НАСТАВНО-НАУЧНОМ ВЕЋУ ХЕМИЈСКОГ ФАКУЛТЕТА УНИВЕРЗИТЕТА У БЕОГРАДУ На седници Наставно-научног Већа Хемијског факултета Универзитета у Београду, одржаној 13.10.2016. године, одређени смо у Комисију за оцену научне заснованости теме докторске тезе кандидата Јоване Трбојевић Ивић, мастер биохемичара, која је пријављена под насловом: Нови аспекти употребе хидроксиапатита као носача за имобилизацију индустријски значајних липаза и гликозидаза дизајн, испитивање механизма, стабилност, примена и значај. На основу проучене документације, подносимо Наставно-научном Већу следећи ИЗВЕШТАЈ A. Основни подаци о кандидату Јована (Јован) Трбојевић Ивић је рођена 25.07.1988. у Београду, Република Србија. Основну школу и гимназију је завршила у Инђији. Студије Биохемијe на Хемијском факултету Универзитета у Београду је уписала школске 2007/2008, а завршила 2012. године са просечном оценом 8,77 и оценом 10 на одбрани завршног рада. Мастер академске студије на истом факултету је уписала школске 2012/2013, а завршила 2013. године са просечном оценом 9,80 и оценом 10 на одбрани мастер рада. Докторске академске студије је уписала школске 2014/2015. године на истом факултету. У периоду од 2012. до 2013. је ангажована на пројекту Министарства просвете, науке и технолошког развоја Републике Србије, под називом: Ензимска синтеза антиоксиданаса растворљивих у липидима (451-03-2372-IP), у звању истраживача-приправника Иновационог центра Хемијског факултета Универзитета у Београду. Од 2015. године је ангажована на пројекту Министарства просвете, науке и технолошког развоја Републике Србије, под називом: Алергени, антитела, ензими и мали физиолошки важни молекули: дизајн, структура, функција и значај (IO172049), прво у звању истраживача-приправника, а затим у звању истраживач-асарадника Иновационог центра Хемијског факултета Универзитета у Београду. 1
B. Објављени научни радови Рад у међународном часопису изузетних вредности (М21а) Trbojević Ivić Jovana, Milosavić Nenad, Dimitrijević Aleksandra, Gavrović Jankulović Marija, Bezbradica Dejan, Kolarski Dušan, Veličković Dušan. Synthesis of medium-chain length capsinoids from coconut oil catalyzed by Candida rugosa lipases. Food Chemistry, 2017, 218, 505 508 (IF 2015 = 4,052; M21a). Радови у врхунским часописима (М21) Trbojević Ivić Jovana, Dimitrijević Aleksandra, Milosavić Nenad, Bezbradica Dejan, Drakulić Branko J., Gavrović Jankulović Marija, Pavlović Marija, Rogniaux Helene, Veličković Dušan. Assessment of the interacting mechanism between Candida rugosa lipases and hydroxyapatite and identification of the hydroxyapatite-binding sequence through proteomics and molecular modelling. RSC Advances, 2016, 6, 34818-34824 (IF 2015 = 3,289; M21) Trbojević Ivić Jovana, Veličković Dušan, Dimitrijević Aleksandra, Bezbradica Dejan, Dragačević Vladimir, Gavrović Jankulović Marija, Milosavić Nenad. Design of biocompatible immobilized Candida rugosa lipase with potential application in food industry. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2016, 96 (12), 4281-4287 (IF 2015 = 2,076, M21) Veličković Dušan, Milosavić Nenad, Bezbradica Dejan, Bihelović Filip, Segal Ann Marie, Šegan Dejan, Trbojević Jovana, Dimitrijević Aleksandra. The specificity of α-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae differs depending on the type of reaction: hydrolysis versus transglucosylation. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98, 6317-6328. Радови у међународним часописима (М23) Trbojević Jovana, Dimitrijević Aleksandra, Veličković Dušan, Gavrović-Jankulović Marija, Milosavić Nenad. Isolation of Candida rugosa lipase isoforms. Hemijska industrija, 2013, 67 (5), 703-706 (IF 2013 = 0,562; M23) Pavlović Marija, Dimitrijević Aleksandra, Trbojević Jovana, Milosavić Nenad, Gavrović- Jankulović Marija, Bezbradica Dejan, Veličković Dušan. A Study of Transglucosylation Kinetic in an Enzymatic Synthesis of Benzyl Alcohol Glucoside by α-glucosidase from S.cerevisiae. Russian Journal of Physical Chemistry A, 2013, 87 (13), 2285-2288 (IF 2013 = 0,488; M23). Саопштење са међународног скупа штампано у целини (М33) Pavlović Marija, Dimitrijević Aleksandra, Trbojević Jovana, Milosavić Nenad, Gavrović- Jankulović Marija, Bezbradica Dejan, Veličković Dušan. Inhibition of transglucosylation synthesis of benzyl alcohol glucoside by glucosyl acceptor. 11th International Conference on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry. Belgrade, 24-28 septembar, 2012. C- 11-P, str 185-187. Саопштења са скупова националног значаја штампана у изводу (М64) Dragačević Vladimir, Trbojević Ivić Jovana, Mutić Jelena, Bezbradica Dejan. Optimizacija proizvodnje i analitika biodizela dobijenog katalitičkom aktivnošću lipaze B Candidae 2
antarcticae. III konferencija mladih hemičara Srbije. Beograd, 24. oktobar 2015. BBP09, Zbornik radova, str. 68 Trbojević Ivić Jovana, Dragačević Vladimir, Dimitrijević Aleksandra, Gavrović Jankulović Marija. Lipaze iz Candida rugosa imobilizovane na hidroksiapatitu: stabilan biokatalizator sa velikim industrijskim potencijalom. III konferencija mladih hemičara Srbije. Beograd, 24. oktobar 2015. BBP010, Zbornik radova, str. 69 Trbojević Ivić Jovana, Veličković Dušan, Dimitrijević Aleksandra, Bezbradica Dejan, Gavrović Jankulović Marija, Milosavić Nenad. Stabilizacija lipaza iz Candida rugosa jednostavnom i efikasnom imobilizacijom na hidroksiapatitu. 52. Savetovanje Srpskog hemijskog društva. Novi Sad, 29-30 мај, 2015. BTO2, Zbornik radova, str. 99. Stojanović Marija, Carević Milica, Jakovetić Sonja, Dimitrijević Aleksandra, Trbojević Jovana, Mihailović Mladen, Veličković Dušan. Enzymatic synthesis of L-ascorbyl linoleate. I konferencija mladih hemičara Srbije. Beograd, 19.-20. Oktobar 2012. HSP17, Zbornik radova, str. 64 Carević Milica, Stojanović Marija, Jakovetić Sonja, Mihailović Mladen, Dimitrijević Aleksandra, Trbojević Jovana, Veličković Dušan. Proizvodnja sirovog ćelijskog ekstrakta β-galaktozidaze pomoću bakterija mlečne kiseline. I konferencija mladih hemičara Srbije. Beograd, 19.-20. Oktobar 2012. BHP02, Zbornik radova, str. 74. Trbojević Jovana, Dimitrijević Aleksandra, Veličković Dušan, Gavrović-Jankulović Marija, Milosavić Nenad. Adsorpcija lipaze iz Candida antarctica na hidroksiapatitu. I konferencija mladih hemičara Srbije, Beograd, 19. 20. oktobar 2012. BH P15, Zbornik radova, str. 87. 3
C. Образложење теме 1. Научна област Научна област је биохемија (ужа област ензимологија: припрема, карактеризација и примена имобилизованих ензимских препарата), за коју је матичан Хемијски факултет Универзитета у Београду. 2. Предмет рада Предмет овог истраживања је испитивање могућности коришћења хидроксиапатита као носача за имобилизацију липаза и гликозидаза, као и потенцијалне примене имобилизованих ензима. Хидроксиапатит је одабран као један од најзначајнијих биокомпатибилних материјала, који се лако може синтетисати из јефтиних и лако доступних основних хемикалија. У првој етапи је планирано да се тестира његова употреба као носача за имобилизацију хидролаза (липаза и гликозидаза) различитог порекла. Међу липазама биће тестиране: липаза Б из Candida antarctica, липазе из Candida rugosa, Pseudomonas cepacia и панкреаса свиње. Од гликозидаза биће тестиране: α-глукозидаза и инвертаза из Saccharomyces cerevisiae, β-глукозидаза из Prunus dulcis и β-галактозидаза из Aspergillus oryzae. У другој етапи ће бити детаљније испитан утицај имобилизације на стабилност и могућност узастопне употребе имобилизованих ензима (на енглеском: reusability), као и механизам интеракција ензим-хидроксиапатит. У трећој етапи је планирано тестирање ефикасности ензима имобилизованих на хидроксиапатиту током синтезе различитих значајних естара и гликозида. 3. Научни циљ истраживања Оптимизација основних параметара за имобилизацију липаза и гликозидаза на хидроксиапатит; Испитивање утицаја имобилизације на стабилност (температурна стабилност, стабилност у органским растварачима) и могућност узастопне употребе (reusability); Испитивање механизма интеракција ензим-хидроксиапатит и идентификација функционалних група, кључних за те интеракције; Тестирање ензим-хидроксиапатит комплекса у синтези различитих алифатичних и ароматичних естара и гликозида. 4. Методе истраживања У циљу праћења тока имобилизације ензима, биће коришћени стандардни спектрофотометријски есеји за одређивање ензимске активности, као и електрофоретске технике (нативна и SDS-PAGE, изоелектрофокусирање). За описивање механизма интеракција ензим-носач, биће претражене протеинске базе података (Protein Data Bank, BRENDA, UniProtKB), ради детаљнијег увида у тродимензионалну структуру сваког од ензима. Главни механизам интеракција ензима и коришћеног носача ће бити одређен након хемијских модификација карбоксилних и амино група протеина. Након тога ће бити урађена компјутерска симулација интеракција различитих региона 4
протеина и хидроксиапатита у програму VegaZZ ради идентификације дела протеина који остварује интеракцију са носачем. Применом LC-MS/MS технике високе резолуције биће испитана и специфичност хидроксиапатита приликом имобилизације липаза из Candida rugosa, будући да комерцијални препарат овог ензима, који ће бити коришћен у току рада, садржи више изоформи поменутих липаза. За праћење ефикасности ензим-хидроксиапатит комплекса у синтези естара и гликозида, биће коришћена аналитичка реверзно-фазна HPLC метода, а за њихово пречишћавање ће бити коришћена препаративна реверзно-фазна HPLC. Пречишћени производи (естри и гликозиди) ће потом бити подвргнути детаљној структурној карактеризацији ради одређивања типа везе и врсте модификованих група. За структурну карактеризацију лако испарљивих кратко-ланчаних мирисних естара биће коришћена GC-MS техника. За структурну анализу естара који садрже ароматично језгро биће коришћене 1D NMR технике. Структурна карактеризација производа на бази гликозида ће бити урађена, комбинацијом LC/ESI/TOF-MS и 2D NMR техника. 5. Актуелност проблематике у свету У модерном концепту индустријске производње ензими су се наметнули као еколошки прихватљива алтернатива хемијским катализаторима. Ензими, у поређењу са конвенционалним катализаторима, имају израженију супстратну специфичност, ефикаснији су катализатори у благим реакционим условима и припадају групи биокатализатора, због чега се процеси у које су укључени означавају као зелени, а производи добијени ензимском технологијом могу да носе етикету природних. Липазе и гликозидазе убрајају се међу најзначајније индустријске биокатализаторе, али њихову масовнију употребу ограничава слаба стабилност у реакционим условима, које обично изискују индустријски производни процеси. Иако су развијене различите методологије за побољшање ензима, засноване на протеинском инжењерингу и техникама рекомбинантне ДНК, због своје једноставности и великог броја могућности, имобилизација је најзаступљенија техника за унапређење биокатализатора. Због високе цене комерцијално доступних имобилизованих липаза и гликозидаза, примена алтернативних, еколошки пожељних, лако доступних биоматеријала, какав је хидроксиапатит, представља обећавајућу стратегију за унапређење и проширење могућности примене поменутих ензима у ширем спектру индустријских трансформација. 6. Очекивани резултати Резултати истраживања проистекли из ове тезе би требало да допринесу дефинисању услова за повећање стабилности липаза и гликозидаза на једноставан, брз и исплатив начин. Битан резултат би требало да буде и разјашњење комплексних интеракција хидроксиапатита као носача са тестираним ензимима, што би чинило основу за даље побољшање ензимске ефикасности имобилизованих препарата. Због биокомпатибилности носача, обим потенцијалне примене овако имобилизованих ензима проширио би се и на индустријске делатности у којима постоје строги захтеви у погледу безбедности коришћених материјала (производња хране, лекова или финих хемикалија). У том смислу очекујемо пре свега унапређену синтезу мирисних естара и пребиотика. 5
D. Закључак комисије На основу свега изнетог, мишљење Комисије је да је предложена тема докторске дисертације под насловом: Нови аспекти употребе хидроксиапатита као носача за имобилизацију индустријски значајних липаза и гликозидаза дизајн, испитивање механизма, стабилност, примена и значај научно заснована, и да кандидат Јована Трбојевић Ивић, мастер биохемичар, испуњава све услове за почетак израде докторске тезе за стицање академског звања доктор биохемијских наука. Због тога препоручујемо Наставно-научном Већу Хемијског факултета у Београду да одобри кандидату израду докторске тезе под наведеним насловом. За ментора предлажемо др Марију Гавровић Јанкуловић, редовног професора Хемијског факултета у Београду. Чланови Комисије: 1. др Марија Гавровић Јанкуловић, редовни професор Хемијског факултета Универзитета у Београду (ментор) 2. др Зоран Вујчић, редовни професор Хемијског факултета Универзитета у Београду 3. др Радивоје Продановић, ванредни професор Хемијског факултета Универзитета у Београду 4. др Љубодраг Вујисић, доцент Хемијског факултета Универзитета у Београду 5. др Дејан Безбрадица, ванредни професор Технолошко-металуршког факултета Универзитета у Београду У Београду, 31.10.2016. године. 6