών (Εικόνες Γ13, Γ14, Γ15, Γ16). Συγκεκριμένα, από τις τρεις αναλύσεις προέκυψαν οι ακόλουθοι κοινοί κλάδοι: 1. Πληθυσμοί του είδους T. palustris, που προέρχονται αποκλειστικά από την Πελοπόννησο. 2. Πληθυσμοί του T. palustris από τη βόρεια Εύβοια και τη χερσόνησο της Μαγνησίας. 3. Πληθυσμοί του είδους T. palustris που προέρχονται από τη βόρεια Πελοπόννησο και τη δυτική Ελλάδα. Σε αυτόν τον κλάδο αντίθετα με τις αναλύσεις των μιτοχονδριακών γονιδίων - ενσωματώνονται και οι απλότυποι από τη βόρεια Εύβοια. 4. Ο κυρίως κλάδος του είδους T. squamuliger που περιλαμβάνει σχεδόν το σύνολο των πληθυσμών του είδους με εξάπλωση σε κεντρική και ανατολική Μακεδονία, Θράκη και κεντρική Ελλάδα (ανατολικά της οροσειράς της Πίνδου). 5. Αντιπρόσωποι του είδους T. rathkii από το Salzburg της Αυστρίας. 164

Αποτελέσματα 6. Πληθυσμοί του είδους T.ratzeburgii από την Ιταλία και τη Σλοβενία. 7. Πληθυσμοί του είδους T. aegaeus από το δυτικό Αιγαίο. 8. Πληθυσμοί του είδους T. camerani που προέρχονται από την Ιταλία, την Κέρκυρα και τη λίμνη Ζηρού (δυτική Ελλάδα). Παρά τη διάκριση των παραπάνω κλάδων, υπάρχουν και περιπτώσεις απλοτύπων των οποίων οι σχέσεις είτε παραμένουν ανεπίλυτες δημιουργώντας πολυτομίες (απλότυποι του Τ. palustris από τη βόρειαβορειοδυτική Πελοπόννησο και τη δυτική Ελλάδα) είτε ομαδοποιούνται στον ίδιο κλάδο με απλοτύπους άλλων ειδών (απλότυποι του T. n. sp που ομαδοποιούνται στον κλάδο του Τ. aegaeus) είτε δημιουργούν ανεξάρτητους κλάδους (μεμονωμένοι απλότυποι του Τ. palustris). 165

Αποτελέσματα Εικόνα Γ13: Κλαδόγραμμα στο οποίο απεικονίζονται οι φυλεγενετικές σχέσεις των απλοτύπων των ειδών Trachelipus, με χρήση των αναλύσεων της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML) και Μέγιστης Φειδωλότητας (MP) για τον πυρηνικό γενετικό τόπο (NaK ATPase). Οι αριθμοί στους κλάδους αντιπροσωπεύουν τη στατιστική υποστήριξη κάθε ανάλυσης (ML/MP). Παρατίθενται μόνο οι τιμές bootstrap 50%. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. 166

Αποτελέσματα Εικόνα Γ14: Το πλήρες ανάπτυγμα του φυλογενετικού δέντρου που προέκυψε από την ανάλυση του πυρηνικού γενετικού τόπου NaK ATPase, με χρήση της ανάλυσης της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML). Η ανάλυση της Μέγιστης Φειδωλότητας κατέληξε σε παρόμοια ομαδοποίηση των απλοτύπων. Οι αριθμοί στους κλάδους αντιπροσωπεύουν bootstrap 50%. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. Οι κωδικοί των απλοτύπων αναλύονται στον Πίνακα Γ6 και η γεωγραφική τους προέλευση απεικονίζεται στις Εικόνες Γ7 και Γ8. 167

Αποτελέσματα Εικόνα Γ15: Κλαδόγραμμα στο οποίο απεικονίζονται οι φυλεγενετικές σχέσεις των απλοτύπων των ειδών Trachelipus, όπως προέκυψαν από την ανάλυση της Μπεϊσιανής Συμπερασματολογίας (ΒΙ) για τον πυρηνικό γενετικό τόπο (NaK ATPase). Στους εσωτερικούς κλάδους του δέντρου οι αριθμοί αντιστοιχούν στις τιμές των εκ των υστέρων πιθανοτήτων της ανάλυσης. Παρατίθενται μόνο τιμές pp 0,5. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. 168

Αποτελέσματα Εικόνα Γ16: Το πλήρες ανάπτυγμα του φυλογενετικού δέντρου που προέκυψε από την ανάλυση του πυρηνικού γενετικού τόπου (NaK ATPase), με τη χρήση της ανάλυσης της Μπεϊσιανής Συμπερασματολογίας (ΒΙ). Στους εσωτερικούς κλάδους του δέντρου, οι αριθμοί αντιστοιχούν σε τιμές posterior probabilities (pp) της ανάλυσης BI. Μόνο οι τιμές pp 0,50 παρουσιάζονται. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. Οι κωδικοί των απλοτύπων αναλύονται στον Πίνακα Γ6 και η γεωγραφική τους προέλευση απεικονίζεται στις Εικόνες Γ7 και Γ8. 169

Αποτελέσματα 2.3.3. Συνδυασμένη ανάλυση πυρηνικού και μιτοχονδριακών γενετικών τόπων Στις αναλύσεις των τριών διαφορετικών μεθόδων φυλογενετικής ανάλυσης οι απλότυποι των εξεταζόμενων πληθυσμών ομαδοποιήθηκαν στους ίδιους εξελικτικούς κλάδους. Διαφορά εμφανίζεται στην ομαδοποίηση των απλοτύπων του Αιγαίου. Οι εν λόγω απλότυποι στις αναλύσεις MP και ML (Εικόνες Γ17, Γ18) σχηματίζουν ενιαίο κλάδο εντός του οποίου διαχωρίζονται οι πληθυσμοί T. aegaeus του ανατολικού Αιγαίου, της Κρήτης (μαζί με τους απλοτύπους του T. cavaticus) και του δυτικού Αιγαίου ενώ στην περίπτωση της ανάλυσης της BI (Εικόνες Γ19, Γ20) οι απλότυποι αποκλίνουν σχηματίζοντας ξεχωριστούς κλάδους στην ευρεία πολυτομία που προκύπτει. Οι κοινοί κλάδοι που σχηματίζονται και στις 3 αναλύσεις (ML,MP,BI) είναι οι ακόλουθοι: 1. Ο κλάδος του είδους Τ. aegaeus που περιλαμβάνει απλοτύπους από τις Κυκλάδες και την Κρήτη. Μέσα σε αυτόν τον κλάδο ομαδοποιούνται και τα άτομα του είδους Τ. cavaticus. 2. Ο κλάδος που περιλαμβάνει τους πληθυσμούς του είδους T. aegaeus ο οποίος περιλαμβάνει τους απλοτύπους του ανατολικού Αιγαίου. 3. Ο κλάδος που περιλαμβάνει τους πληθυσμούς του T. palustris, οι οποίοι προέρχονται αποκλειστικά από την Πελοπόννησο. 4. Ο κυρίως κλάδος του T. squamuliger που περιλαμβάνει σχεδόν το σύνολο των πληθυσμών του είδους με εξάπλωση σε κεντρική και ανατολική Μακεδονία και Θράκη. 5. Ένας δεύτερος κλάδος του T. squamuliger ο οποίος περιλαμβάνει τρεις (3) πληθυσμούς από την ανατολική Μακεδονία και τη Θράκη καθώς και τον πληθυσμό από την κεντρική Εύβοια. 6. Ο κλάδος που περιλαμβάνει πληθυσμούς του T. n.sp. από δύο βραχονησίδες μεταξύ Αττικής και Εύβοιας (Νότιος Ευβοϊκός κόλπος). 7. Ο κλάδος που περιλαμβάνει πληθυσμούς του T. palustris από τη βόρεια Εύβοια και τη χερσόνησο της Μαγνησίας. 170

Αποτελέσματα 8. Ο κλάδος που περιλαμβάνει τους αντιπροσώπους του T. rathkii από το Salzburg της Αυστρίας. 9. Ο κλάδος που περιλαμβάνει πληθυσμούς του T. palustris, οι οποίοι προέρχονται από την ηπειρωτική δυτική Ελλάδα, και από περιοχές της Πελοποννήσου με μεγάλο υψόμετρο. Σε αυτόν τον κλάδο διαφοροποιούνται και οι πληθυσμοί του T. arcuatus που εντοπίζονται στα βορειοδυτικά σύνορα της χώρας (στα σύνορα με την Αλβανία). 10. Ο κλάδος που περιλαμβάνει πληθυσμούς του T. palustris, οι οποίοι προέρχονται αποκλειστικά από περιοχές της Πελοποννήσου. 11. Ο κλάδος του T. camerani με πληθυσμούς που προέρχονται από την Ιταλία, την Κέρκυρα και τη λίμνη Ζηρού (δυτική Ελλάδα). 12. Ο κλάδος που περιλαμβάνει τους πληθυσμούς του T.ratzeburgi από την Ιταλία και τη Σλοβενία. Ακολουθεί μια σύντομη περιγραφή της τοπολογίας του δένδρου της ML αναφορικά με τους κλάδους και τις μεταξύ τους σχέσεις (Εικόνα Γ17), ενώ μια πιο εκτενής ανάλυση γίνεται στο κεφάλαιο της Συζήτησης. Στο φυλογενετικό δέντρο που προέκυψε, παρατηρούνται οι προαναφερθέντες κλάδοι των αντιπροσώπων του γένους Trachelipus που αναλύθηκαν. Παρατηρείται ότι η μονοφυλετικότητα κάποιων κλάδων δεν εμφανίζει ισχυρή στατιστική υποστήριξη (τιμές bootstrap 75). Ο πρώτος κλάδος που αποκλίνει αποτελείται από τους απλοτύπους του είδους T. ratzeburgii (ενός είδους που δεν απαντάται στον ελληνικό χώρο). Οι υπόλοιποι πληθυσμοί (όλοι οι υπόλοιποι κλάδοι) διαμορφώνουν μια μονοφυλετική ομάδα με υψηλή στατιστική υποστήριξη στις αναλύσεις της Μέγιστης Πιθανοφάνειας και Μέγιστης Φειδωλότητας (τιμές bootstrap ML=100 και MP =100). Αντίθετα στην ανάλυση της Μπεϊσιανής Συμπερασματολογίας (Εικόνα Γ19) ο ίδιος κλάδος εμφανίζει χαμηλή στατιστική υποστήριξη (pp= 0,5). Ο επόμενος κλάδος που διαμορφώνεται, είναι αυτός του είδους T. camerani, που περιλαμβάνει πληθυσμούς από την Ιταλία, την Κέρκυρα και τη Λίμνη Ζηρού στη δυτική Ελλάδα, σχηματίζοντας ένα μονοφυλετικό κλάδο με υψηλή στατιστική υποστήριξη (τιμές bootstrap: ML=97/ MP=100, pp: BI=1). Ακολούθως, σχηματίζονται δύο ευρείες ομάδες οι οποίες ενδέχεται να 171

Αποτελέσματα είναι αδελφοί κλάδοι. Ωστόσο η στατιστική υποστήριξη της μεταξύ τους σχέσης είναι χαμηλή (τιμές bootstrap: ML=68/MP=66) και στην ανάλυση της ΒΙ οι εν λόγω κλάδοι εμφανίζονται ανεπίλυτοι σχηματίζοντας μια ευρεία πολυτομία (Εικόνα Γ19). Η μία ομάδα περιλαμβάνει πληθυσμούς του είδους T. palustris από την Πελοπόννησο και τη δυτική Ελλάδα, ενώ η δεύτερη ομάδα ενσωματώνει τους αντιπροσώπους των υπόλοιπων ειδών του γένους Trachelipus (T. aegaeus, T. squamuliger, T. n. sp., T. rathkii) καθώς και τους πληθυσμούς από τη βόρεια Εύβοια και τη χερσόνησο της Μαγνησίας, που αναγνωρίστηκαν ως αντιπρόσωποι του είδους T. palustris. Οι ρηχότεροι κλάδοι που σχηματίζονται - εντός των δύο ευρύτερων ομάδων που προαναφέρθηκαν- εμφανίζουν ικανοποιητικές τιμές στατιστικής υποστήριξης (τιμές bootstrap 75), και ο καθένας ενσωματώνει πληθυσμούς που εξαπλώνονται κατ εξοχήν στην ίδια γεωγραφική περιοχή. 172

Αποτελέσματα Εικόνα Γ17: κλαδόγραμμα στο οποίο απεικονίζονται οι φυλεγενετικές σχέσεις των απλοτύπων των ειδών του γένους Trachelipus όπως προέκυψαν από την ανάλυση ML και MP για τους τρεις γενετικούς τόπους (16S r RNA, COI, NaK ATPase). Στους εσωτερικούς κλάδους του δέντρου, οι αριθμοί αντιστοιχούν σε τιμές bootstrap (ML/MP) των αναλύσεων ML και MP αντίστοιχα. Μόνο τιμές 50% παρουσιάζονται. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. 173

Αποτελέσματα Εικόνα Γ18: Το πλήρες ανάπτυγμα του φυλογενετικού δέντρου όπως προέκυψε από τη συνδυασμένη ανάλυση όλων των γενετικών τόπων (16S rrna, COI, NaK ATPase) με τη χρήση της ανάλυσης της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML). Οι αριθμοί στους κλάδους αντιπροσωπεύουν τιμές bootstrap 50%. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. Οι κωδικοί κάθε πληθυσμού αναλύονται στον Πίνακα Γ7 και η γεωγραφική τους εξάπλωση απεικονίζεται στις Εικόνες Γ7 και Γ8. 174

Αποτελέσματα Εικόνα Γ19: Κλαδόγραμμα στο οποίο απεικονίζονται οι φυλογενετικές σχέσεις των απλοτύπων των ειδών του γένους Trachelipus όπως προέκυψαν από την ανάλυση BI και των τριών γενετικών τόπων. Στους εσωτερικούς κλάδους του δέντρου, οι αριθμοί αντιστοιχούν σε τιμές posterior probabilities (pp) της ανάλυσης BI. Μόνο τιμές pp 0.50 παρουσιάζονται. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. 175

Αποτελέσματα Εικόνα Γ20: Το πλήρες ανάπτυγμα του φυλογενετικού δέντρου που προέκυψε από τη συνδυασμένη ανάλυση όλων των γενετικών τόπων με τη χρήση της ανάλυσης της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML). Οι αριθμοί στους κλάδους αντιπροσωπεύουν τιμές bootstrap 50%. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. Οι κωδικοί κάθε πληθυσμού αναλύονται στον Πίνακα Γ7 και η γεωγραφική τους εξάπλωση απεικονίζεται στις Εικόνες Γ7 και Γ8. 176

Αποτελέσματα 2.4. Εκτίμηση χρόνων απόσχισης Ο έλεγχος του λόγου των πιθανοτήτων (Likelihood Ratio Test, LRT) απέρριψε την υπόθεση του σταθερού μοριακού ρολογιού για τους πληθυσμούς των ειδών Trachelipus για όλους τους μελετηθέντες γενετικούς τόπους (COI, 16S rrna και NaK ATPase). Τα αποτελέσματα των διαφορετικών υποθέσεων που εξετάστηκαν προκειμένου να υπολογιστούν οι χρόνοι απόσχισης των κλάδων παρατίθενται στον Πίνακα Γ11. Συνολικά εξετάστηκαν 12 διαφορετικά μοντέλα που το καθένα «έτρεξε» σε τέσσερις (4) ανεξάρτητες επαναλήψεις στο πρόγραμμα BEAST. Το χρονόγραμμα που προέκυψε από το πρόγραμμα BEAST και αντικατοπτρίζει το επικρατέστερο μοντέλο παρουσιάζεται στις Εικόνες Γ21 και Γ22. Οι προκαταρκτικές αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν με τα δεδομένα των πληθυσμών του Αιγαίου κατέδειξαν σαφώς τη χρονολογία απομόνωσης των νησιών του ανατολικού Αιγαίου (Ικαρία-ΙΚR και Σάμος-SAM) καθώς και τον αποχωρισμό της Κρήτης εντός της περιόδου σχηματισμού της Μεσαιγαιακής Τάφρου (12-9 mya). Ωστόσο, όταν στις αναλύσεις ενσωματώθηκαν όλοι οι πληθυσμοί των ειδών του γένους Trachelipus, τότε παρατηρήθηκε ασυμφωνία στην τοπολογία των κλάδων των απλοτύπων του T. aegaeus μεταξύ των διαφορετικών μεθόδων φυλογενετικής ανάλυσης που χρησιμοποιήθηκαν (Μέγιστη Πιθανοφάνεια, Μέγιστη Φειδωλότητα και Μπεϊσιανή Συμπερασματολογία). Οι απλότυποι του T. aegaeus είτε δεν ομαδοποιούνται σε ένα ευρύτερο κλάδο «του Αιγαίου» (Εικόνα Γ9, Γ13) είτε αποκλίνουν σε επιμέρους κλάδους δημιουργώντας πολυτομίες στο κλαδόγραμμα (Εικόνες Γ11, Γ15, Γ19). Ως εκ τούτου, προκειμένου να υπολογιστούν οι χρόνοι απόσχισης των εξελικτικών κλάδων δεν χρησιμοποιήθηκε ως σημείο βαθμονόμησης το γεωλογικό γεγονός της δημιουργίας της Μεσαιγαιακής Τάφρου, αλλά αξιοποιήθηκαν οι ρυθμοί 177

Αποτελέσματα νουκλεοτιδικής υποκατάστασης των Poulakakis and Sfenthourakis 2008 (COI = 1.56% 1.72%) και Held 2001 (16S rrna = ~0.14%). Στο χρονόγραμμα παρουσιάζονται οι φυλογενετικές σχέσεις και οι εκτιμώμενοι χρόνοι απόσχισης των εξελικτικών γραμμών μεταξύ των διαφορετικών πληθυσμών και ειδών του γένους Trachelipus, βάσει της επικρατέστερης υπόθεσης (Πίνακας Γ11). Το πλέον επικρατές σενάριο ήταν το FR2, όπως προέκυψε μετά τη σύγκριση όλων των υποθέσεων μεταξύ τους με τον υπολογισμό των «οριακών εκτιμητών πιθανοφάνειας» (MLEs), οι οποίοι υπολογίστηκαν με τις μεθόδους Path Sampling και Stepping Stone (Xie et al. 2011, Baele et al. 2012a,b, 2013). Στην υπόθεση FR2 η τοπολογία και η μονοφυλετικότητα των κλάδων δεν είχε οριστεί εκ των προτέρων (με εξαίρεση αυτών της Σάμου-Ικαρίας και της Κρήτης προκειμένου να εφαρμοστούν τα σημεία βαθμονόμησης), το μοντέλο που εφαρμόστηκε ήταν αυτό του Speciation: Birth-Death process και το μοριακό ρολόι που περιγράφει τον ρυθμό υποκατάστασης κάθε κλάδου ήταν το Uncorrelated Exponential Relaxed Clock. Οι χρόνοι απόσχισης που υπολογίστηκαν βάσει αυτού του σεναρίου καταδεικνύουν πως η διαφοροποίηση των κύριων γενεαλογικών γραμμών του γένους ξεκινά στο τέλος του Βουρδιγάλιου (20,44 15,97 mya). Ο παλαιότερος φυλογενετικός διαχωρισμός, περί τα 16,75 mya, που προσδιορίστηκε στην παρούσα διατριβή, χωρίζει τους αντιπροσώπους του γένους Trachelipus σε δύο ομάδες. Η μια ομάδα περιλαμβάνει τους αντιπροσώπους τους είδους T. squamuliger (με εξάπλωση τη Μακεδονία-Θράκη και κεντρική Ελλάδα) ενώ στη δεύτερη ομάδα ενσωματώνονται οι αντιπρόσωποι όλων των υπόλοιπων ειδών (T. aegaeus, T. camerani, T. palustris. T. cavaticus, T. arcuatus, T. rathkii, T. ratzeburgii). Εντός της δεύτερης ομάδας πληθυσμών δημιουργούνται δύο ευρείς κλάδοι οι οποίοι διαχωρίζονται κατά το Μέσο Μειόκαινο (Λάγγιο) στα 14,42 mya. Ο ένας κλάδος περιλαμβάνει τους πληθυσμούς που εξαπλώνονται γεωγραφικά στο Αιγαίο (Τ. aegaeus κλάδος J και Η, T. cavaticus κλάδος Ι και Τ. n.sp. κλάδος F) ενώ ο δεύτερος περιλαμβάνει τους πληθυσμούς που εξαπλώνονται στην Πελοπόννησο, την κεντρική και δυτική Ελλάδα (T. palustris κλάδοι Β, C και Τ. arcuatus εντός του κλάδου C), και την Κέρκυρα (Τ. camerani κλάδος A). 178

Αποτελέσματα Η διαφοροποίηση του είδους Τ. squamuliger (κλάδος K) ξεκινά περί τα 13,27 mya (Ύστερο Μειόκαινο, Σερραβάλιο). Η διαφοροποίηση στην ευρύτερη περιοχή του Αιγαίου ξεκινά περί τα 12,18 mya (Μέσο Μειόκαινο, Σερραβάλιο). Εντός αυτού του κλάδου οι πληθυσμοί του ανατολικού Αιγαίου (Ικαρία και Σάμος κλάδος Η) αποκλίνουν περί τα 10,49 mya και ακολουθεί ο αποχωρισμός της Κρήτης περί τα 9,15 mya (Ύστερο Μειόκαινο, Τορτόνιο). Το είδος T. camerani (κλάδος Α) αποχωρίζεται περί τα 12,16 mya και εν συνεχεία περί τα 10,13 mya αρχίζει η διαφοροποίηση του είδους T. palustris (κλάδοι Β, C, D). Ο κλάδος Β, που ενσωματώνει πληθυσμούς αποκλειστικά από την Πελοπόννησο αρχίζει να διαφοροποιείται περί τα 3,45 mya (Πλειόκαινο, Πιακένζιο). O κλάδος C που περιλαμβάνει τους πληθυσμούς από τις περιοχές της βόρειας-βορειοδυτικής Πελοποννήσου, κεντρικής και δυτικής Ελλάδας αποκλίνει κατά το Ύστερο Μειόκαινο, Τορτόνιο (8,62 mya) και τέλος ο κλάδος D με τους πληθυσμούς από τη βόρεια Εύβοια και τη χερσόνησο της Μαγνησίας αποχωρίζεται στα 5,4 mya (Ύστερο Μειόκαινο, Μεσσήνιο).. 179

ÌÕÁ Αποτελέσματα Εικόνα Γ21. Το χρονόγραμμα που προέκυψε από το πρόγραμμα BEAST στο οποίο παρουσιάζονται οι φυλογενετικές σχέσεις και οι εκτιμώμενοι χρόνοι απόσχισης των εξελικτικών γραμμών για το γένος Trachelipus με βάση το επικρατέστερο σενάριο FR2. Οι αριθμοί στους κλάδους αντιστοιχούν σε χρόνους υπολογισμένους σε εκατομμύρια χρόνια. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. 180

Αποτελέσματα Εικόνα Γ22. Το χρονόγραμμα που προέκυψε από το πρόγραμμα BEAST στο οποίο παρουσιάζονται οι φυλογενετικές σχέσεις και οι εκτιμώμενοι χρόνοι απόσχισης των εξελικτικών γραμμών για το γένος Trachelipus με βάση το επικρατέστερο σενάριο FR2. Οι αριθμοί στους κλάδους αντιστοιχούν σε χρόνους υπολογισμένους σε εκατομμύρια χρόνια. Οι διαφορετικοί χρωματισμοί απεικονίζουν τους κύριους κλάδους της φυλογένεσης. Οι κωδικοί των πληθυσμών αναλύονται στον Πίνακα Γ7 και η γεωγραφική τους προέλευση απεικονίζεται στις Εικόνες Γ7 και Γ8. 181