ΓΕΝΕΤΙΚΗ & ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΗ της ΣΠΕΡΜΑΤΟΓΕΝΝΕΣΗΣ Βύρων Ασημακόπουλος Αναπληρωτής Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικό Τμήμα Δ.Π.Θ.
Ο ομιλητής δηλώνει ότι δεν έχει καμμία σύγκρουση συμφερόντων στα πλαίσια των απόψεων που θα διατυπωθούν στην παρούσα ομιλία
Η ανάπτυξη & ωρίμανση του σπερματοζωαρίου Εμβρυϊκά πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα, ανταποκρινόμενα στο διαλυτό παράγοντα των βλαστικών κυττάρων μεταναστεύουν στις αδιαφοροποίητες γονάδες. Διαφοροποιούνται σε προ-σπερματογόνια και παραμένουν έτσι στα σπερματικά σωληνάρια έως την έναρξη της εφηβείας. Η διέγερση από τις γοναδοτροπίνες εκκινεί τη σπερματογέννεση: μιτωτικές διαιρέσεις ακολουθούμενες από μειωτικές διαιρέσεις (σπερμιογέννεση)
Παράλληλες & συνεχείς διαδικασίες στο σπερματικό επιθήλιο Πολλαπλασιασμός των σπερματογονίων με μιτώσεις Μείωση του αριθμού των χρωμοσωμάτων με μείωση Μετασχηματισμός των απλοειδών σπερματίδων σε ώριμα σπερματοζωάρια
Σπερμιογένεση Οι σπερματίδες είναι τα πλέον πρώιμα απλοειδή γαμετικά κύτταρα. Η πλέον πρόδρομη μορφή σπερματίδων είναι τα στρογγυλά κύτταρα. Έχουν διάμετρο περίπου 7μ. Όταν αποκτήσουν ουρά αναφέρονται ως επιμήκεις σπερματίδες Αμέσως μετά την ολοκλήρωση της μείωσης υπόκεινται σε σύνθετες κυτταρικές διαφοροποιήσεις. Μείωση του κυτταροπλάσματος Σχηματισμός μέσου τμήματος Σχηματισμός ουράς Συμπύκνωση του DNA Κρίσιμο ρόλο στο μετασχηματισμό των σπερματίδων σε ώριμα σπερματοζωάρια παίζουν τα κύτταρα Sertoli. Η μορφογέννεση των σπερματοζωαρίων ολοκληρώνεται στους όρχεις ωστόσο τα ορχικά σπερματοζωάρια παραμένουν φυσιολογικά ανώριμα. Στη συνέχεια είναι αναγκαία η ωρίμανση εντός της επιδιδυμίδας και το τελικό βήμα, η ενεργοποίηση, θα συμβεί εντός της γυναικείας αναπαραγωγικής οδού.
Παραγωγικότητα Σε άνδρα 20 ετών, ο ρυθμός παραγωγής σπερματικών κυττάρων είναι περίπου 6,5 εκατομμύρια ανά γραμμάριο ορχικού παρεγχύματος την ημέρα. Ο ρυθμός παραγωγής μειώνεται προϊούσης της ηλικίας Σε άνδρες 50-90 ετών, ο ρυθμός παραγωγής είναι περίπου 3,8 εκατομμύρια/γρ ορχικού παρεγχύματος/ημέρα. Προϊούσης της ηλικίας μειώνεται σημαντικά το ποσοστό των μορφολογικά φυσιολογικών & κινητικών σπερματοζωαρίων.
Ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων & Σπερματογένεση Πολλές πρωτεΐνες απαιτούνται για την επιτυχή σπερματογένεση Ειδικοί ορχικοί εκκινητές έχουν περιγραφεί για πολλά γονίδια Πρωταμίνη -1 Πρωταμίνη -2 Μεταβατική πρωτεΐνη -1 Μεταβατική πρωτεΐνη -2 Μιτοχονδριακή σελενοπρωτεΐνη Ακροσίνη Καλμεγίνη Η ρύθμιση της έκφρασης τους στους όρχεις κυρίως επιτυγχάνεται σε μεταφραστικό επίπεδο Ειδικές ισομορφές πολλών πρωτεϊνών εκφράζονται στους όρχεις Μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης GATA-1 CD46 CREM-τ
Μετα μεταφραστικός έλεγχος πρωτεϊνών του σπερματοζωαρίου sp56 PH-20 Zonadhesin p95 sp17 Fertilin Cyritestin CD46
Okabe et al. Am. J. Hum. Genet., 62: 1274-1281, 1998
Ο ρόλος του χρωμοσώματος Υ SRY στο βραχύ σκέλος AZF στο μακρύ σκέλος AZFa (αζωοσπερμία, Sertoli cell-only syndrome) AZFb (αζωοσπερμία) AZFc (ολιγοζωοσπερμία έως αζωοσπερμία)
Γενετική ανομοιογένεια των παραγόμενων σπερματοζωαρίων Τα παραγόμενα σπερματοζωάρια per se είναι ανομοιογενή, με την έννοια ότι ως απλοειδή κύτταρα δεν περιέχουν όλα τα ίδια γονίδια, ενώ τα μισά από αυτά περιέχουν το φυλετικό χρωμόσωμα Χ και τα άλλα μισά το Υ. Λάθη στις μειωτικές διαιρέσεις προκαλούν ανευπλοειδίες Λάθη στις μιτωτικές ή μειωτικές διαιρέσεις, καθώς και εξωτερικοί παράγοντες προκαλούν μεταθέσεις, αναστροφές, αναδιπλασιασμούς, μικροελλείψεις, αλλαγή βάσεων
Ανευπλοειδίες σε σπερματοζωάρια φυσιολογικών ανδρών Δισωμίες χρωμόσωμα 1: 0,09% χρωμόσωμα 2: 0,08% Χρωμόσωμα 4: 0,11% Χρωμόσωμα 9: 0,14% Χρωμόσωμα 12: 0,16% Χρωμόσωμα 15, 16 & 18: 0,11% Χρωμόσωμα 20: 0,12% Χρωμόσωμα 21: 0,29% Φυλετικά χρωμοσώματα: 0,43% Martin (1998)
Ανευπλοειδίες σπερματοζωαρίων & ηλικία (φυσιολογικοί άνδρες) Αυξημένα ποσοστά δισωμίας ΥΥ (Martin, 1998) Αυξημένα ποσοστά δισωμίας ΧΥ, ΧΧ, ΥΥ (Grifenet al, 1995) Αυξημένα ποσοστά δισωμίας ΧΧ & ΥΥ (Robins et al, 1995) Αυξημένα ποσοστά δισωμίας 1 & YY (Martin et al, 1995) Ανευπλοειδίες σε σπερματοζωάρια υπογόνιμων ανδρών Αυξημένη συχνότητα δισωμίας 1 & ΧΥ (Martin, 1998) Αυξημένη συχνότητας δισωμίας 1, 13, 21 & ΧΥ (Moosani et al, 1995) Αυξημένη συχνότητα δισωμίας 7,11, 12, 18, Χ, Υ (Pang et al, 1995) Αυξημένη συχνότητα δισωμίας ΧΥ (Hassoldet al, 1991; Egozcue et al, 1983)
Χρωμοσωμικές ανωμαλίες σπερματοζωαρίων ασθενών υπό χημειοθεραπεία Πριν Μετά Αριθμητικές ανωμαλίες 2,5% 2,4% Martin (1998) Δομικές ανωμαλίες 6,4% 7,4% Σπερματοζωάρια Χ 46,3% 50,1% Δισωμία 1 0,11% 0,06% Δισωμία 12 0,18% 0,15% Martin et al (1997) Δισωμία Χ 0,10% 0,09% Δισωμία Υ 0,13% 0,12% Δισωμία ΧΥ 0,25% 0,20% Σπερματοζωάρια Χ 50,2% 50,5%
Μικροελλείψεις στο Υ AZF στο μακρύ σκέλος AZFa (αζωοσπερμία, Sertoli cell-only syndrome) AZFb (αζωοσπερμία) AZFc (ολιγοζωοσπερμία έως αζωοσπερμία)
Η ολοκλήρωση του Προγράμματος καταγραφής του Ανθρώπινου Γονιδιώματος το 2003 οδήγησε πολλούς στο υπεραισιόδοξο συμπέρασμα ότι πλέον μπορούμε να γνωρίζουμε - προβλέψουμε το φαινότυπο κάθε οργανισμού. Η άποψη γνωρίζουμε τώρα ότι ΔΕΝ ισχύει. ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΗ Η ύπαρξη των γονιδίων δεν είναι αρκετή για να εξηγήσει το φαινότυπο
Με τι ασχολείται η ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΗ; Σταθερά, κληρονομούμενα χαρακτηριστικά τα οποία δεν εξηγούνται από αλλαγές στην αλληλουχία του DNA. Αλλαγές στη μικροδομή του DNA ή στις πρωτεΐνες της χρωματίνης Οι αλλαγές αυτές διατηρούνται όταν το κύτταρο διαιρείται. Ορισμένες από αυτές διατηρούνται και στους απογόνους του οργανισμού που τις φέρει.
Μηχανισμοί Επιγενετικών αλλαγών Μεθυλίωση του DNA (μεθυλίωση ή υδροξυ-μεθυλίωση κυτοσίνης) DNMT1, DNMT3A, DNMT3B Αλλαγές στις ιστόνες Μετα-μεταγραφικές αλλαγές των πρωτεϊνών Μεθυλίωση, ακετυλίωση, φωσφορυλίωση κλπ. RNA μετάγραφα Έχει δειχθεί ότι RNAs από τα σπερματοζωάρια μεταφέρονται στο έμβρυο και καθορίζουν χαρακτηριστικά που είναι παρόντα επί αρκετές γενιές mirnas Μειώνουν την έκφραση γονιδίων. Πολλά mirnas ρυθμίζονται επιγενετικά Θέσεις νουκλεοσωμάτων Η θέση των νουκλεοσωμάτων δεν είναι τυχαία Καθορίζει περιοχές DNA εύκολα προσβάσιμες από ρυθμιστικές πρωτεϊνες, άρα διευκολύνει τη μεταγραφή μετάφραση συγκεκριμένων γονιδίων Στο σπερματοζωάριο διατηρούνται ορισμένα νουκλεοσώματα στις περιοχές του DNA όπου διατηρούνται οι ιστόνες (5-15% του συνολικού σπερματικού DNA). Οι επιγενετικές αλλαγές μεταβάλλονται κατά τη διάρκεια της ζωής του κυττάρου/οργανισμού, κληρονομούνται όμως στους απογόνους
Τι καθορίζουν οι επιγενετικές αλλαγές; Το βαθμό έκφρασης των γονιδίων Τα «επιγενετικά σημάδια» (μεθυλιώσεις, ακετυλιώσεις κ.ο.κ.) καθορίζουν θετικά ή αρνητικά τη δραστηριοποίηση και μεταγραφή γονιδίων.
Η επιγενετική κατάσταση του σπερματοζωαρίου Το ώριμο σπερματοζωάριο είναι μεταγραφικά «σιωπηλό» Το DNA είναι συνδεδεμένο με πρωταμίνες και εξαιρετικά συμπυκνωμένο Το λίγο κυτταρόπλασμα δεν έχει ριβοσώματα Ωστόσο, 5-15% του DNA παραμένει συνδεδεμένο με ιστόνες. Εκεί, τα επιγενετικά σημάδια διατηρούνται. Αυτές οι περιοχές DNA σχετίζονται με εκκινητέςγονιδίων που: είναι σημαντικοί για την ανάπτυξη αφορούν σε έκφραση μεταγραφικών παραγόντων mirnas λειτουργία άλλων εντυπωμένων γονιδίων 10-400 femtograms RNA σε κάθε ώριμο σπερματοζωάριο Φαίνεται ότι διατηρείται επιλεκτικά Δεν μεταφράζεται στο ώριμο σπερματοζωάριο Μεταφέρεται στο έμβρυο, επηρεάζει την πρώιμη εμβρυογένεση
Μετά τη γονιμοποίηση: Επιγενετική ανασυγκρότηση Εντός των πρώτων 4 ωρών: Αντικατάσταση πρωταμινών από μητρικές ιστόνες Εκτεταμένη απομεθυλίωση του σπερματικού DNA Ωστόσο, η απομεθυλίωση είναι ατελής: πολλές περιοχές ξεφεύγουν από αυτήν τη διαδικασία, διατηρώντας προηγούμενα επιγενετικά «σημάδια» Το 5-15% του DNA που δεν είχε πρωταμινωθεί έχει αυξημένες πιθανότητες ενεργοποίησης με βάση τα επιγενετικά «σημάδια» που είχε αποκτήσει κατά τη σπερματογένεση Έτσι, το έμβρυο αποκτά έναν πατρικό απλότυπο στον οποίο αφενός εγκαθίστανται νέες επιγενετικές αλλαγές, αφετέρου διατηρούνται ορισμένες από εκείνες που είχαν εγκατασταθεί κατά τη σπερματογένεση
Επιγενετική σπερματοζωαρίων & υπογονιμότητα Αυξημένη ακετυλίωση της ιστόνης 4 μειωμένη σπερματογέννεση (Faure et al, 2003) Sertoli cell-only σύνδρομο υπερακετυλίωση της ιστόνης 4 (Faure et al, 2003) Υπομεθυλίωση σπερματικού DNA σχετίστηκε με μειωμένη σπερματική ωρίμανση και εμβρυογένεση (Benchaib et al, 2005) Ανώμαλη μεθυλίωση γονιδίων βρέθηκε στο σπέρμα ολιγοζωοσπερμικών ασθενών (Marques et al, 2008; Kobayashi et al, 2007) Ανώμαλη μεθυλίωση στο σπερματικό DNA βρέθηκε σε άνδρες με ανώμαλη πρωταμίνωση (Hammoud et al, 2010) Υπογόνιμοι άνδρες φαίνεται ότι έχουν συγκεκριμένες αλλαγές στο προφίλ των RNAs στα σπερματοζωάρια (Hamatani, 2012) και ειδικά των mrnas (Garrido et al, 2009). Υποέκφραση mrnas που κωδικοποιούν για ένζυμα υπεύθυνα για επιδιόρθωση του DNA και την εμβρυογέννεση (Hamatani, 2010)
male offspring showed depressive behaviours and tended to underestimate risk, the study found. Their sperm also showed abnormally high expression of five micrornas. One of these, mir-375, has been linked to stress and regulation of metabolism. The F1 males offspring, the F2 generation, showed similar depressive behaviours, as well as abnormal sugar metabolism. The F1 and F2 generations also had abnormal levels of the five micrornas in their blood and in the hippocampus, a brain region involved in stress responses. Behavioural effects persisted in the F3 generation as well.
«Τόσο η σύνθετη οδός της παραγωγής σπερματοζωαρίων όσο και η λεπτή ισορροπία επιγενετικών και γενετικών παραγόντων κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης των σπερματοζωαρίων, συμβάλλουν στο σχηματισμό σπερματοζωαρίων ικανών να γονιμοποιήσουν το ωάριο και να συμβάλλουν στο αναπτυσσόμενο έμβρυο» (Dada et al, 2012)