25OH-Vitamin D total- RIA-CT KIP1971

25OHVitamin D total RIACT KIP1971 DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2 B1348 Louvainlaeuve Belgium

: 1181/1

en Read entire protocol before use. 25OH Vitamin D total RIACT I. ITEDED USE Radioimmunoassay for the in vitro quantitative measurement of 25hydroxyvitamin D2 and D3 (25 OHD2 and 25OHD3 ) in serum or heparin plasma. II. GEERAL IFORMATIO A. Proprietary name : DIAsource 25OH Vitamin D total RIACT Kit B. Catalog number : KIP 1971 : 96 tests C. Manufactured by : DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B1348 Louvainlaeuve, Belgium. III. CLIICAL BACKGROUD For technical assistance or ordering information contact : Tel : +32 ()1 84.99.11 Fax : +32 ()1 84.99.9 Vitamin D is the generic term used to designate Vitamin D2 or ergocalciferol and Vitamin D3 or cholecalciferol. Humans naturally produce Vitamin D3 when the skin is exposed to ultraviolet sun rays. In the liver mainly, Vitamin D3 is metabolised into 25Hydroxyvitamin D3 (25 OH D3) which is the main form of Vitamin D circulating in the body. 25 OH D3 is a precursor for other Vitamin D metabolites and has also a limited activity by itself. The most active derivative is 1,25Hydroxyvitamin D3, produced in the kidney (or placenta) by 1 α hydroxylation of 25OHD3. 25OHVitamin D stimulates the intestinal absorption of both calcium and phosphorus and also bone resorption and mineralisation. 25OH Vitamin D might also be active in other tissues responsible for calcium transport (placenta, kidney, mammary gland ) and endocrine gland (parathyroid glands, beta cells ). Vitamin D3 and Vitamin D2 are also available by ingestion through food or dietary supplementation. As Vitamin D2 is metabolised in a similar way to vitamin D3, both contribute to the overall Vitamin D status of an individual. It is the reason why it is very important to measure both forms of 25 OH Vitamin D equally for a correct diagnosis of Vitamin D deficiency, insufficiency or intoxication. Vitamin D deficiency is an important risk factor for rickets, osteomalacia, senile osteoporosis, cancer and abnormal pregnancy outcomes. The measurement of both 25 OH Vitamin D forms is also required to determine the cause of abnormal serum calcium concentrations in patients. Vitamin D intoxication has been shown to cause kidney and tissue damages..

IV. PRICIPLES OF THE METHOD At first calibrators, controls and samples (serum or heparin plasma) are pretreated to release 25OH Vitamin D 2 and 25OH Vitamin D 3 from Vitamin D Binding Protein (DBP). A fixed amount of 125 I labelled 25OH Vitamin D competes with the 25OH Vitamin D 2 and 25OH Vitamin D 3 from treated samples, controls or calibrators, for a fixed amount of a specific monoclonal antibody sites immobilized to the lower and inner surface of plastic tubes. After 2 hours incubation at room temperature on a tube shaker, an aspiration step terminates the competition reaction. The tubes are then washed twice and aspirated again. A calibration curve is plotted and the total 25 OH Vitamin D (D 2 and D 3) concentrations of the samples are determined by dose interpolation from the calibration curve. V. REAGETS PROVIDED Reagents 96 Test Kit Colour Code Tubes coated with Mab anti 25OH Vit D2 and 25OH Vit D3 Ag 125 Iodine labelled 25OH Vit D (HPLC grade). CAL Calibrator : horse serum and phosphate buffer with gentamycin. CAL Calibrators 15 in horse serum and phosphate buffer with gentamycin (see exact values on vial labels) WASH SOL COC Wash solution (TRISHCl) COTROL Controls = 2 in human serum with thymol TRACER Tracer Buffer with casein and gentamycin PRE Pretreatment Solution with Proclin 3 (.1 %) PRE Pretreatment Buffer with sodium azide (<.1%) DIL 125 I SOL Dilution Solution with sodium azide (<.1%) SOL Reconstitution 2 x 48 green Ready for use 1 vial 16 kbq lyophilised 1 vial lyophilised 5 vials lyophilised 1 vial 1 ml 2 vials lyophilised 1 vial 7 ml 1 vial lyophilised 1 vial 2 ml 1 vial ml red yellow yellow brown red silver green blue black Add 6 ml of Tracer Buffer Add.5 ml distilled water Add.5 ml distilled water Dilute 7 x with distilled water (use a magnetic stirrer). Add.5 ml distilled water Ready for use Add 5 ml distilled distilled water Ready for use Ready for use ote : Use Calibrator for dilution of samples with values above the highest calibrator before pretreatment step. o international reference material is available. 4. Magnetic stirrer 5. Tube shaker (3 to 7 rpm) 6. Glass tubes (12x 75 mm) or polypropylene tubes (for example: Falcon 35263) for pretreatment step. 7. A water bath at 37 C 8. 5 ml automatic syringe (Cornwall type) for washing 9. Aspiration system 1. Any gamma counter capable of measuring 125 I may be used (minimal yield 7%). VII. REAGET PREPARATIO A. Calibrators : Reconstitute the calibrators with.5 ml distilled water B. Controls: Reconstitute the controls with.5 ml distilled water. C. Tracer: Reconstitute the lyophilized tracer with 6 ml of tracer buffer. D. Pretreatment Solution :Reconstitute extemporaneously the lyophilized pretreatment solution with 5 ml distilled water. E. Working Wash solution: Prepare an adequate volume of Working Wash solution by adding 69 volumes of distilled water to 1 volume of Wash solution (7x). Use a magnetic stirrer to homogenize. Discard unused Working Wash solution at the end of the day. VIII. STORAGE AD EXPIRATIO DATIG OF REAGETS Before opening or reconstitution, all kits components are stable until the expiry date, indicated on the label, if kept at 2 to 8 C. After reconstitution, calibrators and controls are stable for one week at 2 to 8 C. For longer storage periods, aliquots should be made and kept at 2 C for maximum 3 months. Avoid subsequent freezethaw cycles. Freshly prepared Working Wash solution should be used on the same day. After its first use, tracer is stable until expiry date, if kept in the original wellclosed vial at 2 C (with one thawing). After its first use, pretreatment solution is stable 2 months at 2 C(with one thawing) Alterations in physical appearance of kit reagents may indicate instability or deterioration. IX. SPECIME COLLECTIO AD PREPARATIO Don t use EDTA plasma. This kit is suitable for serum and heparin plasma samples. A correlation has been established between 23 serum and heparin plasma samples from same patients: Plasma =.997 Serum, R =.91. Serum and heparin samples must be kept at 28 C. If the test is not run within 24 hrs, samples storage at 2 C is recommended. Avoid subsequent freezethaw cycles. X. PROCEDURE A. Handling notes Do not use the kit or components beyond expiry date. Do not mix materials from different kit lots. Bring all the reagents to room temperature prior to use. Thoroughly mix all reagents and samples by gentle agitation or swirling. Use a clean disposable pipette tip for addition of each different reagent and sample in order to avoid crosscontamination. High precision pipettes or automated pipetting equipment will improve the precision. Prepare a calibration curve for each run, do not use data from previous runs. B. Procedure B1 Pretreatment : 1. Label one glass tube or one polypropylene tube for each calibrator, control and sample. 2. Briefly vortex calibrators, controls and samples and dispense µl of each into the respective tubes. 3. Dispense µl of pretreatment solution into each tube. 4. Dispense 2 µl of pretreatment buffer into each tube. 5. Briefly vortex tubes, cover them and incubate 3 minutes at 37 C in a water bath.! Be careful incubation volume must be completely immersed during this step.! Respect incubation time: 3 35 minutes is necessary.! Respect incubation temperature: 37 4 C is necessary. 6. Dispense 1 ml of Dilution Solution into each tube and vortex briefly. VI. SUPPLIES OT PROVIDED B2 Incubation : The following material is required but not provided in the kit: 1. Distilled water 2. Pipettes for delivery of: µl, μl, 2µl, μl and 1 ml (the use of accurate pipettes with disposable plastic tips is recommended) 3. Vortex mixer 1. Label coated tubes in duplicate for each calibrator, control and sample. For the determination of total counts, label 2 normal tubes. 2. Dispense µl of pretreated calibrator or control or sample 3. Dispense µl of 125 Iodine labelled 25OH Vitamin D into each tube, including the uncoated tubes for total counts.

4. Shake the tube rack gently by hand to liberate any trapped air bubbles. 5. Incubate for 2 hours at room temperature on a tube shaker (3 to 7 rpm) 6. Aspirate the content of each tube (except total counts). Be sure that the tip of the aspirator reaches the bottom of the coated tube in order to remove all the liquid. 7. Wash tubes with 2 ml Working Wash solution (except total counts) and aspirate. Avoid foaming during the addition of the Working Wash solution. 8. Wash tubes again with 2 ml Wash solution (except total counts) and aspirate. 9. Let the tubes stand upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid. 1. Count tubes in a gamma counter for 6 seconds. C. Precision ITRAASSAY Sample <X> ± SD A B 23 23 14.7 ±.8 42.4 ± 2 C.V. 5.2 4.7 SD : Standard Deviation; CV: Coefficient of variation ITERASSAY Sample <X> ± SD A B 16 16 13.8 ± 1.4 38.5 ± 3.5 C.V. 9.8 9.1 XI. CALCULATIO OF RESULTS D. Accuracy 1. Calculate the mean of duplicate determinations. 2. Calculate the bound radioactivity as a percentage of the binding determined at the zero calibrator point () according to the following formula : RECOVERY TEST Counts (Calibrator or sample) B/B = x Counts (Zero Calibrator ) Added 25OHVit.D 3 Recovery 3. Using a 3 cycle semilogarithmic or logitlog graph paper, plot the (B/B) values for each calibrator point as a function of 25OH vitamin D concentration of each calibrator point. Reject obvious outliers. 4. Computer assisted methods can also be used to construct the calibration curve. If automatic result processing is used, a 4parameter logistic function curve fitting is recommended. 5. By interpolation of the sample (B/B ) values, determine the total 25OH vitamin D concentrations of the samples from the calibration curve. 6. For each assay, the percentage of total tracer bound in the absence of unlabelled 25 OH vitamin D (B/T) must be checked. 25 Added 25OHVit.D 2 25 15 15 91 11 11 96 Recovery XII. TYPICAL DATA The following data are for illustration only and should never be used instead of the real time calibration curve. 25OH Vitamin D total cpm B/Bo Total count 45756 Calibrator. ng/ml 2 ng/ml 6 ng/ml 15 ng/ml 55 ng/ml 12 ng/ml ote : 1 ng/ml = 2.5 pmol/ml 21958 17916 1417 171 4949 3161. 81.6 64.5 48.8 22.5 14.4 DILUTIO TEST Sample Theoritical Measured Recovery dilution concent. concent. 1/1 12,8 12,8 % 1/2 51,4 6,1 117% 1/4 25,7 25,6 % 1/8 12,9 12,9 % 1/1 8,3 8,3 % 1/2 4,2 42, 15% 1/4 2,1 24,7 123% 1/8 1, 1,9 18% XIII. PERFORMACE AD LIMITATIOS A. Detection Limit Twenty zero calibrators were assayed along with a set of other calibrators. The detection limit, defined as the apparent 25OHVitamin D total concentration two standard deviations below the average counts at zero binding, was.4ng/ml. B. Specificity The percentage of cross reaction estimated by comparison of the concentration yielding a % inhibition are respectively : E. Time delay between last calibrator and sample dispensing As shown hereafter, assay results remain accurate even when a sample is dispensed 1 and 2 minutes after the calibrator has been added to the coated tubes. Sample 1 Sample 2 TIME DELAY ' 1' 2' 13.5 39.5 13.6 39.3 11.7 37.4 Compound CrossReactivity 25OHVitamin D 3 25OHVitamin D 2 1,25(OH) 2Vitamin.D 3 1,25(OH) 2Vitamin.D 2 Vitamin D3 Vitamin D2 24,25(OH) 2Vitamin.D 3 95 4 4 <.3 <.3 The assay performance is not affected by hemolysis (5 g/l hemoglobin tested), bilirubinemia (.25 g/l bilirubin tested) or triglycerides (5 g/l tested).

XIV. ITERAL QUALITY COTROL If the results obtained for Control 1 and/or Control 2 are not within the range specified on the vial label, the results cannot be used unless a satisfactory explanation for the discrepancy has been given. If desirable, each laboratory can make its own pools of control samples, which should be kept frozen in aliquots. Do not freezethaw more than twice. Acceptance criteria for the difference between the duplo results of the samples should rely on Good Laboratory Practises. XV. EXPECTED VALUES Dietary intake, race, season and age are known to affect the normal levels of 25OH Vitamin D. The expected values given hereafter should not be considered as absolute. DIAsource evaluated serum collected from 4 males and 39 females, healthy according to Ca, PTH and albumin values, from Western Europe. The age of the volunteers fell within the range of 17 58 years. Samples were collected during the months of December 21 and January 211. The mean for the population (n = 79) was 12.9 ng/ml, ranging from 6.6 to 24.5 ng/ml (based on 2.5 % to 97.5 % percentiles). Each laboratory should establish its own range based on their local population. Recent literature has suggested the following ranges for the classification of 25 OH Vitamin D status: Deficiency: 1 ng/ml; Insufficiency: 13 ng/ml; Sufficiency: 3 to 1 ng/ml; Toxicity: >1 ng/ml. XVI. PRECAUTIOS AD WARIGS Safety For in vitro diagnostic use only. This kit contains 125 I (halflife: 6 days), emitting ionizing X (28 kev) and γ (35.5 kev) radiations. This radioactive product can be transferred to and used only by authorized persons; purchase, storage, use and exchange of radioactive products are subject to the legislation of the end user's country. In no case the product must be administered to humans or animals. All radioactive handling should be executed in a designated area. away from regular passage. A logbook for receipt and storage of radioactive materials must be kept in the lab. Laboratory equipment and glassware, which could be contaminated with radioactive substances, should be segregated to prevent cross contamination of different radioisotopes. Any radioactive spills must be cleaned immediately in accordance with the radiation safety procedures. The radioactive waste must be disposed of following the local regulations and guidelines of the authorities holding jurisdiction over the laboratory. Adherence to the basic rules of radiation safety provides adequate protection. The human blood components included in this kit have been tested by European approved and/or FDA approved methods and found negative for HbsAg, anti HCV, antihiv1 and 2. o known method can offer complete assurance that human blood derivatives will not transmit hepatitis, AIDS or other infections. Therefore, handling of reagents, serum or plasma specimens should be in accordance with local safety procedures. All animal products and derivatives have been collected from healthy animals. Bovine components originate from countries where BSE has not been reported. evertheless, components containing animal substances should be treated as potentially infectious. Avoid any skin contact with reagents (sodium azide as preservative). Azide in this kit may react with lead and copper in the plumbing and in this way form highly explosive metal azides. During the washing step, flush the drain with a large amount of water to prevent azide buildup. Do not smoke, drink, eat or apply cosmetics in the working area. Do not pipette by mouth. Use protective clothing and disposable gloves. XVII. BIBLIOGRAPHY 4. DAWSOHUGHES B., HEAEY R.P., HOLICK M.F., LIPS P., MEUIER P.J. (1997) Prevalence of Vitamin D insufficiency in an adult normal population. Osteoporos. Int., 7:439443. 5. BISCHOFFFERRARI H.A., GIOVAUCCI E., WILLETT W.C., DIETRICH T., DAWSOHUGHES B. (26) Estimation of optimal serum concentrations of 25hydroxyvitamin D for multiple health outcomes. Am. J. Clin. utr., 84:1828. 6. HOLICK M.F(24) Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases, cancers and cardiovascular disease. Am. J. Clin. utr., 8:16788S1688S. 7. HEAEY R.P. (21) Defining deficiency of vitamin D. Clinical Laboratory International, October 21, vol.34 : 1619. 8. HOLICK M.F. (27) Vitamin D deficiency.. Engl. J. Med., 357:266281. 9. TAHA. M., VIETH R.(21) The problem of an optimal target level for 25Hydroxyvitamin D, the test for vitamin D nutritional status. Clinical Laboratory International, ovember 21, vol.34 : 283 XVIII. PRETREATMET (in glass tubes or polypropylene tubes) SUMMARY OF THE PROTOCOL Samples, controls, calibrators Pretreatment solution Pretreatment buffer Incubation: TOTAL COUTS μl CALIBRATORS μl 2 SAMPLE (S) COTROLS μl 2 Vortex 335 minutes at 374 C in a water bath (incubation volume must be immersed) Dilution Solution ICUBATIO (in coated tubes) Pretreated Calibrators, samples, controls Tracer Incubation Separation Working Wash solution Separation Working Wash solution Vortex 12 minutes at RT on a shaker (3 to 7 rpm) Aspirate 2. ml Aspirate 2. ml Aspirate 1. ZERWEKH J.E. (28) Blood biomarkers of Vitamin D status. Am. J. Clin. utr., 87(suppl):187S91S. Counting Count tubes for 6 seconds 2. HOLICK M.F. (26) Resurrection of Vitamin D deficiency and rickets. J. Clin. Invest., 116:262272. DIAsource Catalogue r : KIP1971 P.I. umber : 17528/en Revision nr : 1181/1 3. HEAEY R.P. (2) Vitamin D: how much do we need, and how much is too much. Osteoporos. Int., 11:553555. Revision date : 21181

fr Lire entièrement le protocole avant utilisation. 25OH Vitamin D total RIACT I. BUT DU DOSAGE Trousse de dosage radioimmunologique pour la mesure quantitative in vitro de la 25hydroxyvitamine D2 et D3 (25OHD2 et 25OHD3) dans le sérum ou le plasma hépariné. II. IFORMATIOS GÉÉRALES A. om du produit: DIAsource 25OH Vitamin D total RiaCT Kit B. uméro de catalogue: KIP1971 : 96 tests C. Fabriqué par: DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B1348 Louvainlaeuve, Belgique. III. COTEXTE CLIIQUE Pour une assistance technique ou une information sur une commande: Tel : +32 ()1 84.99.11 Fax : +32 ()1 84.99.9 La vitamine D est le terme générique utilisé pour désigner la vitamine D2, ou ergocalciférol, et la vitamine D3, ou cholécalciférol. L'homme produit naturellement de la vitamine D lorsque sa peau est exposée aux ultraviolets des rayons solaires. La vitamine D3 est métabolisée, principalement dans le foie, en 25hydroxyvitamine D3 (25 OH D3) qui est la forme principale de la vitamine D circulante dans le corps. La 25 OH D3 est un précurseur d'autres métabolites de la vitamine D et possède en ellemême une activité limitée. Le dérivé le plus actif est la 1,25hydroxyvitamine D3 produite par le rein (ou le placenta) par 1αhydroxylation de la 25OHD3. La 25OHvitamine D3 stimule l'absorption intestinale à la fois du calcium et du phosphore ainsi que la résorption et la minéralisation de l'os. La 25OH vitamine D peut également être active sur d'autres tissus responsables du transport du calcium (placenta, rein, glande mammaire, ) et sur les glandes endocrines (glandes parathyroïdes, cellules bêta, ). Une autre source de vitamine D3 et de vitamine D2 est l'alimentation ou la prise de suppléments diététiques. La vitamine D2 étant métabolisée par une voie similaire à la vitamine D3, les deux formes de la vitamine contribuent au statut général en vitamine D d'un individu. C'est la raison pour laquelle il est très important de doser les deux formes de la 25OH vitamine D pour un faire diagnostic correct de carence, insuffisance ou intoxication en vitamine D. La carence en vitamine D est un facteur de risque important de rachitisme, ostéomalacie, ostéoporose sénile, cancer et mauvaise évolution de la grossesse. Le dosage des deux formes de la vitamine D est aussi requis pour déterminer la cause d'une concentration anormale de calcium dans le sérum. Il a été démontré qu'une intoxication en vitamine D provoque des dommages aux reins et à d'autres tissus.

IV. PRICIPE DU DOSAGE Les calibrateurs, contrôles et échantillons (sérum ou plasma hépariné) sont tout d'abord prétraités pour que la protéine de liaison de la vitamine D (DBP) relâche la 25OH vitamine D 2 et la 25OH vitamine D 3. Une quantité fixe de 25OH vitamine D marquée à l'i 125 entre en compétition avec la 25OH vitamine D 2 et la 25OH vitamine D 3 des échantillons, contrôles et calibrateurs traités pour une quantité fixe de sites d'anticorps monoclonaux spécifiques immobilisés sur la surface interne et le bas de tubes en plastique. Après une incubation de 2 heures à température ambiante sur un agitateur pour tubes, une étape d'aspiration termine la réaction de compétition. Les tubes sont ensuite lavés deux fois et à nouveau aspirés. Une courbe de calibration est tracée et les concentrations en 25OH vitamine D totale (D 2 et D 3) des échantillons sont déterminées par interpolation de la concentration sur la courbe de calibration. V. RÉACTIFS FOURIS Réactifs Quantité Code Couleur 25OH Vit D marquée à l'i 125 (de grade HPLC). Calibrateur : sérum de cheval et tampon phosphate avec de la gentamycine Calibrateurs 15 dans du sérum de cheval et tampon phosphate avec de la gentamycine (cf. valeurs exactes sur chaque flacon) WASH SOL COC Solution de Lavage (TrisHCl) Contrôles = 2 dans du sérum humain et thymol TRACER Tampon traceur avec de la caséine et de la gentamycine PRE SOL Solution de prétraitement avec du ProClin 3 (,1 %) PRE Tampon de prétraitement avec de l'azoture de sodium (<,1%) DIL SOL Solution de dilution avec de l'azoture de sodium (<,1%) Reconstitution 2 x 48 Vert Prêt à l emploi 1 flacon lyophil. 16 kbq 1 flacon lyophil. 5 flacons lyophil. 1 flacon 1 ml 2 flacons lyophil. 1 flacon 7 ml 1 flacon lyophil. 1 flacon 2 ml 1 flacon ml Rouge Jaune Jaune Brun Argent Rouge Vert Bleu oir Ajouter 6 ml de tampon traceur Ajouter,5 ml d eau distillée Ajouter,5 ml d eau distillée Diluer 7x avec de l eau distillée (utiliser un agitateur magnétique). Ajouter,5 ml d eau distillée Prêt à l emploi Ajouter 5 ml d eau distillée Prêt à l emploi Prêt à l emploi ote : Utiliser le calibrateur zéro pour la dilution des échantillons avec des valeurs audessus du calibrateur le plus haut avant l'étape de prétraitement. Des références internationales ne sont pas disponibles. VI. Tubes tapissés avec l anti 25OHVitamine D 2 et 25OHVitamine D 3 (anticorps monoclonaux) Ag CAL CAL COTROL 125 I MATÉRIEL O FOURI Le matériel mentionné cidessous est requis mais non fourni avec la trousse: 1. Eau distillée 2. Pipettes pour distribuer: μl, μl, 2 μl, µl et 1 ml (il est recommandé d'utiliser des pipettes de précision avec des pointes en plastique à usage unique) 3. Agitateur vortex 4. Agitateur magnétique 5. Agitateur pour tubes (3 à 7 tpm) 6. Tubes en verre (12 x 75 mm) ou en polypropylène (par exemple: Falcon 35263) pour l'étape de prétraitement. 7. Un bainmarie à 37 C 8. Seringue automatique de 5 ml (type Cornwall) pour les lavages 9. Systèmes d aspiration et de lavage. 1. Tout compteur gamma capable de mesurer l 125 I peut être utilisé (rendement minimum 7%). VII. PRÉPARATIO DES RÉACTIFS A. Calibrateurs : Reconstituer les calibrateurs avec,5 ml d eau distillée. B. Contrôles : Reconstituer les contrôles avec,5 ml d eau distillée. C. Traceur : Reconstituer le traceur lyophilisé avec 6 ml de tampon traceur. D. Solution de prétraitement: Reconstituter en extemporané la solution de prétraitement lyophilisée avec 5 ml d'eau distillée. E. Solution de lavage: Préparer un volume adéquat de Solution de Lavage en ajoutant 69 volumes d eau distillée à 1 volume de Solution de Lavage (7x). Utiliser un agitateur magnétique pour homogénéiser. Eliminer la Solution de Lavage non utilisée à la fin de la journée. VIII. STOCKAGE ET DATE D EXPIRATIO DES RÉACTIFS Avant l ouverture ou la reconstitution, tous les composants de la trousse sont stables jusqu à la date d expiration, indiquée sur l étiquette, si la trousse est conservée entre 2 et 8 C. Après reconstitution, les calibrateurs et les contrôles sont stables pendant une semaine entre 2 et 8 C. Pour de plus longues périodes de stockage, des aliquotes devront être réalisées et cellesci seront gardées à 2 C pendant 3 mois maximum. Eviter des cycles de congélation et décongélation successifs. La Solution de Lavage préparée doit être utilisée le jour même. Après sa première utilisation, le traceur est stable jusqu'à la date d'expiration s'il est conservé dans le flacon d'origine bien fermé à 2 C (avec une décongélation). Après sa première utilisation, la solution de prétraitement est stable pendant 2 mois à 2 C (avec une décongélation). Des altérations dans l apparence physique des réactifs de la trousse peuvent indiquer une instabilité ou une détérioration. IX. PRÉPARATIO ET STABILITÉ DE L ÉCHATILLO e pas utiliser de plasma sur EDTA. Cette trousse convient pour des échantillons de sérum et de plasma hépariné. Une corrélation a été établie entre 23 échantillons de sérum et de plasma hépariné de certains patients: plasma =,997 sérum, R =,91. Les échantillons de sérum et de plasma héparinés doivent être gardés entre 2 et 8 C. Si le test n est pas réalisé dans les 24 heures, un stockage à 2 C est recommandé Eviter des cycles de congélation et décongélation successifs. X. MODE OPÉRATOIRE A. otes de manipulation e pas utiliser la trousse ou ses composants après avoir dépassé la date d expiration. e pas mélanger du matériel provenant de trousses de lots différents. Mettre tous les réactifs à température ambiante avant utilisation. Mélanger tous les réactifs et les échantillons sous agitation douce. Pour éviter toute contamination croisée, utiliser une nouvelle pointe de pipette pour l addition de chaque réactif et échantillon. Des pipettes de haute précision ou un équipement de pipetage automatique permettent d augmenter la précision. Respecter les temps d incubation. Préparer une courbe de calibration pour chaque nouvelle série d expériences, ne pas utiliser les données d expériences précédentes. B. Mode opératoire B1 Prétraitement : 1. Étiqueter un tube en verre ou en polypropylène pour chacun des calibrateurs, contrôles et échantillons. 2. Agiter brièvement au vortex les calibrateurs, contrôles et échantillons et distribuer µl de chacun dans leur tube respectif. 3. Distribuer µl de solution de prétraitement dans chacun des tubes. 4. Distribuer 2 µl de tampon de prétraitement dans chacun des tubes. 5. Agiter brièvement au vortex les tubes, les couvrir et incuber 3 minutes à 37 C au bainmarie.! Attention, le volume à incuber doit être complètement immergé pendant cette étape.

! Respecter le temps d'incubation: 3 à 35 minutes sont nécessaires.! Respecter la température d'incubation: 37 à 4 C sont nécessaires. 6. Distribuer 1 ml de solution de dilution dans chacun des tubes et agiter brièvement au vortex. B2 Incubation : 1. Identifier les tubes tapissés fournis dans la trousse, en double pour chaque calibrateur, échantillon, contrôle. Pour la détermination de l activité totale, identifier 2 tubes non tapissés. 2. Distribuer µl de calibrateur ou de contrôle ou d'échantillon prétraités. 3. Ajouter μl de 25OH vitamine D marquée à l'i 125 à chaque tube, ceux pour la détermination de l activité totale inclus. 4. Agiter manuellement et doucement le portetubes pour libérer toutes les bulles d'air emprisonnées. 5. Incuber pendant 2 heures à température ambiante sur un agitateur pour tubes (3 à 7 tpm). 6. Aspirer le contenu de chaque tube (sauf ceux pour la détermination de l activité totale). S'assurer que la pointe de la pipette atteint le fond du tube tapissé afin de retirer tout le liquide. 7. Laver les tubes avec 2 ml de Solution de lavage (sauf ceux pour la détermination de l activité totale) et aspirer. Eviter la formation de mousse pendant l addition de la Solution de Lavage. 8. Laver les tubes avec 2 ml de solution de lavage (sauf ceux pour la détermination de l activité totale) et aspirer. 9. Laisser les tubes droits pendant 2 minutes et aspirer le reste de liquide. 1. Placer les tubes dans un compteur gamma pendant 6 secondes pour quantifier la radioactivité. XI. CALCUL DES RÉSULTATS 1. Calculer la moyenne de chaque détermination réalisée en double. 2. Calculer la capacité de liaison de l essai comme un pourcentage de liaison déterminé au point de calibration () en suivant la formule cidessous : moyenne des cpm (CAL ou échantillon) B/B = x moyenne des cpm (CAL ) 3. Utiliser un 3 cycle semilogarithmic ou un papier graphique logitlog, porter en ordonnée les valeurs exprimées en pourcentage de liaison (B/B) de chaque point de calibration et en abscisse leur concentration respective en 25OH vitamine D, écarter les valeurs aberrantes. 4. Des méthodes informatiques peuvent aussi être utilisées pour construire la courbe de calibration. Si un système d analyse de traitement informatique des données est utilisé, il est recommandé d utiliser la fonction «4 paramètres» du lissage de courbes. 5. L interpolation des valeurs de chaque échantillon (B/B) détermine les concentrations en 25OH vitamine D totale à partir de la courbe d étalonnage. 6. Pour chaque essai, le pourcentage total de traceur lié en absence de 25OH vitamine D non marquée (B/T) doit être vérifié. XII. DOÉES TYPES Les données représentées cidessous sont fournies pour information et ne peuvent jamais être utilisées à la place d une courbe d étalonnage. 25OH Vitamin D total cpm B/Bo Calibrateur Activité totale 45756, ng/ml 2 ng/ml 6 ng/ml 15 ng/ml 55 ng/ml 12 ng/ml ote : 1 ng/ml = 2,5 pmol/ml 21958 17916 1417 171 4949 3161 XIII. PERFORMACE ET LIMITES DU DOSAGE, 81,6 64,5 48,8 22,5 14,4 25OHVitamin D 3 25OHVitamin D 2 1,25(OH) 2Vitamin.D 3 1,25(OH) 2Vitamin.D 2 Vitamin D3 Vitamin D2 24,25(OH) 2Vitamin.D 3 Elément Réactivité Croisée 95 4 4 <,3 <,3 La performance de l'analyse n'est pas affectée par l'hémolyse (on a testé 5 g/l d'hémoglobine), la présence de bilirubine (on a testé,25 g/l de bilirubine) ou triglycérides (5 g/l testé). C. Précision A B ITRAESSAI 23 23 <X> ± SD 14,7 ±,8 42,4 ± 2 C.V. 5,2 4,7 Echantillon Echantillon SD : Déviation Standard; CV: Coefficient de variation D. Exactitude 25OHVit.D 3 ajoutée 25 25OHVit.D 2 ajoutée Dilution 1/1 1/2 1/4 1/8 1/1 1/2 1/4 1/8 25 Concent. théorique 12,8 51,4 25,7 12,9 8,3 4,2 2,1 1, A B TEST DE RECUPÉRATIO TEST DE DILUTIO Concent. mesurée. 12,8 6,1 25,6 12,9 8,3 42, 24,7 1,9 ITERESSAI 16 16 <X> ± SD 13,8 ± 1,4 38,5 ± 3,5 Récupération 15 15 91 Récupération 11 11 96 Récupération 117 15 123 18 C.V. E. Délai entre la distribution du dernier calibrateur et celle de l échantillon Comme montré cidessous, les résultats d un essai restent précis même quand un échantillon est distribué 1 ou 2 minutes après que le calibrateur ait été ajouté aux tubes avec l anticorps. DELAI 9,8 9,1 A. Limite de détection Vingt calibrateurs zéro ont été testés en parallèle avec un assortiment d autres calibrateurs. La limite de détection, définie comme la concentration apparente de 25OHVitamine D totale située 2 déviations standards endessous de la moyenne déterminée à la fixation zéro, était de,4 ng/ml. B. Spécificité Le pourcentage de réaction croisée estimé par la comparaison de la concentration (indiquant une inhibition de %) est respectivement : échantillon 1 échantillon 2 ' 1' 2' 13,5 39,5 13,6 39,3 11,7 37,4

XIV. COTRÔLE QUALITE ITERE Si les résultats obtenus pour le(s) contrôle(s) 1 et/ou 2 ne sont pas dans l intervalle spécifié sur l étiquette du flacon, les résultats ne peuvent pas être utilisés à moins que l'on ait donné une explication satisfaisante de la nonconformité. Chaque laboratoire est libre de faire ses propres stocks d échantillons contrôles, lesquels doivent être congelés aliquotés. e pas congeler décongeler plus de deux fois. Les critères d acceptation pour les écarts des valeurs en duplicat des échantillons doivent être basés sur les pratiques de laboratoire courantes. XV. VALEURS ATTEDUES L alimentation, la race, la saison et l âge ont une influence sur les taux de 25OH.Vitamin D normaux. Les valeurs attendues reprises cidessous ne doivent pas être considérées comme des valeurs absolues. DIAsource a évalué le sérum de 4 hommes et 39 femmes d'europe de l'ouest ayant des valeurs normales du Ca, de la PTH et de l'albumine. L'âge des volontaires se situait dans la fourchette de 17 à 58 ans. Les échantillons ont été prélevés pendant les mois de décembre 21 et janvier 211. La moyenne pour la population (n = 79) était de 12,9 ng/ml, la fourchette allant de 6,6 à 24,5 ng/ml (basé sur les percentiles 2,5 % à 97,5 %). Tous les laboratoires doivent établir leur fourchette à partir de leur population locale. Une bibliographie récente a suggéré les fourchettes suivantes pour la classification du statut en 25 OH Vitamine D: carence: à 1 ng/ml; insufficience: 1 à 3 ng/ml; normal: 3 à 1 ng/ml; toxicité: >1 ng/ml. XVI. PRÉCAUTIOS ET AVERTISSEMETS Sécurité Pour utilisation en diagnostic in vitro uniquement. Cette trousse contient de l 125 I (demivie: 6 jours), une matière radioactive émettant des rayonnements ionisants X (28 kev) et γ (35,5 kev). Ce produit radioactif peut uniquement être reçu, acheté, possédé ou utilisé par des personnes autorisées; l achat, le stockage, l utilisation et l échange de produits radioactifs sont soumis à la législation du pays de l'utilisateur final. Ce produit ne peut en aucun cas être administré à l homme ou aux animaux. Toutes les manipulations radioactives doivent être exécutées dans un secteur désigné, éloigné de tout passage. Un journal de réception et de stockage des matières radioactives doit être tenu à jour dans le laboratoire. L'équipement de laboratoire et la verrerie, qui pourrait être contaminée avec des substances radioactives, doivent être isolés afin d éviter la contamination croisée de plusieurs isotopes. Toute contamination ou perte de substance radioactive doit être réglée conformément aux procédures de radio sécurité. Les déchets radioactifs doivent être placés de manière à respecter les réglementations en vigueur. L'adhésion aux règles de base de sécurité concernant les radiations procure une protection adéquate. Les composants de sang humain inclus dans ce kit ont été évalués par des méthodes approuvées par l Europe et/ou la FDA et trouvés négatifs pour HBsAg, l antihcv, l antihiv1 et 2. Aucune méthode connue ne peut offrir l'assurance complète que des dérivés de sang humain ne transmettront pas d hépatite, le sida ou toute autre infection. Donc, le traitement des réactifs, du sérum ou des échantillons de plasma devront être conformes aux procédures locales de sécurité. Tous les produits animaux et leurs dérivés ont été collectés d'animaux sains. Les composants bovins proviennent de pays où l ESB n'a pas été détectée. éanmoins, les composants contenant des substances animales devront être traités comme potentiellement infectieux. L azoture de sodium est nocif s il est inhalé, avalé ou en contact avec la peau (l azoture de sodium est utilisé comme agent conservateur). L azoture dans cette trousse pouvant réagir avec le plomb et le cuivre dans les canalisations et donner des composés explosifs, il est nécessaire de nettoyer abondamment à l eau le matériel utilisé. e pas fumer, ni boire, ni manger, ni appliquer de produits cosmétiques dans les laboratoires où des produits radioactifs sont utilisés. e pas pipeter avec la bouche. Utiliser des vêtements protecteurs et des gants à usage unique. XVII. BIBLIOGRAPHIE 1. ZERWEKH J.E. (28) Blood biomarkers of Vitamin D status. Am. J. Clin. utr., 87(suppl):187S91S. 2. HOLICK M.F. (26) Resurrection of Vitamin D deficiency and rickets. J. Clin. Invest., 116:262272. 3. HEAEY R.P. (2) Vitamin D: how much do we need, and how much is too much. Osteoporos. Int., 11:553555. 4. DAWSOHUGHES B., HEAEY R.P., HOLICK M.F., LIPS P., MEUIER P.J. (1997) Prevalence of Vitamin D insufficiency in an adult normal population. Osteoporos. Int., 7:439443. 5. BISCHOFFFERRARI H.A., GIOVAUCCI E., WILLETT W.C., DIETRICH T., DAWSOHUGHES B. (26) Estimation of optimal serum concentrations of 25hydroxyvitamin D for multiple health outcomes. Am. J. Clin. utr., 84:1828. 6. HOLICK M.F(24) Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases, cancers and cardiovascular disease. Am. J. Clin. utr., 8:16788S1688S. 7. HEAEY R.P. (21) Defining deficiency of vitamin D. Clinical Laboratory International, October 21, vol.34 : 1619. 8. HOLICK M.F. (27) Vitamin D deficiency.. Engl. J. Med., 357:266281. 9. TAHA. M., VIETH R.(21) The problem of an optimal target level for 25Hydroxyvitamin D, the test for vitamin D nutritional status. Clinical Laboratory International, ovember 21, vol.34 : 283 XVIII. RÉSUMÉ DU PROTOCOLE PRÉTRAITEMET (dans des tubes en verre ou en polypropylène) Calibrateurs, Échantillons, Contrôles Solution de prétraitement Tampon de prétraitement Incubation ACTIVITÉ TOTALE µl CALIBRA TEURS µl 2 ÉCHATILLO(S) COTROLE(S) µl 2 Vortex 3 à 35 minutes à 374 C au bainmarie (le volume à incuber doit être immergé) Solution de dilution ICUBATIO (dans les tubes tapissés) Calibrateurs, Échantillons, Contrôles prétraités Traceur Vortex Incubation 2 heures à température ambiante en agitant (3 à 7 TPM). Séparation Solution de lavage de travail Séparation Solution de lavage de travail Séparation Comptage uméro de catalogue DIAsource : KIP1971 aspirer 2, aspirer 2, aspirer Temps de comptage des tubes: 6 secondes uméro de P.I.: 17528/fr uméro de révision : 1181/1 Date de révision : 21181

de Vor Gebrauch des Kits lesen Sie bitte diese Packungsbeilage. 25OHVitamin D totalriact I. VERWEDUGSZWECK Ein RadioImmunoassay für die quantitative in vitro Bestimmung von 25Hydroxy Vitamin D2 und D3 (25OHD2 und 25OHD3) in Serum oder Heparinplasma. II. ALLGEMEIE IFORMATIO A. Handelsbezeichnung: DIAsource 25OHVitamin D totalriact Kit B. Katalognummer: KIP1971 : 96 Tests C. Hergestellt von: DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B1348 Louvainlaeuve, Belgien. Für technische Unterstützung oder Bestellungen wenden Sie sich bitte an: Tel : +32 ()1 84.99.11 Fax : +32 ()1 84.99.9 III. KLIISCHER HITERGRUD Vitamin D ist der allgemeine Ausdruck zur Bezeichnung von Vitamin D2, oder Ergocalciferol und Vitamin D3, oder Cholecalciferol. Menschen produzieren Vitamin D3 auf natürliche Weise, wenn die Haut ultravioletten Sonnenstrahlen ausgesetzt wird. Hauptsächlich wird Vitamin D3 in der Leber in 25Hydroxyvitamin D3 (25 OH D3) metabolisiert, welches die Hauptform von im Körper zirkulierendem Vitamin D darstellt. 25 OH D3 ist ein Vorläufer für andere Vitamin D Metaboliten und ist in begrenztem Umfang selbst aktiv. Das am meisten aktive Derivat ist 1,25 Hydroxyvitamin D3, welches in den ieren (oder in der Plazenta) durch eine 1 α Hydroxylierung produziert wird. 25 OH Vitamin D stimuliert die intestinale Absorption von Kalzium und Phosphor und auch die Knochenresorption und Mineralisierung. 25 OH Vitamin D kann auch in anderen Geweben aktiv für den Kalziumtransport verantwortlich sein ( Plazenta, ieren, Milchdrüsen, ) und für die Endokrinen Drüsen (ebenschilddrüse, Beta Zellen, ). Vitamin D3 und Vitamin D2 werden ebenfalls über die ahrung oder diätische Ergänzungsmittel verfügbar gemacht. Da Vitamin D2 auf ähnliche Weise metabolisiert wird wie Vitamin D3, tragen auch beide zum Vitamin D Gesamtstatus einer Person bei. Das ist der Grund, warum eine Bestimmung der beiden Formen von 25 OH Vitamin D für eine korrekte Diagnose des Vitamin D Mangels, der Insuffizienz oder der Intoxikation so wichtig ist. Vitamin D Mangel ist ein wichtiger Risikofaktor für Rachitis, Knochenerweichung, altersbedingte Osteoporose, Krebs und Schwangerschaftsvorfällen. Die Messung von beiden Formen von 25 OH Vitamin D ist ebenso erforderlich zur Bestimmung der Ursachen von anormalen Konzentrationen von Serum Kalzium Spiegeln bei Patienten. Vitamin D Intoxikationen verursachen ieren und Gewebeschäden.

IV. GRUDSÄTZLICHES ZUR DURCHFÜHRUG Zunächst werden Kalibratoren, Kontrollen und Proben (Serum oder Heparinplasma) vorbehandelt, um 25 OH Vitamin D 2 und 25 OH Vitamin D 3 aus dem Vitamin D Bindungsprotein (DBP) freizusetzen. Eine festgesetzte Menge an 125 I markiertes 25OHVitamin D konkurriert mit dem aus Proben, Kontrollen oder Kalibratoren extrahierten 25OH Vitamin D 2 und 25OHVitamin D 3 um eine begrenzte Anzahl von spezifische monoklonale Antikörperbindungsstellen, die im unteren Innenteil von Kunststoffröhrchen immobilisiert sind. ach 2 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Röhrchenschüttler beendet das Absaugen die Verdrängungsreaktion. Die Röhrchen werden anschliessend zweimal gewaschen und erneut abgesaugt. Es wird eine Kalibrationskurve erstellt und die Gesamtkonzentrationen von 25 OH Vitamin D (D 2 und D 3 ) der Proben durch Dosis Interpolation aus der Kalibrationskurve abgelesen. V. MITGELIEFERTE REAGEZIE Reagenz Quantität Farbcode Rekonstitution 125 Iod markiertes 25OHVit D (HPLC Grad) ullkalibrator: Pferdeserum /Phosphatpuffer mit Gentamicin Kalibratoren 15: Pferdeserum/Phosphatpuffer mit Gentamicin (genaue Werte auf GefäßEtiketten) WASH SOL COC Waschlösung (TRISHCl) Kontrollen: = 2 in Humanserum und Thymol TRACER Tracerpuffer mit Kasein und Gentamycin Vorbehandlungslösung mit Proclin 3 (,1%) Vorbehandlungspuffer mit atriumazid (<,1%) Verdünnungslösung mit atriumazid (<,1%) 2 x 48 grün Gebrauchsfertig 1 Gefäß lyophil. 16 kbq 1 Gefäß lyophil. 5 Gefäße lyophil. 1 Gefäß 1 ml 2 Gefäße lyophil. 1 Gefäß 7 ml 1 Gefäß lyophil 1 Gefäß 2 ml 1 Gefäß ml rot gelb gelb braun silber rot grün blau schwarz 6 ml Tracerpuffer zugeben,5 ml dest. Wasser zugeben,5 ml dest. Wasser zugeben 7x mit dest. Wasser (Magnetrührer verwenden) verdünnen.,5 ml dest. Wasser zugeben Gebrauchsfertig 5 ml dest. Wasser zugeben Gebrauchsfertig Gebrauchsfertig Bemerkung: Benutzen Sie den ullkalibrator für die Verdünnung von Proben mit Werten über dem höchsten Kalibrator vor der Vorbehandlung. Es sind keine internationalen Referenzen vorhanden. VI. Mit Mab anti 25OHVit D2 und 25OH Vit D3 beschichtete Röhrchen Ag CAL CAL COTROL PRE PRE DIL SOL 125 I SOL ZUSÄTZLICH BEÖTIGTES MATERIAL Folgendes Material wird benötigt, aber nicht mit dem Kit mitgeliefert: 1. Dest. Wasser 2. Pipetten: μl, μl, 2 μl, µl und 1 ml (die Benutzung von genauen Pipetten mit Einmalspitzen ist vorgeschrieben) 3. Vortexmixer 4. Magnetrührer 5. Röhrchenschüttler (3 bis 7 upm) 6. Glasröhrchen (12 x 75 mm) oder Polypropylenröhrchen ( zum Beispiel: Falcon 35263) für den Vorbehandlungsschritt. 7. Wasserbad mit 37 C 8. 5 ml automatische Spritze (CornwallTyp) zum Waschen 9. Absaugsystem 1. Jeder GammaCounter, der 125 I messen kann, kann verwendet werden. (minimal Yield 7%) VII. VORBEREITUG DER REAGEZIE A. Kalibratoren: Rekonstituieren Sie die Kalibratoren mit,5 ml dest. Wasser. B. Kontrollen : Rekonstituieren Sie die Kontrollen mit,5 ml dest. Wasser. C. Tracer: Rekonstituieren Sie den lyophilisierten Tracer mit 6 ml Tracerpuffer. D. Vorbehandlungslösung: Rekonstituieren Sie die lyophilisierte Vorbehandlungslösung mit 5 ml destilliertem Wasser. E. Waschlösung: Zur Vorbereitung eines angemessenen Volumens nutzbarer Waschlösung, mischen Sie zu einem Volumen Waschlösung (7x) 69 Volumen destilliertes Wasser. Benutzen Sie einen Magnetrührer. Entsorgen Sie nach jedem Arbeitstag die überflüssige Waschlösung. VIII. AUFBEWAHRUG UD LAGERUG DER REAGEZIE Vor dem Öffnen und Rekonstituieren sind alle Kitkomponenten bei 2 bis 8 C bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. ach der Rekonstitution sind Kalibratoren und Kontrollen eine Woche bei 2 bis 8 C stabil. Für eine längere Aufbewahrung sollten diese Reagenzien aliquotiert und bei 2 C eingefroren werden for maximum 3 months,für maximal 3 Monate. Vermeiden Sie wiederholte Einfrier Auftau Zyklen. Die Waschlösung sollte frisch hergestellt und am selben Tag aufgebraucht werden. ach dem ersten Gebrauch ist der Tracer bis zum Ablaufdatum stabil, wenn er im verschlossenen Originalröhrchen bei 2 C (mit einem Auftauzyklus) aufbewahrt wird. ach dem ersten Gebrauch ist die Vorbehandlungslösung 2 Monate bei 2 C (mit einem Auftauzyklus) stabil. Veränderungen im Aussehen der Kitkomponenten können auf Instabilität bzw. Zerfall hindeuten. IX. PROBESAMMLUG UD VORBEREITUG Benutzen Sie kein EDTA Plasma Dieser Kit ist für Serum und Heparin Plasmaproben geeignet. Eine Korrelation wurde zwischen 23 Serum und Heparin Plasmaproben des gleichen Patienten festgestellt: Plasma =,997 Serum, R=,91. Serumproben und Heparin Plasmaproben müssen bei 28 C aufbewahrt werden. Falls der Test nicht innerhalb von 24 Std. durchgeführt wird, müssen die Proben bei 2 C aufgehoben werden. Vermeiden Sie wiederholte Einfrier Auftau Zyklen. X. DURCHFÜHRUG A. Bemerkungen zur Durchführung Verwenden Sie den Kit oder dessen Komponenten nicht nach dem Ablaufdatum. Vermischen Sie nie Materialien von unterschiedlichen KitChargen. Bringen Sie alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur. Mischen Sie alle Reagenzien und Proben gründlich durch sanftes Schütteln oder Rühren. Verwenden Sie saubere Einwegpipettenspitzen, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Präzisionspipetten oder ein automatisches Pipettiersystem erhöhen die Präzision. Erstellen Sie für jeden Durchlauf eine Kalibrationskurve, verwenden Sie nicht die Daten von früheren Durchläufen. B. Durchführung B1 Vorbehandlung: 1. Etikettieren Sie je ein Glas oder Polypropylenröhrchen für jeden Kalibrator, jede Kontrolle oder Probe. 2. Vortexen Sie die Kalibratoren, Kontrollen und Proben und dispensieren Sie jeweils µl davon in die entsprechenden Röhrchen. 3. Dispensieren Sie µl der Vorbehandlungslösung in jedes Röhrchen 4. Dispensieren Sie 2µl des Vorbehandlungspuffers in jedes Röhrchen 5. Vortexen Sie die Röhrchen kurz, decken Sie sie ab und inkubieren Sie 3 Minuten bei 37 C in einem Wasserbad.!Achten Sie darauf, dass das Inkubationsvolumen bei diesem Schritt komplett eingetaucht ist!

!Beachten Sie die Inkubationszeit: 3 bis 35 Minuten sind notwendig!!beachten Sie die Inkubationstemperatur: 37 bis 4 Grad sind notwendig! 6. Dispensieren Sie 1 ml der Verdünnungslösung in jedes Röhrchen und Vortexen Sie kurz B2 Inkubation: 1. Beschriften Sie je 2 beschichtete Röhrchen für jeden Kalibrator, jede Probe und jede Kontrolle. Zur Bestimmung der Gesamtaktivität, beschriften Sie 2 normale Röhrchen. 2. Dispensieren Sie µl der vorbehandelten Kalibratoren, Kontrollen oder Proben. 3. Dispensieren Sie µl 125 Iod markiertes 25 OH Vitamin D in jedes Röhrchen, einschließlich der unbeschichteten Röhrchen für die Gesamtaktivität. 4. Schütteln Sie das Röhrchengestell vorsichtig per Hand, um eingschlossene Luftblasen freizusetzen. 5. Inkubieren Sie 2 Stunden, auf einem Röhrchenschüttler (37 UPM), bei Raumtemperatur. 6. Saugen Sie den Inhalt jedes Röhrchens ab (außer Gesamtaktivität). Stellen Sie sicher, dass die Spitze des Absaugers den Boden der beschichteten Röhrchen berührt, um die gesamte Flüssigkeit abzusaugen 7. Waschen Sie die Röhrchen mit 2 ml Waschlösung (außer Gesamtaktivität) und saugen Sie ab. Vermeiden Sie Schaumbildung bei Zugabe der Waschlösung. 8. Waschen Sie die Röhrchen mit 2 ml Waschlösung (außer Gesamtaktivität) und saugen Sie ab. 9. Lassen Sie die Röhrchen 2 Minuten aufrecht stehen, und saugen Sie den verbleibenden Flüssigkeitstropfen ab. 1. Werten Sie die Röhrchen in einem GammaCounter über 6 Sekunden aus. B. Spezifität Der Prozentsatz der Kreuzreaktion, der im Vergleich der Konzentration geschätzt wurde, welche eine %ige Inhibition ergibt, beträgt respektive: 25OHVitamin D 3 25OHVitamin D 2 1,25(OH) 2Vitamin,D 3 1,25(OH) 2Vitamin,D 2 Vitamin D3 Vitamin D2 24,25(OH) 2Vitamin,D 3 Substanz KreuzReaktivität 95 4 4 <,3 <,3 Die Leistung des Tests wird nicht durch Hämolyse (mit 5g/L Hämoglobin getestet), Bilirubinämie (mit,25 g/l Bilirubin getestet) oder Triglyceride (5 g/l getestet) beeinflußt. C. Präzision ITRAASSAY Probe <X> ± SD A B 23 23 14,7 ±,8 42,4 ± 2 C.V. 5,2 4,7 ITERASSAY Probe <X> ± SD A B SD : Standardabweichung; CV: Variationskoeffizient D. Genauigkeit 16 16 13,8 ± 1,4 38,5 ± 3,5 C.V. 9,8 9,1 XI. BERECHUG DER ERGEBISSE WIEDERFIDUGSTEST Aktivität (Kalibrator oder Probe) B/B = x Aktivität (ull Kalibrator ) 1. Berechnen Sie den Durchschnitt aus den Doppelbestimmungen. 2. Berechnen Sie die gebundene Radioaktivität als Prozentsatz des am ull Kalibratorpunkt () bestimmten Wertes nach folgender Formel: 3. Verwenden Sie semilogarithmisches oder doppeltlogarithmisches Millimeterpapier (über 3 Größenordnungen) drucken Sie die (B/B) Werte für jeden Kalibratorpunkt als Funktion der 25OH Vitamin D Konzentration für jeden Kalibratorpunkt, schließen Sie offensichtliche Ausreißer aus. 4. Computergestützte Methoden können ebenfalls zur Erstellung der Kalibrationskurve verwendet werden. Falls die Ergebnisberechnung mit dem Computer durchgeführt wird, empfehlen wir die Berechnung mit einer 4Parameter Kurvenfunktion. 5. Bestimmen Sie die gesamt 25OH Vitamin D Konzentrationen der Proben über Interpolation der Probenwerte B/B) der Kalibrationskurve. 6. Bei jedem Assay muss der Prozentsatz des gesamten gebundenen Tracers ohne unmarkiertes 25OH Vitamin D (B/T) geprüft werden. Probeverdün nung Zugeg. 25OHVit.D 3 25 Zugeg. 25OHVit.D 2 25 Theoretische Konzent. VERDÜUGSTEST Gemessene Konzent. Wiedergefunden 15 15 91 Wiedergefunden 11 11 96 Wiedergefunden XII. TYPISCHE WERTE Die folgenden Daten dienen nur zu Demonstrationszwecken und können nicht als Ersatz für die Echtzeitkalibrationekurve verwendet werden. 25OH Vitamin D komplett Cpm B/Bo 1/1 1/2 1/4 1/8 1/1 1/2 1/4 1/8 12,8 51,4 25,7 12,9 8,3 4,2 2,1 1, 12,8 6,1 25,6 12,9 8,3 42, 24,7 1,9 117 15 123 18 Gesamtaktivität Kalibrator ng/ml 2 ng/ml 6 ng/ml 15 ng/ml 55 ng/ml 12 ng/ml 45756 21958 17916 1417 171 4949 3161, 81,6 64,5 48,8 22,5 14,4 E. Zeitverzögerung zwischen letzter Kalibrator und Probenzugabe Es wird im folgenden gezeigt, dass die Genauigkeit der Tests selbst dann erhalten bleibt, wenn die Probe 1 oder 2 Minuten nach Zugabe des Kalibrators in die beschichteten Röhrchen zugefügt wird. ZEITABSTAD Bemerkung: 1 ng/ml = 2,5 pmol/ml ' 1' 2' XIII. LEISTUGSMERKMALE UD GREZE DER METHODIK Probe 1 Probe 2 13,5 39,5 13,6 39,3 11,7 37,4 A. achweisgrenze Zwanzig ullkalibratoren wurden zusammen mit einem Satz anderer Kalibratoren gemessen. Die achweisgrenze, definiert als die scheinbare 25OH Vitamin D komplett Konzentration bei zwei Standardabweichungen unterhalb des gemessenen Durchschnittswerts bei ullbindung, entsprach,4 ng/ml. XIV. ITERE QUALITÄTSKOTROLLE Wenn die Resultate für Kontrolle 1 und/oder Kontrolle 2 sich nicht innerhalb des auf dem Fläschchenetikett angegebenen Bereichs befinden, können die Resultate nicht verwendet werden, wenn es keine zufrieden stellende

Erklärung für die Diskrepanz gibt. Falls ExtraKontrollen erwünscht sind, kann jedes Labor seinen eigenen Pool herstellen, der in Aliquots eingefroren werden sollte. Erinnern Sie sich, dass zwei GefrierAuftauZyklen erlaubt sind. Akzeptanzkriterien für die Differenz zwischen den Resultaten der Wiederholungstests anhand der Proben müssen auf Guter Laborpraxis beruhen. XV. ZU ERWARTEDER BEREICH ahrungsaufnahme, Rasse, Jahreszeit und Alter haben einen Einfluss auf die ormalwerte des 25OHVitamin D. Die nachfolgend erwarteten Ergebnisse sollten nicht als absolut betrachtet werden. DIAsource evaluierte Serum, das von von 39 Männern und 4 Frauenaus Westeuropa gesammelt wurde, die gesund nach ihren Ca, PTH und Albumin Werten waren. Das Alter der Freiwilligen lag zwischen 17 und 58 Jahren. Die Proben wurden in den Monaten Dezember 21 und Januar 211 gesammelt. Der Durchschnittswert (n= 79) lag bei 12,9 ng/ml, mit Bereichsgrenzen von 6,6 bis 24,5 ng/ml (basierend auf 2,5 bis 97,5 Perzentilen). Jedes Labor sollte seinen eigenen Bereich, basierend auf der lokalen Bevölkerung, etablieren. Aktuelle Literatur schlägt die folgenden Bereiche für die Klassifizierung von 25 OH Vitamin D vor: Mangel: 1 ng/ml; Unzulänglichkeit: 13 ng/ml; Ausreichend: 3 bis 1 ng/ml; Giftigkeit: >1 ng/ml. XVI. VORSICHTMASSAHME UD WARUGE Sicherheit ur für diagnostische Zwecke. Dieser Kit enthält 125 I (Halbwertzeit: 6 Tagen), das ionisierende X (28 kev) und γ (35,5 kev) Strahlungen emittiert. Dieses radioaktive Produkt kann nur an autorisierte Personen abgegeben und darf nur von diesen angewendet werden; Erwerb, Lagerung, Verwendung und Austausch radioaktiver Produkte sind Gegenstand der Gesetzgebung des Landes des jeweiligen Endverbrauchers. In keinem Fall darf das Produkt an Menschen oder Tieren angewendet werden. Der Umgang mit radioaktiven Substanzen sollte fern von Durchgangsverkehr in einem speziell ausgewiesenen Bereich stattfinden. Ein Logbuch für Protokolle und Aufbewahrung muss im Labor sein. Die Laborausrüstung und die Glasbehälter, die mit radioaktiven Substanzen kontaminiert werden können, müssen ausgesondert werden, um Kreuzkontaminationen mit unterschiedlichen Radioisotopen zu verhindern. Verschüttete radioaktive Substanzen müssen sofort den Sicherheitsbestimmungen entsprechend entfernt werden. Radioaktive Abfälle müssen entsprechend den lokalen Bestimmungen und Richtlinien der für das Labor zuständigen Behörden gelagert werden. Das Einhalten der Sicherheitsbestimmungen für den Umgang mit radioaktiven Substanzen gewährleistet ausreichenden Schutz. Die menschlichen Blutkomponenten in diesem Kit wurden mit europäischen und in USA erprobten FDAMethoden getestet, sie waren negativ für HBsAg, anti HCV und antihiv 1 und 2. Keine bekannte Methode kann jedoch vollkommene Sicherheit liefern, dass menschliche Blutbestandteile nicht Hepatitis, AIDS oder andere Infektionen übertragen. Deshalb sollte der Umgang mit Reagenzien, Serum oder Plasmaproben in Übereinstimmung mit den Sicherheitsbestimmungen erfolgen. Alle tierischen Produkte und deren Derivate wurden von gesunden Tieren gesammelt. Komponenten von Rindern stammen aus Ländern in denen BSE nicht nachgewiesen wurde. Trotzdem sollten Komponenten, die tierische Substanzen enthalten, als potentiell ansteckend behandelt werden. Vermeiden Sie Hautkontakt mit den Reagenzien (atriumazid als Konservierungsmittel). Das Azid in diesem Kit kann mit Blei oder Kupfer in den Abflußrohren reagieren und so hochexplosive Metallazide bilden. Spülen Sie während der Waschschritte den Abfluß gründlich mit viel Wasser, um die Metallazidbildung zu verhindern. Bitte rauchen, trinken, essen oder wenden Sie Kosmetika nicht in Ihrem Arbeitsbereich an. Pipettieren Sie nicht mit dem Mund. Tragen Sie Schutzkleidung und Wegwerfhandschuhe. XVII. LITERATUR 1. ZERWEKH J.E. (28) Blood biomarkers of Vitamin D status. Am. J. Clin. utr., 87(suppl):187S91S. 4. DAWSOHUGHES B., HEAEY R.P., HOLICK M.F., LIPS P., MEUIER P.J. (1997) Prevalence of Vitamin D insufficiency in an adult normal population. Osteoporos. Int., 7:439443. 5. BISCHOFFFERRARI H.A., GIOVAUCCI E., WILLETT W.C., DIETRICH T., DAWSOHUGHES B. (26) Estimation of optimal serum concentrations of 25hydroxyvitamin D for multiple health outcomes. Am. J. Clin. utr., 84:1828. 6. HOLICK M.F(24) Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases, cancers and cardiovascular disease. Am. J. Clin. utr., 8:16788S1688S. 7. HEAEY R.P. (21) Defining deficiency of vitamin D. Clinical Laboratory International, October 21, vol.34 : 1619. 8. HOLICK M.F. (27) Vitamin D deficiency.. Engl. J. Med., 357:266281. 9. TAHA. M., VIETH R.(21) The problem of an optimal target level for 25Hydroxyvitamin D, the test for vitamin D nutritional status. Clinical Laboratory International, ovember 21, vol.34 : 283 XVIII. ZUSAMMEFASSUG DES PROTOKOLLS Vorbehandlung (in Glas oder Polypropylenröhrchen) Proben, Kontrollen, Kalibratoren Vorbehandlungslösung Vorbehandlungspuffer Inkubation GESAMT AKTIVITÄT µl KALIBRA TORE µl 2 PROBE() KOTROLLE µl 2 Vortex 335 Minuten bei 374 C im Wasserbad (das Inkubationsvolumen muss eingetaucht sein. Verdünnungslösung IKUBATIO ( in beschichteten Röhrchen) Vorbehandelte Kalibratoren, Proben, Kontrollen Tracer Inkubation Separation Waschlösung Separation Waschlösung Auswertung Vortex 12 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Röhrchenschüttler (37 UPM) absaugen 2, ml absaugen 2, ml absaugen Messen der Röhrchen 6 Sekunden 2. HOLICK M.F. (26) Resurrection of Vitamin D deficiency and rickets. J. Clin. Invest., 116:262272. 3. HEAEY R.P. (2) Vitamin D: how much do we need, and how much is too much. Osteoporos. Int., 11:553555. DIAsource Katalognummer: KIP1971 Beipackzettel nummer: 17528/de ummer der Originalausgabe: 1181/1 Revisionsdatum : 21181

it Prima di utilizzare il kit leggere attentamente le istruzioni per l uso. 25OH Vitamin D total RIACT I. USO DEL KIT Kit radioimmunologico per la determinazione quantitativa in vitro della 25idrossivitamina D2 e D3 (25OHD2 e 25OHD3) nel siero o nel plasma eparinizzato. II. IFORMAZIOI DI CARATTERE GEERALE A. ome commerciale: DIAsource 25OH Vitamin D total RiaCT Kit B. umero di catalogo: KIP1971 : 96 tests C. Prodotto da: DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B1348 Louvainlaeuve, Belgio. III. IFORMAZIOI CLIICHE Per informazioni tecniche o su come ordinare il prodotto contattare: Tel : +32 ()1 84.99.11 Fax : +32 ()1 84.99.9 Con il termine Vitamina D si intendono genericamente la Vitamina D2, o ergocalciferolo, e la Vitamina D3, o colecalciferolo. L esposizione della cute ai raggi ultravioletti induce naturalmente la sintesi di Vitamina D3 da parte dell organismo umano. La Vitamina D3 viene metabolizzata, principalmente nel fegato, a 25idrossivitamina D3 (25OHD3), la principale forma di Vitamina D circolante nell organismo. La 25OHD3 è un precursore di altri metaboliti della Vitamina D, oltre ad avere essa stessa un attività limitata. Il suo derivato più attivo è la 1,25idrossivitamina D3, prodotta dal rene (o dalla placenta) in seguito a idrossilazione della 25OHD3 in posizione 1α. La 25OHVitamina D stimola l assorbimento intestinale sia del calcio che del fosforo, oltre al riassorbimento e alla mineralizzazione delle ossa. La 25OHVitamina D può anche essere attiva in altri tessuti responsabili del trasporto del calcio (placenta, rene, ghiandola mammaria, ecc.) e nelle ghiandole endocrine (paratiroidi, beta cellule, ecc.). Le Vitamine D3 e D2 sono assimilabili anche da fonti alimentari e dalla supplementazione con integratori alimentari. Poiché la Vitamina D2 è metabolizzata in modo simile alla Vitamina D3, entrambe queste vitamine contribuiscono allo stato complessivo di Vitamina D nell organismo umano. Questo è il motivo per cui è molto importante misurare ugualmente entrambe le forme di 25OHVitamina D per effettuare una corretta diagnosi di carenza, insufficienza o intossicazione da Vitamina D. La carenza di Vitamina D è un importante fattore di rischio per rachitismo, osteomalacia, osteoporosi senile, cancro ed esiti sfavorevoli di una gravidanza. La misurazione di entrambe le forme di 25OHVitamina D è indispensabile anche quando è necessario determinare la causa di un anomala concentrazione sierica di calcio in un paziente. È stato dimostrato che l intossicazione da Vitamina D causa danni renali e tissutali.

IV. PRICIPIO DEL METODO Inizialmente calibratori, controlli e campioni (siero o plasma eparinizzato) vengono pretrattati affinché la 25OHVitamina D 2 e la 25OHVitamina D 3 vengano rilasciate dalla proteina di legame della Vitamina D (DBP). Una quantità fissa di 25OHVitamina D marcata con 125 I compete con le 25OH Vitamine D 2 e D 3 presenti nei campioni, controlli e calibratori trattati, per il legame a un numero definito di siti rappresentati da anticorpi monoclonali specifici immobilizzati sulla superficie inferiore e interna delle provette di plastica. Dopo 2 ore di incubazione a temperature ambiente in un agitatore per provette, la reazione di competizione viene interrotta per aspirazione. Le provette vengono quindi lavate due volte e nuovamente sottoposte ad aspirazione. Si costruisce poi una curva di calibrazione e si calcolano le concentrazioni totali delle 25OH Vitamine D (D 2 e D 3) mediante interpolazione della dose sulla curva di calibrazione. V. REATTIVI FORITI Reattivi Quantità Codice colore 25OHVit D marcata con 125 Iodio (qualità per HPLC). Calibratore : siero di cavallo e tampone fosfato con gentamicina Calibratori 15 in siero di cavallo e tampone fosfato con gentamicina (le concentrazioni esatte dei calibratori sono riportate sulle etichette dei flaconi) WASH SOL COC Tampone di lavaggio (Tris HCl) Controlli. 1 e 2, in siero umano, contenente timolo TRACER Tampone per il marcato con caseina e gentamicina PRE SOL Soluzione di pretrattamento con Proclin 3 (,1%) PRE Tampone di pretrattamento con sodio azide (<,1%) DIL SOL Soluzione di diluizione con sodio azide (<,1%) Volume di ricostituzione 2 x 48 verde Pronte per l uso 1 flacone liofilizzati 16 kbq 1 flacone liofilizzati 5 flaconi liofilizzati 1 flacone 1 ml 2 flaconi liofilizzati 1 flacone 7 ml 1 flacone liofilizzati 1 flacone 2 ml 1 flacone ml rosso giallo giallo bruno argento rosso verde blu nero Aggiungere 6 ml di tampone per il marcato Aggiungere,5 ml di acqua distillata Aggiungere,5 ml di acqua distillata Diluire 7 x con acqua distillata usando un agitatore magnetico Aggiungere,5 ml di acqua distillata Pronto per l uso Aggiungere 5 ml di acqua distillata Pronto per l uso Pronto per l uso ota: Utilizzare il calibratore per diluire i campioni con valori superiori a quelli del calibratore maggiore prima della fase di pretrattamento. on è disponibile alcun materiale di riferimento internazionale. VI. Provette sensibilizzate con anticorpo monoclonale anti 25OHVitamina.D 2 e anti 25OHVitamina.D 3 Ag CAL CAL COTROL 125 I REATTIVI O FORITI Il seguente materiale è richiesto per il dosaggio ma non è fornito nel kit: 1. Acqua distillata 2. Pipette per dispensare μl, μl, 2 μl, µl e 1 ml (si raccomanda l uso di pipette accurate con puntali di plastica monouso). 3. Agitatore tipo vortex 4. Agitatore magnetico 5. Agitatore per provette (da 3 a 7 rpm) 6. Provette di vetro (12 x 75 mm) o di polipropilene (ad es.: Falcon 35263) per la fase di pretrattamento. 7. Un bagno termostatato a 37 C 8. Pipetta a ripetizione automatica 5 ml per i lavaggi 9. Dispositivo di aspirazione e lavaggio. 1. Contatore gamma con finestra per 125 I (efficienza minima 7%). VII. PREPARAZIOE DEI REATTIVI A. Calibratore: Ricostituire i calibratori con,5 ml di acqua distillata. B. Controlli: Ricostituire i controlli con,5 ml di acqua distillata. C. Marcato : Ricostituire il marcato liofilizzato con 6 ml di tampone per il marcato. D. Soluzione di pretrattamento: la soluzione di pretrattamento va ricostituita al momento con 5 ml di acqua distillata. E. Soluzione di lavoro del tampone di lavaggio: Preparare la quantità necessaria di soluzione di lavoro del tampone di lavaggio aggiungendo 69 parti di acqua distillata ad una parte di tampone di lavaggio concentrato (7 x). Usare un agitatore magnetico per rendere la soluzione omogenea. La soluzione di lavoro va scartata al termine della giornata. VIII. COSERVAZIOE E SCADEZA DEI REATTIVI I reattivi non utilizzati sono stabili a 28 C fino alla data riportata su ciascuna etichetta. Dopo ricostituzione, calibratore e controlli sono stabili 1 settimana a 28 C e, suddivisi in aliquote a 2 C, per periodi più lunghi, fino a un massimo di 3 mesi. Evitare ripetuti cicli di congelamentoscongelamento. La soluzione di lavoro del tampone di lavaggio deve essere preparata fresca ogni volta e usata nello stesso giorno della preparazione. Dopo il primo utilizzo, il marcato è stabile fino alla data di scadenza, se mantenuto a 2 C nel suo flacone originale ben chiuso (un solo scongelamento). Dopo il primo utilizzo, la soluzione di pretrattamento è stabile per 2 mesi a 2 C (un solo scongelamento). Alterazioni dell aspetto fisico dei reattivi possono indicare una loro instabilità o deterioramento. IX. RACCOLTA E PREPARAZIOE DEI CAMPIOI on usare plasma con EDTA. Questo kit è adatto per campioni di siero e di plasma eparinizzato. È stata stabilita una correlazione tra 23 campioni di siero e di plasma eparinizzato ottenuti dagli stessi pazienti: plasma =,997 siero, R =,91. Conservare i campioni di siero e di plasma eparinizzato a 28 C. Se non si desidera eseguire il dosaggio entro 24 ore dal prelievo, si raccomanda di conservare i campioni a 2 C. Evitare ripetuti cicli di congelamentoscongelamento X. METODO DEL DOSAGGIO A. Avvertenze generali on usare il kit o suoi componenti oltre la data di scadenza. on mescolare reattivi di lotti diversi. Prima dell uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente i campioni per inversione o rotazione. Per evitare crosscontaminazioni, cambiare il puntale della pipetta ogni volta che si usi un nuovo reattivo o campione. L uso di pipette ben tarate e ripetibili o di sistemi di pipettamento automatici migliora la precisione del dosaggio. Rispettare i tempi di incubazione. Allestire una curva di taratura per ogni seduta analitica, in quanto non è possibile utilizzare per un dosaggio curve di taratura di sedute analitiche precedenti. B. Metodo del dosaggio B1 Pretrattamento : 1. Etichettare una provetta di vetro o di polipropilene per ciascun calibratore, controllo e campione. 2. Vortexare brevemente calibratori, controlli e campioni e distribuire µl di ognuno di essi nella rispettiva provetta. 3. Distribuire µl di soluzione di pretrattamento in ogni provetta. 4. Distribuire 2 µl di tampone di pretrattamento in ogni provetta. 5. Vortexare brevemente le provette, coprirle e incubare per 3 minuti a 37 C nel bagno termostatato.

! Attenzione: durante questa fase il volume di incubazione deve risultare completamente immerso nel bagno.! Rispettare il tempo di incubazione: sono necessari 3 35 minuti.! Rispettare la temperatura di incubazione: sono necessari 37 4 C. 6. Distribuire 1 ml di Soluzione di diluizione in ogni provetta e vortexare brevemente. B2 Incubazione: 1. umerare le provette sensibilizzate necessarie per dosare in duplicato ogni calibratore, campione o controllo. umerare 2 provette non sensibilizzate per la determinazione dell attività totale. 2. Distribuire µl di calibratore o controllo o campione pretrattati. 3. Aggiungere μl di 25OHvitamina D marcata con 125 Iodio in ciascuna provetta, incluse quelle per l attività totale. 4. Agitare a mano delicatamente il portaprovette per far fuoriuscire tutte le bolle d aria intrappolate. 5. Incubare 2 ore a temperatura ambiente sotto agitazione (37 rpm). 6. Aspirare il liquido contenuto in tutte le provette, tranne in quelle per l attività totale. Assicurarsi che la punta dell aspiratore raggiunga il fondo della provetta sensibilizzata per rimuovere tutto il liquido. 7. Lavare le provette utilizzando 2 ml di tampone di lavaggio (tranne quelle per l attività totale) ed eseguire l aspirazione. Evitare che si formi schiuma durante l utilizzo del tampone di lavaggio. 8. Lavare ancora le provette con 2 ml di soluzione di lavaggio (eccetto quelle per le conte totali) e aspirare. 9. Lasciare decantare le provette in posizione verticale per due minuti circa e aspirare eventuali gocce di liquido residue. 1. Contare tutte le provette per 1 minuto con il contatore gamma. B. Specificità Le percentuali di crossreattività stimata rispetto alla concentrazione in grado di produrre un inibizione al % sono rispettivamente: 25OHVitamin D 3 25OHVitamin D 2 1,25(OH) 2Vitamin.D 3 1,25(OH) 2Vitamin.D 2 Vitamin D3 Vitamin D2 24,25(OH) 2Vitamin.D 3 Composto CrossReattività 95 4 4 <,3 <,3 Le prestazioni del saggio non sono influenzate dall emolisi (analizzati 5 g/l di emoglobina), dalla bilirubinemia (analizzati,25 g/l di bilirubina) o dai trigliceridi (analizzati 5 g/l). C. Precisione Campio ne A B ITRA SAGGIO 23 23 <X> ± SD 14,7 ±,8 42,4 ± 2 C.V. 5,2 4,7 Campio ne A B ITER SAGGIO 16 16 SD : Deviazione Standard; CV: Coefficiente di Variazione <X> ± SD 13,8 ± 1,4 38,5 ± 3,5 C.V. 9,8 9,1 XI. CALCOLO DEI RISULTATI 1. Calcolare la media delle determinazioni in duplicato. 2. Calcolare il rapporto (rapporto di competizione) tra radioattività legata alle provette di calibratore 15, campioni e controlli (B) e la radioattività legata alle provette dello calibratore zero (B). 3. Usando carta semilogaritmica a 3 cicli o logitlog e ponendo in ordinata i rapporti di competizione. B/B per ogni calibratore e in ascissa le rispettive concentrazioni di 25OHVitamina D, tracciare la curva di taratura, scartare i valori palesemente discordanti. 4. È possibile utilizzare un sistema di interpolazione dati automatizzato. Con un sistema automatico di interpolazione dati utilizzare la curva a 4 parametri. 5. Per interpolazione sulla curva di taratura dei rapporti di competizione di campioni e controlli, determinare le rispettive concentrazioni di 25OH Vitamina D totale. 6. Per ogni dosaggio determinare la capacità legante B/T della 25OH Vitamina D. XII. cpm (Calibratore, campioni o controlli) B/B = cpm (Zero Calibratore ) CARATTERISTICHE TIPICHE x I dati sotto riportati sono forniti a titolo di esempio e non devono essere utilizzati al posto della curva calibratore eseguita contemporaneamente. D. Accuratezza 25OHVit.D 3 aggiunta 25 25OHVit.D 2 aggiunta 25 Diluizione 1/1 1/2 1/4 1/8 Concentrazione teorica 12,8 51,4 25,7 12,9 TEST DI RECUPERO TEST DI DILUZIOE Concentrazione misurata 12,8 6,1 25,6 12,9 Recupero 15 15 91 Recupero 11 11 96 Recupero 117 25OHVitamina D totale cpm B/Bo Calibratore Attività totale 45756, ng/ml 2 ng/ml 6 ng/ml 15 ng/ml 55 ng/ml 12 ng/ml ota: 1 ng/ml = 2,5 pmol/ml 21958 17916 1417 171 4949 3161, 81,6 64,5 48,8 22,5 14,4 1/1 1/2 1/4 1/8 8,3 4,2 2,1 1, 8,3 42, 24,7 1,9 15 123 18 E. Tempo trascorso tra l aggiunta dell ultimo calibratore e il campione Come mostrato nella seguente tabella, il dosaggio si mantiene accurato anche quando un campione viene aggiunto nelle provette sensibilizzate 1 e 2 minuti dopo l aggiunta del calibratore. XIII. CARATTERISTICHE E LIMITI DEL METODO A. Sensibilità Venti replicati dello standard zero sono stati dosati insieme agli altri standard. La sensibilità, calcolata come concentrazione apparente di 25 OHVitamina D totale con cpm inferiori alla media più 2 deviazioni standard di 2 replicati dello standard zero, è risultata essere,4 ng/ml. campioni 1 campioni 2 TEMPO TRASCORSO ' 1' 2' 13,5 39,5 13,6 39,3 11,7 37,4

XIV. COTROLLO DI QUALITÀ ITERO Se i risultati ottenuti dosando il Controllo 1 e il Controllo 2 non sono all interno dei limiti riportati sull etichetta dei flaconi, non è opportuno utilizzare i risultati ottenuti per i campioni, a meno che non si trovi una giustificazione soddisfacente. Ogni laboratorio può preparare un proprio pool di sieri da utilizzare come controllo, da conservare congelato in aliquote. on congelare e scongelare un aliquota più di due volte. I criteri di accettazione delle differenze tra i risultati in duplicato dei campioni devono basarsi sulla buona prassi di laboratorio. XV. VALORI ATTESI È noto che l apporto dietetico, la razza, la stagione e l età influiscono sui normali livelli di 25OH.Vitamin.D 3, I valori attesi forniti qui di seguito non devono essere considerati come assoluti. DIAsource ha analizzato il siero raccolto da 39 soggetti maschili e 4 soggetti femminili, giudicati sani in base ai valori di Ca, PTH e albumina, provenienti dall Europa occidentale. L intervallo di età dei volontari era 17 58 anni. I campioni sono stati raccolti durante i mesi di dicembre 21 e gennaio 211. La media per la popolazione (n = 79) è risultata 12,9 ng/ml, varabile da 6,6 a 24,5 ng/ml (basati sui percentili dal 2,5% al 97,5%). Ogni laboratorio deve stabilire il proprio intervallo di riferimento in base alla propria popolazione locale. 5. BISCHOFFFERRARI H.A., GIOVAUCCI E., WILLETT W.C., DIETRICH T., DAWSOHUGHES B. (26) Estimation of optimal serum concentrations of 25hydroxyvitamin D for multiple health outcomes. Am. J. Clin. utr., 84:1828. 6. HOLICK M.F(24) Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases, cancers and cardiovascular disease. Am. J. Clin. utr., 8:16788S1688S. 7. HEAEY R.P. (21) Defining deficiency of vitamin D. Clinical Laboratory International, October 21, vol.34 : 1619. 8. HOLICK M.F. (27) Vitamin D deficiency.. Engl. J. Med., 357:266281. 9. TAHA. M., VIETH R.(21) The problem of an optimal target level for 25Hydroxyvitamin D, the test for vitamin D nutritional status. Clinical Laboratory International, ovember 21, vol.34 : 283 La letteratura recente suggerisce i seguenti intervalli per la classificazione dello stato di 25OHVitamina D: carenza: 1 ng/ml; insufficienza: 13 ng/ml; sufficienza: da 3 a 1 ng/ml; tossicità: >1 ng/ml. XVIII. SCHEMA DEL DOSAGGIO XVI. PRECAUZIOI PER L USO Sicurezza Il kit è solo per uso diagnostico in vitro. Il kit contiene 125 I (emivita: 6 giorni) emettente raggi X (28 kev) e γ (35,5 kev) ionizzanti. L acquisto, la detenzione, l utilizzo e il trasporto di materiale radioattivo sono soggetti a regolamentazione locale. In nessun caso il prodotto può essere somministrato ad esseri umani o animali. Usare sempre guanti e camici da laboratorio quando si manipola materiale radioattivo. Le sostanze radioattive devono essere conservate in propri contenitori in appositi locali che devono essere interdetti alle persone non autorizzate. Deve essere tenuto un registro di carico e scarico del materiale radioattivo. Il materiale di laboratorio e la vetreria deve essere dedicato all uso di isotopi specifici per evitare crosscontaminazioni. In caso di contaminazione o dispersione di materiale radioattivo, fare riferimento alle norme locali di radioprotezione. I rifiuti radioattivi devono essere smaltiti secondo le norme locali di radioprotezione. Lo scrupoloso rispetto delle norme per l uso di sostanze radioattive fornisce una protezione adeguata agli utilizzatori. I reattivi di origine umana presenti nel kit sono stati dosati con metodi approvati da organismi di controllo europei o da FDA e si sono rivelati negativi per HBs Ag, anti HCV, anti HIV1 e anti HIV2. on sono disponibili metodi in grado di offrire la certezza assoluta che derivati da sangue umano non possano provocare epatiti, AIDS o trasmettere altre infezioni. Manipolare questi reattivi o i campioni di siero o plasma secondo le procedure di sicurezza vigenti. Tutti i prodotti di origine animale o loro derivati provengono da animali sani. I componenti di origine bovina provengono da paesi dove non sono stati segnalati casi di BSE. E comunque necessario considerare i prodotti di origine animale come potenziali fonti di infezioni. Evitare ogni contatto dell epidermide con i reattivi contenenti sodio azide come conservante. La sodio azide può reagire con piombo rame o ottone presenti nelle tubature di scarico per formare metalloazidi esplosive. Smaltire questi reattivi facendo scorrere abbondante acqua negli scarichi. ei luoghi dove si usano sostanze radioattive non è consentito consumare cibi o bevande, fumare o usare cosmetici. on pipettare i reattivi con pipette a bocca. PRETRATTAMETO (in provette di vetro o di polipropilene) Calibratore, Campioni, Controlli Soluzione di pretrattamento Tampone di pretrattamento Incubazione ATTIVIT À TOTALE µl CALIBRATO RE µl 2 CAMPIOI COTROLLI µl 2 Agitare (Vortex) 335 minuti a 374 C in bagno termostatato (il volume di incubazione deve risultare immerso) Soluzione di diluizione ICUBAZIOE (in provette sensibilizzate) Calibratore, Campioni, Controlli pretrattati Marcato Incubazione Agitare (Vortex) Incubare 2 ore a temperatura ambiente sotto agitazione (37 rpm). XVII. RIFERIMETI BIBLIOGRAFICI 1. ZERWEKH J.E. (28) Blood biomarkers of Vitamin D status. Am. J. Clin. utr., 87(suppl):187S91S. Separazione Tampone di lavaggio Separazione Tampone di lavaggio Separazione aspirare 2, aspirare 2, aspirare 2. HOLICK M.F. (26) Resurrection of Vitamin D deficiency and rickets. J. Clin. Invest., 116:262272. Conteggio Contare le provette per 1 minuto 3. HEAEY R.P. (2) Vitamin D: how much do we need, and how much is too much. Osteoporos. Int., 11:553555. umero di catalogo di DIAsource : KIP1971 P.I. numero: 17528/it Revisione numero: 1181/1 4. DAWSOHUGHES B., HEAEY R.P., HOLICK M.F., LIPS P., MEUIER P.J. (1997) Prevalence of Vitamin D insufficiency in an adult normal population. Osteoporos. Int., 7:439443. Data di revisione : 21181

es Leer el protocolo completo antes de usar. 25OH Vitamin D total RIACT I. ISTRUCCIOES DE USO Radioinmunoensayo para la determinación cuantitativa in vitro de la 25hidroxivitamina D2 y D3 (25 OHD2 y 25OHD3) en suero o plasma heparinizado. II. IFORMACIÓ GEERAL A. ombre: DIAsource 25OH Vitamin D total RiaCT B. úmero de Catálogo: KIP1971 : 96 test C. Fabricado por: DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B1348 Louvainlaeuve, Belgium. Para cuestiones técnicas e información sobre pedidos contactar: Tel : +32 ()1 84.99.11 Fax : +32 ()1 84.99.9 III. IFORMACIÓ CLÍICA Vitamina D es el término genérico usado para designar a la vitamina D2 o ergoclaciferol y la Vitamina D3 o colecalciferol. Los humanos producen vitamina D3 en forma natural cuando la piel está expuesta a los rayos ultravioleta del sol. La vitamina D3 es metabolizada principalmente en el hígado produciendo 25Hidroxivitamina D3 (25 OH D3) que es la forma principal de vitamina D circulando en el organismo. 25 OH D3 es la precursora para otros metabolitos de la vitamina D y tiene una actividad limitada por si sola. El derivado más activo es la 1,25Hidroxivitamina D3, producida en el riñón (o placenta) por la 1αhidroxilación de 25OHD3. La 25OHVitamina D estimula la absorción intestinal del calcio y el fósforo y también la reabsorción y mineralización ósea. La 25OH Vitamina D también puede estar activa en otros tejidos siendo responsable del transporte de calcio (placenta, riñón, glándula mamaria ) y glándula endocrina (glándula paratiroides, células beta ). La Vitamina D3 y Vitamina D2 también están disponibles por ingestión a través de los alimentos o suplementos dietéticos. Como la Vitamina D2 se metaboliza en forma similar a la vitamina D3, ambas contribuyen al estado general de la Vitamina D de un individuo. Por esta razón es muy importante medir ambos tipos de 25 OH Vitamina D de la misma forma para un diagnóstico correcto de deficiencia, insuficiencia o intoxicación. La deficiencia de vitamina D es un factor de riesgo importante en raquitismo, osteomalacia, osteoporosis senil, cáncer y el resultado del embarazo. La medición de ambos tipos de 25 OH Vitaminas D también es necesario para determinar la causa de concentraciones anormales de calcio en el suero de pacientes. Se ha demostrado que la intoxicación con Vitamina D puede causar daño en el riñón y tejidos.

IV. PRICIPIOS DEL MÉTODO Al comienzo los calibradores, controles y muestras (suero o plasma heparinizado) son pretratados para liberar 25OH Vitamina D 2 y 25OH Vitamina D 3 de la Proteína de Unión a Vitamina D (DBP). Una cantidad fija de 25OH Vitamin D marcado con 125 I compite con la 25OH Vitamina D 2 y la 25OH Vitamina D 3 de las muestras, controles o calibradores tratados, por una cantidad fija de sitios para un anticuerpo monoclonal específico, inmovilizados en la superficie interna e inferior de los tubos plásticos. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente en un agitador de tubos, una etapa de aspiración termina la reacción de competencia. Luego los tubos se lavan dos veces y se aspiran nuevamente. Se dibuja una curva de calibración y el total de las concentraciones de las 25 OH Vitaminas D (D 2 y D 3) de las muestras se determinan por interpolación de dosis usando la curva de calibración. V. REACTIVOS SUMIISTRADOS Reactivos Cantidad Código de Color 25OH Vitamina D marcado con 125 Yodo (grado HPLC). Calibrador : suero de caballo y tampón fosfato con gentamicina Calibradores 15 en suero de caballo y tampón fosfato con gentamicina (mirar los valores exactos en las etiquetas) WASH SOL COC Solución de lavado (Tris HCl) Controles = 2 en suero humano y timol TRACER Tampón trazador con caseína y gentamicina PRE SOL Solución para pretramiento con Proclina 3 (.1 %) PRE Tampón para pretratamiento con azida de sodio (<.1%) DIL SOL Solución de Dilución con azida de sodio (<.1%) Reconstitución 2 x 48 verde Listo para uso 1 vial liofilizado 16 kbq 1 vial liofilizado 5 viales liofilizados 1 vial 1 ml 2 viales liofilizados 1 vial 7 ml 1 vial liofilizado 1 vial 2 ml 1 vial ml rojo amarillo amarillo marrón plateado rojo verde azul negro Añadir 6 ml del tampón trazador Añadir,5 ml de agua destilada Añadir,5 ml de agua destilada Diluir 7 x con agua destilada (utilizar agitador magnético) Añadir,5 ml de agua destilada Listo para uso Añadir 5 ml de agua destilada Listo para uso Listo para uso ota : Para diluciones de muestras con valores superiores al calibrador más alto antes de la etapa de pretratamiento, utilizar el calibrador. o existe ninguna preparación de referencia internacional. VI. Tubos recubiertos con anti 25OHVitamin.D 2 y 25OH Vitamin.D 3 (anticuerpos monoclonales) Ag CAL CAL COTROL 125 I MATERIAL O SUMIISTRADO El material mencionado a continuación es necesario y no está incluido en el kit 1. Agua destilada 2. Pipetas de µl, µl, 2 µl, µl y 1 ml (se recomienda el uso de pipetas precisas con puntas plásticas) 3. Vortex 4. Agitador magnético 5. Agitador de tubos (3 a 7 rpm) 6. Tubos de vidrio (12 x 75 mm) o tubos de polipropileno (por ejemplo: Falcon 35263) para la etapa de pretratamiento. 7. Un baño maría a 37 C 8. Jeringa automática 5 ml (tipo Cornwall) para el lavado 9. Sistema de aspiración (opcional) 1. Contador de radiaciones gamma para medir I 125 (mínima eficiencia 7%) VII. PREPARACIÓ DE REACTIVOS A. Calibradores: reconstituir los calibradores con,5 ml de agua destilada. B. Controles: Reconstituir los controles con,5 ml de agua destilada. C. Trazador : reconstituir el trazador liofilizado con 6 ml de tampón trazador. D. Solución de pretratamiento: Reconstituir inmediatamente antes de usar la solución de pretratamiento liofilizada con 5 ml de agua destilada. E. Solución de lavado de trabajo: Preparar el volumen necesario de Solución de lavado de trabajo mezclando 69 partes de agua destilada por 1 parte de Solución de lavado (7x). Utilizar un agitador magnético para homogeneizar. Desechar la solución de lavado de trabajo no utilizada al final del día. VIII. ALMACEAJE Y CADUCIDADES DE LOS REACTIVOS Antes de abrir o reconstituir todos los componentes de los kits son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se guardan a 28ºC. Después de su reconstitución los calibradores y controles son estables durante una semana a 28ºC. Para periodos más largos, alicuotar y guardar a 2ºC por 3 meses máximo. Evitar congelar y descongelar sucesivamente. La solución de lavado de trabajo recién preparada solo debe utilizarse en el mismo día. Después del primer uso, el trazador es estable hasta la fecha de caducidad, si se mantiene en el vial original bien tapado a 2 C (descongelado una vez). Después del primer uso, la solución de pretratamiento es estable por 2 meses a 2 C (descongelado una vez) Las alteraciones de los reactivos en el aspecto físico pueden indicar inestabilidad o deterioro. IX. RECOGIDA Y PREPARACIÓ DE MUESTRAS o use plasma con EDTA. Este kit es adecuado para muestras de suero y plasma heparinizado. Se ha establecido una correlación entre 23 sueros y plasmas heparinizados de los mismos pacientes: Plasma =,997 Suero, R =,91. Las muestras de suero y de plasma heparinizado deben ser guardadas a 2 8ºC. Si el ensayo no se realiza en 24 horas, almacenar las muestras a 2º. Evitar congelar y descongelar sucesivamente. X. PROTOCOLO A. otas de manejo o utilizar el kit o componentes después de la fecha de caducidad. o mezclar reactivos de diferente número de lote. Llevar todos los reactivos a temperatura ambiente antes de su uso. Agitar minuciosamente todos los reactivos y muestras, agitándolos o girándolos suavemente. Con el fin de evitar contaminación cruzada utilizar puntas de pipetas desechables y limpias para la adición de cada reactivo y muestra. El uso de pipetas de precisión o equipamiento de dispensación automática mejorara la precisión. Respetar los tiempos de incubación. Preparar la curva de calibración en cada ensayo, no utilizar los datos de un ensayo previo. B. Protocolo B1 Pretratamiento : 1. Marque un tubo de vidrio o polipropileno para cada calibrador, control y muestra. 2. Brevemente agite en un vortex los calibradores, controles y muestras y dispense µl de cada uno en los tubos respectivos. 3. Dispense µl de solución de pretratamiento en cada tubo. 4. Dispense 2 µl de tampón de pretratamiento en cada tubo. 5. Brevemente agite en un vortex los tubos, cúbralos e incube 3 minutos a 37 C en baño maría.! Atención el volumen a incubar debe quedar completamente sumergido durante esta etapa.! Respete el tiempo de incubación: 3 35 minutos son necesarios.! Respete la temperatura de incubación: 37 4 C son necesarios.