ρ. Θ. Σουρλίγκα Εργαστήριο Βιοχηµείας Ιστονών

Transcript

1 Ιστονικές Ποικιλοµορφίες και Μεταφραστικές Τροποποιήσεις των ιστονών: Βασικοί Παράγοντες για την Στερεοδιαµόρφωση της Χρωµατίνης κατά την Γήρανση και Απόπτωση ρ. Θ. Σουρλίγκα Εργαστήριο Βιοχηµείας Ιστονών

2 ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΣΤΗΝ ΣΤΕΡΕΟ ΙΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗΝ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΗΡΑΝΣΗ ΑΠΟΠΤΩΣΗ

3 ΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗΝ ΣΤΕΡΕΟ ΙΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΓΗΡΑΝΣΗ: Αναδιοργανώνεται η δοµή τηςχρωµατίνης. Αλλάζουν δυναµικά περιοχές της ετεροχρωµατίνης. ηλαδή γίνεται µια αναδιοργάνωση ευ- και ετερο-χρωµατινικών περιοχών. Σταδιακή µείωση του µήκους των τελοµερών. ΚΑΤA ΤΗΝ ΑΠΟΠΤΩΣΗ: Συµπύκνωση του DNA (αποπτωτικά σωµάτια) Κατακερµατισµός του DNA

4 REORGANIZATION OF EU- AND HETEROCHROMATIN DOMAINS

5

6 Fig. 1. Apoptotic changes. T-cells undergoing apoptosis in vitro and in the thymus after activation. A: Blebbing (left) and nuclear condensation (right). B: Oligonucleosomal DNA fragmentation in apoptotic T-cells is apparent in the right lane (left lane, DNA from untreated, viable cells).

7 Τι είναι όµως αυτές οι αλλαγές Μπορεί να είναι τοπικές για την µεταγραφή συγκεκριµένων γονιδίων Ή global εκτεταµένες αλλαγές όπως είδαµε πιο πάνω µε το παράδειγµα της γήρανσης και απόπτωσης

8 ΕΥΧΡΩΜΑΤΙΝΗ -EΤΕΡΟΧΡΩΜΑΤΙΝΗ ΕΝΕΡΓΗ ΑΝΕΝΕΡΓΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗ

9 Ετεροχρωµατίνη: Χρωµοσωµικές περιοχές που παραµένουν συµπυκνωµένες κατά την µεσόφαση Περιέχουν επαναλαµβανόµενες ακολουθίες DNA που είναι µεταγραφικά ανενεργείς και είναι εντοπισµένες κυρίως στα κεντροµερίδια και τα τελοµερή Μεταγράφονται αργά στο τέλος της S-φάσης και είναι πλούσιες σε Α-Τ ακολουθίες Βρίσκονται εντοπισµένες στην περιφέρεια του πυρήνα Έχουν διαφορετικό πρότυπο ακετυλίωσης, χαµηλή ακετυλίωση έως καθόλου (π.χ. ανενεργές Χ χρωµατόσωµα) Η µετατόπιση γονιδίου ενεργού στην περιοχή της ανενεργού ετεροχρωµατίνης συνεπάγεται απενεργοποίηση του ενεργού γονιδίου (φαινόµενα αποσιώπησης (silencing), φαινόµενο επίδρασης θέσης (position effect).

10 Ευχρωµατίνη Περιοχές χρωµατίνης που εµφανίζουν χαλαρή δοµή και περιλαµβάνουν µεταγραφόµενα γονίδια Χαρακτηρίζονται από θέσεις υπερευαίσθητες στην δράση της DNAασης Ι Η νουκλεοσωµατική τους σύσταση έχει ορισµένα χαρακτηριστικά που αφορούν σε ορισµένες ποικιλοµορφίες και µετα-µεταγραφικές τροποποιήσεις (ακετυλιώσεις, ουβικιτίνωση, κτλ.) Ενδιάµεσες µορφές (Facultative Heterochromatin) Περιοχές χρωµατίνης που δεν ανήκουν στην κατηγορία της κλασικής ετεροχρωµατίνης και περιέχουν γονίδια που δεν µεταγράφονται την δεδοµένη στιγµή, αλλά έχουν το δυναµικό να µεταγραφούν Οι περιοχές αυτές συχνά χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη υπερευαίσθητων σε DNAαση Ι θέσεων

11 ΜΕΤΑΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΙΣΤΟΝΩΝ ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗ ΙΣΤΟΝΩΝ ΕΝΑΡΞΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΟ ΠΡΟΤΥΠΟ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΙΚΩΝ ΠΟΙΚΙΛΟΜΟΡΦΙΩΝ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗΝ ΣΤΕΡΕΟ ΙΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ

12 Είναι µικρές βασικές πρωτείνες. Τι είναι οι ιστόνες? Υπάρχουν 5 τάξεις ιστονών: H2A, H2B, H3, H4 και Η1. Οι πρώτες 4 ανά 2 συνιστούν το οκταµερές του πυρήνα του νουκλεοσώµατος. Η Η1 βρίσκεται στο συνδέτη DNA µεταξύ των νουκλεοσωµάτων και σταθεροποιεί την είσοδο και έξοδο του DNA από τα νουκλεοσώµατα. Ολες έχουν διαειδικές ποικιλοµορφίες και εκτός από την Η4 οι υπόλοιπες έχουν και ενδοειδικές ποικιλοµορφίες. Οι ποικιλοµορφίες ή υπότυποι είναι ξεχωριστές πρωτείνες της κάθε τάξης (κωδικοποιούνται από µη αλληλόµορφα γονίδια), οι οποίες µπορεί να έχουν µεγάλη έως και πολύ µικρή οµολογία µεταξύ τους. ηλαδή µπορεί να έχουν λίγες έως και πολλές αµινο οξικές αντικαταστάσεις κυρίως στο καρβοξυλικό άκρο τους. Παρ ολα αυτά, εξελικτικά, θεωρούνται από τις πιο συντηρηµένες πρωτείνες.

13 Τα γονιδιά τους βρίσκονται σε πολλαπλά αντίγραφα. Η έκφραση διαφόρων ποικιλοµορφιών είναι προγραµµατισµένη κατά την ανάπτυξη, τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, την διαφοροποίηση, την κυτταρική γήρανση. Aποτελούν το κύριο κλάσµα των πρωτεινών της χρωµατίνης και πακετάρουν περίπου 2 µέτρα DNA σε συµπαγές δοµές έτσι ώστε να χωράει στον πυρήνα του κυττάρου.

14

15 Επίσης οι ιστόνες είναι µια οµάδα πρωτεινών που υπόκεινται στις περισσότερες µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις. Ακετυλιώση, φωσφορυλίωση, µεθυλίωση, ουβικιτίνωση και ADP-ριβοσυλίωση. Αυτές οι τροποποιήσεις λαµβάνουν χώρα σε συγκεκριµένα αµινο οξικά κατάλοιπα στα αµινοτερµατικά άκρα των ουρών των ιστονών του οκταµερούς, οι οποίες ουρές προεξέχουν από το νουκλεόσωµα. Σήµερα οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ αυτών των τροποποιήσεων, ονοµάζονται «ΙΣΤΟΝΙΚΟΣ ΚΩ ΙΚΑΣ» και ενδέχεται, µεταξύ άλλων, να ευθύνονται για λειτουργικές αλλαγές στην δοµή τηςχρωµατίνης.

16

17 ΜΕΓΑΛΗ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ ΝΟΥΚΛΕΟΣΩΜΑΤΩΝ Υπαρξη ποικιλοµορφιών ιστονών Υπαρξη µετα-µεταφραστικών τροποποιήσεων ιστονών

18

19 Συγκρότηση του Οκταµερούς

20 ΟΜΗ ΝΟΥΚΛΕΟΣΩΜΑΤΟΣ 1 ¾ στροφές DNA = 146 ζβ

21 Χρωµατόσωµα = ζβ = νουκλεόσωµα + συνδέτη DNA + H1 H H1 «σφραγίζει» 2 πλήρη στροφές DNA 1ος βαθµός Συµπύκνωσης = 10 nm ίνα

22 ASSEMBLY OF HIGHER-ORDER CHROMATIN STRUCTURES AND CHROMATIN CONDENSATION

23 Ποικιλοµορφίες Ιστονών του Πυρήνα του Νουκλεοσώµατος DNA εξαρτώµενες = συντίθενται κατά την S φάση (Major histone variants). Είναιοικύριοιυπότυποιτωνιστονών. εν έχουν εσώνια. εν είναι πολυαδενυλιοµένα στο 3 άκρο τους. Αντ αυτού έχουν µια εσωτερική δοµή θηλειάς. Τα γονίδια τους έχουν πολλαπλά αντίγραφα (10) βρίσκονται συγκεντρωµένα σε τουλάχιστον 2 οµάδες σε διαφορετικά χρωµοσώµατα. Είναι τα µοναδικά γονίδια που έχουν αυτά τα χαρακτηριστικά και αυτό για να γίνεται πολύ γρήγορα η σύνθεσή τους κατά τη S φάση ταυτόχρονα µε τοdna για την συγκρότηση των χρωµατίνης.

24 Η S-φάση εξαρτώµενες ποικιλοµορφίες των ιστονών του πυρήνα του νουκλεοσώµατος είναι: H2A.1 H2A.2 H3.1 H3.2 H2B.1 H2B.2 H4

25 Οι DNA µη-εξαρτώµενες ιστονικές ποικιλοµορφίες των ιστονών του πυρήνα του νουκλεοσώµατος συντίθενται σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου και το mrna τους δεν έχει κανένα από τα χαρακτηριστικά των κύριων ιστονικών µορφών. Είναι κανονικά mrna όπως έχουν όλες οι πρωτείνες γιατί η σύνθεση τους δεν είναι συντονισµένη µε την σύνθεση του DNA. Επίσης τα γονίδιά τους δεν είναι οµαδοποιηµένα. Ονοµάζονται βασικές ιστονικές ποικιλοµορφίες (basal histone variants) ή ιστονικές ποικιλοµορφίες αντικατάστασης (replacement variants) γιατί αντικαθιστούν τις κύριες µορφές κατά τις υπόλοιπες φάσεις του κκ.

26 Ποιος ο λόγος γι αυτές τις αντικαταστάσεις? Επιφέρουν αλλαγές στην στερεοδιαµόρφωση των νουλεοσωµάτων και κατά συνέπεια διευκολύνεται ο γονιδιακός ανα-προγραµµατισµός. Ηνουκλεοσωµική ετερογένεια που προκύπτει εξυπηρετεί τις διάφορες αλλαγές της κυτταρικής λειτουργίας κατά τις διάφορες βιολογικές διεργασίες όπως κατά την ανάπτυξη, διαφοροποίηση, γήρανση, απόπτωση.

27 H2A H2A.X H2A.Z MacroH2A H2ABbD H3 H3.3 CENH3

28

29

30 Οι ποικιλοµορφίες της Η1 Τάξης των Ιστονών του Συνδέτου DNA H1.1 H1.2 ΣΩΜΑΤΙΚΟΙ YΠΟΤΥΠΟΙ ΤΩΝ ΟΠΟΙΩΝ H1.3 Η ΣΥΝΘΕΣΗ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ H1.4 ΑΝΑ ΙΠΛΑΣΙΑΣΜΟ ΤΟΥ DNA H1.5 H1o ΥΠΟΤΥΠΟΣ ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ, ΣΥΝΤΙΘΕΤΑΙ ΣΕ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΦΑΣΕΙΣ ΤΟΥ Κ.Κ. Η1t, ιστόνη των σπερµατοκυττάρων

31

32 ΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΟΜΩΝ ΑΝΩΤΕΡΗΣ ΤΑΞΗΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΕΣ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΟΡΙΣΜΕΝΩΝ ΓΟΝΙ ΙΩΝ

33 Ενδιαφέρον παρουσιάζουν αποτελέσµατα από πρόσφατες µελέτες που υποδηλώνουν πως οι Η1 ιστόνες παίζουν ρόλο στην Γήρανση (γενικώς οι ιστόνες του συνδέτου σε µύκητες) Επιδιόρθωση του DNA (Η1.2 θηλαστικά) Απόπτωση (Η1.2 θηλαστικά) Από δουλειά του εργαστηρίου µας βρέθηκε πως ή έκφραση της Η1ο συσχετίζεται και µε την απόπτωση αλλά και µε την γήρανση

34

35

36

37

38

39

40 Global Genomic Repair Growth arrest p53 Local chromatin remodelling Transcriptional activation or repression of target genes Senescence Mitosis? Global chromatin condensation Apoptosis? Maintenance of normal cell ploidy

41 ΙΣΤΟΝΕΣ ΚΑΙ ΓΗΡΑΝΣΗ ΣΥΣΤHΜΑΤΑ ΓΗΡΑΝΣΗΣ: ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ IN VITRO ΓΗΡΑΝΣΗΣ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ EX VIVO/IN VITRO ΓΗΡΑΝΣΗΣ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΚΟΠΟΙ: ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΣΤΟ ΠΡΟΤΥΠΟ ΤΩΝ ΥΠΟΤΥΠΩΝ ΤΟΥ ΣΥΝ ΕΤΟΥ DNA ΜΕΣΚΟΠΟΝΑΣΥΝ ΕΘΟΥΝΜΕ ΠΑΡΑΤΗΡΟΥΜΕΝΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗ ΙΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΚΑΤA ΤΗΝ ΓΗΡΑΝΣΗ

42 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ H1o ΙΣΤΟΝΗ ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ ΒΑΣΙΚΟΙ ΛΟΓΟΙ: Χάρη στις βιοχηµικές της ιδιότητες έχει µια στενότερη σχέση µε κλειστές δοµές της χρωµατίνης (ευ- και ετεροχρωµατίνη) που όπως προανέφερα τέτοιες δοµές σχηµατίζονται και αναδιοργανώνονται κατά τη γήρανση. Επιπλέον είναι µια ιστονική ποικιλοµορφία που συσσωρεύεται κατά την τερµατική διαφοροποίηση. Η σχέσητηςµε τηνχρωµατίνη και µε κύτταρα που έχουν παύσει να διαιρούνται ενδέχεται να υποδηλώνει κάποιο ρυθµιστικό ρόλο. Η γήρανση έχει κάποια κοινά χαρακτηριστικά µε την τερµατική διαφοροποίηση. Και οι 2 διαδικασίες είναι γενετικά προγραµµατισµένες. Συµπεριλαµβάνουν την αποσιώπηση ορισµένων γονιδίων και την ενεργοποίηση άλλων.

43 ΣΥΣΤΗΜΑ:ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ Η1ο mrna LEVELS OF THE DIFFERENTIATION ASSOCIATED LINKER HISTONE VARIANT H1o

44 ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Η3 ΚΑΙ Η4, ΕΠΑΓΩΓΗ ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗΣ ΜΕ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΩΝ ΑΠΟΑΚΕΤΥΛΑΣΩΝ, ΕΠΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΙΣΤΟΝΗΣ Η1ο ΣΕ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΓΗΡΑΝΣΗΣ, ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΓΙΑΤΙ ΟΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΩΝ ΑΠΟΑΚΕΤΥΛΑΣΩΝ ΕΊΝΑΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΑ ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΣΤΗΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΑΝΑΛΟΓΑ ΜΕ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΠΑΓΟΥΝ ΤΗΝ ΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ, ΤΗΝ ΓΗΡΑΝΣΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΠΟΠΤΩΣΗ (ΓΙ ΑΥΤΌ ΤΟ ΛΟΓΟ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΚΑΙ ΩΣ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ) ΕΠΑΓΟΥΝ ΤΗΝ ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΙΣΤΟΝΗΣ Η1ο

45 ΛΕΜΦΟΚYΤΤΑΡΑ: ΜΕ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΩΝ ΑΠΟΑΚΕΤΥΛΑΣΩΝ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ ΕΧΟΥΜΕ ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ ΚΑΙ ΕΠΑΓΩΓΗ ΤΗΣ Η1ο ΚΑΘΩΣ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΣΗ

46 ΓΗΡΑΝΣΗ: ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΠΟ ΟΤΕΣ ΙΑΦΟΡΩΝ ΗΛΙΚΙΩΝ ---- ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ Η4 ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙ ΡΑΣΗ TSA ΠΡΟΤΥΠΟ ΑΚΕΤΥΛΙΩΣΗΣ Η4 ΣΕ ΥΟ ΗΛΙΚΙΕΣ absorbance H4.0 H4.1 H4.2 H4.3 H CONTROL YOUNG MID SENIOR ELDERLY NONACETYLATED H4.0 TETRA-ACETYLATED H4.4 ABSORBANCE CONTROL YOUNG MIDAGED SENIOR ELDERLY ABSORBANCE CONTROL YOUNG MIDAGED SENIOR ELDERLY

47 ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΑΠΟ ΟΤΕΣ ΙΑΦΟΡΩΝ ΗΛΙΚΙΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΙ ΡΑΣΗ TSA: ΕΠΑΓΩΓΗ ΤΗΣ Η1ο ΑΝΑΛΥΣΗ WESTERN THΣ Η1ο H1o H2B

48 H1 LINKER HISTONE FRACTION OF S-PHASE LYMPHOCYTES YOUNG DONOR MID-AGED DONOR

49 H1 LINKER HISTONE FRACTION OF S-PHASE LYMPHOCYTES SENIOR DONOR ELDERLY DONOR

50 ΕΥΡΗΜΑΤΑ: ΙΝΟΒΛΑΣΤΕΣ ΚΑΙ ΓΗΡΑΝΣΗ ΠΕΡΙΛΗΠΤΙΚΑ: Η έκφραση της ιστόνης Η1ο αυξάνεται σε γηρασµένους µεταµιτωτικούς πληθυσµούς ινοβλαστών τόσο στο επίπεδο της πρωτείνης όσο και στο επίπεδο του mrna ΕΥΡΗΜΑΤΑ: ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΓΗΡΑΝΣΗ ΠΕΡΙΛΗΠΤΙΚΑ: Ηεπαγώµενη συσσώρευση των ακετυλιώσεων των ιστονών και η έκφραση της Η1ο µετά από επίδραση µε αναστολείςτων αποακετυλασών των ιστονών, αυξάνουν σε συνάρτηση µε την αυξανόµενη ηλικία του δότη. Το πρότυπο των σωµατικών Η1 υποτύπων του συνδέτου DNA εµφανίζει σηµαντική διαφορά σε λεµφοκύτταρα υπερηλίκων και ηλικιωµένων ατόµων σε σχέση µε νεαράάτοµα

51 Συγκεκριµένα ταυτοποίηση της κορυφής έδειξε πως µειώνεται η pη1.4 και η ph1.5 κατά την γήρανση. Τι µπορεί να σηµαίνει αυτό? Αλλαγές στον κυτταρικό κύκλο κατά την γήρανση (λόγο αλλαγών επιπέδων φωσφορυλίωσης)? Ή / και αλλαγές στην αναδιοργάνωση της ετεροχρωµατίνης (λόγο Η1.4, Η1.5)? Ελπίζουµε µελλοντικές µελέτες να δώσουν κάποια απάντηση

52 ΕΠΙΣΗΣ: Μετά από επίδραση µε αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών, η επαγωγή της έκφρασης της Η1ο συνδέεται µε την επαγωγή της απόπτωσης σε λεµφοκύτταρα ανθρώπου.

53 Τέλος η pη2α.χ συνδέεταιµόνο µε τηναπόπτωση? Λεµφοκύτταρα από δότες αυξανόµενης ηλικίας 1,2 νέοι 3,4 µεσήλικες 5,6,7 ηλικιωµένοι 8 υπερήλικας