ΑΣΚΗΣΗ: Ενδονουκλεάσες περιορισμού Μοριακή χαρτογράφηση γονιδίων
ΑΣΚΗΣΗ: Ενδονουκλεάσες περιορισμού Μοριακή χαρτογράφηση γονιδίων Σκοπός της άσκησης Η εισαγωγή στις βιολογικές ιδιότητες των ενζύμων περιορισμού και τις βασικές εφαρμογές τους στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA. Η εκμάθηση κατασκευής χάρτη περιορισμού. 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ Η ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA ξεκίνησε με την ανακάλυψη των ενδονουκλεάσεων περιορισμού (restriction endonucleases). Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι ένζυμα που αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες βάσεων στη διπλή έλικα του DNA και στη συνέχεια «κόβουν» (τεμαχίζουν) το DNA σε μικρότερα δίκλωνα κομμάτια κατά τρόπο καθορισμένο και επαναλαμβανόμενο. Η ιδιότητά τους αυτή τις καθιστά αναντικατάστατα εργαλεία για την απομόνωση και κλωνοποίηση γονιδίων σε ειδικούς φορείς (βλέπε και άσκηση «Κλωνοποίηση γονιδίων»), την ανάλυση της δομής των χρωμοσωμάτων, την αλληλούχιση μεγάλων μορίων DNA κ.ά. Η ανακάλυψή τους από τους Nathans, Smith και Arber τιμήθηκε με το βραβείο Νόμπελ. Η αρχική παρατήρηση που οδήγησε στην ανακάλυψη των ενζύμων περιορισμού έγινε στις αρχές της δεκαετίας του 1950, όταν βρέθηκε ότι κάποια στελέχη βακτηρίων είναι ανθεκτικά σε μόλυνση από βακτηριοφάγους (ιοί βακτηρίων), ένα φαινόμενο γνωστό ως «περιορισμός ελεγχόμενος από τον ξενιστή». Κατά το φαινόμενο αυτό το βακτήριο παράγει ένα ένζυμο (ενδονουκλεάση περιορισμού) το οποίο κόβει το ιϊκό DNA σε συγκεκριμένες θέσεις αναγνώρισης. Το DNA του βακτηρίου είναι προστατευμένο από τη δράση των ενζύμων περιορισμού γιατί οι αντίστοιχες θέσεις αναγνώρισης είναι μεθυλιωμένες, γεγονός που παρεμποδίζει την αποικοδομητική δράση των ενζύμων. Ενδονουκλεάσες περιορισμού παράγονται από πολλά, ίσως όλα τα είδη βακτηρίων. Μέχρι σήμερα έχουν χαρακτηριστεί πάνω από 1200 τέτοια ένζυμα, τα οποία διακρίνονται σε τρεις διαφορετικές κατηγορίες, ανάλογα με τον τρόπο λειτουργίας τους. Τα ένζυμα τύπου Ι και ΙΙΙ έχουν σχετικά πολύπλοκο τρόπο δράσης και βρίσκουν περιορισμένη εφαρμογή στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA, αντίθετα με τα ένζυμα τύπου ΙΙ που αποτελούν τα κύρια εργαλεία της Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής.
1.1. Κατηγορίες ενζύμων περιορισμού Ενδονουκλεάσες τύπου Ι Οι ενδονουκλεάσες τύπου Ι αναγνωρίζουν μια συγκεκριμένη δίκλωνη περιοχή μήκους 15 βάσεων αλλά κόβουν μόνο τη μία αλυσίδα του DNA και μάλιστα σε απόσταση 1000 έως 5000 νουκλεοτιδίων από την αλληλουχία αναγνώρισης, γι αυτό και παρουσιάζουν θεωρητικό μόνο ενδιαφέρον. Ενδονουκλεάσες τύπου ΙΙ Στα εργαστήρια χρησιμοποιούνται αποκλειστικά οι ενδονουκλεάσες τύπου ΙΙ. Το βασικό χαρακτηριστικό των περιοριστικών ενζύμων τύπου ΙΙ είναι ότι κάθε ένζυμο αναγνωρίζει μια συγκεκριμένη, συνήθως παλίνδρομη νουκλεοτιδική αλληλουχία εσωτερικά της οποίας κόβει το μόριο του DNA ώστε να παραχθούν κομμάτια DNA ορισμένου μήκους. Παλίνδρομες ονομάζονται οι αλληλουχίες οι οποίες είναι όμοιες στις δύο αλυσίδες του DNA όταν διαβάζονται σε κατεύθυνση από το 5 προς το 3 άκρο. Κάθε ενδονουκλεάση περιορισμού κόβει το DNA στη συγκεκριμένη αλληλουχία αναγνώρισης και πουθενά αλλού. Για παράδειγμα η ενδονουκλεάση περιορισμού PvuI (που προέρχεται από το βακτήριο Proteus vulgaris) αναγνωρίζει την εξανουκλεοτιδική αλληλουχία CGATCG ενώ η ενδονουκλεάση PvuII του ίδιου βακτηρίου πέπτει το DNA στην αλληλουχία CAGCTG. Η αλληλουχία αναγνώρισης ενός ενζύμου περιορισμού, όπως κάθε τμήμα DNA, γράφεται πάντα με κατεύθυνση 5 προς 3. Οι περισσότερες ενδονουκλεάσες περιορισμού αναγνωρίζουν εξανουκλεοτιδικές αλληλουχίες, αλλά υπάρχουν και ένζυμα που αναγνωρίζουν αλληλουχίες τεσσάρων, πέντε, οκτώ ή και περισσοτέρων νουκλεοτιδίων. Υπάρχουν επίσης και περιπτώσεις περιοριστικών ενζύμων με εκφυλισμένες αλληλουχίες αναγνώρισης, που σημαίνει ότι πέπτουν το DNA σε μια σειρά σημείων αναγνώρισης. Τέτοιο παράδειγμα αποτελεί το ένζυμο HinfI, το οποίο αναγνωρίζει την αλληλουχία GANTC όπου το Ν μπορεί να είναι οποιοδήποτε νουκλεοτίδιο και επομένως το συγκεκριμένο ένζυμο κόβει το DNA στις θέσεις GAATC, GATTC, GAGTC και GACTC. Ο πίνακας 1 περιέχει μια λίστα ενδεικτικών ενδονουκλεασών περιορισμού τύπου ΙΙ. Ενδονουκλεάσες τύπου ΙΙΙ Οι ενδονουκλεάσες τύπου ΙΙΙ αναγνωρίζουν μια συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων και τέμνουν το DNA μετά από περίπου 20-30 νουκλεοτίδια, γι αυτό και παρουσιάζουν θεωρητικό μόνο ενδιαφέρον.
1.2. Ονοματολογία των ενζύμων περιορισμού Η ονομασία των ενζύμων περιορισμού προέρχεται από το πρώτο γράμμα του γένους και τα δύο πρώτα γράμματα του είδους του βακτηρίου, ενώ ακολουθεί το πρώτο γράμμα του στελέχους από το οποίο απομονώθηκαν για πρώτη φορά καθώς και η σειρά απομόνωσης. Για παράδειγμα, το ένζυμο απομονώθηκε από το Escherichia coli, στέλεχος RΥ13, και ήταν το πρώτο (Ι) ένζυμο που ταυτοποιήθηκε στο συγκεκριμένο βακτήριο. 1.3. Τρόποι λειτουργίας των ενζύμων περιορισμού Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού κόβουν το DNA υδρολύοντας ένα φωσφοδιεστερικό δεσμό σε κάθε αλυσίδα του DNA. Πολλές ενδονουκλεάσες, όπως οι PvuII και AluI, κάνουν ένα απλό κόψιμο στο μέσο της δίκλωνης έλικας του DNA, γεγονός που δημιουργεί τυφλά άκρα (blunt ends) στα κομμάτια DNA που προκύπτουν. Ονομασία ενζύμου Προέλευση Αλληλουχία αναγνώρισης και θέση κοπής Δημιουργία5 προεξεχόντων άκρων BamHI Bacillus amyloliquefaciensh 5 G GATCC 3 3 CCTAG G 5 Escherichia coli 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 TaqI Thermus aquaticus 5 T CGA 3 3 AGC T 5 HindIII Haemophilus influenzae 5 A AGCTT 3 3 TTCGA A 5 ΝotI Nocardia otitidis 5 GC GGCCGC 3 3 CGCCGG CG 5 Δημιουργία3 προεξεχόντων άκρων KpnI Klebsiella pneumoniae 5 GGTAC C 3 3 C CATGG 5 Δημιουργίατυφλών άκρων EcoRV Escherichia coli 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 AluI Arthrobacter luteus 5 AG CT 3 3 TC GA 5 Πίνακας 1. Χαρακτηριστικές ενδονουκλεάσες περιορισμού και ο τρόπος δράσης τους. Άλλα περιοριστικά ένζυμα δρουν με ελαφρώς διαφορετικό τρόπο. Αντί να κόβουν τις δύο αλυσίδες του DNA στην ίδια ακριβώς θέση, το σημείο τομής των δύο αλυσίδων διαφέρει συνήθως κατά δύο ή τέσσερα νουκλεοτίδια, με αποτέλεσμα να προκύπτουν τμήματα DNA με προεξέχοντα μονόκλωνα άκρα που είναι γνωστά ως «κολλώδη» άκρα
(sticky ends). Τα προεξέχοντα αυτά κολλώδη άκρα, λόγω της συμπληρωματικότητας των βάσεων του DNA, καθιστούν δυνατή την εκ νέου συγκόλληση του μορίου DNA. Επομένως, όταν ένα μόριο DNA υποστεί κατάτμηση από ένα συγκεκριμένο ένζυμο περιορισμού με μια ορισμένη αλληλουχία αναγνώρισης, τα άκρα του θα έχουν συμπληρωματικά ζεύγη βάσεων με οποιαδήποτε άλλο μόριο DNA έχει κοπεί με το ίδιο ένζυμο αυτή η αρχή αποτελεί ένα από τα σπουδαιότερα θεμέλια για την ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA. Η επανασύνδεση του DNA, τόσο στην περίπτωση των τυφλών όσο και των προεξεχόντων άκρων, γίνεται με τη δράση του ενζύμου DNA λιγάση. Ανάλογα με τον τρόπο δράσης του εκάστοτε ενζύμου είναι δυνατό να προκύψουν προεξέχοντα άκρα τόσο στο 5 όσο και στο 3 άκρο της αλυσίδας του DNA (Εικόνα 1 και Πίνακας 1). Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του τρόπου δράσης των περιοριστικών ενζύμων είναι ότι ενδονουκλεάσες που αναγνωρίζουν διαφορετικές αλληλουχίες μπορεί να σχηματίσουν τα ίδια κολλώδη άκρα, όπως για παράδειγμα τα ένζυμα BamHI και BglII. Εικόνα 1. Τρόποι δράσης των ενζύμων περιορισμού. Για τις ανάγκες της βιολογικής έρευνας, πάνω από εκατό ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι σήμερα εμπορικά διαθέσιμες, μαζί με τα αντίστοιχα ρυθμιστικά διαλύματα (buffers) που εξασφαλίζουν τις βέλτιστες συνθήκες ph και ιοντικής ισχύος για
την αποδοτικότερη λειτουργία του εκάστοτε περιοριστικού ενζύμου. Συγκεκριμένα, το ph ρυθμίζεται από την παρουσία Tris-HCl στο ρυθμιστικό διάλυμα ενώ η ιοντική ισχύς από τα ιόντα Mg 2+ και Na +. Το ρυθμιστικό διάλυμα περιέχει επίσης συστατικά που σταθεροποιούν το ένζυμο και παρεμποδίζουν την απενεργοποίησή του, όπως η διθειοθρεϊτόλη (DTT) και η ορολευκωματίνη (bovine serum albumin, BSA). Οι περισσότερες ενδονουκλεάσες περιορισμού δρουν σε θερμοκρασία 37 C, ενώ η ποσότητα που χρησιμοποιείται εξαρτάται από την ενεργότητα του ενζύμου και από το μέγεθος και την ποσότητα του προς κατάτμηση τμήματος DNA. Εξ ορισμού, μια (1) μονάδα (unit) ενός ενζύμου περιορισμού θα κατατμήσει ολοκληρωτικά 1μg DNA υποστρώματος σε μια αντίδραση όγκου 20 μl σε 1 ώρα. Συνήθως όμως χρησιμοποιείται μεγαλύτερη ποσότητα ενζύμου (2-3 units), προκειμένου να αντιμετωπιστούν παράγοντες που μπορεί να αλλοιώσουν το τελικό αποτέλεσμα της ενζυμικής πέψης όπως η ποσότητα ή η καθαρότητα του DNA. Από την άλλη μεριά, προσθήκη μεγάλης περίσσειας ενζύμου μπορεί να οδηγήσει σε μη ειδική λειτουργία του ενζύμου, με αποτέλεσμα να κόβει το DNA σε μη ειδικές θέσεις και να το κατακερματίζει σε πολλά κομμάτια διαφορετικών μεγεθών (ενεργότητα αστέρος, star activity). Σε κάθε περίπτωση ο όγκος του ενζύμου δεν πρέπει να ξεπερνάει το 1/10 της αντίδρασης καθώς η γλυκερόλη που περιέχεται στο διάλυμα του ενζύμου μπορεί να επηρεάσει αρνητικά την ενζυμική αντίδραση. Επιπρόσθετα, έχει αναπτυχθεί μια πληθώρα διαδικτυακών εργαλείων (π.χ. το πρόγραμμα NEBcutter), για την εύρεση θέσεων αναγνώρισης ενζύμων περιορισμού σε μια οποιαδήποτε αλληλουχία DNA. 1.4. Συχνότητα αλληλουχιών αναγνώρισης Δεδομένου ότι το DNA αποτελείται από επαναλήψεις τεσσάρων νουκλεοτιδίων, η πιθανότητα μια αλληλουχία DNA να περιέχει μια τετρανουκλεοτιδική θέση αναγνώρισης ενός περιοριστικού ενζύμου είναι (1/4) 4, δηλαδή μία θέση αναγνώρισης κάθε 256 περίπου βάσεις, η πιθανότητα ύπαρξης μιας εξανουκλεοτιδικής θέσης αναγνώρισης είναι (1/4) 6 και επομένως αντιστοιχεί σε μία θέση αναγνώρισης για κάθε 4096 περίπου βάσεις κ.ο.κ. Αυτός ο τρόπος παρέχει μια αδρή εκτίμηση του μέσου μεγέθους των τμημάτων DNA που προκύπτουν από τη δράση ενός ενζύμου περιορισμού, καθώς το πραγματικό μέγεθος των κατατμημένων τμημάτων εξαρτάται και από άλλους παράγοντες όπως για παράδειγμα τη σύσταση του DNA σε GC.
1.5. Αντιμετώπιση προβλημάτων Είναι δυνατόν μια αντίδραση πέψης να παράγει μη επιθυμητά ή και καθόλου αποτελέσματα. Πιθανές αιτίες για να συμβεί κάτι τέτοιο μπορεί να είναι: Το ένζυμο να έχει χάσει τη δραστικότητά του. Η αντίδραση να έχει πραγματοποιηθεί σε λάθος θερμοκρασία. Η αντίδραση να έχει πραγματοποιηθεί με λάθος ρυθμιστικό διάλυμα. Η αντίδραση να περιέχει μεγάλη ποσότητα DNA ή μεγάλη ποσότητα ενζύμου. Το ένζυμο να έχει πέψει μερικώς το DNA. Όταν μια αντίδραση πέψης πραγματοποιείται σε μη βέλτιστες συνθήκες, π.χ. σε χαμηλότερη θερμοκρασία ή σε λιγότερο χρόνο από τον προβλεπόμενο, τότε πραγματοποιείται πέψη μερικών μόνο θέσεων αναγνώρισης του ενζύμου (μερική πέψη). Σε αυτήν την περίπτωση, εκτός από τα αναμενόμενα τμήματα DNA που προκύπτουν από μία τέλεια πέψη, εμφανίζονται επιπλέον κομμάτια DNA που αντιπροσωπεύουν γειτονικά κομμάτια DNA που διαχωρίζονται από ένα σημείο αναγνώρισης που δεν έχει κοπεί (Εικόνα 2)..... Τέλεια πέψη.... Μερική πέψη Εικόνα 2. Ηλεκτροφορητικά αποτελέσματα τέλειας και μερικής πέψης. Το DNA να μην είναι καθαρό. Να έχει προκύψει ενεργότητα αστέρος (star activity) λόγω περίσσειας ενζύμου, υψηλής ιοντικής ισχύος ή υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης. 1.6. Εφαρμογές των ενζύμων περιορισμού Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού αποτελούν εξαιρετικά εργαλεία στους τομείς της Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής. Όπως ειπώθηκε και παραπάνω, οι εκτεταμένες εφαρμογές τους έχουν δώσει σημαντική ώθηση στη σύγχρονη βιοϊατρική έρευνα.
Ενδεικτικές εφαρμογές των σημαντικών αυτών εργαλείων αποτελούν η κλωνοποίηση γονιδίων, η ανίχνευση πολυμορφισμών / επιγενετικών τροποποιήσεων του DNA, η χαρτογράφηση ενός μορίου DNA, η κατασκευή βιβλιοθηκών DNA κ.α. Στα πλαίσια της παρούσας άσκησης θα παρουσιαστεί εκτενέστερα η μεθοδολογία δημιουργίας ενός περιοριστικού χάρτη DNA και πιο συγκεκριμένα η περιοριστική χαρτογράφηση πλασμιδιακού DNA. Επομένως θα εκτελέσετε πέψη του πλασμιδιακού DNA που έχετε απομονώσει στην αντίστοιχη άσκηση ώστε να κατασκευάσετε έναν χάρτη περιορισμού για το πλασμίδιο και το κλωνοποιημένο ένθεμα που περιέχει. 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 2.1. Υλικά και όργανα Για την αντίδραση πέψης Πλασμιδιακό DNA Ενδονουκλεάσες περιορισμού Ρυθμιστικά διαλύματα Δις απεσταγμένο (di-distilled - dd) H 2 O Mικροπιπέτες των 20 μl Αποστειρωμένα σωληνάκια eppendorf και αποστειρωμένα ρύγχη μικροπιπετών 20 μl Μαρκαδόρος μόνιμης γραφής Γάντια Θερμο-μπλοκ ή υδατόλουτρο ρυθμισμένο σε κατάλληλη θερμοκρασία Για την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Την προηγούμενη αντίδραση πέψης Αγαρόζη Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ 1x Βρωμιούχο αιθίδιο ή άλλη παρόμοια χρωστική πρόσδεσης στο DNA, όπως είναι η Midori Green Χρωστική φόρτωσης (loading dye) Μάρτυρας γνωστών μοριακών μεγεθών Εκμαγείο, «χτενάκια», συσκευή ηλεκτροφόρησης, τροφοδοτικό ρεύματος Γάντια
2.2. Πειραματική πορεία Σχεδιασμός της αντίδρασης πέψης Όπως είπαμε, μια αντίδραση πέψης περιλαμβάνει το DNA (πλασμιδιακό στη συγκεκριμένη περίπτωση), την ή τις ενδονουκλεάσες περιορισμού, το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα και δις απεσταγμένο νερό. Θα πραγματοποιήσετε τρεις ενζυμικές αντιδράσεις με δύο διαφορετικές ενδονουκλεάσες περιορισμού και τον συνδυασμό αυτών. Όταν πραγματοποιείτε αντιδράσεις πέψης με δύο περιοριστικά ένζυμα (διπλή πέψη) πρέπει να προσέξετε ιδιαίτερα ώστε να επιλέξετε ένζυμα που δρουν στην ίδια θερμοκρασία και επιπλέον να επιλέξετε το σωστό ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο θα παρέχει τις βέλτιστες συνθήκες λειτουργίας και για τα δύο ένζυμα. Αν κάτι τέτοιο δεν είναι δυνατό τότε θα πρέπει να εκτελέσετε διαδοχικές αντιδράσεις πέψης πρώτα με το ένα και μετά με το άλλο ένζυμο. 1. Ετοιμάζετε τις αντιδράσεις πέψεις σε σωληνάκια eppendorf. Υπολογίζετε τις ποσότητες που πρέπει να προσθέσετε από κάθε αντιδραστήριο στην αντίδραση πέψης (Πίνακας 2) με βάση τον τύπο των αραιώσεων C 1 x V 1 = C 2 x V 2 Πίνακας 2. 2. Επωάζετε τις αντιδράσεις σε κατάλληλη θερμοκρασία για 2 ώρες
3. Διατηρείτε τις αντιδράσεις στους -20 C ή τις ηλεκτροφορείτε αμέσως σε ένα πήκτωμα αγαρόζης. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Οι διαδικασίες για την προετοιμασία ενός πηκτώματος αγαρόζης και την ηλεκτροφόρηση DNA σε αυτό παραθέτονται στην άσκηση «Ποσοτική ποιοτική ανάλυση DNA». 1. Ηλεκτροφορείτε τις αντιδράσεις των πέψεων σε ένα πήκτωμα αγαρόζης με την εξής σειρά: DNA μάρτυρας μονές πέψεις διπλές πέψεις 2. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης φωτογραφίζετε το πήκτωμα και κατασκευάζετε τον χάρτη περιορισμού του πλασμιδίου. Κατασκευή χάρτη περιορισμού Ένας χάρτης περιορισμού απεικονίζει τις σχετικές θέσεις των αλληλουχιών αναγνώρισης των διαφόρων ενζύμων περιορισμού πάνω σε ένα τμήμα DNA. Μόνο όταν είναι διαθέσιμος ένας ολοκληρωμένος χάρτης περιορισμού μπορούμε να επιλέξουμε τη σωστή ενδονουκλεάση περιορισμού για τους γενετικούς χειρισμούς που θέλουμε να πραγματοποιήσουμε. Για την κατασκευή ενός χάρτη περιορισμού πρέπει να πραγματοποιηθεί μια σειρά από μονές και διπλές πέψεις, ακολουθούμενη από ανάλυση του αριθμού και του μεγέθους των τμημάτων DNA που προκύπτουν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Ο χάρτης περιορισμού προκύπτει από τον συνδυασμό των αποτελεσμάτων των μονών και διπλών πέψεων και αναπαριστά τη διευθέτηση των θέσεων αναγνώρισης ενός ενζύμου περιορισμού σε σχέση με γειτονικά σημεία περιορισμού άλλων ενζύμων καθώς και τις μεταξύ τους αποστάσεις ώστε να δικαιολογούνται όλες οι ζώνες που παρατηρήθηκαν κατά την ηλεκτροφόρηση. Η κατασκευή ενός χάρτη περιορισμού μοιάζει περισσότερο με σπαζοκεφαλιά και δεν υπάρχουν συγκεκριμένες οδηγίες. Η γενική αρχή είναι ότι ξεκινάμε τη χαρτογράφηση από τα αποτελέσματα μιας μονής πέψης, τοποθετώντας τις θέσεις αναγνώρισης του συγκεκριμένου ενζύμου πάνω στο πλασμίδιο σε αποστάσεις που συμφωνούν με τα μεγέθη που παρατηρήθηκαν στην ηλεκτροφόρηση, και στη συνέχεια προσπαθούμε να ενσωματώσουμε τα αποτελέσματα των διπλών πέψεων επιβεβαιώνοντας ή
απορρίπτοντας την αρχική διευθέτηση. Παρακάτω θα παρατεθεί ένα παράδειγμα τέτοιας μοριακής χαρτογράφησης. Έστω ότι έχετε κλωνοποιήσει ένα άγνωστο ένθεμα στη θέση ενός πλασμιδίου για το οποίο επίσης ξέρετε λίγα. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιείτε μονές και διπλές πέψεις, τόσο του απλού όσο και του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου, με τα ένζυμα και. Τα αποτελέσματα των πέψεων μετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης φαίνονται στον παρακάτω πίνακα (σε kb). φορέας/ φορέας/ φορέας / - φορέας +ένθεμα/ φορέας +ένθεμα/ 5 kb 5 kb 2 kb 5 kb 4,5 kb 3 kb 3 kb 3 kb 3,5 kb 2 kb 0,5 kb 2,5 kb φορέας +ένθεμα/ EcoRΙ- Ποιο είναι το μέγεθος του πλασμιδιακού φορέα; Από τα αποτελέσματα των πέψεων του φορέα συμπεραίνουμε ότι το μέγεθός του είναι 5 kb. Ποιο είναι το μέγεθος του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού φορέα; Από τα αποτελέσματα των πέψεων του ανασυνδυασμένου φορέα (φορέας + ένθεμα) συμπεραίνουμε ότι το μέγεθός του είναι 8 kb. Ποιο είναι το μέγεθος του ενθέματος; 8 5 = 3 kb Το άθροισμα των ζωνών κάθε στήλης πρέπει να είναι σταθερό για τις περιπτώσεις του απλού πλασμιδίου και του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού φορέα. Πόσες φορές κόβουν τα δύο ένζυμα το απλό πλασμίδιο; Αφού προκύπτει μία ζώνη στις αντίστοιχες μονές πέψεις και το πλασμίδιο είναι κυκλικό, και τα δύο ένζυμα έχουν από μία θέση αναγνώρισης στο πλασμίδιο (Εικόνα 2).
Κυκλικό πλασμίδιο Γραμμικό DNA Εικόνα 2. Πόσες φορές κόβουν τα δύο ένζυμα το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο; Εφόσον η μονή πέψη με το παράγει 2 ζώνες, αυτό σημαίνει ότι υπάρχουν 2 θέσεις αναγνώρισης για το συγκεκριμένο ένζυμο στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Αντίστοιχα υπάρχουν 2 θέσεις και για το. Πόσες φορές κόβουν τα δύο ένζυμα το ένθεμα; Υπάρχει βέβαια περίπτωση να υπάρχουν θέσεις αναγνώρισης των περιοριστικών ενζύμων και μέσα στο ένθεμα. Αυτό ακριβώς υποδεικνύει το γεγονός ότι η πέψη του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου με το ένζυμο εμφανίζει μία παραπάνω ζώνη σε σχέση με την πέψη του απλού πλασμιδίου με το ίδιο ένζυμο. Επομένως το ένθεμα έχει μία θέση αναγνώρισης για το και καμία για το. Ας προχωρήσουμε τώρα στην κατασκευή του χάρτη περιορισμού. Σύμφωνα με την εκφώνηση το ένθεμα έχει κλωνοποιηθεί στη θέση του πλασμιδίου, επομένως το πλασμίδιο με το ένθεμα έχει την εξής μορφή: Ένθεμα Πλασμίδιο Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο
Το ένθεμα έχει στα άκρα του θέσεις και επομένως πέψη με το ένζυμο αυτό θα δώσει δύο ζώνες, μία που θα αντιστοιχεί στο μέγεθος του ενθέματος και μια δεύτερη που θα αντιστοιχεί στο μέγεθος του απλού πλασμιδίου. Από τη διπλή πέψη του απλού πλασμιδίου προέκυψαν δύο ζώνες με μεγέθη 2 kb και 3 kb, γεγονός που σημαίνει ότι ο χάρτης του απλού πλασμιδίου είναι ο εξής: 3 kb 2 kb Πλασμίδιο Σύμφωνα με τα προηγούμενα, στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο θα υπάρχει και μία θέση αναγνώρισης για το ένζυμο μέσα στο ένθεμα. Η περιοριστική αυτή θέση κόβει το ένθεμα σε δύο τμήματα, ένα τμήμα μεγέθους 0,5 kb και ένα τμήμα μεγέθους 2,5 kb. Υπάρχουν όμως δύο δυνατές θέσεις για την αλληλουχία αναγνώρισης μέσα στο ένθεμα, όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα: 0,5 kb 2,5 kb 2,5 kb 0,5 kb 2 kb 2 kb 3 kb 3 kb Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Συνδυάζοντας όμως και τα αποτελέσματα της μονής πέψης του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου με το, από την οποία προκύπτουν δύο κομμάτια DNA μεγέθους 3,5 kb και
4,5 kb, εξάγεται το συμπέρασμα ότι σωστή είναι η πρώτη περίπτωση του παραπάνω σχήματος. 0,5 kb 2,5 kb 2,5 kb 0,5 kb 3 kb 3,5 kb 4,5 kb 2 kb 3 kb 5,5 kb 2,5 kb 2 kb Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο 3. Βιβλιογραφία S.Β. Primrose, R.Μ. Twyman and R.W. Old. Principles of Gene Manipulation, Sixth edition. Blackwell Science Ltd, 2001. J.M. Berg, J.L. Tymoczko, and L. Stryer. Biochemistry, Fifth edition. W. H. Freeman and Company, 2002. H. Lodish, A. Berk, P. Matsudaira, C.A. Kaiser, M. Krieger, M.P. Scott, L. Zipursky and J. Darnell. Molecular Cell Biology, Fifth edition. W. H. Freeman and Company, 2003.