AFPIRMA KIP0081 KIP0084 DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue de l'industrie, 8 B1400 Nivelles Belgium
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en Read entire protocol before use. AFPIRMA I. INTENDED USE Immunoradiometric assay for the in vitro quantitative measurement of human Alpha Fetoprotein (AFP) in serum and plasma. This kit is not intended to be used for the risk evaluation of trisomy 21. II. GENERAL INFORMATION A. Proprietary name : DIAsource AFPIRMA B. Catalog number : KIP0081 : 96 tests KIP0084 : 4 x 96 tests C. Manufactured by : DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue de l'industrie 8, B1400 Nivelles, Belgium. For technical assistance or ordering information contact : Tel : +32 (0)67 88.99.99 Fax : +32 (0)67 88.99.96 III. CLINICAL BACKGROUND A. Introduction αfetoprotein (AFP) is a 70.000 Da MW oncofetal protein synthesized by liverparenchymal cells, yolk sac and gastrointestinal tract of human fetus. The peak of AFP concentration occurs between weeks 12 and 15 of gestation. After birth AFP concentration in plasma rapidly decreases to less than 5 IU/ml. AFP levels are elevated in the following clinical situation: B. Clinical applications The main clinical applications of measurements of AFP are found in the monitoring of cancer following treatment. However, AFP measurement may also be of clinical interest in monitoring of pregnancy when applied to serum or amniotic fluid. Cancer. Hepatocellular carcinoma. Teratocarcinomas and embryonal cell carcinoma of testis and ovaries. Yolk sac tumor. Other cancers (less than 5 %). Viral diseases. Acute hepatitis (usually < 0 IU/ml). Chronic active hepatitis (usually < 0 IU/ml).
IV. PRINCIPLES OF THE METHOD VIII. STORAGE AND EXPIRATION DATING OF REAGENTS DIAsource AFPIRMA is a twostep immunoradiometric assay based on coated tube separation. Mabs 1 the capture antibodies are attached to the lower and inner surface of the plastic tube. Calibrators or samples are added to the tubes. After incubation, washing removes the occasional excess of antigen. Mab 2 the 125 Ilabelledantibody is added. After incubation and washing, the remaining radioactivity bound to the tube reflects the antigen concentration. Because of the occasional extremely high concentration of AFP in serum (> 1 mg/ml) in case of cancer, the present DIAsource AFPIRMA has been developed on a two steps procedure to avoid high dose hook effects. V. REAGENTS PROVIDED Reagents TRACER: 125 Iodine labelled anti AFP (monoclonal antibodies) in phosphate buffer with bovine serum albumin, azide (0.1%) and an inert red dye Zero calibrator (0 IU/ml) in bovine serum with azide (0.5%) and merthiolate Calibrators AFP N = 1 to 5 (see exact values on vial labels) in bovine serum with thymol WASH SOLN CONC Wash solution (TRISHCl) Controls N = 1 or 2 in human serum with merthiolate 96 Test Kit 4 x 96 Test Kit Colour Code Reconstitution 2 x 48 8 x 48 dark red Ready for use 1 vial.5 ml 350 kbq 1 vial ml 5 vials lyophil. 1 vial ml 2 vials lyophil. 4 vials.5 ml 4x350 kbq 2 vials ml 2 x 5 vials lyophil. 4 vials ml 2 x 2 vials lyophil. red yellow yellow brown silver Ready for use Ready for use Add 0.5 ml distilled water Dilute 70 x with distilled water (use a magnetic stirrer). Add 0.5 ml distilled water Note : Use the zero calibrator for sample dilutions. 1 IU of the calibrator preparation is equivalent to 1 IU of the 1 st IRP 72/225 VI. SUPPLIES NOT PROVIDED The following material is required but not provided in the kit: 1. Distilled water 2. Pipettes for delivery of: 0 μl, 200 µl, 500 μl and 1 ml (the use of accurate pipettes with disposable plastic tips is recommended) 3. Vortex mixer 4. Magnetic stirrer 5. 5 ml automatic syringe (Cornwall type) for washing 6. Aspiration system (optional) 7. Any gamma counter capable of measuring 125 I may be used (minimal yield 70%). VII. Tubes coated with anti AFP (monoclonal antibodies) Ab CAL CAL CONTROL 125 I 0 N N REAGENT PREPARATION A. Calibrators : Reconstitute the calibrators 15 with 0.5 ml distilled water. B. Controls : Reconstitute the controls with 0.5 ml distilled water. C. Working Wash solution : Prepare an adequate volume of Working Wash solution by adding 69 volumes of distilled water to 1 volume of Wash Solution (70x). Use a magnetic stirrer to homogenize. Discard unused Working Wash solution at the end of the day. Before opening or reconstitution, all kit components are stable until the expiry date, indicated on the label, if kept at 2 to 8 C. After reconstitution, calibrators and controls are stable for one week at 2 to 8 C. For longer storage periods, aliquots should be made and kept at 20 C for maximum 3 months. Avoid successive freezing and thawing. Freshly prepared Working Wash solution should be used on the same day. After its first use, tracer is stable until expiry date, if kept in the original wellclosed vial at 2 to 8 C. Alterations in physical appearance of kit reagents may indicate instability or deterioration. IX. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Serum or plasma samples must be kept at 28 C. If the test is not run within 24 hrs, storage in aliquots at 20 C is recommended. Avoid successive freezing and thawing. Serum or plasma (EDTA or Heparin) provide similar results. y(serum) = 1.05 x (hep. plasma) 0.2 r = 0.98 n = 31 y(serum) = 1.05 x (EDTA plasma) 0.5 r = 0.99 n = 32 X. PROCEDURE A. Handling notes Do not use the kit or components beyond expiry date. Do not mix materials from different kit lots. Bring all the reagents to room temperature prior to use. Thoroughly mix all reagents and samples by gentle agitation or swirling. In order to avoid crosscontamination, use a clean disposable pipette tip for the addition of each reagent and sample. High precision pipettes or automated pipetting equipment will improve the precision. Respect the incubation times. Prepare a calibration curve for each run, do not use data from previous runs. B. Procedure 1. Label coated tubes in duplicate for each calibrator, control and sample. For the determination of total counts, label 2 normal tubes 2. Briefly vortex calibrators, controls and samples and dispense 50μl of each into respective tubes. 3. Shake the rack containing the tubes gently by hand to liberate any trapped air bubbles. 4. Incubate for 1 hour at room temperature. 5. Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). Be sure that the plastic tip of the aspirator reaches the bottom of the coated tube in order to remove all the liquid. 6. Wash tubes twice with 2 ml Working Wash solution (except total counts) and aspirate (or decant). Avoid foaming during the addition of the Working Wash solution. 7. After the last washing, let the tubes stand upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid. 8. Dispense 0 µl of antiafp 125 I tracer into each tube, including the uncoated tubes for total counts. 9. Shake the rack containing the tubes gently by hand to liberate any trapped air bubbles.. Incubate for 1 hour at room temperature. 11. Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). Be sure that the plastic tip of the aspirator reaches the bottom of the coated tube in order to remove all the liquid. 12. Wash tubes with 2 ml Working Wash solution (except total counts) and aspirate (or decant). Avoid foaming during the addition of the Working Wash solution. 13. Let the tubes stand upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid. 14. Count tubes in a gamma counter for 60 seconds. XI. CALCULATION OF RESULTS 1. Calculate the mean of duplicate determinations. 2. On semi logarithmic or linear graph paper plot the c.p.m. (ordinate) for each calibrator against the corresponding concentration of AFP (abscissa) and draw a calibration curve through the calibrator points, reject the obvious outliers. 3. Read the concentration for each control and sample by interpolation on the calibration curve. 4. Computer assisted data reduction will simplify these calculations. If automatic result processing is used, a 4parameter logistic function curve fitting is recommended.
XII. TYPICAL DATA The following data are for illustration only and should never be used instead of the real time calibration curve. AFPIRMA cpm B/T (%) Total count 133479 Calibrator 0.0 IU/ml 5.3 IU/ml 15.0 IU/ml 45.0 IU/ml 155.0 IU/ml 440.0 IU/ml 268 2821 6076 19122 44001 66466 XIII. PERFORMANCE AND LIMITATIONS 0.2 2.11 4.55 14.33 32.96 49.79 A. Detection limit Twenty zero calibrators were assayed along with a set of other calibrators. The detection limit, defined as the apparent concentration two standard deviations above the average counts at zero binding, was 0.5 IU/ml. B. Specificity The AFPIRMA does not crossreact with structurally related substances. Human serum albumin (HSA) at a concentration of 60 ng/ml was added to a low (5 IU/ml) and a high (50 IU/ml) AFP Calibrator, the apparent AFP response was measured. Observed AFP value IU/ml E. Time delay between last calibrator and sample dispensing As shown hereafter, assay results remain accurate even when a sample is dispensed 30 minutes after the calibrator has been added to coated tubes. Serum (ng/ml) Serum 1 Serum 2 12.7 31.3 TIME DELAY 0' 20' 30' 11.0 29.4.1 27.3 F. Hook effect A sample spiked with an AFP concentration up to 1460000 IU/ml gives higher counts than the last calibrator point. XIV. LIMITATIONS Specimens from patients who have received preparations of mouse monoclonal antibodies for diagnosis or therapy may contain human antimouse antibodies (HAMA). Such specimens may show either falsely elevated or depressed values when tested with assay kits which employ mouse monoclonal antibodies. Heterophilic antibodies in human serum can react with reagent immunoglobulins, interfering with in vitro immunoassays. Patients routinely exposed to animals or animal serum products can be prone to this interference and anomalous values may be observed in case of the presence of heterophelic antibodies. Carefully evaluate the results of patients suspected of having these antibodies. If results are not consistent with other clinical observations, additional information should be required before diagnosis. Cal 5 IU/ml + HSA (60 ng/ml) Cal 50 IU/ml + HSA (60 ng/ml) Note : this table shows the crossreactivity for the AFPIRMA. C. Precision INTRAASSAY Serum N <X> ± SD A B C D 4.2 ± 0.2 11.4 ± 0.2 26.2 ± 0.6 357 ± 19.6 CV (%) 4.8% 1.8% 2.3% 5.5% 4.8 49.0 INTERASSAY Serum N <X> ± SD E F 22 22 SD : Standard Deviation; CV: Coefficient of variation 7.8 ± 0.5 19.8 ± 1.2 CV (%) 5.8% 6.0% XV. INTERNAL QUALITY CONTROL If the results obtained for Control 1 and/or Control 2 are not within the range specified on the vial label, the results cannot be used unless a satisfactory explanation for the discrepancy has been given. If desirable, each laboratory can make its own pools of control samples, which should be kept frozen in aliquots. Acceptance criteria for the difference between the duplicate results of the samples should rely on Good Laboratory Practises. XVI. REFERENCE INTERVALS These values are given only for guidance; each laboratory should establish its own normal range of values. A. Healthy nonpregnant individuals NORMAL MEN n=111 NORMAL WOMEN n=111 MENOPAUSAL WOMEN n=29 D. Accuracy Serum 1 Serum 2 DILUTION TEST Sample Dilution Theoretical Concent. 1/1 1/3 1/6 1/ 1/50 1/1 1/2 1/4 1/ 1/20 Samples were diluted with the zero calibrator. 148.0 74.0 44.4 8.9 43.7 21.9 8.7 4.4 RECOVERY TEST Measured Concent. 444 158 86 42 9.8 87.4 39.6 21.8 9.0 4.2 0% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% % 0% 0 1 2 3 4 5 6 AFP IU/ml 0 1 2 3 4 5 6 AFP IU/ml 0 1 2 3 4 5 6 AFP IU/ml B. Pregnancy (*) Maternal serum The distribution of serum values in normal pregnancy. The upper normal limits for serum samples were obtained by expressing the data as the median multiplied by 2.5. Sample added AFP Recovered AFP Recovered (%) Week of gestation Lower values 2.5 Percentile (IU AFP/ml) Median (IU AFP/ml) Higher values 97.5 Percentile (IU AFP/ml) 2.5 Median (IU AFP/ml) Serum 1 Serum 2 7.5 22.5 80 2.5 22.5 225 9.6 23.2 82.2 2.4 21.4 218 128% 3% 3% 96% 95% 97% 15 16 17 18 19 20 11.1 15.1 19.0 23 26 30 21 28 36 42 50 58 59 73 84 93 4 113 52.5 70 90 5 125 145
(*) Studies performed for DIAsource ImmunoAssays S.A.., Belgium based on samples from Belgium. C. Oncology AFP concentrations were measured in serum during disease monitoring in three individual cases of cancer of different cell type origin. 3. KOHN, J. WEAVER, P.C. 1974. Serum alphafetoprotein in hepatocellular carcinoma. Lancet, i:334 4. KOHN, J., ORR, A.H. MC ELWAIN, T.J. et al. Serum alphafetoprotein in patients with testicular tumours. Lancet; II:433 2000 1800 1600 1400 1200 00 800 600 400 200 0 0000 000 00 0 Testis carcinoma 0.0 50.0 0.0 150.0 200.0 250.0 weeks 1 Liver carcinoma 0.0.0 20.0 30.0 40.0 50.0 weeks Ovarium carcinoma 0.0 5.0.0 15.0 weeks 5. NORGAARDPENDERSEN, B. 1976. Human alphafetoprotein A review of recent methodological and clinical studies. Scand. J. Immunol., Suppl. 4:7. 6. U.K. Collaborative study, First report. 1977. Maternal serum alphafetoprotein measurement in antenatal screening for anencephaly and spina bifidein early pregnancy. Lancet, i:1323. 7. JEVY, L.B. et al. 1995 Hepatocellular carcinoma in a pregnant woman detected by routine screening of maternal alphafetoprotein. Am. J. Obstet. Gynecology, 172(1pt1):219220. 8. VERLOES, A. et al. 1995. A prenatal trisomy 21 screening program using AFP, hcg and free estriol assays on maternal dried blood. Am. J. Obstet. Gynecology, 172(1pt1):167179. 9. CHRISTMOS, J.T. et al. 1994. The effect of fetomaternal bleeding of the risk of adverse pregnancy outcome in patients with elevated second trimester maternal serum alphafetoprotein levels. Am. J. Obstet. Gynecology, 171(2):315320. XVII. PRECAUTIONS AND WARNINGS Safety For in vitro diagnostic use only. This kit contains 125 I (halflife: 60 days),emitting ionizing X (28 kev) and γ (35.5 kev) radiations. This radioactive product can be transferred to and used only by authorized persons; purchase, storage, use and exchange of radioactive products are subject to the legislation of the end user's country. In no case the product must be administered to humans or animals. All radioactive handling should be executed in a designated area, away from regular passage. A logbook for receipt and storage of radioactive materials must be kept in the lab. Laboratory equipment and glassware, which could be contaminated with radioactive substances, should be segregated to prevent cross contamination of different radioisotopes. Any radioactive spills must be cleaned immediately in accordance with the radiation safety procedures. The radioactive waste must be disposed of following the local regulations and guidelines of the authorities holding jurisdiction over the laboratory. Adherence to the basic rules of radiation safety provides adequate protection. The human blood components included in this kit have been tested by European approved and/or FDA approved methods and found negative for HBsAg, anti HCV, antihiv1 and 2. No known method can offer complete assurance that human blood derivatives will not transmit hepatitis, AIDS or other infections. Therefore, handling of reagents, serum or plasma specimens should be in accordance with local safety procedures. All animal products and derivatives have been collected from healthy animals. Bovine components originate from countries where BSE has not been reported. Nevertheless, components containing animal substances should be treated as potentially infectious. Avoid any skin contact with reagents (sodium azide as preservative). Azide in this kit may react with lead and copper in the plumbing and in this way form highly explosive metal azides. During the washing step, flush the drain with a large amount of water to prevent azide buildup. Do not smoke, drink, eat or apply cosmetics in the working area. Do not pipette by mouth. Use protective clothing and disposable gloves. XIX. Calibrators (0 to 5) Samples, controls Incubation Separation Wash solution Separation Wash solution Separation SUMMARY OF THE PROTOCOL TOTAL COUNTS ml CALIBRATORS ml 0.05 1 hour at room temperature aspirate 2.0 aspirate 2.0 aspirate carefully SAMPLE(S) CONTROLS ml 0.05 Tracer 0.1 0.1 0.1 Incubation Separation Wash solution Separation Counting DIAsource Catalogue Nr : KIP0081 KIP0084 1 hour at room temperature aspirate 2.0 aspirate carefully Count tubes for 60 seconds P.I. Number : 1700503/en Revision nr : 28/1 XVIII. BIBLIOGRAPHY 1. CUCKLE, H.S., WALD, N.J. 1984. Maternal serum alphafetoprotein measurement : a screening test for Down Syndrome. Lancet, i:926 Revision date : 2028 2. HUNTER, W.M. BUDD, P.S. 1981. Immunoradiometric versusradioimmunoassay a comparison using alphafetoprotein as the model analyte. J. of Immunol. Meth.45:255
fr Lire entièrement le protocole avant utilisation. AFPIRMA I. BUT DU DOSAGE Trousse de dosage radioimmunométrique pour la mesure quantitative in vitro de l alphafoetoprotéine humaine (AFP) dans le sérum et le plasma humain. Cette trousse n'est pas destinée à être utilisée pour évaluer le risque de trisomie 21. II. INFORMATIONS GENERALES A. Nom du produit : DIAsource AFPIRMA kit B. Numéro de catalogue : KIP0081 : 96 tests KIP0084 : 4 x 96 tests C. Fabriqué par : DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue de l'industrie, 8 B1400 Nivelles Belgium. III. CONTEXTE CLINIQUE Pour une assistance technique ou une information sur une commande : Tel : +32 (0)67 88.99.99 Fax : +32 (0)67 88.99.96 A. Introduction L αfoetoprotéine (AFP) est une protéine oncofoetale avec un poids moléculaire de 70.000 Da, synthétisée par le foie, la vésicule vitelline et la zone gastrointestinale du fœtus humain. Le sommet de la production de l AFP a lieu entre la 12 e et la 15 e semaine de la grossesse. Après la naissance, la concentration en AFP dans le plasma décroît rapidement jusqu à moins de 5 UI/ml. Les taux en AFP sont élevés lors de la situation clinique suivante : B. Applications cliniques Les applications cliniques principales des mesures de l AFP se trouvent dans le domaine de l observation de cancer après traitement. Pourtant, la mesure de l AFP peut également avoir un intérêt clinique pour l observation de la grossesse, si elle est appliquée au sérum ou au liquide amniotique. Cancer. Carcinome hépatocellulaire. Tératocarcinome et carcinome cellulaire embryonnaire du testicule et des ovaires. Tumeur de la vésicule vitelline. Autres cancers (moins de 5 %) Maladies virales. hépatite aiguë (normalement < 0 UI/ml). hépatite active chronique (normalement < 0 UI/ml)
IV. PRINCIPE DU DOSAGE VIII. STOCKAGE ET DATE D EXPIRATION DES REACTIFS La trousse DIAsource AFPIrma est une trousse de dosage radioimmunométrique à deux phases basée sur la séparation en tube recouvert d'anticorps. Mabs1, les anticorps de capture, sont attachés sur la surface basse et interne du tube plastic. Des calibrateurs ou des échantillons sont ajoutés aux tubes. Après incubation, le lavage enlève l éventuel excès d antigène. Mab 2 l anticorps marqué avec 125 I est ajouté. Suite à l incubation et au lavage, la radioactivité restante liée au tube reflètera la concentration de l antigène. A cause de la concentration parfois extrêmement élevée de l AFP dans le sérum (> 1 mg/ml) en cas de cancer, la trousse DIAsource AFPIRMA a été développé avec une procédure à deux phases, afin d éviter des effets crochet pour les doses élevées. V. REACTIFS FOURNIS Reactifs TRACEUR: antiafp marquée à l 125 Iodine (anticorps monoclonaux) dans un tampon phosphate avec de l'albumine bovine, de l azide de sodium (<0,1%) et un colorant rouge inactif Calibrateur zéro dans du sérum bovin, de l azide de sodium (0,5%) et merthiolate Calibrateur N = 1 à 5 (cfr. Valeurs exactes sur chaque flacon) dans du sérum bovin et du thymol Solution de Lavage (TrisHCl) Contrôles N = 1 ou 2 dans du sérum humain et merthiolate 96 tests Kit 4x96 tests Kit Code Couleur 2 x 48 8 x 48 Rouge foncé 1 flacon,5 ml 350 kbq 1 flacon ml 5 flacons lyophilisé s 1 flacon ml 2 flacons lyophilisé s 4 flacons,5 ml 4x350 kbq 2 flacons ml 2 x 5 flacons lyophilisé s 4 flacons ml 2 x 2 flacons lyophilisé s Rouge Jaune Jaune Brun Gris Reconstitution Prêt à l emploi Prêt à l emploi Prêt à l emploi Ajouter 0,5 ml d eau distillée Diluer 70 x avec de l eau distillée (utiliser un agitateur magnétique). Ajouter 0,5 ml d eau distillée Note: 1. Utiliser le Calibrateur zéro pour la dilution des échantillons. 2. 1 UI de la préparation du calibrateur est équivalent à 1 UI 1 st IRP 72/225. VI. MATERIEL NON FOURNI Le matériel mentionné cidessous est requis mais non fourni avec la trousse: 1. Eau distillée 2. Pipettes pour distribuer: 0 μl, 200 µl, 500 μl et 1 ml (l utilisation de pipettes précises et de pointes jetables en plastique est recommandée) 3. Agitateur vortex 4. Agitateur magnétique 5. Seringue automatique de 5 ml (type Cornwall) pour les lavages 6. Système d aspiration (optionnel) 7. Tout compteur gamma capable de mesurer l 125 I peut être utilisé (rendement minimum 70%). VII. Tubes recouverts avec l anti AFP (anticorps monoclonal) CAL WASH Ab CAL SOLN CONTROL 0 125 I N CONC N PREPARATION DES REACTIFS A. Calibrateurs : Reconstituer les calibrateurs 15 avec 0,5 ml d eau distillée. B. Contrôles : Reconstituer les contrôles avec 0,5 ml d eau distillée. C. Solution de Lavage : Préparer un volume adéquat de Solution de Lavage en ajoutant 69 volumes d eau distillée à 1 volume de Solution de Lavage (70x). Utiliser un agitateur magnétique pour homogénéiser. Eliminer la Solution de Lavage non utilisée à la fin de la journée. Avant l ouverture ou la reconstitution, tous les composants de la trousse sont stables jusqu à la date d expiration, indiquée sur l étiquette, si la trousse est conservée entre 2 et 8 C. Après reconstitution, les calibrateurs et les contrôles sont stables pendant 7 jours entre 2 et 8 C. Pour de plus longues périodes de stockage, des aliquots devront être réalisés et ceuxci seront gardés à 20 C pendant 3 mois au maximum. Eviter des cycles de congélation et décongélation successifs. La Solution de Lavage préparée doit être utilisée le jour même. Après la première utilisation, le traceur est stable jusqu à la date d expiration, si celuici est conservé entre 2 et 8 C dans le flacon d origine correctement fermé. Des altérations dans l apparence physique des réactifs de la trousse peuvent indiquer une instabilité ou une détérioration. IX. PREPARATION ET STABILITE DE L ECHANTILLON Les échantillons de sérum ou de plasma doivent être gardés entre 2 et 8 C. Si le test n est pas réalisé dans les 24 heures, un stockage en aliquots à 20 C est recommandé. Eviter des cycles de congélation et décongélation successifs. Le sérum ou le plasma (EDTA ou héparinés) donne des résultats similaires. Y (sérum) = 1,05x (plasma hép.) 0,2 r = 0,98 n = 31 Y (sérum) = 1,05x (plasma EDTA) 0,5 r = 0,99 n = 32 X. MODE OPERATOIRE A. Notes de manipulation Ne pas utiliser la trousse ou ses composants après avoir dépassé la date d expiration. Ne pas mélanger du matériel provenant de trousses de lots différents. Mettre tous les réactifs à température ambiante avant utilisation. Mélangez tous les réactifs et les échantillons sous agitation douce. Pour éviter toute contamination croisée, utiliser une nouvelle pointe de pipette pour l addition de chaque réactif et échantillon. Des pipettes de haute précision ou un équipement de pipetage automatique permettent d augmenter la précision. Respecter les temps d incubation. Préparer une courbe de calibration pour chaque nouvelle série d expériences, ne pas utiliser les données d expériences précédentes. B. Mode opératoire 1. Identifier les tubes recouverts fournis dans la trousse, en double pour chaque calibrateur, échantillon, contrôle. Pour la détermination de l activité totale, identifier 2 tubes non recouverts d anticorps. 2. Agiter au vortex brièvement les calibrateurs, les contrôles et les échantillons. Puis distribuer 50 μl de chacun d eux dans leurs tubes respectifs. 3. Agiter légèrement le portoir de tube manuellement pour libérer toute bulle d air emprisonnée. 4. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. 5. Aspirer (ou décanter) le contenu de chaque tube (à l exception des tubes utilisés pour la détermination de l activité totale). Assurezvous que la pointe utilisée pour aspirer le liquide des tubes atteint le fond de chacun d eux pour éliminer toute trace de liquide. 6. Laver les tubes 2 fois avec 2 ml de Solution de Lavage (à l exception des tubes utilisés pour la détermination de l activité totale) et aspirer (ou décanter). Eviter la formation de mousse pendant l addition de la Solution de Lavage. 7. Après le dernier lavage, laisser les tubes droits pendant 2 minutes et aspirer (ou décanter) le reste de liquide. 8. Distribuer 0 μl de traceur dans chaque tube. 9. Agiter légèrement le portoir de tube manuellement pour libérer toute bulle d air emprisonnée.. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. 11. Aspirer (ou décanter) le contenu de chaque tube (à l exception des tubes utilisés pour la détermination de l activité totale). Assurezvous que la pointe utilisée pour aspirer le liquide des tubes atteint le fond de chacun d eux pour éliminer toute trace de liquide. 12. Laver les tubes avec 2 ml de Solution de Lavage (à l exception des tubes utilisés pour la détermination de l activité totale) et aspirer (ou décanter). Eviter la formation de mousse pendant l addition de la Solution de Lavage. 13. Laisser les tubes droits pendant 2 minutes et aspirer (ou décanter) le reste de liquide. 14. Placer les tubes dans un compteur gamma pendant 60 secondes pour quantifier la radioactivité.
XI. CALCUL DES RESULTATS TEST DE DILUTION 1. Calculer la moyenne de chaque détermination réalisée en double. 2. Dessiner sur un graphique linéaire ou semilogarithmique les cpm (ordonnées) pour chaque calibrateur contre la concentration correspondante en AFP (abscisses) et dessiner une courbe de calibration à l aide des points de calibration, écarter les valeurs aberrantes. 3. Lire la concentration pour chaque contrôle et échantillon par interpolation sur la courbe de calibration. 4. L analyse informatique des données simplifiera les calculs. Si un système d analyse de traitement informatique des données est utilisé, il est recommandé d utiliser la fonction «4 paramètres» du lissage de courbes. XII. DONNEES TYPES Les données représentées cidessous sont fournies pour information et ne peuvent jamais être utilisées à la place d une courbe de calibration. Echantillon Dilution Concent. théorique (UI/ml) Sérum 1 Sérum 2 1/1 1/3 1/6 1/ 1/50 1/1 1/2 1/4 1/ 1/20 148,0 74,0 44,4 8,9 43,7 21,9 8,7 4,4 Les échantillons ont été dilués avec le calibrateur zéro. Concent. Mesurée (UI/ml) 444 158 86 42 9,8 87,4 39,6 21,8 9,0 4,2 Activité totale Calibrateur AFPIRMA cpm B/T (%) 0,0 UI/ml 5,3 UI/ml 15,0 UI/ml 45,0 UI/ml 155,0 UI/ml 440,0 UI/ml 133479 268 2821 6076 19122 44001 66466 XIII. PERFORMANCE ET LIMITES DU DOSAGE 0,2 2,11 4,55 14,33 32,96 49,79 A. Sensibilité Vingt calibrateurs zéro ont été testés en parallèle avec un assortiment d autres calibrateurs. La limite de détection, définie comme la concentration apparente située 2 déviations standards audessus de la moyenne déterminée à la fixation zéro, était de 0,5 UI/ml. B. Spécificité La trousse AFPIRMA ne présente pas de réactivité croisée avec des substances structurellement analogues. De l albumine de sérum humain (HSA) avec une concentration de 60 ng/ml a été ajoutée à un calibrateur AFP bas (5 IU/ml) et haut (50 IU/ml), la réponse apparente de l AFP a été mesurée. Cal 5 IU/ml + HSA (60 ng/ml) Cal 50 IU/ml + HSA (60 ng/ml) Valeur d AFP observée IU/ml 4,8 49,0 P.S.: ce tableau montre la réactivité croisée de l AFPIRMA C. Précision E. Délai entre la distribution du dernier calibrateur et celle de l échantillon Comme montré cidessous, les résultats d un essai restent précis même quand un échantillon est distribué 30 minutes après que le calibrateur a été ajouté aux tubes avec l anticorps. Sérum (ng/ml) Sérum 1 Sérum 2 DELAI 0' 20' 30' 12,7 31,3 11,0 29,4,1 27,3 F. Effet crochet Un échantillon dopé avec de l AFP jusqu à 1460000 UI/ml donne des cpm supérieurs au dernier point de calibration. XIV. LIMITATIONS Les échantillons de patients ayant reçu des préparations d'anticorps monoclonaux de souris pour un diagnostic ou comme traitement peuvent contenir des anticorps humains antisouris (HAMA). De tels échantillons peuvent montrer des valeurs soit faussement élevées soit faussement basses lorsqu'ils sont analysés avec des trousses d'analyses utilisant des anticorps monoclonaux de souris. Des anticorps hétérophiles dans le sérum humain peuvent réagir avec le réactif immunoglobulines, interférant ainsi avec les méthodes d'analyse immunologiques in vitro. Les patients couramment en contact avec des animaux ou des produits de sérum animal peuvent être sujets à ces interférences. Des valeurs anormales peuvent être observées en cas de présence d'anticorps hétérophiles. Évaluer soigneusement les résultats des patients suspectés d'avoir ces anticorps. Si les résultats ne sont pas cohérents avec les autres observations cliniques, des informations supplémentaires doivent être demandées avant de poser le diagnostic. INTRAESSAI Sérum N <X> ± SD A B C D 4,2 ± 0,2 11,4 ± 0,2 26,2 ± 0,6 357 ± 19,6 CV (%) 4,8% 1,8% 2,3% 5,5% INTERESSAI Sérum N <X> ± SD E F 22 22 SD : Déviation Standard; CV: Coéfficient de variation D. Exactitude TEST DE RECUPERATION 7,8 ± 0,5 19,8 ± 1,2 CV (%) 5,8% 6,0% XV. CONTROLE QUALITE INTERNE Si les résultats obtenus pour le(s) contrôle(s) 1 et/ou 2 ne sont pas dans l intervalle spécifié sur l étiquette du flacon, les résultats ne peuvent pas être utilisés à moins que l'on ait donné une explication satisfaisante de la nonconformité. Chaque laboratoire est libre de faire ses propres stocks d échantillons contrôles, lesquels doivent être congelés aliquotés. Les critères d acceptation pour les écarts des valeurs in duplo des échantillons doivent être basés sur les pratiques de laboratoire courantes. Echantillon AFP ajoutée AFP récupérée Récupération (%) Sérum 1 7,5 22,5 80 9,6 23,2 82,2 128% 3% 3% Sérum 2 2,5 22,5 225 2,4 21,4 218 96% 95% 97%
XVI. VALEURS ATTENDUES Les valeurs sont données à titre d information; chaque laboratoire doit établir ses propres écarts de valeurs. A. Individus sains qui ne sont pas en état de grossesse 0% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% % 0% Hommes normaux n=111 0 1 2 3 4 5 6 AFP IU/ml Femmes normales n=111 0 1 2 3 4 5 6 AFP IU/ml Femmes ménopausiques n=29 0 1 2 3 4 5 6 AFP IU/ml B. Grossesse (*) Sérum maternel La distribution des valeurs de sérum pendant une grossesse normale. Les limites normales supérieures ont été obtenues par l expression des données comme la médiane multipliée par 2,5. Semaine de la grossesse 15 16 17 18 19 20 Valeurs inférieures Percentile 2,5 (UI AFP/ml) 11,1 15,1 19,0 23 26 30 Médiane (UI AFP/ml) 21 28 36 42 50 58 Valeurs supérieures Percentile 97,5 (UI AFP/ml) 59 73 84 93 4 113 2,5 Médiane (UI AFP/ml) 52,5 70 90 5 125 145 (*) Etudes effectuées pour DIAsource ImmunoAssays S.A.., Belgium, basées sur des échantillons belges. C. Oncologie Lors de l observation de la maladie, les concentrations en AFP ont été mesurées pour trois cas individuels de cancer d origine cellulaire différente. 2000 180 160 140 120 0 800 600 400 200 0 000 00 0 0 Carcinome du testicule 0.0 50.0 0. 150. 200. 250. wee 1 Carcinome du foie 0.0. 20.0 30.0 40.0 50.0 wee Carcinome des ovaires 0.0 5.0. 15. wee contaminée avec des substances radioactives, doivent être isolés afin d éviter la contamination croisée de plusieurs isotopes. Toute contamination ou perte de substance radioactive doit être réglée conformément aux procédures de radio sécurité. Les déchets radioactifs doivent être placés de manière à respecter les réglementations en vigueur. L'adhésion aux règles de base de sécurité concernant les radiations procure une protection adéquate. Les composants de sang humain inclus dans ce kit ont été évalués par des méthodes approuvées par l Europe et/ou la FDA et trouvés négatifs pour HBsAg, l antihcv, l antihiv1 et 2. Aucune méthode connue ne peut offrir l'assurance complète que des dérivés de sang humain ne transmettront pas d hépatite, le sida ou toute autre infection. Donc, le traitement des réactifs, du sérum ou des échantillons de plasma devront être conformes aux procédures locales de sécurité. Tous les produits animaux et leurs dérivés ont été collectés d'animaux sains. Les composants bovins proviennent de pays où l ESB n'a pas été détectée. Néanmoins, les composants contenant des substances animales devront être traités comme potentiellement infectieux. L azide de sodium est nocif s il est inhalé, avalé ou en contact avec la peau (l azide de sodium est utilisé comme agent conservateur). L azide dans cette trousse pouvant réagir avec le plomb et le cuivre dans les canalisations et donner des composés explosifs, il est nécessaire de nettoyer abondamment à l eau le matériel utilisé. Ne pas fumer, ni boire, ni manger ni appliquer de produits cosmétiques dans les laboratoires où des produits radioactifs sont utilisés. Ne pas pipeter avec la bouche. Utiliser des vêtements protecteurs et des gants à usage unique. XVIII. BIBLIOGRAPHIE 1. CUCKLE, H.S., WALD, N.J. 1984. Maternal serum alphafetoprotein measurement : a screening test for Down Syndrome. Lancet, i:926 2. HUNTER, W.M. BUDD, P.S. 1981. Immunoradiometric versusradioimmunoassay a comparison using alphafetoprotein as the model analyte. J. of Immunol. Meth.45:255 3. KOHN, J. WEAVER, P.C. 1974. Serum alphafetoprotein in hepatocellular carcinoma. Lancet, i:334 4. KOHN, J., ORR, A.H. MC ELWAIN, T.J. et al. Serum alphafetoprotein in patients with testicular tumours. Lancet; II:433 5. NORGAARDPENDERSEN, B. 1976. Human alphafetoprotein A review of recent methodological and clinical studies. Scand. J. Immunol., Suppl. 4:7. 6. U.K. Collaborative study, First report. 1977. Maternal serum alphafetoprotein measurement in antenatal screening for anencephaly and spina bifidein early pregnancy. Lancet, i:1323. 7. JEVY, L.B. et al. 1995 Hepatocellular carcinoma in a pregnant woman detected by routine screening of maternal alphafetoprotein. Am. J. Obstet. Gynecology, 172(1pt1):219220. 8. VERLOES, A. et al. 1995. A prenatal trisomy 21 screening program using AFP, hcg and free estriol assays on maternal dried blood. Am. J. Obstet. Gynecology, 172(1pt1):167179. 9. CHRISTMOS, J.T. et al. 1994. The effect of fetomaternal bleeding of the risk of adverse pregnancy outcome in patients with elevated second trimester maternal serum alphafetoprotein levels. Am. J. Obstet. Gynecology, 171(2):315320. XVII. PRECAUTIONS ET AVERTISSEMENTS Sécurité Pour utilisation en diagnostic in vitro uniquement. Cette trousse contient de l 125 I (demivie: 60 jours), une matière radioactive émettant des rayonnements ionisants X (28 kev) et γ (35.5 kev). Ce produit radioactif peut uniquement être reçu, acheté, possédé ou utilisé par des personnes autorisées; l achat, le stockage, l utilisation et l échange de produits radioactifs sont soumis à la législation du pays de l'utilisateur final. Ce produit ne peut en aucun cas être administré à l homme ou aux animaux. Toutes les manipulations radioactives doivent être exécutées dans un secteur désigné, éloigné de tout passage. Un journal de réception et de stockage des matières radioactives doit être tenu à jour dans le laboratoire. L'équipement de laboratoire et la verrerie, qui pourrait être
XIX. RESUME DU PROTOCOLE ACTIVITE TOTALE (ml) CALIBRA TEURS (ml) ECHANTIL LON(S) CONTROLES (ml) Calibrateurs (05) Echantillons, Contrôles 0,05 0,05 Incubation 1 heure à temperature ambiante Séparation Solution de Lavage Séparation Solution de Lavage Séparation aspiration 2,0 aspiration 2,0 aspiration Traceur 0,1 0,1 0,1 Incubation 1 heure à temperature ambiante Séparation Solution de Lavage Séparation aspiration 2,0 aspiration Comptage Temps de comptage des tubes: 60 secondes Numéro de catalogue DIAsource : KIP0081 KIP0084 Numéro de P.I.: 1700503/fr Numéro de révision : 28/1 Date de révision : 2028
nl Lees het hele protocol vóór gebruik. AFPIRMA I. BEOOGD GEBRUIK Immunoradiometrische testkit voor de in vitro kwantitatieve bepaling van humaan AlfaFoetoproteïne (AFP) in serum en plasma. Deze testkit mag niet worden gebruikt bij de evaluatie van het risico op trisomie 21. II. ALGEMENE INFORMATIE A. Gedeponeerd handelsmerk: DIAsource AFPIRMA kit B. Catalogusnummer: KIP0081: 96 testen KIP0084: 4 x 96 testen C. Geproduceerd door: DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue de l'industrie 8, B1400 Nivelles, België. Voor technische assistentie of voor bestelinformatie kunt u contact opnemen met: Tel.: +32 (0)67 88 99 99 Fax: +32 (0)67 88 99 96 III. KLINISCHE ACHTERGROND A. Inleiding αfoetoproteïne (AFP) is een oncofoetaal proteïne met een moleculair gewicht 70.000 Da dat gesynthetiseerd wordt door parenchymale cellen van de lever, de dooierzak en de gastrointestinale zone van de menselijke foetus. De piek van AFPconcentratie doet zich voor tussen de 12e en de 15e week van de zwangerschap. Na de geboorte neemt de AFPconcentratie in plasma snel af tot minder dan 5 IU/ml. De AFPniveaus zijn hoog bij de volgende klinische situatie: B. Klinische toepassingen De belangrijkste toepassingen van het bepalen van AFP behelzen de opvolging van kanker na behandeling. Nochtans kan de bepaling van AFP ook een klinisch belang hebben bij de opvolging van zwangerschap als zij toegepast wordt op serum of amniotisch fluïdum. Kanker. Hepatocellulair carcinoma. Teratocarcinoma en embryonale celkanker van de testikels en de eierstokken. Tumor aan de dooierzak. Andere kankers (minder dan 5 %). Virale aandoeningen. Acute hepatitis (gewoonlijk < 0 IU/ml). Chronische actieve hepatitis (gewoonlijk < 0 IU/ml).
IV. BESCHRIJVING VAN DE METHODE VIII. OPSLAG EN VERVALDATUM VAN REAGENTIA AFPIrma van DIAsource is een immunoradiometrisch testkit in twee fasen die gebaseerd is op een scheiding aan de hand van een gecoate buis. Mabs1, de invangantilichamen, zijn onderaan aan het binnenoppervlak van de plastic buis gehecht. Kalibrators of monsters worden toegevoegd aan de buisjes. Na incubatie verwijdert een wasfase het gebeurlijke teveel aan antigenen. Mab 2 het met 125 I gelabelde antilichaam wordt toegevoegd. Na incubatie en de wasfase geeft de overblijvende radioactiviteit, gebonden aan de buis, de antigeenconcentratie weer. Omwille van de soms bijzonder hoge concentratie van AFP in serum (> 1 mg/ml) in geval van kanker, is deze DIAsource AFPIRMA ontwikkeld in een procedure met twee fasen om het hook effect bij hoge doses te vermijden. V. GELEVERDE REAGENTIA Vóór opening of reconstitutie zijn alle kitcomponenten houdbaar tot de vervaldatum, zoals vermeld op het etiket, indien zij bewaard werden bij 2 tot 8 C. Na reconstitutie zijn de kalibrators en controles gedurende 7 dagen houdbaar bij 2 tot 8 C. Voor een langere bewaartermijn moeten aliquots gemaakt worden, die bij 20 C bewaard moeten worden voor maximaal 3 maanden. Vermijd opeenvolgende cycli van bevriezen en ontdooien. Een vers bereide werkwasoplossing moet op dezelfde dag nog gebruikt worden. Na het eerste gebruik is de tracer houdbaar tot de vervaldatum, indien bewaard bij 2 tot 8 C in de oorspronkelijke, goed afgesloten flacon. Wijzigingen in het fysieke aspect van kitreagentia kunnen wijzen op instabiliteit of op een kwaliteitsvermindering. Reagentia TRACER: AntiAFP (monoklonale antilichamen) gelabeld met 125 jood in fosfaat buffer met bovien serumalbumine, azide (< 0,1%) en een inerte rode kleurstof Nulkalibrator in bovien serum en azide (0.5%) en merthiolaat Kalibrator N = 1 tot 5 (raadpleeg de flaconetiketten voor de exacte waarden) in bovien serum en thymol Wasoplossing (TrisHCl) Controles N = 1 of 2 in humaan serum en merthiolaat Kit met 96 testen Kit met 4 x 96 testen Kleur Code 2 x 48 8 x 48 Donker rood 1 flacon,5 ml 350 kbq 1 flacon ml 5 flacons, gevriesdroogd 1 flacon ml 2 flacons, gevriesdroogd 4 flacons,5 ml 4x350 kbq 2 flacons ml 2 x 5 flacons, gevriesdroogd 4 flacons ml 2 x 2 flacons, gevriesdroogd Rood Geel Geel Bruin Zilver Reconstitutie Klaar voor gebruik Klaar voor gebruik Klaar voor gebruik 0,5 ml gedestilleerd water toevoegen 70 x met gedestilleerd water verdunnen (gebruik een magnetische roerder). 0,5 ml gedestilleerd water toevoegen Opmerking: 1. Gebruik de Nulkalibrator voor monsterverdunningen. 2. 1 IE van de kalibratorbereiding is gelijk aan 1 IE 1 st IRP 72/225. VI. NIET MEEGELEVERDE MATERIALEN De volgende materialen zijn noodzakelijk maar worden niet meegeleverd met de kit: 1. Gedestilleerd water. 2. Pipetten voor een volume van 0 µl, 200 µl, 500 µl en 1 ml (het gebruik van nauwkeurige pipetten met plastic wegwerptips wordt aanbevolen). 3. Automatische spuit van 5 ml (type Cornwall) voor de wasfase. 4. Afzuigsysteem (facultatief). 5. Vortexmenger. 6. Magnetische roerder. 7. Een gammateller die geschikt is voor de bepaling van 125 I (rendement van ten minste 70%). VII. buizen gecoat met antiafp (monoklonale antilichamen) Ab WASH CAL CAL CONTROL 125 I SOLN 0 N N CONC BEREIDING VAN HET REAGENS IX. MONSTERAFNAME EN MONSTERBEREIDING Serum en plasma moeten bij 2 tot 8 C bewaard worden. Indien de bepaling niet binnen 24 uur uitgevoerd wordt, dan wordt aanbevolen om ze, in aliquots, bij 20 C te bewaren. Vermijd opeenvolgende cycli van bevriezen en ontdooien Serum en plasma (EDTA en heparine) leveren vergelijkbare resultaten op. Y (serum) = 1,05x (Hep. plasma) 0,2 r = 0,98 n = 31 Y (serum) = 1,05x (EDTA plasma) 0,5 r = 0,99 n = 32 X. PROCEDURE A. Opmerkingen bij de procedure Gebruik de kit of de componenten niet langer dan de aangegeven vervaldatum. Materialen van kits van verschillende loten mogen niet gemengd worden. Laat alle reagentia op kamertemperatuur komen vóór gebruik. Meng alle reagentia en monsters goed door ze voorzichtig te bewegen of door er voorzichtig mee te draaien. Om kruisbesmetting te vermijden, moet een propere wegwerpbare pipettip gebruikt worden voor toevoeging van elk reagens en monster. Pipetten met een grote precisie of geautomatiseerde pipetteerapparatuur zullen de precisie verhogen. Respecteer de incubatietijden. Bereid een kalibratiecurve voor elke run; men mag geen gegevens gebruiken van voorafgaande runs. B. Procedure 1. Etiketteer de gecoate buisjes in duplo voor elke kalibrator, voor elke controle en voor elk monster. Etiketteer 2 normale buizen voor de bepaling van de totaaltellingen. 2. Vortex de kalibrators, controles en monsters gedurende korte tijd en pipetteer 50 µl van elk in de desbetreffende buis. 3. Schud het rek met de buizen voorzichtig met de hand zodat eventueel ingesloten luchtbellen vrijkomen. 4. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. 5. Zuig de inhoud van elke buis (met uitzondering van de totaaltellingen) op (of decanteer) Zorg ervoor dat de plastic tip van de aspirator tot aan de bodem van de gecoate buis komt zodat alle vloeistof verwijderd wordt. 6. Was de buizen tweemaal met 2 ml werkwasoplossing (met uitzondering van de totaaltellingen). Vermijd schuimvorming tijdens toevoeging van de werkwasoplossing. 7. Na de laatste wasfase moeten de buizen gedurende twee minuten rechtop blijven staan en zuig daarna de overblijvende vloeistof op. 8. Pipetteer 0 µl van de tracer in elke buis. 9. Schud het rek met de buizen voorzichtig met de hand zodat eventueel ingesloten luchtbellen vrijkomen.. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. 11. Zuig de inhoud van elke buis (met uitzondering van de totaaltellingen) op (of decanteer) Zorg ervoor dat de plastic tip van de aspirator tot aan de bodem van de gecoate buis komt zodat alle vloeistof verwijderd wordt. 12. Was de buizen met 2 ml werkwasoplossing (met uitzondering van de totaaltellingen) en zuig de inhoud van elke buis op (of decanteer). Vermijd schuimvorming tijdens toevoeging van de werkwasoplossing. 13. Laat de buizen gedurende twee minuten rechtop staan en zuig daarna de overblijvende vloeistof op. 14. Tel de buizen in een gammateller gedurende 60 seconden. A. Kalibrators: Reconstitueer de kalibrators 15 met 0,5 ml gedestilleerd water. B. Controles: Reconstitueer de controles met 0,5 ml gedestilleerd water. C. Werkwasoplossing: Bereid een voldoende hoeveelheid werkwasoplossing door 69 eenheden gedestilleerd water toe te voegen aan 1 eenheid wasoplossing (70 x). Gebruik een magnetische roerder voor de homogenisering. Op het eind van de dag moet de ongebruikte werkwasoplossing afgevoerd worden.
XI. BEREKENING VAN DE RESULTATEN 1. Bereken het gemiddelde voor de bepalingen in duplo. 2. Zet de cpm (ordinaat) uit voor elke kalibrator tegen de overeenkomstige AFP concentratie (abscis) op semilogaritmisch of lineair millimeterpapier en teken een kalibratiecurve door de kalibratiepunten, waarbij de duidelijke uitschieters verworpen worden. 3. Lees door interpolatie de concentratie voor elke controle en voor elk monster op de kalibratiecurve. 4. Door computergestuurde gegevensreductie worden deze berekeningen vereenvoudigd. Indien de resultaten automatisch verwerkt worden, wordt de 4 parameter logistische functie aanbevolen voor de gepaste curve. XII. KENMERKENDE GEGEVENS De volgende gegevens dienen enkel ter illustratie en mogen in geen geval gebruikt worden ter vervanging van de real time kalibratiecurve. Totaaltelling Kalibrator AFPIRMA cpm B/T (%) 0,0 IU/ml 5,3 IU/ml 15,0 IU/ml 45,0 IU/ml 155,0 IU/ml 440,0 IU/ml 133479 268 2821 6076 19122 44001 66466 0,2 2,11 4,55 14,33 32,96 49,79 Monster Verdunning Theoretische concentratie (IE/ml) Serum 1 Serum 2 1/1 1/3 1/6 1/ 1/50 1/1 1/2 1/4 1/ 1/20 148,0 74,0 44,4 8,9 43,7 21,9 8,7 4,4 De stalen zijn verdund met de nulkalibrator. Concentratie die bepaald werd (IE/ml) 444 158 86 42 9,8 87,4 39,6 21,8 9,0 4,2 F. Tijdspanne tussen de laatste kalibrator en distributie van het monster Zoals hieronder weergegeven wordt, blijven de resultaten van de bepaling nauwkeurig, zelfs wanneer een monster 30 minuten na toevoeging van de kalibrator in de gecoate buizen gepipetteerd wordt. Serum (ng/ml) Serum 1 Serum 2 TIJDSPANNE 0' 20' 30' 12,7 31,3 11,0 29,4,1 27,3 XIII. EIGENSCHAPPEN EN GRENZEN A. Detectielimiet Twintig nulkalibrators werden bepaald, samen met een reeks andere kalibrators. De detectielimiet, omschreven als de schijnbare concentratie van twee standaarddeviaties boven de gemiddelde tellingen bij nulbinding, bedroeg 0,5 IE/ml. B. Specificiteit De AFPIRMA vertoont geen kruisreactiviteit met structureel verwante substanties. Humaan serumalbumine (HSA) bij een concentratie van 60 ng/ml is toegevoegd aan een lage (5 IU/ml) en een hoge (50 IU/ml) AFP Kalibrator, de schijnbare AFPrespons werd gemeten. Cal 5 IU/ml + HSA (60 ng/ml) Cal 50 IU/ml + HSA (60 ng/ml) Waargenomen AFPwaarde IU/ml 4,8 49,0 Opmerking: deze tabel toont de kruisreactiviteit voor de AFPIRMA. C. Precisie G. "Hook"effect Een monster, waaraan 1460000 IE/ml AFP werd toegevoegd, levert hogere tellingen op dan het laatste kalibratiepunt. XIV. BEPERKINGEN Specimens van patiënten die voor de diagnose of behandeling preparaten hebben gekregen van monoklonale antilichamen van muizen kunnen humane antimuisantilichamen (HAMA) bevatten. Dergelijke specimens kunnen ofwel valsverhoogde of valsverlaagde waarden vertonen wanneer ze met testkits worden getest waarbij gebruik wordt gemaakt van monoklonale antilichamen van muizen. Heterofiele antilichamen in humaan serum kunnen reageren met reagensimmunoglobulinen, wat een effect kan hebben op in vitro immunoassays. Patiënten die regelmatig aan dieren of dierlijke serumproducten worden blootgesteld, kunnen vatbaar zijn voor een dergelijk effect, terwijl afwijkende waarden kunnen worden waargenomen wanneer heterofiele antilichamen aanwezig zijn. Beoordeel de resultaten zorgvuldig van patiënten van wie vermoed wordt dat ze deze antilichamen hebben. Als de resultaten niet overeenstemmen met andere klinische waarnemingen moet bijkomende informatie worden verkregen voordat de diagnose wordt gesteld. BINNEN EEN TEST TUSSEN TESTEN XV. INTERNE KWALITEITSCONTROLE Serum N <X> ± SD (IE/ml) A B C D 4,2 ± 0,2 11,4 ± 0,2 26,2 ± 0,6 357 ± 19,6 VC (%) 4,8% 1,8% 2,3% 5,5% SD: standaarddeviatie; VC: variatiecoëfficiënt D. Nauwkeurigheid Monster Serum 1 Toegevoegd AFP (IE/ml) Serum N <X> ± SD (IE/ml) E F RECOVERY TEST 7,5 22,5 80 22 22 Recovery van AFP (IE/ml) 9,6 23,2 82,2 7,8 ± 0,5 19,8 ± 1,2 VC (%) Recovery (%) 5,8% 6,0% 128% 3% 3% Indien de resultaten, die verkregen werden voor controle 1 en/of controle 2, niet binnen het bereik vallen zoals vermeld op het flaconetiket, dan mogen de resultaten niet gebruikt worden tenzij een bevredigende uitleg gegeven wordt voor de discrepantie. Indien gewenst, kan elk laboratorium zijn eigen pools voor controlemonsters maken, die dan in aliquots bewaard moeten worden in de diepvriezer. Aanvaardingscriteria voor het verschil tussen de resultaten in duplo van monsters moeten steunen op gangbare laboratoriumpraktijken. XVI. REFERENTIEINTERVALS Deze waarden worden slechts als leidraad gegeven; elk laboratorium moet zijn eigen normaal bereik van waarden uitmaken. A. Gezonde nietzwangere individuen Serum 2 2,5 22,5 225 2,4 21,4 218 96% 95% 97%
B. Zwangerschap(*) Maternaal serum De distributie van serumwaarden bij normale zwangerschap. De normale bovenlimieten voor serummonsters zijn weergegeven als de mediaanwaarden vermenigvuldigd met 2,5 Week van de zwangerschap 15 16 17 18 19 20 Lagere waarden 2,5 Percentiel (IU AFP/ml) 11,1 15,1 19,0 23 26 30 Mediaan (IU AFP/ml) 21 28 36 42 50 58 Hogere waarden 97,5 Percentiel (IU AFP/ml) 59 73 84 93 4 113 2,5 Mediaan (IU AFP/ml) 52,5 70 90 5 125 145 (*) Studies uitgevoerd voor DIAsource ImmunoAssays S.A., Belgium, gebaseerd op Belgische stalen. C. Oncologie AFP concentraties werden gemeten in serum tijdens de opvolging van de ziekte bij drie individuele gevallen van kanker van een verschillend celtype als oorsprong. 2000 0% 1800 1600 1400 1200 00 800 600 400 200 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% % 0% 0 0000 000 00 0 Testiscarcinoma 0.0 50.0 0.0 150.0 200.0 250.0 week s 1 Normale mannen n=111 0 1 2 3 4 5 6 AFP IU/ml Levercarcinoma 0.0.0 20.0 30.0 40.0 50.0 week s Normale vrouwen n=111 0 1 2 3 4 5 6 AFP IU/ml Ovariumcarcinoma 0.0 5.0.0 15.0 week s XVII. VOORZORGSMAATREGELEN EN WAARSCHUWINGEN Menopausale vrouwen n=29 0 1 2 3 4 5 6 AFP IU/ml bijgehouden in het laboratorium. Laboratoriumapparatuur en glaswerk, dat eventueel gecontamineerd werd met radioactieve bestanddelen, moeten worden gesegregeerd om kruisbesmetting van verschillende radioisotopen te vermijden. Als radioactief materiaal gemorst werd, dan moet dat onmiddellijk gereinigd worden in overeenstemming met de procedure voor stralingsveiligheid. Het radioactieve afval moet worden weggegooid in overeenstemming met de plaatselijke voorschriften en richtlijnen van de autoriteiten waaronder het laboratorium valt. Naleving van de basisregels van stralingsveiligheid zorgt voor een juiste bescherming. De componenten, afkomstig van menselijk bloed, in deze kit werden getest door in Europa goedgekeurde en/of door de Amerikaanse FDA goedgekeurde methoden op aanwezigheid van HBsAg, antihcv, antihiv1 en 2 en gaven een negatief resultaat. Geen enkele bekende methode kan echter volledige garantie bieden dat derivaten van menselijk bloed geen hepatitis, aids of andere infecties overdragen. Daarom moet men reagentia, serum of plasmamonsters behandelen in overeenstemming met de plaatselijke veiligheidsprocedures. Alle producten en derivaten van dierlijke oorsprong zijn afkomstig van gezonde dieren. Boviene componenten komen uit landen waar BSE niet gerapporteerd werd. Toch moeten componenten die bestanddelen van dierlijke oorsprong bevatten, behandeld worden als potentieel infectieus materiaal. Vermijd dat de reagentia (natriumazide als conserveermiddel) in contact komen met de huid. Azide in deze kit kan reageren met lood en koper in de afvoerleidingen en op die manier zeer explosieve metaalaziden vormen. Tijdens de wasfase moeten de afvoerleidingen ruimschoots met water nagespoeld worden om ophoping van azide te vermijden. Niet roken, drinken, eten of cosmetica aanbrengen in de werkruimte. Niet met de mond pipetteren. Draag beschermende kleding en gebruik wegwerphandschoenen. XVIII. BIBLIOGRAFIE 1. CUCKLE, H.S., WALD, N.J. 1984. Maternal serum alphafetoprotein measurement : a screening test for Down Syndrome. Lancet, i:926 2. HUNTER, W.M. BUDD, P.S. 1981. Immunoradiometric versus radioimmunoassay a comparison using alphafetoprotein as the model analyte. J. of Immunol. Meth.45:255 3. KOHN, J. WEAVER, P.C. 1974. Serum alphafetoprotein in hepatocellular carcinoma. Lancet, i:334 4. KOHN, J., ORR, A.H. MC ELWAIN, T.J. et al. Serum alphafetoprotein in patients with testicular tumours. Lancet; II:433 5. NORGAARDPENDERSEN, B. 1976. Human alphafetoprotein A review of recent methodological and clinical studies. Scand. J. Immunol., Suppl. 4:7. 6. U.K. Collaborative study, First report. 1977. Maternal serum alphafetoprotein measurement in antenatal screening for anencephaly and spina bifidein early pregnancy. Lancet, i:1323. 7. JEVY, L.B. et al. 1995 Hepatocellular carcinoma in a pregnant woman detected by routine screening of maternal alphafetoprotein. Am. J. Obstet. Gynecology, 172(1pt1):219220. 8. VERLOES, A. et al. 1995. A prenatal trisomy 21 screening program using AFP, hcg and free estriol assays on maternal dried blood. Am. J. Obstet. Gynecology, 172(1pt1):167179. 9. CHRISTMOS, J.T. et al. 1994. The effect of fetomaternal bleeding of the risk of adverse pregnancy outcome in patients with elevated second trimester maternal serum alphafetoprotein levels. Am. J. Obstet. Gynecology, 171(2):315320. Veiligheid Uitsluitend voor in vitro diagnostisch gebruik. Deze kit bevat 125 I (halfwaardetijd: 60 dagen), dat ioniserende X (28 kev) en γstralen (35.5 kev) uitzendt. Dit radioactieve product mag enkel overhandigd worden aan en gebruikt worden door bevoegd personeel; ontvangst, opslag, gebruik en overdracht van radioactieve producten zijn onderworpen aan de wetgeving van het land van de eindgebruiker. In geen geval mag het product toegediend worden aan mensen of dieren. Alle handelingen met radioactief materiaal moeten plaatsvinden in een daartoe bestemde ruimte, waar uitsluitend bevoegd personeel toegelaten wordt. Een logboek met ontvangst en opslag van radioactieve materialen moet worden