ELISA KIT Rapid hcg Σ = 96 tests REF: PSHC - 01
1 مقدمه : هورمون گنادوتروپین جفتی انسان )hcg( گلیکوپروتئینی است که توسط سلول های تروفوبالست جفت در دوران بارداری سنتز می شود. hcg متشکل از دو زیرواحد با وزن مولکولی 39 کیلودالتون است. زیرواحد آلفا hcg مشابه زیرواحد آلفا هورمون های LH FSH و TSH انسانی است و زیر واحد بتا مسوول اثرات هورمونی اختصاصی مولکول hcg می باشد. hcg دارای اثرات لوتئوتروپیک بوده و شکل گیری جسم زرد را حمایت می کند. hcg همچنین عملکرد هورمونی بیضه و غده آدرنال جنین را تعیین می کند. عالوه بر تشخیص زودهنگام بارداری اندازه گیری hcg همچنین در تشخیص بارداری های غیر طبیعی اهمیت دارد. در بارداری خارج رحمی نسبت به بارداری طبیعی سرعت افزایش hcg آهسته تر بوده و در سطوح پایین تری باقی می ماند. غلظت باالی hcg عموما در بارداری چند قلویی و در بیماران با تومورهای تروفوبالست و غیر تروفوبالست نظیر بیضه پستان کارسینوما برونشیال و سلول های رویانی مشاهده می شود. بر پایه مقاالت علمی هورمون hcg پس از گذشت حدود 10 روز از لقاح قابل تشخیص است و پس از حدود 15 روز به حدودIU/L 100 می رسد. این روند افزایش غلظت تا سه ماهه سوم بارداری ادامه می یابد و سطح هورمون به 50000 IU/L و حتی 100000 IU/L نیز می رسد.پس از این زمان سطح هورمون بتدریج کاهش می یابد و بعد از زایمان بشدت کاهش یافته به طوری که پس از چند روز دیگر قابل سنجش نیست.
2 اساس روش اندازه گیری : در این تست االیزا از آنتی بادی های منوکلونال اختصاصی که بر علیه یکی از شاخص های آنتی ژنیک مولکول hcg تهیه شده است استفاده می شود. در این سیستم یک آنتی بادی منوکلونال Anti - hcg برای تثبیت بر روی فاز جامد و یک آنتی بادی Anti - hcg دیگر برای کونژوگاسیون با آنزیم )HRP( مورد استفاده قرار گرفته است. با افزودن نمونه سرم مولکول hcg به طور همزمان با دو آنتی بادی فوق واکنش داده و بین آنتی بادی متصل به فاز جامد و آنتی بادی کونژوگه شده با آنزیم ساندویچ می گردد. پس از 10 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق برای حذف آنتی بادی های نشاندار آزاد چاهک ها توسط محلول شستشو شسته می شوند. با افزودن محلول سوبسترا - رنگزا و 5 دقیقه انکوباسیون رنگ آبی ظاهر می گردد. تولید رنگ با اضافه کردن محلول توقف متوقف شده و رنگ آبی به زرد تبدیل می شود که شدت رنگ در 450 nm اندازه گیری می گردد. شدت رنگ با غلظت hcg در نمونه رابطه مستقیمی دارد. معرف ها : 1- پلیت پوشانده شده با آنتی بادی منوکلونال : Anti- hcg )1 پلیت 96 چاهک(. 2- محلول آنزیم کونژوگه: 2 ویال حاوی Anti- hcg -HRP در بافر نگهدارنده آماده مصرف )2 ویال ml 12( -3 استانداردها : 6 استاندارد در غلظتهای 500, 250, 100, 20, 0 و 1000 برحسب IU/L در بافر حاوی نگهدارنده که در مقابل استاندارد 3rd IS WHO 537/75 کالیبر شده اند. )6 ویال 0.5 (.حجم ml استاندارد صفر 5 میلی لیتر میباشد. -4 بافر شستشوی غلیظ: 1( PBS-Tween ویال )20X()30 ml 5- محلول سوبسترا- رنگزا: پروکسید هیدروژن و تترا متیل بنزدین در بافر نگهدارنده آماده مصرف. )1 ویال )11ml 6- محلول توقف: اسید کلریدریک یک نرمال )1 ویال 6(. ml 7- سرم کنترل: hcg در سرم به همراه نگهدارنده )1 ویال 0.5(. ml
3 * محلول شستشو رنگزا و توقف در تمام کیتهای شرکت مشترک میباشند. مواد و وسایل مورد نیاز که در کیت موجود نیست : -1 سمپلرهای 100, 50, 20 و 200 میکرولیتری دقیق 2- آب مقطر 3- دستگاه االیزا ریدر دارای فیلتر 450 نانومتری و در صورت امکان 630 نانومتری بعنوان فیلتر رفرانس. 4- کاغذ جاذب رطوبت نگهداری کیت : 1- کیت های باز نشده پس از تحویل باید در دمای 2-8 درجه سانتی گراد )یخچال( نگهداری شوند. 2- میکروپلیت باید در کیسه در بسته به همراه نمگیر نگهداری شود. 3- کیت باید تا تاریخ انقضا استفاده شود ( یکسال از زمان تولید(. برای اطالع از تاریخ انقضا به برچسب کیت مراجعه شود. 4- کیت های باز شده اگر در شرایط توصیه شده در باال نگهداری شود حداقل به مدت 3 ماه پایدار خواهند ماند. جمع آوری و آماده سازی نمونه : 1- سرم نمونه مناسب برای این آزمایش است. 2- از نمونه های با کدورت باال همولیز شده و لیپمیک ترجیحا استفاده نشود. 3- قبل از استفاده برای نگهداری کوتاه مدت نمونه ها باید در دمای 2-8 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت نگهداری شوند. برای نگهداری طوالنی نمونه ها باید در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شوند. نمونه هایی که ذوب شده باید قبل از آزمایش مخلوط شوند. 4- از فریز و ذوب مکرر نمونه ها اجتناب شود. هشدارها : 1- کیت فقط برای استفاده در آزمایشگاه تشخیصی کاربرد دارد. 2- از تماس تمام معرف ها به ویژه محلول توقف که حاوی اسید کلریدریک است
4 با پوست جلوگیری شود. در صورت تماس با آب کافی شستشو داده شود. 3- در این کیت برای ساخت برخی اجزا از سرم انسانی استفاده شده است که از نظر HbsAg و HIV و HCV منفی بوده اند. 4- در محل کار از استعمال دخانیات نوشیدن و خوردن اجتناب شود. با دهان پیپت نشود. از دستکش و لباس های مناسب استفاده شود. 5- اجزاء کیت ها با سری ساخت متفاوت را با یکدیگر مخلوط نسازید و از تعویض شدن درب معرف ها جلوگیری شود. 6- استفاده از سر سمپلر یکبار مصرف برای دقت و صحت بیشتر توصیه می شود. 7- چاهک ها از نظر وجود حباب بررسی شوند. در صورت وجود حباب با ضربه آهسته به پلیت خارج شوند. آماده سازی معرف ها : 1- همه معرف ها باید قبل از استفاده به دمای اتاق )22-28 درجه سانتی گراد( برسند. 2- تهیه محلول شستشو: برای تهیه محلول شستشوی آماده مصرف یک حجم از بافر شستشو غلیظ )20X( را با 19 حجم آب مقطر رقیق نمائید. نکته های مهم : 1- توصیه می شود که بیشتر از 32 چاهک در هر ران کاری استفاده نشود. 2- فرایند شستشو خیلی مهم است. شستشوی ناکافی باعث کاهش دقت و افزایش کاذب جذب می شود. 3- در مواردی که مقدار hcg نمونه بیش از 1000 IU/L باشد نمونه را با استاندارد صفر رقیق نموده و سپس آزمایش را تکرار نمائید. روش انجام آزمایش : 1- تعداد چاهک های کوت شده برای استانداردها کنترل و نمونه های بیمار را بصورت 2 تایی انتخاب کنید و مابقی چاهک ها را همراه ماده نمگیر درون کیسه مخصوص قرار داده و درب آنرا ببندید. 20-2 میکرولیترازاستانداردها کنترلونمونههایبیماررابهداخلهرچاهکبریزید.
5 200 3- میکرولیتر از کونژوگه آنزیمی را به تمام چاهک ها اضافه کنید. 4- پلیت را بمدت 15 ثانیه به آرامی تکان دهید تا محتویات چاهک ها خوب مخلوط شوند. سپس درب چاهک ها را با برچسب مخصوص پلیت پوشانده آنرا بمدت 10 دقیقه در دمای اتاق )22-28 درجه سانتیگراد( انکوبه کنید. 5- محتویات چاهک ها را خالی کرده و چاهک ها را 5 بار با 350 میکرولیتر بافر شستشوی آماده مصرف بشوئید. برای شستشوی چاهک ها ابتدا 350 میکرولیتر بافر شستشو را داخل چاهک بریزید سپس چاهک ها را وارونه کرده و همراه با تکان د ادن خالی کنید و در انتهای شستشو با ضربات مالیم بر روی کاغذ جاذب تمامی مایع موجود در چاهک ها را تخلیه نمائید. 100 6- میکرولیتر از سوبسترای آماده مصرف به تمامی چاهک ها اضافه کنید و آنها را بمدت 5 دقیقه در دمای اتاق و تاریکی انکوبه نمائید. 50 7- میکرولیتر از محلول متوقف کننده واکنش به همه چاهک ها اضافه کنید. سپس جذب نور هر چاهک را در طول موج 450 نانومتر با دستگاه االیزا ریدر قرائت نمائید )در صورت امکان از طول موج 630 نانومتر بعنوان فیلتر رفرانس استفاده کنید(. سنجش جذب نوری باید حداکثر تا 15 دقیقه پس از اتمام آزمایش انجام شود. محاسبه نتایج : 1- با استفاده از میانگین جذب نوری استانداردها )محور Y( و غلظت مشخص آنها )محور X( برروی کاغذ میلی متری منحنی استانداردی رسم کنید. 2- میانگین جذب نوری برای هر نمونه را بدست آورده و روی محور Y جای آنرا پیدا کنید. سپس نقطه مذکور را توسط خطی به منحنی وصل کنید. از نقطه بدست آمده خطی عمود بر محور X وارد کنید تا نقطه تالقی که نشان دهنده غلظت نمونه است بدست آید. راهنمای محاسبه : مقادیر جذب نوری ارائه شده در جدول ذیل تنها بعنوان راهنمایی آورده شده
6 است و هر آزمایشگاهی باید برای هر بار آزمایش یک منحنی استاندارد جدید بدست آورد. 3 2.5 hcg ردیف مقدار استاندارد جذب نوری )IU/L( Absorbance 2 1.5 1 0.5 0.02 0.12 0.33 0 20 100 1 2 3 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Conc. 0.82 1.54 2.85 250 500 1000 4 5 6 مقادیر طبیعی : هر آزمایشگاهی الزم است تا براساس بافت جمعیتی محدوده طبیعی مقادیر این هورمون را بدست آورد. مقادیر طبیعی در سرم افراد نرمال که توسط آزمایشات مکرر به روش االیزا بدست آمده است به قرار زیر می باشد: محدوده طبیعی: 10 IU/L 0.5 محدوده مشکوک: 25 IU/L 10 چنانچه فردی در این محدوده مشکوک باشد الزم است یک هفته بعد مجددا خونگیری و آزمایش مجدد بعمل آید. همچنین در نمونه هایی که در Boarder line
7 قرار دارند آزمایش مجدد حتما تکرار شود. در افراد باردار طبیعی مقادیر در دوران مختلف )برحسب )IU/L بشرح ذیل است: 25 35 35 100 100 1000 1000 10000 30000 100000 10000 30000 5000 15000 هفته اول هفته دوم هفته سوم هفته چهارم ماه دوم و سوم سه ماه دوم سه ماه سوم خصوصیات کیت : 1- حساسیت آنالیتیکال )حد تشخیص( : برای تعیین حد تشخیص 20 مرتبه استاندارد صفر آزمایش شد. حد تشخیص از 2 انحراف معیار )SD( باالتر از میانگین جذب در غلظت صفر بدست آمد. حد تشخیص برای این کیت 2 IU/L بدست آمد. 2- دقت: برای محاسبه میزان دقت در یک روز)درون سنجی( و روزهای مختلف )میان سنجی(آزمایش بر روی 3 نمونه سرم 15 بار تکرار شد که ضریب تغییرات به شرح ذیل است.
8 دقت درون سنجی میانگین )IU/L( نمونه سرم دفعات تکرار انحراف معیار ضریب تغییرات )CV( 12 0.78 6.49 15 1 6.9 2 29.02 15 2 5.9 16.68 282.6 15 3 دقت میان سنجی میانگین )IU/L( نمونه سرم دفعات تکرار انحراف معیار ضریب تغییرات )CV( 11.5 0.78 6.84 15 1 10.4 2.79 26.84 15 2 8.5 24.05 282 15 3
9-3 ویژگی : آنتی بادی های منوکلونال مورد استفاده در این کیت االیزا اختصاصی hcg انسانی می باشند. هیچگونه تداخلی با LH FSH و TSH انسانی در غلظت های طبیعی دیده نشده است. نوع ماده FSH LH TSH غلظت 500 miu/ml 500 miu/ml 500 µiu/ml درصد تداخل)%( 0.05 0.37 0.18 4- خطی بودن: سه نمونه مختلف سرمی با استاندارد صفر به نسبت های 1:4 1:2 و 1:8 رقیق شدند. سپس غلظتhCG در آنها با استفاده از کیت محاسبه شد که نتایج ذیل بدست آمد. 1:8 نمونه سرمی غلظت اولیه )IU/L( درصد خطی بودن 1:4 1:2 107 97 105 185 1 104 102 98 423 2 103 101 103 891 3-5 اثرهوک : در این کیت در روش 1 اثر هوک تا غلظت 100,000 IU/L دیده نشد. در روش 2 اثر هوک تا غلظت 1,000,000 IU/L ظاهر نمی شود.
10 References : 1. Cole LA (2009). «New discoveries on the biology and detection of human chorionic gonadotropin». Reprod. Biol. Endocrinol. 8 :7. doi:-7827-1477/10.1186 8-7. PMC 2649930. PMID 19171054. 2. Gregory JJ, Finlay JL (April 1999). «Alpha-fetoprotein and beta-human chorionic gonadotropin: their clinical significance as tumour markers». Drugs 7 463 :)4( 57. doi:00001-199957040-00003495/10.2165. PMID 10235686. 3. Hoermann R, Spoettl G, Moncayo R, Mann K (July 1990). «Evidence for the presence of human chorionic gonadotropin (hcg) and free beta-subunit of hcg in the human pituitary». J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 179 :)1( 71. doi:10.1210/jcem179-1-71-. PMID 1695224. 4. Gever, John (December 2011,6). «FDA Yanks HCG Weight Loss Agents from Market». MedPage Today. Retrieved December 2011,7. 5. «HCG Diet Products Are Illegal». FDA. December 2011,6. 6. «FDA, FTC act to remove homeopathic HCG weight loss products from the market» (Press release). FDA. December 2011,6. Retrieved December 2011,7. 7. PDB: 1HRP ; Lapthorn AJ, Harris DC, Littlejohn A, Lustbader JW, Canfield RE, Machin KJ, Morgan FJ, Isaacs NW (June 1994). «Crystal structure of human chorionic gonadotropin». Nature 61 455 :)6480( 369. doi:369455/10.1038a0. PMID 8202136
11 «پاره ای نکات عملی در خصوص رفع مشکالت احتمالی در کیتهای االیزا» نوع مشکل پایین بودن OD استانداردها و نمونه ها عدم تولید رنگ در چاهک ها علت مشکل افت و یا آلودگی کونژوگه پایین بودن دما و یا کوتاه بودن زمان انکوباسیون به دما نرسیدن محلولهای کیت و نمونه بیماران PH نامناسب و یا غلظت باالی Wash Buffer شستشوی نامناسب و یا خشک شدن چاهک ها نگهداری نامناسب کیت و عدم رعایت زنجیره سرد طول موج خوانش نامناسب) nm 405 به جای )450 nm استفاده از مواد سایر کیت ها انجام نشدن مرحله ای از تست آلودگی محلول رنگزا آلودگی محلول کونژوگه با سدیم آزاید راه حل تکرار تست با کونژوگه جدید دمای آزمایشگاه و تایمر را چک کرده و تست را تکرار کنید قبل از شروع آزمایش کیت و نمونه بیماران به دمای اتاق برسد. Wash Buffer آب مقطر را چک کنید و تست را با PH جدید تکرار کنید پس از شستشوی کامل و تخلیه چاهک ها بالفاصله تست را ادامه دهید پس از باز کردن کیت تاریخ را ثبت کنید و به تاریخ انقضا توجه کنید پس از هر بار مصرف پلیت را با چسب بپوشانید و کیت را در یخچال نگهداری کنید تست را با دستگاه کالیبر شده بخوانید طول موج دستگاه را دوباره چک کنید تکرار تست با مواد همان کیت تکرار تست تکرار تست با محلول رنگزا جدید تکرار تست با محلول کونژوگه جدید
12 نوع مشکل صحیح نبودن نمودار باال بودن رنگ زمینه باال بودن OD علت مشکل آلودگی استانداردها پیپتینگ نامناسب PH نامناسب و یا غلظت باالی Wash Buffer شستشوی نامناسب و یا خشک شدن چاهک ها آلودگی استاندارد صفر آلودگی محلول رنگزا آلودگی و یا غلظت پایین Wash Buffer شستشوی نامناسب طول موج نامناسب در خوانش آلودگی محلول Stop ایجاد وقفه در خوانش راه حل از سری استاندارد جدید استفاده کنید استفاده از نوک سمپلر یکبار مصرف از سمپلرهای تک کاناله یا چند کاناله کالیبر شده استفاده کنید توجه کنید نوک سمپلر محکم به سمپلر متصل باشد توجه کنید در هنگام پیپتینگ حباب وارد نوک سمپلر نشود Wash آب مقطر را چک کنید و تست را با PH Buffer جدید تکرار کنید پس از شستشوی کامل و تخلیه چاهک ها بالفاصله تست را ادامه دهید تکرار تست با استاندارد های جدید استفاده از محلول رنگزا جدید عدم آلودگی آب مقطر با موادی مانند وایتکس را چک کنید و تست را با Wash Buffer جدید تکرار کنید تمام سوزن های دستگاه واشر را چک کنید تست را با دستگاه کالیبر شده بخوانید طول موج دستگاه را دوباره چک کنید از فیلتر 630 نانومتر بعنوان فیلتر رفرانس استفاده کنید تکرار تست با محلول Stop جدید بالفاصله بعد از Stop کردن تست یا حداکثر تا 15 دقیقه پلیت را بخوانید
13 نوع مشکل علت مشکل پیپتینگ نامناسب راه حل استفاده از نوک سمپلر یکبار مصرف از سمپلرهای تک کاناله یا چند کاناله کالیبر شده استفاده کنید توجه کنید نوک سمپلر محکم به سمپلر متصل باشد توجه کنید در هنگام پیپتینگ حباب وارد نشود توجه کنید جداره خارجی نوک سمپلر حاوی محلول نباشد کالیبراسیون و تمیز کردن ادواری سمپلر ها عدم تکرار پذیری مناسب طوالنی شدن زمان انجام تست نگهداری نامناسب کیت و عدم رعایت زنجیره سرد باقی ماندن کونژوگه در لبه چاهکها و عدم شستشوی مناسب و یا خشک شدن چاهک ها وجود حباب در چاهک ها کثیف بودن کف چاهکها مخلوط نشدن محلول های کیت فاصله زمانی بین اضافه کردن استاندارد ها و نمونه نباید بیشتر از 10 دقیقه باشد. در این صورت نتایج قابل اعتماد نیست پس از باز کردن کیت تاریخ را ثبت کنید و به تاریخ انقضا توجه کنید پیپتینگ صحیح و شستشوی مناسب پس از شستشوی کامل و تخلیه چاهک ها بالفاصله تست را ادامه دهید در حین انکوباسیون و بعد از Stop کردن واکنش توجه کنید حباب در چاهک ها نباشد کف چاهکها را با دستمال نرم و مرطوب تمیز کنید قبل از استفاده ویال محلول ها را به آرامی تکان دهید
14 خالصه روش آزمایش 2 در برخی از شرایط ممکن است مقادیر هورمون hcg بسیار افزایش پیدا کند. ( IU/L 100,000>( در این نمونه ها احتمال بوجود آمدن پدیده هوک وجود دارد. در صورتی که در نمونه ای )با توجه به شرایط کلینیکی بیمار( انتظار اعداد باالتر از 1000 IU/L را داشته باشیم و در این شرایط عدد به دست آمده در تست کمتر از 1000 IU/L بود الزم است نمونه را با استاندارد صفر رقیق کرده و آزمایش نمائید. از طرفی با استفاده از روش زیر پدیده هوک اتفاق نیفتاده و در نمونه های فوق نتیجه تست در نمونه مستقیم )بدون رقیق سازی( باالی 1000 IU/L خواهد بود. نتایج تست ها با هر دو روش قابل اعتماد بوده ولی به دلیل سادگی انجام تست به روش اول)یک مرحله ای( توصیه می شود. معرف ها استاندارد ها استانداردها نمونه ها - 50 µl 50 µl - نمونه ها «در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه انکوبه نمایید» «5 بار با 350µl محلول بافرشستشو رقیق شده شستشو دهید» 50 µl 50 µl کونژوگه «در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه انکوبه نمایید» «5 بار با 350µl محلول بافرشستشو رقیق شده شستشو دهید» 100 µl 100 µl محلول رنگزا «به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه نمایید» 50 µl 50 µl محلول متوقف کننده «جذب نوری هر چاهک در طول موج 450 nm و فیلتر رفرانس 630 nm قرائت شود.»
خالصه روش آزمایش 1 معرف ها استاندارد ها نمونه ها کونژوگه استانداردها 20 µl - 200 µl نمونه ها - 20 µl 200 µl «در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه انکوبه نمایید» «5 بار با 350µl محلول بافرشستشو رقیق شده شستشو دهید و با دقت محتویات را خالی کنید«100 µl 100 µl محلول رنگزا «به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه نمایید» 50 µl محلول متوقف کننده 50 µl «جذب نوری هر چاهک در طول موج 450 nm و فیلتر رفرانس 630 nm قرائت شود.» www.pishgamansanjesh.com info@pishgamansanjesh.com