Μοριακή και φυτοπαθολογική διερεύνηση του ρυθμιστικού γονιδίου του δευτερογενούς μεταβολισμού VdVeA στο μύκητα Verticillium dahliae Ασκούμενη: Αθηνά Αντωνιάδη Διεξαγωγή Πρακτικής Άσκησης: Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας Υπεύθυνος Πρακτικής Άσκησης: Επ. Καθ. Δημήτριος Τσιτσιγιάννης Διάρκεια: από 01/03/2012 μέχρι 30/06/2012
Ο μύκητας Verticillium dahliae Σύνδρομο απότομου μαρασμού σε δένδρο ελιάς. Λιβανάτες 2011 Εφαρμογή ηλιοαπολύμανσης σε χωράφια καρπουζιού. Αχαΐα 2011 Εδαφογενές παθογόνο Προκαλεί την ασθένεια της Αδρομύκωσης Χαρακτηριστικά συμπτώματα: φύλλο σημαίας, μάρανση, επιναστία, χλώρωση, νέκρωση και φυλλόπτωση. Συνυπάρχουν καστανός μεταχρωματισμός αγγείων, νανισμός και ακολουθεί στο τέλος νέκρωση ολόκληρου του φυτού Εύρος ξενιστών: περισσότερα από 200 είδη ετήσιων φυτών και δενδρωδών καλλιεργειών, μεταξύ αυτών είναι η ελιά, φιστικιά, τομάτα, μελιτζάνα Δεν υπάρχει χημική αντιμετώπιση, μπορούν να ληφθούν μόνο προληπτικά μέτρα: Υγειές πολλαπλασιαστικό υλικό, Αποφυγή εγκατάστασης φυτείας σε εδάφη όπου καλλιεργήθηκαν για μεγάλο χρονικό διάστημα με ευπαθή φυτά Ηλιοαπολύμανση Αποφυγή άρδευσης με αυλάκια, λόγω μεταφοράς μολύσματος κ.α.
Βιολογικός κύκλος V. dahliae Ληθαργική φάση παρεμπόδιση βλάστησης μικροσκληρωτίων λόγω μυκόστασης ή μικροβιόστασης Παρασιτική φάση είσοδος από ρίζες και εξάπλωση Σαπροφυτική φάση νέκρωση και ξήρανση ξενιστή, σχηματισμός μικροσκληρωτίων Πηγή: The American Phytopathological Society Εικόνα από μικροσκόπιο 40x: Παρατηρούμε κονίδια και μυκηλιακές υφές του μύκητα V. dahliae
Το παθογόνο V. dahliae είναι εξαιρετικά ζημιογόνο στη χώρα μας αφού οι ξενιστές του αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος της ελληνικής παραγωγής. Η αδυναμία εφαρμογής ενός συμβατικού προγράμματος αντιμετώπισης έχει οδηγήσει στη μοριακή διερεύνηση των γονιδίων που εμπλέκονται στην παθογένεια και μολυσματικότητα του μύκητα Στην εργασία αυτή επικεντρωθήκαμε στο γονίδιο VdVeA, ορθόλογο γονίδιο του laea του Aspergillus nidulans
Δευτερογενής μεταβολισμός και η πρωτεΐνη VeA Δευτερογενείς μεταβολίτες μυκήτων: σχετίζονται με την ανάπτυξη σε σχέση με τον φωτισμό, τη σποροπαραγωγή, την παραγωγή τοξινών και τη σύνθεση ουσιών με ιδιαίτερο βιοτεχνολογικό και φαρμακευτικό ενδιαφέρον. Η πρωτεΐνη VeA: ρυθμιστής του δευτερογενούς μεταβολισμού στο γένος Aspergillus, Fusarium spp. και Botrytis cinerea. Το γονίδιο VeA προκαλεί διαφοροποίηση της ανάπτυξης του στελέχους σε σχέση με το φωτισμό, ελέγχει την αναπαραγωγή και παθογένεια των μυκήτων και ρυθμίζει την έκφραση πολλών γονιδίων του δευτερογενούς μεταβολισμού και την παραγωγή τοξινών, αντιβιοτικών και μυκηλιακών χρωστικών. a. b. Διαφοροποίηση ανάπτυξης μονόσπορης αποικίας στο Botrytis cinerea (a) και ανάπτυξης κονιδίων (b) μεταξύ άγριου στελέχους και μεταλλαγμένου ΔVeA, Qianqian Yang 2012 Σχηματματισμός κλειστοθηκίων στον Aspergillus nidulans. Εικόνες από το άγριο στέλεχος και το μετάλλαγμένο ΔVeA και διαφοροποίηση μεταξύ ημέρας και νύχτας, το κλειστοθήκιο περικυκλώνεται από τις βούλες. Meggan C. Laskowski-Peaka 2012
Στόχοι της μελέτης Η διερεύνηση της ύπαρξης αλληλεπίδρασης μεταξύ προϊόντων του δευτερογενούς μεταβολισμού και παθογένειας στο μύκητα Verticillium dahliae. Η απενεργοποίηση του γονιδίου VdVeA στο μύκητα V. dahliae Ο ρόλος του γονιδίου VdVeA στην παθογένεια διαφόρων ξενιστών Η μελέτη της μορφολογίας και φυσιολογίας των μεταλλαγμένων ΔVdVeA στελεχών
Τι πραγματοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της πρακτικής άσκησης: Μέρος της κατασκευής του πλασμιδιακού φορέα απενεργοποίησης του γονιδίου VdVeA Απενεργοποίηση και αντικατάσταση του γονιδίου VeA στο μύκητα Verticillium dahliae με γονίδιο που προσδίνει ανθεκτικότητα στη γενετισίνη Μόλυνση φυτών Αραβίδωψης με άγρια και μεταλλαγμένα ΔVdVeΑ στελέχη του μύκητα Verticillium dahliae
4η κλωνοποίηση: μεταφορά του pakaiii στον δυαδικό φορέα pgk02 Στο τελευταίο στάδιο της δημιουργίας κασέτας αντικατάστασης του γονιδίου VeA στο παθογόνο, το οποίο και πραγματοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της πρακτικής άσκησης, σχεδιάστηκαν απλοί εκκινητές με σκοπό την ενίσχυση με PCR περίπου 1000 βάσεων (base pairs) πριν το κωδικόνιο έναρξης και μετά το κωδικόνιο λήξης του γονιδίου αντίστοιχα. DveA-F1-XhoI για το κωδικόνιο έναρξης (GGTTCAGTGATCTCGAGGTGGCG) DveA-R2-XbaI για το κωδικόνιο λήξης (GACGCGCTTGGACAAAACAGTCTAGATCGA)
Συνέχεια: Χρησιμοποιήθηκε DNA από το pakaiii και pgk02 που είχε δημιουργηθεί προηγουμένως από το midiprep kit της Qiagen Ακολούθησαν δύο αντιδράσεις πέψεων με ένζυμα XhoI/XbaI της εταιρίας New England Biolabs σε τελικό όγκο 20μl μία για το κάθε στέλεχος Επωάστηκαν στους 37 C κατά τη διάρκεια της νύχτας Πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε πήγμα αγαρόζης 0.8% Εξαγωγή του πήγματος σύμφωνα με το πρωτόκολλο QIAquick Gel extraction kit Protocol (Qiagen) των επιθυμητών κομματιών DNA Πραγματοποιήθηκε έκλουση του DNA σε τελικό όγκο 40μl Ακολούθησε ηλεκτρόφορηση για ποσοτικοποίηση του DNA Αντίδραση συνένωσης του τμήματος DNA με τον φορέα (ligation) χρησιμοποιώντας το ένζυμα λιγάση (fermantas) σε αναλογία εισδοχή/φορέα 1/3 και 1/5 με τελικό όγκο αντίδρασης 30μl Επώαση στους 14 C κατά τη διάρκεια της νύχτας
Συνέχεια: Ακολούθησε μετασχηματισμός με εισαγωγή του ανασυνδιασμένου φορέα, που ονομάστηκε pakaiv, σε επιδεκτικά κύτταρα (competent cells) Έγινε επώαση των κυττάρων με υγρό θρεπτικό υπόστρωμα LB για 1h και στη συνέχεια μεταφορά σε τρυβλία με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα LB παρουσία αμπικιλλίνης Επωάστηκαν για 24h στους 37 C Από τις αποικίες που εμφανίζονται έγινε διαλογή και ακλούθησε DNA extraction με το πρωτόκολλο QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen) Έλεγχος της επιτυχημένης κλωνοποίησης έγινε με πέψη του DNA τους με τα περιοριστικά ένζυμα XhoI/EcoRV και ηλεκτροφόρηση που εμφάνισε το επιθυμητό μέγεθος DNA 1 2 3 4 Εμφάνιση αποικιών στα τριβλία με το στερεό θρεπτικό υπόστρωμα Εικόνα ηλεκτροφόρησης: 1. Φορέας pgk02, 2. pakaii, 3-4. Επιτυχώς μεταλλαγμένα στελέχη
Εισαγωγή του δυαδικού φορέα στο βακτήριο Agrobacterium tumefaciens Χρησιμοποιήθηκαν 50-100μl επιδεκτικών κυττάρων Α. tumefaciens τα οποία αναμίχθηκαν προσεκτικά με 1 ng δηλαδή περίπου 5μl του pakaiv 5 min στο υγρό άζωτο, 25 min στους 37 C, προσθήκη 1 ml υγρού θρεπτικού και επώαση για 3h στους 28 C και 250 rpm Επίστρωση σε τριβλία με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα παρουσία καναμικίνης Επώαση στους 28 C για δύο ημέρες
Συνέχεια: Από τις μετασχηματισμένες αποικίες που εμφανίστηκαν έγινε διαλογή και μεταφορά τους σε υγρή καλλιέργεια με θρεπτικό υπόστρωμα και αντιβιοτικά: ριφαμπικίνη και καναμικίνη Ακολούθησε εξαγωγή πλασμιδιακού DNA και επιβεβαίωση με κατάλληλους εκκινητές Ανάπτυξη αποικιών Agrobacterium στα τριβλία παρουσίας κατάλληλων αντιβιοτικών ουσιών
Μετασχηματισμός του μύκητα V. dahliae με χρήση του βακτηρίου Agrobacterium tumefaciens Για τη μεταφορά της κασέτας απενεργοποίησης σε διάφορες φυλές του μύκητα V. dahliae και τη διαγραφή του γονίδιου VdVeA μέσω διπλού γενετικού ανασυνδυασμού ακλούθησε πρωτόκολλο 6 ημερών όπου ο κλώνος του αγροβακτηρίου αναμίχτηκε με αιώρημα κονίδιων στελεχών του V. dahliae Ο ομόλογος ανασυνδυασμός πραγματοποιήθηκε σε τρία άγρια στελέχη του V. dahliae, το 25V, το 70V και σε στέλεχος που απομονώθηκε από ραπανάκι. Έγινε συγκαλλιέργεια πάνω σε μεμβράνες Hybond οι οποίες στο τέλος μεταφέρθηκαν σε τριβλία με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα παρουσία αντιβιοτικών: γενετισινη, σεφοταξαμη, μοξαλακταμη και F2DU και επωάστηκαν στους 28 C Μετά από 5 μέρες εμφανίστηκαν οι πρώτες αποικίες Έγινε διαλογή των αποικιών, μεταφορά σε ξεχωριστά τριβλία με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα Υλικά για την διεξαγωγή του πρωτοκόλλου κατά το πρώτο στάδιο της συγκαλλιέργειας Τριβλίο με μεμβράνες Hybond για την ανάπτυξη του μύκητα
Μετασχηματισμός του μύκητα V. dahliae με χρήση του βακτηρίου Agrobacterium tumefaciens Μυκήλια των μεταλλαγμένων στελεχών επώαστηκαν σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα SSN και ακολούθησε ανάπτυξη αυτών στους 25 C για 3-4 ημέρες. Ακολούθησε συγκομιδή μυκηλίου, λυοφυλίωση και εξαγωγή DNA Πραγματοποιήθηκε PCR με εσωτερικούς VeA εκκινιτές Ηλεκτροφόρηση που εμφάνισε το επιθυμητό μέγεθος DNA μόνο στα άγρια στελέχη Άγρια στελέχη Μεταλλαγμένα στελέχη Επιβεβαίωση της διαγραφής του γονιδίου μέσω γενετικού ανασυνδυασμού Ανάπτυξη μυκηλίου σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα για την χρήση του στην εξαγωγή DNA
Δοκιμές παθογένειας σε φυτά Arabidopsis thaliana Έγινε επιλογή μετασχηματισμένων ΔVdVeA στελεχών για κάθε φυλή (TAKA2.2-3 από το άγριο στέλεχος 25V, TAKA3.5-4 και ΤΑΚΑ3.2-1 από το άγριο στέλεχος 70V) Πραγματοποιήθηκαν μολύνσεις φυτών Arabidopsis thaliana Col-0 με ριζοπότισμα 10 ml/φυτό αιωρήματος κονιδίων του κάθε στελέχους με συγκέντρωση 10 6 κον/ml. Μολύνσεις Arabidopsis thaliana με τα ΔVdVeA και WT στελέχη για διάστημα 36 ημερών μετά την μόλυνση
Εξέλιξη(%) Ασθένειας Σχετική AUDPC Εξέλιξη(%) Ασθένειας Δοκιμές παθογένειας σε φυτά Arabidopsis thaliana Ακολούθησε καταγραφή της σοβαρότητας της ασθένειας και της σχετικής AUDPC όπου προκύπτει το συμπέρασμα ότι η μολυσματική ικανότητα των μεταλλαγμένων ΔVdVeA στελεχών μειώνεται στατιστικά σημαντικά συγκριτικά με το μάρτυρα. a a b b b Ημέρες μετά τη μόλυνση ΔVdVeA στελέχη Ημέρες μετά τη μόλυνση