Медицинско одељење, Институт Хемофарм, Хемофарм АД, Вршац, Србија; 2. Србији као дијететски додатак у терапији

610 Srp Arh Celok Lek. 2011 Sep-Oct;139(9-10):610-618 DOI: 10.2298/SARH1110610C ОРИГИНАЛНИ РАД / ORIGINAL ARTICLE UDC: 612.34.086 Ефекат ферментационог производа јечма и пивског квасца обогаћеног хромом и његове комбинације са росиглитазоном на експериментално изазвану хипергликемију код мишева Влада Цекић 1, Велибор Васовић 2, Вида Јаковљевић 2, Душан Лалошевић 3, Иван Чапо 3, Момир Миков 2, Ана Сабо 2 1 Медицинско одељење, Институт Хемофарм, Хемофарм АД, Вршац, Србија; 2 Завод за фармакологију, токсикологију и клиничку фармакологију, Медицински факултет, Универзитет у Новом Саду, Нови Сад, Србија; 3 Катедра за хистологију и ембриологију, Медицински факултет, Универзитет у Новом Саду, Нови Сад, Србија КРАТАК САДРЖАЈ Увод По след њих го ди на све се че шће при ме њу ју биљ ни пре па ра ти у ле че њу осо ба обо ле лих од ше ћер не бо ле сти. Пре па рат на ба зи јеч ма и пив ског ква сца са до дат ком хро ма ре ги стро ван је у Србији као дијететски додатак у терапији дијабетеса тип 2. Циљ ра да Циљ ис тра жи ва ња био је да се ис пи та де ло ва ње фер мен та ци о ног про из во да јеч ма и пив ског ква сца обо га ће ног хро мом (BBCr), р осигл ит аз он а ( R) и њихо в е ко мб ин ац иј е ( BBCr+R) на гли ке ми ју код ми ше ва на та ште и по сле при ме не глу ко зе, адре на ли на и алок са на. М е т о д е р а д а Оглед не жи во ти ње су свр ста не у три гру пе: пр ва је при ми ла глу ко зу у до зи од 500 mg/kg, дру га адре на лин у до зи од 0,2 mg/kg, а тре ћа алок сан у до зи од 100 mg/kg. Гру пе су да ље поде ље не у под гру пе у за ви сно сти од при ме ње ног пре па ра та (BBCr: 750 mg/kg; R: 0,75 mg/kg; BBCr+R). Сва ка животиња је била сама се би кон тро ла у по гле ду гли ке ми је пре трет ма на, осим у тре ћој гру - пи, ко ја је има ла кон трол ну под гру пу жи во ти ња ко је су при ма ле пла це бо. Резултати BBCr је зна чај но сма њио гли ке ми ју на та ште и по сле оп те ре ће ња глу ко зом у од но су на вред но сти пре трет ма на (7,4±0,6 пре ма 9,2±0,6 mmol/l; p=0,01), док су R и BBCr+R сма њи ли гли кем и ј у п о с л е п р и м е н е а д р е н а л ин а у о д н о с у н а в р е д н о с т и п р е т р е т м а н а ( R: 8,6±1,8 пре ма 15,4±3,2 mmol/l; p=0,004; BBCr+R: 9,6±2,4 пре ма 15,0±4,4 mmol/l; p=0,04). Након примене алоксана гликемија је би ла зна чај но ма ња у под гру па ма ми ше ва ко ји су при ма ли BBCr, R и BBCr+R у од но су на контрол ну под гру пу (ре дом: 10,1±8,0 пре ма 6,8±2,7 пре ма 13,5±9,7 пре ма 24,5±4,7 mmol/l; p=0,001). За кљу чак Пре трет ман са BBCr код огледних животиња смањио је гликемију наташте и после опт е р е ћ ењ а гл укоз о м, д о к с у R и BBCr+R с м а њи л и гл и ке м и ј у п о с л е о п т е р е ћ е њ а а д р е н а л и н о м. Пр е - трет ман ис пи ти ва ним пре парати ма спре чио је раз вој екс пе ри менталног дијабе теса услед деј - ства алок са на, што је по твр ди ла и хи сто ло шка ана ли за тки ва пан кре а са ла бо ра то риј ских ми ше ва. Кључ не ре чи: екс тракт јеч ма и пив ског ква сца; ро си гли та зон; алок сан; ди ја бе тес; пан кре ас; хисто ло ги ја Correspondence to: Vlada CEKIĆ Prote Mateje 70 11000 Beograd Srbija vlada.cekic@yahoo.com УВОД Због изузетно великог повећања броја особа обо ле лих од ди ја бе те са, ова бо лест про глашена је епидемијом 21. века. Године 2000. реги стро ван је 171 ми лион љу ди обо ле лих од ди ја бе те са, а про це њу је се да ће их 2030. бити 366 ми ли о на [1]. Узрок то ме је по већање броја људи на планети, старење становништва, урбанизација, повећање преваленције гојазности и недовољна физичка активност. Због реакције преосетљивости на лекове и појаве очекиваних и неочекиваних нежељених дејстава лекова, последњих година све је веће интересовање за примену биљних препарата у лечењу болесника са дијабетесом. Екс пе ри мен тал на прет кли нич ка и клиничка истраживања препарата на бази јечма по ка за ла су да је чам има пре вен тив ни и те ра пиј ски ан ти ди ја бе тич ки по тен цијал [2]. Фер мен та ци о ни про из вод из јеч ма и пивског квасца обогаћен органски везаним хро мом (BBCr) ре ги стро ван је у Ре публици Србији као дијететски додатак у терапији дијабетеса тип 2. Активна компонента овог препарата је GLUT4. Терапијско дејство екстракта јечменог слада (енгл. malted bar ley ex tract MBE) на вредности гликемије, инсулинемије и друге биохемијске параме тре ис пи ти ва ли су Хонг (Hong) и Менг (Maeng) [3]. При ме на MBE до ве ла је до смање ња гли ке ми је за 30% без про ме не концен тра ци је ин су ли на. Ре зул та ти њи хо вог истраживања указују на то да је MBE по већао пре у зи ма ње глу ко зе у ће ли је ак ти вирањем механизама који не зависе од инсулина [3]. Један од механизама инсулин-независне стимулације преузимања глукозе у

Srp Arh Celok Lek. 2011;139(9-10):610-618 611 мишићне ћелије је активација аденозинмонофосфатпро те ин ки на зе (AMPK). До ак ти ва ци је AMPK до лази услед кон трак ци је ми ши ћа или фар ма ко ло шке акти ва ци је [4-7]. Сту ди ја V DF Fu tu re ce u ti cal s [8, 9] показала је да MBE повећава активност AMPK. Његови истраживачи су показали да екстракт пивског квасца (Saccharomyces cerevisiae) садржи активаторе AMPK и да постоји синергизам између екстракта јечма и пивског квасца у погледу повећања преузимања глукозе у ми шић не ће ли је [8, 9]. Ор ган ски ве за ни хром нор мализује пропустљивост ћелијских мембрана за глукозу, регулише биохемијске процесе њеног искоришћавања и депоновања у ћелијама и делује синергистички с инсулином [10]. Ти а зо ли дин ди о ни и би гва ни ди су је ди не две групе оралних антидијабетика који делимично остварују сво је те ра пиј ско деј ство пре ко ак ти ва ци је AMPK [5]. Ро си гли та зон (R) је орал ни ан ти ди ја бе тик из групе тиазолидиндиона. Делује као селективни агониста ну кле у сног PPAR-γ (енгл. peroxisome proliferator-activated receptor gamma), ко ји сту па у кон такт са ре ти ноид ним X-ре цеп то ром. На кон ве зи ва ња ро си гли та зона за PPAR-γ долази до активације инсулин-зависних ге на ко ји ре гу ли шу ме та бо ли зам угље них хи дра та и ли пи да. Ро си гли та зон ин хи би ра осло ба ђа ње не ко лико ади по ки на из ади по зних ће ли ја, као што су фак тор ту мор ске не кро зе ал фа (TNF-α), ин тер ле у кин 6 (IL-6) и ре зи стин, ко ји иза зи ва ју ре зи стен ци ју на ин су лин. У исто време росиглитазон повећава ослобађање адипонектина, који повећава осетљивост ткива на инсулин [5]. Главно дејство росиглитазона је повећање осетљивости мишићног, масног и ткива јетре на инсулин. Осим тога, росиглитазон смањује глуконеогенезу у јетри, по ве ћа ва екс пре си ју и тран сло ка ци ју глу ко зног тран спор те ра GLUT4 у масном ткиву и повећава експре си ју ге на укљу че них у ме та бо ли зам ма сних ки сели на у ади по ци ти ма [11]. У ис пи ти ва њи ма на жи воти ња ма са ди ја бе те сом тип 2 по ка за но је да ро си глитазон стимулише функцију бета ћелија панкреаса (повећава се маса острваца и садржај инсулина) и спречава хипергликемију. Росиглитазон не подстиче лучење инсулина и не изазива хипогликемију код лабораторијских животиња [11]. ЦИЉ РАДА Имајући у виду актуелност проблема шећерне болести, појаву тешких и понекад по живот опасних нежељених дејстава оралних антидијабетика и све чешћу примену по моћ них ле ко ви тих сред ста ва, циљ овог ра да био је да се испита утицај дијететског суплемента BBCr и ње го ве ком би на ци је са ро си гли та зо ном (BBCr+R) на гликемију наташте и хипергликемију узроковану применом глукозе, адреналина и алоксана код лабораторијских мишева, као и да се помоћу хистолошке анализе испита утицај дванаестодневног претретмана са BBCr, R и BBCr+R на Лангерхансова острвца панкреаса код мишева са дијабетесом изазваним алоксаном. МЕТОДЕ РАДА Лабораторијске животиње У истраживању су коришћени лабораторијски мишеви соја NMRI Haan, оба по ла, те ле сне ма се 17,6 46,2 грама и ста ри ји од три ме се ца. Жи во ти ње су има ле слободан приступ храни и води и дванаесточасовну смену светла и мрака. Протокол истраживања је одобрио Етички комитет Медицинског факултета Универзитета у Но вом Са ду. Ла бо ра то риј ске жи во ти ње су би ле под људском негом у складу с критеријумима Водича за негу и коришћење лабораторијских животиња [12]. Супстанце за изазивање хипергликемије За иза зи ва ње хи пер гли ке ми је код оглед них жи во тиња коришћени су анхидрирана глукоза (Merck-Darmstut), адре на лин-хи дро хло рид (Ју го ре ме ди ја, Зре њанин, Србија) и алоксан-монохидрат (Sig ma Che mi cals Co, St. Lo u is, MO, USA). Испитивани препарати BBCr је ферментациони производ јечма и пивског квасца с ор ган ски ве за ним хро мом (Hemofarm AD, Вршац, Србија). Активна компонента овог препарата је ин су лин ски сен зи тај зер GLUT4, ко ји у са ста ву та блете (1300 mg) уче ству је са 76,9% (1000 mg). Препарат је обо га ћен ор ган ски ве за ним хро мом у кон цен тра ци ји од 28,1±5 mg на 100 g. Помоћне супстанце су: манитол, скроб, лактоза, микрокристална целулоза, натријумстеарилфумарат, ацесулфам К, арома чоколаде и кафе. Ро си гли та зон (Gla xo Smit hkli ne, Ux brid ge, Uni ted Kingdom) је при ме њен у об ли ку филм-та бле те од 4 mg. Примењена је и комбинација BBCr и росиглитазона. Апарат за мерење гликемије Ни во ше ће ра у кр ви од ре ђи ван је по мо ћу апа ра та Ac cu-check (Hof fman La Roc he), применом тест-трака са специфичним ензимом глукозо-оксидаза. Концентрација глукозе је изражена у mmol/l. Поступак експерименталног рада Оглед не жи во ти ње су на су мич но свр ста не у три групе према начину изазивања хипергликемије. Прву групу чи ни ли су ми ше ви ко ји су при ма ли глу ко зу (500 mg/kg, p.o.), другу групу мишеви који су добијали адреналин (0,2 mg/kg, s.c.), а тре ћу ми ше ви ко ји су при мали алок сан (100 mg/kg, i.p.). Свака од наведених група даље је подељена у три подгрупе у зависности од приме ње ног пре па ра та (BBCr, R или BBCr+R). Пре па рат на ба зи јеч ма и пив ског ква сца (BBCr) да ван је у до зи www.srp-arh.rs

612 Цекић В. и сар. Ефекат BBCr и његове комбинације са росиглитазоном на експериментално изазвану хипергликемију код мишева од 750 mg/kg, а ро си гли та зон (R) у до зи од 0,75 mg/kg. Испитивани препарати су примењивани per os, оралном сон дом. У пр вој и дру гој гру пи жи во ти ње су саме себи биле контроле у погледу вредности гликемије пре третмана испитиваним супстанцама. Трећа група је имала контролну подгрупу коју су чинили лабораторијски мишеви који су примали само алоксан, а уместо испитиваних препарата добијали су плацебо у облику физиолошког раствора (1 ml/100 g, p.o.). До зе за ми ше ве би ле су из ра чу на те пре ма пре порученој дози за људе путем Кларкове (Clark) фор муле. Препоручена доза за људе за препарат на бази јечма и пив ског ква сца је 4000 mg днев но, а за ро си глитазон 4 mg дневно. Кларкова формула гласи: X = D/kg 3 Tt (човека) 3 Tt (животиње) где је X доза за огледну животињу, Tt телесна тежина, а D/kg до за за љу де. Пре почетка експеримента измерене су и забележене телесна маса мишева и вредности гликемије наташте. Након тога, животиње прве групе примиле су глукозу, а гликемија је измерена 30 минута касније. Животиње друге групе примиле су адреналин, а гликемија је измерена после 45 минута. Наредних седам дана животи ње пр ве и дру ге гру пе при ма ле су ис пи ти ва не препарате (BBCr, R и BBCr+R). По сле се дам да на трет мана, жи во ти ња ма пр ве и дру ге гру пе из ме ре на је гликемија наташте. Потом је урађен тест оптерећења глукозом (прва група), односно адреналином (друга група), те измерена гликемија после 30, односно 45 минута. Сви ми ше ви тре ће гру пе су то ком се дам да на до бијали испитиване препарате, осим контролне подгрупе, која је добијала физиолошки раствор. Седам дана касни је дат је алок сан у три до зе од по 100 mg/kg (7, 8. и 10. дана). Гликемија је мерена 24 часа након прве дозе и 48 ча со ва на кон дру ге, од но сно тре ће до зе алокса на. Трет ман ис пи ти ва ним пре па ра ти ма на ста вљен је до 12. дана, када су вредности гликемије указале на раз вој екс пе ри мен тал ног ди ја бе те са. Хистолошка анализа Хистолошка и имунохистохемијска обрада ткива Након жртвовања и обдукције животиња из треће групе, пан кре ас је био из дво јен у це ло сти, фик си ран у Бу а- новом (Bouin) фиксативу, дехидриран и калупљен у парапласт, те сечен на ротационом микротому марке Leica на 5 μm. Исечци су депарафинизовани и рехидрирани, након чега су испрани четири пута у пуферу (TBS, ph 7,4). Ради отклањања неспецифичног позадинског бојења, под утицајем ендогене пероксидазе, исечци су ин ку би ра ни 10-15 ми ну та у хи дро ген-пе рок сид блоку (Lab Vi sion, TA-015-HP), потом испрани четири пута у пуферу и инкубирани пет минута у ултра V бло ку (Lab Vi sion TA-015-UB). По испирању у пуферу примење но је при мар но ан ти те ло ин су лин Ab-6 (Lab Vi sion, INS04 + INS05) у тра ја њу од 30 ми ну та. Исеч ци су потом подвргнути третману појачивачем примарног антитела (Lab Vi sion, TL-015-PB) у тра ја њу од 20 ми ну та. Након испирања пуфером исечци су тридесет минута подвргнути HRP полимеру (Lab Vi sion, TL-015-PH). Визу е ли за ци ја је из вр ше на при ме ном AEC хромогрена (Lab Vi sion, TA-015-SA). Бо је ње и кон тра сти ра ње позадине урађено је применом Харисовог хематоксилина, а пре па ра ти су мон ти ра ни упо тре бом сред ства на воденој бази (Bio-Optica). Препарати су анализирани на микроскопу (Le i ca DM LB) и фотографисани (Le i ca DC 100) при уве ћа њу од 400 и 630 пу та. Морфометријска анализа Лангерхансових острваца Па жљи вом ре сек ци јом из дво јен је спле нич ни ре гион панкреаса за анализу следећих експерименталних подгрупа: здраве јединке, контролна подгрупа која је добијала алоксан и плацебо (III-плацебо), алоксан са претрет ма ном BBCr (III-BBCr), алок сан са пре трет маном ро сли гли та зо ном (III-R), алок сан са пре трет маном BBCr+R (III-BBCr+R). У сва кој под гру пи би ло је по шест је дин ки и од сва ке је узе то за ана ли зу пет несуседних пресека ткива поменутог региона. На сваком од пресека фотографисано је у просеку око пет Лангерхан со вих остр ва ца, што је укуп но 25 по је дин ки, односно 150 по подгрупи, тј. укупно 600 анализираних остр ва ца. При ме ном хи сто ло шког про гра ма Image J израчуната је површина Лангерхансовог острвца, као и број по зи тив них обо је них бе та-ће ли ја. Бро ја ње ћелија вршено је под имерзијом (увеличање од 1000 пута), ка ко би ре зул та ти би ли што пре ци зни ји, да би потом уследило фотографисање острвца и израчунавање ње го ве по вр ши не. Де ље њем бро ја ће ли ја и по вр ши не по сма тра ног острв ца из ра чу нат је про се чан број бета-ће ли ја по ква драт ном ми кро ме тру (μm 2 ) Лан герхансовог острвца. Статистичка анализа података За статистичку анализу података коришћен је Студентов t-тест за зависне узорке и једнофакторски тест анали зе ва ри јан се (ANOVA). Раз ли ка се сма тра ла ста тистички значајном уколико је вредност p би ла ма ња од 0,05. Резултати су приказани у виду средње вредности и стандардне девијације (X±SD), графички и табеларно. РЕЗУЛТАТИ Мерење гликемије У пр вој гру пи оглед них жи во ти ња (оп те ре ће ње глуко зом) сед мо днев ни трет ман са BBCr и BBCr+R статистички је значајно смањио гликемију наташте у односу на вредности пре третмана (p=0,04; p=0,03). Пре- doi: 10.2298/SARH1110610C

Srp Arh Celok Lek. 2011;139(9-10):610-618 613 Табела 1. Ефекат препарата на бази јечма и пивског квасца обогаћеног хромом (BBCr), росиглитазона (R) и њихове комбинације (BBCr+R) на хипергликемијски одговор мишева након оптерећења глукозом (прва група) Table 1. The effects of preparation based on barley and brewer s yeast extracts enriched with chromium (BBCr), rosiglitazone (R) and their combination (BBCr+R) on hyperglycaemic response to glucose load in mice (Group I) Препарат Preparation Број мишева Number of mice Наташте Fasting Гликемија (mmol/l) / Glycaemia (mmol/l) Пре третмана Before treatment Оптерећење глукозом Glucose load После седмодневног третмана After 7-day treatment Наташте Fasting Оптерећење глукозом Glucose load BBCr 6 8.2±1.1 9.2±0.6 7.1±0.8* 7.4±0.6** R 6 7.3±1.5 9.2±1.6 6.9±0.8 8.8±1.7 BBCr+R 6 8.0±1.6 8.2±1.3 6.7±1.2* 7.7±0.7 * p<0.05; ** p=0.01 Табела 2. Ефекат препарата на бази јечма и пивског квасца обога ће ног хромом (BBCr), росиглитазона (R) и њихове комбинације (BBCr+R) на хипергликемијски одговор мишева након оптерећења адреналином (друга група) Table 2. The effects of preparation based on barley and brewer s yeast extracts enriched with chromium (BBCr), rosiglitazone (R) and their combination (BBCr+R) on hyperglycaemic response to adrenalin load in mice (Group II) Препарат Preparation Број мишева Number of mice Наташте Fasting Гликемија (mmol/l) / Glycaemia (mmol/l) Пре третмана Before treatment Оптерећење адреналином Adrenalin load После седмодневног третмана After 7-day treatment Наташте Fasting Оптерећење адреналином Adrenalin load BBCr 6 7.1±0.8 15.1±2.6 6.6±0.5* 14.2±2.8 R 6 7.0±1.1 15.4±3.2 7.4±1.0 8.6±1.8** BBCr+R 6 6.5±0.9 15.0±4.4 7.0±0.3 9.6±2.4* * p<0.05; ** p<0.01 Табела 3. Утицај примене алоксана на телесну масу мишева (трећа група) Table 3. The effect of alloxan administration on body weight in mice (Group III) Препарат Preparation Број мишева Number of mice Пре алоксана Before alloxan Телесна маса (g) Body weight (g) После алоксана After alloxan BBCr 6 31.0±5.5 23.0±3.2* R 6 30.6±4.7 24.7±5.9* BBCr+R 6 29.3±4.8 25.1±4.2* Placebo 6 33.7±5.5 23.7±5.2* * p<0.01 парат BBCr значајно је смањио гликемију након оптере ће ња глу ко зом у по ре ђе њу с вред но сти ма пре третма на (p=0,01) (Табела 1). У дру гој гру пи оглед них жи во ти ња (оп те ре ће ње адреналином) BBCr је на кон сед мо днев ног трет ма на значајно смањио гликемију наташте у односу на вредно сти пре трет ма на (p=0,02). Препарати R и BBCr+R значајно су смањили гликемију након оптерећења адреналином у односу на вредности пре третмана (p=0,004; p=0,04). Осим тога, постојала је статистички значајна раз ли ка у гли ке ми ји по сле оп те ре ће ња адре на ли ном између подгрупа које су добијале R и BBCr+R и подгрупе која је добијала само BBCr (p=0,002) (Табела 2). Пре по чет ка екс пе ри мен та у тре ћој гру пи (при мена алоксана) није било варирања у телесној маси мишева у испитиваним подгрупама (p>0,05). На кон примене три дозе алоксана телесна маса огледних животиња се значајно смањила у све четири подгрупе, али без статистички значајне разлике (Табела 3). Након примене три дозе алоксана експериментални дијабетес се развио код мишева контролне групе која је при ма ла пла це бо (6,8±0,7 пре ма 24,5±4,7 mmol/l; p=0,0002). У подгрупама огледних животиња које су током 12 да на при ма ле BBCr (10,1±8,0 mmol/l), R (6,8±2,7 mmol/l) и BBCr+R (13,5±9,7 mmol/l) вредности гликемије након примене алоксана биле су статистички значајно мање у поређењу с контролном групом (p<0,05) (Графикон 1). Хистолошка анализа При ме ном иму но хи сто хе миј ског бо је ња код здра вих ми ше ва (без ди ја бе те са) ја сно се уоча ва ју цен трал но по зи ци о ни ра не бе та-ће ли је мар ки ра не цр ве ним применом AEC хромогена. У околини се јасно уочава руб ал фа-ће ли ја, ко је не по ка зу ју по зи тив ност при имунохистохемијском бојењу (Слика 1A). У гру пи огледних животиња које су примале само алоксан уочава се из ра зи ти гу би так бе та-ће ли ја, са 1-3 очу ва не бе та-ћели је уну тар Лан гер хан со вог острв ца. Оста так ће ли ја су углавном алфа-ћелије које луче глукагон и које, за разлику од бета-ћелија, нису осетљиве на оксидативни стрес иза зван алок са ном (Сли ка 1B). У све три експерименталне подгрупе које су пре излагања алоксану биле третиране препаратима BBCr, R и BBCr+R уочава се углав ном иста хи сто ло шка сли ка. Она се од ликује изразитом очуваношћу броја бета-ћелија, како у централним, тако и у периферним деловима Лангерхансовог острвца (Слике 1C, 1D и 1E). Ин тен зив ност пребојености хромогеном у испитиваним експерименталним подгрупама у односу на здраве јединке знатно је мања, што ипак указује на одређени степен губитка способности стварања инсулина од стране бета-ћелија које су биле изложене алоксану. www.srp-arh.rs

614 Цекић В. и сар. Ефекат BBCr и његове комбинације са росиглитазоном на експериментално изазвану хипергликемију код мишева Мор фо ме триј ска ана ли за ука зу је на из ра зи ту очуваност броја бета-ћелија у подгрупама мишева који су пре излагања алоксану добијали испитиване супстанце (III-BBCr, III-R, III-BBCr+R) у по ре ђе њу с оглед ним жи во ти ња ма кон трол не под гру пе (III-плацебо), које су при ма ле са мо алок сан. Број бе та-ће ли ја био је статистички значајно већи (p<0,001) у подгрупама које су при ма ле BBCr (0,004±0,0009/μ 2 ), R (0,002±0,0004/μ 2 ) и BBCr+R (0,003±0,0004/μ 2 ) у од но су на кон трол ну подгрупу (0,001±0,0001/μ 2 ). Примена самог препарата BBCr по ка за ла је ве ћи про тек тив ни ефе кат на бе та-ће ли је од примене самог росиглитазона, док је њихова комбинација повећала протективни ефекат росиглитазона (Графикон 2). ДИСКУСИЈА Прецизна контрола гликемије је кључни корак у превенцији компликација дијабетеса и побољшању квали те та жи во та осо ба с овом бо ле шћу. Иако су орални ан ти ди ја бе ти ци и ин су лин успе шни у ле че њу дијабетеса, њихова примена је често повезана с појавом тешких нежељених дејстава. Због тога је проналажење ефикаснијих и безбеднијих хипогликемијских супстанци и даље предмет многих истраживања. У овом ра ду је ис пи ти ва но хи по гли ке миј ско деј ство пре пара та BBCr код ла бо ра то риј ских ми ше ва с хи пер глике ми јом која је иза зва на при ме ном глу ко зе, адре налина и алоксана. A D B E C Слика 1. Хистолошке одлике Лангерхансових острваца панкреаса. По зитивно имунохистохемијско бојење на инсулин у бета-ћелијама код здравих јединки без дијабетеса (A; 400 ). Оштећење бета-ћелија иза звано алоксаном у подгрупи мишева који су примали само алоксан (B; 400 ). Слабије позитивно бојење AEC хромогеном инсулина уз видљи ву очуваност бета-ћелијске популације у подгрупама мишева који су примали BBCr (C; 400 ), росиглитазон (D, 630x) и комбинацију ових пре парата BBCr+R (E; 630 ) (Имунохистохемија, метода UltraVision Detection System Anti-Mouse, HRP/AEC). Figure 1. Histological features of pancreatic islets of Langerhans. Insulinpositive beta cells (red) as determined by immunohistochemical staining in nondiabetic mice (A; 400 ). Alloxan-induced beta-cell damage in the control subgroup that were treated only with alloxan (B; 400 ). Reduced insulin positive staining with AEC chromogen and evidently preserved beta-cell density in the subgroups that were pretreated with BBCr (C; 400 ), rosiglitazone (D; 630 ) and combination BBCr+R (E; 630 ) (Immunohistochemia, method UltraVision Detection System Anti-Mouse, HRP/AEC). doi: 10.2298/SARH1110610C

Srp Arh Celok Lek. 2011;139(9-10):610-618 615 30.00 25.00 III-BBCr III-R 24.52±4.70 III-BBCr+R Гликемија (mmol/l) Glycemia (mmol/l) 20.00 15.00 10.00 III-placebo * p<0.05 10.11±7.98* 13.53±9.71* 5.00 6.29±1.61 6.33±1.28 5.44±0.65 6.75±0.72 6.79±2.70* 0.00 Пре алоксана Before alloxan После алоксана After alloxan Графикон 1. Дејство препарата на бази јечма и пивског квасца обогаћеног хромом (BBCr), росиглитазона (R) и њихове комбинације (BBCr+R) на хипергликемијски одговор мишева након примене три дозе алоксана (после 12 дана третмана) Graph 1. The effects of preparation based on barley and brewer s yeast extracts enriched with chromium (BBCr), rosiglitazone (R) and their combination (BBCr+R) on hyperglycaemic response to three doses of alloxan in mice (after 12-day treatment) 0.006 0.005 0.005±0.0001 *p<0.001 0.004 0.004±0.0009* 0.003 0.002 0.002±0.0004* 0.003±0.0004* 0.001 0.001±0.0001 0.000 Контролна група Control group III-placebo III-BBCr III-R III-BBCr+R Графикон 2. Морфометријска анализа густине бета-ћелија по квадратном микрометру (μm 2 ) Лангерхансовог острвца Graph 2. Morphometric analysis of beta-cell density per μm 2 of islet of Langerhans BBCr је након седмодневне примене значајно смањио гликемију наташте у првој и другој групи огледних животиња у односу на вредности пре третмана. Сличне резултате у свом истраживању добили су Миљковић и Пјет жков ски (Pi e trz kow ski) [9], где је пре па рат на бази екстракта јечма након једномесечне примене смањио гликемију код мишева наташте за око 12%. Након сед мо днев ног трет ма на ро си гли та зо ном (R) гликемија наташте није се значајно променила у односу на вред но сти пре трет ма на у пр вој и дру гој ис пи тива ној гру пи ми ше ва. Ови ре зул та ти су у скла ду с његовим механизмом деловања. Наиме, росиглитазон не стимулише лучење инсулина и не изазива хипогликемију код лабораторијских животиња [11]. Седмодневна при ме на BBCr+R до ве ла је до зна чај ног сма ње ња гликемије наташте у првој групи, али није утицала на вредности гликемије наташте у другој групи мишева. Има ју ћи у ви ду то да је оп те ре ће ње глу ко зом, од носно адреналином вршено после мерења гликемије ната ште, вред но сти гли ке ми је на та ште у ове две гру пе могу да се сумирају (I-BBCr+R + II-BBCr+R; n=12). Доби је ни по да ци по ка зу ју да сед мо днев ни трет ман комбинацијом BBCr+R не ме ња зна чај но вред но сти гликемије наташте (7,2±1,5 према 6,9±0,9 mmol/l; p>0,05). Тест оптерећења глукозом у првој групи лабораторијских мишева је показао да је гликемија била значајно мања после седам дана примене BBCr (p=0,01). Претретман препаратом R ни је ути цао на вред но сти гликемије после оптерећења глукозом, док је претретман са BBCr+R показао тенденцију смањења гликемије након оптерећења глукозом, али разлика није била статистички значајна. У истраживању Миљковића и Пјет- www.srp-arh.rs

616 Цекић В. и сар. Ефекат BBCr и његове комбинације са росиглитазоном на експериментално изазвану хипергликемију код мишева жков ског [9] утвр ђе но је да пре па рат на ба зи екс трак та јечма након једномесечне примене смањује постпрандијалну гликемију за 13%. Аутори су претпоставили да у основи деловања препарата BBCr лежи његова сличност са AICAR (5-аминоимидазол-4-карбоксамид-1-β- D-рибофуранозид), који је познати активатор AMPK. Иако је познато да активирана AMPK до во ди до по већања преузимања глукозе у мишићне ћелије, сигнални пу те ви ко ји су за то од го вор ни и да ље су пред мет испитивања. Сматра се да активирана AMPK повећава преузимање глукозе повећањем броја GLUT4 на ћелијској мембрани на инсулин-независни начин [7, 13, 14, 15]. Транслокацији везикула са GLUT4 индукованој с AMPK претходи фосфорилација протеина AS-160 на Thr 642, који ослобађа ове везикуле из унутарћелијских де поа [5]. Осим то га, AMPK повећава експресију гена који кодирају GLUT4 и хексокиназу II и под стиче синтезу гликогена у мишићима [5]. У дру гој гру пи оглед них жи во ти ња сед мо днев ни пре трет ман пре па ра том BBCr ни је иза звао зна чај ну про ме ну гли ке ми је по сле оп те ре ће ња адре на ли ном у од но су на вред но сти пре трет ма на. За раз ли ку од BBCr, третман росиглитазоном значајно је смањио пораст гликемије након примене адреналина у поређењу с вредностима пре третмана (p=0,004). Осим то га, у подгрупи мишева који су примали росиглитазон вредно сти гли ке ми је по сле оп те ре ће ња адре на ли ном биле су статистички значајно мање него у подгрупи мише ва ко ји су би ли тре ти ра ни са BBCr (p=0,002). Ово деловање росиглитазона може се објаснити његовим дејством на смањење глуконеогенезе у јетри и повећањем осетљивости периферних ткива на инсулин [11]. Ро си гли та зон по ве ћа ва лу че ње ади по нек ти на из масног тки ва код љу ди и код гло да ра, док ади по нек тин сти му ли ше пре у зи ма ње глу ко зе и ок си да ци ју ма сних киселина у скелетним мишићима и инхибира глуконеогенезу у јетри преко активације AMPK [5]. Гликемија после оптерећења адреналином у подгрупи која је била третирана комбинацијом BBCr+R би ла је зна чај но мања у поређењу с вредностима пре третмана (p=0,04) и вред но сти ма ко је су за бе ле же не у под гру пи ми шева ко ји су при ма ли са мо BBCr (p=0,002). На ме ће се закључак да је претретман комбинацијом BBCr+R ефикаснији у смањењу гликемије након оптерећења адреналином у односу на примену само препарата BBCr. Алоксан је бета-цитотоксин који се користи за изазивање експерименталног дијабетеса код лабораторијских животиња. Цитотоксично дејство алоксана и његових метаболита састоји се од стварања радикала супероксида у редукционом циклусу. Радикали супероксида подлежу дисмутацији до водоник-пероксида. Након тога формирају се високореактивни хидроксилни радикали у Фентоновој реакцији. Реактивни продукти кисеоника и огроман пораст концентрације калцијума у цитосолу доводе до веома брзог уништавања бетаћелија панкреаса [16]. После примене алоксана у свим испитиваним подгрупама дошло је до значајног смањења телесне масе мишева. Експериментални дијабетес је иза зван код жи во ти ња кон трол не гру пе, где су вредности гликемије после давања алоксана биле значајно ве ће не го пре ње го ве при ме не (p=0,0002). Ме ђу тим, до развоја експерименталног дијабетеса није дошло у под гру па ма жи во ти ња ко је су при ма ле BBCr (p>0,05), R (p>0,05) и BBCr+R (p=0,05). Вред но сти гли ке ми је у овим подгрупама биле су статистички значајно мање од вред но сти из ме ре них у кон трол ној гру пи ми шева (p=0,001). Последња истраживања показују да тиазолидиндиони повећавају експресију супероксид-дисмутазе 2 (SOD2) и хинон-оксидоредуктазе 1 (NQO1), чи ме обез бе ђу ју ефи ка сну ан ти ок си дант ну за шти ту од по ви ше ног ни воа ре ак тив них ра ди ка ла ки се о ника [5]. Може се претпоставити да је дејство росиглитазона антагонизовало токсично дејство алоксана на бета-ћелије панкреаса. Поред тога, вероватно су своје место имала и друга дејства росиглитазона, као што је повећање осетљивости рецептора на инсулин у масном, ми шић ном тки ву и је три. Препарат BBCr повећава преузимање глукозе у ћелије које не зависи од инсулина. У истраживању Хонга и Менга [3] проучавано је деловање екстракта јечма у до зи од 62,5 mg/kg током 12 недеља на гликемију, инсулинемију и друге биохемијске параметре код мишева са генетским дијабетесом. Резултати су показали статистички значајно смањење нивоа гликозилира ног хе мо гло би на (HbA1c) и гли ке ми је у по ре ђе њу с кон трол ном гру пом. Ове ре зул та те су по твр ди ли и немачки истраживачи који су показали да дуготрајна примена протеина јечма и пшенице смањује инциденцију аутоимуног дијабетеса [17]. Међутим, постоји и дру го ми шље ње ко је глав ну уло гу да је хро му. Сма тра се да хром убр за ва ка ска ду уну тар ће лиј ских фос форилација и активацију ензима након везивања инсулина за инсулинске рецепторе и повећава експресију ре цеп то ра GLUT4 на по вр ши ни ће лиј ске мем бране [10, 18, 19]. Има ју ћи у ви ду то да је пре па рат BBCr обогаћен органски везаним хромом (28±5%), повећано је дејство на транслокацију и експресију рецептора GLUT4 на ћелијској мембрани, а тиме и преузимање глу ко зе, што је у скла ду с ре зул та ти ма на шег истраживања. При ме ном иму но хи сто хе миј ског бо је ња ја сно се морфолошки указало на оштећења која узрокује примена алоксана, као и на централну позиционираност бе та-ће ли ја и пе ри фер ну по ста вље ност ал фа-ће ли ја код здра вих је дин ки. Алок сан до во ди до прак тич но потпуног губитка бета-ћелија и развоја експерименталног дијабетеса. Претретманом испитиваним супстанца ма ја сно се уоча ва њи хов за штит ни ефе кат ко ји се огледа у већем броју сачуваних бета-ћелија. Ипак, смањен ин тен зи тет пре бо је но сти AEC хро мо ге ном ових ћелија указује на њихову смањену способност стварања инсулина. Механизам којим долази до очуваности бета-ћелија могао би да се објасни њиховим потенцијалним антиоксидантним ефектом, с обзиром на то да алоксан изазива изразити оксидативни стрес, нарочито у бета-ћелијама. doi: 10.2298/SARH1110610C

Srp Arh Celok Lek. 2011;139(9-10):610-618 617 ЗАКЉУЧАК Седмодневна примена препарата на бази екстракта јечма и пив ског ква сца (BBCr) значајно је смањила гликемију наташте и гликемију после оптерећења глукозом код лабораторијских мишева, а примена росиглитазона (R) и њихове комбинације (BBCr+R) зна чај но је смањила гликемију после оптерећења адреналином. Двана е сто днев на при ме на свих ис пи ти ва них пре па ра та спречила је код огледних животиња развој дијабетеса изазваног алоксаном. Морфометријска анализа Лангер хан со вих остр ва ца по ка за ла је да два на е сто дневни пре трет ман овим пре па ра ти ма шти ти бе та-ће ли је панкреаса од токсичног дејства алоксана. НАПОМЕНЕ Рад је део ма ги стар ске те зе пр вог ауто ра под на зи вом Ефикасност хипогликемика са деловањем на GLUT-4 рецепторе у експерименталном моделу на огледним животињама, ко ја је од бра ње на 2008. године на Медицинском факултету Универзитета у Новом Саду. Истраживања приказана у овом раду финансирана су средствима научноистраживачког пројекта број 41012 Министарства просвете и науке Републике Србије. ЛИТЕРАТУРА 1. Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 2004; 27(5):1047-53. 2. Bailey CJ, Day C. Traditional plant medicines as treatments for diabetes. Diabetes Care. 1989; 12: 553-564. 3. Hong H, Jai Maeng W. Effects of malted barley extract and banaba extract on blood glucose levels in genetically diabetic mice. J Med Food. 2004; 7(4):487-90. 4. Fryer LGD, Hajduch E, Rencurel F, Salt IP, Hundal HS, Hardie DG, et al. Activation of glucose transport by AMP-activated protein kinase via stimulation of nitric oxide synthase. Diabetes. 2000; 49:1978-85. 5. Gruzman A, Babai G, Sasson S. Adenosine monophosphateactivated protein kinase (AMPK) as a new target for antidiabetic drugs: a review on metabolic, pharmacological and chemical considerations. Rev Diabet Stud. 2009; 6(1):13-36. 6. Winder WW, Hardie DG. AMP-activated protein kinase, a metabolic master switch: possible roles in type 2 diabetes. Am J Physiol. 1999; 277:E1-10. 7. Ojuka EO, Jones TE, Nolte LA, Chen M, Wamhoff BR, Sturek M, et al. Regulation of GLUT4 biogenesis in muscle: evidence for involvement of AMPK and Ca 2+. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002; 282:E1008-13. 8. VDF Futureceuticals: Research Laboratory Report. San Diego, CA: VDF Futureceuticals; 2003. 9. Miljkovic D, Pietrzkowski Z, inventors; VDF Futureceuticals, Inc., assignee. Compositions and methods for treating NIDDM and other conditions and disorders associated with AMPK regulation. International patent application WO2004/021980. 2004 Mar 18. 10. Wang ZQ, Zhang XH, Russell JC, Hulver M, Cefalu WT. Chromium picolinate enhances skeletal muscle cellular insulin signaling in vivo in obese, insulin-resistant JCR:LA-cp rats. J Nutr. 2006; 136(2):415-20. 11. The Electronic Medicines Compendium. Summary of Product Characteristics, Avandia 4mg & 8mg film-coated tablets, GlaxoSmithKline UK [updated 2010 May 26]. Available from: http:// www.emc.medicines.org.uk. 12. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Committee on Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council, Washington, D.C., U.S. Department of Health and Human Services; 1996. 13. Kim JH, Park JM, Yea K, Kim HW, Suh PG, Ryu SH. Phospholipase D1 mediates AMP-activated protein kinase signaling for glucose uptake. PLoS One. 2010; 5(3):e9600. 14. Fujii N, Jessen N, Goodyear LJ. AMP-activated protein kinase and the regulation of glucose transport. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2006; 291(5):E867-77. 15. Kyriakis JM. At the crossroads: AMP-activated kinase and the LKB1 tumor suppressor link cell proliferation to metabolic regulation. J Biol. 2003; 2(4):26. 16. Szkudelski T. The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas. Physiol Res. 2001; 50(6):537-46. 17. Schmid S, Koczwara K, Schwinghammer S, Lampasona V, Ziegler AG, Bonifacio E. Delayed exposure to wheat and barley proteins reduces diabetes incidence in non-obese diabetic mice. Clin Immunol. 2004; 111(1):108-18. 18. Mahdi GS, Naismith DJ. Role of chromium in barley in modulating the symptoms of diabetes. Ann Nutr Metab. 1991; 35(2):65-70. 19. Cefalu WT, Wang ZQ, Zhang XH, Baldor LC, Russell JC. Oral chromium picolinate improves carbohydrate and lipid metabolism and enhances skeletal muscle Glut-4 translocation in obese, hyperinsulinemic (JCR-LA corpulent) rats. J Nutr. 2002; 132:1107-14. www.srp-arh.rs

618 Цекић В. и сар. Ефекат BBCr и његове комбинације са росиглитазоном на експериментално изазвану хипергликемију код мишева Effect of Chromium Enriched Fermentation Product of Barley and Brewer s Yeast and Its Combination with Rosiglitazone on Experimentally Induced Hyperglycaemia in Mice Vlada Cekić 1, Velibor Vasović 2, Vida Jakovljević 2, Dušan Lalošević 3, Ivan Čapo 3, Momir Mikov 2, Ana Sabo 2 1 Medical Department, Institute Hemofarm, Hemofarm AD, Vršac, Serbia; 2 Department of Pharmacology, Toxicology and Clinical Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Novi Sad, Novi Sad, Serbia; 3 Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, University of Novi Sad, Novi Sad, Serbia SUMMARY Introduction. In the recent years, herbal preparations have been more used to treat diabetes. Dietetic supplement based on barley and beer yeast enriched with chromium (BBCr) is registered in Serbia as a supplement in the treatment of type 2 diabetes. Objective To investigate the effect of the preparation based on barley and brewer s yeast with chromium (BBCr), rosiglitazone (R) and their combination (BBCr+R) on fasting glycaemia and glycaemia in mice after glucose, adrenalin and alloxan application. Methods The animals were divided into three groups: glucose 500 mg/kg (I); adrenalin 0.2 mg/kg (II); and alloxan 100 mg/kg (III) and into subgroups according to the substance they received (BBCr: 750 mg/kg, R: 0.75 mg/kg and BBCr+R). Each animal was its own control in respect of glycaemia before and after the treatment with test substances, except for group III which contained a placebo subgroup. Results BBCr caused a significant decrease of fasting glycaemia and significant reduction of glycaemia after glucose load compared to the values before treatment (7.4±0.6 mmol/l vs 9.2±0.6 mmol/l; p=0.01). R and BBCr+R significantly decreased glycaemia after adrenalin load (R: 8.6±1.8 mmol/l vs 15.4±3.2 mmol/l; p=0.004; BBCr+R: 9.6±2.4 mmol/l vs 15.0±4.4 mmol/l; p=0.04). After alloxan application the glycaemia was significantly lower in the subgroups treated with BBCr, R and BBCr+R compared to placebo subgroup (10.1±8.0 mmol/l vs 6.8±2.7 mmol/l vs 13.5±9.7 mmol/l vs 24.5±4.7 mmol/l; p=0.001). Conclusion Pretreatment with BBCr caused a significant reduction of fasting glycaemia and glycaemia after glucose load. Rosiglitazone and BBCr+R caused a significant reduction of glycaemia after adrenalin load. Pretreatment with BBCr, R and BBCr+R prevented the onset of experimental diabetes caused by alloxan, which was confirmed by histological analysis of pancreas tissue. Keywords: barley and brewer s yeast extract; rosiglitazone; alloxan; diabetes mellitus; pancreas; histology Примљен Received: 15/10/2009 Ревизија Revision: 13/01/2010 Прихваћен Accepted: 22/02/2011 doi: 10.2298/SARH1110610C