QUANTA Lite TM RNA Pol III Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM RNA Pol III 704555 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM RNA Pol III ELISA είναι μια ημι-ποσοτική ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση για την ανίχνευση αντισωμάτων IgG αντι-rna Πολυμεράσης III σε ορούς ασθενών. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων, όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα, βοηθά στη διάγνωση της συστημικής σκλήρυνσης (σκληροδερμία) με αυξημένα σημεία εμπλοκής του δέρματος και νεφρικής κρίσης. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Αυτοαντισώματα RNA Pol III αντιγόνου εντοπίζονται στο 11% έως 23% των ασθενών με συστημική σκλήρυνση. 1-8 Ασθενείς οι οποίοι είναι θετικοί για RNA Pol III αντισώματα, δεν έχουν τα άλλα αντισώματα τα οποία εντοπίζονται συνήθως σε ασθενείς με συστημική σκλήρυνση, όπως αντισώματα αντι-κεντρόμερου, αντι-scl-70 ή αντι-pm/scl. 6 Συνεπώς, αποτελούν ξεχωριστή οροδιαγνωστική ομάδα. Πολυάριθμες μελέτες κατέδειξαν ότι αυτοί οι ασθενείς έχουν αυξημένο κίνδυνο διάχυτης δερματικής μορφής σκληροδερμίας, με υψηλή πιθανότητα εμπλοκής του δέρματος και υπερτασική νεφρική νόσο. 1-8 Αντισώματα σε διαφορετικούς τύπους RNA Πολυμερασών εντοπίζονται σε ασθενείς με συστημική σκλήρυνση. 4,5 Ο ανοσοκυρίαρχος επίτοπος στην RNA Pol III αναγνωρίστηκε και κλωνοποιήθηκε. 3 Ο ανασυνδυασμένος ανοσοκυρίαρχος επίτοπος της RNA Pol III λειτούργησε στην μπορέστε να χρησιμοποιηθείτε μέσα ELISA με υψηλή ειδικότητα για την ανίχνευση αντι-rna Pol III αντισωμάτων σε ασθενείς με τη διάχυτη δερματική μορφή της συστημικής σκλήρυνσης, με αυξημένα σημεία εμπλοκής του δέρματος. 1 Αρχη Μεθοδου Το κεκαθαρμένο ανασυνδυασμένο ανοσοκυρίαρχο κλάσμα του RNA Pol III αντιγόνου δεσμεύεται στα πηγαδάκια μιας μικροπλάκας πολυστυρενίου. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντι-rna Pol III αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Μικροπλάκα πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με κεκαθαρμένα RNA Pol III αντιγόνο (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου (έτοιμο για χρήση) διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα RNA Pol III) 1. RNA Pol III ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο (έτοιμο για χρήση) RNA Pol III, προαραιωμένο, 1.2ml 2. RNA Pol III ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο (έτοιμο για χρήση) RNA Pol III, προαραιωμένο, 1.2ml 3. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 4. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 5. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 6. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 7. HRP Stop Soulution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 9 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών 1

ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 10 Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 RNA Pol III ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου, (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος RNA Pol III Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου, (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος RNA Pol III High Ρυθμιστής, (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 2

1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low 3

positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25 αλλά μη μεγαλύτερος από 0.6 δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A3 toυ CLSI (NCCLS) για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. 11 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του RNA Pol III ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του RNA Pol III ELISA Low. Η τιμή του RNA Pol III ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X RNA Pol III oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. RNA Pol III ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων, πλυθισμού κ.λ.π. Το δείγμα μπορεί να χαρακτηρισθεί σάν αρνητικό, ασθενές θετικό, ισχυρώς θετικό. Mονάδες Αρνητικό <20 Ασθενώς Θετικό 20-39 Συγκρατήστε θετικά στο 40-80 Εντόνως θετικά >80 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύει την παρουσία RNA Pol III αντισωμάτων και υποδηλώνει την πιθανότητα συστημικής σκλήρυνσης. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων RNA Pol III ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία ανοσοσυμπλόκων ή άλλων συναθροίσεων ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα του ασθενούς μπορεί να προκαλέσει αυξημένα επίπεδα μη ειδικής δέσμευσης και να δώσει ψευδή θετικά αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης. 2. Δεν είναι όλοι οι ασθενείς με συστημική σκλήρυνση θετικοί για RNA Pol III. Μελέτες ανοσοκαθίζησης και ELISA κατέδειξαν ότι μόνο 11% έως 23% των ασθενών με συστημική σκλήρυνση έχουν RNA Pol III αντίσωμα. 3. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 4. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα του QUANTA Lite RNA Pol III ELISA να ανιχνεύει αντι-rna Pol III αντισώματα αξιολογήθηκε με την εκτέλεση διαφόρων μελετών σε κλινικά καθορισμένους ασθενείς και επίσης με σύγκριση του RNA Polymerase III ELISA με εμπορικά διαθέσιμος Βλ. τον παρακάτω πίνακα για μια σύγκριση των αποτελεσμάτων από τη βιβλιογραφία και το QUANTA Lite RNA Pol III ELISA. 4

Πίνακας 1. Συχνότητα των αντι-rna Pol III αντισωμάτων σε διάφορες νόσους Λογοτεχνία 1,2,5-8 INOVA RNA Pol III ELISA Ασθένεια # Σύνολο # anti-rna Pol III Pos % Pos # Σύνολο # anti-rna Pol III Pos % Pos Ολικά SSc 1,2,5-8 2323 356 15% 1737 394 23% SLE 1,5 177 3 2% 30 0 0% MCTD 5 49 0 0% ND PM/DM 1 50 0 0% ND RA 1 84 1 1% 30 0 0% Αρχικός SSc 1 32 1 3% ND UCTD 2,6 243 0 0% ND NBD 1,2,5 360 4 1% 564 2 0.4% Nucleolar 5 200 3 2% ND ID ND 42 2 5% Όλοι οι έλεγχοι 968 12 1% 666 4 1% Συντομογραφίες: Pos=Θετικό, SSc=συστημική σκλήρυνση, SLE=συστημικός ερυθηματώδης λύκος, MCTD=μικτή νόσος του συνδετικού ιστού, PM/DM=πολυμυοσίτιδα/δερματομυοσίτιδα, RA=ρευματοειδής αρθρίτιδα, UCTD=μη καθορισμένη διαταραχή του συνδετικού ιστού, NBD=φυσιολογικός αιμοδότης, Nucleolar=σχήμα ανοσοφθορισμού πυρηνίου, ID=μολυσματική νόσος. Στις αναφορές 1 και 5 χρησιμοποιήθηκε ELISA, στη 2 χρησιμοποιήθηκε Western blot και στις 6, 7 και 8 χρησιμοποιήθηκε ραδιοανοσοκαθίζηση. Πίνακας 2. Εμφάνιση συμπτωμάτων σε ασθενείς που είναι θετικοί για αντι-rna Pol III # anti-rna # Διάχυτη δερματική μορφή % # Περιορισμένη ή % # Νεφρική κρίση % Pol III Pos επικαλυπτόμενη 319 264 83% 55 17% 86 27% Από τις αναφορές 1,2,5-8. Φυσιολογικές Τιμές Πεντακόσιοι είκοσι επτά τυχαίοι αιμοδότες κάτοικοι Η.Π.Α. εξετάστηκαν για αντισώματα σε RNA Pol III. Μόνο 2 δείγματα (0.4%) ήταν πάνω από την οριακή τιμή αποκοπής των 20 μονάδων με τιμές 27 και 39 μονάδες. Η μέση τιμή των 527 δειγμάτων ήταν 3.4 μονάδες. Η τυπική απόκλιση των δειγμάτων ήταν 2.6 μονάδες. Η μέση τιμή είναι 6.4 τυπικές αποκλίσεις κάτω από την οριακή τιμή των 20 μονάδων. Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης Μελέτη Aληλεπίδρασης Ένα σύνολο πενήντα ενός δειγμάτων εξετάστηκαν σε δύο κλινικά εργαστήρια με τις αναλύσεις INOVA QUANTA Lite TM RNA Pol III Εμπορικά διαθέσιμος RNA Polymerase III ELISA. Τα αποτελέσματα αυτά παρουσιάζονται παρακάτω. N= 51 Εμπορικά διαθέσιμος Anti-RNA Polymerase III ELISA INOVA QUANTA Lite Pos Neg RNA Pol III Pos 32 0 Neg 2 17 Ποσοστό συμφωνίας θετικών: 32/34 [(94%; 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI) =80-99%] Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών: 17/17 [(100%; 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI) =80-100%] Γενική συμφωνία: 49/51 (96%) Κλινικές μελέτες Διενεργήθηκαν δύο τύποι κλινικών μελετών. Σε μία μελέτη, 1319 ασθενείς με συστημική σκλήρυνση καθώς και 37 φυσιολογικοί αιμοδότες οι οποίοι είχαν δοκιμαστεί για αντι-rna Pol III με ραδιο-ανοσοκαθίζηση εξετάστηκαν με την ανάλυση QUANTA Lite RNA Pol III ELISA. Η ανάλυση ELISA έχει 96% θετικών ποσοστό συμφωνίας και 98% συμφωνίας ποσοστό συμφωνίας σε σύγκριση με την ανάλυση ραδιοανοσοκαθίζησης. Θετικό και αρνητικό ποσοστό συμφωνίας του RNA Pol III ELISA σε σύγκριση με RIP Όλα τα δείγματα RNA Pol III θετικών % συμφωνίας συμφωνίας % συμφωνίας N=1,356 από RIP (95% CI) (95% CI) συμφωνίας = + - 97.5% RNA Pol III από + 320 20* 96% (93-98%) ELISA - 14** 1,002 98% (97-99%) *Και οι 20 από αυτούς διαγνώστηκαν με SSc **Και οι 14 από αυτούς διαγνώστηκαν με SSc Ένας πρόσθετος αριθμός 418 ασθενών με συστημική σκλήρυνση και 629 αιμοδοτών ή ατόμων με μολυσματικές ή αυτοάνοσες νόσους εξετάστηκαν μόνο με το QUANTA Lite RNA Pol III ELISA, για να παρέχουν τα στοιχεία για υπολογισμό της κλινικής ευαισθησίας και ειδικότητας. 5

Κλινικές Ευαισθησία και Ειδίκευση QUANTA Lite Anti-RNA Pol III ELISA N=2,403 RNA Pol III από ELISA Κλινικές Ειδίκευση (95% CI) Κλινικές Ευαισθησία + - Όλοι οι έλεγχοι N=666 4 662 99% (98.5-99.8%) Όλοι SSc N= 1737 394 1343 23% (20.7-24.7%) Η κλινική ειδικότητα για την ανάλυση RNA Pol III ELISA είναι πάνω από 99%. Η κλινική ευαισθησία είναι 23%, το οποίο είναι σύμφωνο με τη δημοσιευμένη βιβλιογραφία. Μελέτη Aληλεπίδρασης Για την αξιολόγηση πιθανών προβλημάτων διασταυρωμένης αντιδραστικότητας με άλλα αυτοαντισώματα, αναλύθηκαν με το κιτ QUANTA Lite TM RNA Pol III διάφορα δείγματα υψηλού τίτλου θετικά για αυτοαντισώματα. Οι ειδικότητες συμπεριλάμβαναν SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Chromatin, Ribo-P, CCP και διάφορες μολυσματικές νόσους. Δεν υπήρξαν ενδείξεις διασταυρούμενης αντιδραστικότητας. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης για το QUANTA Lite TM RNA Pol III ELISA αξιολογήθηκε εξετάζοντας 9 δείγματα 9 φορές συνολικά σε 2 μέρη των εξαρτήσεων. Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται παρακάτω: Απόδοση εντός της ανάλυσης του QUANTA Lite TM RNA Pol III ELISA ELISA P2 P3 P4 P5 MP773 int 148 Μέσες Μονάδες 22 U 31 U 26 U 90 U 58 U 2 U Τυπική απόκλιση 0.7 1.3 0.6 1.5 1.5 0.1 Συντελεστής διακύμανσης 3% 4% 2% 2% 3% 5% Η διακύμανση μεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε εξετάζοντας τουλάχιστον 12 δείγματα σε κάθε ένα από 2 μέρη των εξαρτήσεων μέρη τουλάχιστον 5 διαφορετικών εκτελέσεων. Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται παρακάτω: Απόδοση ανάμεσα των αναλύσεων για το QUANTA Lite TM RNA Pol III ELISA P2 P3 P4 P5 MP773 int 148 Μέσες Μονάδες 23 U 32 U 27 U 91 U 62 U 3 U Τυπική απόκλιση 0.5 1.6 1.2 3.5 1.4 0.2 Συντελεστής διακύμανσης 2% 5% 4% 4% 2% 5% 6

Βιβλιογραφία 1. Kuwana M, et al.: Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of anti-rna polymerase III antibody: analytical accuracy and clinical associations in systemic sclerosis. Arthritis Rheum 52: 2425-2432, 2005. 2. Okano Y, Steen VD, Medsger Jr.TA: Autoantibody reactive with RNA polymerase III in systemic sclerosis. Ann Intern Med 119:1005-1013, 1993. 3. Kuwana M, Kimura K, Kawakami Y.: Identification of an immunodominant epitope on RNA polymerase III recognized by systemic sclerosis sera: application to enzyme-linked immunosorbent assay. Arthritis Rheum 46: 2742-2747, 2002. 4. Steen VD and Medsger TA:. Long term outcomes of scleroderma renal crisis. Ann Intern Med 133:600-603, 2000. 5. Chang M, et al.: Analysis of autoantibodies against RNA polymerases using immunoaffinitypurifed RNA polymerase I, II, and III antigen in an enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Immunol Immunopathol. 19: 71-78, 1998. 6. Bunn CC, et al.: Anti-RNA polymerases and other autoantibody specificities in systemic sclerosis. Br J Rheumatol. 37: 15-20, 1998. 7. Harvey GR, et al.: Clinical and serological associations with anti-rna polymerase antibodies in systemic sclerosis. Clin Exp Immunol 117:395-402, 1999. 8. Meyer OC, et al.: Disease subsets, antinuclear antibody profile, and clinical features in 127 French and 247 US adult patients with systemic sclerosis. J Rheumatol 34:104-109, 2007. 9. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, 2007 Fifth Edition. 10. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24 (38), 2004. 11. CLSI (NCCLS). Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions; Approved Guideline- 3 rd edition NCCLS Document C24-A3, Vol. 26 (25), 2006 Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 624555 June 2007 Revision GRC0 7