Γενετική Ανθεκτικότητα στις Ασθένειες

Transcript

1 1 Γενετική Ανθεκτικότητα στις Ασθένειες Γενικά Αντικείμενο της άσκησης αυτής είναι να εξοικειωθούν οι φοιτητές με τον τρόπο που γίνεται η επιλογή φυτών για γενετική ανθεκτικότητα σε μια ή περισσότερες ασθένειες. Εικόνα 1. α) Συμπτώματα προσβολής από περονόσπορο α) σε ανθεκτική ποικιλία και β) σε ευπαθή ποικιλία αγγουριού, μια εβδομάδα μετά τη μόλυνση. Βασικές αρχές που ισχύουν για τις τεχνικές της επιλογής για ανθεκτικότητα στις ασθένειες : 1) Για να διακρίνουμε σε ένα πληθυσμό τα ανθεκτικά φυτά από τα ευπαθή είναι απαραίτητο να αναπτύξουμε την ασθένεια. Τα συμπτώματα της ασθένειας είναι εκείνα που μας υποδεικνύουν στην πράξη το επίπεδο της ανθεκτικότητας ή ευπάθειας ενός φυτού. 2) Για να γίνει σωστή διάκριση των ανθεκτικών φυτών πρέπει να δώσουμε στο φυτό τη δυνατότητα να εκδηλώσει το επίπεδο ανθεκτικότητας του υπό συνθήκες ευνοϊκές για την ανάπτυξη του παθογόνου. Οφείλουμε επομένως να εξασφαλίσουμε άριστες συνθήκες για την ανάπτυξη του παθογόνου κατά τη μόλυνση και την εκδήλωση των συμπτωμάτων. 3) Τα παθογόνα διαθέτουν συχνά περισσότερες από μία φυλές στους φυσικούς τους πληθυσμούς. Αυτό σημαίνει ότι μία ποικιλία που είναι ανθεκτική σε μία φυλή μπορεί να προσβληθεί από άλλες φυλές του ίδιου παθογόνου που προϋπάρχουν στη φύση. 4) Τα παθογόνα γενικά έχουν την ικανότητα να παρουσιάζουν γενετικές μεταλλαγές και να σπάνε την ανθεκτικότητα. Μια ποικιλία ανθεκτική μπορεί να παρουσιάσει κάποια στιγμή ευπάθεια, επειδή μετάλλαξε το παθογόνο και κατάφερε να ξεπεράσει την ανθεκτικότητα.

2 2 Εικόνα 2. α) Συμπτώματα προσβολής από περονόσπορο: α) σε ανθεκτική ποικιλία (υπερευαισθησία), β) σε ευπαθή ποικιλία αγγουριού, μέρες μετά τη μόλυνση από περονόσπορο. 5) Στις τεχνητές μολύνσεις χρησιμοποιούμε δείγματα παθογόνων (απομονώσεις) που συλλέγουμε από φυσικούς πληθυσμούς τους και στη συνέχεια τα διατηρούμε στο Εργαστήριο,. Τα προαιρετικά παράσιτα (τα διατηρούμε στο Εργαστήριο in vitro π.χ. σε θρεπτικά υποστρώματα, υδατικά διαλύματα κ.λπ.) μπορεί να χάσουν εύκολα τη μολυσματικότητά τους. Για να αποφύγουμε αυτό το πρόβλημα πρέπει να διατηρούμε το παθογόνο σε λήθαργο ή γενικά σε αδρανή μορφή (π.χ. διατήρηση σε υγρό άζωτο ή σε αποξηραμένους φυτικούς ιστούς κ.λπ.). Επίσης πρέπει να ανανεώνουμε το παθογόνο, να συλλέγουμε δηλαδή νέα δείγματα κατά τακτά χρονικά διαστήματα από τους φυσικούς πληθυσμούς για τις ανάγκες του πειράματος. Εικόνα 4. Ανθεκτική και ευπαθής ποικιλία αγγουριού στον περονόσπορο 30 μέρες μετά τη μόλυνση.

3 3 Εικόνα 4. α) Πάνω: Μόλυνση κοτυληδόνων αγγουριού με σταγόνα αιωρήματος σπορίων περονοσπόρου, β) Κάτω αριστερά: Συμπτώματα προσβολής από περονόσπορο σε κοτυληδόνες αγγουριού ανθεκτικής ποικιλίας και γ) Κάτω δεξιά: Συμπτώματα προσβολής από περονόσπορο σε κοτυληδόνες αγγουριού ευπαθούς ποικιλίας (μια εβδομάδα μετά την μόλυνση).

4 4 Άσκηση στο Εργαστήριο Αντικείμενο: Επιλογή φυτών αγγουριού για ανθεκτικότητα στο ωίδιο Σκοπός: Η εξοικείωση με την τεχνητή μόλυνση και την επιλογή ανθεκτικών φυτών Ξενιστής: Αγγουριά Παθογόνο:Ο μύκητας Podosphaera xanthii. Προκαλεί την ασθένεια ωίδιο. Συμπτώματα: Λευκή εξάνθηση στην πάνω και συχνά και στην κάτω επιφάνεια των φύλλων. Σε έντονες προσβολές η ανάπτυξη του μύκητα επεκτείνεται και στους μίσχους των φύλλων, στους πλάγιους βλαστούς, στο κεντρικό στέλεχος ή ακόμη και στους καρπούς. Ανθεκτικότητα: Γονίδια ανθεκτικότητας έχουν βρεθεί σε συλλογές γενετικού υλικού και έχουν ενσωματωθεί σε εμπορικές ποικιλίες. Ως προς την κληρονομικότητα θεωρείται ότι ελέγχεται από τρία διαφορετικά γονίδια με την ανθεκτικότητα σε υπολειπόμενη μορφή. Τρόποι αξιολόγησης των φυτών Δυο βασικές μέθοδοι τεχνητής μόλυνσης εφαρμόζονται συνήθως.: α) Η μόλυνση στο θερμοκήπιο με σκόνισμα των φύλλων β) Η μέθοδος με ροδέλες στο Εργαστήριο Εικόνα 5. α) Μόλυνση φυτών αγγουριού με σκόνισμα φύλλων μολυσμένων με ωίδιο β) Μόλυνση φυτών αγγουριού με ωίδιο, με ψεκασμό αιωρήματος σπορίων. Ανάπτυξη της ασθένειας α) Μόλυνση με σκόνισμα των φύλλων. Η τεχνητή μόλυνση των φυτών αγγουριού με ωίδιο είναι γενικά εύκολη. Τα φυτά που πρόκειται να αξιολογηθούν αναπτύσσονται συνήθως σε μικρά γλαστράκια στο

5 5 θερμοκήπιο (στάδιο 2-3 φύλλων). Η μόλυνση σε αυτό το στάδιο ανάπτυξης έχει το πλεονέκτημα ότι η όλη διαδικασία γίνεται χωρίς να χρειαστεί φύτεμα σε έδαφος (εξοικονόμηση χώρου, χρόνου, χρημάτων κλπ). Η μόλυνση σε νεαρά φύλλα πετυχαίνει συνήθως ευκολότερα, γι αυτό τα φυτά τα μολύνουμε στο πρώτο καλά αναπτυγμένο φύλλο του φυτού από την κορυφή. Η μόλυνση γίνεται με σκόνισμα δηλαδή τίναγμα των σπορίων του μύκητα από άλλα μολυσμένα φύλλα, στην πάνω επιφάνεια του φύλλου που θέλουμε να αξιολογήσουμε. Το τίναγμα του μολύσματος γίνεται με τη βοήθεια πινέλου ώστε να αποσπώνται τα σπόρια και να πέφτουν εύκολα. Τα νεαρά φυτά που μολύνουμε παραμένουν στο χώρο του θερμοκηπίου χωρίς ιδιαίτερη προφύλαξη. Απλά αποφεύγουμε το βρέξιμο του μολυσμένου φύλλου για να μην ξεπλυθεί το μόλυσμα. Μετά από 10 περίπου μέρες έχει αναπτυχθεί άφθονο ωίδιο στα ευπαθή φυτά και μπορεί να γίνει η αξιολόγηση τους. Η μέθοδος αυτή είναι αρκετά απλή στην εφαρμογή της και είναι κατάλληλη όταν οι συνθήκες του περιβάλλοντος (θερμοκρασία, υγρασία κλπ.) είναι ευνοϊκές για την ανάπτυξη της ασθένειας. Εικόνα 6. Ανθεκτικά (αριστερά) και ευπαθή (δεξιά) φυτά αγγουριού 10 μέρες μετά τη μόλυνση με αιώρημα σπορίων ωιδίου. β) Η μέθοδος με ροδέλες στο Εργαστήριο. Η μέθοδος αυτή αποφεύγει τα μειονεκτήματα της προηγούμενης μεθόδου διότι εξασφαλίζει: 1) Ελεγχόμενες συνθήκες στο χώρο της μόλυνσης (θάλαμο ανάπτυξης) που ρυθμίζονται στο άριστο επίπεδο για το παθογόνο. 2) Ομοιόμορφη έκθεση των φυτών στο παθογόνο διότι ελαχιστοποιείται η διακύμανση των συνθηκών του περιβάλλοντος.

6 6 Η τεχνική της μόλυνσης και αξιολόγησης με ροδέλες περιλαμβάνει τα εξής: Από κάθε φυτό του πληθυσμού που πρόκειται να αξιολογήσουμε επιλέγουμε ένα νεαρό φύλλο σχεδόν πλήρως αναπτυγμένο. Κόβουμε με διατρητήρα διαμέτρου 1,5 cm δύο δίσκους (ροδέλες) και τις τοποθετούμε σε πλαστικό σακουλάκι στην επιφάνεια του οποίου γράφουμε τον αριθμό του φυτού από το οποίο τις πήραμε.. Τα πλαστικά σακουλάκια τα φέρνουμε στο Εργαστήριο όπου πρόκειται να γίνει η μόλυνση με ωίδιο. Εκτός από τα φυτά που πρόκειται να αξιολογήσουμε παίρνουμε επίσης ροδέλες και από φυτά μάρτυρες, έναν ευπαθή και έναν ανθεκτικό. Οι μάρτυρες είναι ποικιλίες γνωστής ανθεκτικότητας και γνωστής ευπάθειας αντίστοιχα και μολύνονται πάντοτε μαζί με τα υπόλοιπα φυτά. Η χρησιμοποίηση τους αποτελεί μέτρο σύγκρισης για την αξιολόγηση των φυτών και ταυτόχρονα δείχνει αν η δοκιμή της μόλυνσης ήταν επιτυχής ή όχι. Για τη μόλυνση με ωίδιο χρησιμοποιούνται συνήθως πλαστικά τετράγωνα δοχεία (10Χ10Χ5 cm). Στο κάθε δοχείο βάζουμε αραιό διάλυμα γιββερελλικού οξέος (2 ppm). Η προσθήκη γιβερελλικού οξέος βοηθά να διατηρούνται οι ροδέλες σε καλή φυσιολογική δραστηριότητα κατά την περίοδο της μόλυνσης. Στην επιφάνεια του διαλύματος τοποθετούμε ένα αφρώδες πλαστικό και πάνω σε αυτό ένα σκληρό πλαστικό δίχτυ με μεγάλα κενά ώστε να χωράνε οι ροδέλες και να εφάπτονται του αφρώδους πλαστικού. Έτσι εξασφαλίζεται η διατήρηση των ροδελών στην επιφάνεια χωρίς να βουλιάζουν και συγχρόνως έρχονται σε επαφή με το υδατικό διάλυμα που περνά από τους πόρους του αφρώδους πλαστικού. Εξ άλλου το δίχτυ διατηρεί τις ροδέλες ακίνητες ώστε να μπορούμε να αναγνωρίζουμε την προέλευση τους δηλαδή το φυτό από το οποίο έχουν προέλθει. Για το λόγο αυτό κολλάμε σε κάθε δοχείο ετικέτα με σχεδιάγραμμα στο οποίο γράφουμε τους αριθμούς των φυτών από τα οποία προέρχονται οι αντίστοιχες ροδέλες. Η μόλυνση γίνεται με σπόρια από εξάνθηση του ωιδίου (κονίδια). Ως πηγή μολύσματος χρησιμοποιούνται ζωντανά φύλλα αγγουριού με άφθονη ανάπτυξη εξάνθησης. Συνήθως χρησιμοποιούμε μικρό πινέλο με το οποίο αποσπούμε το μόλυσμα από τα φύλλα για να πέσει πάνω στις ροδέλες. Μετά τη μόλυνση τοποθετούμε τα πλαστικά δοχεία σε θάλαμο ανάπτυξης φυτών υπό συνεχή φωτισμό και θερμοκρασία C. Για να διευκολυνθεί η βλάστηση των σπορίων του μύκητα καλύπτουμε το κάθε δοχείο με λεπτό πλαστικό για 24 ώρες ώστε να εξασφαλιστεί πολύ υψηλή σχετική υγρασία. Μία εβδομάδα μετά, έχει αναπτυχθεί το ωίδιο ( άφθονοι κονιδιοφόροι στην πάνω επιφάνεια στις ευπαθείς ροδέλες). Ανάλογα με την ένταση της προσβολής οι ροδέλες κατατάσσονται σε κατηγορίες σύμφωνα με την κλίμακα αξιολόγησης που αναφέρεται παρακάτω.

7 7 Διατήρηση που παθογόνου Το ωίδιο του αγγουριού, όπως όλα τα ωίδια, είναι υποχρεωτικό παράσιτο και επομένως διατηρείται μόνο σε ζωντανούς ιστούς. Για να εξασφαλίσουμε επομένως μόλυσμα για τις ανάγκες του πειράματος αξιολόγησης, διατηρούμε μόνιμα στο θερμοκήπιο μερικά φυτά αγγουριού από μια ευπαθή ποικιλία ώστε να αναπτύσσεται άφθονο ωίδιο. Υλικά: - Τετράγωνα πλαστικά δοχεία διαστάσεων 10Χ20Χ5 cm - Αφρώδες πλαστικό 9χ9 cm - Σκληρό πλαστικό δίχτυ 9χ9 cm με τετράγωνες τρύπες 1,5 cm - Διατρητήρας φύλλων 1,5 cm - Λαβίδες, πινέλα - Πλαστικά σακουλάκια και ετικέτες - Απιονισμένο νερό - Διάλυμα γιββερελλικού οξέος 2 ppm Διαδικασία Πρώτη Εβδομάδα: α) Προετοιμασία δοχείων Βάλτε στο πλαστικό δοχείο 300 κ.εκ. από το διάλυμα απιονισμένου νερού με γιββερελλικό οξύ. Η προσθήκη του γιββερελλικού οξέος βοηθά να διατηρηθούν οι ροδέλες σε καλή φυσιολογική κατάσταση μέχρι την ημέρα της αξιολόγησης. Τοποθετήστε στην επιφάνεια του διαλύματος ένα κομμάτι αφρώδες πλαστικό. Πάνω σ αυτό βάλτε ένα κομμάτι σκληρό πλαστικό δίχτυ. β) Ροδέλες. Πάρτε μαζί σας για το θερμοκήπιο ένα μικρό πλαστικό σακουλάκι για κάθε φυτό αγγουριού που θα αξιολογήσετε, το διατρητήρα, ένα μαρκαδόρο, ένα μικρό κομμάτι 10 x 10 περίπου χοντρό χαρτί και μια λαβίδα. Από νεαρό φύλλο σχεδόν πλήρως αναπτυγμένο, κόβετε δυο ροδέλες με το διατρητήρα και τις τοποθετείτε με τη λαβίδα μέσα στο πλαστικό σακουλάκι. Γράφουμε πάνω στο σακουλάκι τον αριθμό θερμοκηπίου του φυτού. Σε κάθε σακουλάκι βάζουμε τις ροδέλες ενός μόνο φυτού.

8 8 Κόψετε επίσης ροδέλες από ένα ανθεκτικό και ένα ευπαθές φυτό (μάρτυρες) και βάλτε τις σε χωριστά σακουλάκια Επιστροφή στο εργαστήριο. Σε κάθε πλαστικό δοχείο θα κολλήσετε απέξω μια ετικέτα στην οποία θα χαράξετε το σχέδιο που έχουν οι τρύπες του πλαστικού διχτυού. Τοποθετήστε τις δυο ροδέλες κάθε φυτού σε δυο συνεχόμενες θέσεις πάνω στο πλαστικό δίχτυ και πιέστε ελαφρά την περιφέρεια κάθε ροδέλας ώστε να έρχεται σε επαφή με το υδατικό διάλυμα. Το πλαστικό δίχτυ εξασφαλίζει τις ροδέλες να μένουν ακίνητες και να διαπιστώνουμε ανά πάσα στιγμή από ποιο φυτό έχουν προέλθει. Γράψε τον αριθμό θερμοκηπίου του φυτού στις αντίστοιχες θέσεις της ετικέτας. Έτσι ξέρετε από ποιό φυτό προέρχεται η κάθε ροδέλα. Σε κάθε δοχείο θα τοποθετήσετε δυο ροδέλες από τον ανθεκτικό και δυο από τον ευπαθή μάρτυρα. Μην ξεχάσετε να γράψετε τον αριθμό τους στην αντίστοιχη θέση της ετικέτας Πάρτε ένα φύλλο μολυσμένο με ωίδιο και ένα πινέλο για να μολύνετε τις ροδέλες ενός δοχείου. Ξύστε το μόλυσμα με το πινέλο ακριβώς πάνω από τις ροδέλες. Θα δείτε τη λευκή σκόνη που πέφτει και κάθεται στην επιφάνεια της ροδέλας. Προσπαθήστε να πέσει το μόλυσμα ομοιόμορφα σε όλες τις ροδέλες. Εικόνα 7. Μόλυνση με σκόνισμα σπορίων ωιδίου σε ροδέλλες φύλλων αγγουριού

9 9 Σκεπάστε με ένα λεπτό διαφανές πλαστικό το κάθε δοχείο και τοποθετήστε το προσεκτικά στο θάλαμο ανάπτυξης. (Η κάλυψη του δοχείου βοηθά να αυξηθεί η σχετική υγρασία και να πετύχει η μόλυνση.) Ρύθμιση του θαλάμου στους 21 ο C και φωτοπερίοδο 16 ώρες μέρα, 8 νύχτα. Μετά από 24 ώρες ξεσκεπάστε τα δοχεία Επειδή εξατμίζεται γρήγορα το νερό του διαλύματος, πρέπει να προσθέτετε νερό στο κάθε δοχείο το αργότερο κάθε 2 η μέρα. Προσοχή! Βάλτε νερό με τον υδροβολέα πολύ προσεκτικά ώστε να μη βραχούν οι ροδέλες. Το ωίδιο δεν πρόκειται να αναπτυχθεί εάν η επιφάνεια της ροδέλας είναι βρεγμένη. Δεύτερη Εβδομάδα Το ωίδιο έχει αναπτυχθεί στην πάνω επιφάνεια της ροδέλας. Η λευκή εξάνθηση περιλαμβάνει άφθονες καρποφορίες (κονιδιοφόρους) του μύκητα. Η ταξινόμηση της ανθεκτικότητας γίνεται με κλίμακα, ανάλογα με την επιφάνεια της ροδέλας που έχει καλυφθεί με εξάνθηση. Εικόνα 9. Ροδέλες αγγουριού μία εβδομάδα μετά τη μόλυνση με ωίδιο. Διακρίνεται η ανθεκτικότητα και η ευπάθεια από την ανάπτυξη εξάνθησης.

10 10 Κλίμακα Αξιολόγησης: 1, 3, 5, 7, 9 1. Άνοσο (κανένα σύμπτωμα) 3. Μεμονωμένοι κονιδιοφόροι 5. Αραιοί κονιδιοφόροι, αλλά και λίγες μικρές συστάδες 7. Κονιδιοφόροι σε συστάδες. Κάλυψη μεγάλου μέρους της επιφάνειας 9. Δασώδης ανάπτυξη των κονιδιοφόρων Για να είναι η ταξινόμηση ακριβής χρησιμοποιούμε το στερεοσκόπιο όπου φαίνονται στην επιφάνεια οι κονιδιοφόροι ως αλυσίδες των κονιδίων. Για την τελική ταξινόμηση των φυτών σε ευπαθή ή ανθεκτικά γίνεται σύγκριση της προσβολής τους με την προσβολή του ευπαθή και του ανθεκτικού μάρτυρα. Κανονικά ο ευπαθής μάρτυρας πρέπει να βαθμολογείται με 8-9 και ο ανθεκτικός με 1-3. Εάν οι μάρτυρες δεν δείξουν την αναμενόμενη βαθμολογία τότε η δοκιμή μας τίθεται σε αμφισβήτηση και πρέπει να επαναληφθεί.