Δοµή και ιδιότητες του DNA σε επίπεδο χρωµατίνηςνουκλεοσώµατος 09/04/2014 1
09/04/2014 2
Η καθαρά δοµική εικόνα της χρωµατίνης µας παρέχει µόνο µια στατική περιγραφή της. Δυναµική εικόνα της χρωµατίνης µπορούµε να αποκτήσουµε έµµεσα. Δυναµική εικόνα της χρωµατίνης είναι η διευθέτηση των νουκλεοσωµάτων σε τυχαίες ή ειδικές θέσεις στην αλληλουχία του DNA. Ο όρος: νουκλεόσωµα σε φάση (phased nucleosomes) περιγράφει συγκεκριµένη διευθέτηση των νουκλεοσωµάτων στο DNA. 09/04/2014 3
Η οργάνωση της χρωµατίνης είναι ελαστική για να καλύψει τις δοµικές και λειτουργικές της ανάγκες. Η χρωµατίνη από φωτογραφίες ΗΜ είναι γνωστό οτι εµφανίζεται ως ευχρωµατίνη (ενεργός χρωµατίνη) και ετεροχρωµατίνη (ανενεργός χρωµατίνη) 09/04/2014 4
Το µικροχρωµόσωµα του SV40, απλό παράδειγµα, περιέχει µια περιοχή χωρίς νουκλεοσώµατα. 09/04/2014 5
Πριν τη µεταγραφή, το γονίδιο URA3 διαθέτει κατά µήκος διατεταγµένα νουκλεοσώµατα. Όταν επάγεται η µεταγραφή, τα νουκλεοσώµατα βρίσκονται σε τυχαίες θέσεις. Όταν καταστέλλεται η µεταγραφή, τα νουκλεοσώµατα επανέρχονται στις ειδικές θέσεις τους. 09/04/2014 6
Η µηχανισµοί αποδόµησης (και όχι αποικοδόµησης) της χρωµατίνης, των νουκλεοσωµάτων, στόχο έχουν να αυξήσουν τη διαθεσιµότητα του DNA στις πρωτείνες που θα αναλάβουν την µεταγραφή και άρα τη γονιδιακή έκφραση. Αυτό επιτυγχάνεται: µέσω συµπλόκων αναδόµησης της χρωµατίνης χρησιµοποιώντας ATP (chromatin remodeling complexes) µέσω ενζυµικής (χηµικής) τροποποίησης των νουκλεοσωµάτων, µέσω τροποποίησης των ιστονών, µε στόχο την προγραµµατισµένη έκφραση/ αδρανοποίση γονιδίων ανταποκρινόµενη σε αναπτυξιακά και περιβαλλοντικά ερεθίσµατα-σήµατα. 09/04/2014 7
Τα συµπλόκα αναδόµησης της χρωµατίνη είναι σύµπλοκα πρωτεϊνικών υποµονάδων που χρησιµοποιούν ενέργεια (ATP) για να σπάσουν τη δοµή των νουκλεοσωµάτων ώστε να αυξηθεί η προσπελασιµότητα του DNA από µεταγραφικούς παράγοντες. Υπάρχουν πολλές οικογένειες τέτοιων συµπλόκων που η κάθε µια σχετίζεται µε οµάδες γονιδίων (άρα εξειδίκευση). 09/04/2014 8
Σύµπλοκο αναδόµησης ή αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης Το δυναµικό µοντέλο για τη µεταγραφή της χρωµατίνης προβλέπει τη δράση παραγόντων οι οποίοι χρησιµοποιούν την ενέργεια που παράγεται από την υδρόλυση του ATP για να εκτοπίσουν τα νουκλεοσώµατα από συγκεκριµένες περιοχές του DNA. 09/04/2014 9
Τα σύµπλοκα αναδιαµόρφωσης µπορούν να: προωθήσουν την ολίσθηση των νουκλεοσωµάτων κατά µήκος του DNA να εκτοπίσουν ολοκληρωτικά τα νουκλεοσώµατα από το DNA να αλλάξουν την απόσταση διαδοχικών νουκλεοσωµάτων. 09/04/2014 10
Ενζυµική (χηµική) τροποποίηση των νουκλεοσωµάτων µέσω τροποποίησης των ιστονών µε στόχο την προγραµµατισµένη έκφραση/αδρανοποίση γονιδίων ανταποκρινόµενη σε εξωτερικά σήµατα. Η ακετυλίωση των ιστονών ενεργοποιεί τη χρωµατίνη Η µεθυλίωση των ιστονών απενεργοποιεί τη χρωµατίνη. Η µεθυλίωση του DNA απενεργοποιεί τη χρωµατίνη. 09/04/2014 11
Τα σύµπλοκα που τροποποιούν τη δοµή της χρωµατίνης (ή την ενεργότητά της) φέρουν υποµονάδες στόχευσης που καθορίζουν τις θέσεις δράσης τους πάνω στο DNA, ενζυµικές υποµονάδες HAT ή HDAC που ακετυλιώνουν ή απακετυλιώνουν τις ιστόνες, καθώς και άλλες υποµονάδες που ασκούν επιπλέον επιδράσεις στη χρωµατίνη ή στο DNA. 09/04/2014 12
Οι περιοχές της περιοχές της χρωµατίνης που είναι ελεύθερες από νουκλεοσώµατα είναι γνωστές ως υπερευαίσθητες περιοχή στη δράση του ενζύµου DNase I και µε τον τρόπο αυτό µπορούµε να τις χαρτογραφήσουµε. Ποιές είναι οι περιοχές αυτές; Είναι οι περιοχές που αλληλεπιδρούν οι ιστόνες και οι παράγοντες µεταγραφής και σχετίζονται µε τη ρύθµιση της γονιδιακής ρύθµισης. 09/04/2014 13
Οι θέσεις εγκοπών βρίσκονται σε περιοδικά διαστήµατα κατά µήκος του πυρηνικού DNA, όπως φαίνεται από την πέψη αποµονωµένων κυτταρικών πυρήνων µε DNAάση Ι. Οι περισσότερο εκτεθειµένες θέσεις στο DNA εµφανίζονται µε µια περιοδικότητα που αντικατοπτρίζει τη δοµή της διπλής έλικας. Για απλότητα παρουσιάζονται οι εκτεθειµένες θέσεις µόνο της κόκκινης αλυσίδας. 09/04/2014 14
Η ανάλυση υψηλής διακριτικότητας δείχνει ότι κάθε θέση πέψης από την DNΑάση Ι αποτελείται από αρκετούς παρακείµενους φωσφοδιεστερικούς δεσµούς, όπως φαίνεται σε αυτό το παράδειγµα ανάλυσης των θέσεων S4 και S5, µε σήµανση των άκρων πυρηνικών σωµατίων. 09/04/2014 15
Κατά τη νουκλεοσωµική διάταξη, οι θέσεις περιορισµού εντοπίζονται σε σταθερή απόσταση από το συνδετικό DNA, το οποίο κόβεται από τη µικροκοκκική νουκλεάση. Με κόκκινο χρώµα φαίνεται η περιοχή όπου υβριδίζεται ο σηµασµένος ιχνηθέτης που χρησιµοποιείται για την ανάλυση κατά Southern, η οποία ακολουθεί την ηλεκτροφορητική ανάλυση των τµηµάτων. Μόνο όσα τµήµατα φέρουν την «κόκκινη» περιοχή µπορούν να παρατηρηθούν κατά την ανάλυση. Η εµφάνιση µόνο µίας ζώνης φανερώνει ότι σε όλα τα µόρια DNA τα νουκλεοσώµατα διατάσσονται µε τον ίδιο τρόπο (µη τυχαία διάταξη). 09/04/2014 16
Οι εγκοπές του δίκλωνου DNA αποκαλύπτονται από τα µονόκλωνα τµήµατα που προκύπτουν όταν µετουσιώνεται το DNA. Εάν το DNA σηµανθεί (λόγου χάρη) στα 5 άκρα του, µόνο τα 5 τµήµατα θα ανιχνεύονται µε αυτοραδιογραφία. Το µέγεθος των τµηµάτων προσδιορίζει την απόσταση της εγκοπής από το σηµασµένο άκρο. 09/04/2014 17
Με έµµεση επάκρια σήµανση προσδιορίζεται η απόσταση µιας υπερευαίσθητης σε DNΑάση-Ι θέσης από µια δεδοµένη θέση περιορισµού. Η ύπαρξη µίας συγκεκριµένης θέσης-στόχου για την DNΑάση-Ι παράγει ένα διακριτό τµήµα DNA, το µέγεθος του οποίου αντιστοιχεί στην απόσταση της υπερευαίσθητης σε DNΑάση-Ι θέσης από τη θέση περιορισµού. 09/04/2014 18
Η περιοχή χωρίς νουκλεοσώµατα του χρωµοσώµατος του SV40 περιλαµβάνει υπερευαίσθητες θέσεις, ευαίσθητες περιοχές και µια προστατευµένη περιοχή. Η υπερευαίσθητη θέση ενός γονιδίου β-σφαιρίνης στην κότα συνιστά µια περιοχή που είναι ευαίσθητη σε αρκετές νουκλεάσες. 09/04/2014 19
Η ευαισθησία στην DNΑάση Ι µπορεί να εκτιµηθεί προσδιορίζοντας το ρυθµό µε τον οποίο εξαφανίζεται υβριδοποιήσιµο υλικό. 09/04/2014 20
Στα ερυθροκύτταρα των ενηλίκων, το γονίδιο της β- σφαιρίνης είναι εξαιρετικά ευαίσθητο στην πέψη µε DNΑάση-Ι. Το ίδιο γονίδιο στα ερυθροκύτταρα των εµβρύων είναι µετρίως ευαίσθητο. Το γονίδιο της ωαλβουµίνης (το οποίο δεν είναι ενεργό) δεν είναι ευαίσθητο. 09/04/2014 21
Η επικράτεια των γονιδίων των σφαιρινών έχει υπερευαίσθητες θέσεις και στα δύο άκρα. Η οµάδα των θέσεων στο 5 άκρο αποτελεί την Locus Control Region και είναι θεµελιώδους σηµασίας για τη λειτουργία όλων των γονιδίων που βρίσκονται στην επικράτεια αυτή. 09/04/2014 22
09/04/2014 23
09/04/2014 24
09/04/2014 25
Η χαλάρωση της δοµής της χρωµατίνης είναι απαραίτητη για: Έκφραση γονιδίων Επιδιόρθωση βλαβών Συµπύκνωση χρωµοσωµάτων κατά την κυτταρική διαίρεση Πως επιτυγχάνεται η αναδιάπλαση της χρωµατίνης? 09/04/2014 26
Πως επιτυγχάνεται η αναδιάπλαση της χρωµατίνης? Η χρωµατίνη αναδιαπλάσεται µέσω επιγενετικών τροποποιήσεων 09/04/2014 27
Τι σηµαίνει επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωµατίνης 09/04/2014 28
Ποιές είναι οι επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωµατίνης 09/04/2014 29
Που γίνονται οι επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωµατίνης 09/04/2014 30
Οι επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών επιφέρουν αλλαγές στη δοµή της χρωµατίνης 09/04/2014 31
Ποιές είναι επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών του πυρήνα του νουκλεοσώµατος που επιφέρουν αλλαγές στη δοµή της χρωµατίνης 09/04/2014 32
09/04/2014 33
09/04/2014 34
Η ακετυλίωση που σχετίζεται µε την ενεργοποίηση της γονιδιακής έκφρασης πραγµατοποιείται µε άµεση τροποποίηση των ιστονών που συγκροτούν τα νουκλεοσώµατα. Η ακετυλίωση των ιστονών H3 και H4 σχετίζεται µε την ενεργή κατάσταση της χρωµατίνης. 09/04/2014 35
Πότε ακετυλιώνονται οι ιστόνες; Στη φάση της αντιγραφής, οι ιστόνες υφίστανται ακετυλίωση και πριν ενσωµατωθούν σε νουκλεοσώµατα. Μετά αποµακρύνονται οι ακετυλοµάδες 09/04/2014 36
Ακετυλίωση ιστονών 09/04/2014 37
Ακετυλίωση ιστονών 09/04/2014 38
Ακετυλίωση ιστονών 09/04/2014 39
Ακετυλίωση ιστονών 09/04/2014 40
Ο ρόλος της ακετυλίωση ιστονών 09/04/2014 41
Μεθυλίωση ιστονών 09/04/2014 42
Μεθυλίωση ιστονών 09/04/2014 43
Μεθυλίωση vs Αποµεθυλίωση ιστονών 09/04/2014 44
Πρωτείνες Μεταφορείς Μεθυλίων σε Ιστόνες 09/04/2014 45
Πρωτείνες Μεταφορείς Μεθυλίων σε Ιστόνες 09/04/2014 46
Σχηµατισµός ετεροχρωµατίνης 09/04/2014 47
Ο Ρόλος της Μεθυλίωση ιστονών 09/04/2014 48
Η ακετυλίωση λυσίνης και η φωσφορυλίωση σερίνης µειώνουν το συνολικό θετικό φορτίο µιας πρωτεΐνης. Αντίθετα, η µεθυλίωση ενισχύει την ηλεκτροθετικότητα της λυσίνης. 09/04/2014 49
09/04/2014 50
Μεθυλίωση του DNA 09/04/2014 51
Η τροποποίηση µεθυλίωση - των κυτιδινών είναι ένας παράγοντας που επηρεάζει-ρυθµίζει την µεταγραφική ενεργότητα. Πώς: Η µεθυλίωση της C σε ειδικές θέσεις του γονιδίου εµποδίζει την πρόσδεση παραγόντων µεταγραφής (transcription factors) Tα ήδη ενεργά γονίδια δεν µεθυλιώνονται: Στα ενεργά γονίδια δουλεύουν µια σειρά από πρωτείνες. Είναι πιθανόν αυτές οι πρωτείνες να εµποδίζουν να δράσουν τα ένζυµα µεθυλίωσης (DNA methylases). 09/04/2014 52
Μεθυλίωση του DNA 09/04/2014 53
Μεθυλίωση του DNA 09/04/2014 54
Μεθυλίωση του DNA 09/04/2014 55
O ρόλος της Μεθυλίωση του DNA 09/04/2014 56
Σύγκριση ευχρωµατίνης µε ετεροχρωµατίνη 09/04/2014 57
09/04/2014 58
09/04/2014 59
09/04/2014 60
09/04/2014 61