ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΟΜΗΣ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ ΙΟΡ ΑΝΙ ΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΟΜΗΣ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ HNF-4α ΣΤΗ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ ΙΟΡ ΑΝΙ ΟΥ ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΟΜΗΣ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ HNF-4α ΣΤΗ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τµήµα Βιολογίας, Τοµέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας. Ηµεροµηνία Προφορικής Εξέτασης: 25 Φεβρουαρίου 2005 Εξεταστική Επιτροπή Αν. Καθηγήτρια Μ. Χατζοπούλου-Κλαδαρά, Επιβλέπουσα Καθηγητής Μ. Αρσενάκης, Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Αν. Καθηγητής. Καρδάσης, Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Ζ. Σκούρας, Εξεταστής Καθηγήτρια Α. Λάζου, Εξετάστρια Αν. Καθηγήτρια Π. Μαυραγάνη, Εξετάστρια Αν. Καθηγήτρια Α. Κουβάτση, Εξετάστρια 2

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας διερευνήθηκε ο ρόλος επιµέρους περιοχών και αµινοξέων του ηπατικού µεταγραφικού παράγοντα HNF-4α στην ενεργοποίηση της µεταγραφής και αλληλεπίδραση µε µόρια των συνενεργοποιητών. Ο HNF-4α είναι ένας καθοριστικός µεταγραφικός παράγοντας για την ανάπτυξη και λειτουργία του ήπατος των ανώτερων οργανισµών ελέγχοντας τη ρύθµιση πολλών σηµαντικών ηπατικών γονιδίων, όπως τα γονίδια των απολιποπρωτεϊνών. Στόχος της εργασίας ήταν να διερευνηθεί περαιτέρω η σχέση δοµής-λειτουργίας στο µόριο του µεταγραφικού παράγοντα, του οποίου ο µηχανισµός δράσης δεν είναι πλήρως κατανοητός, ειδικά όσον αφορά στη σηµασία των επιµέρους περιοχών, που επηρεάζουν την αλληλεπίδρασή του µε διάφορα είδη µορίων. Τέτοια µόρια, που ενδέχεται να ρυθµίζουν τη δράση του in vivo, είναι τα λιπαρά οξέα, µε τα οποία δείχθηκε πρόσφατα από την κρυσταλλογραφία ότι συνδέεται στα κύτταρα, και διάφοροι συνενεργοποιητές της µεταγραφής, µε τους οποίους έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά. Το πειραµατικό µέρος της παρούσας εργασίας πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογίας Ανάπτυξης του Τοµέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του Τµήµατος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη της Αν. Καθηγήτριας κ. Μαργαρίτας Χατζοπούλου- Κλαδαρά, την οποία ευχαριστώ βαθύτατα για την ανάθεση του θέµατος, την πολύτιµη καθοδήγηση και τη συµπαράστασή της όλα αυτά τα χρόνια. Αν υπάρχει κάτι, που µπορεί να κρατήσει κάποιον στις δύσκολες στιγµές, είναι η αγάπη του για αυτό που κάνει. Αυτό είναι ένα µάθηµα, που σπάνια βιώνεται, και το χρωστώ εξ ολοκλήρου σε αυτήν. Θερµές ευχαριστίες οφείλω στα µέλη της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, Καθηγητή Μηνά Αρσενάκη και Αν. Καθηγητή ηµήτρη Καρδάση, για την καλή τους διάθεση να συζητούν κατά καιρούς µαζί µου τα αποτελέσµατα της παρούσας εργασίας προσφέροντας ιδέες και συµβουλές για τη συνέχισή της. Επίσης, ευχαριστώ τα µέλη της Επταµελούς Εξεταστικής Επιτροπής, Καθηγητή Ζαχαρία Σκούρα, Καθηγήτρια Αντιγόνη Λάζου, Αν. Καθηγήτρια Πηνελόπη Μαυραγάνη και Αν. Καθηγήτρια Αναστασία Κουβάτση, που δέχτηκαν να µε εξετάσουν. Οι ευχαριστίες δε θα ήταν ολοκληρωµένες, αν δεν αναφερόµουν στα διάφορα εργαστήρια, που µε «φιλοξένησαν» για τις ανάγκες των πειραµάτων κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής µου. Ευχαριστώ θερµά τους Καθηγητές κ.κ. Αρσενάκη, 3

Λάζου, Σκούρα, Τριανταφυλλίδη, Αν. Καθηγητές κ.κ. Γιάγκου, Παπαδόπουλο και την Επίκουρο Καθηγήτρια κ. Αφροδίτη Σιβροπούλου, που µου εµπιστεύτηκαν τη χρήση συσκευών και χώρων των εργαστηρίων τους, καθώς και τους συναδέλφους στα εργαστήρια αυτά για την αµέριστη βοήθεια, που µου πρόσφεραν όποτε χρειάστηκε. Καταλήγοντας, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα µέλη του εργαστηρίου, παλιά και τωρινά, για τη συνεργασία µαζί τους, τη συµπαράσταση και κατανόησή τους σε δύσκολες περιόδους και, γενικά, για τις στιγµές που µοιραστήκαµε. Τα ονόµατα είναι πολλά για να αναφερθούν στις περιορισµένες διαστάσεις αυτού του κειµένου, χωρίς αυτό να µειώνει την ευγνωµοσύνη που οφείλω στον καθέναν ξεχωριστά. Μεταξύ αυτών ένα µεγάλο ευχαριστώ απευθύνω στο συνάδελφο Τάσο Αλατζά, Υποψήφιο ιδάκτορα του Τµήµατος, µε τον οποίο µοιραστήκαµε τους χώρους του εργαστηρίου όλα αυτά τα έτη. Τέλος, τις θερµότερες ευχαριστίες οφείλω στη συνεργάτιδά µου Έλενα Αγγελίδου, Υποψήφια ιδάκτορα του Τµήµατος, για την άψογη συνεργασία µας καθ όλο το διάστηµα εκπόνησης της διδακτορικής µου διατριβής. Την ευγνωµονώ βαθύτατα για την υποµονή και αµέριστη βοήθειά της όλον αυτόν τον καιρό. Κοιτάζοντας πίσω, είναι αδύνατο να φανταστώ την πορεία µου στο Εργαστήριο Βιολογίας Ανάπτυξης χωρίς αυτήν. Κλείνοντας αυτόν το σύντοµο πρόλογο ευχαριστώ τους φίλους, που µε στήριξαν όλα αυτά τα χρόνια, για τη συµπαράστασή τους- τις θερµότερες ευχαριστίες όλων, ωστόσο, απευθύνω στους γονείς και το σύντροφό µου, για την απεριόριστη στήριξή τους. Χωρίς αυτήν, η παρούσα εργασία δε θα είχε ίσως φτάσει στο τέλος της. Τους την αφιερώνω. Θεσσαλονίκη, Φεβρουάριος 2005 4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 13 Α. Η ρύθµιση της µεταγραφής στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς 14 Ι. Η αλληλουχία γεγονότων στους υποκινητές των µεταγραφόµενων γονιδίων 14 ΙΙ. Οι επαγώγιµοι µεταγραφικοί παράγοντες αυξάνουν την ταχύτητα της «βασικής µεταγραφής» 18 ΙΙΙ. Έναρξη της ευκαρυωτικής µεταγραφής: η συνισταµένη πολλών πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων 20 B. Η οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων 24 IV. Πυρηνικοί υποδοχείς: µια οικογένεια επαγώγιµων µεταγραφικών παραγόντων. οµή και µηχανισµός δράσης τους στα κύτταρα 24 Γ. Το µέλος της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων HNF-4α 29 V. HNF-4α: ένα µέλος της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων µε καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη και το µεταβολισµό των ανώτερων οργανισµών 29 i. Ο ρόλος του HNF-4α στη φυσιολογική ανάπτυξη και λειτουργία του οργανισµού 29 ii. HNF-4α και παθογένεση 32 VI. οµή του HNF-4α: λειτουργικές περιοχές των διάφορων ισοµορφών και ο ρόλος τους 33 VII. Λειτουργικές αλληλεπιδράσεις του HNF-4α µε διάφορες κατηγορίες µορίων ελέγχουν τη ρύθµιση της µεταγραφής 39 i. Αλληλεπίδραση µε συνενεργοποιητές της µεταγραφής 39 ii. Αλληλεπίδραση µε συγκαταστολείς της µεταγραφής 42 iii. Αλληλεπίδραση µε µόρια-συνδέτες 43 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 46 ΜΕΘΟ ΟΙ 47 Ι. Εισαγωγή σηµειακών µεταλλάξεων στο cdna του µεταγραφικού παράγοντα HNF-4α. Κλωνοποίηση των χιµαιρικών µορίων HNF-4α και Bio-PGC-1. 48 ιαλύµατα 48 i. ηµιουργία επιλεγµένων σηµειακών µεταλλάξεων στην LBD περιοχή του rhnf-4α2 µε τη µέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) 49 5

ii. Ηλεκτροφορητικός έλεγχος του προϊόντος της αντίδρασης PCR σε πηκτή αγαρόζης 59 iii. Καθαρισµός του ενθέµατος µε φαινόλη/χλωροφόρµιο 60 iv. Πέψη του ενθέµατος και του φορέα κλωνοποίησης µε ενδονουκλεάσες περιορισµού και αποφωσφορυλίωση των 5 άκρων του ενθέµατος µε αλκαλική φωσφατάση 60 v. Καθαρισµός του φορέα και του ενθέµατος από την πηκτή µε το σύστηµα QIAquick (Qiagen) 62 vi. Επανένωση φορέα-ενθέµατος µε την επίδραση λιγάσης 64 II. Βακτηριακές καλλιέργειες 65 ιαλύµατα και µέσα καλλιέργειας 65 Βακτηριακά στελέχη 65 i. Προετοιµασία stock βακτηριακών κυττάρων σε γλυκερόλη 65 ii. Προετοιµασία ικανών προς µετασχηµατισµό κυττάρων 65 III. Παρασκευή πλασµιδιακού DNA και αποµόνωση επιθυµητών πρωτεϊνών από καλλιέργειες µετασχηµατισµένων βακτηρίων 66 ιαλύµατα και µέσα καλλιέργειας 66 i. Μετασχηµατισµός ικανών βακτηριακών κυττάρων E.coli 68 ii. Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µικρής κλίµακας για έλεγχο αποικιών 69 iii. Αποµόνωση πλασµιδιακούdna µεγάλης κλίµακας (Qiagen Maxi Prep) 71 iv. Φασµατοφωτοµετρικός προσδιορισµός της συγκέντρωσης DNA 72 v. Επαγωγή της έκφρασης επιθυµητών (GST χιµαιρικών) πρωτεϊνών σε βακτηριακή καλλιέργεια: το οπερόνιο lacz 72 IV. Καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυτταρικών σειρών και πειράµατα επιµόλυνσης κυττάρων για τη µελέτη της δραστικότητας του µεταγραφικού παράγοντα HNF-4α και των µεταλλάξεών του 73 ιαλύµατα και µέσα καλλιέργειας 73 Κυτταρικές σειρές 74 i. Συντήρηση κυτταρικών σειρών 74 ii. Παροδική επιµόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων µε µείγµα Ca 3 (PO 4 ) 2 -DNA 75 iii. Συλλογή κυττάρων και παρασκευή κυτταρικών εκχυλισµάτων 77 iv. Συλλογή κυττάρων και παρασκευή πυρηνικών εκχυλισµάτων 77 6

V. In vitro µελέτη αλληλεπιδράσεων DNA-πρωτεϊνών: Ανάλυση της Μεταβολής Ηλεκτροφορητικής Κινητικότητας (EMSA) 78 ιαλύµατα 78 i. Υβριδισµός της ακολουθίας-στόχου 79 ii. Σήµανση της ακολουθίας-στόχου µε [γ- 32 P] 80 iii. Αντιδράσεις σχηµατισµού συµπλόκων DNA-πρωτεϊνών και ηλεκτροφορητική ανάλυση των συµπλόκων σε πηκτή πολυακρυλαµίδης 82 VI. Ανάλυση µεταγραφικής ενεργότητας των µεταλλάξεων του HNF-4α 83 ιαλύµατα 83 i. οκιµασία CAT 84 ii. οκιµασία β-gal 85 VII. In vitro και in vivo µελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνικών συµπλόκων σε πηκτές πολυακρυαµίδης και εντοπισµός πρωτεϊνών µε τη µέθοδο της ανοσοανίχνευσης 86 ιαλύµατα 86 i. έσµευση των GST χιµαιρικών πρωτεϊνών, που έχουν εκφραστεί σε βακτήρια, σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης 88 ii. Ηλεκτροφορητική ανάλυση των δεσµευµένων πρωτεϊνών 89 iii. In vitro αντιδράσεις αλληλεπίδρασης των δεσµευµένων GST πρωτεϊνών µε πρωτεΐνες που εκφράζονται σε πυρηνικά εκχυλίσµατα ευκαρυωτικών κυττάρων, ανάλυση των πρωτεϊνικών συµπλόκων που προκύπτουν και ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνες PVDF 90 iv. Ανοσοανίχνευση πρωτεϊνών κατά Western 90 v. In vivo µελέτη της αλληλεπίδρασης βιοτινυλιωµένων πρωτεϊνών µε πρωτεΐνες-στόχους τους στα κύτταρα 92 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 95 I. Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων, που εισάγονται στις έλικες 5,10,11 της LBD περιοχής του HNF-4α, στην ενεργότητα του µορίου: µελέτη µε GAL-4 χιµαιρικά µόρια 96 i. Μελέτη της µεταγραφικής ενεργοποίησης απουσία συνενεργοποιητών 96 ii. Μελέτη της µεταγραφικής ενεργοποίησης παρουσία συνενεργοποιητών 105 iii. Προσπάθεια χαρτογράφησης συγκεκριµένων LXXLL µοτίβων του συνενεργοποιητή SRC-3, που ευθύνονται για την αλληλεπίδραση µε τον HNF-4α 107 7

II. Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων, που εισάγονται στις έλικες 5,10,11 της LBD περιοχής του HNF-4α, στην ενεργότητα του µορίου: µεταφορά των µεταλλάξεων στο πλήρες µόριο του HNF-4α 112 i. Πρόσδεση στο DNA και µελέτη ιδιοτήτων διµερισµού των σηµειακών µεταλλάξεων σε ολόκληρο το µόριο του HNF-4α 112 ii. Μεταγραφική µελέτη των σηµειακών µεταλλάξεων σε ολόκληρο το µόριο του HNF-4α απουσία και παρουσία συνενεργοποιητών 119 iii. Μελέτη των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων µεταξύ του HNF-4α και του PGC-1 121 a. In vitro µελέτη 121 β. In vivo µελέτη 126 III. Λειτουργικές αλληλεπιδράσεις του HNF-4α µε µόρια των συνενεργοποιητών: διερεύνηση της σηµασίας άλλων περιοχών εκτός από την κοιλότητα πρόσδεσης του ενδογενούς συνδέτη 128 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 133 I. Η αναγκαιότητα λειτουργικής µελέτης της LBD περιοχής του HNF-4α 134 II. Επίδραση µεταλλάξεων στην έλικα 5 της LBD περιοχής του HNF-4α 135 ΙΙΙ. Ο HNF-4 είναι ένας «ορφανός» υποδοχέας µε ενδογενείς συνδέτες 141 IV. Επίδραση µεταλλάξεων στις έλικες 10, 11 της LBD περιοχής του HNF-4α 144 V. HNF-4α: ένα νέο πρότυπο ενεργοποίησης προκύπτει 148 VI. Η λειτουργία της περιοχής D στη µεταγραφική ενεργοποίηση και αλληλεπίδραση µε συνενεργοποιητές του HNF-4α 153 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 157 ABSTRACT 159 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 161 8

ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ ΚΑΙ ΠΙΝΑΚΩΝ Σχήµατα Σχ.1: Σταδιακή συγκρότηση του προεναρκτηρίου συµπλόκου της µεταγραφής 16 Σχ.2: Στρατολόγηση του ολοενζύµου της RNA πολυµεράσης ΙΙ 17 Σχ.3: Συγκρότηση του ενισχυοσώµατος 23 Σχ.4: Το «µοντέλο της ποντικοπαγίδας» 27 Σχ.5: Το µοτίβο φφχεφφ των πυρηνικών υποδοχέων 28 Σχ.6: Ο HNF-4α είναι µια συντηρηµένη εξελικτικά πρωτεΐνη 34 Σχ.7: Οργάνωση του γονιδίου και ισοµορφές της πρωτεΐνης του HNF-4α 38 Σχ.8: Εισαγωγή σηµειακών µεταλλάξεων µε τη µέθοδο «επιµήκυνσης των επικαλυπτόµενων άκρων» 51 Σχ.9: Προβλεπόµενη δευτεροταγής διαµόρφωση του HNF-4α 97 Σχ.10: Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων της έλικας 5 στη µεταγραφική ενεργότητα των pcmxgal-lbd µορίων σε COS-7 κύτταρα 99 Σχ.11: Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων της έλικας 5 στη µεταγραφική ενεργότητα των pcmxgal-lbd µορίων σε HepG2 κύτταρα 100 Σχ.12: Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων των ελίκων 10, 11 στη µεταγραφική ενεργότητα των pcmxgal-lbd µορίων σε COS-7 κύτταρα 102 Σχ.13: Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων των ελίκων 10, 11 στη µεταγραφική ενεργότητα των pcmxgal-lbd µορίων σε HepG2 κύτταρα 103 Σχ.14: Έκφραση των pcmxgal-lbd µορίων σε COS-7 κύτταρα 104 Σχ.15: οµή των συνενεργοποιητών PGC-1 και SRC-3 106 Σχ.16: Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων των ελίκων 5, 10, 11 στην αλληλεπίδραση των pcmxgal-lbd µορίων µε το συνενεργοποιητή PGC-1 108 Σχ.17: Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων των ελίκων 5, 10, 11 στην αλληλεπίδραση των pcmxgal-lbd µορίων µε το συνενεργοποιητή SRC-3 109 Σχ.18: Αποτελέσµατα του διϋβριδικού συστήµατος µελέτης της αλληλεπίδρασης των pcmxgal-lbd µορίων µε το συνενεργοποιητή VP16-SRC3 111 Σχ.19: Κλωνοποίηση των σηµειακών µεταλλάξεων των ελίκων 5, 10, 11 στο µόριο HNF-4α άγριου τύπου και έκφραση των µεταλλαγµένων πρωτεϊνών 113 Σχ.20: Έλεγχος διµερισµού και πρόσδεσης στο DNA των pcdna3.1-lbd µορίων 116 Σχ.21: Έλεγχος ετεροδιµερισµού των pcdna3.1-lbd µορίων µε τον άγριο τύπο 117 Σχ.22: Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων των ελίκων 5, 10, 11 των pcdna3.1- LBD µορίων στη δραστικότητα του ενδογενούς HNF-4α : οι µεταλλάξεις 9

δρουν ως επικρατείς αρνητικές µορφές του µεταγραφικού παράγοντα 118 Σχ.23: Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων των ελίκων 5, 10, 11 των pcdna3.1- LBD µορίων στην ενεργοποίηση υποκινητών φυσικών γονιδίων-στόχων του HNF-4α 120 Σχ.24: Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων των ελίκων 5, 10, 11 των pcdna3.1- LBD µορίων στην ενεργοποίηση υποκινητών φυσικών γονιδίων-στόχων του HNF-4α παρουσία του συνενεργοποιητή PGC-1 122 Σχ.25: In vitro µελέτη της πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης των pcmxgal-lbd µορίων µε το συνενεργοποιητή PGC-1 124 Σχ.26: In vitro µελέτη της πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης των pcdna3.1-lbd µορίων µε το συνενεργοποιητή PGC-1 125 Σχ.27: In vivo µελέτη της πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης της µετάλλαξης R226G µε το συνενεργοποιητή PGC-1 127 Σχ.28: Επίδραση ελλειµµατικών µεταλλάξεων του HNF-4α στην αλληλεπίδραση µε το συνενεργοποιητή PGC-1 131 Σχ.29: Επίδραση ελλειµµατικών µεταλλάξεων του HNF-4α στην αλληλεπίδραση µε το συνενεργοποιητή SRC-3 132 Σχ.30: Κρυστάλλωση του LBD του HNF-4α 140 Σχ.31: οµικό µοντέλο της µετάλλαξης R226G 143 Σχ.32: οµικό µοντέλο της µετάλλαξης I338F 145 Σχ.33: οµικό µοντέλο της µετάλλαξης I346F 147 Πίνακες Πίν.1: Ολιγονουκλεοτίδια που χρησιµοποιήθηκαν για την εισαγωγή των σηµειακών µεταλλάξεων στις έλικες 5, 10, 11 των pcmxgal-lbd µορίων 52 Πίν.2: Θερµοκρασίες αποδιάταξης (T m ) των ολιγονουκλεοτιδίων του Πίν.1 53 Πίν.3: Ολιγονουκλεοτίδια που χρησιµοποιήθηκαν για την εισαγωγή των σηµειακών µεταλλάξεων στις έλικες 5, 10, 11 των pcdna3.1-lbd µορίων 56 Πίν.4: Θερµοκρασίες αποδιάταξης (T m ) των ολιγονουκλεοτιδίων του Πίν.3 57 Πίν.5: Ολιγονουκλεοτίδια που χρησιµοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση του συνενεργοποιητή PGC-1 στο φορέα pcdna3.1-bio 58 Πίν.6: Θερµοκρασίες αποδιάταξης (T m ) των ολιγονουκλεοτιδίων του Πίν.5 58 10

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ AF-1/2: Activation Function-1/2 β-gal: β-galactosidase BRG-1: Brahma Related Gene-1 CAT: Chloramphenicol AcetylTransferase CBP: CREB (c-amp response element binding protein) Binding Protein COUP-TF I/II: Chicken Ovalbumin Upstream Promoter-Transcription Factor I/II CYP7A1: Cytochrome P450 7A1 DBD: DNA-Binding Domain ER: Estrogen Receptor GR: Glucocorticoid Receptor GRIP1: Glucocorticoid Receptor Interacting Protein 1 GST: Glutathione S Transferase h: human HDL: High Density Lipoproteins HNF-1: Hepatocyte Nuclear Factor-1 HNF-4: Hepatocyte Nuclear Factor-4 HSP: Heat Shock Proteins LBD: Ligand-Binding Domain LBP: Ligand-Binding Pocket LDL: Low Density Lipoproteins m: mouse MAR: Matrix Attachment Region MODY: Maturity Onset Diabetes of the Young MTP: Microsomal Triglyceride Transfer Protein NIDDM: Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus NFκB: Nuclear Factor for the κ light chain of B lymphocytes NGFI-B: Nerve Growth Factor Interacting protein-b P/CAF: p300/cbp Associated Factor PEPCK: PhosphoEnolPyruvate CarboxyKinase PGC-1: PPAR-Gamma Coactivator-1 PPAR-γ: Peroxisome Proliferator Activated Receptor-γ PXR: Pregnane X Receptor RAR: Retinoic Acid Receptor 11

RXR: Retinoid X Receptor SMRT: Silencing Mediator for the Retinoid and Thyroid receptors SP1: Specificity Protein 1 SPDB: Swiss Protein Data Bank SRC: Steroid Receptor Coactivator SREBP-1: Sterol Response Element Binding Protein-1 SWI/SNF: yeast mating type SWItching/Sucrose Non-Fermenting TAF II : TBP Associated Factor II TBP: TATA Binding Protein TFII: Transcription Factor of RNA polymerase II TR: Thyroid Receptor TRAP: Thyroid Receptor Associated Protein VLDL: Very Low Density Lipoproteins VP16: (Herpes simplex) Viral Protein 16 12

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 13

Α. Η ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Ι. Η αλληλουχία γεγονότων στους υποκινητές των µεταγραφόµενων γονιδίων Η προσαρµογή κάθε οργανισµού στις εναλλασσόµενες συνθήκες του περιβάλλοντος όσο και η συντονισµένη λειτουργία του, από τους µονοκύτταρους προκαρυώτες ως τους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, απαιτούν την αυστηρά ελεγχόµενη ρύθµιση της έκφρασης της γενετικής πληροφορίας, που οι οργανισµοί περιέχουν. Η ρύθµιση αυτή συντελείται κατά κύριο λόγο στο επίπεδο της µεταγραφής. Είναι προφανής η καθοριστική σηµασία που έχει η διερεύνηση των µηχανισµών της µεταγραφικής ρύθµισης, τόσο στους προκαρυωτικούς οργανισµούς όσο και στους ευκαρυωτικούς, και ειδικότερα το κρίσιµο βήµα της σύνδεσης της RNA πολυµεράσης στον υποκινητή του µεταγραφόµενου γονιδίου. Η σύνδεση αυτή είναι ένα από τα πρώτα βήµατα στην έκφραση ενός γονιδίου και σηµατοδοτεί συνήθως την έναρξη της µεταγραφικής διαδικασίας. Ειδικότερα στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, µετά την ανακάλυψη της ύπαρξης των τριών ευκαρυωτικών RNA πολυµερασών (Roeder & Rutter, 1969) η κατανόηση των µηχανισµών της µεταγραφής έχει σηµειώσει αλµατώδη πρόοδο. Ωστόσο, τα ερωτήµατα που παραµένουν αναπάντητα είναι τόσα, ώστε να απέχουµε αρκετά ακόµη από το σηµείο να κατανοούµε πλήρως τις µοριακές αλληλεπιδράσεις, που συνθέτουν το τοπίο της µεταγραφικής ρύθµισης ενός γονιδίου. Προσπάθειες για την κατανόηση της ύπαρξης τριών διακριτών RNA πολυµερασών στα κύτταρα των ευκαρυωτικών οργανισµών έδειξαν από πολύ νωρίς την ειδίκευση κάθε πολυµεράσης στη µεταγραφή διαφορετικών οµάδων γονιδίων. Συγκεκριµένα, η RNA πολυµεράση Ι βρέθηκε να εµπλέκεται στη µεταγραφή των rrna γονιδίων, η RNA πολυµεράση ΙΙ στη µεταγραφή γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες µέσω της σύνθεσης mrna, ενώ η RNA πολυµεράση ΙΙΙ δείχθηκε να εµπλέκεται στη σύνθεση των 5S RNA και trna (Roeder, 2003). Παρ όλ αυτά και τα τρία ένζυµα έδειχναν να διαθέτουν ανάλογους περιορισµούς ως προς την παρουσία απαραίτητων «παραγόντων» ώστε να µπορούν να ενεργοποιούν τη µεταγραφή επιλεγµένων DNA αλληλουχιών in vitro, καθώς ήταν αδύνατη η µεταγραφή γονιδίων-στόχων παρουσία µόνο καθαρών κλασµάτων πολυµεράσης (Roeder, 2003). Αυτό οδήγησε σταδιακά στην αποµόνωση και το χαρακτηρισµό των βασικών µεταγραφικών παραγόντων, που συνοδεύουν τις RNA πολυµεράσες (Matsui et al., 14

1980, Samuels et al., 1982), και την «αναπαραγωγή» της µεταγραφικής διαδικασίας in vitro εφ όσον προηγουµένως αποµονώνονταν καθαρά κλάσµατα των βασικών µεταγραφικών παραγόντων από κυτταρικά εκχυλίσµατα. Μελέτες αυτού του είδους, που έγιναν χρησιµοποιώντας ως «µήτρα» γυµνό DNA, δηλαδή DNA απαλλαγµένο από ιστόνες, δεν άργησαν να οδηγήσουν στην ανακάλυψη µιας σειράς διαδοχικών βηµάτων, τα οποία θεωρήθηκαν καθοριστικά για το σχηµατισµό των προεναρκτηρίων συµπλόκων της µεταγραφής από την RNA πολυµεράση ΙΙ (Buratowski et al., 1989). Το µοντέλο της «σταδιακής συγκρότησης» των προεναρκτηρίων µεταγραφικών συµπλόκων περιγράφει τη διαδοχική στρατολόγηση των βασικών µεταγραφικών παραγόντων και της RNA πολυµεράσης στους υποκινητές των µεταγραφόµενων γονιδίων. Σύµφωνα µε αυτό το µοντέλο η αναγνώριση της βασικής αλληλουχίας ΤΑΤΑ, που αποτελεί µέρος των υποκινητών πολλών ευκαρυωτικών γονιδίων, από την TATA-Βinding Ρrotein (TBP) του βασικού µεταγραφικού παράγοντα TFIID οδηγεί στη στρατολόγηση του παράγοντα TFIIB, ο οποίος φέρνει µαζί του την RNA πολυµεράση ΙΙ συνδεδεµένη µε έναν ακόµη βασικό µεταγραφικό παράγοντα, τον TFIIF. Τέλος, πρόσδεση των παραπάνω στην αλληλουχία του υποκινητή έχει ως αποτέλεσµα τη στρατολόγηση των βασικών µεταγραφικών παραγόντων TFIIE και TFIIH και το εξαρτώµενο από ATP άνοιγµα της διπλής έλικας του DNA στον υποκινητή (Σχ.1). Μία υποµονάδα του TFIIH µε δραστικότητα κινάσης φωσφορυλιώνει την καρβοξυτελική περιοχή (Carboxy- Terminal Domain, CTD) της RNA πολυµεράσης II, µε αποτέλεσµα την αποδέσµευση του συµπλόκου από τον υποκινητή και την επιµήκυνση του νεοσυντιθέµενου RNA (Orphanides et al., 1996). Ωστόσο, προσπάθειες αποµόνωσης από τα κύτταρα της RNA πολυµεράσης ΙΙ από αρκετούς ερευνητές οδηγούσαν επανειληµµένα στην αποµόνωση του ενζύµου σε σύµπλεγµα µε διάφορες πρωτεΐνες. Μερικές από αυτές ήταν το σύµπλοκο αναδιοργάνωσης της χρωµατίνης BRG-1 των θηλαστικών (Brahma Related Gene-1) και η πρωτεΐνη p300 µε δράση ακετυλοτρανσφεράσης των ιστονών (Neish et al., 1998), ή η πολύ οµόλογη προς την p300 πρωτεΐνη CBP (CREB Binding Protein) (Lemon & Tjian, 2000). Αυτό οδήγησε στη διατύπωση της πρότασης ότι στα κύτταρα υπάρχουν έτοιµα σύµπλοκα της RNA πολυµεράσης II µε τους βασικούς µεταγραφικούς παράγοντες, τα οποία στρατολογούνται ως ενιαία σύνολα στους υποκινητές των µεταγραφόµενων γονιδίων. 15

Σε πολλές µελέτες που ακολούθησαν βρέθηκε ότι ο µεταγραφικός παράγοντας TFIID δεν περιλαµβανόταν στα «έτοιµα» ολοένζυµα της RNA πολυµεράσης µε τους υπόλοιπους µεταγραφικούς παράγοντες. Μάλιστα, το ξεχωριστό βήµα της στρατολόγησής του προτάθηκε ως η καθοριστική προϋπόθεση για την έναρξη της µεταγραφής στους υποκινητές των γονιδίων. Στη συνέχεια διαπιστώθηκε πως όχι µόνο ο TFIID αλλά και ο TFIIΑ δεν περιλαµβανόταν σε πολλά τέτοια σύµπλοκα. Έτσι, προτάθηκε στη βιβλιογραφία ότι η έλλειψη κάποιων από τους βασικούς µεταγραφικούς παράγοντες ελέγχει κάθε φορά την έναρξη της µεταγραφής (Lemon & Tjian, 2000) (Σχ.2). Σχ.1. Σταδιακή συγκρότηση του προεναρκτηρίου συµπλόκου (Lemon & Tjian, 2000). Βιοχηµικές µελέτες έδειξαν ότι η in vitro έναρξη της µεταγραφής απατεί τη διαδοχική σύνδεση των βασικών µεταγραφικών παραγόντων στoν υποκινητή µε καθορισµένη σειρά, όπως απεικονίζεται από τα λεπτά µαύρα βέλη στο σχήµα. CBP, SRC=συνενεργοποιητές µε δράση ακετυλοτρανσφεράσης των ιστονών, ISWI=πρωτεΐνες µε ενζυµική δράση ATPάσης, που τροποποιούν τη χρωµατίνη, ARC/DRIP/TRAP και CRSP =συνενεργοποιητές των θηλαστικών, που συνδέουν την RNA πολυµεράση II (RNAP II ) µε µεταγραφικούς παράγοντες, CE=ένζυµο που συµµετέχει στη δηµιουργία της 5 καλύπτρας στο νεοσυντιθέµενο mrna, EFs=παράγοντες επιµήκυνσης, SFs=παράγοντες συρραφής εξωνίων Fig.1. Stepwise assembly of the preinitiation complex (Lemon & Tjian, 2000). Biochemical studies suggest that the in vitro reconstitution of promoter binding and transcription initiation requires a specific ordered assembly of the general transcription factors associated with RNA pol II (RNAP II ), as indicated by the small black arrows in the figure. CBP, SRC=histone acetyltransferases, ISWI=chromatin remodeling factors with ATPase activity, ARC/DRIP/TRAP and CRSP=multifunctional co-regulators that interact with RNA pol II and multiple types of activators, CE=capping enzyme, EFs=elongation factors, SFs=splicing factors 16

Σχ.2. Στρατολόγηση του ολοενζύµου της RNA πολυµεράσης II (Lemon & Tjian, 2000), που περιλαµβάνει παράγοντες αναδιοργάνωσης της χρωµατίνης, πολλούς συνενεργοποιητές, την RNA πολυµεράση II (RNAP II ), τη βασική µεταγραφική µηχανή, και παράγοντες επεξεργασίας του RNA. Στο ολοένζυµο της πολυµεράσης έχει αναφερθεί ότι συµµετέχουν διάφορα πολυπεπτίδια, που ανήκουν στην κατηγορία των συνενεργοποιητών των θηλαστικών SRB και Med, οµόλογα προς το συνενεργοποιητή Mediator της ζύµης. Άλλες αναφορές υποστηρίζουν ότι συστατικό του ολοενζύµου αποτελεί το σύµπλοκο αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης SWI/SNF µε δράση ATPάσης, και ο συνενεργοποιητής CBP. Αντίθετα, ο TBP, οι συνενεργοποιητές TAF II, που συνοδεύουν το βασικό µεταγραφικό παράγοντα TFIID, ο βασικός µεταγραφικός παράγοντας TFIIA, και το σύµπλοκο SAGA, µε δράση ακετυλοτρανσφεράσης των ιστονών, δε συµπεριλαµβάνονται. Σε αυτό το µοντέλο η έναρξη της µεταγραφής προϋποθέτει τουλάχιστον δύο ξεχωριστά βήµατα: τη σύνδεση της RNA πολυµεράσης και του TFIID (ή TFIIA). Fig.2. RNA pol II holoenzyme recruitment (Lemon & Tjian, 2000). Depicted is the holoenzyme containing chromatin remodeling facotrs, multiple co-regulators, RNA polymerase, the core initiation machinery, and RNA processing factors. The holoenzyme has been variously defined to contain multiple SRB and Med polypeptides, which are homologous to the yeast Mediator, as well as SWI/SNF, a chromatin remodeling complex with ATPase activity, and CBP. By contrast, TBP, TBP Associated Factors (TAF II s), the general transcription factor TFIIA, and the histone acetyltransferase complex SAGA, were not found to form part of the pre-assembled holoenzyme. With such a model at least two steps are required for transcription initiation, involving separate recruitment of RNA pol II and TFIID (or TFIIA). 17

Στην πραγµατικότητα είναι δυνατόν να απαντώνται και οι δύο τύποι µεταγραφικής ρύθµισης in vivo, δηλαδή η σταδιακή στρατολόγηση των βασικών µεταγραφικών παραγόντων, µε καθορισµένη σειρά, σε κάποιους υποκινητές, και η σύνδεση προσχηµατισµένων ολοενζύµων σε άλλους. Πολύ συχνά τα προσχηµατισµένα σύµπλοκα της πολυµεράσης είναι ηµιτελή, δηλαδή η πολυµεράση είναι συνδεδεµένη µε κάποιους αλλά όχι όλους τους απαραίτητους µεταγραφικούς παράγοντες, µε αποτέλεσµα η σύνδεση στον υποκινητή αυτών των µεταγραφικών παραγόντων που λείπουν από το ολοένζυµο, όπως ο TFIID, να είναι το κρίσιµο βήµα που καθορίζει την έναρξη της µεταγραφής (Alberts et al., 2002). ΙΙ. Οι επαγώγιµοι µεταγραφικοί παράγοντες αυξάνουν την ταχύτητα της «βασικής µεταγραφής» Είναι προφανές ότι τα παραπάνω σηµεία σύνδεσης όλων ή κάποιων καθοριστικών µεταγραφικών παραγόντων στους υποκινητές αποτελούν κοµβικά σηµεία για τη ρύθµιση της µεταγραφικής διαδικασίας. Ειδικότερα, τα σηµεία αυτά προσφέρουν τη δυνατότητα ελέγχου της ταχύτητας της µεταγραφής, ώστε αυτή να προσαρµόζεται στις ανάγκες έκφρασης ενός συγκεκριµένου γονιδίου και παραγωγής της απαιτούµενης ποσότητας του αντίστοιχου προϊόντος στο κύτταρο. Η µεταγραφή που παρατηρείται πειραµατικά σε αποµονωµένο DNA µε προσθήκη µόνο της πολυµεράσης και των βασικών µεταγραφικών παραγόντων χαρακτηρίζεται ως βασική µεταγραφή, είναι όµως άγνωστο αν συµβαίνει, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, στα κύτταρα. Στην πραγµατικότητα η φυσιολογία του κυττάρου και η απόκριση στις απαιτήσεις του οργανισµού προϋποθέτει µια πιο δυναµική και ευέλικτη ρύθµιση, µε τη δυνατότητα αύξησης της ταχύτητας της µεταγραφής όσο και όπου αυτή χρειάζεται. Ως αύξηση της µεταγραφής ενός γονιδίου νοείται η αύξηση των µεταγραφικών κύκλων που επιτελεί η RNA πολυµεράση και καθορίζεται από τις επιτυχείς συνδέσεις της πολυµεράσης στον υποκινητή στη µονάδα του χρόνου. Αυτή η ρύθµιση στα κύτταρα επιτυγχάνεται µε ειδικές πρωτεΐνες, που αποτελούν ενεργοποιητές ή καταστολείς της µεταγραφής, και, προσδενόµενες σε ειδικές αλληλουχίες στο DNA, µπορούν να επηρεάζουν τη σύνδεση της RNA πολυµεράσης II θετικά ή αρνητικά. Συχνά αυτό το επιτυγχάνουν διευκολύνοντας τη σύνδεση άλλων συµπαραγόντων µε θετική ή αρνητική ρυθµιστική δράση, που αποτελούν συστατικά του ολοενζύµου της πολυµεράσης ή συµπλόκων 18

που καταστέλλουν τη µεταγραφή (Lee & Young, 1998, Chen et al., 1999, Kim et al., 2001). Όσον αφορά στους ενεργοποιητές, αυτοί διακρίνονται σε επαγόµενους και µη, ανάλογα µε το αν η δράση τους ρυθµίζεται µε βάση διάφορα ερεθίσµατα που δέχεται το κύτταρο ή αν δρουν ανεξάρτητα. Οι ενεργοποιητές, αφού αναγνωρίσουν και προσδεθούν σε ειδικές αλληλουχίες στο DNA, µπορούν να επηρεάζουν τη σύνδεση του ολοενζύµου της πολυµεράσης στον υποκινητή του γονιδίου. Αυτό επιτυγχάνεται µέσω της αλληλεπίδρασής τους µε τους βασικούς µεταγραφικούς παράγοντες του ολοενζύµου, µια ιδιότητα που ορισµένοι ενεργοποιητές διαθέτουν, ή µέσω αλληλεπίδρασης µε άλλα ρυθµιστικά µόρια, τους συνενεργοποιητές, που έχουν αυτήν την ιδιότητα (Lemon & Tjian, 2000). Χαρακτηριστικό της ευκαρυωτικής µεταγραφής είναι ότι οι αλληλουχίες, που αναγνωρίζουν οι ενεργοποιητές, είναι δυνατόν να βρίσκονται όχι µόνο στην ευρύτερη περιοχή του υποκινητή, δηλαδή µερικές δεκάδες νουκλεοτίδια πριν από την αλληλουχία TATA, αλλά ακόµη και χιλιάδες βάσεις πέρα από το σηµείο έναρξης της µεταγραφής, τόσο προς το 5 όσο και προς το 3 άκρο του γονιδίου. Οι ρυθµιστικές αυτές περιοχές στο γονιδίωµα των ευκαρυωτών ονοµάζονται ενισχυτές και έχουν την ικανότητα να επιτρέπουν τη ρύθµιση της µεταγραφής ενός γονιδίου, µέσω σύνδεσης των αντίστοιχων ενεργοποιητών, ανεξαρτήτως θέσης και προσανατολισµού τους ως προς τον υποκινητή του γονιδίου. Έτσι είναι δυνατόν να ρυθµιστεί η µεταγραφή µιας αλληλουχίας DNA από πρωτεΐνες που είναι προσδεδεµένες χιλιάδες βάσεις µακριά από τον υποκινητή, µε ένα µηχανισµό δηµιουργίας θηλιάς του ενδιάµεσου DNA, που επιτρέπει την προσέγγιση των ρυθµιστικών πρωτεϊνών και του DNA στην περιοχή του υποκινητή (Ptashne, 1986, Ringrose et al., 1999), αν και υπάρχουν αναφορές που υποστηρίζουν εναλλακτικά µοντέλα. Ένα τέτοιο είναι το µοντέλο της «ολίσθησης κατά µήκος του DNA» των παραγόντων, που είναι προσδεδεµένοι στον ενισχυτή του γονιδίου, ως τον υποκινητή, που βρίσκεται δεκάδες χιλιάδες βάσεις µακριά. Αυτό επιτυγχάνεται µέσω υπερακετυλίωσης των ιστονών στη χρωµατίνη που παρεµβάλλεται, που οδηγεί σε χαλάρωση της ενδιάµεσης δοµής, ώστε να έρθει σε επικοινωνία η βασική µεταγραφική µηχανή, που έχει στρατολογηθεί στον ενισχυτή, µε τις αλληλουχίες του υποκινητή οδηγώντας στην έναρξη της µεταγραφής (Hadzis & Talianidis, 2002). 19

ΙΙΙ. Έναρξη της ευκαρυωτικής µεταγραφής: η συνισταµένη πολλών πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων Οι πρωτεΐνες που συνεργάζονται για την έναρξη της µεταγραφής στον υποκινητή ενός ευκαρυωτικού γονιδίου είναι ακόµη περισσότερες από την RNA πολυµεράση και τους διάφορους µεταγραφικούς παράγοντες. Κι αυτό γιατί, εκτός από τους βασικούς µεταγραφικούς παράγοντες και τους ειδικούς (µε βάση την αλληλουχία) ενεργοποιητές, πρέπει να συνεργήσει µια πληθώρα άλλων µορίων, που θα κάνουν την περιοχή «προσβάσιµη» στη µεταγραφική µηχανή τροποποιώντας τη σύσταση της χρωµατίνης. Από τις πρώτες µεταγραφικές µελέτες ήταν προφανές ότι το «πακετάρισµα» του DNA µε τη µορφή της χρωµατίνης στους πυρήνες των ευκαρυωτικών κυττάρων αποτελούσε ένα ιδιαίτερο «εµπόδιο», το οποίο έπρεπε να παρακαµφθεί προκειµένου η πολυµεράση να αρχίσει τη µεταγραφή σε οποιονδήποτε ευκαρυωτικό υποκινητή. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια έγινε κατανοητό πως η χρωµατίνη έχει έναν κάθε άλλο παρά παθητικό ρόλο στη µεταγραφή. Συµµετέχει πολύ δυναµικά στη ρύθµισή της, δεδοµένου ότι οι «µηχανές αναδιοργάνωσης της χρωµατίνης», πρωτεϊνικά σύµπλοκα που περιέχουν δράση ATPάσης και συµµετέχουν στην τοπική συµπύκνωση ή αποσυµπύκνωση της πακεταρισµένης χρωµατίνης, αποτελούν αναπόσπαστα µέρη των ευρύτερων συµπλόκων, που λαµβάνουν µέρος στη µεταγραφή (Pazin & Kadonaga, 1997). Παραδείγµατα τέτοιων µοριακών µηχανών αποτελούν το σύµπλοκο SWI/SNF (yeast mating type SWItching/Sucrose Non-Fermenting) της ζύµης, καθώς και NURF (Nucleosome Remodeling Factor) της Drosophila και BRG-1 των θηλαστικών (Pazin & Kadonaga, 1997). Το κοινό χαρακτηριστικό όλων αυτών των «µηχανών» είναι ένα τµήµα, που προσδένεται σε τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοσίδια, και έχει προταθεί ότι µπορεί να χρησιµεύει ως κινητήρας, που µετακινείται στο DNA µε κατανάλωση ενέργειας διασπώντας τους δεσµούς µε τις ιστόνες. Αυτές οι µηχανές έχουν αποµονωθεί από κάποιους ερευνητές ως συστατικά του ολοενζύµου της πολυµεράσης, ενώ σε άλλες περιπτώσεις δε φαίνεται να αποτελούν µέρος των προσχηµατισµένων ολοενζύµων (Kadonaga, 1998). Ωστόσο, η συµµετοχή τους είναι απαραίτητη για το τοπικό ξετύλιγµα της χρωµατίνης, που προηγείται σε κάθε περίπτωση της µεταγραφικής έναρξης. Οι µοριακές αυτές µηχανές, που σε κάθε περίπτωση αναδιαµορφώνουν τη χρωµατίνη, είναι δυνατόν να στρατολογούνται από ενεργοποιητές της µεταγραφής, οι οποίοι µπορούν να αλληλεπιδρούν ασθενώς σε ορισµένα σηµεία µε την αλληλουχία του DNA των υποκινητών ή των ενισχυτών παρά την ύπαρξη της χρωµατίνης και να 20

συνδέονται τοπικά. Η σύνδεση αυτή έχει ως αποτέλεσµα την επιπρόσθετη στρατολόγηση των τροποποιητικών ενζύµων και την αναδιοργάνωση της χρωµατίνης στην ευρύτερη περιοχή, ώστε αυτή να είναι πλέον προσβάσιµη στο σύνολο των µεταγραφικών παραγόντων και τη µεταγραφική µηχανή (Cirillo et al., 2002). Σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της µεταγραφής µέσω τροποποίησης της δοµής της χρωµατίνης διαδραµατίζουν επίσης οι ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών, οι οποίες παίρνουν µέρος στην αποσυσπείρωση της χρωµατινικής δοµής. Γενικά πιστεύεται ότι η εξουδετέρωση του φορτίου των λυσινών των ιστονών µε προσθήκη των ακετυλικών οµάδων συνεπάγεται την ασθενέστερη αλληλεπίδραση των ιστονών µε το DNA. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη χαλάρωση της χρωµατινικής δοµής και την ευκολότερη πρόσβαση των µεταγραφικών παραγόντων στις ρυθµιστικές αλληλουχίες που καθορίζουν την έναρξη της µεταγραφής (Kadonaga, 1998). Έτσι, η σύνδεση των ακετυλοτρανσφερασών των ιστονών σε ορισµένα πειραµατικά συστήµατα βρέθηκε να προηγείται της σύνδεσης όλων των άλλων παραγόντων που απαιτούνται για την έναρξη της µεταγραφής (Agalioti et al., 2000). Ωστόσο, η ακετυλίωση των ιστονών σε άλλες περιπτώσεις βρέθηκε ότι προϋποθέτει την προηγούµενη αναδιοργάνωση της χρωµατίνης µε µεσολάβηση των µηχανών αναδιοργάνωσης που έχουν ενζυµική δράση ATPάσης (Ito et al., 2000). Πολλά από τα µόρια που έχουν ενζυµική δράση ακετυλοτρανσφεράσης είναι συµπαράγοντες των βασικών µεταγραφικών παραγόντων, όπως ο TAF II 250 ή TAF1 (TBP Associated Factor 1), που είναι µία από τις πρωτεΐνες που συνδέονται µε τον παράγοντα TFIID, ή πρωτεΐνες που ανήκουν στην κατηγορία των συνενεργοποιητών, όπως oι p300/cbp, P/CAF (p300/cbp Associated Factor) και οι πρωτεΐνες της οικογένειας SRC (Steroid Receptor Coactivators) (Kadonaga, 1998, Kraus et al., 1999, Liu et al., 2001). Οι συνενεργοποιητές είναι ρυθµιστικά µόρια που, αποκλειστικά µέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, δρουν συνεργειακά προς τους ενεργοποιητές, ενισχύοντας τη δράση τους κατά δεκάδες φορές. Το αποτέλεσµα αυτού του είδους των αλληλεπιδράσεων είναι η δυνατότητα ακόµη µεγαλύτερης αύξησης της ταχύτητας, άρα και απόδοσης, της µεταγραφής. Ο κρίσιµος ρόλος που διαδραµατίζει η χρωµατίνη στη ρύθµιση της µεταγραφής αποδεικνύεται από το ότι, σε πολλές περιπτώσεις, δεν είναι η σύνδεση της RNA πολυµεράσης στον υποκινητή που καθορίζει την έναρξη της µεταγραφής, αλλά η τροποποίηση της δοµής της χρωµατίνης τοπικά, στη θέση έναρξης. Έτσι, τόσο στον υποκινητή του επαγόµενου από ιούς γονιδίου της ιντερφερόνης β, για 21

παράδειγµα, όσο και του γονιδίου της α 1 -αντιτρυψίνης, η θέση έναρξης της µεταγραφής βρέθηκε να καλύπτεται από ένα νουκλεόσωµα, το οποίο πρέπει να «παρακαµφθεί», προκειµένου να αρχίσει η µεταγραφή. Στην περίπτωση του υποκινητή της ιντερφερόνης β αυτό βρέθηκε να γίνεται µέσω «ολίσθησης» του νουκλεοσώµατος σε µία θέση µερικά νουκλεοτίδια πιο κάτω στην αλληλουχία του DNA (Lomvardas & Thanos, 2001). Στην περίπτωση του υποκινητή της α 1 - αντιτρυψίνης βρέθηκε να γίνεται µε αναδιαµόρφωση του νουκλεοσώµατος, µέσω δράσης ακετυλοτρανσφερασών των ιστονών (CBP/p300) καθώς και µέσω του παράγοντα hbrm (human Brahma homolog), που συµµετέχει στην τοπική αναδιοργάνωση της χρωµατίνης (Soutoglou & Talianidis, 2001). Και στις δύο περιπτώσεις, η στρατολόγηση των βασικών µεταγραφικών παραγόντων και της RNA πολυµεράσης ΙΙ στους υποκινητές φάνηκε να προηγείται κατά πολύ της έναρξης της µεταγραφής, µε την αναδιαµόρφωση ή µετατόπιση του νουκλεοσώµατος να αποτελεί τον καθοριστικό παράγοντα της έναρξης, σε αντίθεση µε το µοντέλο σύνδεσης της RNA πολυµεράσης που επικρατεί γενικότερα. Έτσι για παράδειγµα, τεχνητή ολίσθηση του νουκλεοσώµατος πέρα από τη θέση έναρξης της µεταγραφής στον υποκινητή της ιντερφερόνης β αλλάζει το χρονικό πρότυπο, αλλά και την εξειδίκευση ως προς το ερέθισµα, της έκφρασης του γονιδίου (Lomvardas & Thanos 2002). Το γεγονός αυτό αποδεικνύει τον κρίσιµο ρόλο που διαδραµατίζει η τοπική οργάνωση της χρωµατίνης στους υποκινητές των γονιδίων, σε συνδυασµό µε τη σύνδεση των σωστών µεταγραφικών παραγόντων, για την έκφρασή τους. Ο σωστός συνδυασµός µεταγραφικών παραγόντων, που εξασφαλίζει κάθε φορά τη σωστή έναρξη της µεταγραφής στον υποκινητή ενός γονιδίου, επιτυγχάνεται µέσω της συγκρότησης µεγαλοµοριακών συµπλόκων στους ενισχυτές πολλών ευκαρυωτικών γονιδίων, που ονοµάζονται «ενισχυοσώµατα» (enhanceosomes) (Thanos & Maniatis, 1995, Agalioti et al., 2000) (Σχ.3). Οι κατάλληλοι µεταγραφικοί παράγοντες µπορούν να προσδένονται συνεργατικά, έτσι ώστε η πρόσδεση του ενός να διευκολύνει την πρόσδεση των υπολοίπων, µε τελικό αποτέλεσµα την πρόσδεση του κατάλληλου συνδυασµού για την έναρξη της µεταγραφής. Συµπερασµατικά, η έναρξη της µεταγραφής ρυθµίζεται τόσο στο επίπεδο της αναδιοργάνωσης της χρωµατίνης µέσω τροποποίησης των ιστονών και µετατόπισης ή αναδιαµόρφωσης των νουκλεοσωµάτων, όσο και στο επίπεδο της στρατολόγησης της βασικής µεταγραφικής µηχανής στους, ελεύθερους πλέον από νουκλεοσώµατα, υποκινητές των γονιδίων. Σε κάθε περίπτωση, τα διάφορα µόρια, που λαµβάνουν 22

µέρος, οργανώνουν τις αλληλεπιδράσεις τους στο χώρο µε τη βοήθεια ορισµένων πρωτεϊνών µεγάλου µοριακού βάρους, που διαθέτουν ποικίλες επιφάνειες πρόσδεσης, τις οποίες προσφέρουν για τη συγκρότηση των παραπάνω συµπλόκων (co-integrators, π.χ. CBP). Τα µεγαλοµοριακά αυτά σύµπλοκα συχνά συνδέονται µε τoν πυρηνικό σκελετό µέσω ειδικών περιοχών της χρωµατίνης που ονοµάζονται Περιοχές Σύνδεσης µε τη Μήτρα (Matrix Attachment Regions, MARs). Εξ άλλου το κύτταρο µπορεί να ρυθµίζει τη µεταγραφή του επιλεγµένου κάθε φορά γονιδίου µε απόλυτη ακρίβεια και τάξη µέσα στον πυρήνα, χωρίς την εσφαλµένη «διάχυση» του εναρκτήριου µηνύµατος κατά µήκος της χρωµατίνης, δηλαδή χωρίς την εσφαλµένη ενεργοποίηση της µεταγραφής από υποκινητές γειτονικών γονιδίων, µέσω περιοχών του DNA που δρουν ως «µονωτές» (insulators) (West et al., 2002). Με όλους αυτούς τους τρόπους τα κύτταρα εξασφαλίζουν την οργανωµένη και ακριβή έναρξη της µεταγραφής σε κάθε υποκινητή ως απόκριση στα κατάλληλα περιβαλλοντικά ερεθίσµατα. Σχ.3. ιαδοχική στρατολόγηση ακετυλοτρανσφερασών (GCN5), µεγαλοµοριακών πρωτεϊνών µε αρχιτεκτονικό ρόλο (CBP), του ολοενζύµου της RNA πολυµεράσης II, και παραγόντων αναδιοργάνωσης της χρωµατίνης (SWI/SNF) στον ενισχυτή για τη δηµιουργία του µεγαλοµοριακού συµπλόκου του «ενισχυοσώµατος» (Agalioti et al., 2000). Fig.3. Ordered recruitment of histone acetyltransferases (GCN5), co-integrators (CBP), the RNA Pol II holoenzyme, and chromatin remodeling factors (SWI/SNF) to the enhancer, to form the enhanceosome (Agalioti et al., 2000). 23

Β. Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ IV. Πυρηνικοί υποδοχείς: µία οικογένεια επαγώγιµων µεταγραφικών παραγόντων. οµή και µηχανισµός δράσης τους στα κύτταρα Μεταξύ των επαγώγιµων µεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι ρυθµίζουν τη µεταγραφή ως απόκριση σε διάφορα περιβαλλοντικά ερεθίσµατα, σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και φυσιολογία των οργανισµών διαδραµατίζει η οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων. Η οικογένεια αυτή περιλαµβάνει µεταγραφικούς παράγοντες, οι οποίοι ενεργοποιούν τη µεταγραφή γονιδίων-στόχων ως απόκριση στην ένωση του κατάλληλου συνδέτη, πολύ συχνά κάποιας ορµόνης. Παραδείγµατα πυρηνικών υποδοχέων είναι οι υποδοχείς των στεροειδών ορµονών, όπως των γλυκοκορτικοειδών, του οιστρογόνου, του ανδρογόνου, της προγεστερόνης, καθώς και οι υποδοχείς της θυρεοειδούς ορµόνης, της βιταµίνης D και των ρετινοϊκών οξέων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει µία οµάδα πυρηνικών υποδοχέων, οι λεγόµενοι ορφανοί υποδοχείς, για τους οποίους δεν είναι γνωστός κάποιος εξωγενής συνδέτης, αν και πολλοί από αυτούς εικάζεται ότι ενεργοποιούνται από µόρια που υπάρχουν ενδογενώς στα κύτταρα, ενώ για άλλους έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι η δραστηριότητά τους µπορεί να ρυθµίζεται αποκλειστικά µέσω µετα-µεταφραστικών τροποποιήσεων (Mangelsdorf & Evans, 1995). Η ένωση του συνδέτη στα µόρια των πυρηνικών υποδοχέων έχει ως αποτέλεσµα, για τους υποδοχείς των στεροειδών ορµονών, τη µετατόπιση στον πυρήνα και την πρόσδεση των υποδοχέων στις ειδικές αλληλουχίες DNA που αναγνωρίζουν (Tsai & O Malley, 1994). Σε άλλα µέλη της οικογένειας η ένωση του συνδέτη προκαλεί αλλαγές στη στερεοδιάταξη των µορίων, που έχουν ως αποτέλεσµα την αλληλεπίδραση του υποδοχέων µε µόρια συνενεργοποιητών, ώστε να ενισχυθεί η µεταγραφή των γονιδίων-στόχων (Renaud et al., 1995, Moras & Gronemeyer, 1998, Gronemeyer & Miturski, 2001). Μέλη της οικογένειας, όπως ο υποδοχέας της θυρεοειδούς ορµόνης, TR (Thyroid Receptor), και ο υποδοχέας του trans-ρετινοϊκού οξέος, RAR (Retinoic Acid Receptor), τα οποία έχουν τη δυνατότητα να προσδένονται στο DNA και κατά την απουσία συνδέτη, επιδρούν κατασταλτικά στη µεταγραφή µέσω στρατολόγησης συγκαταστολέων στην περιοχή των υποκινητών όπου συνδέονται (Tsai & O Malley, 1994, Hörlein et al., 1995, Chen & Evans, 1995). Οι οµόφωνες αλληλουχίες (consensus sequences) που αναγνωρίζουν οι πυρηνικοί υποδοχείς στο DNA διακρίνονται σε κατηγορίες, µε βάση αν περιέχουν 24

ευθείες, ανεστραµµένες ή παλίνδροµες επαναλήψεις (Direct, Inverted, Everted Repeats) ενός χαρακτηριστικού εξανουκλεοτιδίου που περιέχεται δύο φορές σε κάθε οµόφωνη αλληλουχία. Ανάλογα µε τον προσανατολισµό των επαναλήψεων και τον αριθµό των νουκλεοτιδίων που χωρίζουν τις δύο επαναλήψεις παρόµοιες αλληλουχίες µπορεί να αναγνωρίζονται από διαφορετικούς υποδοχείς, γεγονός που επιτρέπει εξαιρετική ακρίβεια στη ρύθµιση της µεταγραφής από τους πυρηνικούς υποδοχείς (Schwabe et al., 1993). Οι υποδοχείς έχουν την ικανότητα να προσδένονται ως διµερή και, σπανιότερα, ως µονοµερή στις οµόφωνες αλληλουχίες τους. Tα µέλη της οικογένειας διακρίνονται σε τέσσερις κατηγορίες ανάλογα µε το µηχανισµό πρόσδεσής τους στο DNA (Mangelsdorf et al., 1995). Η πρώτη κατηγορία περιλαµβάνει τους υποδοχείς των στεροειδών ορµονών, οι οποίοι απουσία συνδέτη βρίσκονται ανενεργοί στο κυτταρόπλασµα, σε σύµπλεγµα µε πρωτεΐνες της οικογένειας του θερµικού πλήγµατος (Heat Shock Proteins, HSP). Παρουσία συνδέτη οι υποδοχείς ενεργοποιούνται, αποσυνδέονται από τις «µοριακές συνοδούς» (chaperones) και µεταναστεύουν στον πυρήνα, όπου συνδέονται στο DNA των οµόφωνων αλληλουχιών ως οµοδιµερή (Berg, 1989). Οι οµόφωνες αλληλουχίες τους αποτελούνται από ανεστραµµένες επαναλήψεις της αλληλουχίας AGAACA. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν οι υποδοχείς των ρετινοειδών, της θυρεοειδούς ορµόνης, της βιταµίνης D, οι οποίοι προσδένονται σε ευθείες επαναλήψεις αλληλουχιών DNA µε το χαρακτηριστικό εξανουκλεοτίδιο AGGTCA, κυρίως ως ετεροδιµερή µε τον υποδοχέα του 9-cis ρετινοϊκού οξέος RXR (Retinoid X Receptor) (Umesono et al., 1991, Mangelsdorf & Evans, 1995). Ωστόσο, ορισµένοι από αυτούς έχουν τη δυνατότητα να προσδένονται και ως οµοδιµερή, όπως ο TR ή ο RXR (Mangelsdorf & Evans, 1995). Στην τρίτη κατηγορία ανήκουν υποδοχείς, οι οποίοι προσδένονται σε ευθείες επαναλήψεις αλληλουχιών του DNA αποκλειστικά ως οµοδιµερή, όπως ο HNF-4α (Hepatocyte Nuclear Factor-4α) (Jiang et al., 1995), ενώ τέλος η τέταρτη κατηγορία περιλαµβάνει υποδοχείς οι οποίοι προσδένονται στο DNA κυρίως ως µονοµερή, αλλά έχουν τη δυνατότητα να προσδεθούν και ως ετεροδιµερή µε υποδοχείς της δεύτερης κατηγορίας, ιδιαίτερα µε τον RXR, όπως ο υποδοχέας NGFI- B (Nerve Growth Factor Inetracting protein-b) (Wilson et al., 1993, Perlmann & Jansson, 1995). Εκτός από το µηχανισµό πρόσδεσης στο DNA, οι πυρηνικοί υποδοχείς µοιράζονται και ένα χαρακτηριστικό δοµικό πρότυπο. Συγκεκριµένα, αποτελούνται 25

από πέντε δοµικά και λειτουργικά διακριτές περιοχές, εκ των οποίων οι καλύτερα συντηρηµένες µεταξύ των µελών είναι η περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DNA- Binding Domain, DBD) και η περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη (Ligand-Binding Domain, LBD) (Evans, 1988, Green & Chambon, 1988). Το ότι οι διακριτές αυτές περιοχές διατηρούν τη λειτουργικότητά τους ανεξάρτητα από τις υπόλοιπες περιοχές του µορίου των υποδοχέων ανακαλύφθηκε µε πειράµατα «ανταλλαγής περιοχών», όπου η περιοχή ένωσης µε το συνδέτη ενός υποδοχέα µπορούσε να ενεργοποιήσει τη µεταγραφή των κατάλληλων γονιδίων-στόχων έπειτα από σύντηξη µε την ετερόλογη περιοχή πρόσδεσης στο DNA ενός άλλου µεταγραφικού παράγοντα (Evans, 1988). Η περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη είναι πολύ σηµαντική, εκτός από την ένωση µε το συνδέτη, για τις λειτουργίες του διµερισµού και της µεταγραφικής ενεργοποίησης. Η λειτουργία µεταγραφικής ενεργοποίησης της LBD περιοχής µάλιστα έχει δειχθεί, στα µέλη της οικογένειας που φέρουν εξωγενείς συνδέτες, ότι εξαρτάται από την παρουσία του συνδέτη, καθώς κατά την απουσία του η περιοχή αυτή δεν µπορεί να ενεργοποιήσει τη µεταγραφή. Αντίθετα, σε ορισµένες περιπτώσεις η απουσία του συνδέτη οδηγεί σε µεταγραφική καταστολή, καθώς σε αυτήν την περίπτωση συνδέονται στο µόριο συγκαταστολείς της µεταγραφής, οι οποίοι στρατολογούν αποακετυλάσες, συντελώντας έτσι στη συµπύκνωση της χρωµατινικής δοµής στον υποκινητή και την καταστολή της µεταγραφής (Hörlein et al. 1995, Heinzel et al. 1997). Κρυσταλλογραφική ανάλυση της LBD περιοχής, αρχικά των υποδοχέων των ρετινοϊκών οξέων και του υποδοχέα της θυρεοειδούς ορµόνης (Bourguet et al. 1995, Renaud et al. 1995, Wagner et al. 1995) και αργότερα πολλών άλλων κατά τη διάρκεια της περασµένης δεκαετίας, φανέρωσε τη µοναδική δευτεροταγή διαµόρφωση αυτής της περιοχής, που αποτελεί ιδιαίτερο χαρακτηριστικό όλων των πυρηνικών υποδοχέων. Η περιοχή ένωσης µε το συνδέτη βρέθηκε να περιλαµβάνει 12 αµφιπαθείς α-έλικες και µία β-στροφή, που συνολικά απαρτίζουν ένα τριπλό στρώµα αντιπαράλληλων ελίκων. Η παρουσία υδρόφοβων αµινοξέων σε ορισµένες από αυτές τις έλικες οδηγεί στη δηµιουργία µιας κοιλότητας µε υδρόφοβο κυρίως χαρακτήρα, όπου προσδένεται ο συνδέτης. Ειδικότερα, οι κρυσταλλογραφικές µελέτες των LBD περιοχών των υποδοχέων των ρετινοϊκών οξέων φανέρωσαν πως, κατά την πρόσδεση του συνδέτη, η LBD περιοχή υφίσταται µια δραµατική αλλαγή διαµόρφωσης (από την «ανοιχτή» στην «κλειστή» µορφή). Η αλλαγή αυτή επιτυγχάνεται µε µετατόπιση των ελίκων κατά τέτοιον τρόπο ώστε να σφραγιστεί το στόµιο της κοιλότητας, στην οποία ενώνεται ο συνδέτης, 26

εγκλωβίζοντάς τον σε αυτή τη θέση. Το φαινόµενο αυτό χαρακτηρίστηκε στη βιβλιογραφία ως «µοντέλο της ποντικοπαγίδας» (Wurtz et al., 1996) (Σχ.4). Η έλικα, η οποία έρχεται και «κλείνει» την κοιλότητα µετά την πρόσδεση του συνδέτη, είναι η έλικα 12. Με αυτόν τον τρόπο παράλληλα µε την «παγίδευση» του συνδέτη εκτίθεται προς το εξωτερικό του µορίου το καλά συντηρηµένο µοτίβο αµινοξέων φφχεφφ (όπου φ ένα υδρόφοβο αµινοξύ, Χ ένα οποιοδήποτε αµινοξύ και Ε το γλουταµικό οξύ), που περιέχει η έλικα 12 (Renaud et al., 1995, Feng et al., 1998, Nolte et al., 1998, Egea et al., 2000). Το µοτίβο αυτό προσφέρει την επιφάνεια αλληλεπίδρασης µε τα µόρια των συνενεργοποιητών της µεταγραφής (Σχ.5). Αυτή η αλληλεπίδραση είναι απαραίτητη για την ενίσχυση της µεταγραφικής δράσης των υποδοχέων (Danielian et al., 1992). Σχ.4. Σχηµατική ανπαράσταση του «µοντέλου της ποντικοπαγίδας», όπου απεικονίζονται η µετακίνηση των ελίκων κατά την πρόσδεση του συνδέτη στον υποδοχέα του ρετινοϊκού οξέος και το «σφράγισµα» της κοιλότητας, όπου προσδένεται ο συνδέτης, από την έλικα 12 (Renaud et al., 1995). Fig.4. Schematic representation of the mouse trap model. Rearrangement of the LBD alpha helices and sealing of the ligand-binding pocket by helix 12 following ligand binding are shown for the Retinoic Acid Receptor (Renaud et al., 1995). 27

Σχ..5. Η καλά συντηρηµένη ακολουθία του µοτίβου αλληλεπίδρασης µε τους συνενεργοποιητές, που φέρουν οι πυρηνικοί υποδοχείς (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Fig.5. Conserved sequence of the coactivator interaction motif in the nuclear receptor superfamily (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Η αµινοτελική περιοχή των πυρηνικών υποδοχέων περικλείει επίσης έναν πυρήνα µεταγραφικής ενεργοποίησης, η δράση του οποίου, στους περισσότερους υποδοχείς, συνεισφέρει αθροιστικά ως προς τη δράση της περιοχής ένωσης του συνδέτη. Εξ άλλου, πολύ σηµαντική είναι η περιοχή που βρίσκεται ανάµεσα στην περιοχή πρόσδεσης στο DNA και την περιοχή ένωσης του συνδέτη. Αρχικά είχε προταθεί ότι η περιοχή αυτή δεν παίζει παρά ένα ρόλο «ελαστικού συνδέσµου», επιτρέποντας τον κατάλληλο προσανατολισµό των µορίων ώστε να µπορούν να συνδεθούν σωστά στην οµόφωνη αλληλουχία τους στο DNA (Bourguet et al., 1995). Nεότερα βιβλιογραφικά δεδοµένα, καθώς και αποτελέσµατα αυτής της διατριβής, υποστηρίζουν περαιτέρω τη σηµασία αυτής της περιοχής για τη µεταγραφική ενεργότητα των υποδοχέων και για την αλληλεπίδραση µε τους συνενεργοποιητές της µεταγραφής (Tcherepanova et al., 2000, Wu et al., 2002). Ορισµένοι πυρηνικοί υποδοχείς διαθέτουν και µία έκτη διακριτή περιοχή στο καρβοξυτελικό τους άκρο, της οποίας η λειτουργία είναι άγνωστη στα περισσότερα µέλη, µε µία εξαίρεση όπου έχει βρεθεί ότι ασκεί κατασταλτική δράση (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997, Iyemere et al., 1998). 28

Γ. ΤΟ ΜΕΛΟΣ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΤΩΝ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ HNF-4α V. HNF-4α: ένα µέλος της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων µε καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη και το µεταβολισµό των ανώτερων οργανισµών i. Ο ρόλος του HNF-4α στη φυσιολογική ανάπτυξη και λειτουργία του οργανισµού Ο πυρηνικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων Hepatocyte Nuclear Factor-4α είναι ένα µέλος της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, που έχει δειχθεί ότι είναι καθοριστικής σηµασίας τόσο για την ανάπτυξη των θηλαστικών στα πολύ αρχικά στάδια της εµβρυογένεσης (Chen et al., 1994) όσο και για την πλήρη διαφοροποίηση της ηπατικής κυτταρικής σειράς στα έµβρυα αυτών των οργανισµών (Li et al., 2000). Επίσης, φαίνεται να είναι απαραίτητος στη διατήρηση του ηπατικού φαινοτύπου και του πλήρους φάσµατος λειτουργιών των ηπατικών κυττάρων στα ενήλικα ζώα (Späth & Weiss, 1997, Hayhurst et al., 2001). Ειδικότερα, η δηµιουργία ποντικών µε οµόζυγη απαλοιφή του γονιδίου του HNF-4α (hnf-4α -/- ) φανέρωσε καταρχήν τη σηµασία αυτού του παράγοντα για την επιβίωση των αναπτυσσόµενων οργανισµών. Ο HNF-4α εκφράζεται από πολύ νωρίς στο εξωεµβρυϊκό ενδόδερµα, όπου φαίνεται να διαδραµατίζει καθοριστικό ρόλο για τη σύνθεση εκκρινόµενων ουσιών, απαραίτητων στα έµβρυα (Chen et al., 1994). Τα (hnf-4α -/- ) έµβρυα δεν µπορούν να ολοκληρώσουν τη γαστριδιοποίηση και πεθαίνουν στο στάδιο του µοριδίου (Chen et al., 1994). Με τη στρατηγική δηµιουργίας τετραπλοειδών (hnf-4α +/+ ) εµβρύων ποντικού άγριου τύπου, που αναπτύσσονται µαζί µε (hnf-4α -/- ) εµβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα, δηµιουργούνται οργανισµοί που προέρχονται αποκλειστικά από τα (hnf-4α -/- ) εµβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα. Οι οργανισµοί µπορούν να αναπτυχθούν κανονικά πέρα από τη γαστριδιοποίηση, αφού η έλλειψη HNF-4α στα πολύ αρχικά στάδια αναπληρώνεται µε εξωεµβρυϊκό ενδόδερµα που προέρχεται από τα τετραπλοειδή (hnf-4α +/+ ) έµβρυα (Duncan et al., 1997). Μελέτη εµβρύων, τα οποία αναπτύχθηκαν µε αυτήν την τεχνική, οδήγησε στη διαπίστωση πως οι οργανισµοί µε οµόζυγη έλλειψη του hnf-4α προχωρούν κανονικά στα αρχικά στάδια ανάπτυξης του ήπατος, και αποκτούν ηπατικούς ιστούς οι οποίοι είναι µορφολογικά απαράλλακτοι µε αυτούς των ζώων άγριου τύπου (Li et al., 2000). Ωστόσο πολλά από τα χαρακτηριστικά γονίδια, που αποτελούν δείκτες της 29

φυσιολογικής ηπατικής λειτουργίας, δεν εκφράζονται στα κύτταρα αυτά καθιστώντας έτσι φανερή τη σηµασία του HNF-4α για τη δηµιουργία µιας πλήρως διαφοροποιηµένης ηπατοκυτταρικής σειράς στα αναπτυσσόµενα έµβρυα (Li et al., 2000). Ο HNF-4α έχει κρίσιµο ρόλο και στη φυσιολογία του ενήλικου οργανισµού ρυθµίζοντας διαφορετικές λειτουργίες, όπως η µεταφορά θρεπτικών ουσιών στον οργανισµό, ο µεταβολισµός των λιπαρών οξέων, της χοληστερόλης και της γλυκόζης, η σύνθεση πηκτικών αλλά και αντιπηκτικών παραγόντων του αίµατος, η παραγωγή της ερυθροποιητίνης, που ελέγχει τη διαφοροποίηση των ερυθρών αιµοσφαιρίων, ακόµη και η σύνθεση παραγόντων που συµµετέχουν στην άµυνα του οργανισµού, όπως ο παράγοντας Bf που συµµετέχει στην ενεργοποίηση του συµπληρώµατος (Sladek & Seidel, 2001). Όπως είναι αναµενόµενο ο HNF-4α, ως µεταγραφικός παράγοντας, συµµετέχει στο συντονισµό των παραπάνω λειτουργιών ελέγχοντας τη µεταγραφή γονιδίων που εµπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες. Τα περισσότερα από τα γονίδια που ρυθµίζονται από τον HNF-4α είναι ηπατοειδικά, όπως τα γονίδια των απολιποπρωτεϊνών (Sladek et al., 1990, Ladias et al., 1992, Mietus-Snyder et al., 1992, Cardot et al., 1993, Metzger et al., 1993, Ktistaki et al., 1994, Kardassis et al., 1997, Kardassis et al., 1998, Hadzopoulou-Cladaras et al., 1998), που συµµετέχουν στη µεταφορά της χοληστερόλης και των λιπαρών οξέων. Άλλα ηπατοειδικά γονίδια που ρυθµίζονται από τον HNF-4α είναι το γονίδιο της τρανσθυρετίνης (Sladek et al., 1990), που ελέγχει τη µεταφορά της θυρεοειδούς ορµόνης (Τ 4 ), ενώ από τον HNF-4α ελέγχονται επίσης γονίδια µεταβολικών ενζύµων του ήπατος, όπως της καρβοξυκινάσης του φωσφοενολπυροσταφυλικού οξέος (Hall et al., 1992), που συµµετέχει στη γλυκονεογένεση, της κινάσης του L-πυροσταφυλικού οξέος (Diaz- Guerra et al., 1993) και της αλδολάσης Β (Gregori et al., 1998), που συµµετέχουν στη γλυκόλυση, και της αµινοτρανσφεράσης της τυροσίνης (Nitsch et al., 1993) και τρανσκαρβαµυλάσης της ορνιθίνης (Nishiyori et al., 1994), που συµµετέχουν στη σύνθεση διαφόρων αµινοξέων. Τέλος, µεταξύ των ηπατοειδικών γονιδίων, που ρυθµίζονται από τον HNF-4α, συγκαταλέγονται και ορισµένα γονίδια, τα οποία κωδικοποιούν διαλυτές πρωτεΐνες του ορού που εκκρίνονται από το ήπαρ, όπως το γονίδιο της α 1 -αντιτρυψίνης (Hardon et al., 1988) (για πλήρη επισκόπηση, βλ. Sladek & Seidel, 2001). Κάποια µάλιστα από τα παραπάνω γονίδια θεωρούνται χαρακτηριστικά της ηπατικής κυτταρικής σειράς και η έκφρασή τους χρησιµοποιείται ως δείκτης για τη διαφοροποίηση των ηπατικών κυττάρων και τον καθορισµό του 30

ηπατικού φαινοτύπου σε αναπτυξιακές µελέτες (Späth & Weiss, 1997, Li et al., 2000). Τέλος, ο HNF-4α ελέγχει γονίδια µελών της οικογένειας του κυτοχρώµατος P450, που συµµετέχουν στο µεταβολισµό των λιπιδίων, στεροειδών και διαφόρων φαρµάκων, στη σύνθεση των χολικών οξέων κ.α. (De Fabiani et al., 2001, Tirona et al., 2003). Η έκφραση όλων των παραπάνω γονιδίων ελέγχεται από τον HNF-4α άµεσα, αλλά σε ορισµένες περιπτώσεις και µέσω ρύθµισης της έκφρασης άλλων καθοριστικών για αυτές τις λειτουργίες µεταγραφικών παραγόντων, όπως οι ηπατοειδικοί πυρηνικοί υποδοχείς HNF-1α (Hepatocyte Nuclear Factor 1α) (Ktistaki & Talianidis, 1997) και PXR (Pregnane X Receptor) (Kamiya et al., 2003). Εξ άλλου, προσπάθεια επαναδιαφοροποίησησης αποδιαφοροποιηµένων κυττάρων που προέρχονται από καρκινικό ιστό ηπατώµατος, έπειτα από µόνιµη επιµόλυνση µε cdna του HNF-4α, οδηγεί στην απόκτηση της χαρακτηριστικής µορφολογίας των φυσιολογικών ηπατικών κυττάρων και επανέκφραση ορισµένων από τα ηπατοειδικά γονίδια-δείκτες στα κύτταρα που είχαν χάσει την ικανότητα έκφρασης αυτών των γονιδίων (Späth & Weiss, 1997). Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει τη σηµασία του HNF-4α για την απόκτηση του φυσιολογικού φάσµατος λειτουργιών των ηπατικών κυττάρων, µέσα από το συντονισµό της έκφρασης χαρακτηριστικών ηπατικών γονιδίων, τα οποία ελέγχει. Οι παρατηρήσεις αυτές επεκτείνονται και στη µελέτη ενήλικων ποντικών µε στοχευµένη απαλοιφή του γονιδίου του HNF-4α (conditional gene knockouts) (Hayhurst et al., 2001). Tα ζώα αυτά, αν και δεν εµφανίζουν το φαινότυπο των εµβρύων µε στοχευµένη απαλοιφή του γονιδίου του HNF-4α, εµφανίζουν ωστόσο µια µείωση στα mrna πολλών χαρακτηριστικών ηπατικών γονιδίων, όπως των απολιποπρωτεϊνών ApoAII, ApoAIV, ApoΒ100, ApoCII, ApoCIII, και της µικροσωµικής πρωτεΐνης µεταφοράς των τριγλυκεριδίων (Microsomal triglyceride Transfer Protein, MTP). Αποτέλεσµα της µείωσης αυτής, µεταξύ άλλων, είναι µία σειρά από χαρακτηριστικές διαταραχές στην έκκριση των λιποπρωτεϊνών πολύ χαµηλής πυκνότητας (Very Low Density Lipoproteins, VLDL) και στην οµοιόσταση των χολικών οξέων, καθώς και η αύξηση της απορρόφησης της χοληστερόλης από το ήπαρ. Τέλος, τα ζώα αυτά εµφανίζουν µία χαρακτηριστική αθηροπροστατευτική σύνθεση λιποπρωτεϊνών στο αίµα τους, µε µείωση των λιποπρωτεϊνών LDL (Low Density Lipoproteins) και αύξηση των λιποπρωτεϊνών HDL (High Density Lipoproteins), που περιέχουν την απολιποπρωτεΐνη ApoAI (Hayhurst et al., 2001). 31

Βέβαια, η ρύθµιση πολλών από τα γονίδια που αποτελούν στόχους του HNF- 4α δεν οφείλεται αποκλειστικά στον HNF-4, αλλά επιτελείται σε συνδυασµό και µε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες. Έτσι, ο HNF-4α συναγωνίζεται το µεταγραφικό παράγοντα COUP-TF ΙΙ (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor II) για την ενεργοποίηση του υποκινητή του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης ApoAII (Ladias et al., 1992), του ίδιου του γονιδίου του HNF-4α (Hadzis & Talianidis, 2001), καθώς και του µέλους της οικογένειας P450, CYP7A1, (Crestani et al., 1998). Αντίθετα, ο HNF-4α συνεργάζεται µε το µεταγραφικό παράγοντα SP1 (Specificity Protein 1) για την ενεργοποίηση του υποκινητή της απολιποπρωτεΐνης ApoCIII (Talianidis et al., 1995, Kardassis et al., 1997) και µε τον παράγοντα HNF- 1α στην περίπτωση ενεργοποίησης του υποκινητή της α 1 -αντιτρυψίνης (Hu & Perlmutter, 1999). Από την άλλη πλευρά, έχουν καταγραφεί απευθείας πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις του HNF-4α µε τον HNF-1α, οι οποίες έχουν ως αποτέλεσµα την αναστολή της µεταγραφής από τον υποκινητή του γονιδίου του HNF-1α (Ktistaki & Talianidis, 1997), και απευθείας αλληλεπιδράσεις µε τον SREBP-1 (Sterol Response Element Binding Protein-1), οι οποίες αναστέλλουν τη µεταγραφή από τον υποκινητή της καρβοξυκινάσης του φωσφοενολπυροσταφυλικού οξέος ενεργοποιώντας τη λιπογένεση εις βάρος της γλυκονεογένεσης (Yamamoto et al., 2004). Αντίθετα, απευθείας πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις του HNF-4α µε το µεταγραφικό παράγοντα HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor-1α) ενεργοποιούν τον υποκινητή του γονιδίου της ερυθροποιητίνης (Galson et al., 1995, Tsuchiya et al., 2002). Τέλος, νεότερες µελέτες δείχνουν τη συντονισµένη ρύθµιση γονιδίων-στόχων, όπως του CYP7Α1, από τον HNF-4α και τον ηπατικό µεταγραφικό παράγοντα PXR έπειτα από συναγωνισµό για κοινούς συνενεργοποιητές (Bhalla et al., 2004). ii. HNF-4α και παθογένεση Ο HNF-4α εµπλέκεται σε παθολογικές καταστάσεις που απαντώνται στον άνθρωπο. Ειδικότερα, έχει βρεθεί ότι συνδέεται µε µία µορφή αιµοφιλίας (την αιµοφιλία Β τύπου Leiden), όπου ανιχνεύτηκαν µεταλλάξεις σε συγκεκριµένες θέσεις πρόσδεσης του HNF-4α στον υποκινητή του παράγοντα πήξης IX του αίµατος (Reijnen et al., 1992, Naka & Brownlee, 1996). Επίσης, µία οµόζυγη µετάλλαξη στη θέση πρόσδεσης του HNF-4α στον υποκινητή του γονιδίου που κωδικοποιεί για τον παράγοντα πήξης VII του αίµατος έχει καταγραφεί σε ένα άτοµο µε αιµοφιλία σοβαρού τύπου (Arbini et al., 1997). 32

Η σηµαντικότερη ωστόσο κατηγορία παθολογικών καταστάσεων, που σχετίζεται µε τον HNF-4α, είναι αυτή του µη εξαρτώµενου από την ινσουλίνη διαβήτη (Non Insulin Dependent Diabetes Mellitus, NIDDM) ή τύπου II διαβήτη, και ειδικότερα η υποκατηγορία του νεανικού διαβήτη µε αργοπορηµένη έναρξη (Maturity Onset Diabetes of the Young, MODY). Σηµειακές µεταλλάξεις στην κωδική περιοχή του γονιδίου του HNF-4α σχετίζονται άµεσα µε την εµφάνιση νεανικού διαβήτη τύπου MODY-1 (Yamagata et al., 1996, Ryffel, 2001) που περιλαµβάνει το 2-4% όλων των ασθενών µε MODY (Malecki et al., 1999). Αυτός ο τύπος διαβήτη σχετίζεται µε ελλιπή έκκριση ινσουλίνης από τα β-παγκρεατικά κύτταρα ως απόκριση στην παρουσία υψηλών επιπέδων γλυκόζης στο αίµα και συνοδεύεται από µειωµένα επίπεδα ApoAII, ApoCIII και τριγλυκεριδίων στο αίµα των ασθενών (Shih et al., 2000). Γίνεται λοιπόν προφανής η σηµασία που έχει η συντονισµένη ρύθµιση της µεταγραφής γονιδίων από τον HNF-4α για τη φυσιολογική λειτουργία του οργανισµού. Η απορύθµιση ή η ανεπιθύµητη ενεργοποίησή της είναι προφανές ότι έχει ως αποτέλεσµα την εµφάνιση παθολογικών καταστάσεων. Υπάρχουν, τέλος, ασθένειες που πιθανώς συνδέονται µε τον HNF-4α µέσω γονιδίων-στόχων, των οποίων τη µεταγραφή ελέγχει, χωρίς να έχουν καταγραφεί ωστόσο ακόµη στη βιβλιογραφία συγκεκριµένα περιστατικά που να οριστικοποιούν τους προτεινόµενους συσχετισµούς. Χαρακτηριστικό παράδειγµα «υποψήφιας» ασθένειας είναι η αθηροσκλήρωση, που σχετίζεται µε αυξηµένο κίνδυνο εµφάνισης στεφανιαίας νόσου, καθώς τα κύρια γονίδια που εµπλέκονται στο µεταβολισµό της χοληστερόλης και των λιπαρών οξέων, αυτά των απολιποπρωτεϊνών, αποτελούν κατεξοχήν γονίδια-στόχους του HNF-4α. Ακόµη και ασθένειες όπως ο καρκίνος του ήπατος, που σχετίζεται µε ιϊκές µολύνσεις (π.χ. µόλυνση από τον ιό της ηπατίτιδας Β), θα µπορούσε κανείς να υποστηρίξει ότι συνδέονται άµεσα µε τον HNF-4α, καθώς µεταξύ των κύριων µεταγραφικών παραγόντων, που ενοχοποιούνται για τη µεταγραφή και έκφραση των ιϊκών γονιδίων, είναι ο HNF-4α (Garcia et al., 1993). VI. οµή του HNF-4α: λειτουργικές περιοχές των διάφορων ισοµορφών και ο ρόλος τους. Ο HNF-4α είναι µία αρκετά συντηρηµένη, από εξελικτικής άποψης, πρωτεΐνη των οργανισµών (Σχ.6). Εκτός από τα θηλαστικά (άνθρωπο, αρουραίο, ποντίκι) και από το βάτραχο, cdna αυτού του µεταγραφικού παράγοντα έχουν κλωνοποιηθεί από διάφορα έντοµα όπως η δροσόφιλα, ο µεταξοσκώληκας και το κουνούπι (Sladek et 33

al., 1990, Zhong et al., 1994, Swevers & Iatrou, 1998, Kapitskaya et al., 1998). Η πρωτοταγής αλληλουχία αµινοξέων της πρωτεΐνης του HNF-4α παρουσιάζει υψηλή οµολογία στα διάφορα επίπεδα της φυλογενετικής κλίµακας (Sladek & Seidel, 2001). Επίσης, η δοµική και λειτουργική οργάνωση της πρωτεΐνης είναι απόλυτα συντηρηµένη ως προς τα υπόλοιπα µέλη της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, καθώς ο HNF-4α φέρει τη χαρακτηριστική δοµή των µελών της οικογένειας, µε έξι δοµικά και λειτουργικά διακριτές περιοχές (A-F) (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Η µελέτη της σχέσης δοµής-λειτουργίας στο µόριο του συγκεκριµένου µεταγραφικού παράγοντα µε δηµιουργία ελλειµµατικών µεταλλάξεων προσδιόρισε τις βασικές ιδιότητες κάθε περιοχής και επιβεβαίωσε την οµολογία της λειτουργικής οργάνωσης του HNF-4α µε αυτήν των υπόλοιπων πυρηνικών υποδοχέων, καθώς και ορισµένα µοναδικά χαρακτηριστικά, που ο HNF-4α διαθέτει (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Σχ.6. Ο HNF-4α είναι µια συντηρηµένη εξελικτικά πρωτεΐνη (Sladek & Seidel, 2001). Fig.6. Conservation of the HNF-4α amino acid sequence (Sladek & Seidel, 2001). 34

Έτσι, η αµινοτελική περιοχή Α/Β βρέθηκε ότι περικλείει µεταξύ των πρώτων 24 αµινοξέων έναν πυρήνα ενεργοποίησης (AF-1), που ανήκει στην τάξη των όξινων ενεργοποιητών (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Η τάξη αυτή των ενεργοποιητών περιλαµβάνει µέλη όπως οι πρωτεΐνες της ζύµης GCN-4 και GAL-4, ο µεταγραφικός παράγοντας NFκB-p65 (Nuclear Factor for the κ light chain of B lymphocytes) των θηλαστικών και ο VP16 (Viral Protein 16) του ερπητοϊού (Green et al., 1998, Kistanova et al., 2001). Το πολύ σηµαντικό κοινό χαρακτηριστικό της AF-1 µε αυτές τις πρωτεΐνες είναι η συντηρηµένη θέση κάποιων όξινων και υδρόφοβων αµινοξέων (Green et al., 1998, Kistanova et al., 2001). Συστηµατική διερεύνηση της περιοχής µε δηµιουργία σηµειακών µεταλλάξεων σε µεµονωµένα όξινα και υδρόφοβα αµινοξέα, και σε συνδυασµούς αυτών, έδειξε καταρχήν πως το αρνητικό φορτίο, που χαρακτηρίζει την περιοχή λόγω των ασπαρτικών και γλουταµικών οξέων που περιέχει, είναι µεν σηµαντικό, σε συνδυασµό όµως µε τη θέση των επιµέρους αµινοξέων (Green et al., 1998, Kistanova et al., 2001). Εξ άλλου, κρίσιµο ρόλο δείχθηκε να διαδραµατίζουν υδρόφοβα αµινοξέα της περιοχής µε τις ογκώδεις πλευρικές τους αλυσίδες, τα οποία, ακόµη και έπειτα από συντηρητικές αντικαταστάσεις (Kistanova et al., 2001), έδειξαν να µειώνουν δραστικά το δυναµικό ενεργοποίησης της AF-1. Η παρατήρηση αυτή βρίσκεται σε συµφωνία µε άλλες µελέτες επάνω στο ρόλο των συγκεκριµένων αµινοξέων στη δράση των όξινων ενεργοποιητών, όπως π.χ. του VP16 (Cress & Triezenberg, 1991, Regier et al., 1993). Την A/B περιοχή διαδέχεται στο µόριο του HNF-4α η περιοχή πρόσδεσης στο DNA (C), που παρουσιάζει και τη µεγαλύτερη οµολογία τόσο µεταξύ των HNF-4α πρωτεϊνών των διαφόρων οργανισµών όσο και µεταξύ του HNF-4α και των άλλων πυρηνικών υποδοχέων, όπως οι υποδοχείς του cis και του trans ρετινοϊκού οξέος. Το µοτίβο πρόσδεσης στο DNA του HNF-4α περιλαµβάνει δύο δακτύλους ψευδαργύρου στην περιοχή C (αα 48-128), µε τη βοήθεια των οποίων το µόριο προσδένεται στη µεγάλη αύλακα της διπλής έλικας του DNA, σε οµόφωνες αλληλουχίες που περιλαµβάνουν τις επαναλήψεις G/AGGT/CCA AGG/TT/CCA, οι οποίες χωρίζονται από ένα νουκλεοτίδιο (A ή σπανιότερα G). Εποµένως η οµόφωνη αλληλουχία του HNF-4α συµπεριλαµβάνεται στις αλληλουχίες τύπου DR1 (Direct Repeat 1). Στην περιοχή C εξ άλλου εντοπίζεται και το σήµα πυρηνικού εντοπισµού του HNF-4α, που εξασφαλίζει τη σωστή ενδοκυτταρική κατανοµή της πυρηνικής αυτής πρωτεΐνης. Η περιοχή D (αα 128-174), που ακολουθεί, αρχικά είχε προταθεί ότι δεν αποτελεί παρά έναν ευέλικτο σύνδεσµο στο µέσο του µορίου, που του επέτρεπε να 35

διατηρεί την κατάλληλη ελαστικότητα ώστε να προσδένεται ως διµερές στην οµόφωνη αλληλουχία του στο DNA. Στη συνέχεια όµως βρέθηκε να διαδραµατίζει έναν πιο δυναµικό ρόλο, επηρεάζοντας την ίδια τη µεταγραφική ενεργότητα του υποδοχέα. Ειδικότερα ένα τµήµα της D περιοχής δείχθηκε ότι είναι απαραίτητο για τη διατήρηση της ενεργότητας της περιοχής ενεργοποίησης AF-2, καθώς προοδευτική εξάλειψη της D οδηγεί σε διαδοχική µείωση της µεταγραφικής ενεργότητας του παράγοντα σε πειράµατα επιµόλυνσης κυττάρων, ενώ οριστική απαλοιφή της µηδενίζει την ικανότητα ενεργοποίησης της µεταγραφής του HNF-4α (Hadzopoulou- Cladaras et al., 1997). Το πλήρες δυναµικό ενεργοποίησης της περιοχής AF-2 ωστόσο καθορίζεται κατά κύριο λόγο από την περιοχή Ε (αα 175-370), η οποία περιλαµβάνει την επιφάνεια αλληλεπίδρασης µε το συνδέτη στα µόρια όλων των πυρηνικών υποδοχέων για τα οποία έχει προσδιοριστεί ως σήµερα η ύπαρξη συνδέτη, καθώς και την επιφάνεια διµερισµού. Συστηµατική µελέτη της Ε περιοχής του HNF-4α µε δηµιουργία ελλειµµατικών µεταλλάξεων φανέρωσε τη θέση του κρίσιµου µοτίβου φφχεφφ της έλικας 12 µεταξύ των αµινοξέων 360-366. Αφαίρεση αυτών των αµινοξέων καταργεί οριστικά κάθε δυνατότητα ενεργοποίησης της µεταγραφής από τον υποδοχέα (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Η πρόβλεψη της δευτεροταγούς διαµόρφωσης της LBD περιοχής, µε την αντιστοιχία των αµινοξέων σε α-έλικες σύµφωνα µε τη δευτεροταγή διαµόρφωση του οµόλογου υποδοχέα RXRα (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997), επιβεβαιώθηκε πρόσφατα µε την κρυστάλλωση της LBD περιοχής του πολύ οµόλογου προς τον HNF-4α υποδοχέα HNF-4γ, αλλά και µε την κρυστάλλωση της LBD περιοχής του ίδιου του HNF-4α (Wisely et al., 2002, Dhe-Paganon et al., 2002). Τέλος, η περιοχή F βρέθηκε να διαθέτει ένα µοναδικό ρόλο στον HNF-4α (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997, Iyemere et al., 1998), αφού απαλοιφή της οδηγεί σε πολλαπλάσια αύξηση της ικανότητας ενεργοποίησης του µορίου, αποδίδοντας για πρώτη φορά µία ιδιότητα καταστολής της µεταγραφής σε αυτήν την περιοχή µε την άγνωστη λειτουργία στα µόρια των περισσότερων πυρηνικών υποδοχέων. Μία πιθανή ερµηνεία του ρόλου, που έχει προταθεί ότι παίζει η περιοχή αυτή, περιλαµβάνει τον εν µέρει αποκλεισµό της έλικας 12 του µορίου ώστε να δυσχεραίνεται η αλληλεπίδρασή του µοτίβου φφχεφφ µε µόρια των συνενεργοποιητών (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997), ενώ νεότερες µελέτες έχουν αποδώσει έναν πιο ενεργητικό ρόλο στην περιοχή, υποστηρίζοντας ότι διευκολύνει γενικότερα την 36

αλληλεπίδραση του HNF-4α µε το συγκαταστολέα της µεταγραφής SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors) (Ruse et al., 2002). Τα παραπάνω µοντέλα επιχειρούν να ερµηνεύσουν τον αρνητικό ρόλο που διαδραµατίζει η περιοχή F στο δυναµικό ενεργοποίησης τόσο της ισοµορφής α1 όσο και α2 του HNF-4α. Οι ισοµορφές αυτές ήταν οι πρώτες που κλωνοποιήθηκαν (Sladek et al., 1990, Hata et al., 1992) αλλά και οι πιο άφθονες στους ιστούς όπου εντοπίστηκε ο HNF-4α, διαφέρουν δε µεταξύ τους µόνο κατά 10 αµινοξέα στην F περιοχή, και οι µεταγραφικές τους ιδιότητες έχουν εξεταστεί διεξοδικά (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997, Sladek et al., 1999). Ωστόσο, όσον αφορά στα θηλαστικά, ο HNF-4α διακρίνεται σε περισσότερες ισοµορφές. Οι ισοµορφές αυτές είναι προϊόντα εναλλακτικής συρραφής εξωνίων στα µόρια mrna του υποδοχέα που µεταγράφονται από το ίδιο γονίδιο (Taraviras et al., 1994, Drewes et al., 1996) ή προϊόντα εναλλακτικής χρήσης δύο διαφορετικών υποκινητών, που έχει βρεθεί ότι διαθέτει ο HNF-4α (Thomas et al., 2001) (Σχ.7). Οι διάφορες ισοµορφές του HNF-4α που έχουν καταγραφεί στα θηλαστικά αφορούν αλλαγές αποκλειστικά στις περιοχές A/B και F του µορίου, ενώ π.χ. στο κουνούπι (Aedes aegypti) έχει ταυτοποιηθεί ακόµη και µία επικρατής αρνητική µορφή, που δεν περιέχει την περιοχή πρόσδεσης στο DNA (Kapitskaya et al., 1998). Έτσι, οι ισοµορφές των θηλαστικών HNF-4α1, 2 και 3 διαφέρουν µεταξύ τους στην καρβοξυτελική περιοχή F, µε την ισοµορφή α2 να περιέχει µία προσθήκη 10 αµινοξέων σε σχέση µε την α1 και την ισοµορφή α3 να περιλαµβάνει µία εντελώς διακριτή περιοχή F (Kritis et al., 1996). Από την άλλη, η ισοµορφή α4, που περιγράφηκε λίγο αργότερα (Drewes et al., 1996) και περιέχει µία προσθήκη 30 αµινοξέων στο αµινοτελικό άκρο (περιοχή Α/Β) της πρωτεΐνης, φαίνεται να στερείται ιδιαίτερης φυσιολογικής σηµασίας. Τέλος, η ισοµορφή α7, που περιέχει µία εντελώς διακριτή Α/Β περιοχή (Nakhei et al., 1998), παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Η ανίχνευση και ο χαρακτηρισµός της στον άνθρωπο συνοδεύτηκαν αρχικά από αναφορές που υποστήριζαν πως είναι η µόνη ισοµορφή που ανιχνεύεται στο πάγκρεας, ως προϊόν της αποκλειστικής χρήσης, στον ιστό αυτό, του εναλλακτικού υποκινητή P2 που διαθέτει το γονίδιο του HNF-4α (Thomas et al., 2001). Ωστόσο, ο συγκεκριµένος ισχυρισµός φαίνεται να αποτελεί αµφισβητούµενο σηµείο, καθώς άλλες αναφορές επισηµαίνουν την ύπαρξη µεταγραφηµάτων και από τους δύο υποκινητές του γονιδίου (ισοµορφές α1 και α7) στο συγκεκριµένο ιστό (Eeckhoute et al., 2002). Εξ άλλου, διαφορετικές µελέτες δείχνουν την ισοµορφή α7 να προηγείται, 37

ως προς την έκφραση, της ισοµορφής α1, κατά την ανάπτυξη στο ήπαρ (Torres- Padilla et al., 2001). Γενικότερα πάντως, αν και δεν έχει διερευνηθεί διεξοδικά ως τώρα πώς οι διάφορες ισοµορφές κατανέµονται στους ιστούς ή µε ποια χρονική σειρά εκφράζονται σε συγκεκριµένους ιστούς στον οργανισµό, η πλειοψηφία τους φαίνεται να εκφράζεται κατά κύριο λόγο στο ήπαρ, το νεφρό και το έντερο, και σε µικρότερα ποσοστά στο στοµάχι και το πάγκρεας, ενώ έχουν διαπιστωθεί ποσοτικές διαφορές ανάµεσα στις διάφορες ισοµορφές (Hata et al., 1992, Kritis et al., 1996). Γεγονός είναι πως χρειάζονται περισσότερες µελέτες σε αυτόν τον τοµέα, προκειµένου να εξακριβωθεί ο διαφορετικός ιστοειδικός ή αναπτυξιακός ρόλος που οι ισοµορφές αυτές ενδεχοµένως διαδραµατίζουν. Σχ.7. Οργάνωση του γονιδίου του HNF-4α και ισοµορφές, οι οποίες προκύπτουν από εναλλακτική συρραφή εξωνίων (προσαρµοσµένο από Sladek & Seidel, 2001). Η ισοµορφή α7 προκύπτει από εναλλακτική χρήση ενός δεύτερου υποκινητή του γονιδίου (Ρ2). Στο κάτω µέρος της εικόνας φαίνονται οι λειτουργίες που επιτελούν οι επιµέρους δοµικές περιοχές (προσαρµοσµένο από Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Fig.7. Organization of the HNF-4α gene and isoforms generated by alternative exon splicing (adapted from Sladek & Seidel, 2001). The α7 isofrom is generated by usage of an alternative promoter (P2). The functions of the structurally distinct domains A-F are listed in the lower panel (adapted from Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). 38

Όσο για διαφορές στην ικανότητα ενεργοποίησης της µεταγραφής µεταξύ των διαφορετικών ισοµορφών, λειτουργική ανάλυση των περιοχών του HNF-4α έδειξε ότι οι ισοµορφές HNF-4α1 και 2, που αποτελούν τις κύριες ισοµορφές στο ήπαρ και το νεφρό όλων των θηλαστικών, δε διαφέρουν ως προς την ικανότητα ενεργοποίησης γονιδίων αναφοράς σε πειραµατικά συστήµατα παροδικής επιµόλυνσης κυττάρων, π.χ. σε κύτταρα της σειράς HepG2, που προέρχονται από ηπατοκαρκίνωµα ανθρώπου (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997), αν και υπάρχουν αναφορές στη βιβλιογραφία που υποστηρίζουν µία µικρή διαφοροποίηση της ικανότητας ενεργοποίησης των δύο ισοµορφών σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές (Sladek et al., 1999). Νεότερες δε µελέτες επισηµαίνουν την κατά πολύ µειωµένη µεταγραφική ενεργότητα της ισοµορφής α7, σε σχέση µε τις ισοµορφές α1 και α2 (Torres-Padilla et al., 2002). Το αποτέλεσµα αυτό ήταν αναµενόµενο, δεδοµένου ότι η ισοµορφή αυτή στερείται του πυρήνα ενεργοποίησης AF-1 των άλλων δύο, που έχει δειχθεί να είναι καθοριστικός για την ικανότητα ενεργοποίησης του HNF-4α δρώντας συνεργειακά ως προς την περιοχή AF-2 του υποδοχέα για την ενεργοποίηση της µεταγραφής (Hadzopoulou- Cladaras et al., 1997). VII. Λειτουργικές αλληλεπιδράσεις του HNF-4α µε διάφορες κατηγορίες µορίων ελέγχουν τη ρύθµιση της µεταγραφής i. Αλληλεπίδραση µε συνενεργοποιητές της µεταγραφής Οι συνενεργοποιητές της µεταγραφής είναι µία ευρεία κατηγορία πρωτεϊνών, που περιλαµβάνει µόρια µε διακριτούς ρόλους, τα οποία ωστόσο έχουν ένα κοινό καθοριστικό χαρακτηριστικό: αλληλεπιδρούν µε τις αλληλουχίες των ενισχυτών ή των υποκινητών αποκλειστικά µέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων µε µεταγραφικούς παράγοντες, που έχουν προσδεθεί στις οµόφωνες αλληλουχίες τους. Οι συνενεργοποιητές δεν έχουν οι ίδιοι τη δυνατότητα να προσδένονται στο DNA. Μέσω των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, που αναπτύσσουν, συντελούν στην ενίσχυση της δράσης των ενεργοποιητών της µεταγραφής µε διάφορους τρόπους. Έτσι, ορισµένοι από αυτούς έχει βρεθεί ότι διαθέτουν ενζυµική δράση ακετυλοτρανσφεράσης, συντελώντας στην ακετυλίωση των ιστονών και την τροποποίηση της χρωµατινικής δοµής ώστε αυτή να είναι προσβάσιµη στη βασική µεταγραφική µηχανή. Άλλοι αποτελούν µέρη της ίδιας της µεταγραφικής µηχανής ή του ολοενζύµου της RNA πολυµεράσης II, βοηθώντας έτσι να στρατολογηθεί το 39

ένζυµο στον υποκινητή ώστε να αρχίσει η µεταγραφή, ενώ τέλος η λειτουργία ορισµένων µπορεί να είναι η διευκόλυνση της δηµιουργίας µεγαλοµοριακών συµπλόκων, τα οποία περιέχουν το σύνολο των απαραίτητων παραγόντων για την έναρξη (Xu et al., 2000). Η τελευταία αυτή λειτουργία των συνενεργοποιητών επιτυγχάνεται καθώς πολλά από τα µόρια έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν ταυτόχρονα µε διάφορους µεταγραφικούς παράγοντες ή συστατικά των µηχανών αναδιοργάνωσης της χρωµατίνης προσφέροντας µία πληθώρα επιφανειών για την ανάπτυξη των συνολικών αλληλεπιδράσεων, που απαιτεί η έναρξη της µεταγραφής. Από τους συνενεργοποιητές, που έχουν αποµονωθεί, πολλοί έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρούν λειτουργικά µε τον HNF-4α εµφανίζοντας τη δυνατότητα να ενισχύουν τη µεταγραφή γονιδίων-στόχων που βρίσκονται υπό τον έλεγχό του. Τόσο συνενεργοποιητές της οικογένειας p160 (Steroid Receptor Coactivator 1, SRC-1, Glucocorticoid Receptor Intermediary Protein 1, GRIP1/SRC-2, Receptor Associated Coactivator-3, RAC-3/SRC-3) όσο και της p300 (p300/cbp) έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρούν µε τον HNF-4α in vitro (σε πειράµατα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων) και in vivo (σε πειράµατα επιµόλυνσης κυττάρων) (Yoshida et al., 1997, Wang et al., 1998, Green et al., 1998, Dell & Hadzopoulou-Cladaras, 1999, Sladek et al., 1999, Lee et al., 2000). Εξ άλλου, in vitro µεταγραφικές µελέτες πάνω στην ικανότητα του HNF-4 να ενεργοποιεί τη µεταγραφή γονιδίων-στόχων, όταν αυτά βρίσκονται τόσο µε τη µορφή γυµνού DNA όσο και µε τη µορφή χρωµατίνης, έδειξαν ότι πολύ σηµαντικές για την ενεργοποίηση της µεταγραφής από τον HNF-4 είναι οι αλληλεπιδράσεις του µε τους συνενεργοποιητές της µεταγραφής TRAP220 και TRAP170 (Thyroid Receptor Associated Proteins, TRAP) (Malik et al., 2002). Οι πρωτεΐνες αυτές ανήκουν στο σύµπλοκο TRAP/SMCC/Mediator, το οποίο αποτελεί τµήµα του ολοενζύµου της RNA πολυµεράσης II (Kadonaga, 1998, Malik et al., 2002). Η φυσιολογική σηµασία των αλληλεπιδράσεων του HNF-4α µε ορισµένους από τους συνενεργοποιητές που αναφέρθηκαν δεν είναι απόλυτα γνωστή στον ενήλικο οργανισµό, δεδοµένου ότι κάποια από αυτά τα µόρια εµφανίζουν µια ιδιαίτερη ιστο-ειδική κατανοµή, που δε συµπίπτει ακριβώς µε εκείνη του HNF-4α (Xu et al., 2000). Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια έχουν χαρακτηριστεί αλληλεπιδράσεις του µεταγραφικού παράγοντα µε το συνενεργοποιητή PGC-1 (PPAR-Gamma Coactivator-1) (Puigserver et al., 1998, Knutti & Kralli, 2001), που είναι ιδιαίτερης φυσιολογικής σηµασίας για το µεταβολισµό του ενήλικου οργανισµού (Yoon et al., 40

2001, Rhee et al., 2003, Yamamoto et al., 2004, Bhalla et al., 2004). Έτσι, ο PGC-1 δείχθηκε αρχικά να αλληλεπιδρά µε τον HNF-4α σε µελέτες ρύθµισης της γλυκονεογένεσης στο ήπαρ ποντικών (Yoon et al., 2001). Στις µελέτες αυτές ο PGC-1 εµφάνιζε την ικανότητα να αλληλεπιδρά µε τον HNF-4α in vitro, ενώ παράλληλα ενίσχυε τη µεταγραφή, που ενεργοποιεί ο HNF-4α από τον υποκινητή της καρβοξυκινάσης του φωσφοενολπυροσταφυλικού οξέος (PhosphoEnolPyruvate CarboxyKinase, PEPCK), σε πειράµατα παροδικής επιµόλυνσης κυττάρων. Αυτό ήταν το έναυσµα για µια ολόκληρη σειρά µελετών, που φανέρωσαν τη σηµασία αυτής της αλληλεπίδρασης στη ρύθµιση της γλυκονεογένεσης in vivo, σε συντονισµό µε τη ρύθµιση και άλλων µεταβολικών µονοπατιών, όπως της λιπογένεσης. Για παράδειγµα, ο µεταγραφικός παράγοντας SREBP-1 καταστέλλει το γλυκονεογενετικό µονοπάτι και ενεργοποιεί τη λιπογένεση, αναιρώντας την αλληλεπίδραση του HNF- 4α µε τον PGC-1 στους υποκινητές γλυκονεογενετικών ενζύµων, όπως της καρβοξυκινάσης του φωσφοενολπυροσταφυλικού (Yamamoto et al., 2004). Σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία η αλληλεπίδραση του HNF-4α µε τα διάφορα µόρια των συνενεργοποιητών επιτυγχάνεται µέσω δύο κυρίως περιοχών. Κατ αρχήν έχει βρεθεί ότι ένα σηµαντικό µέρος των συνενεργοποιητών καθώς και παράγοντες της βασικής µεταγραφικής µηχανής αλληλεπιδρούν µε τον HNF-4α µέσω της AF-1 περιοχής, όπως οι παράγοντες TAF II 31 και TAF II 80, καθώς και οι ίδιοι οι γενικοί µεταγραφικοί παράγοντες TFIIHp62, TFIIB και η TATA-Binding Protein (TBP), ενώ τέλος µε την περιοχή αυτή έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρά και ο συνενεργοποιητής CBP (Green et al., 1998, Dell & Hadzopoulou-Cladaras, 1999, Kistanova et al., 2001). Η περιοχή όµως, η οποία κατά κύριο λόγο δείχθηκε ότι εξασφαλίζει στον HNF-4α την αλληλεπίδραση µε τους συνενεργοποιητές της µεταγραφής, είναι το συντηρηµένο µοτίβο αµινοξέων φφχεφφ, που απαντάται στην έλικα 12 της LBD περιοχής (Wang et al., 1998, Lee et al., 2000, Yoon et al., 2001). Η αλληλεπίδραση αυτή των συνενεργοποιητών µε το µοτίβο φφχεφφ της έλικας 12 απαντά σε όλους τους πυρηνικούς υποδοχείς και εξαρτάται από την ένωση του συνδέτη στα µόρια των πυρηνικών υποδοχέων που δεν είναι ορφανά (Wurtz et al., 1996). H αλληλεπίδραση αναπτύσσεται ανάµεσα σε αµινοξέα της έλικας 12 των πυρηνικών υποδοχέων και σε υδρόφοβα αµινοξέα του µοτίβου LXXLL (όπου L η λευκίνη και X οποιοδήποτε αµινοξύ), το οποίο απαντάται στα µόρια των περισσότερων συνενεργοποιητών, που αλληλεπιδρούν µε πυρηνικούς υποδοχείς (Heery et al., 1997, Darimont et al., 1998). 41

Ειδικότερα, η κοιλότητα, η οποία σχηµατίζεται στα µόρια των πυρηνικών υποδοχέων και στην οποία δεσµεύεται ο συνενεργοποιητής, αποτελείται από υδρόφοβα αµινοξέα στο εσωτερικό και φορτισµένα αµινοξέα στην περιφέρεια (Feng et al., 1998, Darimont et al., 1998, Egea et al., 2000, Dhe-Paganon et al., 2002). Το µοντέλο, το οποίο επικρατεί στις σχέσεις πυρηνικών υποδοχέων-συνενεργοποιητών, προτείνει έναν κρίσιµο ρόλο για µία οµάδα φορτισµένων αµινοξέων των πυρηνικών υποδοχέων, που αποτελείται από το καλά συντηρηµένο γλουταµικό οξύ της έλικας 12 και µία λυσίνη της έλικας 3 της LBD περιοχής, µεταξύ των οποίων αναπτύσσονται οι καθοριστικές ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις για το σχηµατισµό της κοιλότητας που «φιλοξενεί» τους συνενεργοποιητές (Nolte et al., 1998, Duda et al., 2004). Αυτό το µοντέλο φαίνεται να εξηγεί ικανοποιητικά τις αλληλεπιδράσεις διάφορων υποδοχέων µε τους συνενεργοποιητές της οικογένειας p160. Από την πλευρά των συνενεργοποιητών, ιδιαίτερη σηµασία για την αλληλεπίδρασή τους µε τους πυρηνικούς υποδοχείς φαίνεται να έχουν, εκτός από τις αλληλουχίες LXXLL, οι οποίες εµπλέκονται άµεσα στην αλληλεπίδραση µε τους υποδοχείς, και οι γειτονικές τους αλληλουχίες στα µόρια των συνενεργοποιητών, καθώς έχει προταθεί ότι διαδραµατίζουν σηµαντικότατο ρόλο στην εξειδίκευση και τη συγγένεια των αλληλεπιδράσεων (Darimont et al., 1998). Έτσι, έχει βρεθεί ότι υπάρχουν τρεις οµάδες LXXLL µοτίβων ανάλογα µε τα αµινοξέα που περιστοιχίζουν τις LXXLL αλληλουχίες (Chang et al., 1999). Οι τρεις οµάδες µοτίβων εµφανίζουν διαφορές ως προς τις ιδιότητες αλληλεπίδρασής τους µε τους πυρηνικούς υποδοχείς. Ειδικότερα, σηµειακές µεταλλάξεις στην έλικα 12 των υποδοχέων επηρεάζουν σε διαφορετικό βαθµό τη δυνατότητα της κάθε οµάδας LXXLL µοτίβων να αλληλεπιδρά µε τη µεταλλαγµένη έλικα 12 (Tcherepanova et al., 2000, Wu et al., 2002). Αυτή η παρατήρηση έχει πολύ σηµαντικές συνέπειες για τη λειτουργική σηµασία διαφόρων µεταλλάξεων στα µόρια των πυρηνικών υποδοχέων, καθώς ορισµένες από αυτές ενδέχεται να διατηρούν τη λειτουργικότητά τους, αντίθετα από ό,τι θα ήταν αναµενόµενο. ii. Αλληλεπίδραση µε συγκαταστολείς της µεταγραφής Η κατασταλτική λειτουργία της περιοχής F του HNF-4α είχε προταθεί αρχικά ότι µπορεί να επηρεάζει το δυναµικό ενεργοποίησης του µεταγραφικού παράγοντα αποκλείοντας εν µέρει την περιοχή ενεργοποίησης AF-2, και ειδικότερα το µοτίβο 42

φφχεφφ της έλικας 12, από αλληλεπιδράσεις µε τους συνενεργοποιητές (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997, Sladek et al., 1999). Ωστόσο, νεότερες αναφορές υποστηρίζουν ότι ο HNF-4α έχει τη δυνατότητα να αλληλεπιδρά µε συγκαταστολείς της µεταγραφής, όπως ο SMRT, οι οποίοι µειώνουν τη µεταγραφική του ενεργότητα (Ruse et al., 2002, Torres-Padilla et al., 2002). Σύµφωνα µε τις αναφορές αυτές η περιοχή F είναι καθοριστική για την καταστολή της µεταγραφικής ενεργότητας. Παρά το γεγονός ότι η περιοχή F δεν έχει τη δυνατότητα να αλληλεπιδρά άµεσα µε το συγκαταστολέα σε in vitro πειράµατα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (Ruse et al., 2002), εν τούτοις φαίνεται να συντελεί έµµεσα στην αλληλεπίδραση του µορίου µε το συγκαταστολέα, αφού απαλοιφή της µειώνει την επίδραση, που έχει ο SMRT, στη µεταγραφική δραστηριότητα του HNF- 4α. Αυτό το φαινόµενο έχει παρατηρηθεί τόσο στην ισοµορφή α2 όσο και στην ισοµορφή α7 του HNF-4α (Ruse et al., 2002, Torres-Padilla et al., 2002). Αν και δεν έχει προταθεί ακόµη κάποιος ικανοποιητικός µηχανισµός σχετικά µε το πώς η περιοχή F συντελεί στην αλληλεπίδραση αυτή του HNF-4α µε το συγκαταστολέα, εν τούτοις η προτεινόµενη αλληλεπίδραση µπορεί να προσφέρει µία ελκυστική εξήγηση τόσο για την παρατηρούµενη κατασταλτική δράση της καρβοξυτελικής περιοχής στο ενδογενές δυναµικό ενεργοποίησης του µορίου, όσο και για τη ρύθµιση της δράσης του HNF-4α γενικότερα. iii. Αλληλεπίδραση µε µόρια-συνδέτες Η εξέταση του µηχανισµού δράσης των πυρηνικών υποδοχέων φανερώνει τον καθοριστικό ρόλο που διαδραµατίζουν οι συνδέτες αυτών των µορίων στην ενεργοποίηση της µεταγραφής. Πράγµατι, αν οι περιοχές πρόσδεσης του συνδέτη (LBD) των πυρηνικών υποδοχέων οριστούν ως ρυθµιστικά στοιχεία, που ελέγχουν µια πληθώρα λειτουργιών του οργανισµού ως απόκριση σε διάφορα ερεθίσµατα, µέσα από την αλληλεπίδραση µε µοριακές συνοδούς, συνενεργοποιητές και συγκαταστολείς (Moras & Gronemeyer, 1998), τότε γίνεται φανερή η σηµασία των συνδετών στη ρύθµιση της λειτουργίας των πυρηνικών υποδοχέων. Συνοψίζοντας, στην περίπτωση των στεροειδών υποδοχέων η σύνδεση των εξωγενών συνδετών έχει ως αποτέλεσµα την αποσύνδεση των βοηθητικών µορίων-συνοδών από τους υποδοχείς και τη µετατόπιση των υποδοχέων από το κυτταρόπλασµα στον πυρήνα, όπου θα εκτελέσουν τις µεταγραφικές τους λειτουργίες. Εξ άλλου, η λειτουργία ενεργοποίησης της µεταγραφής που χαρακτηρίζει την περιοχή AF-2, στο 43

καρβοξυτελικό άκρο των υποδοχέων, εξαρτάται από την παρουσία συνδέτη. Το µεταγραφικό δυναµικό αυτής της περιοχής µάλιστα πολλαπλασιάζεται µέσω αλληλεπίδρασης του συντηρηµένου µοτίβου αµινοξέων που περιέχεται στην έλικα 12 της AF-2 περιοχής µε µόρια των συνενεργοποιητών. H λειτουργία αυτή εξαρτάται επίσης από την ένωση του συνδέτη στο µόριο του υποδοχέα. Τέλος, στα µόρια διαφόρων υποδοχέων, όπως ο υποδοχέας της θυρεοειδούς ορµόνης TR, η απουσία συνδέτη έχει ως αποτέλεσµα την καταστολή της µεταγραφής από τους ανενεργούς υποδοχείς µέσω σύνδεσής τους µε συγκαταστολείς, που στρατολογούν στους υποκινητές των γονιδίων αποακετυλάσες (Hörlein et al., 1995, Heinzel et al., 1997). Η σύνδεση αυτή αντιστρέφεται µόλις ο κατάλληλος συνδέτης προσδεθεί στο µόριο, οπότε τα µόρια των πυρηνικών υποδοχέων «απελευθερώνονται» από τους συγκαταστολείς και µπορούν πλέον να στρατολογήσουν στη θέση τους συνενεργοποιητές, που θα βοηθήσουν στην ενίσχυση της µεταγραφής των γονιδίωνστόχων (Gronemeyer & Miturski, 2001). Ο HNF-4α αποτελεί έναν «ορφανό» υποδοχέα, σε αντίθεση µε πολλά άλλα µέλη της οικογένειας. Ως ορφανός υποδοχέας, ήταν άγνωστο κατά πόσο ακολουθεί αυτό το εξαρτώµενο από το συνδέτη πρότυπο ενεργοποίησης, που είναι χαρακτηριστικό των περισσότερων πυρηνικών υποδοχέων. Συγκεκριµένα, ο ορφανός αυτός υποδοχέας είναι συνεχώς ενεργός και από την αρχή της µελέτης του θεωρούνταν πως παρουσίαζε ορισµένες αποκλίσεις από το κλασσικό µοντέλο της εξωγενώς ενεργοποιούµενης µεταγραφής, που είναι χαρακτηριστική των υπολοίπων υποδοχέων. Αν και υπήρξε µία αναφορά στη βιβλιογραφία, που υποστήριξε ότι οι θειεστέρες του ακετυλο-συνενζύµου Α µε κορεσµένα λιπαρά οξέα (C14:0, C16:0) µπορούν να δρουν ως ενδογενείς συνδέτες του HNF-4α τροποποιώντας την ενεργότητά του (Hertz et al., 1998), αυτό το στοιχείο αµφισβητήθηκε από µετέπειτα µελέτες. Οι συγκεντρώσεις των θειεστέρων που είχαν χρησιµοποιηθεί στα παραπάνω πειράµατα θεωρήθηκαν υπερβολικά υψηλές ώστε να αντιπροσωπεύουν φυσιολογικές συγκεντρώσεις αυτών των συστατικών in vivo, ενώ επίσης οι θειεστέρες παρουσίαζαν ασυνήθιστα µεγάλο µέγεθος για την προβλεπόµενη υδρόφοβη κοιλότητα του HNF-4α (Bogan et al., 2000). Τέλος, τα προτεινόµενα µόρια δε φαίνονταν να επιφέρουν στον HNF-4α αλλαγές, οι οποίες θεωρούνται χαρακτηριστικές της ένωσης του συνδέτη µε τον υποδοχέα του, όπως η «συµπίεση» της δοµής του υποδοχέα σε ένα πιο σταθερό σχήµα και η αύξηση της ικανότητας αλληλεπίδρασής του µε µόρια των συνενεργοποιητών (Bogan et al., 2000). Το γεγονός αυτό άφηνε ανοιχτό το ερώτηµα 44

της ύπαρξης κάποιων ενδογενών µορίων, που θα µπορούσαν να δρουν ως συνδέτες για τον HNF-4, και ενέτεινε γενικά το ενδιαφέρον γύρω από την ανακάλυψη τέτοιων µορίων. Παράλληλα, ενέτεινε το ενδιαφέρον σχετικά µε την περαιτέρω διερεύνηση των ασυνήθιστων ιδιοτήτων µεταγραφικής ενεργοποίησης του ορφανού αυτού υποδοχέα. 45

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής επιχειρήθηκε µία συστηµατική ανάλυση της σχέσης δοµής-λειτουργίας στο µόριο του ορφανού πυρηνικού υποδοχέα HNF-4α, που διαδραµατίζει καίριο ρόλο στη ρύθµιση πολλών ηπατικών γονιδίων, µεταξύ των οποίων και των γονιδίων των απολιποπρωτεϊνών. Η ανάλυση είχε ως κύριο στόχο τη διερεύνηση των αµινοξέων, που είναι καθοριστικά για την εξαρτώµενη από το συνδέτη ενεργότητα της LBD περιοχής. Το σκεπτικό ήταν πως τα αµινοξέα αυτά θα συµµετείχαν στην κοιλότητα πρόσδεσης ενός πιθανού ενδογενούς συνδέτη, βάσει οµολογίας της LBD περιοχής του HNF-4α µε αυτήν άλλων πυρηνικών υποδοχέων. Ένας δεύτερος στόχος της εργασίας ήταν η χαρτογράφηση των λειτουργικών περιοχών και των αµινοξέων, τα οποία είναι αναγκαία για την ενίσχυση της µεταγραφικής δραστηριότητας του υποδοχέα από τους συνενεργοποιητές. Για το σκοπό αυτό εισήχθησαν επιλεγµένες σηµειακές µεταλλάξεις σε αµινοξέα της LBD περιοχής, που θεωρήθηκαν κρίσιµα για την αλληλεπίδραση µε έναν πιθανό ενδογενή συνδέτη, οι οποίες κλωνοποιήθηκαν αρχικά σε φορείς έκφρασης ώστε να προκύψουν χιµαιρικές πρωτεΐνες, που θα περιείχαν την ετερόλογη περιοχή πρόσδεσης στο DNA της πρωτεΐνης GAL-4 του ζυµοµύκητα και τη µεταλλαγµένη LBD περιοχή του HNF- 4α. Στη συνέχεια οι µεταλλάξεις αυτές κλωνοποιήθηκαν και σε ολόκληρο το µόριο του HNF-4α, όπου εξετάστηκε η επίδρασή τους στον οµοδιµερισµό του µεταγραφικού παράγοντα. Στα πλαίσια διερεύνησης της σηµασίας των επιµέρους αµινοξέων για την ενεργότητα της LBD περιοχής, εξετάστηκε η δραστικότητα των σηµειακών µεταλλάξεων, εκφρασµένων τόσο στα πλαίσια των GAL-4 χιµαιρικών µορίων όσο και των µορίων HNF-4α αγρίου τύπου, απουσία και παρουσία συνενεργοποιητών, σε πειράµατα συνεπιµόλυνσης κυττάρων διαφόρων κυτταρικών σειρών, µε συνθετικούς υποκινητές και υποκινητές φυσικών γονιδίων-στόχων του HNF-4α. Οι συνενεργοποιητές, οι οποίοι επιλέχθηκαν για τα πειράµατα, ήταν ο SRC- 3, µέλος της οικογένειας των p160 συνενεργοποιητών, και ο PGC-1. Στη µελέτη χρησιµοποιήθηκαν και κάποιες ελλειµµατικές µορφές του HNF-4α, οι οποίες έχουν περιγραφεί παλιότερα (Hadzopoulou-Cladaras et al. 1997), µε σκοπό τη διερεύνηση της σηµασίας ευρύτερων περιοχών της LBD περιοχής του HNF-4α για τη µεταγραφική δραστικότητα του υποδοχέα και την ενίσχυση από τους συνενεργοποιητές. Τέλος, εξετάστηκαν in vitro και in vivo οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις των χαρακτηριστικότερων από τις σηµειακές µεταλλάξεις µε το συνενεργοποιητή PGC-1. 46

ΜΕΘΟ ΟΙ 47

I. Εισαγωγή σηµειακών µεταλλάξεων στο cdna του µεταγραφικού παράγοντα HNF-4α. Κλωνοποίηση χιµαιρικών µορίων HNF-4a και Bio-PGC-1. ιαλύµατα ιάλυµα θερµοανθεκτικής DNA πολυµεράσης Vent R, 10x Σύνθεση διαλύµατος: 100mM KCl, 100mM (NH 4 ) 2 SO 4, 200mM Tris-HCl (ph 8.8), 20mM Mg SO 4, 1% κ.ο. Triton X-100 Η πολυµεράση Vent R, που χρησιµοποιήθηκε στις αντιδράσεις κατασκευής σηµειακών µεταλλάξεων (New England Biolabs, M0254S), φέρει επιδιορθωτική ικανότητα 3 5 εξωνουκλεάσης, γεγονός που εξασφαλίζει µεγαλύτερη πιστότητα της αντιγραφής. Προσοχή: Το διάλυµα της πολυµεράσης, όπως και τα άλλα διαλύµατα των ενζύµων που χρησιµοποιούνται κατά τη διαδικασία της κλωνοποίησης, παρασκευάζονται σε συγκέντρωση 10x και προστίθενται κάθε φορά στην αντίδραση σε αναλογία 10% κ.ο. (αναγωγή σε 1x). ιάλυµα περιοριστικής ενδονουκλεάσης BamHI, 10x Σύνθεση διαλύµατος: 1,5M NaCl, 100mM Tris-HCl (ph 7.9), 100mM MgCl 2, 10mM Dithiothreitol (διθειοθρεϊτόλη, DTT) Η περιοριστική ενδονουκλεάση BamHI, που χρησιµοποιήθηκε, είναι της εταιρείας New England Biolabs, CAT. No R0136S. ιάλυµα περιοριστικών ενδονουκλεασών ClaI/MscI, 10x Σύνθεση διαλύµατος: 200mM Tris-acetate (ph 7.9), 100mM magnesium acetate, 500mM potassium acetate, 10mM DTT Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες ClaI και MscI, που χρησιµοποιήθηκαν, είναι της εταιρείας New England Biolabs, CAT. No R0197S και R0534S αντίστοιχα. ιάλυµα περιοριστικών ενδονουκλεασών EcoRV/ NotI/ AflIII, 10x Σύνθεση διαλύµατος: 1M NaCl, 500mM Tris-HCl (ph 7.9), 100mM MgCl 2, 10mM DTT Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες EcoRV, NotI και AflIII, που χρησιµοποιήθηκαν, είναι της εταιρείας New England Biolabs, CAT. No R0195S, R0189S και R0541S αντίστοιχα. ιάλυµα περιοριστικής ενδονουκλεάσης HindIII, 10x Σύνθεση διαλύµατος: 500mM NaCl, 100mM Tris-HCl (ph 7.9), 100mM MgCl 2, 10mM DTT 48

Η περιοριστική ενδονουκλεάση HindIII, που χρησιµοποιήθηκε, είναι της εταιρείας New England Biolabs, CAT. No R0104S. ιάλυµα λιγάσης, 10x Σύνθεση διαλύµατος: 500mM Tris-HCl (ph 7.5), 100mM MgCl 2, 100mM DTT, 10mM ATP, 250µg/ml BSA (Bovine Serum Albumin) Η λιγάση, που χρησιµοποιήθηκε (T 4 DNA ligase), είναι της εταιρείας New England Biolabs, CAT. No M0202S. Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης 50xTAE Σύνθεση διαλύµατος: 2M Tris Base, 5,71% κ.ο. glacial Acetic acid, 50mM EDTA Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται σε 8.5 µε 1N NaOH. Σηµείωση: Σε όλα τα διαλύµατα µε EDTA χρησιµοποιείται το άλας Na 2 EDTA. ιάλυµα φόρτωσης δειγµάτων DNA Σύνθεση διαλύµατος: 0,2% κ.β. xylene cyanol (κυανό της ξυλόλης), 0,2% κ.β. bromophenol blue (κυανό της βρωµοφαινόλης), 30% κ.ο. γλυκερόλη σε αποστειρωµένο dh 2 O Πρωτόκολλα i. ηµιουργία επιλεγµένων σηµειακών µεταλλάξεων στην LBD περιοχή του rhnf-4α2 µε τη µέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) Για τη δηµιουργία των σηµειακών µεταλλάξεων χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR), µε την οποία αντιγράφεται επιλεκτικά µία αλληλουχία DNA κατόπιν αποδιάταξης του δίκλωνου τµήµατος, όπου η αλληλουχία αυτή περιέχεται, και υβριδισµού ειδικά σχεδιασµένων DNA εκκινητών στα 5 και 3 άκρα της (Sambrook et al., 1989). Tο τµήµα, όπου έχουν υβριδιστεί οι εκκινητές, αντιγράφεται in vitro µε τη βοήθεια του ενζύµου της DNA πολυµεράσης κατόπιν προσθήκης των απαραίτητων συστατικών (δεοξυριβονουκλεοτιδίων και ιόντων). Η επανάληψη αλλεπάλληλων κύκλων in vitro αποδιάταξης, υβριδισµού και αντιγραφής οδηγεί στην ενίσχυση (amplification) του επιθυµητού τµήµατος DNA στα προϊόντα της αντίδρασης. Παράλληλα, µε τη µέθοδο αυτή είναι δυνατόν να εισαχθούν µέσω των εκκινητών, που χρησιµοποιούνται, επιθυµητές αλληλουχίες (όπως θέσεις αναγνώρισης ενζύµων περιορισµού) ή σηµειακές µεταλλάξεις (που προκύπτουν από αντικαταστάσεις µεµονωµένων νουκλεοτιδίων του αναγνωστικού πλαισίου) στην ακολουθία που ενισχύεται. Αυτό 49

έχει ως αποτέλεσµα την αναπαραγωγή σε µεγάλες ποσότητες της τροποποιηµένης ακολουθίας από την αρχική «µήτρα» DNA. Μία ευρέως χρησιµοποιούµενη µέθοδος για τη δηµιουργία σηµειακών µεταλλάξεων µε τον παραπάνω τρόπο είναι η µέθοδος «επιµήκυνσης των επικαλυπτόµενων άκρων» (overlap extension PCR, Ho et al., 1989), που στηρίζεται στη διεξαγωγή δύο, αρχικά, και µίας τρίτης συνδυαστικής PCR, στη συνέχεια, για κάθε µετάλλαξη. Η πρώτη αντίδραση περιλαµβάνει έναν «εσωτερικό» 5 εκκινητή (πρόσθιος εκκινητής, forward primer) (ο οποίος εισάγει τη σηµειακή µετάλλαξη στους νεοσυντιθέµενους κλώνους του DNA) και έναν «εξωτερικό» 3 εκκινητή (οπίσθιος εκκινητής, reverse primer) (ο οποίος είναι συµπληρωµατικός προς καθορισµένη αλληλουχία της περιοχής που ενισχύεται, αρκετά νουκλεοτίδια µακριά από τη θέση της µετάλλαξης). Η δεύτερη αντίδραση περιέχει έναν «εξωτερικό» 5 εκκινητή και έναν «εσωτερικό» 3 εκκινητή (ο οποίος εισάγει τη σηµειακή µετάλλαξη στους νεοσυντιθέµενους κλώνους του DNA προς την αντίθετη κατεύθυνση), ενώ η τρίτη αντίδραση PCR συνδυάζει ισοµοριακές ποσότητες των προϊόντων καθεµιάς από τις 2 προηγούµενες αντιδράσεις µε τους 5 και 3 «εξωτερικούς» εκκινητές. Το αποτέλεσµα των τριών αντιδράσεων είναι η παραγωγή αντιγράφων µιας συγκεκριµένης περιοχής µε ενσωµατωµένη την επιθυµητή, σε κάθε περίπτωση, µετάλλαξη. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας εισήχθησαν επιλεγµένες σηµειακές µεταλλάξεις στην LBD περιοχή (αα 116-371) του HNF-4α αρουραίου (rhnf-4α). Ειδικότερα, για την εισαγωγή των σηµειακών µεταλλάξεων στις έλικες 5,10 και 11 της LBD περιοχής χρησιµοποιήθηκαν τα ολιγονουκλετίδια, που αναγράφονται στον Πίνακα 1. Τα ολιγονουκλεοτίδια αυτά είναι «εκφυλισµένα», δηλαδή περιέχουν αντικαταστάσεις σε περισσότερες από µία νουκλεοτιδικές θέσεις ταυτόχρονα, ώστε να είναι δυνατόν να προκύψουν διάφοροι συνδυασµοί µεταλλάξεων σε κάθε έλικα, π.χ. τόσο οι επιµέρους απλές µεταλλάξεις L220Q, R226G, όσο και η διπλή µετάλλαξη L220Q/R226G στην έλικα 5, κ.ο.κ.. Στο Σχ.8 φαίνεται µια σχηµατική αναπαράσταση του τρόπου εισαγωγής σηµειακών µεταλλάξεων µε «εκφυλισµένα» ολιγονουκλεοτίδια µέσω της µεθόδου PCR στην έλικα 5 της LBD περιοχής του HNF- 4α. 50

Σχ.8. Σχηµατική αναπαράσταση του τρόπου εισαγωγής σηµειακών µεταλλάξεων µε τη µέθοδο «επιµήκυνσης των επικαλυπτόµενων άκρων» της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (overlap extension PCR) στην έλικα 5 της LBD περιοχής του HNF-4α µέσω «εκφυλισµένων» ολιγονουκλεοτιδίων. Με κόκκινο χρώµα συµβολίζεται η αλλαγή βάσης στην τριπλέτα που κωδικοποιεί τη λευκίνη (L)220 και µε πράσινο χρώµα η αλλαγή στην τριπλέτα που κωδικοποιεί την αργινίνη (R)226. Με παρόµοιο τρόπο εισήχθησαν οι σηµειακές µεταλλάξεις στις έλικες 10, 11. Οι εκκινητές, που χρησιµοποιήθηκαν συνολικά, αναγράφονται στον Πίνακα 1. Fig.8. Schematic representation of the introduction of point mutations in helix 5 of the HNF-4α LBD with the help of the overlap extension polymerase chain reaction and degenerate oligonucleotides. The substitution in codon L220 is depicted in red, whereas in codon R226 in green. Point mutations in helices 10, 11 were introduced in the same manner. The full set of primers used is analyzed in Table 1. 51

Εκκινητής LBDMUTGR2 F L220Q R226G LBDMUTGR2 R L220Q R226G LBDMUTGR3 F I338F Αλληλουχία 5 -CTC AGA GCC CAC GCT GGT GAG CAC CTG C(A/T)G CTT GGA GCC ACC AAG (A/G)GG-3 5 -CC(T/C) CTT GGT GGC TCC AAG G(T/A)C CAG GTG CTC ACC AGC GTG GGC TCC GAG-3 5 -AGC (A/T)TT ACC TGG CAG ATG ATC GAG CAG (A/T)TC CAG-3 I346F LBDMUTGR3 R I338F 5 -CTG GA(T/A) CTG CTC GAT CAT CTG CCA GGT AA(T/A) GCT -3 I346F HNF-4 AFL3 F 5 -AGG AAG AAC CAC ATG TAC TCC TGC AGG TTT AGC-3 HNF-4 CLA1 R HNF-4 CLA1 F HNF-4 MSC1 R 5 -TTC ATT ATC ATC GAT CTG CAG CTC TTG GAA GGG-3 5 -CCC TTC CAA GAG CTG CAG ATC GAT GAT AAT GAA-3 5 -CAG CAG GTT GTC AAT CTT GGC CAT GCC AAA-3 Πίν.1. Αλληλουχίες των µεταλλαγµένων ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιµοποιήθηκαν για την εισαγωγή των σηµειακών µεταλλάξεων στις έλικες 5,10,11 των χιµαιρικών pcmxgal- LBD µορίων. Οι συµβολισµοί F και R αντιστοιχούν στους πρόσθιους και οπίσθιους εκκινητές αντίστοιχα. Τα υπογραµµισµένα γράµµατα µε πλάγια γραφή υποδηλώνουν τις θέσεις αναγνώρισης των ενζύµων περιορισµού AflIII, ClaI και MscI. Οι υπογραµµισµένες τριπλέτες αντιστοιχούν στα µεταλλαγµένα κωδικόνια. Table 1. Sequences of the mutated oligonucleotides used for the introduction of point mutations in helices 5,10,11 of the chimeric pcmxgal-lbd constructs (F=Forward, R=Reverse primers). Underlined letters in italics indicate the restriction endonuclease sites AflIII, ClaI and MscI. The underlined triplets show the mutated codons. 52

Οι θερµοκρασίες αποδιάταξης (T m ) των παραπάνω ολιγονουκλεοτιδίων φαίνονται στον Πίνακα 2. Ολιγονουκλεοτίδιο T m ( C) LBDMUTGR2 F 82 LBDMUTGR2 R 82 LBDMUTGR3 F 71 LBDMUTGR3 R 71 HNF-4 AFL3 F 70 HNF-4 CLA1 R 70 HNF-4 CLA1 F 70 HNF-4 MSC1 R 70 Πίν.2. Θερµοκρασίες αποδιάταξης των ολιγονουκλεοτιδίων, που χρησιµοποιήθηκαν για την κατασκευή των σηµειακών µεταλλάξεων στις έλικες 5,10,11 των χιµαιρικών pcmxgal-lbd µορίων. Table 2. T m values of the oligonucleotides used for cloning of pcmxgal-lbd mutants. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, για τη δηµιουργία των απλών σηµειακών µεταλλάξεων pcmxgal-lbd L220Q, R226G (ή των συνδυασµών τους) στην έλικα 5 ακολουθήθηκαν οι εξής αντιδράσεις: µία, που περιείχε ως πρόσθιο εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο LBDMUTGR2 F (µε αντικαταστάσεις στη δέκατη και δέκατη έκτη τριπλέτα νουκλεοτιδίων αντίστοιχα) και ως οπίσθιο, εξωτερικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο HNF-4 CLA1 R, µία δεύτερη, που περιείχε ως πρόσθιο, εξωτερικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο HNF-4 AFL3 F και ως οπίσθιο εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο LBDMUTGR2 R (µε αντικαταστάσεις στις ίδιες τριπλέτες της έλικας 5 αλλά προς την αντίθετη κατεύθυνση), και µία τρίτη, που περιείχε ισοµοριακές ποσότητες από τα προϊόντα της πρώτης και δεύτερης PCR, και τους εξωτερικούς εκκινητές HNF-4 AFL3 F και HNF-4 CLA1 R. Κατά τον ίδιο τρόπο, για τη δηµιουργία των σηµειακών µεταλλάξεων στις έλικες 10, 11 χρησιµοποιήθηκαν οι εξωτερικοί εκκινητές HNF-4 CLA1 F (πρόσθιος), HNF-4 MSC1 R (οπίσθιος) και οι εσωτερικοί εκκινητές LBDMUTGR3 R (οπίσθιος) και LBDMUTGR3 F (πρόσθιος) αντίστοιχα. 53

Οι PCR αντιδράσεις, που χρησιµοποιήθηκαν για την κατασκευή των µεταλλάξεων π.χ. στην έλικα 5, σχεδιάστηκαν ως εξής: Πρώτη αντίδραση «Μήτρα» DNA 100 ng του φορέα έκφρασης HNF-4α GAL-D2CD1 (αα128-370) Πρόσθιος εκκινητής 1,2µΜ του ολιγονουκλεοτιδίου LBDMUTGR2 F Οπίσθιος εκκινητής 1,2µΜ του ολιγονουκλεοτιδίου HNF-4 CLA1 R Μείγµα dntp 400µΜ 10xδιάλυµα πολυµεράσης 10% κ.ο. της αντίδρασης (2,5 µl) DNA πολυµεράση 2 units* (0,02-0,08u/µl αντίδρ.) Τελικός όγκος αντίδρασης 25 µl (συµπληρώνεται µε αποστειρωµένο, απεσταγµένο (d)h 2 O) εύτερη αντίδραση «Μήτρα» DNA 100 ng του φορέα έκφρασης HNF-4α GAL-D2CD1 (αα128-370) Πρόσθιος εκκινητής 1,2µΜ του ολιγονουκλεοτιδίου HNF-4 AFL3 F Οπίσθιος εκκινητής 1,2µΜ του ολιγονουκλεοτιδίου LBDMUTGR2 R Μείγµα dntp 400µΜ 10xδιάλυµα πολυµεράσης 10% κ.ο. της αντίδρασης (2,5 µl) DNA πολυµεράση 2 units* (0,02-0,08u/µl αντίδρ.) Τελικός όγκος αντίδρασης 25 µl (συµπληρώνεται µε αποστειρωµένο dh 2 O) *units: µονάδες ενζυµικής δραστικότητας Μεταξύ των δύο αντιδράσεων και της τρίτης µεσολαβεί ηλεκτροφορητικός έλεγχος των προϊόντων PCR σε 0,8% πηκτή αγαρόζης ώστε να επιβεβαιωθεί η επιλεκτική ενίσχυση της επιθυµητής ακολουθίας, και όχι άλλων, µη ειδικών ακολουθιών, αλλά και να προσδιοριστεί η σχετική συγκέντρωση των προϊόντων των δύο αντιδράσεων. Σε περίπτωση που υπάρχουν παραπροϊόντα παραπλήσιου µεγέθους µε αυτού της επιθυµητής αλληλουχίας, ενδείκνυται η κοπή της ζώνης, που αντιστοιχεί στην επιθυµητή αλληλουχία, από την πηκτή και η χρήση της ως «µήτρας» σε µία νέα αντίδραση PCR, ώστε να εξασφαλιστεί η αντιγραφή του ειδικού, και µόνο, προϊόντος σε µεγάλη ποσότητα. 54

Η εκτίµηση της σχετικής συγκέντρωσης των προϊόντων των δύο αντιδράσεων, εξ άλλου, είναι απαραίτητη για το σχεδιασµό της τρίτης αντίδρασης, καθώς συντελεί στη λήψη ισοµοριακών ποσοτήτων από τα DNA που έχουν προκύψει. Τρίτη αντίδραση «Μήτρα» DNA x, π.χ. 2 µl από το προϊόν της πρώτης αντίδρασης «Μήτρα» DNA y, π.χ. 2 µl από το προϊόν της δεύτερης αντίδρασης Πρόσθιος εκκινητής 1,2µΜ του ολιγονουκλεοτιδίου HNF-4 AFL3 F Οπίσθιος εκκινητής 1,2µΜ του ολιγονουκλεοτιδίου HNF-4 CLA1 R Μείγµα dntp 400µΜ 10xδιάλυµα πολυµεράσης 10% κ.ο. της αντίδρασης (10 µl) DNA πολυµεράση 2 units (0,02-0,08u/µl αντίδρ.) Τελικός όγκος αντίδρασης 100 µl (συµπληρώνεται µε αποστειρωµένο dh 2 O) Το πρόγραµµα της PCR, το οποίο ακολουθήθηκε, µε αναπροσαρµογή κάθε φορά στη θερµοκρασία αποδιάταξης των διαφορετικών ολιγονουκλεοτιδίων, είχε ως εξής: 96 C : 3 λεπτά Τ υβρ. : 3 λεπτά 1 κύκλος 72 C : 1 λεπτό 96 C : 1 λεπτό Τ υβρ. : 2 λεπτά 25 κύκλοι 72 C : 3 λεπτά 72 C : 7 λεπτά Οι 96 C χρησιµεύουν ως θερµοκρασία αποδιάταξης όλων των δίκλωνων µορίων DNA, που περιέχονται στην αντίδραση. Το Τ υβρ. αποτελεί τη θερµοκρασία υβριδισµού, που ισούται µε τη θερµοκρασία αποδιάταξης των επιµέρους ολιγονουκλεοτιδίων µείον 4-5 C. Τέλος, οι 72 C αποτελούν θερµοκρασία άριστης λειτουργίας του θερµοανθεκτικού ενζύµου, που χρησιµοποιείται στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης. Η τελική επώαση για 7 λεπτά σε αυτήν τη θερµοκρασία επιτρέπει τη συµπλήρωση µονόκλωνων άκρων, που έχουν τυχόν αφεθεί από την πολυµεράση, ώστε να ολοκληρωθεί η δηµιουργία των δίκλωνων αντιγράφων της επιθυµητής αλληλουχίας DNA. 55

Με αντίστοιχο τρόπο µεταφέρθηκαν οι απλές σηµειακές µεταλλάξεις R226G, I338F και I346F της LBD περιοχής σε ολόκληρο το µόριο του HNF-4α (rhnf-4α2, αα 1-465) χρησιµοποιώντας τα ολιγονουκλεοτίδια, που αναγράφονται στον Πίνακα 3. Εκκινητής MUTGR2F R226G MUTGR2R R226G MUTGR3F I338F I346F MUTGR3R I338F I346F HNF-N HNF-C Αλληλουχία 5 -A GCC ACC AAG GGG TCC ATG GTG TT-3 5 -AA CAC CAT GGA CCC CTT GGT GGC T-3 5 -T CTG CAG AGC TTT ACC TGG CAG AT-3 5 -G ATC GAG CAG TTC CAG TTC ATC AA-3 5 -AT CTG CCA GGT AAA GCT CTG CAG A-3 5 -TT GAT GAA CTG GAA CTG CTC GAT C-3 5 -GAT ATC AAG CTT GCC GCC GCC ATG GAC ATG GCT GAC TAC AGT GCT-3 5 -TCT AGA GGA TCC CTA GAT GGC TTC CTG CTT GGT GAT-3 Πίν.3. Αλληλουχίες των µεταλλαγµένων ολιγονουκλεοτιδίων, που χρησιµοποιήθηκαν για την εισαγωγή των σηµειακών µεταλλάξεων στις έλικες 5, 10, 11 των pcdna3.1 LBD µορίων. Τα υπογραµµισµένα γράµµατα µε πλάγια γραφή υποδηλώνουν τις θέσεις αναγνώρισης των ενζύµων περιορισµού HindIII και BamHI, καθώς και τα κωδικόνια έναρξης ATG και λήξης TAG (CTA το συµπληρωµατικό του κωδικονίου λήξης σε ανάποδη κατεύθυνση). Τα έντονα γράµµατα υποδηλώνουν την ακολουθία Kozak, που τοποθετήθηκε πριν από το κωδικόνιο έναρξης για βελτιστοποίηση της απόδοσης µετάφρασης, ενώ οι υπογραµµισµένες τριπλέτες αντιστοιχούν στα µεταλλαγµένα κωδικόνια. Table 3. Sequences of the mutated oligonucleotides used for the introduction of point mutations in helices 5, 10, 11 of the pcdna3.1-lbd constructs. Underlined letters in italics indicate the restriction endonuclease sites HindIII and BamHI, as well as the initiator ATG and terminator TAG (CTA in reverse orientation) codons. Boldface letters indicate the Kozak sequence, placed adjacent to the initiator codon for optimal translation. Underlined triplets show the mutated codons. 56

Οι θερµοκρασίες αποδιάταξης (T m ) των παραπάνω ολιγονουκλεοτιδίων φαίνονται στον Πίνακα 4. Ολιγονουκλεοτίδιο T m ( C) R226G F 57 R226G R 57 I338F F 56,4 I338F R 56,4 I346F F 56 I346F R 56 HNF-N 56,4 HNF-C 56,4 Πίν.4. Θερµοκρασίες αποδιάταξης των ολιγονουκλεοτιδίων, που χρησιµοποιήθηκαν για την κατασκευή των σηµειακών µεταλλάξεων στις έλικες 5, 10, 11 των pcdna3.1-lbd µορίων. Table 4. T m values of the oligonucleotides used for cloning the pcdna3.1-lbd mutants. Τέλος, για την κλωνοποίηση του µορίου PGC-1 στο φορέα pcdna3.1-bio, και ειδικότερα στο ίδιο αναγνωστικό πλαίσιο µε την αλληλουχία Bio, που αποτελεί το σήµα βιοτινυλίωσης in vivo (βλ. VII. In vitro και in vivo µελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνικών συµπλόκων σε πηκτές πολυακρυλαµίδης και εντοπισµός πρωτεϊνών µε τη µέθοδο της ανοσοανίχνευσης, v. In vivo µελέτη της αλληλεπίδρασης βιοτινυλιωµένων πρωτεϊνών µε πρωτεΐνες-στόχους τους στα κύτταρα), χρησιµοποιήθηκαν οι εκκινητές που φαίνονται στον Πίνακα 5, ενώ οι θερµοκρασίες αποδιάταξής τους φαίνονται στον Πίνακα 6: 57

Εκκινητής BIO PGC1 F BIO PGC1 R Αλληλουχία 5 -ATT GCC GAT ATC GC ATG GCG TGG GAC ATG TGC A-3 5 -GGC AAT GC GGC CGC TTA CCT GCG CAA GCT TCT CT-3 Πίν.5. Αλληλουχίες των ολιγονουκλεοτιδίων, που χρησιµοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση του PGC-1 στο φορέα pcdna3.1-bio. Τα υπογραµµισµένα γράµµατα µε πλάγια γραφή υποδηλώνουν τις θέσεις αναγνώρισης των ενζύµων περιορισµού EcoRV και NotI, καθώς και την εναρκτήρια µεθειονίνη ATG και το κωδικόνιο λήξης TAA (TTA το συµπληρωµατικό του κωδικονίου λήξης σε ανάποδη κατεύθυνση). Τα έντονα γράµµατα στην αλληλουχία του εκκινητή BIO PGC1 F αντιστοιχούν στα νουκλεοτίδια που τοποθετήθηκαν πριν από την εναρκτήρια µεθειονίνη του PGC-1 ώστε το αναγνωστικό πλαίσιο του γονιδίου να εναρµονιστεί µε το αναγνωστικό πλαίσιο της αλληλουχίας Bio του φορέα pcdna3.1-bio. Table 5. Sequences of the mutated oligonucleotides used for subcloning PGC-1 in the pcdna3.1-bio vector. Underlined letters in italics indicate the restriction endonuclease sites EcoRV και NotI, as well as the initiator ATG and terminator TAA (TTA in reverse orientation) codons. Boldface letters in the BIO PGC1 F sequence indicate nucleotides added before the initiator codon of PGC-1 to bring it in-frame with the Bio tag of the pcdna3.1-bio vector. Ολιγονουκλεοτίδιο T m ( C) BIO PGC1 F 60 BIO PGC1 R 60 Πίν. 6. Θερµοκρασίες αποδιάταξης των ολιγονουκλεοτιδίων, που χρησιµοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση του PGC-1 στο φορέα pcdna3.1-bio. Table 6. T m values of the oligonucleotides used for subcloning PGC-1 in pcdna3.1-bio. Σηµείωση: Όλα τα ολιγονουκλεοτίδια, που αναφέρονται πιο πάνω, συντέθηκαν από το Εργαστήριο Μικροχηµείας του Ινστιτούτου Τεχνολογίας και Έρευνας στο Ηράκλειο Κρήτης. 58

ii. Ηλεκτροφορητικός έλεγχος του προϊόντος της αντίδρασης PCR σε πηκτή αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πηκτή αγαρόζης (δηλ. η µετανάστευση των νουκλεϊκών οξέων κατά µήκος της πηκτής µε εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου) επιτρέπει το διαχωρισµό των µορίων µέσα από τους πόρους του πλέγµατος, που δηµιουργεί η αγαρόζη, ανάλογα µε το µοριακό τους βάρος. Για την προετοιµασία 0,8% πηκτής αγαρόζης σε 100 ml 1xTAE ρυθµιστικού διαλύµατος ηλεκτροφόρησης, το οποίο περιέχει βρωµιούχο αιθίδιο σε συγκέντρωση 0,5µg/ml, διαλύονται, µε θέρµανση, 0,8 gr αγαρόζης. Το µείγµα µεταφέρεται στην ειδική υποδοχή της ηλεκτροφορητικής συσκευής, όπου αφήνεται να πήξει (σηµείο πήξης=47 C). Ανάλογα µε το µέγεθος των οπών, που έχουν δηµιουργηθεί (το οποίο καθορίζεται από την επιλογή της ηλεκτροφορητικής «κτένας», που τοποθετείται στην υποδοχή), µπορεί να ελεγχθεί ορισµένος όγκος ενός δείγµατος DNA επαναιωρώντας ορισµένη ποσότητα δείγµατος σε διάλυµα «φόρτωσης», που περιέχει µείγµα χρωστικών και γλυκερόλη (Βλ. ιαλύµατα). Για παράδειγµα, στην περίπτωση ηλεκτροφορητικού ελέγχου του προϊόντος της πρώτης αντίδρασης PCR (όγκος 25 µl), που αναφέρθηκε πιο πάνω, αρκεί να επαναιωρηθούν 2 µl από το προϊόν σε 8 µl διαλύµατος «φόρτωσης». Για τον έλεγχο του µεγέθους των µορίων DNA χρησιµοποιούνται ειδικοί δείκτες (size markers) (π.χ. τµήµατα γνωστού µοριακού βάρους, τα οποία προκύπτουν έπειτα από πέψη του DNA του βακτηριοφάγου λ µε την περιοριστική ενδονουκλεάση HindIII). Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν οι δείκτες της εταιρείας New England Biolabs, CAT. No N3012S. Στη συνέχεια δηµιουργείται κλειστό κύκλωµα µε τη βοήθεια διαλύµατος ηλεκτροδίων ορισµένης αγωγιµότητας (1xTAE ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης), στο οποίο βυθίζεται η πηκτή. Στα άκρα του κυκλώµατος εφαρµόζεται σταθερή τάση, 10 Volt/cm. Στο τέλος της ηλεκτροφόρησης, η χρονική διάρκεια της οποίας καθορίζεται από το αναµενόµενο µοριακό βάρος του DNA παρακολουθώντας την πορεία του µετώπου των µορίων χρωστικής στην πηκτή, το DNA ελέγχεται µε έκθεση της πηκτής σε φωτεινή ακτινοβολία µήκους κύµατος 220-260 nm (U.V. light). Το βρωµιούχο αιθίδιο, το οποίο έχει συµπεριληφθεί στην κατασκευή της πηκτής, είναι ένα ισχυρότατο µεταλλαξιγόνο, που έχει την ικανότητα να παρεµβάλλεται µεταξύ των συµπληρωµατικών αζωτούχων βάσεων στη διπλή έλικα του DNA. Συγχρόνως είναι φθορίζουσα ουσία, η οποία εκπέµπει στο φάσµα του υπεριώδους, βοηθώντας να 59

εντοπιστεί το νουκλεϊκό οξύ στην πηκτή έπειτα από έκθεση της πηκτής σε φως µήκους κύµατος λιγότερου από 260 nm (υπεριώδης ακτινοβολία). iii. Καθαρισµός του ενθέµατος µε φαινόλη/χλωροφόρµιο Αφού ολοκληρωθεί ο ηλεκτροφορητικός έλεγχος της καθαρότητας του προϊόντος και της τρίτης PCR αντίδρασης, το προϊόν της αντίδρασης υποβάλλεται σε καθαρισµό µε φαινόλη/χλωροφόρµιο πριν από το επόµενο στάδιο της κλωνοποίησης. Για το σκοπό αυτό, µετά την προσθήκη ίσου όγκου (100 µl περίπου) διαλύµατος φαινόλης:χλωροφορµίου:ισοαµυλικής αλκοόλης σε αναλογία 25:24:1 και ανάδευση του δείγµατος ώστε να αναµειχθούν πλήρως οι φάσεις, το δείγµα φυγοκεντρείται στα 13000 rpm για 15 λεπτά και η υδατική φάση που περιέχει το DNA (επάνω) µεταφέρεται σε καθαρό σωλήνα µικροφυγοκέντρου (Eppendorf, 1,5 ml), ενώ η ενδιάµεση φάση (RNA) και η οργανική φάση (πρωτεΐνες) πετιούνται. Για µέγιστο καθαρισµό του DNA, στα 100 περίπου µl της υδατικής φάσης προστίθενται 10% κ.ο. διάλυµα 3M οξικού νατρίου (CH 3 COONa) (ph 7.0) και 2,5 όγκοι παγωµένης αιθανόλης 100% και το µείγµα αφήνεται στους -20 C κατά τη διάρκεια της νύχτας (κατακρήµνιση µε αιθανόλη). Το επόµενο πρωί, µετά από φυγοκέντρηση στα 13000 rpm για 15 λεπτά, το υπερκείµενο αφαιρείται και, αφού ξεπλυθεί το ίζηµα (DNA) µε 70% αιθανόλη, αφήνεται να στεγνώσει (στον αέρα) και επαναιωρείται σε 50 µl αποστειρωµένου dh 2 O. iv. Πέψη του ενθέµατος και του φορέα κλωνοποίησης µε ενδονουκλεάσες περιορισµού και αποφωσφορυλίωση των 5 άκρων του ενθέµατος µε αλκαλική φωσφατάση Το ένθεµα, όπως και ο φορέας, στον οποίο πρόκειται να κλωνοποιηθεί, πρέπει στη συνέχεια να κοπούν µε κατάλληλες ενδονουκλεάσες περιορισµού ώστε να προκύψουν µονόκλωνα συµπληρωµατικά («κολλώδη») ή δίκλωνα («τυφλά») άκρα, τα οποία θα βοηθήσουν στην επανασύνδεση του φορέα µε το ένθεµα για τη δηµιουργία του επιθυµητού ανασυνδυασµένου DNA. Συνήθης τακτική, η οποία χρησιµοποιείται, είναι η χρήση διαφορετικών ενδονουκλεασών, οι οποίες αναγνωρίζουν τα δύο άκρα του ενθέµατος (και του φορέα), ώστε να εξασφαλίζεται η σύνδεση του ενθέµατος µε το φορέα µε συγκεκριµένο, µόνο, προσανατολισµό. Στην περίπτωση αυτή πραγµατοποιούνται δύο 60

διαδοχικές αντιδράσεις πέψης µε τις αντίστοιχες ενδονουκλεάσες. Ένα ενδεικτικό παράδειγµα είναι το εξής: Πρώτη αντίδραση DNA* προϊόν PCR µετά από καθαρισµό (βλ. iii) BSA (100x) 1% κ.ο. της αντίδρασης (1 µl) 10xδιάλ.ενδονουκλεάσης 10% κ.ο. της αντίδρασης (10 µl) Περιοριστική ενδονουκλεάση 0,2-0,4u/µl (20-40 units για αντίδραση 100 µl) Τελικός όγκος αντίδρασης 100 µl (συµπληρώνεται µε αποστειρωµένο dh 2 O) Επώαση για το προτεινόµενο χρονικό διάστηµα στους 37 C * Αν πρόκειται για το DNA του φορέα, ποσότητα 15 µg αρκεί για την κλωνοποίηση. εύτερη αντίδραση DNA 100 µl (το προϊόν της προηγούµενης πέψης) BSA (100x) 1% κ.ο. της αντίδρασης (2 µl) 10xδιάλ.ενδονουκλεάσης 10% κ.ο. της αντίδρασης (20 µl) Περιοριστική ενδονουκλεάση 0,2-0,4u/µl (40 units συνήθως για αντίδραση 200 µl) Τελικός όγκος αντίδρασης 200 µl (συµπληρώνεται µε αποστειρωµένο dh 2 O) Επώαση για το προτεινόµενο χρονικό διάστηµα στους 37 C Είναι δυνατόν να µεσολαβήσει καθαρισµός του προϊόντος µε φαινόλη/χλωροφόρµιο µεταξύ των αντιδράσεων. Ανεξαρτήτως καθαρισµού είναι σκόπιµο να ελεγχθεί µία µικρή ποσότητα του προϊόντος της πρώτης αντίδρασης πριν τη δεύτερη αντίδραση πέψης ώστε να είναι σίγουρο ότι το πρώτο ένζυµο έχει κόψει το DNA, ενώ είναι επίσης καλό να επαναληφθούν οι αντιδράσεις και µε αντίστροφη σειρά ώστε να επιβεβαιωθεί ότι οι επιθυµητές αλληλουχίες κόβονται και από τα δύο ένζυµα. Όσον αφορά στο ένθεµα, αµέσως µετά την πέψη µε τα ένζυµα περιορισµού, υποβάλλεται σε αντίδραση αποφωσφορυλίωσης των 5 άκρων ώστε να µειωθεί η πιθανότητα σύνδεσης διαδοχικών ενθεµάτων και η δηµιουργία συγκαταµερών υψηλού µοριακού βάρους, που δυσχεραίνουν την επανένωση του ενθέµατος µε τον 61

πλασµιδιακό φορέα. Η αποφωσφορυλίωση γίνεται µετά το τέλος των αντιδράσεων πέψης, µε προσθήκη στο µείγµα 1 µl (10 units) αλκαλικής φωσφατάσης (CIP) και επώαση για 1 ώρα στους 37 C. Η φωσφατάση, που χρησιµοποιήθηκε (New England Biolabs, CAT. No M0290S), είναι ενεργή στα περισσότερα από τα διαλύµατα των περιοριστικών ενδονουκλεασών της ίδιας εταιρείας. Η αλκαλική φωσφατάση απενεργοποιείται µε προσθήκη 0,25 ml διαλύµατος 500mM EDTA (ph 8.0) και επώαση στους 70 C για 10 λεπτά. Μετά τις πέψεις και την αποφωσφορυλίωση του ενθέµατος ακολουθεί καθαρισµός µε φαινόλη/χλωροφόρµιο τόσο για το ένθεµα όσο και για το φορέα. Οι πλασµιδιακοί φορείς, που χρησιµοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση των διαφόρων µορίων στην παρούσα εργασία, ήταν οι εξής: -για την κατασκευή των χιµαιρικών σηµειακών µεταλλάξεων pcmxgal-lbd του HNF-4α, το πλασµίδιο HNF-4α GAL-D2CD1 (αα128-370) (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). (Το πλασµίδιο αυτό περιέχει κλωνοποιηµένη την περιοχή πρόσδεσης στο DNA της πρωτεΐνης GAL-4 του ζυµοµύκητα (GAL-4DBD 1-147 ) στις θέσεις Hind III και Xba I του φορέα pcdna 3.1 (+) (Invitrogen Corp.), σε συνδυασµό µε την LBD περιοχή του HNF-4α (αα 128-370) στις θέσεις EcoRI και BamHI του ίδιου φορέα.) Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού, που χρησιµοποιήθηκαν για την ένωση του ενθέµατος µε το πλασµίδιο HNF-4α GAL-D2CD1, ήταν οι AflIII, ClaI, MscI. -για την κατασκευή των σηµειακών µεταλλάξεων pcdna3.1-lbd του HNF-4α, ο φορέας pcdna 3.1 (+) (Invitrogen Corp.). Η αλληλουχία του HNF-4α, που έφερε τις µεταλλάξεις στην LBD περιοχή, κλωνοποιήθηκε στις θέσεις HindIII και BamHI του φορέα. -για την κατασκευή του φορέα pcdna3.1-bio-pgc-1, το πλασµίδιο pcdna3.1-bio. Το πλασµίδιο αυτό ήταν ένα ευγενικό δώρο του ρ.. Καρδάση, από το Πανεπιστήµιο Κρήτης. Η αλληλουχία του PGC-1 κλωνοποιήθηκε στις θέσεις EcoRV και NotI του φορέα. v. Καθαρισµός του φορέα και του ενθέµατος από την πηκτή µε το σύστηµα QIAquick (Qiagen) Μετά τον καθαρισµό µε φαινόλη/χλωροφόρµιο και την κατακρήµνιση µε αιθανόλη τόσο ο φορέας όσο και το ένθεµα επαναδιαλύονται σε 40-50 µl αποστειρωµένου νερού (dh 2 O) και, έπειτα από προσθήκη επαρκούς ποσότητας διαλύµατος φόρτωσης (συνήθως 10 µl), υποβάλλονται σε ηλεκτροφόρηση αγαρόζης, 62

σε πηκτή 1,5%. Οι ζώνες των δειγµάτων πρέπει να διαχωριστούν πολύ καλά προκειµένου να αποµονωθεί µόνο το επιθυµητό τµήµα DNA, προτού επιχειρηθεί η επανένωση ενθέµατος-φορέα. Τελικά τα τµήµατα της αγαρόζης, που περιέχουν τα επιθυµητά προϊόντα (φορέα και ένθεµα), αποκόπτονται από την πηκτή προσεκτικά και επαναδιαλύονται το καθένα σε τριπλάσιο όγκο (σε σχέση µε το βάρος του) διαλύµατος QG, µε επώαση στους 37 C για 10 λεπτά και ελαφριά ανάδευση ώστε να διαλυθεί η αγαρόζη. Το διάλυµα QG προσφέρει τα κατάλληλα ιόντα για την (αντιστρεπτή) σύνδεση του DNA σε µεµβράνη πυριτίου (QIAquick, Qiagen). Η σύνδεση υψηλού ποσοστού του DNA είναι εφικτή µόνο σε τιµές ph από 7.5 και κάτω. Εφ όσον το χρώµα του διαλύµατος, που προκύπτει, είναι ενδεικτικό του σωστού ph (ως δείκτης σύγκρισης χρησιµοποιείται το ίδιο το διάλυµα QG, που περιέχει χρωµατοµετρικό δείκτη ph), ακολουθεί προσθήκη όγκου ισοπροπανόλης ίσου µε το αρχικό βάρος του κοµµατιού αγαρόζης, ανάµειξη, και µεταφορά του διαλύµατος σε στήλη, που περιέχει τη µεµβράνη. Αν το διάλυµα δεν έχει το σωστό χρώµα µετά την επαναδιάλυση της αγαρόζης, προστίθενται σταγόνες διαλύµατος 3M CH 3 COONa (ph 5.0) ώστε το διάλυµα να αποκτήσει το ενδεικτικό χρώµα του επιθυµητού ph. Έπειτα από φυγοκέντρηση του δείγµατος στα 13000 rpm για 1 λεπτό, αφαιρείται το υπερκείµενο και προστίθενται στη στήλη 0,75 ml διαλύµατος PE. Το διάλυµα αυτό, που περιέχει αιθανόλη για την αποµάκρυνση των αλάτων, αφήνεται να επιδράσει στη στήλη για 5 λεπτά και στη συνέχεια η στήλη φυγοκεντρείται κατά τον ίδιο τρόπο (13000 rpm, 1 λεπτό) και αποµακρύνεται το υπερκείµενο. Μετά την αφαίρεση του υπερκειµένου η στήλη ξαναφυγοκεντρείται στα 13000 rpm για 1 λεπτό ώστε να αποµακρυνθούν όλα τα κατάλοιπα αιθανόλης του διαλύµατος PE, που δεν επιτρέπουν την έκλουση του DNA στο επόµενο στάδιο. Τέλος, η στήλη τοποθετείται σε καθαρό σωλήνα µικροφυγοκέντρου (Eppendorf, 1,5 ml) και συλλέγεται το εκλουόµενο DNA κατόπιν προσθήκης 30 µl διαλύµατος EB, που αφήνεται να επιδράσει στη στήλη για 1-3 λεπτά περίπου, προτού αποµακρυνθεί µε φυγοκέντρηση στα 13000 rpm για 1 λεπτό. Το διάλυµα EB δεν είναι άλλο από 10mM Tris-HCl (ph 8.5). Μετά από αυτό το στάδιο ο κάθε σωλήνας Eppendorf περιέχει το απαλλαγµένο από τα ενδιάµεσα νουκλεοτίδια, πλέον, DNA του φορέα, που έχει κοπεί µε περιοριστικές ενδονουκλεάσες, και το επίσης απαλλαγµένο από ενδιάµεσα νουκλεοτίδια DNA του ενθέµατος, το οποίο έχει κοπεί µε τις ίδιες περιοριστικές ενδονουκλεάσες και τα 5 άκρα του έχουν αποφωσφορυλιωθεί. Τα DNA αυτά είναι 63

έτοιµα να επανασυνδεθούν µε την επίδραση λιγάσης για το σχηµατισµό του επιθυµητού ανασυνδυασµένου µορίου DNA. vi. Επανένωση φορέα-ενθέµατος µε την επίδραση λιγάσης Προτού επανενωθούν ο φορέας µε το ένθεµα, µία ποσότητά τους (5 µl) ελέγχεται ηλεκτροφορητικά σε πηκτή αγαρόζης 0,8% και η εικόνα χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό της σχετικής συγκέντρωσης των µορίων φορέα-ενθέµατος. Αυτό χρησιµεύει στον προσδιορισµό της αναλογίας, που θα τηρηθεί στην αντίδραση επανασύνδεσης. Μία γενικώς αποδεκτή αναλογία είναι 1 µόριο φορέα : 4 µόρια ενθέµατος περίπου, για συνήθη µόρια φορέα µεγέθους 2-5 kb και ενθέµατος 0,5-2 kb. Στο παράδειγµα που ακολουθεί φαίνεται η σύσταση µίας τυπικής αντίδρασης επανένωσης φορέα-ενθέµατος: Αντίδραση επανένωσης DNA φορέα 2-4 µl DNA ενθέµατος 4-10 µl (ανάλογα µε τη σχετική ένταση της ζώνης του ενθέµατος ως προς το φορέα) (~0,5 µg) 10xδιάλ.λιγάσης 10% κ.ο. της αντίδρασης (2 µl) Λιγάση 400units Τελικός όγκος αντίδρασης 20 µl (συµπληρώνεται µε αποστειρωµένο dh 2 O) Επώαση στους 16 C για 12-14 ώρες Το µείγµα που προκύπτει (µόρια φορέα, που έχουν επανασυνδεθεί χωρίς να ενσωµατώσουν το ένθεµα, µόρια ενθέµατος, που δε χρησιµοποιήθηκαν, και µόρια φορέα, που ενσωµάτωσαν το επιθυµητό ένθεµα) χρησιµοποιείται για το µετασχηµατισµό ικανών βακτηριακών κυττάρων, όπως περιγράφεται στην ενότητα: III. Παρασκευή πλασµιδιακού DNA και αποµόνωση επιθυµητών πρωτεϊνών από καλλιέργειες µετασχηµατισµένων βακτηρίων, i. Μετασχηµατισµός ικανών βακτηριακών κυττάρων E.coli. Σηµείωση: Όλες οι µεταλλάξεις που δηµιουργήθηκαν µε τους παραπάνω τρόπους και χρησιµοποιήθηκαν στη συνέχεια σε πειράµατα επιµόλυνσης ευκαρυωτικών κυττάρων ελέγχθηκαν µε προσδιορισµό της πρωτοταγούς αλληλουχίας (sequencing) δειγµάτων 64

πλασµιδιακού DNA, που αποµονώθηκε από τους ενδεικτικούς κλώνους. Οι αναλύσεις της πρωτοταγούς αλληλουχίας του DNA πραγµατοποιήθηκαν στα εργαστήρια της εταιρείας Lark Technologies Inc. II. Βακτηριακές καλλιέργειες ιαλύµατα και µέσα καλλιέργειας Luria-Bertani πλούσιο θρεπτικό µέσο ανάπτυξης βακτηρίων (LB rich medium) 10 gr bactotryptone, 5 gr yeast extract, 5 gr NaCl, 1gr glucose (γλυκόζη) διαλύονται ανά λίτρο απεσταγµένου νερού. Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται σε τιµή 7.0 µε τη βοήθεια 0,1Ν ΝαΟΗ και το διάλυµα αποστειρώνεται µε υγρή αποστείρωση. Βακτηριακά στελέχη Ικανά προς µετασχηµατισµό βακτηριακά κύτταρα στελέχους DH5α E.coli Ικανά προς µετασχηµατισµό βακτηριακά κύτταρα στελέχους BL21 E.coli Ικανά προς µετασχηµατισµό βακτηριακά κύτταρα στελέχους ΗΒ101 E.coli Πρωτόκολλα i. Προετοιµασία stock βακτηριακών κυττάρων σε γλυκερόλη Βακτηριακά κύτταρα από τα διάφορα στελέχη φυλάσσονται ως stock σε 20% κ.ο. γλυκερόλη (0,8 ml βακτηριακής καλλιέργειας + 0,2 ml αποστειρωµένης γλυκερόλης) στους -70 C. Το µείγµα παγώνει ακαριαία, µε εµβάπτιση σε υγρό άζωτο, πριν τη µεταφορά στους -70 C. ii. Προετοιµασία ικανών προς µετασχηµατισµό κυττάρων Αρχική καλλιέργεια 5 ml αποστειρωµένου θρεπτικού µέσου LB, που έχει ενοφθαλµιστεί µε κύτταρα του επιθυµητού στελέχους, επωάζεται κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 37 C µε ανάδευση στα 200 rpm (στροφές ανά λεπτό). Το επόµενο πρωί η καλλιέργεια (~10 7 κύτταρα) µεταφέρεται σε 1000 ml αποστειρωµένου LB µέσου και αφήνεται να αναπτυχθεί ώσπου να φτάσει σε οπτική πυκνότητα O.D. 550nm 0,5 (~5x10 8 κύτταρα). Η καλλιέργεια χωρίζεται στη συνέχεια σε ίσες ποσότητες και φυγοκεντρείται στα 5000 rpm για 10 λεπτά στους 4 C. Τα ιζήµατα επαναιωρούνται σε 250 ml, συνολικά, (2x125) 0,1Μ MgCl 2 σε θερµοκρασία 4 C και ξαναφυγοκεντρούνται στα 5000 rpm για 10 λεπτά στους 4 C. Αφού αποµακρυνθεί το 65

υπερκείµενο διάλυµα, τα ιζήµατα επαναιωρούνται σε 250 ml (2x125) 0,1Μ CaCl 2 σε θερµοκρασία 4 C και αφήνονται στους 0 C (λουτρό πάγου και άλατος) για 20 λεπτά. Ακολουθεί η τελευταία φυγοκέντρηση στα 5000 rpm για 10 λεπτά στους 4 C και τα ιζήµατα επαναιωρούνται σε 50, συνολικά, ml διαλύµατος 0,1Μ CaCl 2 και 14% γλυκερόλης σε θερµοκρασία 4 C. Τα 50 ml εναιωρήµατος, που προέρχονται από το συνολικό βακτηριακό ίζηµα, µοιράζονται ανά 1 ml σε αποστειρωµένους σωλήνες µικροφυγοκέντρου Eppendorf (χωρητικότητας 1,5 ml) και οι σωλήνες τοποθετούνται απευθείας σε ξηρό πάγο ή υγρό άζωτο ώστε τα κύτταρα να παγώσουν ακαριαία. Τα stock διαλύµατα ικανών βακτηριακών κυττάρων φυλάσσονται στους -70 C και αφήνονται να ξεπαγώσουν στους 4 C πριν τη χρήση τους. III. Παρασκευή πλασµιδιακού DNA και αποµόνωση επιθυµητών πρωτεϊνών από καλλιέργειες µετασχηµατισµένων βακτηρίων ιαλύµατα και µέσα καλλιέργειας ιάλυµα αµπικιλλίνης (ampicillin) Η συγκέντρωση του stock διαλύµατος αµπικιλλίνης σε αποστειρωµένο dh 2 O είναι 50mg/ml. Η αποστείρωση του διαλύµατος γίνεται µε διήθηση µέσα από φίλτρο πόρων διαµέτρου 0,22 µm. Η τελική συγκέντρωση της αµπικιλλίνης που χρησιµοποιείται στα υγρά και στερεά θρεπτικά µέσα ανάπτυξης είναι 100µg/ml. Luria-Bertani (LB) - άγαρ στερεό θρεπτικό µέσο ανάπτυξης βακτηρίων, µε προσθήκη αντιβιοτικού µέσου επιλογής Για το διάλυµα αυτό χρησιµοποιήθηκαν κάψουλες παρασκευής LB-άγαρ µέσου της εταιρίας BIO 101, Inc., που είχαν την εξής σύσταση: 10 gr bactotryptone, 5 gr yeast extract, 10 gr NaCl και 15 gr agar ανά λίτρο. Μία κάψουλα αντιστοιχεί σε 40 ml θρεπτικού µέσου-άγαρ µετά τη διάλυσή της σε ίση ποσότητα απεσταγµένου νερού (dh 2 O), οπότε χρησιµοποιούνται 25 κάψουλες ανά λίτρο διαλύµατος. Το διάλυµα αποστειρώνεται και αφήνεται να ψυχθεί στους 55 C πριν την προσθήκη του αντιβιοτικού µέσου επιλογής. Στη συνέχεια χύνεται σε τριβλία Petri διαµέτρου 8 cm, όπου αφήνεται να πήξει σε θερµοκρασία δωµατίου. Τα τριβλία LB-άγαρ φυλάσσονται στους 4 C και επωάζονται για λίγο στους 37 C πριν τη χρήση τους. 66

Luria-Bertani (LB) υγρό θρεπτικό µέσο ανάπτυξης βακτηρίων, µε προσθήκη αντιβιοτικού µέσου επιλογής Για παρασκευή του υγρού θρεπτικού µέσου, βλ.: Μέρος Ι. Βακτηριακές καλλιέργειες, ιαλύµατα. Το διάλυµα αποστειρώνεται και αφήνεται να ψυχθεί στους 55 C πριν την προσθήκη του αντιβιοτικού µέσου επιλογής. SOC θρεπτικό µέσο ανάπτυξης βακτηρίων Σύνθεση διαλύµατος: 5% κ.β. bactotryptone, 1,25% κ.β. yeast extract, 25mM NaCl, 5mM KCl, 25mM MgSO 4, 25mM MgCl 2 και 25mM glucose. Ειδικότερα για 50 ml διαλύµατος SOC, 2,5 gr bactotryptone, 0,625 gr yeast extract, 0,25 ml διαλύµατος 5M NaCl και 0,25 ml διαλύµατος 1M KCl αναµειγνύονται σε dh 2 O (έως όγκου 47 ml), αποστειρώνονται µε υγρή αποστείρωση και στη συνέχεια προστίθενται στο διάλυµα 1,25 ml 1M MgSO 4, 1,25 ml 1M MgCl 2 και 1,25 ml 1M γλυκόζη. Ακολουθεί διήθηση του διαλύµατος σε αποστειρωµένο δοχείο µέσα από φίλτρο µε πόρους µεγέθους 0,22 µm. ιάλυµα αλκαλικής λύσης βακτηριακών κυττάρων για αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µικρής κλίµακας Σύνθεση διαλύµατος: 8% κ.β. sucrose, 50mM EDTA, 50mM Tris-HCl (ph 8.0), 5% κ.ο. Triton X-100 Stock διάλυµα λυσοζύµης Η συγκέντρωση του stock διαλύµατος λυσοζύµης, που ετοιµάζεται σε αποστειρωµένο dh 2 O, είναι 10mg/ml. Η τελική συγκέντρωση λυσοζύµης, που χρησιµοποιείται στο διάλυµα λύσης, είναι 500µg/ml. Το stock φυλάσσεται στους -20 C και η λυσοζύµη προστίθεται στο διάλυµα λύσης πριν τη χρήση του. Stock διάλυµα RNAσης Α Η συγκέντρωση του stock διαλύµατος RNAσης A σε αποστειρωµένο dh 2 O είναι 100mg/ml. Η τελική συγκέντρωση της RNAσης A, που χρησιµοποιείται στο διάλυµα λύσης, είναι 100µg/ml. Το stock φυλάσσεται στους -20 C και η RNAση προστίθεται στο διάλυµα λύσης πριν τη χρήση του. ιάλυµα P1 (επαναιώρησης) για αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µεγάλης κλίµακας (Qiagen Maxi Prep System) Σύνθεση διαλύµατος: 50mM Tris-HCl (ph 8.0) και 10mM EDTA (ph 8.0) ιάλυµα P2 (λύσης) για αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µεγάλης κλίµακας (Qiagen Maxi Prep System) Σύνθεση διαλύµατος: 200mM NaOH, 1% κ.β. SDS (Sodium DodecylSulfate) 67

ιάλυµα P3 (εξουδετέρωσης) για αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µεγάλης κλίµακας (Qiagen Maxi Prep System) Σύνθεση διαλύµατος: 3M CH 3 COOK (ph 5.5) ιάλυµα QBT (εξισορρόπησης στήλης) για αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µεγάλης κλίµακας (Qiagen Maxi Prep System) Σύνθεση διαλύµατος: 750mM NaCl, 50mM MOPS (ph 7.0), 15% κ.ο. ισοπροπανόλη, 0,15% κ.ο. Triton X-100 Προσοχή: ιαλύµατα που περιέχουν MOPS και ισοπροπανόλη δεν αποστειρώνονται. Παρασκευάζονται µε αποστειρωµένο dh 2 O σε στείρες, κατά το δυνατόν, συνθήκες. ιάλυµα QC (πλύσης στήλης) για αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µεγάλης κλίµακας (Qiagen Maxi Prep System) Σύνθεση διαλύµατος: 1M NaCl, 50mM MOPS (ph 7.0), 15% κ.ο. ισοπροπανόλη ιάλυµα QF (έκλουσης) για αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µεγάλης κλίµακας (Qiagen Maxi Prep System) Σύνθεση διαλύµατος: 1,25M NaCl, 50mM Tris-HCl (ph 8.5), 15% κ.ο. ισοπροπανόλη Μέσο επαγωγής IPTG (IsoPropyl-Thio-β-D-Galactopyranoside) Η συγκέντρωση του stock διαλύµατος, που ετοιµάζεται σε αποστειρωµένο dh 2 O, είναι 100mM. Το διάλυµα διηθείται µέσα από φίλτρο πόρων 0,22 µm, µοιράζεται σε αποστειρωµένους σωλήνες µικροφυγοκέντρου (Eppendorf) και φυλάσσεται στους - 20 C. Το IPTG προστίθεται στη βακτηριακή καλλιέργεια σε συγκέντρωση που κυµαίνεται από 100 ως 500µM. Πρωτόκολλα i. Μετασχηµατισµός ικανών βακτηριακών κυττάρων E.coli Ο µετασχηµατισµός βακτηριακών κυττάρων µε το πλασµιδιακό DNA επιλογής στηρίζεται στην ικανότητα του κυτταρικού τοιχώµατος βακτηρίων, τα οποία έχουν υποστεί επεξεργασία µε ιόντα µαγνησίου-ασβεστίου, να γίνεται παροδικά διαπερατό σε µόρια DNA σχετικά µικρού µοριακού βάρους, έπειτα από θερµικό πλήγµα. Για το σκοπό αυτό σε αποστειρωµένους σωλήνες µικροφυγοκέντρου (Eppendorf, 1,5 ml) επωάζονται 200-500 ng του DNA, που επιθυµείται να εισαχθεί στα κύτταρα, µε 50 µl από το stock των ικανών βακτηριακών κυττάρων (των στελεχών DH5α ή HB101 της E.coli) στους 4 C για 20 λεπτά. Στη συνέχεια τα 68

κύτταρα υποβάλλονται σε θερµικό πλήγµα για 45 δευτερόλεπτα στους 42 C και επωάζονται ξανά στους 4 C για 5 λεπτά. Ακολουθεί προσθήκη 250 µl θρεπτικού µέσου SOC και επώαση για 1 ώρα στους 37 C. Στο τέλος της µίας ώρας τα βακτήρια επιστρώνονται µε γυάλινη ράβδο σε προθερµασµένα τριβλία LB-άγαρ/αµπικιλλίνης ή άλλου αντιβιοτικού µέσου επιλογής. (Η ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό ελέγχεται από το πλασµιδιακό DNA, που έχει εισαχθεί στα κύτταρα.) Τα τριβλία επωάζονται στους 37 C για 16 ως και 19 ώρες, σε καµία περίπτωση πάντως περισσότερες από 20, καθώς µετά από αυτό το χρονικό διάστηµα αρχίζουν να εµφανίζονται στην καλλιέργεια ανθεκτικές αποικίες στο αντιβιοτικό, οι οποίες έχουν προκύψει από µεταλλάξεις χωρίς να έχουν προσλάβει το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο. Σε περιπτώσεις χρήσης κυττάρων του βακτηριακού στελέχους E.coli BL21, το οποία εµφανίζει µειωµένη ικανότητα µετασχηµατισµού, ή σε περιπτώσεις µετασχηµατισµού βακτηριακών στελεχών έπειτα από αντιδράσεις επανένωσης φορέα-ενθέµατος, χρησιµοποιείται µεγαλύτερη ποσότητα κυττάρων για το µετασχηµατισµό (200 µl), στην οποία προστίθεται 1 ml θρεπτικού µέσου ανάπτυξης SOC µετά το θερµικό πλήγµα. Έπειτα από επώαση 1 ώρας στους 37 C, τα βακτήρια υποβάλλονται σε στιγµιαία φυγοκέντρηση σε πολύ χαµηλές στροφές (2000 rpm, 30 δευτερόλεπτα) και το ίζηµα που προκύπτει επιστρώνεται σε τριβλία µε τη βοήθεια µικροβιολογικού κρίκου. ii. Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µικρής κλίµακας για έλεγχο αποικιών (microscreening) Η µέθοδος αυτή επιτρέπει τη γρήγορη αποµόνωση δείγµατος πλασµιδιακού DNA από µετασχηµατισµένες αποικίες για τον έλεγχο αυτών. Στηρίζεται στην αλκαλική λύση των βακτηρίων, σε συνδυασµό µε την επίδραση λυσοζύµης, και κατακρήµνιση του πλασµιδιακού DNA µε ισοπροπανόλη (προαιρετικά ακολουθεί και δεύτερη κατακρήµνιση µε αιθανόλη). Έπειτα από ενοφθάλµιση 3-5 ml θρεπτικού µέσου LB (που φέρει το κατάλληλο αντιβιοτικό µέσο επιλογής) µε αποµονωµένη αποικία από το προς έλεγχο τριβλίο, η καλλιέργεια αφήνεται να πολλαπλασιαστεί στους 37 C µε ανάδευση (200 rpm) κατά τη διάρκεια της νύχτας (όχι περισσότερες από 20 ώρες, βλ. i. Μετασχηµατισµός ικανών βακτηριακών κυττάρων E.coli). Το επόµενο πρωί µέρος της υγρής καλλιέργειας µεταφέρεται σε αποστειρωµένους σωλήνες µικροφυγοκέντρου (Eppendorf, 1,5 ml) και ακολουθεί στιγµιαία φυγοκέντρηση του δείγµατος (13000 69

rpm, 30 δευτερόλεπτα). Αφού αποµακρυνθεί το υπερκείµενο, φυγοκεντρείται στον ίδιο σωλήνα η υπόλοιπη καλλιέργεια ώστε να συλλεχθεί το συνολικό ίζηµα. Στη συνέχεια το ίζηµα επαναιωρείται σε 600 µl αλκαλικού διαλύµατος λύσης, που περιέχει 30 µl φρέσκου διαλύµατος λυσοζύµης (συγκέντρωση 10mg/ml, βλ. ιαλύµατα). Το µείγµα αφήνεται σε θερµοκρασία δωµατίου για 10 λεπτά ώστε να λυθούν τα κύτταρα, προτού υποβληθεί σε βρασµό για 1-2 λεπτά. Στη συνέχεια ψύχεται σε θερµοκρασία δωµατίου και φυγοκεντρείται στα 13000 rpm για 10-15 λεπτά. Το χαλαρό ίζηµα που προκύπτει αποµακρύνεται µε τη βοήθεια άγκιστρου, ενώ στο υπερκείµενο προστίθεται ίσος όγκος (600 µl) παγωµένης ισοπροπανόλης. Το ίζηµα, που αποµακρύνεται, περιέχει το βακτηριακό DNA και τα κατάλοιπα της λύσης, ενώ στο υπερκείµενο περιέχονται το πλασµιδιακό DNA και οι πρωτεΐνες των βακτηρίων. Η κατακρήµνιση των νουκλεϊκών οξέων επιτυγχάνεται αφήνοντας το υπερκείµενο, κατόπιν ανάµειξης µε την ισοπροπανόλη, στους -20 C για 30 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 13000 rpm για 15 λεπτά και δεύτερη κατακρήµνιση, µε προσθήκη στο ίζηµα 100 µl αποστειρωµένου νερού, 10 µl (10% κ.ο.) 3Μ οξικού νατρίου (CH 3 COONa) (ph 7.0) και 250 µl (2,5x100µl) παγωµένης αιθανόλης. Το δείγµα αφήνεται στους -20 C κατά τη διάρκεια της νύχτας και το επόµενο πρωί φυγοκεντρείται στα 13000 rpm για 15 λεπτά ώστε να ληφθεί εκ νέου το ίζηµα των νουκλεϊκών οξέων. Μετά από σύντοµη πλύση µε παγωµένη αιθανόλη 70% (13000 rpm, 5 λεπτά) και αφαίρεση του υπερκειµένου, τα δείγµατα αφήνονται να στεγνώσουν (στον αέρα) από τα κατάλοιπα της αιθανόλης. Τέλος, τα νουκλεϊκά οξέα επαναιωρούνται σε 50 µl αποστειρωµένου dh 2 O. Σε περίπτωση που επιθυµείται ο έλεγχος των δειγµάτων, που αποµονώθηκαν, σε πηκτή αγαρόζης, χρησιµοποιούνται 10 µl δείγµατος και 10 µl διαλύµατος φόρτωσης µε χρωστική, όπου περιέχεται RNAση Α σε συγκέντρωση 10µg/µl ώστε να διασπαστεί το RNA, που περιέχει το δείγµα. Το ένζυµο διασπά το RNA έπειτα από επώαση του δείγµατος στους 37 C για 5 λεπτά. Εξ άλλου, αν το δείγµα προέρχεται από µετασχηµατισµένες αποικίες έπειτα από κλωνοποίηση µίας επιθυµητής αλληλουχίας, είναι σκόπιµο να ελεγχθεί κατά πόσο τα κύτταρα έχουν λάβει ανασυνδυασµένο πλασµίδιο, που περιέχει το σωστό ένθεµα, επιδρώντας στο αποµονωµένο DNA µε κατάλληλες ενδονουκλεάσες περιορισµού και ελέγχοντας ηλεκτροφορητικά το προϊόν των πέψεων σε πηκτή αγαρόζης. (Για το σχεδιασµό αντιδράσεων πέψης DNA µε ενδονουκλεάσες περιορισµού βλ. πιο πάνω, ενότητα: I. Εισαγωγή σηµειακών µεταλλάξεων στο cdna 70

του µεταγραφικού παράγοντα HNF-4α. Κλωνοποίηση χιµαιρικών µορίων HNF-4α και Bio-PGC-1, iv. Πέψη του ενθέµατος και του φορέα κλωνοποίησης µε ενδονουκλεάσες περιορισµού.) iii. Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µεγάλης κλίµακας (Qiagen Maxi Prep System) Η αποµόνωση DNA µε αυτό το σύστηµα στηρίζεται στη χρήση ιοντοανταλλακτικής ρητίνης, η οποία δεσµεύει επιλεκτικά τα νουκλεϊκά οξέα, και στοχεύει στην παραγωγή µεγάλων ποσοτήτων πλασµιδιακού DNA υψηλής καθαρότητας για επιµολύνσεις ευκαρυωτικών κυττάρων (transfections). Μετά από ενοφθάλµιση 500-1000 ml θρεπτικού µέσου LB (που φέρει το κατάλληλο αντιβιοτικό µέσο επιλογής) µε αποµονωµένη αποικία από το επιθυµητό τριβλίο, η καλλιέργεια αφήνεται να πολλαπλασιαστεί στους 37 C µε ανάδευση (200 rpm) κατά τη διάρκεια της νύχτας (όχι περισσότερες από 20 ώρες). Το επόµενο πρωί το βακτηριακό ίζηµα συλλέγεται µε φυγοκέντρηση στα 5000 rpm για 20 λεπτά στους 4 C. Το ίζηµα επαναιωρείται σε 10 ml διαλύµατος επαναιώρησης (P1, βλ. ιαλύµατα) όπου προστίθεται RNAση Α σε συγκέντρωση 100µg/ml. Ακολουθεί προσθήκη 10 ml διαλύµατος λύσης (P2, βλ. ιαλύµατα) και επώαση για όχι περισσότερο από 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου ώστε να λυθούν τα κύτταρα. (Μεγαλύτεροι χρόνοι επώασης έχουν ως αποτέλεσµα τη θραύση του βακτηριακού γενωµικού DNA σε τµήµατα µικρότερου µοριακού βάρους, τα οποία αργότερα «επιµολύνουν» το παρασκεύασµα του πλασµιδιακού DNA.) Στη συνέχεια προστίθενται 10 ml διαλύµατος εξουδετέρωσης (P3) και ακολουθεί επώαση στον πάγο για 20 λεπτά ώστε να κατακρηµνιστούν το SDS και τα άλατα, συµπαρασύροντας σε συσσωµατώµατα τις πρωτεΐνες, το µεγαλοµοριακό γενωµικό DNA και τα κυτταρικά υπολείµµατα. Η αποµάκρυνση των συσσωµατωµάτων γίνεται µε φυγοκέντρηση στα 12000 rpm για 30 λεπτά στους 4 C. Το υπερκείµενο της φυγοκέντρησης, το οποίο περιέχει το πλασµιδιακό DNA, µεταφέρεται σε στήλη ρητίνης, που έχει προηγουµένως εξισορροπηθεί µε 10 ml διαλύµατος εξισορρόπησης (QBT). Μετά την εκροή του υπερκειµένου η στήλη πλένεται µε διάλυµα πλύσης (QC) ενδιάµεσης ιονικής ισχύος, για την αποµάκρυνση καταλοίπων, όπως RNA και ορισµένων πρωτεϊνών, και το δεσµευµένο πλασµιδιακό DNA εκλούεται τελευταίο µε την προσθήκη 15 ml διαλύµατος έκλουσης (QF) µέγιστης ιονικής ισχύος. Στο έκλουσµα της στήλης προστίθεται 70% κ.ο. ισοπροπανόλη (10,5 ml) και ακολουθεί 71

κατακρήµνιση του DNA µε φυγοκέντρηση στα 12000 rpm για 30 λεπτά στους 4 C. Για µέγιστο καθαρισµό του πλασµιδιακού DNA, αφού το ίζηµα επαναιωρηθεί σε 800 µl αποστειρωµένου dh 2 O, ακολουθεί δεύτερη κατακρήµνιση µε προσθήκη CH 3 COONa και αιθανόλης (βλ. ii. Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µικρής κλίµακας για έλεγχο αποικιών). Στο τέλος της κατακρήµνισης τα δείγµατα επαναιωρούνται σε 400-500 µl αποστειρωµένου dh 2 O. iv. Φασµατοφωτοµετρικός προσδιορισµός της συγκέντρωσης DNA Η συγκέντρωση του DNA προσδιορίζεται φασµατοφωτοµετρικά µε βάση την οπτική πυκνότητα υδατικού εναιωρήµατος του DNA, που µετρείται στα 260 nm σε UV/Vis φασµατοφωτόµετρο (φασµατοφωτόµετρο υπεριώδους-οπτικής ακτινοβολίας, Pharmacia LKB Ultrospec III). Για το σκοπό αυτό δείγµα από το επιθυµητό DNA αραιώνεται σε dh 2 O και µεταφέρεται σε κυψελίδα χαλαζία του 1 ml (Fisher Brand), όπου και µετρείται η απορρόφηση του DNA στα 260 nm ως προς την απορρόφηση του dh 2 O, η οποία έχει οριστεί στο µηδέν (τυφλό). Η συγκέντρωση του DNA στο δείγµα υπολογίζεται µε βάση τους τύπους: µg/ml = 50 x O.D. 260 x παράγοντα αραίωσης (π.χ. 100), για δίκλωνο DNA µg/ml = 30 x O.D. 260 x παράγοντα αραίωσης, για µονόκλωνο DNA (π.χ. ολιγονουκλεοτίδια) v. Επαγωγή της έκφρασης επιθυµητών (GST χιµαιρικών) πρωτεϊνών σε βακτηριακή καλλιέργεια: το οπερόνιο lacz Έπειτα από ενοφθάλµιση 3-5 ml θρεπτικού µέσου LB (που φέρει το κατάλληλο αντιβιοτικό µέσο επιλογής) µε αποικία µετασχηµατισµένων κυττάρων E.coli BL21, τα οποία φέρουν το DNA για την GST χιµαιρική πρωτεΐνη επιλογής, η καλλιέργεια αφήνεται να πολλαπλασιαστεί στους 37 C µε ανάδευση (200 rpm) κατά τη διάρκεια της νύχτας (όχι περισσότερες από 20 ώρες). Το επόµενο πρωί η καλλιέργεια µεταφέρεται σε 500 ml θρεπτικού µέσου LB, που περιέχει το ίδιο αντιβιοτικό µέσο, και τα βακτήρια αφήνονται να πολλαπλασιαστούν στους 37 C µε ανάδευση (200 rpm) ώσπου η καλλιέργεια φτάσει σε οπτική πυκνότητα O.D. 595 =0.7-0.8. Στο σηµείο αυτό γίνεται επαγωγή της έκφρασης της επιθυµητής πρωτεΐνης, το γονίδιο της οποίας βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του οπερονίου της λακτόζης (LacZ) στο φορέα έκφρασης pgex-4t-2 (Amersham Pharmacia Biotech.). Η επαγωγή γίνεται µε προσθήκη 500µΜ IPTG (βλ. ιαλύµατα) και η καλλιέργεια 72

αφήνεται να πολλαπλασιαστεί για 3 ώρες ακόµη στους 37 C µε ανάδευση (200 rpm). To IPTG αποµακρύνει τον καταστολέα (laci) από το χειριστή του οπερονίου, επιτρέποντας την έναρξη της µεταγραφής του χιµαιρικού GST γονιδίου (Ausubel et al., 1994). Στο τέλος των τριών ωρών τα βακτήρια φυγοκεντρούνται στα 5000 rpm για 20 λεπτά στους 4 C και το ίζηµα επαναιωρείται σε κατάλληλο διάλυµα, για να υποβληθεί στη συνέχεια σε λύση µε υπερήχους (βλ. VII. In vitro και in vivo µελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνικών συµπλόκων σε πηκτές πολυακρυλαµίδης και εντοπισµός πρωτεϊνών µε τη µέθοδο της ανοσοανίχνευσης, i. έσµευση των GST χιµαιρικών πρωτεϊνών, που έχουν εκφραστεί σε βακτήρια, σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης). IV. Καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυτταρικών σειρών και πειράµατα επιµόλυνσης κυττάρων για τη µελέτη της δραστικότητας του µεταγραφικού παράγοντα HNF-4α και των µεταλλάξεών του ιαλύµατα και µέσα καλλιέργειας Πλήρες θρεπτικό µέσο ανάπτυξης κυττάρων DMEM Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM) (Gibco, Invitrogen Corp. CAT no.31885-023) µε προσθήκη 10% κ.ο. FBS (Fetal Bovine Serum, HyClone CAT no.ch30160.03) Trypsin-EDTA ιάλυµα τρυψίνης 100x µε ιόντα EDTA (Gibco, Invitrogen Corp. CAT no.25300-062) 2xHBS (Hepes Buffered Saline) Σύνθεση διαλύµατος: 42mM Hepes (ph 7.10), 270mM NaCl, 10mM KCl, 1,5mM Na 2 HPO 4, 12mM dextrose (σε αποστειρωµένο ddh 2 O) Προσοχή: Το ph του διαλύµατος πρέπει να βρίσκεται µεταξύ 7.0 και 7.2 ΑΥΣΤΗΡΑ. Για τη ρύθµιση του ph χρησιµοποιείται αποστειρωµένο διάλυµα NaOH και το διάλυµα µετά την phµέτρησή του διηθείται από φίλτρο πόρων 0,22 µm. ιάλυµα 2M CaCl 2 για την επιµόλυνση κυττάρων Για 50 ml διαλύµατος, 14,7 gr CaCl 2 (Molecular Biology grade) διαλύονται σε 50 ml αποστειρωµένου ddh 2 O στους 4 C. Το διάλυµα µοιράζεται ΠΟΛΥ ΓΡΗΓΟΡΑ σε αποστειρωµένους σωλήνες µικροφυγοκέντρου, που ψύχονται στον πάγο, και µεταφέρεται αµέσως στους -70 C, όπου φυλάσσεται ως τη χρήση του. 73

Φυσιολογικός ορός (Phosphate Buffered Saline, PBS), 1x Σύνθεση διαλύµατος: 136mM NaCl, 8mM Na 2 HPO 4, 2mM KCl, 1mM KH 2 PO 4 ιάλυµα TEN συλλογής κυττάρων Σύνθεση διαλύµατος: 40mM Tris-HCl (ph 7.5), 1mM EDTA (ph 8.0), 150mM NaCl Υποτονικό διάλυµα λύσης κυττάρων για παρασκευή πυρηνικών εκχυλισµάτων (A) Σύνθεση διαλύµατος: 20mΜ Hepes (ph 7.9), 10mM KCl, 1,5mM MgCl 2, 0,5mM DTT Το DTT προστίθεται πριν τη χρήση του διαλύµατος. Στο διάλυµα προστίθενται, επίσης πριν τη χρήση, και οι αναστολείς της πρωτεόλυσης Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) (100-300µΜ), leupeptin (1µg/µl), aprotinin (1µg/µl), benzamidine (100µΜ). ιάλυµα επαναιώρησης πυρήνων (Β) Σύνθεση διαλύµατος: 20mΜ Hepes (ph 7.9), 1,5mM MgCl 2, 0,5mM DTT, 20% κ.ο. γλυκερόλη Το DTT προστίθεται πριν τη χρήση του διαλύµατος. Στο διάλυµα προστίθενται, επίσης πριν τη χρήση, οι αναστολείς της πρωτεόλυσης PMSF (100-300µΜ), leupeptin (1µg/µl), aprotinin (1µg/µl), benzamidine (100µΜ). ιάλυµα επαναιώρησης πυρήνων αυξηµένης ιονικής ισχύος (Β+KCl) Σύνθεση διαλύµατος: Ίδια µε αυτήν του διαλύµατος Β, + 300mM KCl Στο διάλυµα προστίθενται πριν τη χρήση οι αναστολείς της πρωτεόλυσης PMSF (100-300µΜ), leupeptin (1µg/µl), aprotinin (1µg/µl), benzamidine (100µΜ). Κυτταρικές σειρές COS-7: κυτταρική σειρά από νεφρικό επιθήλιο πράσινου πιθήκου HepG2: κυτταρική σειρά από καρκίνωµα ανθρώπινου ήπατος HEK 293-T: κυτταρική σειρά από εµβρυϊκό καρκίνωµα ανθρώπινου νεφρού Πρωτόκολλα i. Συντήρηση κυτταρικών σειρών Οι κυτταρικές σειρές συντηρούνται ως µονά στρώµατα κυττάρων σε 20-25 ml πλήρους θρεπτικού µέσου ανάπτυξης DMEM (περιέχει 10% FBS) στους 37 C και σε ατµόσφαιρα 5% CO 2, κορεσµένη σε υδρατµούς. Η αραίωση των κυττάρων, όταν η επιφάνεια του δοχείου καλλιέργειας καλυφθεί πλήρως από το κυτταρικό στρώµα 74

(100% confluent), γίνεται ως εξής: Έπειτα από πλύση των κυττάρων µε αποστειρωµένο φυσιολογικό ορό (1xPBS), ακολουθεί επώαση µε 3 ml διαλύµατος trypsin-edta (βλ. ιαλύµατα) για 2-3 λεπτά στους 37 C. Η τρυψίνη ανενεργοποιείται µε προσθήκη 7 ml πλήρους DMEM και ορισµένη ποσότητα κυττάρων µεταφέρεται σε νέο δοχείο καλλιέργειας. Η επιθυµητή αραίωση κυττάρων κυµαίνεται από 1:4 ως 1:20, ανάλογα µε το χρόνο πολλαπλασιασµού κάθε κυτταρικής σειράς. Για πειράµατα παροδικής επιµόλυνσης (transient transfection assays) µία µέρα πριν την επιµόλυνση ετοιµάζονται τριβλία, όπου µεταφέρεται αριθµός κυττάρων 0,2-0,3x10 6, για τριβλία διαµέτρου 30 mm, και 0,5-0,6x10 6, για τριβλία διαµέτρου 60 mm. DNA ii. Παροδική επιµόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων µε µείγµα Ca 3 (PO 4 ) 2 - Όταν έχει καλυφθεί το 50-60% της επιφάνειας των τριβλίων µε κύτταρα, γίνεται η επιµόλυνση των κυττάρων µε τη µέθοδο συγκατακρήµνισης Ca 3 (PO 4 ) 2 (φωσφορικού ασβεστίου) DNA. Στη µέθοδο αυτή το µείγµα του πλασµιδιακού DNA, που επιθυµείται να εισαχθεί στα κύτταρα, αναµειγνύεται µε 10% κ.ο. 2M CaCl 2 και προστίθεται σταγόνα-σταγόνα, µε συνεχή ανάδευση, σε ίσο όγκο διαλύµατος 2xHBS σε θερµοκρασία 4 C (τελική συγκέντρωση HBS και CaCl 2 : 1x και 100mM αντίστοιχα). Το µείγµα αφήνεται για 5-10 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (ώστε να σχηµατιστούν τα σύµπλοκα Ca 3 (PO 4 ) 2 DNA) και προστίθεται στα κύτταρα, επίσης σταγόνα-σταγόνα, από το κέντρο προς την περιφέρεια του τριβλίου. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων από 7-15 ώρες στους 37 C σε ατµόσφαιρα 5% CO 2, κορεσµένη σε υδρατµούς, και αλλαγή θρεπτικού µέσου έπειτα από το ενδεδειγµένο χρονικό διάστηµα, προτού το µείγµα καταστεί τοξικό για τα κύτταρα. Τα κύτταρα αφήνονται να πολλαπλασιαστούν για 24-36 ώρες, προτού συλλεχθούν για περαιτέρω επεξεργασία των κυτταρικών εκχυλισµάτων. Ο όγκος του µείγµατος Ca 3 (PO 4 ) 2 DNA, που χρησιµοποιήθηκε στα πειράµατα της παρούσας εργασίας, ήταν 189 µl (+ ίσος όγκος 2xHBS: τελικός όγκος ιζήµατος 378 µl), για τριβλία διαµέτρου 30 mm, και ο διπλάσιος (378 µl Ca 3 (PO 4 ) 2 DNA + ίσος όγκος 2xHBS: τελικός όγκος 756 µl), για τριβλία διαµέτρου 60 mm. Στα πειράµατα επιµόλυνσης κυττάρων των κυτταρικών σειρών COS-7, HepG2 µε τις σηµειακές µεταλλάξεις pcmxgal-lbd (στις έλικες 5, 10, 11) του 75

HNF-4α, καθώς και επιµόλυνσης κυττάρων COS-7 µε τις σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-lbd του HNF-4α, χρησιµοποιήθηκαν 3 µg των αντίστοιχων γονιδίων αναφοράς (reporter constructs), 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, που περιέχει το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης υπό τον έλεγχο του ιϊκού υποκινητή CMV (CytoMegaloVirus), και 2 µg του φορέα έκφρασης της επιθυµητής σηµειακής µετάλλαξης ή του αντίστοιχου πλασµιδίου άγριου τύπου (σύνολο: 6 µg DNA). Το πλασµίδιο CMV β-gal συµπεριλαµβάνεται στα πειράµατα αυτού του τύπου για την εξοµάλυνση τυχόν διαφορών στην επιµόλυνση µεταξύ διαφορετικών τριβλίων (transfection efficiency normalization control). Εξ άλλου, στα πειράµατα συνεπιµόλυνσης κυττάρων της κυτταρικής σειράς HepG2 µε τις σηµειακές µεταλλάξεις pcmxgal-lbd του HNF-4α και τους συνενεργοποιητές PGC-1, SRC-3, καθώς και συνεπιµόλυνσης κυττάρων COS-7 µε τις σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-lbd του HNF-4α και το συνενεργοποιητή PGC-1, χρησιµοποιήθηκαν 3 µg των αντίστοιχων γονιδίων αναφοράς, 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, 0,2 µg του φορέα έκφρασης της επιθυµητής σηµειακής µετάλλαξης ή του αντίστοιχου πλασµιδίου άγριου τύπου και 1,25 µg του φορέα έκφρασης του αντίστοιχου συνενεργοποιητή (σύνολο: 5,45 µg DNA). Το πλασµίδιο pcdna3-ha-pgc-1 ήταν ένα ευγενικό δώρο της ρ. Α. Κράλλη, από το Πανεπιστήµιο Basel University στην Basel της Ελβετίας, ενώ τα πλασµίδια pcmx- SRC-3 και pcmx-vp16-src3 ήταν δώρα του Dr. D. Moore από το Πανεπιστήµιο Baylor College of Medicine στο Houston των Ηνωµένων Πολιτειών. Οι ίδιες ακριβώς ποσότητες χρησιµοποιήθηκαν και στα πειράµατα συνεπιµόλυνσης κυττάρων HepG2 µε τις ελλειµµατικές µεταλλάξεις GAL-HNF-4α του αµινοτελικού άκρου του HNF-4α και τους συνενεργοποιητές PGC-1, SRC-3. Όλα τα παραπάνω πειράµατα επιµόλυνσης πραγµατοποιήθηκαν σε τριβλία διαµέτρου 30 mm σε 3 τουλάχιστον ανεξάρτητες επαναλήψεις. Αντίθετα, τα πειράµατα επιµόλυνσης κυττάρων της κυτταρικής σειράς HEK 293-T µε τους φορείς έκφρασης των επιθυµητών σηµειακών µεταλλάξεων και των πλασµιδίων άγριου τύπου, για την παρασκευή των αντίστοιχων πυρηνικών εκχυλισµάτων, πραγµατοποιήθηκαν σε τριβλία διαµέτρου 60 mm, µε 18 µg DNA από τον κάθε φορέα έκφρασης. Τέλος, τριβλία διαµέτρου 60 mm µε συνολική ποσότητα 15 µg DNA χρησιµοποιήθηκαν και στα πειράµατα in vivo βιοτινυλίωσης του PGC-1 για τη µελέτη των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων µε τις σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-76

LBD του HNF-4α. Ειδικότερα, στα πειράµατα αυτά χρησιµοποιήθηκαν 5 µg καθενός από τους φορείς έκφρασης pcdna-bio-pgc-1, pcdna3.1-lbd HNF-4α και BirA. Το τελευταίο πλασµίδιο κωδικοποιεί την έκφραση, στα ευκαρυωτικά κύτταρα, της οµώνυµης λιγάσης βιοτίνης του βακτηρίου E.coli, που ευθύνεται για την in vivo βιοτινυλίωση ειδικά «σηµασµένων» µορίων-στόχων (µορίων που φέρουν το κατάλληλο επιτόπιο βιοτινυλίωσης, που αναγνωρίζεται από τη λιγάση, π.χ. Bio-PGC- 1). (Για περισσότερες λεπτοµέρειες σχετικά µε τα πειράµατα αυτά βλ. VII. In vitro και in vivo µελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνικών συµπλόκων σε πηκτές πολυακρυλαµίδης και εντοπισµός πρωτεϊνών µε τη µέθοδο της ανοσοανίχνευσης, v. In vivo µελέτη της αλληλεπίδρασης βιοτινυλιωµένων πρωτεϊνών µε πρωτεΐνες-στόχους τους στα κύτταρα.) iii. Συλλογή κυττάρων και παρασκευή κυτταρικών εκχυλισµάτων Σε περίπτωση χρήσης των κυτταρικών εκχυλισµάτων σε ενζυµικές αντιδράσεις για τον προσδιορισµό του βαθµού έκφρασης των ενζύµων, που κωδικοποιούνται από τα αντίστοιχα γονίδια αναφοράς, παρασκευάζονται κυτταρικά εκχυλίσµατα µε τη µέθοδο «freeze-thaw» (θραύση κυττάρων µε διαδοχική ψύξηαπόψυξη). Ειδικότερα, τα κύτταρα, έπειτα από αφαίρεση του θρεπτικού µέσου, πλένονται 2 φορές µε διάλυµα φυσιολογικού ορού 1xPBS και στη συνέχεια συλλέγονται σε 1 ml διαλύµατος TEN (βλ. ιαλύµατα). Το εναιώρηµα φυγοκεντρείται σε χαµηλές στροφές (5000 rpm) για 2 λεπτά περίπου ώστε να καθιζάνουν τα κύτταρα. Αφού αφαιρεθεί το υπερκείµενο, τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 100 µl διαλύµατος 0,25Μ Tris-HCl (ph 7.8) στους 4 C και υποβάλλονται σε τρεις διαδοχικούς κύκλους ψύξης-απόψυξης (ο κάθε κύκλος αποτελείται από 5 λεπτά στους -70 C, ακολουθούµενα από 5 λεπτά στους 37 C). Το αποτέλεσµα είναι η θραύση των κυττάρων και η απελευθέρωση των κυτταρικών πρωτεϊνών και ενζύµων στο διάλυµα. Έπειτα από φυγοκέντρηση στα 13000 rpm για 5 λεπτά, το υπερκείµενο, το οποίο περιέχει τις πρωτεΐνες, συλλέγεται σε καθαρό σωλήνα (Eppendorf) και αποθηκεύεται στους -80 C ως τη χρήση του. iv. Συλλογή κυττάρων και παρασκευή πυρηνικών εκχυλισµάτων Σε περίπτωση που τα εκχυλίσµατα θα χρησιµοποιηθούν για τη µελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων ή αλληλεπιδράσεων DNA και πρωτεϊνών, είναι σκόπιµο να ληφθούν πυρηνικά κλάσµατα από τα κύτταρα, που έχουν υποστεί 77

επιµόλυνση µε τους φορείς έκφρασης των επιθυµητών γονιδίων. Για το σκοπό αυτό, αφού τα κύτταρα ξεπλυθούν µε διάλυµα φυσιολογικού ορού 1xPBS, συλλέγονται σε 1 ml φυσιολογικού ορού και, κατόπιν φυγοκέντρησης σε χαµηλές στροφές για 2 λεπτά και αποµάκρυνσης του υπερκειµένου, επαναιωρούνται µε ελαφριά ανάδευση σε υποτονικό διάλυµα λύσης (βλ. ιαλύµατα), όγκου ίσου µε το διπλάσιο τουλάχιστον όγκο του κυτταρικού ιζήµατος (σε κάθε περίπτωση ο όγκος του υποτονικού διαλύµατος λύσης πρέπει να είναι επαρκής ώστε να επιτρέπει τη διάλυση του κυτταρικού περιεχοµένου µετά την οµογενοποίηση των κυττάρων). Τα κύτταρα επωάζονται στο υποτονικό διάλυµα λύσης για 10 λεπτά στους 4 C και στη συνέχεια οµογενοποιούνται µε µηχανική θραύση, µε τη βοήθεια ειδικού οµογενοποιητή (Dounce homogenizer, pestle B). Το ίζηµα που προκύπτει µετά από φυγοκέντρηση στα 13000 rpm για 5 λεπτά, το οποίο περιέχει τους πυρήνες, επαναιωρείται σε 1 όγκο διαλύµατος επαναιώρησης αυξηµένης ιονικής ισχύος (B+300mM KCl, βλ. ιαλύµατα) και ακολουθεί επώαση µε περιστροφή (rotation) για 30 λεπτά στους 4 C. Τέλος, το υπερκείµενο συλλέγεται, έπειτα από φυγοκέντρηση στα 13000 rpm για 5 λεπτά, και µεταφέρεται σε καθαρό σωλήνα (Eppendorf), όπου φυλάσσεται στους -80 C ως τη χρήση του. Σε κάθε περίπτωση, προτού χρησιµοποιηθεί η επιθυµητή ποσότητα πυρηνικού εκχυλίσµατος, αραιώνεται µε 2 όγκους διαλύµατος επαναιώρησης (B) ώστε η τελική συγκέντρωση του άλατος (KCl) στο δείγµα να µην υπερβαίνει τα 100mM. Προσοχή: Στα διαλύµατα, που χρησιµοποιούνται κατά την προετοιµασία των πυρηνικών εκχυλισµάτων, προστίθενται αναστολείς πρωτεασών στις κατάλληλες συγκεντρώσεις (βλ. ιαλύµατα) πριν τη χρήση τους. V. In vitro µελέτη αλληλεπιδράσεων DNA-πρωτεϊνών: Ανάλυση της Μεταβολής Ηλεκτροφορητικής Κινητικότητας (EMSA) ιαλύµατα ιάλυµα µέσου (medium buffer), 10x Σύνθεση διαλύµατος: 100mM Tris-HCl (ph 7.5), 500mM NaCl, 100mM MgCl 2 ιάλυµα κινάσης, 10x Σύνθεση διαλύµατος: 700mM Tris-HCl (ph 7.6), 100mM MgCl 2, 50mM DTT Η πολυνουκλεοτιδική κινάση του φάγου T 4, που χρησιµοποιήθηκε, είναι της εταιρείας New England Biolabs, CAT. No M0201S. 78

Το διάλυµα της κινάσης παρασκευάζεται σε συγκέντρωση 10x και προστίθεται κάθε φορά στην αντίδραση σε αναλογία 10% κ.ο. (αναγωγή σε 1x). ιάλυµα TE Σύνθεση διαλύµατος: 10mM Tris-HCl (ph 8.0), 1mM EDTA (ph 8.0) ιάλυµα TBE, 10x Σύνθεση διαλύµατος: 890mM Tris base, 890mM Boric acid, 1mM EDTA (ph 8.0) Το διάλυµα αραιώνεται µε dh 2 O 10 φορές (1x) για την ηλεκτροφορητική ανάλυση των συµπλόκων DNA-πρωτεϊνών. Προσοχή: Το µητρικό διάλυµα (10x) διηθείται µε τη βοήθεια αντλίας κενού πριν τη χρήση του. ιάλυµα αντίδρασης, 10x Σύνθεση διαλύµατος: 50mM MgCl 2, 340mM KCl ιάλυµα δ+f Σύνθεση διαλύµατος: 25mM Hepes (ph 7.6), 40mM KCl, 0,1mM EDTA, 8% Ficoll- 400, 1mM DTT Το DTT προστίθεται πριν τη χρήση του διαλύµατος. ιάλυµα ακρυλαµίδης 30 (29:1) % κ.β. Σύνθεση διαλύµατος: 29 gr (2x) acrylamide, 1 gr (4x) bisacrylamide σε 100 ml dh 2 O Το διάλυµα διηθείται από ηθµό διηθητικού χαρτιού πάχους 1 cm. Προσοχή: Το διάλυµα δεν πρέπει να εκτεθεί στο φως, καθώς η ακρυλαµίδη πολυµερίζεται υπό την επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας. Μη-αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαµίδης 5% Σύνθεση διαλύµατος: 0,5xTBE (44,5mM Tris base, 44,5mM boric acid, 0,05mM EDTA, ph 8.0), 5% κ.β. acrylamide/bis (29:1), 0,005% κ.β. Ammonium PerSulfate (APS), 0,001% κ.ο. N, N, N, N- TEtra Methyl Ethyl Diamine (TEMED) Πρωτόκολλα i. Υβριδισµός της ακολουθίας-στόχου (annealing of the probe) Για τον ειδικό υβριδισµό των µονόκλωνων συµπληρωµατικών ολιγονουκλεοτιδίων και τη δηµιουργία των δίκλωνων ακολουθιών-στόχων αναµειγνύονται ίσα ποσά (10 µg) από κάθε µονόκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο σε αντίδραση όγκου 20 µl, µε 10% κ.ο. διάλυµα µέσου 10x (βλ. ιαλύµατα). Το µείγµα επωάζεται στους 95 C για 2 λεπτά και στη συνέχεια αφήνεται να επανέλθει σταδιακά σε θερµοκρασία δωµατίου, ώστε να υβριδιστούν ειδικά, και όχι µε τυχαίο τρόπο, οι 79

συµπληρωµατικοί κλώνοι του DNA. Το προϊόν υβριδισµού ελέγχεται ηλεκτροφορητικά σε πηκτή αγαρόζης 2,5% και το δίκλωνο, πια, ολιγονουκλεοτίδιο αραιώνεται µε dh 2 O σε συγκέντρωση 100 ng/µl. Προσοχή: Για να γίνει σωστά ο υβριδισµός και η επαναδιάταξη των µονόκλωνων ακολουθιών, πρέπει το µείγµα να ψυχθεί σταδιακά. Για την ανάλυση των ιδιοτήτων πρόσδεσης στο DNA και σχηµατισµού διµερών των µεταλλαγµένων HNF-4α πρωτεϊνών (σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-lbd) χρησιµοποιήθηκε το στοιχείο B του υποκινητή του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης ApoCIII (CIIIB), που αποτελεί φυσική αλληλουχία-στόχο του HNF-4α στα ηπατικά κύτταρα. Η σύνθεση των µονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων, που αντιστοιχούν στους συµπληρωµατικούς κλώνους της ακολουθίας CIIIB, έγινε από το Εργαστήριο Μικροχηµείας του Ινστιτούτου Τεχνολογίας και Έρευνας στο Ηράκλειο Κρήτης. Οι ακολουθίες των συµπληρωµατικών ολιγονουκλεοτιδίων ήταν οι εξής: CIIIBfor, 5 -GGTCAGCAGGTGACCTTTGCCCAGCG-3, CIIIBrev, 5 -CGCTGGGCAAAGGTCACCTGCTGACC-3 ii. Σήµανση της ακολουθίας-στόχου µε [γ- 32 P] (labeling of the probe) Η αντίδραση σήµανσης της ακολουθίας-στόχου µε γ- 32 P στηρίζεται στην ανταλλαγή των φωσφορικών οµάδων των ακραίων 5 νουκλεοτιδίων της δίκλωνης ακολουθίας µε φωσφορικές οµάδες, που προέρχονται από το [γ- 32 P]ATP. Η αντίδραση αυτή καταλύεται από το ένζυµο πολυνουκλεοτιδική κινάση του φάγου T 4. Ένα παράδειγµα αντίδρασης σήµανσης είναι αυτό που ακολουθεί: Αντίδραση σήµανσης DNA 100 ng του δίκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου, που αποτελεί την ακολουθία-στόχο 10xδιάλ.κινάσης 10% κ.ο. της αντίδρασης (2,5 µl) Πολυνουκλεοτιδική κινάση φάγου Τ 4 10 units [γ- 32 P]ATP* 1-2 µl (150-300 µci) Τελικός όγκος αντίδρασης 25 µl (συµπληρώνεται µε αποστειρωµένο dh 2 O) Επώαση για 1 ώρα στους 37 C 80

*Το [γ- 32 P]ATP προστίθεται στην αντίδραση τελευταίο. Στο τέλος της µιας ώρας προστίθενται στην αντίδραση 75 µl αποστειρωµένου dh 2 O (τελικός όγκος 100 µl) και το προϊόν της αντίδρασης εφαρµόζεται σε στήλη χρωµατογραφίας Sephadex G-50 (του 1 ml). Τα σφαιρίδια Sephadex G-50 αποτελούνται από πολυµερή δεξτρανών, οι οποίες είναι πορώδη υλικά, που επιτρέπουν το διαχωρισµό διαφόρων µορίων. Τα µόρια κινούνται κατά µήκος της στήλης µε ταχύτητα που εξαρτάται από το µοριακό τους βάρος. Στη συγκεκριµένη περίπτωση τα σηµασµένα ολιγονουκλεοτίδια, που έχουν µεγαλύτερο µοριακό βάρος από το ATP, κινούνται γρηγορότερα και φτάνουν στην έξοδο της στήλης πρώτα, ενώ τα µονο-νουκλεοτίδια (ATP) φτάνουν τελευταία. Το έκλουσµα, που συλλέγεται σε σωλήνες φυγοκέντρου (Falcon, 15 ml) έπειτα από στιγµιαία φυγοκέντρηση σε χαµηλές στροφές (2500-4000 rpm, 30 δευτερόλεπτα), αποτελεί το πρώτο κλάσµα της στήλης. Στη συνέχεια λαµβάνονται 3-4 ακόµη κλάσµατα µε προσθήκη 100 µl διαλύµατος TE (βλ. ιαλύµατα) στη στήλη και φυγοκέντρηση στα 2500 rpm για 30 δευτερόλεπτα κάθε φορά. Τα κλάσµατα µεταφέρονται από τους σωλήνες φυγοκέντρου, χωρητικότητας 15 ml, σε µικρότερους (Eppendorf, 1,5 ml), όπου και φυλάσσονται στους -20 C ως τη χρήση τους µέσα σε δοχείο Plexiglas, το οποίο προστατεύει από την εκπεµπόµενη ακτινοβολία. Προτού τα κλάσµατα αποθηκευτούν στους -20 C, 1 µl από κάθε κλάσµα υποβάλλεται σε µέτρηση σπινθηρισµού µε τη µέθοδο Cerenkov, σε µετρητή υγρού σπινθηρισµού Wallac 1409. Παράλληλα, 1 µl από κάθε κλάσµα µεταφέρεται σε πλάκες χρωµατογραφίας λεπτής στοιβάδας (TLC, Thin Layer Chromatography) µε επικάλυψη κυτταρίνης (Polygram CELLULOSE 300 PEI/UV 254 ), όπου και αναλύεται µε χρωµατογραφία σε διάλυµα 850mM KH 2 PO 4 (ph 3.5) για 30 λεπτά. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός των ελεύθερων µορίων ATP από τα σηµασµένα ολιγονουκλεοτίδια, καθώς τα λιγότερο πολικά µονο-νουκλεοτίδια (ATP) µεταναστεύουν γρηγορότερα στο συγκεκριµένο διαλύτη σε σχέση µε τα πολικά ολιγονουκλεοτίδια, που καθυστερούν. Ακολουθεί έκθεση της πλάκας σε φιλµ αυτοραδιογραφίας (Kodak X-OMAT AR) για 15 λεπτά και εµφάνιση του φιλµ σε εµφανιστικό υγρό Kodak LX24 (µονιµοποίηση σε µονιµοποιητικό υγρό Kodak AL4). Με τη µέθοδο ξηρού σπινθηρισµού προσδιορίζονται οι κρούσεις ανά λεπτό (cpm) κάθε κλάσµατος ώστε να επιλεγεί το «θερµότερο» κλάσµα, ενώ η 81

χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας επιβεβαιώνει τη µεταφορά των φωσφορικών οµάδων από το [γ- 32 P]ATP στην επιθυµητή αλληλουχία DNA. Το «θερµότερο» κλάσµα αραιώνεται µε dh 2 O σε 60000cpm/µl. iii. Αντιδράσεις σχηµατισµού συµπλόκων DNA-πρωτεϊνών και ηλεκτροφορητική ανάλυση των συµπλόκων σε πηκτή πολυακρυλαµίδης Οι αντιδράσεις αλληλεπίδρασης DNA-πρωτεϊνών περιλαµβάνουν εκτός από τα πυρηνικά εκχυλίσµατα, όπου εκφράζονται οι επιθυµητές πρωτεΐνες, και τη σηµασµένη ακολουθία DNA, το µη ειδικό ανταγωνιστή poly di-dc (πολυνουκλεοτιδική ακολουθία) και το διάλυµα αντίδρασης. Το διάλυµα προσφέρει τα απαραίτητα ιόντα για την αλληλεπίδραση, ενώ ο µη ειδικός ανταγωνιστής µειώνει την πιθανότητα τυχαίας πρόσδεσης των πρωτεϊνών του εκχυλίσµατος στην ακολουθία DNA-στόχο, ώστε να ευνοούνται µόνο οι ειδικές αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών µε τη σηµασµένη αλληλουχία. Μία τυπική αντίδραση αλληλεπίδρασης φαίνεται στη συνέχεια: Αντίδραση αλληλεπίδρασης Poly di-dc 3 µg (συνήθως 3 µl από διάλυµα συγκέντρωσης 3µg/µl) Πυρηνικό εκχύλισµα 1-14 µl για αντίδραση όγκου ως 20 µl 10xδιάλ.αντίδρασης 10% κ.ο. αντίδρασης (2 µl για αντίδραση όγκου 20 µl) Άθροισµα (χωρίς τη 19 µl (συµπληρώνεται µε διάλυµα δ+f, αν χρειαστεί) σηµασµένη ακολουθία) Τα πυρηνικά εκχυλίσµατα επωάζονται µε το διάλυµα αντίδρασης και το µη ειδικό ανταγωνιστή για 15 λεπτά στους 4 C. Ακολουθεί προσθήκη 30000-60000 cpm της ραδιενεργά σηµασµένης ακολουθίας-στόχου (1 µl από την αντίστοιχη αραίωση, 30000-60000cpm/µl τελικός όγκος αντίδρασης 20 µl) και επώαση για 30 λεπτά στους 4 C. Σε περίπτωση που διερευνάται η δυνατότητα σχηµατισµού διµερών µεταξύ διαφορετικών πρωτεϊνών (π.χ. του HNF-4α άγριου τύπου και των σηµειακών µεταλλάξεών του) σε διάλυµα (in solution), δηλαδή πριν την πρόσδεση των πρωτεϊνών στο DNA, τα πυρηνικά εκχυλίσµατα, όπου εκφράζονται οι εν λόγω πρωτεΐνες, αναµειγνύονται και αφήνονται για 15 λεπτά στους 4 C. Με αυτόν τον 82

τρόπο δίνεται η ευκαιρία στις επιµέρους πρωτεΐνες να σχηµατίσουν σύµπλοκα στο διάλυµα, προτού προστεθούν οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του µη ειδικού ανταγωνιστή και του ολιγονουκλεοτιδίου-στόχου. Στη συνέχεια οι αντιδράσεις µε τα σύµπλοκα που έχουν σχηµατιστεί φορτώνονται στους 4 C σε µη-αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαµίδης 5%, η οποία έχει υποβληθεί σε προ-ηλεκτροφόρηση στα 120V για 45 λεπτά. Τα δείγµατα αναλύονται στην πηκτή µε εφαρµογή σταθερής τάσης 10V/cm (120V) για 3 ώρες τουλάχιστον. Είναι πολύ σηµαντικό τόσο η προ-ηλεκτροφόρηση όσο και η ηλεκτροφόρηση της πηκτής να γίνονται στους 4 C. Στο τέλος των τριών ωρών η πηκτή µεταφέρεται σε χαρτί Whatman, στεγνώνει µε την εφαρµογή συνδυασµού υψηλής θερµοκρασίας και κενού και εκτίθεται σε φιλµ αυτοραδιογραφίας (Kodak X- OMAT AR). (Αποθήκευση στους 20 ή -70 C µειώνει τον απαιτούµενο χρόνο έκθεσης επιταχύνοντας την εµφάνιση των αποτυπωµάτων στο φιλµ.) VI. Ανάλυση µεταγραφικής ενεργότητας των µεταλλάξεων του HNF-4α ιαλύµατα: ιάλυµα 4mM Acetyl-CoA για τη δοκιµασία CAT Για την παρασκευή του διαλύµατος, στη συσκευασία των 25mg Acetyl-CoA (Amersham Pharmacia Biotech., CΑΤ. No 27-6200-03) προστίθενται 7,094 ml αποστειρωµένου ddh 2 O, σε όσο το δυνατόν στείρες συνθήκες, στους 4 C. Στη συνέχεια το διάλυµα µοιράζεται σε αποστειρωµένους σωλήνες µικροφυγοκέντρου (Eppendorf) ΠΟΛΥ ΓΡΗΓΟΡΑ και αποθηκεύεται στους -70 C για µακροπρόθεσµη χρήση, ενώ είναι δυνατόν να φυλαχτεί στους -20 C βραχυπρόθεσµα. ιάλυµα ραδιενεργά σηµασµένης χλωραµφαινικόλης µε 14 C 14 C Chloramphenicol 62mCi/mmol, ICN Biomedicals Inc., CΑΤ. No 12060 ιάλυµα 4mg/ml Ο-NitroPhenyl-β-D-Galactopyranoside (ONPG) για τη δοκιµασία β-gal Η συγκέντρωση του stock διαλύµατος, που ετοιµάζεται, είναι 10mg/ml, ενώ η συγκέντρωση του διαλύµατος εργασίας είναι 4mg/ml. Το στερεό ONPG διαλύεται σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών ιόντων (Na 2 HPO 4 - NaH 2 PO 4, ph 7.3) και διηθείται µέσα από φίλτρο µε πόρους µεγέθους 0,22 µm. Κατά τη διάρκεια προετοιµασίας το διάλυµα πρέπει να διατηρείται στους 4 C και να προφυλάσσεται από το φως. Στη συνέχεια µοιράζεται σε αποστειρωµένους σωλήνες 83

µικροφυγοκέντρου (Eppendorf) ΠΟΛΥ ΓΡΗΓΟΡΑ και αποθηκεύεται στους -70 C για µακροπρόθεσµη χρήση, ενώ είναι δυνατόν να φυλαχτεί στους -20 C βραχυπρόθεσµα. Προσοχή: Το ONPG είναι ευαίσθητο στο φως. Για το λόγο αυτό διατηρείται σε σωλήνες που καλύπτονται µε φύλλα αλουµινίου. ιάλυµα ιόντων µαγνησίου Σύνθεση διαλύµατος: 1M KCl, 10mM MgCl 2, 5M β-mercaptoethanol (β- µερκαπτοαιθανόλη), σε αποστειρωµένο ddh 2 O. Το διάλυµα διηθείται µέσα από φίλτρο µε πόρους 0,22 µm. Κατά τη διάρκεια προετοιµασίας πρέπει να διατηρείται στους 4 C. Στη συνέχεια µοιράζεται σε αποστειρωµένους σωλήνες µικροφυγοκέντρου (Eppendorf) ΠΟΛΥ ΓΡΗΓΟΡΑ και αποθηκεύεται στους -70 C για µακροπρόθεσµη χρήση, ενώ είναι δυνατόν να φυλαχτεί στους -20 C βραχυπρόθεσµα. Πρωτόκολλα i. οκιµασία CAT Η δοκιµασία CAT είναι µία ενζυµική αντίδραση, κατά την οποία καταλύεται η µεταφορά ακετυλικών οµάδων από το ακετυλο-συνένζυµο Α στη χλωραµφαινικόλη. Η ακετυλίωση του υποστρώµατος εξαρτάται από το ποσό του ενζύµου, που καταλύει την αντίδραση (Chloramphenicol AcetylTransferase, ακετυλοτρανσφεράση της χλωραµφαινικόλης). Το ένζυµο περιέχεται στο κυτταρικό εκχύλισµα των επιµολυσµένων κυττάρων, καθώς κωδικοποιείται από το γονίδιο αναφοράς, που έχει συµπεριληφθεί στο µείγµα επιµόλυνσης. Το δε γονίδιο αναφοράς βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο υποκινητή, του οποίου η µεταγραφική δραστηριότητα ενεργοποιείται από καθορισµένο µεταγραφικό παράγοντα (στην περίπτωσή µας, από τον HNF-4α). Έτσι τελικά, ανάλογα µε την ικανότητα ενεργοποίησης της µεταγραφής, που διαθέτει ο άγριος τύπος ή οι µεταλλάξεις του µεταγραφικού παράγοντα, παράγεται αντίστοιχη ποσότητα ενζύµου, η οποία ακετυλιώνει µεγαλύτερη ή µικρότερη ποσότητα χλωραµφαινικόλης. Η αναλογία των ακετυλιωµένων προς τη µη ακετυλιωµένη µορφή της χλωραµφαινικόλης αποτελεί µία ένδειξη της ενεργότητας των µεταλλάξεων του µεταγραφικού παράγοντα, δηλαδή της ικανότητάς τους να ενεργοποιούν τη µεταγραφή γονιδίων-στόχων. Οι ενζυµικές αντιδράσεις CAT ετοιµάζονται σε όγκο 150 µl, µε 70 µl 1M Tris-HCl (ph 7.8), 20 µl acetyl-coa 4mM, 0,3 µci ραδιενεργά σηµασµένης 84

χλωραµφαινικόλης 14 C (π.χ. 3 µl από διάλυµα 0,1µCi/µl), ενώ το υπόλοιπο του όγκου συµπληρώνεται µε την επιθυµητή ποσότητα εκχυλίσµατος που προέρχεται από κύτταρα, τα οποία έχουν υποστεί επιµόλυνση µε τους αντίστοιχους φορείς. Αν χρειαστεί, ο όγκος της αντίδρασης συµπληρώνεται µε ανάλογη ποσότητα 0,25M Tris- HCl (ph 7.8). Η αντίδραση επωάζεται στους 37 C για 2-3 ώρες. Στο τέλος των τριών ωρών προστίθενται στην αντίδραση 200 µl ethyl acetate (οξικού αιθυλαιθέρα). Αφού αναµειχθούν µε τον αιθυλαιθέρα, τα δείγµατα φυγοκεντρούνται στιγµιαία σε υψηλές στροφές (13000 rpm, 30 δευτερόλεπτα) ώστε να διαχωριστούν η υδατική από την οργανική φάση. Η οργανική φάση, που περιέχει την ακετυλιωµένη χλωραµφαινικόλη, µεταφέρεται σε καθαρούς σωλήνες µικροφυγοκέντρου (Eppendorf) και λυοφιλείται σε αντλία κενού. Τέλος, τα λυοφιληµένα δείγµατα επαναιωρούνται σε 15 µl ethyl acetate και µεταφέρονται σε πλάκα TLC µε επικάλυψη πυριτίου (Silica Gel IB2 Baker-flex ), όπου υποβάλλονται σε χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας σε µείγµα χλωροφορµίου/µεθανόλης 95:5 για το διαχωρισµό των ακετυλιωµένων από τη µη ακετυλιωµένη µορφή της χλωραµφαινικόλης. Η πλάκα µεταφέρεται σε κασσετίνα αυτοραδιογραφίας (Fisher Brand) µε οθόνη ανάκλασης-ενίσχυσης του σήµατος (Hyperscreen, Amersham Pharmacia Biotech.), όπου εκτίθεται σε φωτογραφικό φιλµ (Kodak X-OMAT AR). Το αποτύπωµα των ραδιενεργών µορφών της χλωραµφαινικόλης υποβάλλεται σε ποσοτική επεξεργασία µε τη βοήθεια ηλεκτρονικού σαρωτή (PhosphorImager). ii. οκιµασία β-gal Η µέθοδος αυτή επιτρέπει την εξοµάλυνση των παρατηρούµενων διαφορών στην επιµόλυνση µεταξύ διαφορετικών τριβλίων του ίδιου πειράµατος. Έτσι, η σύγκριση των τιµών που προκύπτουν από τη δοκιµασία CAT είναι εγκυρότερη, λόγω συνυπολογισµού του ενδεχόµενου σφάλµατος που προκύπτει µε βάση το διαφορετικό παράγοντα επιτυχίας της επιµόλυνσης σε κάθε τριβλίο. Οι ενζυµικές αντιδράσεις β-gal ετοιµάζονται σε όγκο 100 µl, µε 22 µl υποστρώµατος ONPG 4mM, 1 µl διαλύµατος ιόντων µαγνησίου (βλ. ιαλύµατα), 57 µl ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικών ιόντων 100mM (Na 2 HPO 4 - NaH 2 PO 4, ph 7.3), 10 µl 0,25M Tris-HCl (ph 7.8) και 10 µl κυτταρικού εκχυλίσµατος. Το κυτταρικό εκχύλισµα περιέχει το ένζυµο της β-γαλακτοσιδάσης, το οποίο καταλύει τη χρωµογόνο αντίδραση. Το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης έχει εισαχθεί στα κύτταρα µε το µείγµα της επιµόλυνσης. Η αντίδραση επωάζεται στους 37 C για 10-20 λεπτά 85

(η διάρκεια επώασης προσδιορίζεται µε βάση πιλοτική αντίδραση, που περιέχει δείγµα από το µάρτυρα (control) της επιµόλυνσης) και στο τέλος της επώασης προστίθενται σε κάθε αντίδραση 40 µl διαλύµατος 1M Na 2 CO 3, που σταµατούν την αντίδραση. Ακολουθεί µεταφορά 100 µl από κάθε αντίδραση σε τριβλίο 96 οπών και φασµατοφωτοµετρικός προσδιορισµός του προϊόντος στα 410 nm, σε φασµατοφωτόµετρο E.L.I.S.A. (Microplate Autoreader EL311, Bio-Tek instruments), ως προς τυφλό διάλυµα, το οποίο περιέχει όλα τα συστατικά της αντίδρασης εκτός από κυτταρικό εκχύλισµα (το τυφλό επωάζεται κάτω από τις ίδιες συνθήκες µε τα υπόλοιπα δείγµατα). Η παραγωγή του έγχρωµου προϊόντος εξαρτάται από το ποσό του ενζύµου, που καταλύει την αντίδραση, εποµένως χρησιµεύει ως δείκτης της επιτυχίας της επιµόλυνσης. Οι τιµές της δοκιµασίας β-gal χρησιµοποιούνται κατ αυτόν τον τρόπο για την εξοµάλυνση (normalization) της σχετικής CAT δραστικότητας (relative CAT activity) των αντίστοιχων δειγµάτων. VII. In vitro και in vivo µελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνικών συµπλόκων σε πηκτές πολυακρυλαµίδης και εντοπισµός πρωτεϊνών µε τη µέθοδο της ανοσοανίχνευσης ιαλύµατα ιάλυµα λύσης βακτηριακών κυττάρων για την αποµόνωση των επιθυµητών (GST χιµαιρικών) πρωτεϊνών Σύνθεση διαλύµατος: 100mM EDTA, 10mM β-mercaptoethanol, 200 µg/ml λυσοζύµη σε 1xPhosphate Buffered Saline (PBS) Προσοχή: Στο διάλυµα προστίθενται πριν τη χρήση οι αναστολείς της πρωτεόλυσης PMSF (2mM), aprotinin (2 µg/ml ) και benzamidine (200µΜ). ιάλυµα αλληλεπίδρασης των GST πρωτεϊνών µε τις πρωτεΐνες-στόχους Σύνθεση διαλύµατος: 20mM Hepes (ph 7.6 ή 7.7), 75mM KCl, 2,5mM MgCl 2, 0,1mM EDTA, 2mM DTT, 0,05% κ.ο. NP-40, 10% κ.ο. γλυκερόλη Το DTT προστίθεται πριν τη χρήση του διαλύµατος. ιάλυµα πλύσης των σφαιριδίων γλουταθειόνης-αγαρόζης Σύνθεση διαλύµατος: Ίδια µε αυτήν του διαλύµατος αλληλεπίδρασης, χωρίς τη γλυκερόλη 86

ιάλυµα λύσης ευκαρυωτικών κυττάρων για την αποµόνωση βιοτινυλιωµένων πρωτεϊνών Σύνθεση διαλύµατος: 20mM Tris-HCl (ph 7.5), 150mM NaCl, 1% κ.ο. Triton X-100, 10% κ.ο. γλυκερόλη Στο διάλυµα προστίθενται πριν τη χρήση οι αναστολείς της πρωτεόλυσης PMSF (100-300µΜ), leupeptin (1µg/µl), aprotinin (1µg/µl), benzamidine (100µΜ). ιάλυµα πλύσης των σφαιριδίων στρεπταβιδίνης Σύνθεση διαλύµατος: Ίδια µε αυτήν του διαλύµατος λύσης ευκαρυωτικών κυττάρων για την αποµόνωση βιοτινυλιωµένων πρωτεϊνών, χωρίς τη γλυκερόλη Αποδιατακτική πηκτή SDS-πολυακρυλαµίδης -Πηκτή διαχωρισµού 8%: 375mM Tris-HCl (ph 8.8), 8% κ.β. acrylamide/bis (29:1), 0,1% κ.β. SDS, 0,05% κ.β. APS, 0,05% κ.ο. TEMED σε dh 2 O -Πηκτή διαχωρισµού 10%: 375mM Tris-HCl (ph 8.8), 10% κ.β. acrylamide/bis (29:1), 0,1% κ.β. SDS, 0,05% κ.β. APS, 0,05% κ.ο. TEMED σε dh 2 O -Πηκτή επιστοίβαξης 4%: 125mM Tris-HCl (ph 6.8), 4% κ.β. acrylamide/bis (29:1), 0,1% κ.β. SDS, 0,05% κ.β. APS, 0,1% κ.ο. TEMED σε dh 2 O Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης, 5x (ph 8.3) Σύνθεση διαλύµατος: 125mM Tris Base, 960mM glycine, 0,5% κ.β. SDS ιάλυµα φόρτωσης, 2x ή 5x Σύνθεση διαλύµατος 2x: 120mM Tris-HCl (ph 6.8), 4% κ.β. SDS, 100mM β- mercaptoethanol, 0,02% κ.β. bromophenol blue, 20% κ.ο. γλυκερόλη Το πρωτεϊνικό δείγµα αραιώνεται σε αναλογία 1:1 µε το 2xδιάλυµα φόρτωσης. Σύνθεση διαλύµατος 5x: 300mM Tris-HCl (ph 6.8), 10% κ.β. SDS, 250mM β- mercaptoethanol, 0,05% κ.β. bromophenol blue, 50% κ.ο. γλυκερόλη Το πρωτεϊνικό δείγµα αραιώνεται σε αναλογία 4:1 µε το 5xδιάλυµα φόρτωσης. ιάλυµα χρωστικής Coomassie Brilliant Blue R-250 Σύνθεση διαλύµατος: 1 gr χρωστικής Coomassie Brilliant Blue R-250 ανά λίτρο διαλύµατος, σε 45% κ.ο. µεθανόλη, 10% κ.ο. οξικό οξύ ιάλυµα αποχρωµατισµού µεθανόλης/οξικού οξέος Σύνθεση διαλύµατος: 45% κ.ο. µεθανόλη, 10% κ.ο. οξικό οξύ Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς, 5x (ph 8.3) Σύνθεση διαλύµατος: 125mM Tris Base, 960mM glycine (γλυκίνη) Προσοχή: Το ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς 1x, που ετοιµάζεται µε αραίωση 1:4 του πυκνού 5xδιαλύµατος, περιέχει 20% κ.ο. µεθανόλη. 87

ιάλυµα γάλακτος 5% (blocking solution) Σύνθεση διαλύµατος: 5% σκόνη γάλακτος (0% λιπαρά), 0,5% Bovine Serum Albumin (BSA, αλβουµίνη από ορό βοδιού) Fraction V, 0,1% Tween-20, σε PBS (1x) ιάλυµα πλύσης µεµβρανών Σύνθεση διαλύµατος: PBS (1x) + 0,1% Tween-20 ιάλυµα αφαίρεσης των δεσµευµένων αντισωµάτων (stripping solution) Σύνθεση διαλύµατος: 25mM glycine, 1% SDS, 1% Triton X-100 σε dh 2 O To ph του διαλύµατος ρυθµίζεται σε 2.5 µε HCl. Πρωτόκολλα i. έσµευση των GST χιµαιρικών πρωτεϊνών, που έχουν εκφραστεί σε βακτήρια, σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης Το ίζηµα των βακτηρίων, το οποίο προκύπτει έπειτα από επαγωγή της επιθυµητής πρωτεΐνης στη βακτηριακή καλλιέργεια και συλλογή των κυττάρων (βλ. III. Παρασκευή πλασµιδιακού DNA και αποµόνωση επιθυµητών πρωτεϊνών από καλλιέργειες µετασχηµατισµένων βακτηρίων, v. Επαγωγή της έκφρασης επιθυµητών (GST χιµαιρικών) πρωτεϊνών σε βακτηριακή καλλιέργεια: το οπερόνιο lacz), επαναιωρείται σε 10 ml διαλύµατος λύσης των βακτηρίων (βλ. ιαλύµατα) στους 4 C. Στη συνέχεια το εναιώρηµα, στο οποίο προστίθεται 1% κ.ο. Triton X-100, µεταφέρεται σε σωλήνες φυγοκέντρου (polypropylene) και υποβάλλεται σε λύση µε την εφαρµογή υπερήχων για διαδοχικά διαστήµατα των 30 δευτερολέπτων (sonication). Μεταξύ των διαστηµάτων αυτών µεσολαβεί διάστηµα 90 δευτερολέπτων, όπου το δείγµα αφήνεται να κρυώσει. (Η ανάπτυξη πολύ υψηλής θερµοκρασίας από την εφαρµογή των υπερήχων µπορεί να οδηγήσει σε καταστροφή των βακτηριακών πρωτεϊνών). Έπειτα από τρεις γύρους, το εναιώρηµα των λυµένων κυττάρων που έχει προκύψει φυγοκεντρείται στα 8000 rpm για 20 λεπτά στους 4 C και το υπερκείµενο, που περιέχει τις βακτηριακές πρωτεΐνες, µεταφέρεται σε καθαρούς σωλήνες φυγοκέντρου (Falcon, 15 ml), όπου έχει προστεθεί 1 ml εναιωρήµατος σφαιριδίων γλουταθειόνης-αγαρόζης (Sigma G-4510). Το εναιώρηµα έχει προκύψει έπειτα από 2-3 πλύσεις των σφαιριδίων σε ρυθµιστικό διάλυµα 1xPBS και επαναιώρησή τους σε τελικό όγκο PBS ίσο µε τον όγκο των σφαιριδίων (1:1 slurry). Το βακτηριακό υπερκείµενο επωάζεται µε τα σφαιρίδια για 1 ώρα στους 4 C, µε συνεχή ανάδευση, ώστε να δεσµευτούν οι GST χιµαιρικές πρωτεΐνες στη γλουταθειόνη. Στο τέλος της µιας ώρας το µείγµα φυγοκεντρείται σε χαµηλές 88

στροφές (2000 rpm) για 5 λεπτά στους 4 C. Έπειτα από αφαίρεση του υπερκειµένου, τα σφαιρίδια επαναιωρούνται σε 10 ml ρυθµιστικού διαλύµατος PBS και φυγοκεντρούνται και πάλι στα 2000 rpm για 5 λεπτά στους 4 C. Η διαδικασία επαναλαµβάνεται 3 φορές και, αφού αφαιρεθεί το υπερκείµενο της τελευταίας πλύσης, τα σφαιρίδια (στα οποία έχουν δεσµευτεί οι GST χιµαιρικές πρωτεΐνες) επαναιωρούνται σε 1 ml διαλύµατος αλληλεπίδρασης (βλ. ιαλύµατα) και αποθηκεύονται στους 4 C. ii. Ηλεκτροφορητική ανάλυση των δεσµευµένων πρωτεϊνών Ακολουθεί ηλεκτροφορητικός έλεγχος δέσµευσης των GST πρωτεϊνών στα σφαιρίδια, µε προσθήκη, σε ορισµένο όγκο σφαιριδίων, ίσης ποσότητας 2xδιαλύµατος φόρτωσης και βρασµό ώστε να εκλουστούν οι συνδεδεµένες στα σφαιρίδια πρωτεΐνες. Το υπερκείµενο, το οποίο προκύπτει µετά το βρασµό, φορτώνεται σε αποδιατακτική πηκτή SDS-πολυακρυλαµίδης και αναλύεται ηλεκτροφορητικά µε την εφαρµογή σταθερής τάσης 200V, ώστε να διαχωριστούν οι περιεχόµενες πρωτεΐνες. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας για την ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών σε πηκτές χρησιµοποιήθηκε η συσκευή Mini- PROTEAN II Electrophoresis Cell της εταιρείας BIORAD. Το ασυνεχές σύστηµα ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE (SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis), το οποίο εφαρµόστηκε, στηρίζεται στη χρήση δύο ειδών πηκτών (επιστοίβαξης, διαχωρισµού) και τριών διαφορετικών ρυθµιστικών διαλυµάτων (ηλεκτροδίων, επιστοίβαξης, διαχωρισµού). Με αυτό το σύστηµα οι πρωτεΐνες του δείγµατος «συγχρονίζονται» στην πηκτή επιστοίβαξης, ώστε να εισέλθουν όλες µαζί στην πηκτή διαχωρισµού, όπου και επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός τους σε ζώνες, στην προκειµένη περίπτωση αποκλειστικά µε βάση το µοριακό τους βάρος. Ο διαχωρισµός µε βάση το µοριακό βάρος επιτυγχάνεται χάρη στη χρήση µετουσιωτικών συνθηκών, που καταστρέφουν τις ανώτερες διαµορφώσεις των πρωτεϊνών. Στο σύστηµα ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE το ρόλο αποδιατακτικού παράγοντα έχει το απορρυπαντικό SDS, το οποίο, εξ άλλου, αναιρεί τη διαφοροποίηση των πρωτεϊνών µε βάση το φορτίο, φορτίζοντας όλες τις πρωτεΐνες οµοιόµορφα. Στο τέλος της ηλεκτροφόρησης η πηκτή χρωµατίζεται µε διάλυµα χρωστικής Coomassie Brilliant Blue R-250 για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου και ακολουθεί αποχρωµατισµός σε διάλυµα µεθανόλης/οξικού οξέος (βλ. ιαλύµατα). Ο 89

αποχρωµατισµός επιτρέπει τη διάκριση των πρωτεϊνικών ζωνών, όπου έχει δεσµευτεί η χρωστική, καθώς αφαιρεί το φόντο (background). iii. In vitro αντιδράσεις αλληλεπίδρασης των δεσµευµένων GST πρωτεϊνών µε πρωτεΐνες που εκφράζονται σε πυρηνικά εκχυλίσµατα ευκαρυωτικών κυττάρων, ανάλυση των πρωτεϊνικών συµπλόκων που προκύπτουν και ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνες PVDF Οι in vitro αντιδράσεις αλληλεπίδρασης περιλαµβάνουν επώαση των σφαιριδίων, όπου έχουν δεσµευτεί οι GST χιµαιρικές πρωτεΐνες (20-40 µl εναιωρήµατος, ανάλογα µε το βαθµό δέσµευσης των GST πρωτεϊνών), µε αντίστοιχη ποσότητα εκχυλίσµατος ευκαρυωτικών κυττάρων, όπου εκφράζονται οι µεταλλαγµένες πρωτεΐνες (σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-lbd του HNF-4α). Ο τελικός όγκος αντίδρασης είναι 500 µl και συµπληρώνεται συνήθως µε διάλυµα αλληλεπίδρασης (βλ. ιαλύµατα). Οι αντιδράσεις λαµβάνουν χώρα για 1-2 ώρες στους 4 C. Στη συνέχεια τα σφαιρίδια φυγοκεντρούνται στιγµιαία στα 10000 rpm και επαναιωρούνται σε δεκαπλάσιο όγκο διαλύµατος σε σχέση µε τον όγκο τους. Η διαδικασία της πλύσης επαναλαµβάνεται 3-4 φορές και στο τέλος τα σφαιρίδια επαναιωρούνται σε ίσο όγκο 2xδιαλύµατος φόρτωσης, βράζονται, και το υπερκείµενο φορτώνεται σε πηκτή SDS-πολυακρυλαµίδης, όπου και αναλύεται ηλεκτροφορητικά στα 200V, όπως περιγράφτηκε προηγουµένως. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης η πηκτή εξισορροπείται σε ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς (βλ. ιαλύµατα). Τέλος, οι πρωτεΐνες µεταφέρονται από την πηκτή σε µεµβράνη PVDF (Immobilon P, Millipore Corp.) µε την εφαρµογή ηλεκτρικού ρεύµατος σταθερής έντασης (350mA). Το σύστηµα πηκτής-µεµβράνης διατηρείται εµβαπτισµένο στο ρυθµιστικό διάλυµα καθ όλη τη διάρκεια µεταφοράς. Για την υγρή µεταφορά αυτού του τύπου στα πλαίσια της παρούσας εργασίας χρησιµοποιήθηκε η συσκευή Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell της εταιρείας BIORAD. iv. Ανοσοανίχνευση πρωτεϊνών κατά Western Ο λόγος για τον οποίο οι πρωτεΐνες µεταφέρονται από την πηκτή στη µεµβράνη είναι ότι, µε αυτόν τον τρόπο, µπορούν να εντοπιστούν µε µεγαλύτερη ευκολία από τα αντισώµατα, καθώς το πλέγµα των πολυµερισµένων µορίων ακρυλαµίδης στην πηκτή δυσχεραίνει την αλληλεπίδραση των αντιγονικών επιτόπων µε τα αντισώµατα. 90

Η µεµβράνη, η οποία έχει µονιµοποιηθεί µε επώαση σε µεθανόλη για 5 λεπτά µετά το τέλος της ηλεκτροµεταφοράς των πρωτεϊνών, επωάζεται αρχικά, µε συνεχή ανάδευση, σε διάλυµα γάλακτος 5% (βλ. ιαλύµατα) για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, γεγονός το οποίο συντελεί στη δέσµευση των µη ειδικών θέσεων σύνδεσης της µεµβράνης. Ακολουθεί επώαση, µε συνεχή ανάδευση, σε διάλυµα γάλακτος 5%, το οποίο φέρει ορισµένη αραίωση του πρώτου αντισώµατος, για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Το πρώτο αντίσωµα είναι ειδικό για την πρωτεΐνη, που ανιχνεύεται κάθε φορά. Ειδικότερα, στις περιπτώσεις ανίχνευσης των χιµαιρικών µορίων HNF-4α pcmxgal-lbd χρησιµοποιήθηκε το anti-gal-4 αντίσωµα της εταιρείας Santa Cruz (sc577), που αναγνωρίζει την περιοχή πρόσδεσης στο DNA της πρωτεΐνης GAL-4 και προέρχεται από κουνέλι, ενώ στις περιπτώσεις ανίχνευσης του pcdna3.1-hnf-4α ή των σηµειακών µεταλλάξεών του (pcdna3.1-lbd) χρησιµοποιήθηκε το anti-hnf-4α αντίσωµα της οµώνυµης εταιρείας (sc6556), που αναγνωρίζει την καρβοξυτελική περιοχή του HNF-4α και προέρχεται από κατσίκα. Και τα δύο αντισώµατα χρησιµοποιήθηκαν σε αραίωση 1:5000. Ακολουθούν 3 πλύσεις, των 10 λεπτών η καθεµία, σε διάλυµα πλύσης µεµβρανών (βλ. ιαλύµατα), µε ανάδευση, και µετά την τρίτη πλύση προστίθεται στη µεµβράνη διάλυµα γάλακτος 5%, το οποίο περιέχει διαλυµένο το δεύτερο αντίσωµα σε κατάλληλη αραίωση. Η µεµβράνη επωάζεται για 1 ώρα ακόµη σε θερµοκρασία δωµατίου, µε συνεχή ανάδευση. Ως δεύτερο αντίσωµα χρησιµοποιήθηκε, στην περίπτωση που το πρώτο αντίσωµα ήταν anti-gal4 κουνελιού, το anti-rabbit αντίσωµα της εταιρείας Santa Cruz, που προέρχεται από κατσίκα (sc2004), ενώ στην περίπτωση που το πρώτο αντίσωµα ήταν anti-hnf-4α από κατσίκα, το anti-goat αντίσωµα της οµώνυµης εταιρείας, που προέρχεται από κουνέλι (sc2768). Και τα δύο αντισώµατα είναι τεχνητά συζευγµένα µε ένζυµο υπεροξειδάσης (Horse Radish Peroxidase, HRP), που καταλύει τη φωτογόνο αντίδραση οξείδωσης της λουµινόλης παρουσία H 2 O 2. Η αραίωση, στην οποία χρησιµοποιήθηκαν τα αντισώµατα, ήταν 1:10000. Στο τέλος της επώασης µε το δεύτερο αντίσωµα η µεµβράνη πλένεται 3 φορές σε διάλυµα πλύσης και 1 φορά σε απλό φυσιολογικό ορό 1xPBS (10 λεπτά, θερµοκρασία δωµατίου, µε συνεχή ανάδευση) και εκτίθεται στο µείγµα αντιδραστηρίων του συστήµατος ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας (Enhnaced ChemiLluminescence, ECL) της εταιρείας Amersham Pharmacia Biotech. (ECL Plus, CAT. No RPN 1232), σύµφωνα µε τις οδηγίες των κατασκευαστών. Οι πρωτεΐνες γίνονται ορατές έπειτα από έκθεση της µεµβράνης σε φωτογραφικό φιλµ (ECL Hyperfilm, Amersham Pharmacia Biotech.) 91

για 5-10 λεπτά. Η µέθοδος της ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία ανίχνευσης πρωτεϊνών (<1 pg πρωτεΐνης). Στην περίπτωση ανίχνευσης βιοτινυλιωµένων υποστρωµάτων χρησιµοποιείται πολυµερές στρεπταβιδίνης, που χαρακτηρίζεται από υψηλή συγγένεια για βιοτινυλιωµένες πρωτεΐνες (βλ. αµέσως παρακάτω), συζευγµένο µε ένζυµο υπεροξειδάσης (streptavidin/hrp, Sigma 2438). Η µεµβράνη επωάζεται αρχικά σε διάλυµα γάλακτος 5% για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, µε συνεχή ανάδευση, και στη συνέχεια στο ίδιο διάλυµα, που περιέχει streptavidin/hrp σε αραίωση 1:7500. Έπειτα από επώαση µίας ώρας σε θερµοκρασία δωµατίου, µε συνεχή ανάδευση, ακολουθούν πλύσεις. Τέλος, η µεµβράνη εκτίθεται στο σύστηµα ECL. Είναι δυνατόν µεµβράνες, οι οποίες έχουν επωαστεί µε ένα «ζεύγος» αντισωµάτων, να επανυβριδιστούν µε διαφορετικό ζεύγος, έπειτα από αφαίρεση των δεσµευµένων µορίων µε ανάδευση σε διάλυµα κατάλληλης σύστασης για 45 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (stripping solution, βλ. ιαλύµατα). v. In vivo µελέτη της αλληλεπίδρασης βιοτινυλιωµένων πρωτεϊνών µε πρωτεΐνες-στόχους τους στα κύτταρα Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην υψηλή συγγένεια και ειδικότητα πρόσδεσης, που χαρακτηρίζει τα σφαιρίδια στρεπταβιδίνης για βιοτινυλιωµένα υποστρώµατα. Έτσι, µε κλωνοποίηση του γονιδίου της επιθυµητής πρωτεΐνης (π.χ. PGC-1) σε κατάλληλο φορέα ώστε να αποκτήσει το επιτόπιο βιοτινυλίωσης, και επιµόλυνση κυττάρων τόσο µε αυτό το DNA όσο και µε το φορέα, που κωδικοποιεί τη λιγάση βιοτίνης (BirA) του βακτηρίου E.coli, είναι δυνατόν να επιτευχθεί παραγωγή της πρωτεΐνης σε βιοτινυλιωµένη µορφή (πρωτεΐνη-«δόλωµα»). Εάν, παράλληλα, γίνει εισαγωγή του φορέα έκφρασης της πρωτεΐνης-«στόχου» (π.χ. HNF-4α) στα κύτταρα, τα δύο µόρια («δόλωµα» και «στόχος») θα αλληλεπιδράσουν in vivo. Αφού τα κύτταρα λυθούν, µπορούν να χρησιµοποιηθούν σφαιρίδια στρεπταβιδίνης για να κατακρηµνιστεί η βιοτινυλιωµένη πρωτεΐνη. Σε περίπτωση, όµως, που αυτή αλληλεπιδρά µε την πρωτεΐνη-στόχο in vivo, συµπαρασύρει την πρωτεΐνη-στόχο στο ίζηµα και έτσι είναι δυνατή η ανίχνευση και των δύο πρωτεϊνών στο έκλουσµα των σφαιριδίων. Η τεχνική αυτή αποτελεί ένα ισχυρότατο εργαλείο για την ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων in vivo (De Boer et al., 2003). Ο φορέας έκφρασης σε ευκαρυωτικά κύτταρα της βακτηριακής λιγάσης BirA (pev-bira) ήταν 92

ένα ευγενικό δώρο του ρ. Γ. Στρουµπούλη, από το Erasmus Medical Center στο Rotterdam της Ολλανδίας. Για τη µελέτη των in vivo αλληλεπιδράσεων του PGC-1 µε τις σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-lbd του HNF-4α, κύτταρα, τα οποία έχουν επιµολυνθεί µε 15 µg, συνολικά, των φορέων έκφρασης pcdna-bio-pgc-1, pcdna3.1-lbd HNF-4α και BirA (βλ. IV. Καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυτταρικών σειρών και πειράµατα επιµόλυνσης κυττάρων για τη µελέτη της δραστικότητας του µεταγραφικού παράγοντα HNF-4α και των µεταλλάξεών του, iii. Παροδική επιµόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων µε µείγµα Ca 3 (PO 4 ) 2 -DNA), συλλέγονται 36 ώρες µετά την επιµόλυνσή τους. Ειδικότερα, αφού πλυθούν 2 φορές µε διάλυµα φυσιολογικού ορού (1xPBS), τα κύτταρα επωάζονται σε 1 ml διαλύµατος λύσης ευκαρυωτικών κυττάρων (βλ. ιαλύµατα) για 20 λεπτά στους 4 C, µε συνεχή ανάδευση. Ακολουθεί συλλογή των κυττάρων από τα τριβλία, φυγοκέντρηση σε χαµηλές στροφές για 2 λεπτά και µεταφορά του υπερκειµένου, που περιέχει τις κυτταρικές πρωτεΐνες, σε καθαρούς σωλήνες µικροφυγοκέντρου (Eppendorf). Στη συνέχεια µικρή ποσότητα δείγµατος (π.χ. 20 µl) αναλύεται ηλεκτροφορητικά σε αποδιατακτική πηκτή SDSπολυακρυλαµίδης, µεταφέρεται σε µεµβράνη PVDF και επωάζεται τόσο µε anti- HNF-4α αντίσωµα όσο και µε πολυµερές στρεπταβιδίνης (streptavidin/hrp, βλ. πιο πάνω), για τον έλεγχο της έκφρασης των επιθυµητών πρωτεϊνών στο κυτταρικό εκχύλισµα. Αφού ελεγχθούν τα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης, 100-200 µl εκχυλίσµατος επωάζονται µε 50 µl 50% σφαιριδίων στρεπταβιδίνης (Sigma 1638), που έχουν προηγουµένως εξισορροπηθεί σε 1xPBS, σε συνολικό όγκο αντίδρασης 500 µl. (Ο επιθυµητός όγκος αντίδρασης συµπληρώνεται µε διάλυµα λύσης.) Η επώαση διαρκεί για 10-12 ώρες στους 4 C, µε συνεχή περιστροφή. Στο τέλος της επώασης τα σφαιρίδια φυγοκεντρούνται στιγµιαία στα 10000 rpm και, αφού αφαιρεθεί το υπερκείµενο (το οποίο µπορεί να ελεγχθεί για τυχόν παρουσία επιθυµητών πρωτεϊνών, που δεν κατακρατήθηκαν από τη στρεπταβιδίνη), τα σφαιρίδια επαναιωρούνται σε δεκαπλάσιο, τουλάχιστον, όγκο διαλύµατος πλύσης (βλ. ιαλύµατα). Η διαδικασία της πλύσης επαναλαµβάνεται 3 φορές και στο τέλος τα σφαιρίδια επαναιωρούνται σε 25 µl 2xδιαλύµατος φόρτωσης, βράζονται ώστε να εκλουστούν οι δεσµευµένες πρωτεΐνες, και το υπερκείµενο αναλύεται ηλεκτροφορητικά σε αποδιατακτική πηκτή SDS-πολυακρυλαµίδης. Ακολουθεί ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη PVDF και επώαση της µεµβράνης µε το πολυµερές στρεπταβιδίνης-hrp, για τον έλεγχο κατακράτησης του Bio-PGC-1 93

(biotinylated PGC-1) από τη στρεπταβιδίνη. Στη συνέχεια η ίδια µεµβράνη επωάζεται και µε anti-hnf-4α αντίσωµα. Ανίχνευση HNF-4α (άγριου τύπου ή των µεταλλάξεών του) συνεπάγεται την ύπαρξη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του PGC- 1 µε την αντίστοιχη HNF-4α πρωτεΐνη in vivo, στα επιµολυσµένα κύτταρα. 94

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 95

I. Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων, που εισάγονται στις έλικες 5,10,11 της LBD περιοχής του HNF-4α, στην ενεργότητα του µορίου: µελέτη µε GAL-4 χιµαιρικά µόρια i. Μελέτη της µεταγραφικής ενεργοποίησης απουσία συνενεργοποιητών Προκειµένου να διερευνηθεί ο ρόλος αµινοξέων της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη του HNF-4α στην ενεργότητα του µορίου, δηµιουργήθηκαν σηµειακές µεταλλάξεις στις έλικες 5,10,11 της LBD περιοχής και εξετάστηκε η επίδρασή τους στην ενεργότητα του υποδοχέα, όπως αυτή εκτιµάται από την ικανότητα επαγωγής της µεταγραφής του γονιδίου αναφοράς CAT (Chloramphenicol AcetylTransferase) σε πειράµατα παροδικής επιµόλυνσης κυττάρων. Για τη δηµιουργία των σηµειακών µεταλλάξεων στις έλικες 5,10,11 της LBD περιοχής του HNF-4α επιλέχθηκαν αµινοξέα, τα οποία, σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία, επηρεάζουν τη δραστικότητα της LBD περιοχής οµόλογων υποδοχέων όταν µεταλλαχθούν. Η πρόβλεψη της δευτεροταγούς διαµόρφωσης του LBD του HNF-4α, που φαίνεται στο Σχ.9, έγινε κατόπιν ευθυγράµµισης της αλληλουχίας του µε την αλληλουχία του LBD οµόλογων πυρηνικών υποδοχέων, των οποίων η κρυσταλλική δοµή ήταν γνωστή, όπως των υποδοχέων του cis (RXRα) και του all-trans ρετινοϊκού οξέος (RARγ). Ο HNF-4α µάλιστα παρουσιάζει το µεγαλύτερο βαθµό οµολογίας µε τον RXRα, µε ποσοστό σχεδόν 60% για την περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DBD) και πάνω από 35% για την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη. Όπως περιγράφηκε στις Μεθόδους, η εισαγωγή σηµειακών µεταλλάξεων µε τη βοήθεια της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης µέσω εκφυλισµένων ολιγονουκλεοτιδίων συντελεί στη δηµιουργία µορίων DNA, τα οποία είναι δυνατόν να φέρουν περισσότερες από µία µεταλλάξεις. Κατά τον έλεγχο των αποικιών, που αναπτύσσονται έπειτα από µετασχηµατισµό βακτηρίων µε τα µεταλλαγµένα µόρια DNA, εποµένως, είναι δυνατόν να αποµονωθούν κλώνοι, οι οποίοι ενσωµατώνουν απλές µεταλλάξεις ή το συνδυασµό αυτών. Με αυτήν τη διαδικασία προέκυψαν οι µεταλλάξεις που φαίνονται στα Σχ.10,11 και 12,13. Όπως αναφέρθηκε, το σκεπτικό µε το οποίο δηµιουργήθηκαν οι µεταλλάξεις ήταν να σκιαγραφηθούν τα χαρακτηριστικά της κοιλότητας πρόσδεσης ενός υποτιθέµενου ενδογενούς συνδέτη στον HNF-4α, µέσω της διερεύνησης του ρόλου που διαδραµατίζουν συγκεκριµένα αµινοξέα στη µεταγραφική ενεργότητα της LBD περιοχής. Για το σκοπό αυτό, προκειµένου να µελετηθούν οι µεταλλάξεις αυτών των 96

ITDVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELLLDDQVALLRAHAGEHLLLGATKRSMVFKDVLLLGNDYIVPR Η3 Η4 Η5 S1 S2 HCPELAEMSRVSIRILDELVLPFQELQIDDNEYACLKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYI H6 H7 H8 H9 β-turn NDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSITWQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLGGSP H10 H11 H12 Σχ.9. Προβλεπόµενη δευτεροταγής διαµόρφωση της LBD περιοχής του HNF-4α, όπου φαίνεται η θέση των α-ελίκων και της β-στροφής. Με έντονα γράµµατα ξεχωρίζουν τα αµινοξέα στα οποία εισήχθησαν οι σηµειακές µεταλλάξεις στις έλικες 5,10,11. Fig.9. Assignment of the alpha helices and beta turn in the LBD domain of HNF-4α. Boldface letters indicate residues of helices 5,10,11 into which point mutations were introduced. αµινοξέων αποκλειστικά ως προς την επίδρασή τους στην ενεργότητα της LBD περιοχής, ανεξαρτήτως αλλαγών που µπορεί να επέφεραν σε άλλες ιδιότητες του µορίου (π.χ. στην ικανότητα διµερισµού, η οποία επηρεάζει την πρόσδεση στο DNA), οι µεταλλάξεις µελετήθηκαν αρχικά µε τη βοήθεια του µονοϋβριδικού συστήµατος GAL-4 (one-hybrid system). Το σύστηµα αυτό στηρίζεται στην κατασκευή χιµαιρικών µορίων που εκφράζουν την ετερόλογη περιοχή πρόσδεσης στο DNA ενός καλά χαρακτηρισµένου µεταγραφικού παράγοντα της ζύµης, της πρωτεΐνης GAL-4 (Carey et al., 1989). Κατ αυτόν τον τρόπο, η πρόσδεση στο DNA εξασφαλίζεται µέσω του DBD του GAL-4, ενώ η ενεργοποίηση της µεταγραφής εξαρτάται αποκλειστικά από την περιοχή ενεργοποίησης (activation domain) του υπό µελέτη µεταγραφικού παράγοντα. Έτσι, µεταλλάξεις σε αυτήν την περιοχή µελετώνται καθαρά ως προς την επίδρασή τους στο δυναµικό ενεργοποίησης του συγκεκριµένου παράγοντα και όχι όσον αφορά σε άλλες ιδιότητες του µορίου, που ενδεχοµένως επηρεάζουν. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, µεταλλάξεις που εισήχθησαν στο αποµονωµένο τµήµα cdna του HNF-4α που αντιστοιχεί στην LBD περιοχή κλωνοποιήθηκαν στη 97

συνέχεια στο φορέα pcmxgal, ο οποίος φέρει την DBD περιοχή της πρωτεΐνης GAL-4, ώστε να προκύψουν pcmxgal-lbd υβριδικά µόρια. Τα µόρια αυτά χρησιµοποιήθηκαν σε πειράµατα επιµόλυνσης ευκαρυωτικών κυττάρων, όπως φαίνεται στα σχήµατα που ακολουθούν. Ειδικότερα, στο Σχ.10 φαίνεται η επίδραση που είχαν οι µεταλλάξεις της έλικας 5 στη µεταγραφική ενεργοποίηση ενός συνθετικού υποκινητή, ο οποίος αποτελείται από πέντε θέσεις πρόσδεσης του GAL-4. Οι τιµές της δραστικότητας του γονιδίου αναφοράς CAT, το οποίο βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του υποκινητή G 5 CAT, είναι εκφρασµένες ως προς την τιµή δραστικότητας του µάρτυρα (ο οποίος περιέχει άδειο φορέα pcmx-gal) (Σχ.10Α) και, εναλλακτικά, ως προς την τιµή του άγριου τύπου (Σχ.10Β). Τα κύτταρα που χρησιµοποιήθηκαν για την επιµόλυνση ανήκουν στην κυτταρική σειρά COS-7, όπου δεν εκφράζεται ενδογενώς ο HNF-4α. Είναι προφανές ότι όλες οι µεταλλάξεις επηρεάζουν την ενεργότητα της LBD περιοχής. Ειδικότερα, η µετάλλαξη pcmxgal-lbd L220Q µειώνει την ενεργότητα της LBD περιοχής κατά 18,5 φορές σε σχέση µε την ενεργότητα της αντίστοιχης περιοχής του άγριου τύπου. Η µετάλλαξη R226G µειώνει την ενεργότητα ακόµη περισσότερο, καθώς η σχετική τιµή της δραστικότητας CAT, που εµφανίζει, είναι 3,5 φορές χαµηλότερη από την αντίστοιχη της µετάλλαξης L220Q, αγγίζοντας την τιµή του µάρτυρα. Τέλος, η διπλή σηµειακή µετάλλαξη L220Q/R226G επιβεβαιώνει, όπως ήταν αναµενόµενο, την καταλυτική επίδραση των δύο αµινοξέων στη δυνατότητα ενεργοποίησης της µεταγραφής της LBD περιοχής, ρίχνοντας επίσης την ενεργότητα του υβριδικού µορίου στα επίπεδα του µάρτυρα. Εξ άλλου, ανάµεσα στους κλώνους που ελέγχθηκαν έπειτα από µετασχηµατισµό των βακτηρίων DH5α µε τα ανασυνδυασµένα µόρια DNA, αποµονώθηκε και ένας, ο οποίος έφερε τριπλή µετάλλαξη στην έλικα 5, και ειδικότερα στα αµινοξέα L219Q/L220Q/R226G. Η σχετική τιµή της δραστικότητας CAT της τριπλής µετάλλαξης είναι και αυτή, όπως φαίνεται από την εικόνα, παρόµοια µε του µάρτυρα, υπογραµµίζοντας για µια ακόµη φορά το ρόλο των συγκεκριµένων αµινοξέων στην ενεργοποίηση της µεταγραφής από τον HNF-4α, ελλείψει προσθήκης οποιουδήποτε εξωγενούς συνδέτη. Τα πειράµατα αυτά επαναλήφθηκαν και σε κύτταρα της σειράς HepG2, τα οποία εκφράζουν ενδογενώς τον HNF-4α. Η επιλογή αυτής της σειράς, η οποία εκφράζει ενδογενώς τον παράγοντα άγριου τύπου, έγινε ώστε να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσµατα των προηγούµενων πειραµάτων ανεξαρτήτως της κυτταρικής σειράς 98

Σχ.10. Α. Αποτελέσµατα επιµόλυνσης κυττάρων της σειράς COS-7 µε τους φορείς έκφρασης των σηµειακών µεταλλάξεων pcmxgal-lbd L220Q, R226G, L220Q/R226G, L219Q/L220Q/R226G και το γονίδιο αναφοράς G 5 CAT (στο επάνω µέρος της εικόνας). Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς και 2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων. Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα κάθε µετάλλαξης σε σχέση το µάρτυρα, ο οποίος έχει επιµολυνθεί µόνο µε άδειο φορέα (pcmxgal). Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Β. Τα ίδια αποτελέσµατα, εκφρασµένα ως προς τη σχετική δραστικότητα του άγριου τύπου (ΑΤ) (ΑΤ: 100%). Fig.10. A. The reporter plasmid G 5 CAT (3 µg) was transfected into COS-7 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type LBD or indicated point mutants in helix 5, fused in frame to the GAL-4 DBD 1-147 (2 µg each). The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is shown in the form of a bar graph, as the percentage of the reporter activity obtained in a transfection with empty vector DNA. B. Same as in A, except CAT values are expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). 99

Σχ.11. Α. Αποτελέσµατα επιµόλυνσης κυττάρων της σειράς HepG2 µε τους φορείς έκφρασης των σηµειακών µεταλλάξεων pcmxgal-lbd L220Q, R226G, L220Q/R226G, L219Q/L220Q/R226G και το γονίδιο αναφοράς G 5 CAT (στο επάνω µέρος της εικόνας). Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς και 2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων. Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα κάθε µετάλλαξης σε σχέση µε το µάρτυρα, ο οποίος έχει επιµολυνθεί µόνο µε άδειο φορέα (pcmxgal). Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Β. Τα ίδια αποτελέσµατα, εκφρασµένα ως προς τη σχετική δραστικότητα του άγριου τύπου (ΑΤ) (ΑΤ: 100%). Fig.11. A. The reporter plasmid G 5 CAT (3 µg) was transfected into HepG2 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type LBD or indicated point mutants in helix 5, fused in frame to the GAL-4 DBD 1-147 (2 µg each). The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is shown in the form of a bar graph, as the percentage of the reporter activity obtained in a transfection with empty vector DNA. B. Same as in A, except CAT values are expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). 100

στην οποία εκφράζονται τα υβριδικά µόρια. Η έκφραση του HNF-4α άγριου τύπου σε αυτήν την κυτταρική σειρά, βεβαίως, δεν αναµενόταν να επηρεάζει το συγκεκριµένο σύστηµα µελέτης, το οποίο χρησιµοποιεί την αποµονωµένη περιοχή ενεργοποίησης του παράγοντα, και συνεπώς δε στηρίζεται καθόλου στα ενδογενώς εκφραζόµενα µόρια. Στο Σχ.11 φαίνονται τα αποτελέσµατα επανάληψης του τριπλού κύκλου πειραµάτων στα κύτταρα HepG2. Τα αποτελέσµατα είναι παρόµοια µε αυτά της παροδικής επιµόλυνσης κυττάρων της σειράς COS-7, καθώς όλες οι µεταλλάξεις µειώνουν την ενεργότητα της LBD περιοχής κατά 40 ως και 100 φορές περίπου, σε σχέση µε την αντίστοιχη ενεργότητα της LBD περιοχής άγριου τύπου. Όσον αφορά στις µεταλλάξεις που εντοπίζονται στις έλικες 10 και 11, αυτές εξετάστηκαν σε κοινά πειράµατα επιµόλυνσης, τα αποτελέσµατα των οποίων φαίνονται στα Σχ.12 και 13. Ειδικότερα, πειράµατα σε κύτταρα της σειράς COS-7 έδειξαν τη δραµατική επίδραση της µετάλλαξης στη θέση 338 της έλικας 10 (I338F) στην ενεργότητα της LBD περιοχής, καθώς αλλαγή του συγκεκριµένου αµινοξέος σε φαινυλαλανίνη οδηγεί σε µείωση της επαγωγής του γονιδίου CAT κατά 10 φορές, σε σχέση µε την ικανότητα επαγωγής που εµφανίζει ο άγριος τύπος (Σχ.12). Λιγότερο δραµατική είναι, αντίθετα, η επίδραση της µετάλλαξης στη θέση 346 της έλικας 11, καθώς οδηγεί σε µείωση της µεταγραφικής ενεργότητας µόλις στο 1/3 αυτής του άγριου τύπου, αν και ταυτόχρονη έκφραση των δύο µεταλλάξεων οδηγεί σε οριστική απαλοιφή του ποσοστού µεταγραφικής δραστηριότητας που διατηρεί η µετάλλαξη I346F, καθώς η διπλή µετάλλαξη ρίχνει τη σχετική τιµή της δραστικότητας CAT σχεδόν στα επίπεδα του µάρτυρα, ακολουθώντας το πρότυπο της µετάλλαξης I338F. Παρόµοια αποτελέσµατα παρατηρήθηκαν και µε πειράµατα στην κυτταρική σειρά HepG2 (Σχ.13). Η µείωση της µεταγραφικής ενεργότητας της LBD περιοχής επηρεάζεται από τη µετάλλαξη I338F, όπως και από τη διπλή µετάλλαξη I338F/I346F. Συγκεκριµένα, και τα δύο µόρια εµφανίζουν µείωση κατά 32 φορές περίπου σε σχέση µε την ενεργότητα της περιοχής άγριου τύπου. Αντίθετα, η µετάλλαξη I346F εµφανίζει ένα ελαφρώς υψηλότερο ποσοστό ενεργότητας στα HepG2 κύτταρα, σε σχέση µε τα COS-7 (43% έναντι 30% της ενεργότητας του άγριου τύπου αντίστοιχα). 101

Σχ.12. Α. Αποτελέσµατα επιµόλυνσης κυττάρων της σειράς COS-7 µε τους φορείς έκφρασης των σηµειακών µεταλλάξεων pcmxgal-lbd I338F, I346F, I338F/I346F και το γονίδιο αναφοράς G 5 CAT (στο επάνω µέρος της εικόνας). Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς και 2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων. Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα κάθε µετάλλαξης σε σχέση µε το µάρτυρα, ο οποίος έχει επιµολυνθεί µόνο µε άδειο φορέα (pcmxgal). Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Β. Τα ίδια αποτελέσµατα, εκφρασµένα ως προς τη σχετική δραστικότητα του άγριου τύπου (ΑΤ) (ΑΤ: 100%). Fig.12. A. The reporter plasmid G 5 CAT (3 µg) was transfected into COS-7 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type LBD or indicated point mutants in helices 10,11, fused in frame to the GAL-4 DBD (2 µg each). The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is shown in the form of a bar graph, as the percentage of the reporter activity obtained in a transfection with empty vector DNA. B. Same as in A, except CAT values are expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). 102

Σχ.13. Α. Αποτελέσµατα επιµόλυνσης κυττάρων της σειράς HepG2 µε τους φορείς έκφρασης των σηµειακών µεταλλάξεων pcmxgal-lbd I338F, I346F, I338F/I346F και το γονίδιο αναφοράς G 5 CAT (στο επάνω µέρος της εικόνας). Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς και 2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων. Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα κάθε µετάλλαξης σε σχέση µε το µάρτυρα, ο οποίος έχει επιµολυνθεί µόνο µε άδειο φορέα (pcmxgal). Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Β. Τα ίδια αποτελέσµατα, εκφρασµένα ως προς τη σχετική δραστικότητα του άγριου τύπου (ΑΤ) (ΑΤ: 100%). Fig.13. A. The reporter plasmid G 5 CAT (3 µg) was transfected into HepG2 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type LBD or indicated point mutants in helices 10,11, fused in frame to the GAL-4 DBD (2 µg each). The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is shown in the form of a bar graph, as the percentage of the reporter activity obtained in a transfection with empty vector DNA. B. Same as in A, except CAT values are expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). 103

Ο έλεγχος της έκφρασης όλων των παραπάνω µορίων µε ανοσοανίχνευση κατά Western σε COS-7 κύτταρα έδειξε ότι τα µεταλλαγµένα µόρια εκφράζονται κανονικά, έτσι ώστε για τις µεταξύ τους διακυµάνσεις στην ενεργότητα δεν ευθύνονται διαφορές στην έκφραση (Σχ.14). Σχ.14. Western blot µε anti-gal-4 αντίσωµα, όπου φαίνεται ότι οι σηµειακές µεταλλάξεις pcmxgal-lbd L220Q, R226G, I338F, I346F εκφράζονται σε επίπεδα συγκρίσιµα µε το pcmxgal υβριδικό µόριο που περιέχει το LBD άγριου τύπου (AT). Κύτταρα της σειράς COS-7 επιµολύνθηκαν µε 18 µg των αντίστοιχων φορέων έκφρασης και ορισµένη ποσότητα του εκχυλίσµατος αναλύθηκε ηλεκτροφορητικά σε 10% αποδιατακτική πηκτή SDS-πολυακρυλαµίδης. Fig.14. Western blot of the pcmxgal-lbd chimeric proteins, using an anti-gal- 4 antibody, where is shown that the indicated point mutants are expressed in levels similar to those of the wild type construct. COS-7 cells were transfected with 18 µg of the indicated point mutants and cell extracts were submitted to electrophoresis on a 10% denaturing SDSpolyacrylamide gel. 104

ii. Μελέτη της µεταγραφικής ενεργοποίησης παρουσία συνενεργοποιητών Έχοντας καθορίσει την επίδραση των συγκεκριµένων µεταλλάξεων στη µεταγραφική ενεργοποίηση από τον HNF-4α ελλείψει προσθήκης οποιουδήποτε εξωγενούς συνδέτη ή άλλου µορίου, επόµενος σκοπός της εργασίας ήταν να διερευνηθεί πώς οι συγκεκριµένες µεταλλάξεις θα αποκρίνονταν στην παρουσία συνενεργοποιητών, οι οποίοι θα συµπεριλαµβάνονταν στα πειράµατα επιµόλυνσης. Όπως αναφέρθηκε, οι συνενεργοποιητές είναι µόρια που έχουν την ικανότητα να ενισχύουν την ενεργοποίηση της µεταγραφής από µεταγραφικούς παράγοντες, µέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσουν µε συστατικά της βασικής µεταγραφικής µηχανής ή µε σύµπλοκα αναδιοργάνωσης της δοµής της χρωµατίνης. Στα πειράµατα αυτά εξετάστηκαν µόνο οι επιµέρους απλές µεταλλάξεις, καθώς οι διπλές και η τριπλή µετάλλαξη δεν είχε δειχθεί να προσθέτουν κάποια ιδιαίτερη πληροφορία ως προς το ρόλο των σχετικών αµινοξέων στο δυναµικό ενεργοποίησης του HNF-4α, στα προηγούµενα πειράµατα. Οι συνενεργοποιητές, οι οποίοι επιλέχθηκαν, ήταν ο PGC-1 (Σχ.15Α), ο οποίος αποτελεί φυσικό συνεργάτη του HNF-4α στα ηπατικά κύτταρα σύµφωνα µε πληθώρα πρόσφατων µελετών (Yoon et al., 2001, Rhee et al., 2003, Yamamoto et al., 2004), και ο SRC-3 (Σχ.15Β), ο οποίος εµφανίζει επίσης την ικανότητα να αλληλεπιδρά µε τον HNF-4α, ενισχύοντας τη µεταγραφή του, σε πειράµατα παροδικής επιµόλυνσης κυτταρικών σειρών (Lee et al., 2000). Τα πειράµατα αυτά πραγµατοποιήθηκαν στην κυτταρική σειρά HepG2, η οποία, σύµφωνα µε τις παρατηρήσεις από τους δύο προηγούµενους κύκλους πειραµάτων, εµφάνιζε υψηλότερα ποσοστά επιµόλυνσης σε σχέση µε τα κύτταρα της σειράς COS-7. Στο Σχ.16 φαίνεται η επίδραση των σηµειακών µεταλλάξεων pcmxgal-lbd L220Q, R226G, I338F και I346F στην ενίσχυση της ικανότητας µεταγραφικής ενεργοποίησης της LBD περιοχής του HNF-4α από τον PGC-1. Οι σηµειακές µεταλλάξεις L220Q και I338F δεν µπορούν να ενισχυθούν µεταγραφικά από τον PGC-1, καθώς η µεταγραφική τους ενεργότητα, παρουσία του συνενεργοποιητή, ενισχύεται µόνο κατά 0,7 και 0,4 φορές αντίστοιχα, σε σχέση µε την ενεργότητα απουσία συνενεργοποιητή. Αντίθετα, η σηµειακή µετάλλαξη I346F, η οποία διατηρεί ένα ποσοστό ενεργότητας απουσία του PGC-1, ενισχύεται δυναµικά στα πειράµατα συνεπιµόλυνσης µε τo συνενεργοποιητή, επάγοντας τη µεταγραφή του γονιδίου αναφοράς κατά 25 φορές περισσότερο σε σχέση µε την απουσία PGC-1. 105

Σχ.15. Α. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής του συνενεργοποιητή PGC-1 (Knutti & Kralli, 2001). Η περιοχή AD (Activating Domain) αντιστοιχεί στην περιοχή ενεργοποίησης του µορίου, ενώ η περιοχή-καταστολέας «καλύπτει» την περιοχή AD όταν το µόριο δεν αλληλεπιδρά µε µεταγραφικούς παράγοντες. Όταν ο PGC-1 αλληλεπιδράσει µε κάποιο µεταγραφικό παράγοντα υφίσταται µια τέτοια αλλαγή διαµόρφωσης ώστε «αποκαλύπτεται» η περιοχή ενεργοποίησης AD, η οποία αλληλεπιδρά µε τη σειρά της µε άλλους συνενεργοποιητές ενισχύοντας τη µεταγραφή. Η θέση του LXXLL µοτίβου, που συµµετέχει στην αλληλεπίδραση µε το µοτίβο φφχεφφ των πυρηνικών υποδοχέων, φαίνεται στο σχήµα. Β. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής του συνενεργοποιητή SRC-3 (Li et al., 1997). Η περιοχή αλληλεπίδρασης µε τους πυρηνικούς υποδοχείς περιλαµβάνει 6 LXXLL µοτίβα, τα οποία απεικονίζονται στο σχήµα. Fig.15. A. Schematic representation of the structure of coactivator PGC-1 (Knutti & Kralli, 2001). The Activating Domain (AD), located at the amino-terminus of the molecule, is masked by an inhibitory domain, in the absence of interactions with transcription factors. When PGC-1 becomes engaged in a physical interaction with an activator it undergoes a change in conformation, which exposes the activating domain. This domain interacts in turn with other coactivators, leading to the enhancement of transcription. The position of the LXXLL motif, which interacts with the φφχεφφ motif of nuclear receptors, is depicted. B. Schematic representation of the structure of coactivator SRC-3 (Li et al., 1997). The Receptor Interaction Domain encompasses 6 LXXLL motifs, which are depicted in the figure. 106

Ωστόσο, η µετάλλαξη R226G, η οποία δεν εµφανίζει µεταγραφική δραστικότητα απουσία του συνενεργοποιητή, ενισχύεται κατά 80 φορές παρουσία του PGC-1, φτάνοντας σε επίπεδα παραπλήσια µε αυτά του άγριου τύπου παρουσία του συνενεργοποιητή. Το αποτέλεσµα αυτό παρατηρήθηκε και µε το συνενεργοποιητή SRC-3 (Σχ.17). Παρ όλο που, όπως είναι προφανές από το διάγραµµα (σύγκρ. WT, WT+PGC-1 και WT+SRC-3), ο SRC-3 µπορεί γενικώς να ενισχύει τη δράση του HNF-4α πολύ ασθενέστερα σε σχέση µε τον PGC-1, το πρότυπο επιλεκτικής µεταγραφικής ενίσχυσης ορισµένων µόνο µεταλλάξεων διατηρείται και σε αυτήν την περίπτωση. Έτσι, ενώ οι µεταλλάξεις L220Q και I338F ενισχύονται από τον SRC-3 µόλις κατά 1 και 0,6 φορές αντίστοιχα, διατηρώντας ουσιαστικά την αδυναµία µεταγραφικής επαγωγής του γονιδίου CAT, που εµφανίζουν και απουσία του συνενεργοποιητή, η µετάλλαξη R226G ενισχύεται µεταγραφικά κατά 18 φορές από το συνενεργοποιητή, ανακτώντας την ικανότητα επαγωγής της ακετυλοτρανσφεράσης της χλωραµφαινικόλης. Τέλος, η µετάλλαξη I346F εµφανίζει τη διπλάσια ενεργότητα παρουσία του SRC-3 από αυτήν που διαθέτει απουσία του, όπως περίπου συµβαίνει και µε τον άγριο τύπο. iii. Προσπάθεια χαρτογράφησης συγκεκριµένων LXXLL µοτίβων του συνενεργοποιητή SRC-3, που ευθύνονται για την αλληλεπίδραση µε τον HNF-4α εδοµένου ότι ο συνενεργοποιητής SRC-3 διαθέτει 6 από τις αλληλουχίες του τύπου LXXLL (Li et al., 1997), που, όπως αναφέρθηκε, είναι υπεύθυνες για την αλληλεπίδραση µε την έλικα 12 των πυρηνικών υποδοχέων, σε αντιδιαστολή µε τον PGC-1, που διαθέτει µία µόνο από αυτές τις αλληλουχίες (Puigserver et al., 1998) (Σχ.15), εξετάστηκε στη συνέχεια αν τα τρία πρώτα LXXLL µοτίβα του SRC-3, που ανήκουν στην περιοχή αλληλεπίδρασης µε τους υποδοχείς (Receptor Interaction Domain, RID), εµπλέκονται στην αλληλεπίδραση µε τον HNF-4α. Το ερώτηµα τέθηκε καθώς, στην περίπτωση του οµόλογου συνενεργοποιητή του SRC-3, SRC-1, έχει δειχθεί ότι τα τρία πρώτα µοτίβα είναι αυτά που ευθύνονται για τις αλληλεπιδράσεις µε τους πυρηνικούς υποδοχείς (Torchia et al., 1997). Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκε το διϋβριδικό σύστηµα GAL-4/VP16 (mammalian two-hybrid system), το οποίο περιλαµβάνει επιµόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων µε υβριδικά µόρια, εκ των οποίων το ένα είναι συζευγµένο µε την DBD περιοχή του µεταγραφικού παράγοντα GAL-4 της ζύµης, όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, 107

Σχ.16. Αποτελέσµατα συνεπιµόλυνσης κυττάρων της σειράς HepG2 µε τους φορείς έκφρασης των σηµειακών µετάλλάξεων pcmxgal-lbd L220Q, R226G, I338F, I346F, το γονίδιο αναφοράς G 5 CAT και το συνενεργοποιητή PGC-1. Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς, 0,2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων ή του άγριου τύπου και 1,25 µg του συνενεργοποιητή ή του αντίστοιχου άδειου φορέα (πλασµίδιο pcdna 3.1). Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα της κάθε µετάλλαξης σε σχέση µε τον άγριο τύπο. Οι σκουρόχρωµες ράβδοι αναφέρονται στη δραστικότητα των µεταλλάξεων απουσία PGC-1, ενώ οι ανοικτόχρωµες σε αυτήν παρουσία του συνενεργοποιητή. Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Fig.16. The reporter plasmid G 5 CAT (3 µg) was transfected into HepG2 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type LBD or indicated point mutants, fused in frame to the GAL-4 DBD (0.2 µg each), in the presence or absence of coactivator. Open bars represent transfections with 1.25 µg of PGC-1 expression vector, whereas closed bars indicate transfections with 1.25 µg of empty vector instead. The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). 108

Σχ.17. Αποτελέσµατα συνεπιµόλυνσης κυττάρων της σειράς HepG2 µε τους φορείς έκφρασης των σηµειακών µετάλλάξεων pcmxgal-lbd L220Q, R226G, I338F, I346F, το γονίδιο αναφοράς G 5 CAT και το συνενεργοποιητή SRC-3. Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς, 0,2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων ή του άγριου τύπου και 1,25 µg του συνενεργοποιητή ή του αντίστοιχου άδειου φορέα (pcmxgal). Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα της κάθε µετάλλαξης σε σχέση µε τον άγριο τύπο. Οι σκουρόχρωµες ράβδοι αναφέρονται στη δραστικότητα των µεταλλάξεων απουσία SRC-3, ενώ οι ανοικτόχρωµες σε αυτήν παρουσία του συνενεργοποιητή. Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Fig.17. The reporter plasmid G 5 CAT (3 µg) was transfected into HepG2 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type LBD or indicated point mutants, fused in frame to the GAL-4 DBD (0.2 µg each), in the presence or absence of coactivator. Open bars represent transfections with 1.25 µg of SRC-3 expression vector, whereas closed bars indicate transfections with 1.25 µg of empty vector instead. The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). 109

ενώ το άλλο είναι συζευγµένο µε την περιοχή ενεργοποίησης (activation domain) ενός καλά χαρακτηρισµένου ενεργοποιητή της µεταγραφής, όπως του VP16 του ερπητοϊού. εδοµένου ότι ο GAL-4 και ο VP16 δεν αλληλεπιδρούν φυσιολογικά, η ενεργοποίηση της µεταγραφής του γονιδίου αναφοράς, µέσω επικοινωνίας του προσδεδεµένου στο DNA GAL-4 DBD και της ετερόλογης περιοχής ενεργοποίησης του VP16, γίνεται µόνο σε περίπτωση που τα δύο τµήµατα έρθουν σε επαφή µέσω των µορίων που είναι προσαρτηµένα σε αυτά (Luo et al., 1997). Έτσι, στην περίπτωσή µας χρησιµοποιήθηκαν τα µόρια pcmxgal-lbd του HNF-4α σε πειράµατα συνεπιµόλυνσης κυττάρων µε το µόριο VP16-SRC3. Το µόριο αυτό φέρει κλωνοποιηµένη αποκλειστικά την περιοχή του SRC-3 που αντιστοιχεί στα 3 πρώτα LXXLL µοτίβα του συνενεργοποιητή, σε συνδυασµό µε την περιοχή ενεργοποίησης του VP16 (Lee et al., 2000). Το σκεπτικό ήταν ότι, αν το LBD του HNF-4α αλληλεπιδρά µε τον SRC-3 µέσω των συγκεκριµένων LXXLL µοτίβων, θα έπρεπε να παρατηρηθεί µία αύξηση της µεταγραφής στην περίπτωση των µεταλλάξεων R226G, I346F, καθώς φυσικά και του άγριου τύπου. Το Σχ.18 δείχνει πως κάτι τέτοιο παρατηρήθηκε πράγµατι στην περίπτωση του άγριου τύπου και της µετάλλαξης I346F, όχι όµως και στην περίπτωση της R226G. Προσεκτικότερη εξέταση του σχήµατος, ωστόσο, αποκαλύπτει πως η αύξηση της µεταγραφής στην περίπτωση της I346F, αλλά και του άγριου τύπου, επαναλαµβάνεται στα πειράµατα συνεπιµόλυνσης µόνο µε τον VP16, συνηγορώντας υπέρ της άποψης ότι οφείλεται σε αλληλεπίδραση του LBD του HNF-4α απευθείας µε τον VP16, και όχι σε αλληλεπίδραση µέσω των συγκεκριµένων µοτίβων που συνεισφέρει ο SRC-3. Υπέρ αυτής της άποψης συντελεί άλλωστε και το γεγονός ότι συνεπιµόλυνση κυττάρων µε τον άγριο τύπο ή τη µετάλλαξη I346F και το υβριδικό µόριο VP16-SRC3 δεν ενισχύει περαιτέρω τη µεταγραφή του γονιδίου αναφοράς, σε σχέση µε τη µεταγραφή του παρουσία µόνο του VP16. Με βάση, λοιπόν, τις παραπάνω παρατηρήσεις είναι φανερό ότι η αλληλεπίδραση του HNF-4α µε τον SRC-3 δε γίνεται µέσω των 3 πρώτων µοτίβων του συνενεργοποιητή, αλλά η αύξηση της µεταγραφής στο δεδοµένο σύστηµα οφείλεται µάλλον σε αλληλεπίδραση του LBD του µεταγραφικού παράγοντα µε την περιοχή ενεργοποίησης του VP16. Η αλληλεπίδραση αυτή πιθανόν στηρίζεται σε αµινοξέα που περιλαµβάνουν την αργινίνη στη θέση 226, καθώς µετάλλαξη σε αυτήν τη θέση δεν µπορεί να ενεργοποιηθεί µεταγραφικά στο διϋβριδικό σύστηµα, σε αντίθεση µε ό,τι παρατηρείται στο µονοϋβριδικό σύστηµα µελέτης. 110

Σχ.18. Αποτελέσµατα συνεπιµόλυνσης κυττάρων της σειράς HepG2 µε τους φορείς έκφρασης των σηµειακών µεταλλάξεων pcmxgal-lbd L220Q, R226G, I338F, I346F, το γονίδιο αναφοράς G 5 CAT και τα µόρια VP16 ή VP16-SRC3, στο διϋβριδικό σύστηµα µελέτης GAL-4/VP16. Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς, 0,2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων ή του άγριου τύπου και 1,25 µg των VP16, VP16-SRC3 ή του αντίστοιχου άδειου φορέα (πλασµίδιο pcmxgal). Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα της κάθε µετάλλαξης σε σχέση µε τον άγριο τύπο. Οι λευκές ράβδοι αναφέρονται στη δραστικότητα των µεταλλάξεων απουσία VP16 ή VP16-SRC3, οι γκρίζες παρουσία VP16 και οι µαύρες παρουσία VP16-SRC3. Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Fig.18. Results of the mammalian two-hybrid (GAL-4/VP16) system. The reporter plasmid G 5 CAT (3 µg) was transfected into HepG2 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type LBD or indicated point mutants, fused in frame to the GAL-4 DBD (0.2 µg each), in the absence (white bars) or presence of 1.25 µg VP16 (gray bars) or VP16-SRC-3 expression vectors (black bars). The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). 111

II. Επίδραση σηµειακών µεταλλάξεων, που εισάγονται στις έλικες 5,10,11 της LBD περιοχής του HNF-4α, στην ενεργότητα του µορίου: µεταφορά των µεταλλάξεων στο πλήρες µόριο του HNF-4α i. Πρόσδεση στο DNA και µελέτη ιδιοτήτων διµερισµού των σηµειακών µεταλλάξεων σε ολόκληρο το µόριο του HNF-4α Με βάση τα αποτελέσµατα µελέτης των µεταλλάξεων στο µονοϋβριδικό GAL-4 σύστηµα κρίθηκε σκόπιµο στη συνέχεια να εξεταστεί η επίδραση που θα είχαν οι µεταλλάξεις αυτές στη µεταγραφή γονιδίων, τα οποία βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο φυσικών υποκινητών-στόχων του HNF-4α. Αυτό θα µπορούσε να γίνει µόνο κατόπιν κλωνοποίησής τους σε ολόκληρο το µόριο του µεταγραφικού παράγοντα. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκαν τρεις από τις τέσσερις, συνολικά, απλές αντικαταστάσεις, που είχαν µελετηθεί στα πλαίσια του µονοϋβριδικού GAL-4 συστήµατος. Κατ αρχήν επιλέχθηκε η µετάλλαξη R226G, η οποία, παρ όλο που είναι ανενεργή απουσία συνενεργοποιητών, έδειξε να ανακτά ένα σηµαντικό δυναµικό µεταγραφικής ενεργοποίησης παρουσία PGC-1 και, σε µικρότερο βαθµό, παρουσία SRC-3. Επίσης, επιλέχθηκε η µετάλλαξη I338F, η οποία ήταν ανενεργή τόσο απουσία συνενεργοποιητών όσο και κατά την παρουσία τους, και τέλος η µετάλλαξη I346F, που στο µονοϋβριδικό GAL-4 σύστηµα διατηρεί ένα ποσοστό ενεργότητας ακόµη και κατά την απουσία συνενεργοποιητών, το οποίο ενισχύεται έπειτα από εξωγενή προσθήκη του PGC-1 ή του SRC-3. Στο Σχ.19Α φαίνεται ο χαρακτηρισµός, µε πέψη, ανασυνδυασµένων µορίων DNA, που αποµονώθηκαν από διαφορετικούς βακτηριακούς κλώνους µετά από κλωνοποίηση των µεταλλάξεων στο cdna του HNF-4α. Με αυτόν τον τρόπο επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη του αναµενόµενου ενθέµατος στα επιµέρους πλασµίδια, προτού ελεγχθεί η πρωτοταγής αλληλουχία βάσεων των ανασυνδυασµένων µορίων. Στο Σχ.19Β εξετάστηκε η έκφραση των µεταλλαγµένων HNF-4α πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα της σειράς HEK-293T. Οι παρατηρούµενες διαφορές στην έκφραση δεν ήταν σηµαντικές, ώστε να θεωρηθεί ότι θα µπορούσαν να επηρεάσουν την ενεργοποίηση των υποκινητών-στόχων στα πειράµατα ελέγχου της δραστικότητας των σηµειακών µεταλλάξεων. Το πρώτο πράγµα, που έπρεπε να ελεγχθεί, ωστόσο, µετά την κλωνοποίηση των µεταλλάξεων σε ολόκληρο το µόριο, ήταν κατά πόσο αυτές επηρεάζουν καθοριστικές ιδιότητες για τη λειτουργία, όπως την ικανότητα σχηµατισµού διµερών και πρόσδεσης στο DNA. Για το λόγο αυτό πραγµατοποιήθηκαν 112

Σχ.19. Α. Αποµόνωση κλώνων που φέρουν τις επιθυµητές pcdna3.1-lbd σηµειακές µεταλλάξεις. Στην εικόνα φαίνεται πηκτή αγαρόζης όπου έχουν αναλυθεί ηλεκτροφορητικά τα προϊόντα πέψης µε περιοριστικές ενδονουκλεάσες πλασµιδιακού DNA που αποµονώθηκε από τους σχετικούς κλώνους. Περίπου 200 ng DNA από τον κάθε κλώνο υποβλήθηκαν σε διαδοχικές πέψεις µε τις ενδονουκλεάσες HindIII, BamHI. Β. Western blot µε anti-hnf-4α αντίσωµα, όπου φαίνεται ότι οι σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-lbd R226G, I338F, I346F εκφράζονται σε επίπεδα συγκρίσιµα µε τον άγριου τύπου HNF-4α (ΑT). Κύτταρα της σειράς HEK-293T επιµολύνθηκαν µε 18 µg των αντίστοιχων φορέων έκφρασης και ορισµένη ποσότητα του εκχυλίσµατος αναλύθηκε ηλεκτροφορητικά σε 10% αποδιατακτική πηκτή SDS-πολυακρυλαµίδης. Fig.19. A. Isolation and characterization of clones bearing the desired pcdna3.1- LBD point mutations. Plasmid DNA was prepared from the relevant clones, digested with HindIII, BamHI and digestion products were separated on a 8% agarose gel. B. Western blot of the pcdna3.1-lbd proteins, using an anti-hnf-4α antibody, where it is shown that the indicated point mutants are expressed in levels similar to those of the wild type. HEK-293T cells were transfected with 18 µg of the indicated point mutants and cell extracts were submitted to electrophoresis on a 10% SDS-polyacrylamide gel. 113

µελέτες µεταβολής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (E.M.S.A.), στις οποίες χρησιµοποιήθηκε το ολιγονουκλεοτίδιο που αντιστοιχεί στη φυσική αλληλουχία πρόσδεσης του HNF-4α στον υποκινητή του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης CIII (Ogami et al., 1990), παρουσία των µεταλλαγµένων HNF-4α πρωτεϊνών ή του HNF- 4α άγριου τύπου. Όπως φαίνεται στη δεύτερη διαδροµή του Σχ.20 η κινητικότητα του σηµασµένου ολιγονουκλεοτιδίου δε µεταβάλλεται όταν το ολιγονουκλεοτίδιο επωαστεί µε πυρηνικό εκχύλισµα που προέρχεται από κύτταρα τα οποία δεν έχουν επιµολυνθεί µε τον HNF-4α, καθώς η σηµασµένη αλληλουχία φαίνεται να εντοπίζεται εξ ολοκλήρου στο ίδιο ύψος µε το ελεύθερο ολιγονουκλεοτίδιο (σύγκρ. διαδροµή 2 µε 1). Αντίθετα, όταν το πυρηνικό εκχύλισµα, µε το οποίο επωάζεται το ολιγονουκλεοτίδιο, προέρχεται από κύτταρα που έχουν επιµολυνθεί µε τον άγριο τύπο, η κινητικότητα του σηµασµένου ολιγονουκλεοτιδίου µεταβάλλεται όπως φαίνεται στην τρίτη διαδροµή. Ο HNF-4α είναι γνωστό ότι προσδένεται στο DNA αποκλειστικά ως οµοδιµερές (Jiang et al., 1995). εδοµένου ότι επώαση µε τις µεταλλάξεις R226G, I338F και I346F µεταβάλλει την κινητικότητα της σηµασµένης DNA ακολουθίας, µε τρόπο παραπλήσιο µε εκείνον που τη µεταβάλλει ο HNF-4α άγριου τύπου, προκύπτει το συµπέρασµα ότι οι συγκεκριµένες µεταλλάξεις στην LBD περιοχή δεν επηρεάζουν την ιδιότητα πρόσδεσης στο DNA των µορίων, γεγονός που θα επιδρούσε σαφώς στην πρόσδεση των µεταλλαγµένων πρωτεϊνών στις φυσικές αλληλουχίες-στόχους τους στους υποκινητές των γονιδίων, οδηγώντας σε αδυναµία ενεργοποίησης της µεταγραφής. Με αυτόν τον τρόπο εξασφαλίστηκε, πριν τη διεξαγωγή µεταγραφικών µελετών, ότι οι όποιες επιδράσεις των µεταλλάξεων παρατηρούνταν στην ενεργοποίηση της µεταγραφής του συστήµατος αναφοράς, θα οφείλονταν αποκλειστικά σε µεταβολές του δυναµικού ενεργοποίησης της LBD περιοχής, που προκαλούν οι εν λόγω µεταλλάξεις, παρά σε µεταβολή άλλων φυσικών ιδιοτήτων του µορίου του HNF-4α. Το σύστηµα E.M.S.A. χρησιµοποιήθηκε και για τον έλεγχο της ικανότητας ετεροδιµερισµού των σηµειακών µεταλλάξεων µε το µόριο HNF-4α άγριου τύπου. Ειδικότερα, για τη διευκόλυνση αυτής της µελέτης, χρησιµοποιήθηκε το ελλειµµατικό µόριο CD1b του HNF-4α, που φέρει τα αµινοξέα 1-360 (σε σχέση µε τα αµινοξέα 1-465 της ισοµορφής α2 άγριου τύπου), το οποίο έχει περιγραφεί σε προηγούµενη µελέτη (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997). Το µόριο αυτό (µικρότερου µοριακού βάρους από τον άγριο τύπο) διατηρεί, όπως έχει δειχθεί, αναλλοίωτες τις ιδιότητες διµερισµού και πρόσδεσης στο DNA, εποµένως µπορεί να 114

χρησιµοποιείται αδιακρίτως του αγρίου τύπου σε µελέτες αυτού του είδους. Ο λόγος χρήσης του είναι ότι, σε περίπτωση που οι σηµειακές µεταλλάξεις διατηρούν την ικανότητα διµερισµού µε τον άγριο τύπο, τα ετεροδιµερή, που σχηµατίζονται, δεν µπορούν να διακριθούν από τα αντίστοιχα οµοδιµερή των σηµειακών µεταλλάξεων ή τα οµοδιµερή του άγριου τύπου, δεδοµένου ότι όλες αυτές οι πρωτεΐνες έχουν το ίδιο µοριακό βάρος, άρα παραπλήσια ηλεκτροφορητική κινητικότητα κατόπιν πρόσδεσής τους στην αλληλουχία-στόχο. Αντίθετα, µε χρήση του CD1b, τα οµοδιµερή του ελλειµµατικού µορίου µεταναστεύουν γρηγορότερα από τα αντίστοιχα οµοδιµερή των σηµειακών µεταλλάξεων (βλ. Σχ.21, τέταρτη διαδροµή), ενώ αν σχηµατίζονται ετεροδιµερή, αυτά αναµένεται να ανιχνεύονται ως σύµπλοκα ενδιάµεσης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας ως προς τους δύο τύπους οµοδιµερών. Πράγµατι, όπως φαίνεται στο Σχ.21, και οι τρεις σηµειακές µεταλλάξεις, που εξετάστηκαν, σχηµατίζουν τις χαρακτηριστικές ενδιάµεσες ζώνες των ετεροδιµερών. Η ζώνη του ετεροδιµερούς παρατηρείται ακόµη και στην περίπτωση της µετάλλαξης R226G, που φαίνεται να αλληλεπιδρά ασθενέστερα µε τον άγριο τύπο σε σχέση µε τις άλλες δύο µεταλλάξεις (σύγκρ. διαδροµή 1 στο Σχ.21 µε τις 2 και 3). Η ικανότητα ετεροδιµερισµού των σηµειακών µεταλλάξεων µε τον άγριο τύπο επιβεβαιώθηκε οριστικά σε συνδυασµό µε πειράµατα επιµόλυνσης κυττάρων της σειράς HepG2 µε τις σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-lbd R226G, I338F και I346F. Τα κύτταρα αυτά εκφράζουν, όπως αναφέρθηκε, ενδογενώς τον άγριο τύπο του HNF-4α, γεγονός το οποίο αποδεικνύεται και από την ικανότητα επαγωγής του γονιδίου CAT στο «µάρτυρα» (κύτταρα που δεν έχουν επιµολυνθεί), στο Σχ.22. Το σύστηµα αναφοράς (BA1) 5 CAT, που χρησιµοποιήθηκε στη µελέτη αυτή, αποτελεί ένα συνθετικό υποκινητή, που περιλαµβάνει πέντε φυσικές αλληλουχίες πρόσδεσης του HNF-4α στη σειρά, οι οποίες προέρχονται από το γονίδιο της απολιποπρωτεΐνης B, την αλληλουχία TATA του υποκινητή της β-σφαιρίνης, και το γονίδιο αναφοράς CAT (βλ. σχήµα). Ο συνθετικός αυτός υποκινητής είναι απόλυτα ειδικός ως προς τον HNF-4α, αποκρινόµενος µόνο σε αυτόν και όχι σε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες, που ενδεχοµένως αναγνωρίζουν κοινές αλληλουχίες µε τον HNF-4, όπως π.χ. συµβαίνει µε τις αλληλουχίες πρόσδεσης του HNF-4α στον υποκινητή του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης CIII. Από το Σχ.22, λοιπόν, φαίνεται πως επιµόλυνση κυττάρων HepG2 τόσο µε τη µετάλλαξη I346F όσο και µε την I338F, αλλά, κυρίως, 115

Σχ.20. Ανάλυση κατά EMSA, όπου φαίνεται ότι οι σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-lbd R226G, I338F, I346F προσδένονται στο DNA ως οµοδιµερή, όπως ο HNF-4α άγριου τύπου (AT). Κύτταρα της σειράς HEK 293-T επιµολύνθηκαν µε 18 µg των αντίστοιχων φορέων έκφρασης και ορισµένη ποσότητα του εκχυλίσµατος επωάστηκε µε το ραδιενεργά σηµασµένο ολιγονουκλεοτίδιο, που αντιστοιχεί στη φυσική αλληλουχία πρόσδεσης του HNF-4α στον υποκινητή του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης CIII (CIIIB). Τα σύµπλοκα που προέκυψαν αναλύθηκαν ηλεκτροφορητικά σε 5% µη-αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαµίδης. Στην πρώτη διαδροµή έχει τρέξει ολιγονουκλεοτίδιο, το οποίο δεν επωάστηκε µε κανενός είδους πυρηνικό εκχύλισµα. Στη δεύτερη διαδροµή έχει τρέξει ολιγονουκλεοτίδιο, το οποίο επωάστηκε µε πυρηνικό εκχύλισµα µη επιµολυµένων κυττάρων HEK 293-T. Fig.20. EMSA analysis of the binding and dimerization properties of the pcdna3.1-lbd point mutants, where it is shown that all of the indicated mutants are able to bind DNA as homodimers, just like the wild type receptor. HEK 293-T cells were transfected with 18 µg of the wild type or mutant expression vectors and nuclear extracts were incubated with 32 P-labeled CIIIB probe, which is a natural high-affinity binding site for HNF-4α. The resulting complexes were electrophoretically separated on a 5% non-denaturing polyacrylamide gel. The first and second lane contain free probe and probe incubated with nuclear extract from untransfected cells respectively. 116

Σχ.21. Ανάλυση κατά EMSA, όπου φαίνεται ότι οι σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-lbd R226G, I338F, I346F έχουν την ικανότητα να προσδένονται στο DNA, εκτός από οµοδιµερή (επάνω ζώνη), και ως ετεροδιµερή µε τον HNF-4α άγριου τύπου (ενδιάµεση ζώνη). Το µόριο CD1b, που χρησιµοποιήθηκε αντί του άγριου τύπου, είναι µία ελλειµµατική µετάλλαξη του HNF-4α, που διατηρεί αναλλοίωτες τις ιδιότητες πρόσδεσης στο DNA και διµερισµού µε τον άγριο τύπο. Κύτταρα της σειράς HEK 293-T επιµολύνθηκαν µε 18 µg των αντίστοιχων φορέων έκφρασης και ορισµένη ποσότητα από κάθε εκχύλισµα επωάστηκε για 15 λεπτά στους 4 C µε ισοµοριακή ποσότητα εκχυλίσµατος CD1b, προτού προστεθεί το ραδιενεργά σηµασµένο ολιγονουκλεοτίδιο, που αντιστοιχεί στη φυσική αλληλουχία πρόσδεσης του HNF-4α στον υποκινητή του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης CIII (CIIIB). Τα σύµπλοκα που προέκυψαν αναλύθηκαν ηλεκτροφορητικά σε 5% µηαποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαµίδης. Στην τελευταία διαδροµή έχει τρέξει ολιγονουκλεοτίδιο, το οποίο επωάστηκε µόνο µε πυρηνικό εκχύλισµα CD1b (κάτω ζώνη). Fig.21. EMSA analysis of the ability of the pcdna3.1-lbd point mutants to heterodimerize with wild type HNF-4α, where it is shown that all of the indicated mutants are able to form complexes of intermediate electrophoretic mobility with wild type HNF-4α. CD1b, which was used instead of the wild type, is a truncated HNF-4α protein that has been shown to retain wild type binding and dimerization properties. HEK-293T cells were transfected with 18 µg of the wild type or mutant expression vectors and nuclear extracts were incubated for 15 min at 4 C with equimolar amounts of CD1b, prior to addition of the 32 P- labeled CIIIB probe, which is a natural high-affinity binding site for HNF-4α. The resulting complexes were electrophoretically separated on a 5% non-denaturing polyacrylamide gel. The last lane contains probe that was incubated with nuclear extract from cells expressing CD1b. 117

Σχ.22. Αποτελέσµατα επιµόλυνσης κυττάρων της σειράς HepG2 µε τους φορείς έκφρασης των σηµειακών µεταλλάξεων pcdna3.1-lbd R226G, I338F, I346F και το γονίδιο αναφοράς (BA1) 5 CAT (στο επάνω µέρος της εικόνας). Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς και 2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων. Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα κάθε µετάλλαξης σε σχέση µε το µάρτυρα, ο οποίος αντιπροσωπεύει τη δραστικότητα του ενδογενούς HNF-4α, καθώς έχει επιµολυνθεί µόνο µε άδειο φορέα (pcdna3.1). Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Fig.22. The reporter plasmid (BA1) 5 CAT (3 µg) was transfected into HepG2 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the indicated pcdna3.1-lbd point mutants (2 µg each). The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is shown in the form of a bar graph, as the percentage of the reporter activity obtained in a transfection with empty vector DNA. Control shows the activity of the endogenous HNF-4α in HepG2 cells. 118

µε τη µετάλλαξη R226G, µειώνει την επαγωγή του γονιδίου αναφοράς στα κύτταρα σε σχέση µε το µάρτυρα, που περιέχει µόνο τον ενδογενή HNF-4. Εποµένως, σε συνδυασµό µε τα αποτελέσµατα που προκύπτουν από την ανάλυση κατά E.M.S.A., συµπεραίνεται ότι οι σηµειακές µεταλλάξεις είναι σε θέση να ετεροδιµερίζονται µε τον HNF-4α άγριου τύπου, επηρεάζοντας (αρνητικά) τη δράση του in vivo. ii. Μεταγραφική µελέτη των σηµειακών µεταλλάξεων σε ολόκληρο το µόριο του HNF-4α απουσία και παρουσία συνενεργοποιητών Προκειµένου να µελετηθεί ξεκάθαρα η επίδραση των σηµειακών µεταλλάξεων στο δυναµικό ενεργοποίησης της LBD περιοχής, στα πλαίσια του φυσικού µορίου του HNF-4α, κατά την απουσία αλλά και παρουσία συνενεργοποιητών, έπρεπε να χρησιµοποιηθεί ένα σύστηµα απαλλαγµένο από την ενδογενή παρουσία του µεταγραφικού παράγοντα, καθώς, όπως φάνηκε στο Σχ.22, αυτός εµπλέκεται σε ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις µε τις σηµειακές µεταλλάξεις στα κύτταρα, περιπλέκοντας αναπόφευκτα την ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Για το σκοπό αυτό τα πειράµατα που περιγράφονται στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκαν στην κυτταρική σειρά COS-7, ενώ ως σύστηµα αναφοράς χρησιµοποιήθηκε και πάλι το γονίδιο CAT, αυτή τη φορά όµως υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης ApoCIII, ο οποίος αποτελεί φυσικό στόχο του HNF-4α in vivo (apociii(-890/+24)cat). Η χρήση του συγκεκριµένου υποκινητή, ως φυσικού συστήµατος µελέτης της δράσης του HNF-4α, ενδείκνυται στην περίπτωση επιµόλυνσης κυττάρων της σειράς COS-7, καθώς σε αυτά τα κύτταρα δεν υπάρχουν µεταγραφικοί παράγοντες που να επηρεάζουν τη δράση του υποκινητή, όπως συµβαίνει µε τα ηπατικής προέλευσης HepG2. Παρατηρώντας τα αποτελέσµατα του Σχ.23, είναι προφανές ότι οι σηµειακές µεταλλάξεις pcdna3.1-lbd R226G, I338F και I346F έχουν παρόµοια επίδραση στην ενεργότητα του φυσικού µορίου HNF-4α, όπως και στην περίπτωση των χιµαιρικών pcmxgal-lbd µορίων. Ειδικότερα, οι µεταλλάξεις R226G, I338F παρουσιάζουν µόλις 7 και 9% της ενεργότητας του άγριου τύπου, αντίστοιχα, ενώ η µετάλλαξη I346F παρουσιάζει, σε αυτήν την περίπτωση, το 70% της ενεργότητας του φυσικού µορίου, ποσοστό δηλαδή ακόµη υψηλότερο από αυτό που διατηρεί στα πλαίσια του αντίστοιχου pcmxgal-lbd υβριδικού µορίου (βλ. Σχ.12 και 13Β). 119

Σχ.23. Αποτελέσµατα επιµόλυνσης κυττάρων της σειράς COS-7 µε τους φορείς έκφρασης των σηµειακών µεταλλάξεων pcdna3.1-lbd R226G, I338F, I346F και το γονίδιο αναφοράς ApoCIII(-890/+24)CAT (στο επάνω µέρος της εικόνας). Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς και 2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων. Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα κάθε µετάλλαξης σε σχέση µε τον άγριο τύπο HNF-4α. Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Fig.23. The reporter plasmid ApoCIII(-890/+24)CAT (3 µg) was transfected into COS-7 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type or indicated pcdna3.1-lbd point mutants (2 µg each). The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). 120

Εξ άλλου, στο Σχ.24 φαίνεται η επίδραση της παρουσίας του φυσικού συνενεργοποιητή του HNF-4α, PGC-1, στη δραστικότητα των συγκεκριµένων σηµειακών µεταλλάξεων. Σε αναλογία µε ό,τι παρατηρείται στα pcmxgal-lbd υβριδικά µόρια, η µετάλλαξη I338F δεν µπορεί να ενισχυθεί µεταγραφικά παρουσία του συγκεκριµένου συνενεργοποιητή, ενώ η µετάλλαξη R226G «διασώζεται» λειτουργικά ανακτώντας µεταγραφική δραστικότητα, που επιτρέπει την επαγωγή του γονιδίου CAT κατά 33 φορές σε σχέση µε την επαγωγή του απουσία PGC-1. Σηµειώνεται ότι η επαγωγή του γονιδίου CAT ενισχύεται µόλις κατά 6 φορές παρουσία PGC-1 από τον άγριο τύπο, σε σχέση µε την επαγωγή απουσία PGC-1. Η ενίσχυση, βέβαια, στην περίπτωση της µετάλλαξης pcdna3.1-lbd R226G είναι 2,5 φορές λιγότερη από την αντίστοιχη ενίσχυση που παρατηρείται στα pcmxgal-lbd µόρια παρουσία του PGC-1. Σε παρόµοια πλαίσια κινείται και η µετάλλαξη I346F, η οποία ενισχύεται µόλις κατά 2,2 φορές παρουσία του PGC-1, περίπου 10 φορές λιγότερο σε σχέση µε την ενίσχυσή της από τον ίδιο συνενεργοποιητή στα πλαίσια του αντίστοιχου pcmxgal-lbd υβριδικού µορίου. Παρά τις διαφορές στις παρατηρούµενες τιµές ωστόσο, γεγονός παραµένει ότι οι σηµειακές µεταλλάξεις εµφανίζουν ανάλογο πρότυπο µεταγραφικής ενεργοποίησης και ενίσχυσης της δράσης τους παρουσία συνενεργοποιητών τόσο στα πλαίσια του µονοϋβριδικού GAL-4 συστήµατος όσο και στα πλαίσια του φυσικού HNF-4α µορίου. iii. Μελέτη των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων του HNF-4α µε τον PGC-1 α. In vitro µελέτη Σε µια προσπάθεια ερµηνείας των αποτελεσµάτων που προέκυψαν από τη µεταγραφική ανάλυση έγινε η υπόθεση ότι οι µεταλλάξεις, που µελετήθηκαν, θα µπορούσαν ενδεχοµένως να προξενούν µεταβολές στο µικροπεριβάλλον των αµινοξέων, και κατά συνέπεια στην τοπική διαµόρφωση της κοιλότητας πρόσδεσης του συνδέτη ή άλλων επιφανειών του µορίου, επηρεάζοντας µε αυτόν τον τρόπο τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης του HNF-4α µε το συνενεργοποιητή διαφορετικά σε κάθε περίπτωση. Για το λόγο αυτό πραγµατοποιήθηκαν in vitro πειράµατα ελέγχου της πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης των µεταλλάξεων µε το συνενεργοποιητή PGC-1, γνωστά και ως GST pulldowns. Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην ικανότητα µορίων, τα οποία εκφράζονται ως χίµαιρες µε το ένζυµο GST (Glutathione S Transferase), να κατακρατούνται από σφαιρίδια γλουταθειόνης. Η σύνδεση επιτυγχάνεται δεδοµένης της υψηλής συγγένειας, που χαρακτηρίζει κάθε φυσική αλληλεπίδραση ενζύµου µε το 121

Σχ.24. Αποτελέσµατα συνεπιµόλυνσης κυττάρων της σειράς COS-7 µε τους φορείς έκφρασης των σηµειακών µεταλλάξεων pcdna3.1-lbd R226G, I338F, I346F, το γονίδιο αναφοράς ApoCIII(-890/+24)CAT (στο επάνω µέρος της εικόνας) και το συνενεργοποιητή PGC-1. Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς, 0,2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων ή του άγριου τύπου και 1,25 µg του συνενεργοποιητή ή του αντίστοιχου άδειου φορέα (πλαµίδιο pcdna3.1). Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα της κάθε µετάλλαξης ως προς τον άγριο τύπο. Οι σκουρόχρωµες ράβδοι αναφέρονται στη δραστικότητα των µεταλλάξεων απουσία PGC-1, ενώ οι ανοικτόχρωµες σε αυτήν παρουσία του συνενεργοποιητή. Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Fig.24. The reporter plasmid ApoCIII(-890/+24)CAT (3 µg) was transfected into COS-7 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type or indicated pcdna3.1-lbd point mutants, (0.2 µg each), in the presence or absence of coactivator. Open bars represent transfections with 1.25 µg of PGC-1 expression vector, whereas closed bars indicate transfections with 1.25 µg of empty vector instead. The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). 122

υπόστρωµά του (στην περίπτωση αυτή θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνηςγλουταθειόνη). Το GST-χιµαιρικό µόριο, που χρησιµοποιήθηκε, ήταν ο GST-PGC- 1(αα 91-408). Το µόριο αυτό εκφράζει τµήµα του PGC-1, στο οποίο συµπεριλαµβάνεται το µοναδικό LXXLL µοτίβο του συνενεργοποιητή (αα 142-146), ως πρωτεΐνη σύντηξης µε τη θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης. Το σκεπτικό ήταν ότι, αν οι µεταλλαγµένες HNF-4α πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν µε τον (GST-)PGC-1, θα έπρεπε να κατακρατηθούν από τα σφαιρίδια γλουταθειόνης λόγω δηµιουργίας συµπλόκου µε τη χιµαιρική πρωτεΐνη PGC-1, η οποία δεσµεύεται στα σφαιρίδια ούτως ή άλλως χάρη στο GST τµήµα που φέρει. Ειδικότερα, ορισµένη ποσότητα σφαιριδίων γλουταθειόνης-αγαρόζης επωάστηκε µε πυρηνικό εκχύλισµα κυττάρων της σειράς HEK 293-T, τα οποία είχαν επιµολυνθεί µε τα pcmxgal-lbd ή pcdna3.1-lbd µόρια άγριου τύπου, καθώς και µε τις αντίστοιχες σηµειακές µεταλλάξεις. Στο Σχ.25 φαίνεται το αποτέλεσµα της επώασης σφαιριδίων GST-PGC-1(αα 91-408) µε πυρηνικά εκχυλίσµατα, που εκφράζουν τις υβριδικές σηµειακές µεταλλάξεις pcmxgal-lbd. Όπως φαίνεται από την εικόνα, η µετάλλαξη I346F κατακρατείται σε υψηλότερο ποσοστό, συγκρίσιµο µε αυτό του άγριου τύπου, από τα σφαιρίδια γλουταθειόνης σε σύγκριση µε τις υπόλοιπες µεταλλάξεις, οι οποίες εµφανίζουν σαφώς µειωµένη την ικανότητα αλληλεπίδρασης µε τον GST-PGC-1. Οι µεταλλάξεις R226G, L220Q και I338F φαίνεται να κατακρατούνται σε παρόµοιο βαθµό. Εξ άλλου, στο Σχ.26, όπου εξετάζεται η κατακράτηση των pcdna3.1-lbd µορίων στα σφαιρίδια γλουταθειόνης, η µετάλλαξη I346F φαίνεται και πάλι να κατακρατείται από τα σφαιρίδια σε βαθµό συγκρίσιµο µε αυτόν του άγριου τύπου, σε αναλογία µε ό,τι παρατηρείται στο Σχ.25, ενώ αντίθετα, η µετάλλαξη pcdna3.1- LBD I338F δείχνει να διαθέτει µια σαφώς αυξηµένη ικανότητα αλληλεπίδρασης µε τον PGC-1(αα 91-408) σε σχέση µε το αντίστοιχο pcmxgal-lbd µόριο. Βέβαια, και σε αυτήν την περίπτωση, η παρατηρούµενη αλληλεπίδραση της µετάλλαξης I338F µε τον PGC-1(αα 91-408) είναι ασθενέστερη από την αντίστοιχη αλληλεπίδραση της I346F µε το χιµαιρικό µόριο του συνενεργοποιητή. Παρά τις 3, τουλάχιστον, ανεξάρτητες επαναλήψεις των πειραµάτων αυτού του τύπου για κάθε κατηγορία µορίων, στάθηκε αδύνατο να ανιχνευθεί µε το συγκεκριµένο σύστηµα η αναµενόµενη, σύµφωνα µε τη µεταγραφική ανάλυση, πρωτεϊνική αλληλεπίδραση της σηµειακής µετάλλαξης R226G µε τον PGC-1(αα 91-123

Σχ.25. Αποτέλεσµα in vitro αλληλεπίδρασης των pcmxgal-lbd σηµειακών µεταλλάξεων µε το µάρτυρα (GST πρωτεΐνη, αριστερά κάτω), και µε τον GST-PGC-1 (αα 91-408) (δεξιά κάτω). Η εικόνα παρουσιάζει ένα αντιπροσωπευτικό από τρία τουλάχιστον, σε κάθε περίπτωση, Western blot µε anti-gal4 αντίσωµα, όπου φαίνεται ότι η σηµειακή µετάλλαξη I346F κατακρατείται από τα σφαιρίδια γλουταθειόνης, που φέρουν δεσµευµένο τον GST-PGC-1 (αα 91-408), σε επίπεδα συγκρίσιµα µε τον άγριο τύπο (AT). Ακολουθούν οι µεταλλάξεις R226G, L220Q και I338F. Κύτταρα της σειράς HEK 293-T επιµολύνθηκαν µε 18 µg των αντίστοιχων πλασµιδίων και, αφού επιβεβαιώθηκε ότι τα pcmxgal-lbd µόρια εκφράζονται σε παρόµοια επίπεδα (επάνω), ορισµένη ποσότητα από το κάθε εκχύλισµα χρησιµοποιήθηκε σε in vitro επώαση µε σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης, όπου είχαν προηγουµένως δεσµευτεί οι αντίστοιχες GST πρωτεΐνες, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Fig.25. In vitro interactions of the pcmxgal-lbd wild type or indicated point mutants with GST protein alone (lower left panel) or GST-PGC-1 (αα 91-408) fusion protein (lower right panel). A representative of at least three independent experiments is shown in each case. The membrane was incubated with an anti-gal4 antibody, following electrophoretic separation of the protein complexes formed on glutathione agarose beads, where the respective proteins were bound. Mutant I346F is retained by GST-PGC-1 (αα 91-408) at levels comparable to those of the wild type, followed by R226G, L220Q and I338F. The pcmxgal-lbd constructs are expressed at comparable levels, as shown at the top. 124

Σχ.26. Αποτέλεσµα in vitro αλληλεπίδρασης των pcdna3.1-lbd σηµειακών µεταλλάξεων µε την GST πρωτεΐνη και τον GST-PGC-1 (αα 91-408). Η εικόνα παρουσιάζει ένα αντιπροσωπευτικό από τρία τουλάχιστον, σε κάθε περίπτωση, Western blot µε anti- HNF-4α αντίσωµα, όπου φαίνεται ότι η σηµειακή µετάλλαξη I346F κατακρατείται από τα σφαιρίδια γλουτθειόνης, που φέρουν δεσµευµένο τον GST-PGC-1 (αα 91-408), σε επίπεδα συγκρίσιµα µε τον άγριο τύπο (HNF-4α). Σχεδόν εξ ίσου καλά κατακρατείται και η µετάλλαξη I338F. Κύτταρα της σειράς HEK 293-T επιµολύνθηκαν µε 18 µg των αντίστοιχων πλασµιδίων και, αφού επιβεβαιώθηκε ότι τα pcmxgal-lbd µόρια εκφράζονται σε παρόµοια επίπεδα (επάνω), ορισµένη ποσότητα από το κάθε εκχύλισµα χρησιµοποιήθηκε σε in vitro επώαση µε σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης, όπου είχαν προηγουµένως δεσµευτεί οι αντίστοιχες GST πρωτεΐνες, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Fig.26. In vitro interactions of the pcdna3.1-lbd wild type or indicated point mutants with GST or GST-PGC-1 (αα 91-408). A representative of at least three independent experiments is shown in each case. The membrane was incubated with an anti- HNF-4α antibody, following electrophoretic separation of the protein complexes formed on glutathione agarose beads, where the respective proteins were bound. Mutant I346F is retained by GST-PGC-1 (αα 91-408) at levels comparable to those of the wild type, and I338F is retained almost equally well. The pcdna3.1-lbd constructs are expressed at comparable levels, as shown at the top. 125

408). Για το σκοπό αυτό υιοθετήθηκε µία εναλλακτική µέθοδος διερεύνησης της συγκεκριµένης αλληλεπίδρασης, στο in vivo σύστηµα µελέτης που ακολουθεί. β. In vivo µελέτη Το σύστηµα αυτό στηρίζεται, όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, στην ικανότητα της στρεπταβιδίνης να αλληλεπιδρά ειδικά µε βιοτινυλιωµένα υποστρώµατα, δεσµεύοντάς τα επιλεκτικά από το κυτταρικό εκχύλισµα. Οι ισχυρές αλληλεπιδράσεις, που αναπτύσσονται ανάµεσα στη στρεπταβιδίνη και τις βιοτινυλιωµένες πρωτεΐνες, µπορούν εποµένως να χρησιµοποιηθούν ως εργαλείο για την αποµόνωση, µαζί µε τις συγκεκριµένες πρωτεΐνες, µορίων µε τα οποία αυτές αλληλεπιδρούν in vivo. Για το σκοπό αυτό στην παρούσα µελέτη κλωνοποιήθηκε το µόριο του συνενεργοποιητή PGC-1 στο φορέα pcdna3.1-bio, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους, και πραγµατοποιήθηκαν συνεπιµολύνσεις κυττάρων της σειράς HEK 293-T µε τον Bio-PGC-1, ο οποίος εκφράζει το επιτόπιο βιοτινυλίωσης στο αµινοτελικό άκρο του µορίου, και µε τη σηµειακή µετάλλαξη R226G, κλωνοποιηµένη στα πλαίσια ολόκληρου του µορίου του HNF-4α (pcdna3.1-lbd). Στις επιµολύνσεις συµπεριλήφθη, όπως αναφέρεται στις Μεθόδους, και το πλασµίδιο έκφρασης της - βακτηριακής προέλευσης - λιγάσης βιοτίνης, που επιτελεί τη βιοτινυλίωση των σχετικών υποστρωµάτων στα κύτταρα. Στο Σχ.27 αναλύονται τα αποτελέσµατα του συνολικού πειράµατος. Ειδικότερα, στο επάνω µέρος της εικόνας (Σχ.27Α) φαίνεται το αποτέλεσµα επώασης µεµβράνης, όπου έχει αναλυθεί ηλεκτροφορητικά δείγµα πυρηνικών εκχυλισµάτων, µε δύο διαφορετικά µόρια: στην πρώτη περίπτωση µε αντίσωµα κατά του HNF-4α, το οποίο ανιχνεύει τον άγριο τύπο ή τη µετάλλαξη pcdna3.1-lbd R226G στα αντίστοιχα πυρηνικά εκχυλίσµατα, και στη δεύτερη περίπτωση µε πολυµερές στρεπταβιδίνης, το οποίο ανιχνεύει ειδικά τη βιοτινυλιωµένη µορφή του PGC-1, όπως προαναφέρθηκε. Πράγµατι, όπως φαίνεται στην εικόνα, οι επιθυµητές πρωτεΐνες εκφράζονται κανονικά στα εκχυλίσµατα των επιµολυσµένων κυττάρων. Εξαίρεση αποτελεί η έκφραση της βιοτινυλιωµένης µορφής του PGC-1 στο εκχύλισµα κυττάρων τα οποία δεν επιµολύνθηκαν µε το φορέα της λιγάσης βιοτίνης, οπότε στα κύτταρα αυτά δεν ήταν δυνατή η βιοτινυλίωση του PGC-1 (Σχ.27Α). Στη συνέχεια ακολουθεί επώαση των εκχυλισµάτων µε σφαιρίδια στρεπταβιδίνης. Όπως φαίνεται στο κάτω µέρος της εικόνας (Σχ.27Β), ανάµεσα 126

Σχ.27. Α. Η εικόνα παρουσιάζει Western blot, όπου έχει ελεγχθεί η έκφραση του HNF-4α (ΑT, R226G) µε anti-hnf-4α αντίσωµα και του Bio-PGC1 µε πολυµερές στρεπταβιδίνης. Κύτταρα της σειράς HEK-293T επιµολύνθηκαν µε 5 µg καθενός από τους φορείς έκφρασης pcdna3.1-lbd HNF-4α, Bio-PGC-1, και της λιγάσης βιοτίνης BirA. Στη δεύτερη διαδροµή της πηκτής έχει αναλυθεί εκχύλισµα κυττάρων, τα οποία επιµολύνθηκαν µε τους φορείς pcdna3.1-hnf-4α ΑΤ και Bio-PGC-1, χωρίς το φορέα της λιγάσης. Β. Ορισµένη ποσότητα εκχυλίσµατος χρησιµοποιήθηκε σε επωάσεις µε σφαιρίδια στρεπταβιδίνης-αγαρόζης, όπου κατακρατούνται οι βιοτινυλιωµένες πρωτεΐνες. Το έκλουσµα των σφαιριδίων αναλύθηκε ηλεκτροφορητικά σε 8% αποδιατακτική πηκτή SDSπολυακρυλαµίδης και η µεµβράνη υβριδίστηκε µε anti-hnf-4α αντίσωµα. Ο HNF-4α κατακρατείται από τα σφαιρίδια εφ όσον αλληλεπιδρά in vivo µε τον Bio-PGC-1, γεγονός που παρατηρήθηκε τόσο για τη µετάλλαξη R226G όσο και για τον άγριο τύπο. Fig.27. A. Western blot to monitor expression of the HNF-4α and Bio-PGC-1 proteins in the nuclear extracts of cells transfected with pcdna3.1-lbd HNF-4α, Bio-PGC-1 and BirA ligase (5 µg each). The membrane was incubated with an anti-hnf-4α antibody, stripped and re-probed with an HRP-conjugated streptavidin polymer, which is highly specific for biotinylated proteins. In the second lane was included extract from cells that were transfected with pcdna3.1-lbd HNF-4α WT and Bio-PGC-1, in the absence of BirA ligase. B. Nuclear extracts were incubated with streptavidin beads. Mutant R226G was retained on streptavidin, as evidenced by electrophoretic separation of the complexes that were eluted from the beads on a 8% SDS-polyacrylamide gel, followed by Western blot with an anti-hnf-4α antibody. HNF-4α must form a complex in vivo with the biotinylated form of PGC-1 in order to be retained by the beads. 127

στις πρωτεΐνες που εκλούονται από τα σφαιρίδια στρεπταβιδίνης, έπειτα από πολύωρη επώαση των σφαιριδίων µε τα σχετικά πυρηνικά εκχυλίσµατα, περιλαµβάνεται ο HNF-4α άγριου τύπου, αλλά, σε µικρότερο βαθµό, και η µετάλλαξη R226G. Η παρατήρηση αυτή προκύπτει έπειτα από ηλεκτροφορητική ανάλυση των πρωτεϊνών που εκλούονται από τα σφαιρίδια στρεπταβιδίνης και επώαση της αντίστοιχης µεµβράνης µε αντίσωµα κατά του HNF-4α, και επιβεβαιώνει, πέρα από κάθε αµφιβολία, τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης της µετάλλαξης R226G µε το συνενεργοποιητή PGC-1 in vivo, ερµηνεύοντας µε αυτόν τον τρόπο την παρατηρούµενη λειτουργική αλληλεπίδραση των δύο µορίων σε συστήµατα παροδικής επιµόλυνσης κυττάρων, στα πλαίσια µελετών µεταγραφικής ενεργοποίησης. III. Λειτουργικές αλληλεπιδράσεις του HNF-4α µε µόρια των συνενεργοποιητών: διερεύνηση της σηµασίας άλλων περιοχών εκτός από την κοιλότητα πρόσδεσης του ενδογενούς συνδέτη Τέλος, στα πλαίσια διερεύνησης των λειτουργικών αλληλεπιδράσεων του HNF-4α µε τα µόρια των συνενεργοποιητών, έγινε προσπάθεια να επεκταθούν οι σχετικές παρατηρήσεις, από µεµονωµένα αµινοξέα της κοιλότητας πρόσδεσης του συνδέτη, που είναι σηµαντικά, σε ευρύτερες περιοχές της AF-2 περιοχής, που είναι ιδιαίτερης σηµασίας για αυτού του είδους τις αλληλεπιδράσεις. Για το σκοπό αυτό εξετάστηκε η δυνατότητα ορισµένων GAL-4 ελλειµµατικών µεταλλάξεων του HNF- 4α να ενισχύονται µεταγραφικά από τους συνενεργοποιητές PGC-1 και SRC-3. Τα αποτελέσµατα αυτής της ανάλυσης φαίνονται στα Σχ.28 και 29. Παρόµοια αποτελέσµατα παρατηρούνται σε γενικές γραµµές και µε τους δύο συνενεργοποιητές, αν και είναι φανερό ότι ο PGC-1 είναι σε θέση να ενισχύει λειτουργικά τον HNF-4α σε πολύ µεγαλύτερο βαθµό από ότι ο SRC-3, κάτι το οποίο παρατηρήθηκε και στα πειράµατα συνεπιµόλυνσης µε τους συνενεργοποιητές και τις σηµειακές µεταλλάξεις pcmxgal-lbd (σύγκρ. Σχ.16,17). Στα Σχ.28 και 29 φαίνεται κατ αρχήν ότι απαλοιφή της περιοχής F, που βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο του µορίου, στη µετάλλαξη GAL-D2CD1, συνεπάγεται αύξηση της µεταγραφής του γονιδίου αναφοράς σε σχέση µε τη µεταγραφή που επάγεται από το άγριου τύπου µόριο HNF-4α, ακόµη και κατά την απουσία συνενεργοποιητή, παρά την ταυτόχρονη απαλοιφή της περιοχής 128

ενεργοποίησης AF-1 (αα 1-24). Επιπλέον, η συγκεκριµένη µετάλλαξη διαθέτει τη δυνατότητα ενίσχυσης της µεταγραφής κατά 20 φορές παρουσία του συνενεργοποιητή PGC-1, προφανώς µέσω λειτουργικών αλληλεπιδράσεων µε το µόριο αυτό (παρατ. διαφορά στις κλίµακες, απουσία και παρουσία συνενεργοποιητή). Περαιτέρω απαλοιφή αµινοξέων ως τη θέση 140 του µεταγραφικού παράγοντα (µετάλλαξη GAL-D3CD1) δεν επηρεάζει καθόλου τον παρατηρούµενο φαινότυπο σε σχέση µε την προηγούµενη µετάλλαξη, καθώς το µόριο διατηρεί παρόµοιο ποσοστό ενεργότητας τόσο απουσία όσο και παρουσία του PGC-1 (π.χ. ενίσχυση κατά 21,5 φορές, έναντι 20 φορών στην περίπτωση της µετάλλαξης GAL- D2CD1). Η µετάλλαξη GAL-D3CD1 εξ άλλου εµφανίζει ενίσχυση της ενεργότητας κατά 2,5 περίπου φορές παρουσία του συνενεργοποιητή SRC-3, σε σχέση µε την ενεργότητα που εµφανίζει απουσία SRC-3. Από την άλλη πλευρά η µετάλλαξη GAL-D4CD1, η οποία περιλαµβάνει τα αµινοξέα 151-370 του HNF-4α και εµφανίζει ακόµη υψηλότερη δραστικότητα απουσία συνενεργοποιητών σε σχέση µε τις δύο προηγούµενες µεταλλάξεις, όπως ήταν αναµενόµενο µε βάση παλιότερες παρατηρήσεις από το εργαστήριό µας (Hadzopoulou-Cladaras et al., 1997), εµφανίζει µειωµένη ικανότητα ενίσχυσης της µεταγραφής τόσο παρουσία του PGC-1 όσο και του SRC-3, σε σχέση µε τις µεταλλάξεις GAL-D2CD1 και D3CD1 (3,4 και 1,7 φορές αντίστοιχα). Η παρατήρηση αυτή, βεβαίως, θα µπορούσε να ερµηνευθεί βάσει κορεσµού του συστήµατος αναφοράς (υπερακετυλίωση του υποστρώµατος), το οποίο ενδεχοµένως δε δύναται να αποδώσει µία ενίσχυση της µεταγραφής πάνω από τα παρατηρούµενα όρια. Υπέρ αυτής της άποψης συνηγορεί άλλωστε και η παρατήρηση ότι η µετάλλαξη GAL- D5CD1 (αα 160-370), µε πολύ χαµηλότερο ποσοστό ενεργότητας απουσία συνενεργοποιητών σε σχέση µε τα τρία προηγούµενα µόρια, ανακτά δυναµικό ενίσχυσης, παρουσία PGC-1 και SRC-3, παρόµοιο µε αυτό της µετάλλαξης D3CD1 (20,7 και 3 φορές, έναντι 21,5 και 2,7 φορών αντίστοιχα). Αυτό είναι συντριπτικά υψηλότερο από το ποσοστό ενίσχυσης της µετάλλαξης D4CD1, που συζητήθηκε αµέσως παραπάνω. Τέλος, σηµαντική είναι η παρατήρηση ότι απαλοιφή µόλις των 15 επόµενων αµινοξέων στη µετάλλαξη GAL-D6CD1 (αα 175-370, έναντι 160-370 στην GAL- D5CD1) οδηγεί σε πλήρη εξάλειψη τόσο της µεταγραφικής ενεργοποίησης απουσία συνενεργοποιητών, όσο και ενεργοποίησης της µεταγραφής παρουσία τους, γεγονός που παρατηρείται και για τους δύο συνενεργοποιητές που εξετάστηκαν (PGC-1, 129

Σχ.28, SRC-3, Σχ.29). Η ενεργότητα δεν επανακάµπτει ούτε στην περίπτωση της µετάλλαξης GAL-D7CD1, που περιλαµβάνει περαιτέρω απαλοιφή των αµινοξέων ως τη θέση 241 του µορίου του HNF-4α. Η τελευταία αυτή παρατήρηση σχετικά µε τον καθοριστικό ρόλο της περιοχής D, και ειδικότερα των αµινοξέων 160-175, στην ενίσχυση της µεταγραφής από µόρια των συνενεργοποιητών έρχεται να προστεθεί σε έναν αριθµό πρόσφατων µελετών, που επισηµαίνουν τον καθοριστικό ρόλο της D περιοχής στα µόρια και άλλων πυρηνικών υποδοχέων (βλ. Συζήτηση). 130

Σχ. 28. Αποτελέσµατα συνεπιµόλυνσης κυττάρων της σειράς HepG2 µε τους φορείς έκφρασης των ελλειµµατικών µεταλλάξεων GAL-HNF-4α D2CD1-D7CD1, το γονίδιο αναφοράς G 5 CAT και το συνενεργοποιητή PGC-1. Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς, 0,2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων και 1,25 µg του συνενεργοποιητή ή του αντίστοιχου άδειου φορέα (pcdna 3.1). Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα κάθε µετάλλαξης σε σχέση µε τον άγριο τύπο. Οι σκουρόχρωµες ράβδοι αναφέρονται στη δραστικότητα των µεταλλάξεων απουσία PGC-1, ενώ οι ανοικτόχρωµες σε αυτήν παρουσία του συνενεργοποιητή. Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Είναι φανερή από το διάγραµµα η σηµασία των αµινοξέων 160-175 της D περιοχής για τη µεταγραφική ενεργοποίηση του HNF-4α, καθώς και για την ενίσχυση της δραστικότητάς του από τον PGC-1. Fig.28. The reporter plasmid G 5 CAT (3 µg) was transfected into HepG2 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type or indicated GAL-HNF- 4α D2CD1-D7CD1 deletion constructs (0.2 µg each), in the presence or absence of coactivator. Open bars represent transfections with 1.25 µg of PGC-1 expression vector, whereas closed bars indicate transfections with 1.25 µg of empty vector instead. The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). The importance of residues 160-175 of the D domain for transactivation by HNF-4α and enhancement of its activity through PGC-1 is obvious. 131

Σχ. 29. Αποτελέσµατα συνεπιµόλυνσης κυττάρων της σειράς HepG2 µε τους φορείς έκφρασης των ελλειµµατικών µεταλλάξεων GAL-HNF-4α D2CD1-D7CD1, το γονίδιο αναφοράς G 5 CAT και το συνενεργοποιητή SRC-3. Στις επιµολύνσεις χρησιµοποιήθηκαν 3 µg του γονιδίου αναφοράς, 0,2 µg των σηµειακών µεταλλάξεων και 1,25 µg του συνενεργοποιητή ή του αντίστοιχου άδειου φορέα (pcmxgal). Τα αποτελέσµατα είναι εκφρασµένα ως η σχετική CAT δραστικότητα κάθε µετάλλαξης σε σχέση µε τον άγριο τύπο. Οι σκουρόχρωµες ράβδοι αναφέρονται στη δραστικότητα των µεταλλάξεων απουσία SRC-3, ενώ οι ανοικτόχρωµες σε αυτήν παρουσία του συνενεργοποιητή. Οι τιµές έχουν εξοµαλυνθεί ως προς β- gal, δεδοµένου ότι σε κάθε επιµόλυνση συµπεριλήφθη και 1 µg του πλασµιδίου CMV β-gal, και αντιπροσωπεύουν το µέσο όρο (±τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραµάτων. Είναι φανερή από το διάγραµµα η σηµασία των αµινοξέων 160-175 της D περιοχής για τη µεταγραφική ενεργοποίηση του HNF-4α, καθώς και για την ενίσχυση της δραστικότητάς του από τον SRC-3. Fig.29. The reporter plasmid G 5 CAT (3 µg) was transfected into HepG2 cells with pcmv β-gal (1 µg) and effector plasmids expressing the wild type or indicated GAL-HNF- 4α D2CD1-D7CD1 deletion constructs (0.2 µg each), in the presence or absence of coactivator. Open bars represent transfections with 1.25 µg of SRC-3 expression vector, whereas closed bars indicate transfections with 1.25 µg of empty vector instead. The normalized CAT activity (±S.E.M.) of three independent experiments is expressed relative to the wild type activity (WT: 100%). The importance of residues 160-175 of the D domain for transactivation by HNF-4α and enhancement of its activity through SRC-3 is obvious. 132

ΣΥΖΗΤΗΣΗ 133

I. Η αναγκαιότητα λειτουργικής µελέτης της LBD περιοχής του HNF-4α Θα µπορούσε κανείς να ισχυριστεί πως κάθε µελέτη µεταγραφικών παραγόντων, που πραγµατεύεται τη σχέση δοµής λειτουργίας στο µόριό τους, στην πραγµατικότητα στοχεύει σε µία ερώτηση: τι σηµαίνει ενεργοποίηση της µεταγραφής στο µοριακό επίπεδο, µε άλλα λόγια πώς ερµηνεύεται δοµικά, στο χώρο, η ικανότητα των µεταγραφικών παραγόντων να προσαρµόζουν τη δραστηριότητά τους στην παρουσία και τις δραστηριότητες άλλων µορίων, έτσι ώστε να προκύπτει τελικά αυτό που εµείς αντιλαµβανόµαστε ως αύξηση της µεταγραφής των γονιδίων-στόχων. Μία «έκρηξη» κρυσταλλογραφικών µελετών στα µέσα της προηγούµενης δεκαετίας προσδιόρισε µε αρκετή ακρίβεια τη δοµική βάση των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών, τα οποία µεταγραφικές µελέτες είχαν αποκαλύψει ότι ισχύουν στην περίπτωση των πυρηνικών υποδοχέων. Η οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων, µε καθοριστική σηµασία για την ανάπτυξη και φυσιολογία ενός φάσµατος οργανισµών που εκτείνονται από τα έντοµα ως τον άνθρωπο, διαθέτει σήµερα πολλά µέλη, των οποίων η κρυσταλλική δοµή, ως µονοµερών ή διµερών, συζευγµένων µε τους συνδέτες τους ή όχι, είναι καλά χαρακτηρισµένη (Bourguet et al., 1995, Renaud et al., 1995, Wagner et al., 1995, Williams & Sigler, 1998, Nolte et al., 1998). Επιπλέον, στην περίπτωση ορισµένων µελών της οικογένειας, όπως ο υποδοχέας του οιστρογόνου, κρυσταλλογραφικές µελέτες έχουν προσφέρει µία δοµική ερµηνεία σχετικά µε την ύπαρξη συνδετών, οι οποίοι έχουν την ικανότητα να δρουν ως θετικοί ρυθµιστές της µεταγραφής µέσω σύνδεσής τους µε τους αντίστοιχους υποδοχείς (αγωνιστές), και άλλων, οι οποίοι δρουν αρνητικά καταστέλλοντας τη µεταγραφή (ανταγωνιστές) (Brzozowski et al., 1997). Οι αγωνιστές και ανταγωνιστές δρουν επηρεάζοντας τη δοµή της καρβοξυτελικής περιοχής των υποδοχέων µε τέτοιον τρόπο ώστε να επιτρέπουν ή όχι την αλληλεπίδραση µε άλλα ρυθµιστικά µόρια της µεταγραφής (συνενεργοποιητές και συγκαταστολείς) (Gronemeyer & Miturski, 2001). Το σύνολο των παραπάνω κρυσταλλογραφικών µελετών αποκάλυψε ότι η ενεργοποίηση ή καταστολή της µεταγραφής των γονιδίων-στόχων δεν είναι παρά το αποτέλεσµα της στερεοχηµικής «αλλοίωσης» επιφανειών από τη µια και ταυτόχρονης δηµιουργίας νέων επιφανειών από την άλλη, ως αποτέλεσµα της παρουσίας ή µη διαφόρων µορίων, που εµπλέκονται στην ενεργοποίηση της µεταγραφής. ηλαδή στο µοριακό επίπεδο η µεταγραφική ενεργοποίηση µεταφράζεται ως η συνισταµένη ενός περισσότερο ή λιγότερο πολύπλοκου συνόλου αλληλεπιδράσεων στο χώρο. 134

Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας η προσπάθεια αποκρυπτογράφησης αυτών των κρίσιµων λειτουργικών αλληλεπιδράσεων οδήγησε στη διεξαγωγή µιας συστηµατικής µελέτης µεταλλαξιγένεσης για την ιδιαίτερη περίπτωση του µεταγραφικού παράγοντα HNF-4α. Η ιδιαιτερότητα αυτού του µέλους της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων έγκειται στο ότι, από όσο είναι γνωστό, ο HNF-4 δε διαφοροποιεί τη δραστηριότητά του ως απόκριση στην παρουσία εξωγενών µορίων-συνδετών, όπως έχει δειχτεί ότι ισχύει για την πλειοψηφία των υπολοίπων µελών της οικογένειας, αλλά αντιθέτως φαίνεται να δρα ως «ιδιοσυστατικός» ενεργοποιητής της µεταγραφής (constitutive activator), δηλαδή ενεργοποιεί τη µεταγραφή ελλείψει προσθήκης οποιουδήποτε εξωγενούς µορίου. Εποµένως, στην περίπτωση του HNF-4α ήταν ιδιαίτερα ενδιαφέρον να µελετηθεί κατά πόσο οι επιφάνειες αλληλεπίδρασης, που σχηµατίζει το µόριο αυτό, εµφανίζουν οµολογία µε αυτές που δηµιουργούνται στα µόρια πυρηνικών υποδοχέων µε καλά χαρακτηρισµένους συνδέτες. ιαφορετικά, είχε ενδιαφέρον να µελετηθεί κατά πόσο η λειτουργία των διαφόρων ορφανών και µη πυρηνικών υποδοχέων µπορεί να ερµηνευτεί ως το αποτέλεσµα παρόµοιων λειτουργικών αλληλεπιδράσεων στο χώρο. II. Επίδραση µεταλλάξεων στην έλικα 5 της LBD περιοχής του HNF-4α Από τις πρώτες ακόµη µεταγραφικές µελέτες των πυρηνικών υποδοχέων (Bocquel et al., 1989) ήταν γνωστό ότι η ενεργότητα των υποδοχέων εξαρτάται από την παρουσία δύο περιοχών ενεργοποίησης (Activation Functions, AFs) στο µόριό τους. Η χαρακτηριστική διαφορά των δύο περιοχών ενεργοποίησης ήταν κατά πόσο η καθεµιά από αυτές ενεργοποιείται ανεξάρτητα, ή έπειτα από, την παρουσία ενός µορίου-συνδέτη στον υποδοχέα. Έτσι, η AF-1 περιοχή που εστιάζεται στο αµινοτελικό άκρο των υποδοχέων έχει το ρόλο ενός όξινου ενεργοποιητή, ο οποίος έχει την ιδιότητα να επάγει τη µεταγραφή ανεξάρτητα από την παρουσία συνδέτη. Αντίθετα, η AF-2 περιοχή στο ακριβώς αντίθετο άκρο του µορίου λειτουργεί ως ευαίσθητος στην παρουσία του συνδέτη «διακόπτης», που υφίσταται δραµατικές αλλαγές κατά την πρόσδεση των εξωγενών συνδετών οδηγώντας στη λειτουργικά ενεργό µορφή της περιοχής. Η περιοχή αποκτά στη συνέχεια την ιδιότητα να αλληλεπιδρά µε µεταγραφικούς συνενεργοποιητές (Renaud et al., 1995, Wurtz et al., 1996, Moras & Gronemeyer, 1998, Gronemeyer & Miturski, 2001). Ο τρόπος µε τον οποίο γίνεται η µετάβαση από τη λειτουργικά ανενεργό στην ενεργό µορφή των πυρηνικών υποδοχέων είναι µέσω πρόσδεσης του συνδέτη σε µια 135

κοιλότητα κοντά στο καρβοξυτελικό τους άκρο (περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη, LBD). Κρυσταλλογραφικές µελέτες αποκάλυψαν πως η LBD περιοχή αποκτά τη διαµόρφωσή της στο χώρο µέσω της δηµιουργίας 12 α-ελίκων και µίας β-στροφής, που σχηµατίζουν µια κοιλότητα, όπου ακριβώς δεσµεύεται ο συνδέτης. Η συµµετοχή υδρόφοβων αµινοξέων από τις διάφορες έλικες συνεπάγεται τον υδρόφοβο χαρακτήρα της κοιλότητας αυτής σε όλους τους πυρηνικούς υποδοχείς. Αυτό προϋποθέτει, βεβαίως, τον υδρόφοβο χαρακτήρα των µορίων, τα οποία χρησιµεύουν ως συνδέτες για αυτήν τη µεγάλη οικογένεια µεταγραφικών παραγόντων. Σύγκριση της δοµής της LBD περιοχής των υποδοχέων κατά την απουσία ή παρουσία των συνδετών τους αποκάλυψε ορισµένες χαρακτηριστικές διαφορές στη διαµόρφωση µεταξύ των συζευγµένων και µη συζευγµένων µορφών. Ειδικότερα, οι έλικες 11 και 12 φάνηκε να κατέχουν πολύ διαφορετικές θέσεις στις επιµέρους µορφές, µε ταυτόχρονες αλλαγές και σε άλλες έλικες, όπως η έλικα 3 ή η περιοχή µεταξύ 1 και 3 (omega loop) στους υποδοχείς των ρετινοϊκών οξέων. Τα αποτελέσµατα αυτά οδήγησαν στη διατύπωση του, κλασσικού πλέον, «µοντέλου της ποντικοπαγίδας» (Renaud et al., 1995, Wurtz et al., 1996). Το µοντέλο περιγράφει τη «σύλληψη» του συνδέτη στο εσωτερικό της υδρόφοβης κοιλότητας του υποδοχέα έπειτα από αλλαγές, που τελικά οδηγούν στη δηµιουργία µιας νέας επιφάνειας αλληλεπίδρασης των υποδοχέων µε τους συνενεργοποιητές της µεταγραφής. Στην παρούσα µελέτη επιχειρήθηκε, κατ αρχήν, η διερεύνηση αµινοξέων, τα οποία θα ήταν δυνατόν να συµµετέχουν στο σχηµατισµό της κοιλότητας πρόσδεσης ενός άγνωστου ακόµη τότε συνδέτη στο µόριο του HNF-4α. Το σκεπτικό ήταν πως, αν υπήρχε ενδογενής συνδέτης για τον HNF-4α, αυτός θα έπρεπε να συνδέεται σε µία κοιλότητα µε παρόµοια χαρακτηριστικά όπως αυτά που παρατηρούνται στην περίπτωση των υπόλοιπων µορίων των πυρηνικών υποδοχέων. Για το σκοπό αυτό µεταλλάχθηκαν επιλεγµένα αµινοξέα, τα οποία είχε δειχθεί είτε µέσω της κρυσταλλογραφίας είτε µέσω µελετών µεταλλαξιγένεσης να διαδραµατίζουν έναν καθοριστικό ρόλο στην ενεργότητα της LBD περιοχής οµόλογων προς τον HNF-4α υποδοχέων. Ο ρόλος των παραπάνω αµινοξέων είχε βρεθεί ότι σχετιζόταν είτε µε την ανάπτυξη απευθείας επαφών µε το µόριο του συνδέτη είτε µε την ανάπτυξη επαφών µε άλλα αµινοξέα, οι οποίες συντελούν στη διατήρηση της ενεργού διαµόρφωσης. Συγκεκριµένα, η πρώτη κρυσταλλογραφική µελέτη της LBD περιοχής ενός συζευγµένου µε συνδέτη πυρηνικού υποδοχέα, η οποία δηµοσιεύτηκε στα µέσα της προηγούµενης δεκαετίας, ήταν αυτή του ανθρώπινου (h)rarγ (Renaud et al., 1995). 136

Η µελέτη αυτή έριξε φως σε συγκεκριµένα αµινοξέα, που είναι σηµαντικά για την αλληλεπίδραση µε το συνδέτη στο µόριο ενός πυρηνικού υποδοχέα, καθώς και για την καθοδήγηση του συνδέτη στη σωστή του θέση µέσα στην κοιλότητα πρόσδεσης (Ligand-Binding Pocket, LBP). Το µοντέλο, το οποίο πρότειναν οι ερευνητές συγκρίνοντας τη δοµή του holo-rarγ (δηλαδή του υποδοχέα RARγ, που είχε κρυσταλλωθεί παρουσία του συνδέτη του) µε αυτήν του apo-rxrα (δηλαδή του υποδοχέα RXRα, που είχε κρυσταλλωθεί ελλείψει συνδέτη), περιέγραφε την ηλεκτροστατική έλξη της καρβοξυλικής οµάδας του ρετινοϊκού οξέος κατά µήκος µιας υδρόφοβης κατά κύριο λόγο κοιλότητας, προς το µέρος δύο θετικά φορτισµένων αµινοξέων, που εντοπίζονται στο αντίθετο άκρο της κοιλότητας: της αργινίνης (R)278 και της λυσίνης (K)236. Ελλείψει κρυστάλλωσης του ίδιου υποδοχέα στις δύο µορφές (apo-, απουσία συνδέτη, και holo, παρουσία συνδέτη), οι ερευνητές στηρίχτηκαν στη σύγκριση των οµόλογων υποδοχέων apo-rxrα και holo-rarγ για να προτείνουν το µοντέλο της «ποντικοπαγίδας» (Renaud et al., 1995, Wurtz et al., 1996). Εξ άλλου, µε βάση τις παρατηρήσεις από την κρυσταλλογραφία αλλά και µε βάση παλιότερες µελέτες µεταλλαξιγένεσης, που είχαν περιγραφεί σε µόρια στεροειδών υποδοχέων, προχώρησαν στην κατασκευή σηµειακών µεταλλάξεων στο µόριο RXRα του ποντικού (mrxrα), ώστε να ελέγξουν την υπόθεσή τους, σύµφωνα µε την οποία οµόλογα αµινοξέα είναι σηµαντικά για την πρόσδεση του συνδέτη στα διάφορα µόρια των πυρηνικών υποδοχέων (Wurtz et al., 1996). Προβλέποντας λοιπόν, µε βάση µία φυσική µετάλλαξη στο αµινοξύ V746 του ανθρώπινου υποδοχέα του ανδρογόνου (har V746M), ότι το αµινοξύ Ι315 στον mrxrα θα µπορούσε να επηρεάζει δραµατικά την απόκριση του συγκεκριµένου υποδοχέα στο 9-cis ρετινοϊκό οξύ, κατασκεύασαν µετάλλαξη του αντίστοιχου αµινοξέος σε αλανίνη. Η µετάλλαξη V746M είχε παρατηρηθεί ότι προκαλεί στον άνθρωπο το σύνδροµο ολικής αντίστασης στο ανδρογόνο, που χαρακτηρίζεται από ανικανότητα ρύθµισης του υποδοχέα AR ως απόκριση στην παρουσία της ορµόνης. Αντίστοιχα, η µετάλλαξη Ι315Α στον ποντικό εµφάνιζε µειωµένη συγγένεια για το ρετινοϊκό οξύ κατά 15 φορές, υπογραµµίζοντας τη σηµασία του οµόλογου αµινοξέος για τον mrxrα σε συµφωνία µε ό,τι παρατηρείται για τον har (Wurtz et al., 1996). Εξ άλλου, φυσική µετάλλαξη σε µία καλά συντηρηµένη αργινίνη του har, λίγα µόλις αµινοξέα πιο κάτω από τη θέση της προηγούµενης µετάλλαξης (R752Q), η οποία είχε παρατηρηθεί ότι προκαλεί στον άνθρωπο µια µορφή µερικής αντίστασης στο ανδρογόνο, ώθησε τους ερευνητές στην κατασκευή µίας ακόµη µετάλλαξης στο µόριο του mrxrα, και 137

συγκεκριµένα της µετάλλαξης R321Α, όπου η αργινίνη στη θέση 321 µετατράπηκε σε αλανίνη. Η µετάλλαξη αυτή του mrxrα εµφάνιζε µειωµένη κατά περισσότερες από 100 φορές την ικανότητα λειτουργικής απόκρισης στο 9-cis ρετινοϊκό οξύ, δηλαδή την ικανότητα ενεργοποίησης της µεταγραφής παρουσία του ρετινοϊκού οξέος. Το αποτέλεσµα αυτό δικαιολογείται από την κρυσταλλογραφία µε βάση την παρατήρηση ότι η οµόλογη αργινίνη στον ανθρώπινο υποδοχέα holo-rarγ (hrarγ R278) φάνηκε να έχει ιδιαίτερη σηµασία για τη σωστή καθοδήγηση του συνδέτη στην κοιλότητα πρόσδεσης του υποδοχέα. Τα οµόλογα αµινοξέα µε τα παραπάνω στον rhnf-4α είναι η λευκίνη (L)220 και η αργινίνη (R)226. Με βάση τα στοιχεία που αναφέρθηκαν και, ειδικά στην περίπτωση της R226, µε βάση την ευθυγράµµιση των αλληλουχιών πολλών πυρηνικών υποδοχέων, η οποία έδειξε ότι η αργινίνη αυτή είναι συντηρηµένη σε 10 από 16 πυρηνικούς υποδοχείς που εξετάστηκαν (Wurtz et al., 1996), τα συγκεκριµένα αµινοξέα του rhnf-4α επιλέχθηκαν για την εισαγωγή σηµειακών µεταλλάξεων. Κατ αυτόν τον τρόπο σχεδιάστηκε µετάλλαξη της L220 σε γλουταµίνη (Q) και της R226 σε γλυκίνη (G), µε το σκεπτικό ότι θα έπρεπε οι συγκεκριµένες αντικαταστάσεις να αλλάζουν ριζικά το χαρακτήρα του αµινοξέος στην αντίστοιχη θέση (από υδρόφοβο σε πολικό κι από φορτισµένο σε ουδέτερο), προκειµένου να διαπιστωθεί η σηµασία αυτών των αµινοξέων για τη λειτουργικότητα της περιοχής. Αυτό που προκύπτει από τα αποτελέσµατα της µελέτης είναι ότι και οι δύο µεταλλάξεις επιδρούν δραστικά στο δυναµικό ενεργοποίησης της περιοχής. Το γεγονός αυτό παρατηρήθηκε τόσο στα pcmxgal- όσο και στα pcdna3.1-lbd µόρια (τουλάχιστον στην περίπτωση της µετάλλαξης R226G, η οποία κλωνοποιήθηκε και µε τις δύο µορφές, καθώς η µετάλλαξη L220Q µελετήθηκε µόνο στην pcmxgal-µορφή). Εξ άλλου, τα ίδια αποτελέσµατα παρατηρήθηκαν τόσο σε COS-7 όσο και σε HepG2 κύτταρα. ηλαδή, οι συγκεκριµένες µεταλλάξεις επιδρούν καταλυτικά στο δυναµικό ενεργοποίησης της AF-2 περιοχής, ανεξαρτήτως έκφρασής τους σε χιµαιρικά µόρια ή σε ολόκληρο το µόριο του HNF-4α, και σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν, ανεξαρτήτως αν αυτές εκφράζουν ενδογενώς τον άγριο τύπο HNF-4α ή όχι (Σχ.10,11,23). Εξ άλλου, πειράµατα επιµόλυνσης κυττάρων HepG2, τα οποία εκφράζουν ενδογενώς τον άγριο τύπο HNF-4α, µε τη µετάλλαξη pcdna3.1-r226g έδειξαν ότι η συγκεκριµένη µετάλλαξη έχει την ικανότητα να επιδρά κατασταλτικά στη δράση του ίδιου του HNF-4α (Σχ.22). Το γεγονός αυτό µπορεί να ερµηνευτεί βάσει της ικανότητας «ετερο»διµερισµού µε τον 138

άγριο τύπο, που διαθέτει η µετάλλαξη R226G, όπως προκύπτει από τα πειράµατα µεταβολής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (E.M.S.A.), που φαίνονται στο Σχ.21. Η κατασταλτική δράση της συγκεκριµένης µετάλλαξης στη δραστικότητα του φυσικού µορίου άγριου τύπου δε θα µπορούσε να ερµηνευτεί διαφορετικά, π.χ. λόγω κορεσµού των κοινών θέσεων σύνδεσης του άγριου τύπου και της µετάλλαξης στον υποκινητή αποκλειστικά από τα διµερή της µετάλλαξης, κι αυτό γιατί η ποσότητα του υποκινητή, που προσφέρεται στα πειράµατα, είναι υπεραρκετή (3 µg) ώστε αυτός να λειτουργεί ως περιοριστικός παράγοντας. Μόνο αν ο υποκινητής προσφερόταν σε περιορισµένα ποσά, θα µπορούσε να ερµηνευτεί η παρατηρούµενη επίδραση της µετάλλαξης R226G ως αποτέλεσµα ανταγωνιστικού αποκλεισµού του HNF-4α άγριου τύπου από τις διαθέσιµες θέσεις σύνδεσης στον υποκινητή, κι αυτό γιατί, σε µια τέτοια περίπτωση, η µετάλλαξη, που θα υπερεκφραζόταν σε σχέση µε τον ενδογενή άγριο τύπο λόγω επιµόλυνσης, θα ήταν αρκετή για να καλύψει από µόνη της όλες τις προσφερόµενες θέσεις σύνδεσης. Καθώς όµως, όπως αναφέρθηκε, η ποσότητα του υποκινητή, που χρησιµοποιείται στα πειράµατα, είναι υπεραρκετή για να συµβεί κάτι τέτοιο, η παρατηρούµενη «απόσβεση» της δράσης του άγριου τύπου από τη σηµειακή µετάλλαξη R226G µπορεί να εξηγηθεί µόνο µέσω «καταπίεσης» της δράσης του άγριου τύπου, στα ετεροδιµερή που δηµιουργούνται µεταξύ αυτού και της µετάλλαξης. Η µετάλλαξη εποµένως εµφανίζει επικρατή αρνητικό φαινότυπο (dominant negative phenotype). Με βάση τα παραπάνω θα µπορούσε κανείς να υποθέσει ότι η παρατηρούµενη δραστική επίδραση των δύο σηµειακών µεταλλάξεων στην ενεργότητα της LBD περιοχής (και ολόκληρου) του HNF-4α οφείλεται σε δραµατικές αλλαγές, που αυτές οι αντικαταστάσεις αµινοξέων προκαλούν στην όλη δοµή του µορίου. Κάτι τέτοιο ωστόσο θα ήταν σαφώς έξω από τους στόχους της εργασίας και ανεπιθύµητο. Για το σκοπό αυτό διερευνήθηκε, µε τη βοήθεια κρυσταλλογραφικών µοντέλων, η επίδραση των µεταλλάξεων στη δοµή του µορίου προκειµένου να εξασφαλιστεί πως αλλαγή των συγκεκριµένων αµινοξέων δεν επηρεάζει δραµατικά το φαινότυπο όλου του µορίου, αλλά µάλλον οι δραστικές αλλαγές που παρατηρούνται στην ενεργότητα του υποδοχέα µπορούν να εξηγηθούν µέσω τοπικών διαταραχών στο µικροπεριβάλλον των αµινοξέων (Σχ.31,32,33). Τα αποτελέσµατα αυτά θα συζητηθούν αµέσως παρακάτω. Ενόσω τα πειράµατα που περιγράφτηκαν βρίσκονταν σε εξέλιξη, δηµοσιεύθηκαν, αρχικά η κρυσταλλική δοµή του πιο οµόλογου προς τον HNF-4 139

υποδοχέα, του RXRα, σε σύζευξη µε το φυσικό του συνδέτη, και στη συνέχεια οι δοµές του HNF-4γ και του ίδιου του HNF-4α (Σχ.30), ρίχνοντας σταδιακά φως στα ευρήµατα στα οποία µας οδηγούσαν τα πειράµατά µας (Egea et al., 2000, Wisely et al., 2002, Dhe-Paganon et al., 2002). Σχ.30. Η κρυσταλλική δοµή του LBD του HNF-4α (Dhe-Paganon et al., 2002). Σχηµατική αναπαράσταση του υποδοχέα, που κρυσταλλώθηκε ως οµοδιµερές, µε το ένα µόριο κάθε διµερούς να βρίσκεται στην «ανοιχτή» διαµόρφωση (η έλικα 11 είναι συνεχής και ενιαία µε την έλικα 10 και τόσο η έλικα 10 όσο και η έλικα 12 εκτείνονται προς το υγρό µέσο διάλυσης), ενώ το άλλο µόριο βρίσκεται στην «κλειστή» διαµόρφωση (η έλικα 12 «αναδιπλώνεται» φράσσοντας το στόµιο της κοιλότητας, όπου προσδένεται ο συνδέτης). Με µωβ χρώµα απεικονίζεται ο συνδέτης (ffa, µείγµα ελεύθερων λιπαρών οξέων), που βρέθηκε να περιέχεται σε κάθε µόριο ανεξάρτητα από την ανοιχτή ή κλειστή διαµόρφωση. Τα λιπαρά οξέα αποτελούν τους ενδογενείς συνδέτες του HNF-4α, δεδοµένου ότι η κρυστάλλωση του υποδοχέα έγινε χωρίς την προσθήκη οποιουδήποτε εξωγενούς µορίου. Fig.30. The HNF-4α LBD crystal structure (Dhe-Paganon et al., 2002). Shown is a ribbon diagram of the receptor LBD, which was crystallized as a homodimer. One molecule within each dimer is found in the open conformation (helix 12 extends into the solvent, contiguous with helix 10/11), whereas the other molecule adopts the closed conformation (helix 12 is folded back, sealing the ligand-binding cavity). The ligand (ffa, free fatty acid mixture), which is depicted in magenta, is contained in the pocket regardless of the open or closed conformation. Free fatty acids were shown to be the endogenous ligands for HNF-4α, given that the receptor was crystallized without addition of any exogenous molecules. 140

Κατ αρχήν, η επίλυση της κρυσταλλικής δοµής του holo-rxrα αποκάλυψε πως, και σε αυτήν την περίπτωση, η συντηρηµένη αργινίνη R316 της έλικας 5 διαδραµατίζει έναν καθοριστικό ρόλο στη «σύλληψη» και «αγκυροβόληση» του συνδέτη (9-cis ρετινοϊκού οξέος) στην LBP κοιλότητα, µέσω αλληλεπίδρασης της καρβοξυλικής οµάδας του οξέος µε τη θετικά φορτισµένη γουανιδική οµάδα της αργινίνης (Egea et al., 2000). ύο χρόνια αργότερα η επίλυση της κρυσταλλικής δοµής του HNF-4γ και του HNF-4α επιβεβαίωναν, όπως ήταν αναµενόµενο, την ύπαρξη παρόµοιας αλληλεπίδρασης και στον HNF-4 (R187 για τον HNF-4γ, Wisely et al., 2002, R226 για τον HNF-4α, Dhe-Paganon et al., 2002). III. Ο HNF-4 είναι ένας «ορφανός» υποδοχέας µε ενδογενείς συνδέτες Η επίλυση της κρυσταλλικής δοµής του HNF-4γ απέδειξε, για πρώτη φορά, ότι η LBD περιοχή του HNF-4 περικλείει µια κοιλότητα, κατ αναλογία µε την κοιλότητα πρόσδεσης άλλων πυρηνικών υποδοχέων. Αυτό το εύρηµα επιβεβαίωσε την υπόθεση, η οποία αποτέλεσε τη βάση της παρούσας µελέτης. Η κοιλότητα του HNF-4 δε βρέθηκε να στερείται συνδέτη, αλλά, αντίθετα, οι κρυσταλλογραφικές µελέτες έδειξαν ότι φιλοξενούσε ένα µείγµα ενδογενών µορίων, για την ακρίβεια λιπαρών οξέων, τα οποία θεωρήθηκε ότι είχαν το ρόλο ενδογενών συνδετών, καθώς η κρυστάλλωση του υποδοχέα είχε γίνει ελλείψει προσθήκης οποιουδήποτε εξωγενούς µορίου. Το διαφορετικό στην περίπτωση του HNF-4, ωστόσο, ήταν ότι, σύµφωνα µε τη µελέτη των συγκεκριµένων ερευνητών, τα λιπαρά οξέα δεν µπορούσαν να αποµακρυνθούν από τον υποδοχέα µε καµία από τις γνωστές µεθοδολογίες χρωµατογραφίας ανταλλαγής, ακόµη και έπειτα από µερικώς αποδιατακτικές για το µόριο συνθήκες, οδηγώντας στο συµπέρασµα πως τα ενδογενή λιπαρά οξέα λειτουργούν κατά κάποιον τρόπο ως δοµικοί «συµπαράγοντες» (structural cofactors) για το µεταγραφικό παράγοντα (Wisely et al., 2002). Λίγους µήνες αργότερα τα αποτελέσµατα αυτά επιβεβαιώθηκαν µε τη δηµοσίευση της κρυσταλλικής δοµής του HNF-4α, όπου οι ερευνητές παρατήρησαν το ίδιο ακριβώς φαινόµενο. Ένα µείγµα λιπαρών οξέων «φιλοξενούνταν» και στην κοιλότητα του HNF-4α χωρίς να µπορεί να αποµακρυνθεί (Dhe-Paganon et al., 2002). Οι παρατηρήσεις αυτές έθεσαν τέλος στη αναζήτηση ενός συνδέτη για το µόριο του ορφανού υποδοχέα HNF-4. Ταυτόχρονα, «προκάλεσαν» το µοντέλο της ποντικοπαγίδας, σύµφωνα µε το οποίο η αλλαγή, η οποία προκαλείται στην κοιλότητα της LBD περιοχής των πυρηνικών 141

υποδοχέων κατόπιν σύνδεσης του συνδέτη στο µόριό τους, είναι αυτή που ευθύνεται για την ενεργοποίηση των υποδοχέων. Η κρυσταλλική δοµή του υποδοχέα πρόσφερε τη δυνατότητα να ερµηνευθούν ορισµένες από τις παρατηρήσεις, που προέκυψαν από την παρούσα µελέτη. Για παράδειγµα, στην περίπτωση της µετάλλαξης R226G, η κρυσταλλογραφική ανάλυση στα µόρια τόσο του HNF-4γ όσο και του HNF-4α αποκάλυψε ότι η συγκεκριµένη αργινίνη στο µόριο του HNF-4, κατ αναλογία µε ό,τι συµβαίνει στους άλλους υποδοχείς, εµπλέκεται σε απευθείας ιοντικές αλληλεπιδράσεις µε τα άτοµα οξυγόνου της καρβοξυλικής οµάδας των συνδεδεµένων λιπαρών οξέων, σταθεροποιώντας τους ενδογενείς συνδέτες στην κοιλότητα πρόσδεσης. Εξ άλλου, µελέτες µοντελισµού, που πραγµατοποιήθηκαν µε αντικατάσταση της συγκεκριµένης αργινίνης από γλυκίνη επάνω στη δηµοσιευµένη κρυσταλλική δοµή του HNF-4α, αποκάλυψαν πως η παρουσία της µη θετικά φορτισµένης γλυκίνης στη θέση 226 της LBD περιοχής αποτρέπει τη «σύλληψη» του λιπαρού οξέος στη σωστή του θέση στην κοιλότητα του υποδοχέα. Παράλληλα, οι µειωµένες απαιτήσεις σε όγκο της πολύ µικρότερης γλυκίνης συντελούν πιθανόν σε ολίσθηση της όξινης «κεφαλής» του µορίου του λιπαρού οξέος πιο κοντά προς τη σερίνη (S)181, µε την οποία η καρβοξυλική οµάδα του οξέος εµπλέκεται ούτως ή άλλως σε δεσµούς υδρογόνου (Σχ.31). Το γεγονός όµως αυτό επιφέρει προσέγγιση της «φουρκέτας», η οποία σχηµατίζεται από το ασπαρτικό οξύ (D) στη θέση 232 ως και την αργινίνη (R) στη θέση 244, προς την έλικα 5, οδηγώντας σε αλλαγή του σχήµατος της κοιλότητας πρόσδεσης του συνδέτη. Η υπόθεση αυτή προσφέρει µία πιθανή ερµηνεία για τη δραµατική επίδραση της µετάλλαξης R226G στη µεταγραφική ενεργότητα του HNF- 4α. Η δηµοσίευση της κρυσταλλικής δοµής του HNF-4α πρόσφερε το δοµικό πλαίσιο για την ενσωµάτωση και των άλλων δύο σηµειακών µεταλλάξεων, οι οποίες εισήχθησαν στις έλικες 10 και 11 (Σχ.32,33). Ωστόσο, τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από τη µεταγραφική ανάλυση επεκτείνουν τις προβλέψεις της κρυσταλλογραφίας ως προς αµινοξέα µε ιδιαίτερη λειτουργική σηµασία στην LBD περιοχή. Έτσι, παρ όλο που µπορεί να µη φάνηκε από την κρυσταλλική δοµή του HNF-4α ότι το αµινοξύ ισολευκίνη (I)338 έρχεται σε φυσική επαφή µε το συνδέτη, τα αποτελέσµατα της λειτουργικής ανάλυσης δείχνουν ότι είναι σηµαντικό για τη µεταγραφική ενεργοποίηση από τον HNF-4α. 142

Σχ.31. οµικό µοντέλο αντικατάστασης της αργινίνης (Arg)226 από γλυκίνη (Gly), που κατασκευάστηκε µε βάση την κρυσταλλική δοµή του HNF-4α µε τη βοήθεια του προγράµµατος SPDB Viewer. Στο επάνω µέρος της εικόνας φαίνεται η δοµή της κοιλότητας πρόσδεσης του συνδέτη στην LBD περιοχή του HNF-4α. Στο κάτω µέρος της εικόνας φαίνεται η αντικατάσταση της αργινίνης από γλυκίνη στη θέση 226. Απουσία της αργινίνης διαταράσσονται οι ιοντικοί δεσµοί µε τα άτοµα οξυγόνου της καρβοξυλικής οµάδας του λιπαρού οξέος και ο συνδέτης αναµένεται ότι µετατοπίζεται προς την πλευρά της σερίνης (Ser) 181, µε την οποία σχηµατίζει δεσµούς υδρογόνου. Κάτι τέτοιο θα άλλαζε, εκτός από τη σχετική θέση του συνδέτη στην κοιλότητα, το όλο σχήµα της κοιλότητας, προσφέροντας µία πιθανή ερµηνεία για την επίδραση της συγκεκριµένης µετάλλαξης στη δραστικότητα του µορίου. Fig.31. Structural model of mutation R226G, engineered on the published crystal structure of the HNF-4α LBD with the help of SPDB Viewer. The ligand binding pocket is shown at the top of the panel. Glycine (Gly) 226, versus arginine (Arg) 226, is depicted at the bottom. In the absence of arginine, the ionic interactions with the fatty acid carboxylic group cannot be formed and the ligand is shifted towards serine (Ser) 181, with which it forms hydrogen bonds. This would not only change the relative orientation of the ligand in the LBD pocket, but also the entire shape of the pocket, offering a potential explanation for the observed loss of transcriptional activity in the case of this mutant. 143

IV. Επίδραση µεταλλάξεων στις έλικες 10, 11 της LBD περιοχής του HNF-4α Σύντοµα µετά τη δηµοσίευση της κρυσταλλικής δοµής των apo-rxrα και holo-rarγ είχε επιχειρηθεί µία πρόβλεψη των αµινοξέων, τα οποία θα συµµετείχαν στο σχηµατισµό της κοιλότητας πρόσδεσης του συνδέτη στο µόριο του holo-rxrα, µε τη βοήθεια δοµικού µοντελισµού, βασισµένου στο συνδυασµό των δύο προηγούµενων κρυσταλλικών δοµών (Wurtz et al., 1996). Σε αυτήν τη µελέτη µεταξύ των αµινοξέων, που είχε προβλεφθεί ότι θα βρίσκονταν σε απόσταση µικρότερη από 4,5 Å από το συνδέτη στο µόριο του holo-rxrα, βρίσκονταν αµινοξέα των ελίκων 5,10 και 11, όπως η φαινυλαλανίνη (F)313, η ισολευκίνη (I)428 και η ιστιδίνη (H)435 αντίστοιχα. Η κρυστάλλωση του holo-rxrα τέσσερα χρόνια αργότερα έδειξε πως, πράγµατι, τα περισσότερα από τα αµινοξέα, που είχε προβλεφθεί να έρχονται σε άµεση επαφή µε το συνδέτη στο µόριο του holo-rxrα σύµφωνα µε τη µελέτη του µοντελισµού, εµπλέκονταν άµεσα σε αλληλεπιδράσεις µε το ρετινοϊκό οξύ στον κρύσταλλο (Egea et al., 2000). Οι εξαιρέσεις ήταν ελάχιστες, συµπεριλαµβανοµένης και της ισολευκίνης (I)428, η οποία είναι το οµόλογο αµινοξύ της ισολευκίνης 338 στον HNF-4α. Περίπου δύο χρόνια αργότερα, κρυστάλλωση του ίδιου του HNF-4α επιβεβαίωσε ότι η συγκεκριµένη ισολευκίνη δεν εµπλέκεται σε άµεσες αλληλεπιδράσεις µε τα λιπαρά οξέα στην κοιλότητα του υποδοχέα (Dhe-Paganon et al., 2002). Παρ όλ αυτά τα λειτουργικά αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης καθιστούν φανερή τη σηµασία του συγκεκριµένου αµινοξέος για τη δυνατότητα µεταγραφικής ενεργοποίησης από το µόριο του HNF-4α, καθώς µετάλλαξη της ισολευκίνης στην ογκωδέστερη φαινυλαλανίνη (I338F) συνεπάγεται συντριπτική µείωση της µεταγραφικής ενεργότητας (Σχ.12,13,22,23). Η µελέτη δοµικού µοντελισµού στην περίπτωση αυτή δείχνει ότι ο ογκώδης αρωµατικός δακτύλιος της φαινυλαλανίνης στη θέση 338 θα επέβαλε προσκρούσεις µε τη λευκίνη (L)220 της έλικας 5 και τη βαλίνη (V)255 της έλικας 7, µε τις οποίες το αµινοξύ στη θέση 338 συνορεύει άµεσα, αποµακρύνοντας µεταξύ τους τις έλικες 5,7 και 10 και διαταράσσοντας το όλο σχήµα της κοιλότητας (Σχ.32). Κατ αυτόν τον τρόπο το δοµικό µοντέλο προσφέρει µια πιθανή ερµηνεία για το σοβαρό αντίκτυπο, που έχει η µετάλλαξη, στην ενεργότητα του µορίου. Το αµινοξύ στη θέση 346 του HNF-4α, εξ άλλου, βρίσκεται στην οµόλογη θέση µε αµινοξέα που, στο µόριο του hrarγ και του mgr (υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών), δείχθηκε να είναι πολύ σηµαντικά για την επαφή µε το συνδέτη. 144

Σχ.32. οµικό µοντέλο της σηµειακής µετάλλαξης F (Phe) 338, όπου µε λευκό χρώµα αναπαριστώνται τα ηλεκτρονικά νέφη των ατόµων των αµινοξέων, που απεικονίζονται. Όπως φαίνεται από την εικόνα, η φαινυλαλανίνη στη θέση 338 προσκρούει στη λευκίνη (Leu) 220 της έλικας 5 και στη βαλίνη (Val) 255 της έλικας 7, γεγονός που αναµένεται να προκαλεί µία απώθηση των ελίκων 5, 7, 10 και επακόλουθη αλλαγή στο σχήµα της κοιλότητας, εξηγώντας κατ αυτόν τον τρόπο την απώλεια δραστικότητας της συγκεκριµένης µετάλλαξης. Fig.32. Structural model of point F (Phe) 338, where the electron maps of the relevant amino acids are depicted in white. The aromatic ring of phenylalanine imposes serious clashes with leucine (Leu) 220 of helix 5 and valine (Val) 255 of helix 7, leading to a small increase in the distance between helices 5, 7 and 10. The resulting change in the pocket shape possibly explains the observed loss of transcriptional activity in the case of this mutant. 145

Μετάλλαξη της αντίστοιχης αλανίνης (A)397 του hrarγ σε θρεονίνη (T) είχε δειχθεί να µειώνει κατά περισσότερο από 100 φορές τη λειτουργική απόκριση του µεταλλαγµένου µορίου στο στο all-trans ρετινοϊκό οξύ (Renaud et al., 1995), ενώ µία φυσική µετάλλαξη, η οποία αποµονώθηκε για την αντίστοιχη κυστεΐνη του υποδοχέα GR του ποντικού (C742G), είχε δειχθεί να ευθύνεται για την πλήρη έλλειψη απόκρισης του συγκεκριµένου υποδοχέα στη δεξαµεθαζόνη (dexamethazone, συνθετικός συνδέτης του GR) (Wurtz et al., 1996). Μελέτες µεταλλαξιγένεσης, που ακολούθησαν στο µόριο του hrxrα, έδειξαν ότι αλλαγή του οµόλογου αµινοξέος (L436) δηµιουργεί υποδοχείς µε αλλαγµένες ιδιότητες ως προς την εξειδίκευση για το συνδέτη, καθώς µεταλλάξεις αυτού του είδους δίνουν γένεση σε µόρια, τα οποία µπορούν να αποκρίνονται φυσιολογικά στο 9-cis ρετινοϊκό οξύ (φυσικό συνδέτη), όχι όµως και σε συνθετικούς συνδέτες, στους οποίους το φυσιολογικό µόριο αποκρίνεται εξ ίσου καλά (Peet et al., 1998). Η κρυστάλλωση του holo-rxrα φανέρωσε τον καθοριστικό ρόλο της λευκίνης 436 στη σταθεροποίηση της έλικας 12 µετά την πρόσδεση του ρετινοϊκού οξέος στο µόριο του RXRα (Egea et al., 2000). Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίον αλλαγή του συγκεκριµένου αµινοξέος επηρεάζει δραµατικά τις ιδιότητες αναγνώρισης και απόκρισης σε διαφορετικούς συνδέτες του RXRα, γεγονός το οποίο επηρεάζει τη µεταγραφική ενεργοποίηση από τον υποδοχέα. Με βάση τα παραπάνω, δεν προξενεί έκπληξη το γεγονός ότι η οµόλογη ισολευκίνη, I346, στην έλικα 11 της LBD περιοχής του HNF-4α δείχθηκε να συµµετέχει στην κοιλότητα πρόσδεσης των λιπαρών οξέων του HNF-4 (Dhe-Paganon et al., 2002). Παρ όλ αυτά, µετάλλαξη της συγκεκριµένης ισολευκίνης σε φανυλαλανίνη δείχνει να διατηρεί, στα πλαίσια των πειραµάτων που περιγράφτηκαν, το 30% περίπου της ενεργότητας του άγριου τύπου στα υβριδικά pcmxgal-lbd µόρια κι ένα εντυπωσιακό 70% στα pcdna3.1-lbd µόρια (Σχ.12,13,23). Σε αντίθεση µε ό,τι παρατηρείται στην περίπτωση της λευκίνης 436 στον RXRα, η συγκεκριµένη ισολευκίνη στον HNF-4α δε φαίνεται να συµµετέχει σε αλληλεπιδράσεις σταθεροποίησης της έλικας 12 µετά την ένωση του συνδέτη. Αντίθετα, η έλικα 12 στον HNF-4α φαίνεται να σταθεροποιείται, στην «κλειστή» διαµόρφωση του µορίου, χάρη σε αλληλεπιδράσεις αµινοξέων της µε αµινοξέα της κοιλότητας πρόσδεσης του συνδέτη πέραν της I346, όπως η µεθειονίνη (M)182 της έλικας 3 ή η λευκίνη (L)219 της έλικας 5. Το γεγονός αυτό θα µπορούσε να ερµηνεύσει την παρατηρούµενη διατήρηση µεταγραφικής ενεργότητας από τη µετάλλαξη I346F (Σχ.33). 146

Σχ.33. οµικό µοντέλο της σηµειακής µετάλλαξης F (Phe) 346, όπου µε λευκό χρώµα αναπαριστώνται τα ηλεκτρονικά νέφη των ατόµων των αµινοξέων που απεικονίζονται. Όπως φαίνεται από την εικόνα, η φαινυλαλανίνη στη θέση 346 είναι σε θέση να αλληλεπιδρά µε τον ενδογενή συνδέτη, όπως και η ισολευκίνη που βρίσκεται φυσιολογικά στη θέση αυτή, ενώ δε διαταράσσει το σχήµα της κοιλότητας, παρά το γεγονός ότι παρατηρούνται κάποιες προσκρούσεις του αρωµατικού δακτυλίου της µε την πλευρική οµάδα της µεθειονίνης (Met) 182. Fig.33. Structural model of point mutation F (Phe) 346, where the electron maps of the relevant amino acids are depicted in white. Phenylalanine is able to interact with the endogenous ligand pretty much like the isoleucine, which normally occupies this position. On the other hand, it does not change the overall shape of the pocket, despite introducing minor clashes with the side chain of methionine (Met) 182. 147