Απομόνωση ανθρώπινου DNA γονιδιώματος & ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός Ευαγγελία - Ειρήνη Τσερμπίνι 1. Σκοπός Σκοπός της παρούσας άσκησης είναι η απομόνωση ανθρώπινου DNA γονιδιώματος από δείγμα σιέλου, με σκοπό τη χρήση αυτού για τη μελέτη πολυμορφικών θέσεων στο γονιδίωμα. 2. Θεωρητικό υπόβαθρο Κάθε άνθρωπος άνω των 18 ετών έχει περίπου εκατό τρισεκατομμύρια κύτταρα. Το κύτταρο αποτελεί μια οργανωμένη μονάδα ζωής που μπορεί να ζήσει και να πολλαπλασιαστεί μόνη ή σε συνδυασμό με άλλα κύτταρα. Όταν πολλά όμοια κύτταρα συνδέονται μεταξύ τους, σχηματίζουν έναν ιστό. Όταν διαφορετικοί ιστοί συνδυάζονται μεταξύ τους, σχηματίζουν ένα όργανο και εν συνεχεία, διαφορετικά όργανα συνεργάζονται για να αποτελέσουν ένα σύστημα που επιτελεί μια συγκεκριμένη λειτουργία ενός οργανισμού. Όλα τα συστήματα μαζί δημιουργούν έναν οργανισμό. Όλα τα κύτταρα ενός οργανισμού δεν είναι ίδια. Αντιθέτως, παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλομορφία. Διαφορές στην μορφολογία των κυττάρων απορρέουν από διαφορές στη λειτουργία τους, αφού διαφορετικά κύτταρα επιτελούν διαφορετικές λειτουργίες και παίζουν διαφορετικό ρόλο στη φυσιολογία ενός οργανισμού. Ωστόσο, κάθε ευκαρυωτικό κύτταρο αποτελείται από τον πυρήνα, το κυτταρόπλασμα, το ενδοπλασματικό δίκτυο, το σύμπλεγμα Golgi, τα μιτοχόνδρια, το ριβόσωμα, το λυσόσωμα και την κυτταρική μεμβράνη. Ο πυρήνας έχει, συνήθως, σχήμα σφαιρικό ή ωοειδές και αποτελεί το «κέντρο ελέγχου» του κυττάρου. Εκεί βρίσκεται το γενετικό υλικό ή αλλιώς δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) στο οποίο είναι καταγεγραμμένες όλες οι πληροφορίες που χρειάζεται το κύτταρο για να ελέγξει τη δομή και τη λειτουργία του. Κάθε κύτταρο περιέχει στον πυρήνα του την ίδια ακριβώς αλληλουχία DNA, δηλαδή το ίδιο γενετικό υλικό, που αλλιώς ονομάζεται και γονιδίωμα. Το DNA είναι ένα μακρομόριο που συγκροτείται από νουκλεοτίδια. Κάθε νουκλεοτίδιο αποτελείται από μια πεντόζη, την δεοξυριβόζη, μια φωσφορική ομάδα και μια αζωτούχα βάση που συνδέονται με τον 5 άνθρακα και τον 1 άνθρακα της πεντόζης, αντίστοιχα. Οι αζωτούχες βάσεις του DNA μπορεί να είναι η αδενίνη (Α), η θυμίνη (Τ), η
γουανίνη (G) και η κυτοσίνη (C). Το γενετικό υλικό των οργανισμών, με εξαίρεση ορισμένους ιούς, αποτελείται από ένα ή περισσότερα δίκλωνα μόρια DNA. Το 1953, οι James Watson και Francis Crick, διατύπωσαν το μοντέλο της διπλής έλικας του DNA. Τα χαρακτηριστικά του μοντέλου της διπλής έλικας είναι τα εξής: Α. το DNA συνίσταται από δυο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες που συγκροτούν μια δεξιόστροφη διπλή έλικα Β. οι δυο αλυσίδες του DNA είναι συμπληρωματικές και αντιπαράληλες και καθορίζουν η μια την αλληλουχία της άλλης Γ. η διπλή έλικα έχει ως σκελετό τα αλλεπάλληλα ζεύγη φωσφορικής ομάδας δεοξυριβόζης, τα οποία συνδέονται με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. Ο σκελετός είναι υδρόφιλος και εκτείνεται στο εξωτερικό του μορίου, ενώ στο εσωτερικό βρίσκονται οι αζωτούχες βάσεις, οι οποίες είναι υδρόφοβες. Δ. οι αζωτούχες βάσεις της μιας αλυσίδας σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου (Η) με τις απέναντι βάσεις, ακολουθώντας τον κανόνα της συμπληρωματικότητας. Σύμφωνα με τον κανόνα αυτόν, η Α συνδέεται μόνο με την Τ και αντίστροφα, σχηματίζοντας δυο δεσμούς υδρογόνου, ενώ η G συνδέεται μόνο με την C και αντίστροφα, σχηματίζοντας τρεις δεσμούς υδρογόνου, σταθεροποιώντας την τριτοταγή δομή του μακρομορίου. Το DNA μεταφέρει πληροφορίες, οι οποίες διατηρούνται και μεταβιβάζονται από την μια γενιά στην επόμενη. Συγκεκριμένες αλληλουχίες του DNA αποτελούν τα γονίδια, τα οποία εμπεριέχουν όλες τις πληροφορίες που χρειάζεται ένας μονοκύτταρος ή πολυκύτταρος οργανισμός για τη λειτουργία του. Συνοπτικά, οι λειτουργίες του γενετικού υλικού, είναι οι εξής: Α. η αποθήκευση των γενετικών πληροφοριών, οι οποίες είναι οργανωμένες σε λειτουργικές μονάδες, που ονομάζονται γονίδια και καθορίζουν όλα τα χαρακτηριστικά ενός οργανισμού. Β. η διατήρηση και η μεταβίβαση των γενετικών πληροφοριών από κύτταρο σε κύτταρο και από οργανισμό σε οργανισμό, ιδιότητες που βασίζονται στην ικανότητα που έχει το DNA να αυτοδιπλασιάζεται. Γ. η έκφραση των γενετικών πληροφοριών, η οποία επιτυγχάνεται μέσω της σύνθεσης των πρωτεϊνών. Το μήκος ενός νουκλεϊκού οξέος περιγράφεται από τον αριθμό βάσεων που περιέχει, ενώ η αλληλουχία του περιγράφεται από την αλληλουχία των βάσεων που περιέχει στο μόριό του. Η απομόνωση του DNA βασίζεται στα παρακάτω βασικά στάδια: 1. Λύση των κυτταρικών μεμβρανών και της πυρηνικής μεμβράνης, με σκοπό την απελευθέρωση του DNA στο διάλυμα
2. Αποικοδόμηση των κυτταρικών πρωτεϊνών μετά από επίδραση πρωτεολυτικών ενζύμων 3. Διαχωρισμός του DNA από τις πρωτεΐνες 4. Καθαρισμός του DNA από υπολείμματα αλάτων με διάλυμα το οποίο περιέχει αιθανόλη 70% 5. Έκλουση/κατακρήμνιση του DNA με το κατάλληλο διάλυμα. 3. Μέτρα προστασίας Όλοι οι εκπαιδευόμενοι οφείλουν να τηρούν τους κανόνες ασφαλείας του εργαστηρίου. Συγκεκριμένα, πρέπει να γίνεται χρήση: ειδικών γαντιών μιας χρήσης, τα οποία θα πρέπει να ελέγχονται για τυχόν τρύπες ή σκισίματα πριν τη χρήση και της εργαστηριακής ποδιάς, η χρήση της οποίας περιορίζεται στο χώρο του εργαστηρίου και μόνον. Επίσης, οι εκπαιδευόμενοι θα πρέπει: να φορούν ρούχα που θα καλύπτουν πλήρως το σώμα τους να φορούν κλειστά παπούτσια και όχι πέδιλα ή σανδάλια, που θα τους παρέχουν επιπλέον προστασία ενάντια στην επαφή των αντιδραστηρίων με το δέρμα τους να έχουν πιασμένα τα μαλλιά τους, σε περίπτωση που είναι μακριά και να καλύπτουν πιθανές εκδορές στο δέρμα τους. Τέλος, στον χώρο του εργαστηρίου απαγορεύεται το κάπνισμα και η κατανάλωση τροφίμων και ποτών. 4. Πειραματικό μέρος 4.1. Όργανα - Σκεύη - Κλινική φυγόκεντρος - Υδατόλουτρο ή θερμομπλόκ - Μικροπιπέτα των 2-20 μl - Μικροπιπέτα των 20-200 μl - Μικροπιπέτα των 100-1000 μl - Αποστειρωμένα ρύγχοι μικροπιπετών - Πλαστικοί μικροσωλήνες φυγοκέντρησης όγκου 1.5 ml (Eppendorff) - Βάση για σωλήνες φυγοκέντρου
- Σωλήνας φυγοκέντρου (Falcon) 50 ml - Χρονόμετρο - Γάντια μιας χρήσης 4.2. Υλικά - Χημικές ουσίες - Δείγμα σάλιου, από το οποίο θα γίνει η απομόνωση του DNA - Φυσιολογικός ορός 0,9% 4.3. Διαλύματα Διάλυμα Α: Διάλυμα λύσης (RNAase και απορρυπαντικό) Διάλυμα Β: Χαοτροπικό άλας Διάλυμα Γ: Πρωτεϊνάση Κ Διάλυμα Δ: Διάλυμα κατακρήμνισης (96-100% αιθανόλη) Διάλυμα Ε: Διάλυμα ουδετεροποίησης (;) Διάλυμα Ζ: Διάλυμα πλύσης Διάλυμα Η: Διάλυμα έκλουσης 4.4. Διαδικασία Τα στάδια που ακολουθούμε κατά τη διαδικασία απομόνωσης DNA γονιδιώματος από σίελο, αναλύονται παρακάτω: 1. Πλύση της στοματικής κοιλότητας με φυσιολογικό ορό 5 ml 2. Μεταφορά του διαλύματος σε πλαστικό σωλήνα φυγοκέντρησης (Falcon) των 50 ml. 3. Φυγοκέντρηση σε ταχύτητα 3000 rpm για 15 λεπτά στους 15 o C. 4. Απομάκρυνση του υπερκείμενου με αντλία κενού. 5. Προσθήκη στο ίζημα 200 μl από το διάλυμα Α και επαναδιάλυση αυτού. 6. Μεταφορά σε πλαστικό μικροσωλήνα φυγοκέντρησης όγκου 1.5 ml (Eppendorff). 7. Προσθήκη 200 μl του διαλύματος Β,25 μl του διαλύματος Γ και ανάδευση με αναστροφή του σωλήνα. 8. Επώαση για 15 λεπτά στους 70 o C. 9. Προσθήκη 210 μl από το διάλυμα Δ και ανάδευση με αναστροφή του σωλήνα. 10. Σύντομη φυγοκέντρηση με σκοπό τη συγκέντρωση του διαλύματος στο κάτω μέρος του σωλήνα. 11. Μεταφορά 700 μl του διαλύματος στην στήλη. 12. Φυγοκέντρηση σε ταχύτητα 13000 rpm για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Απομάκρυνση του σωλήνα συλλογής του διηθήματος και τοποθέτηση της στήλης σε νέο σωλήνα συλλογής.
14. Προσθήκη 500 μl διαλύματος Ε στη στήλη. 15. Φυγοκέντρηση σε ταχύτητα 13000 rpm, για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. 16. Απόρριψη του διηθήματος. 17. Προσθήκη 600 μl διαλύματος Ζ. 18. Φυγοκέντρηση σε ταχύτητα 13000 rpm, για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. 19. Απόρριψη του διηθήματος. 20. Φυγοκέντρηση σε ταχύτητα 13000 rpm, για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 21. Μεταφορά της στήλης σε νέο πλαστικό μικροσωλήνα φυγοκέντρησης όγκου 1.5 ml (Eppendorf). 22. Προσθήκη 60 μl διαλύματος Η. 23. Επώαση για 5 λεπτά στους 37 oc. 24. Φυγοκέντρηση σε ταχύτητα 12000 rpm για 1 λεπτό, σε θερμοκρασία δωματίου. 25. Συλλογή και αποθήκευση του διηθήματος, το οποίο περιέχει το απομονωμένο DNA, σε θερμοκρασία -20 o C. 26. Ακολουθεί ποσοτικός και ποιοτικός προσδιορισμός του DNA. 4.5. Παρατηρήσεις Μετά το πέρας της διαδικασίας απομόνωσης, γίνεται ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του DNA, με σκοπό να ελεγχθεί η καθαρότητα, η συγκέντρωσή του, κτλ. Ο ποιοτικός προσδιορισμός γίνεται με την βοήθεια της ηλεκτροφόρησης και ο ποσοτικός προσδιορισμός γίνεται με φωτομέτρηση, όπως περιγράφτηκε αναλυτικά στην Άσκηση Ποσοτική-Ποιοτική Ανάλυση DNA, αντίστοιχα. 5. Ερωτήσεις - Προβλήματα 1. Συμπληρώστε τις λέξεις που λείπουν. i. Όταν πολλά όμοια κύτταρα συνδέονται μεταξύ τους, σχηματίζουν έναν. Όταν διαφορετικοί συνδυάζονται μεταξύ τους, σχηματίζουν ένα και διαφορετικά συνεργάζονται για να αποτελέσουν ένα που επιτελεί μια συγκεκριμένη λειτουργία ενός. ii. Οι αζωτούχες βάσεις του DNA μπορεί να είναι η ( ), η ( ), η ( ) και η ( ). iii. Σύμφωνα με τον κανόνα της συμπληρωματικότητας, η συνδέεται μόνο με την και αντίστροφα, σχηματίζοντας δυο δεσμούς
υδρογόνου, ενώ η συνδέεται μόνο με την και αντίστροφα, σχηματίζοντας τρεις δεσμούς υδρογόνου. iv. Κάθε ευκαρυωτικό κύτταρο αποτελείται από τον, το, το, το, τα, το, το και την. 2. Ποια είναι τα χαρακτηριστικά του μοντέλου της διπλής έλικας; 3. Κυκλώστε την σωστή απάντηση Α. Στη δομή ενός νουκλεοτιδίου δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος δεν περιλαμβάνεται: i. Ένας φωσφοδιεστερικός δεσμός ii. Μια αζωτούχα βάση iii. Μια ριβόζη iv. Μια φωσφορική ομάδα Β. Ποιες είναι οι λειτουργίες του γενετικού υλικού; i. Η αποθήκευση των πληροφοριών που καθορίζουν όλα τα χαρακτηριστικά ενός οργανισμού. ii. Η διατήρηση και η μεταβίβαση των γενετικών πληροφοριών από κύτταρο σε κύτταρο και από οργανισμό σε οργανισμό. iii. Η έκφραση των γενετικών πληροφοριών μέσω του ελέγχου της πρωτεϊνοσύνθεσης. iv. Όλα τα παραπάνω. Γ. Πως περιγράφεται το μήκος του DNA; i. Με τον αριθμό των αζωτούχων βάσεων ii. Με την αλληλουχία των αζωτούχων βάσεων iii. Με τον αριθμό των αζωτούχων βάσεων ή των ζευγών τους iv. Όλα τα παραπάνω. 4. Αναφέρατε τα πέντε βασικά στάδια, στα οποία βασίζεται η απομόνωση του DNA.