1. Ανάπτυξη του νοραδρενεργικού συστήµατος στον VC και στον MC

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ιάφορα αντισώµατα, µεταξύ των οποίων και αντισώµατα εναντίον της DBH, έχουν χρησιµοποιηθεί για την in situ σήµανση και ανίχνευση των νοραδρενεργικών ινών. Μεγάλος αριθµός µελετών, ενδεικτικά αναφέρονται εκείνες των Morrison και συν. (1978), Olschowka και συν. (1981), Liu και Cynader (1994), Wang και Lidow (1997), Aoki και συν. (1998), έδειξαν την ειδικότητα των αντισωµάτων εναντίον της DBH. Για τον λόγο αυτό, στην παρούσα εργασία χρησιµοποιούµε ως ταυτόσηµους τους όρους σεσηµασµένες ίνες και διογκώσεις και νοραδρενεργικές ίνες και διογκώσεις. 1. Ανάπτυξη του νοραδρενεργικού συστήµατος στον VC και στον MC 1.1. Παρατηρήσεις µε το οπτικό µικροσκόπιο Στον νεογέννητο επίµυ παρατηρήθηκαν στoν VC και στον MC δύο οµάδες οριζόντιων, κυρίως, σεσηµασµένων ινών, που βρίσκονταν η µία επιπολής και η άλλη εν τω βάθει της φλοιικής πλάκας (Εικ. 2α, 5α, 9α). Οι ίνες αυτές και τα παράπλευρα κλωνία τους διανέµονταν σταδιακά σε όλες τις στιβάδες του φλοιού. Η επιπολής οµάδα ινών βρισκόταν στο εν τω βάθει τµήµα της επιχείλιας ζώνης (µελλοντική στιβάδα Ι) και αποτελούνταν, κυρίως, από ίνες µεγάλου µήκους, που φέρονταν παράλληλα προς την επιφάνεια του φλοιού. Οι ίνες αυτές εισέρχονταν στον Εικ.2 Μικροφωτογραφίες σκοτεινού πεδίου που δείχνουν την πυκνότητα και την τοπογραφική κατανοµή των νοραδρενεργικών ινών στον οπτικό φλοιό στις ηλικίες Μ0 (α), Μ7 (β), Μ14 (γ), Μ21 (δ) και στον ενήλικο επίµυ (ε). Ράβδος= 100 µm. Συντοµογραφίες που χρησιµοποιήθηκαν σε αυτή και στις επόµενες εικόνες: P, φλοιική πλάκα. WM, λευκή ουσία dlgn, ραχιαίος έξω γονατώδης πυρήνας IGL, µεσογονατώδες φύλλο vlgn, κοιλιακός έξω γονατώδης πυρήνας. 41

42

MC και στον VC από την έξω επιφάνεια του εγκεφαλικού ηµισφαιρίου και έδιναν κλάδους που κατευθύνονταν προς τη φλοιική πλάκα και το επιπολής τµήµα της επιχείλιας ζώνης (Εικ. 6α, 9α). Η πλειονότητα, όµως, των σεσηµασµένων ινών που διανέµονταν στον αναπτυσσόµενο φλοιό, προέρχονταν από την εν τω βάθει οµάδα (βλ. επίσης Εικ. 7α, 7γ). Oι οριζόντιες ίνες της οµάδας αυτής εισέρχονταν στον MC και στον VC είτε από την έξω επιφάνεια του εγκεφαλικού ηµισφαιρίου, µέσω της στιβάδας VI και της λευκής ουσίας, είτε προέρχονταν από ίνες που εισέρχονταν στον φλοιό από τον µετωπιαίο πόλο του εγκεφαλικού ηµισφαιρίου και, διατρέχοντας τη στιβάδα VI και τη λευκή ουσία, έφθαναν στον ινιακό πόλο του (Εικ. 9α). Οι ίνες αυτές έδιναν κλάδους σε όλες τις στιβάδες του φλοιού, πρώτα στις εν τω βάθει και κατόπιν στις επιπολής, καθώς οι στιβάδες αυτές σχηµατίζονταν σταδιακά µε την πάροδο της ηλικίας. Στην ηλικία αυτή, παρατηρήθηκαν ελάχιστες σεσηµασµένες ίνες στη φλοιική πλάκα. Στην υποφλοιική πλάκα, όµως, ιδιαίτερα στον MC, παρατηρήθηκε ένα πυκνό δίκτυο σεσηµασµένων ινών (Εικ. 6ζ, η). Oι νοραδρενεργικές ίνες στον νεογέννητο επίµυ ήταν παχιές, µε λίγα παράπλευρα κλωνία και µεγάλες, ακανόνιστα διατεταγµένες διογκώσεις. Συχνά παρατηρούνταν ίνες χωρίς διογκώσεις τέτοιες ίνες, όµως, δεν παρατηρήθηκαν σε Εικ.3 Μικροφωτογραφίες σκοτεινού πεδίου από τον οπτικό φλοιό σε διάφορες µεταγεννητικές ηλικίες. Στις α, β και γ, φαίνεται η πυκνότητα και η τοπογραφική κατανοµή των νοραδρενεργικών ινών στις επιπολής στιβάδες του φλοιού στις ηλικίες Μ7, Μ14 και στον ενήλικο επίµυ, αντίστοιχα. Στην β, τα βέλη δείχνουν σεσηµασµένες ίνες που διχοτοµούνται στις στιβάδες ΙΙ-ΙΙΙ. Στην δ, φαίνεται µία µακριά οριζόντια ίνα µε µορφή κοµπολογιού στη στιβάδα VI στην ηλικία Μ7. Στην ζ, φαίνεται µία κυµατοειδής ίνα στις στιβάδες ΙΙ-ΙΙΙ στην ηλικία Μ7. Στην ε, φαίνεται η πυκνότητα και η τοπογραφική κατανοµή των νοραδρενεργικών ινών στις στιβάδες IV και V στον ενήλικο επίµυ. Ράβδος= 40 µm. 43

44

µεγαλύτερες ηλικίες. Ορισµένες σεσηµασµένες ίνες διχοτοµούνταν, µε πολύ χαρακτηριστικό τρόπο, κυρίως στις εν τω βάθει στιβάδες και στην υποφλοιική πλάκα (Εικ. 7δ). Θα πρέπει να σηµειωθεί, ιδιαίτερα, ότι στον νεογέννητο επίµυ η πυκνότητα της νοραδρενεργικής εννεύρωσης ήταν µεγαλύτερη στον MC από ό,τι στον VC. Στο τέλος της πρώτης µεταγεννητικής εβδοµάδας, η πυκνότητα των νοραδρενεργικών ινών αυξήθηκε κυρίως στις εν τω βάθει στιβάδες ενώ στις στιβάδες ΙΙ-ΙΙΙ εξακολουθούσε να είναι µικρή (Εικ. 2β, 3α, 5β, 6β, 7β, 8α, 8β). Στην ηλικία αυτή, παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά στις στιβάδες ΙΙ-ΙΙΙ ακτινοειδείς σεσηµασµένες ίνες (Εικ. 4α, 9β), οι οποίες σε ορισµένες περιπτώσεις εµφάνιζαν στη συνέχεια κυµατοειδή πορεία (Εικ. 3ζ, 9β). Σε µεγαλύτερες ηλικίες, παρατηρήθηκαν περισσότερες ίνες µε τέτοια πορεία (Εικ. 6ε, 9γ). Οι ακτινοειδείς ίνες που παρατηρούνταν στις στιβάδες ΙΙ-ΙΙΙ είτε προέρχονταν από τις εν τω βάθει στιβάδες και συµµετείχαν στον σχηµατισµό της οµάδας των οριζόντιων ινών της στιβάδας Ι είτε ήταν κλάδοι των οριζόντιων αυτών ινών που κάµπτονταν απότοµα και κατευθύνονταν προς τις εν τω βάθει στιβάδες. Εικ.4 Μικροφωτογραφίες φωτεινού πεδίου από τον οπτικό φλοιό σε διάφορες µεταγεννητικές ηλικίες. Στην α, µία σεσηµασµένη ακτινοειδής ίνα κατευθύνεται από τις επιπολής προς τις εν τω βάθει στιβάδες (Μ7) το βέλος δείχνει τον αυξητικό κώνο. Στην β, φαίνεται η µορφολογία και η πορεία σεσηµασµένων ινών στις στιβάδες V και VI (Μ14). Στην γ, φαίνεται η µορφολογία και η κατανοµή σεσηµασµένων ινών στη στιβάδα V στον ενήλικο επίµυ. Οι ίνες αυτές είναι λεπτές, µε µικρές διογκώσεις και επικρατούν σε όλες τις στιβάδες του φλοιού. Ράβδος= 25 µm. Εικ.5 Μικροφωτογραφίες σκοτεινού πεδίου που δείχνουν την πυκνότητα και την τοπογραφική κατανοµή των νοραδρενεργικών ινών στον κινητικό φλοιό στις ηλικίες Μ0 (α), Μ7 (β), Μ14 (γ), Μ21 (δ) και στον ενήλικο επίµυ (ε). Ράβδος= 100 µm. 45

46

47

Στο τέλος της δεύτερης µεταγεννητικής εβδοµάδας, οι σεσηµασµένες ίνες ήταν πολυπληθέστερες (Εικ. 2γ, 5γ), λεπτότερες και µε περισσότερες διογκώσεις (Εικ. 4β) από ό,τι στις προηγούµενες ηλικίες. Στην ηλικία αυτή, οι σεσηµασµένες ίνες διανέµονταν πλέον σε όλες τις στιβάδες του φλοιού και εµφάνιζαν τοπογραφική κατανοµή παρόµοια µε εκείνη του ενήλικου επίµυος. εν παρατηρήθηκε διαφορά σε ό,τι αφορά την πυκνότητα των ινών µεταξύ των δύο φλοιικών περιοχών που εξετάστηκαν. Ακτινοειδείς ίνες επικρατούσαν στις στιβάδες ΙΙ-ΙΙΙ (Εικ. 6γ, 8γ) και σε ορισµένες περιπτώσεις σχηµάτιζαν δεσµίδες που αποτελούνταν από 3-5 νευράξονες (Εικ. 6ε). Σε αρκετές περιπτώσεις κάποιες νοραδρενεργικές ίνες διχοτοµούνταν στις στιβάδες ΙΙ-ΙΙΙ (Εικ. 3β). Η σταδιακή εννεύρωση του φλοιού από τις νοραδρενεργικές ίνες κατά τη διάρκεια των πρώτων µεταγεννητικών εβδοµάδων απεικονίζεται στην Εικόνα 9. Στο τέλος της τρίτης µεταγεννητικής εβδοµάδας, παρατηρήθηκε ακόµη µεγαλύτερη πυκνότητα σεσηµασµένων ινών η οποία ήταν συγκρίσιµη µε εκείνη του ενήλικου επίµυος (Εικ. 2δ, 2ε, 5δ, 5ε). Στην ηλικία αυτή, όπως και στον ενήλικο επίµυ, οι σεσηµασµένες ίνες ήταν κατανεµηµένες σε όλες τις στιβάδες του φλοιού και η πλειονότητά τους εµφάνιζε χαρακτηριστική πορεία για κάθε στιβάδα, όπως έχει αναφερθεί και σε προηγούµενες εργασίες (Levitt και Moore, 1978 Morrison και συν., 1978 Papadopoulos και συν., 1989α). Στη στιβάδα Ι, επικρατούσαν µεγάλου µήκους ίνες που διατάσσονταν παράλληλα προς την επιφάνεια του εγκεφαλικού ηµισφαιρίου (Εικ. 3γ, 6δ). Στις στιβάδες II και ΙΙI, οι περισσότερες ήταν ακτινοειδείς ίνες, ενώ παρατηρούνταν και λίγες ίνες µε κυµατοειδή πορεία. Σε αντίθεση µε τις επιπολής στιβάδες στις οποίες επικρατούσαν οι µακριές ίνες, οι στιβάδες IV και V χαρακτηρίζονταν από ίνες µε βραχεία και, συχνά, ελικοειδή πορεία (Εικ. 3ε). Τέλος, στη στιβάδα VI παρατηρούνταν ένα πυκνό δίκτυο από νοραδρενεργικές ίνες µε φορά παράλληλη προς τη λευκή ουσία (Εικ. 8δ). Με κριτήριο το πάχος των ινών 48

και τη µορφολογία των διογκώσεων, αναγνωρίστηκαν τρεις, κυρίως, µορφολογικοί τύποι νοραδρενεργικών ινών: λεπτές ίνες µε µικρές διογκώσεις, ίνες µε µεγαλύτερες διογκώσεις και µορφή κοµπολογιού και παχιές ίνες χωρίς διογκώσεις. Σε όλες τις στιβάδες επικρατούσαν οι λεπτές ίνες µε τις µικρές διογκώσεις (Εικ. 4γ). Οι ίνες µε τη µορφή κοµπολογιού ήταν λιγότερες από τις λεπτές ίνες και εµφανίζονταν κυρίως ως οριζόντιες ίνες στις εν τω βάθει στιβάδες του φλοιού (Εικ. 3δ, 7γ). Οι παχιές ίνες χωρίς διογκώσεις ήταν ελάχιστες και εµφάνιζαν, τις περισσότερες φορές, ακτινοειδή πορεία. Εικ.6 Μικροφωτογραφίες φωτεινού (α, ζ, η) και σκοτεινού (β, γ, δ, ε) πεδίου από τον κινητικό φλοιό σε διάφορες µεταγεννητικές ηλικίες. Στις α, β, γ και δ, φαίνεται η πυκνότητα και η τοπογραφική κατανοµή των νοραδρενεργικών ινών της στιβάδας Ι στις ηλικίες Μ0, Μ7, Μ14 και στον ενήλικο επίµυ, αντίστοιχα. Στην γ, µία ακτινοειδής ίνα κάµπτεται (βέλος) και συνεχίζει την πορεία της ως οριζόντια ίνα στη στιβάδα Ι, ή, αντίθετα, µία οριζόντια ίνα της στιβάδας Ι κάµπτεται και κατευθύνεται προς τις βαθύτερες στιβάδες του φλοιού ως ακτινοειδής ίνα. Στην ε, φαίνεται µία δεσµίδα από σεσηµασµένες ακτινοειδείς ίνες στις στιβάδες ΙΙ-ΙΙΙ (Μ14). Μία από τις ίνες αυτές φαίνεται ότι ακολουθεί στη συνέχεια κυµατοειδή πορεία (βέλος). Στην ζ, φαίνεται η πυκνότατη εννεύρωση της υποφλοιικής πλάκας στον νεογέννητο επίµυ. Στην η, φαίνεται σε µεγαλύτερη µεγέθυνση το ένθετο τµήµα της ζ. Ράβδος= 40 µm (α, β, γ, δ, η), 25 µm (ε) και 105 µm (ζ). Εικ.7 Μικροφωτογραφίες σκοτεινού πεδίου που δείχνουν την πυκνότητα και την τοπογραφική κατανοµή των νοραδρενεργικών ινών στις εν τω βάθει στιβάδες του κινητικού φλοιού στις ηλικίες Μ0 (α, γ) και Μ7 (β) και στην υποφλοιική πλάκα στην ηλικία Μ0 (δ). Στην γ, τα βέλη δείχνουν µία οριζόντια ίνα µε µορφή κοµπολογιού στην στιβάδα VI, η οποία δίνει κλάδους στα επιπολής τµήµατα της στιβάδας αυτής. Στην δ, φαίνεται µία λεπτή ίνα που διχοτοµείται στην υποφλοιική πλάκα. Ράβδος= 40 µm. 49

50

51

Εικ.8 Μικροφωτογραφίες φωτεινού (α, β) και σκοτεινού (γ, δ) πεδίου από τον κινητικό φλοιό στις ηλικίες Μ7 (α, β), Μ14 (γ) και Μ21 (δ). Στην α και στην β, φαίνεται η πορεία και η µορφολογία των οριζόντιων σεσηµασµένων ινών και των παράπλευρων κλάδων τους στις στιβάδες I και VI, αντίστοιχα. Στην γ, φαίνονται πολλές σεσηµασµένες ίνες µε ακτινοειδή πορεία στις επιπολής, κυρίως, στιβάδες του φλοιού. Στην δ, φαίνονται σεσηµασµένες ίνες στις εν τω βάθει στιβάδες του φλοιού. Ράβδος= 40 µm (α, β, δ) και 84 µm (γ). 1.2. Παρατηρήσεις µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο Με το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο, αναγνωρίστηκαν µικρά τµήµατα σεσηµασµένων αµύελων ινών και σεσηµασµένες διογκώσεις σε όλες τις στιβάδες του VC και του MC. Οι διογκώσεις αυτές εµφανίζονταν είτε ανεξάρτητες είτε κατά µήκος σεσηµασµένων ινών και περιείχαν κυστίδια µικρού µεγέθους καθώς και ένα ή περισσότερα µιτοχόνδρια. Τα 52

Εικ.9 Σχηµατική απεικόνιση της νοραδρενεργικής εννεύρωσης στον κινητικό φλοιό κατά τη διάρκεια των πρώτων µεταγεννητικών εβδοµάδων: Μ0 (α), Μ7 (β), Μ14 (γ). To ίδιο σχήµα ισχύει και για τον οπτικό φλοιό. Οι ανοικτοί κύκλοι απεικονίζουν νοραδρενεργικές ίνες που πορεύονται από τον µετωπιαίο προς τον ινιακό πόλο του εγκεφαλικού ηµισφαιρίου µέσω της στιβάδας VI και της λευκής ουσίας. Οι νευράξονες που προέρχονται από τις ίνες αυτές καθώς και οι κλάδοι τους σχεδιάστηκαν µε µπλε χρώµα. Οι νοραδρενεργικές ίνες που εισέρχονται στον κινητικό φλοιό από έξω τµήµατα του ηµισφαιρίου, διατρέχοντας τις στιβάδες Ι, VI και τη λευκή ουσία, και οι κλάδοι τους σχεδιάστηκαν µε κόκκινο χρώµα. µορφολογικά χαρακτηριστικά των διογκώσεων των νοραδρενεργικών ινών και των συνάψεων, που αυτές σχηµάτιζαν, δεν διέφεραν στις δύο περιοχές που εξετάστηκαν και για τον λόγο αυτό τα αποτελέσµατά µας από τις περιοχές αυτές περιγράφονται µαζί. 1.2.1. Νεογέννητος επίµυς Κατά τη γέννηση, παρατηρήθηκαν λίγες µόνο σεσηµασµένες διογκώσεις στον VC και στον MC. Οι διογκώσεις αυτές εντοπίστηκαν κυρίως στην επιχείλια ζώνη, στην υποφλοιική πλάκα και στη διάµεση ζώνη. Συχνά οι σεσηµασµένες διογκώσεις εφάπτονταν µε δενδρίτες (Εικ. 10α) και σπανιότερα µε σώµατα νευρώνων, χωρίς να παρεµβάλλονται µεταξύ τους νευρογλοιακές αποφυάδες. Στην ηλικία αυτή παρατηρήθηκαν ήδη νοραδρενεργικές συνάψεις στις οποίες η προσυναπτική και η µετασυναπτική µεµβράνη διακρίνονταν καλύτερα από ό,τι στις «ανώριµες» συνάψεις στις οποίες συµµετείχαν µη σεσηµασµένες διογκώσεις. Οι νοραδρενεργικές συνάψεις ήταν, κυρίως, συµµετρικές και τα µετασυναπτικά στοιχεία ήταν µικρού ή µεσαίου µεγέθους δενδρίτες (Εικ. 11α). Χαρακτηριστικό εύρηµα, που παρατηρήθηκε µόνο στην ηλικία αυτή, ήταν η παρουσία συµµετρικών συνάψεων µε σώµατα νευρώνων. Οι 53

νευρώνες αυτοί, µε βάση καθιερωµένα µορφολογικά κριτήρια όπως είναι η ύπαρξη του κορυφαίου δενδρίτη, το άφθονο κυτταρόπλασµα και η παρουσία αποκλειστικά συµµετρικών συνάψεων στα σώµατα τους (Peters και Fairén, 1978), θεωρήθηκε ότι είναι ανώριµοι πυραµιδοειδείς νευρώνες. 1.2.2. Μεταγεννητικές ηµέρες 7-21 Στην αρχή της δεύτερης µεταγεννητικής εβδοµάδας, παρατηρήθηκαν σεσηµασµένες διογκώσεις σε όλες τις στιβάδες του φλοιού και µε µεγαλύτερη συχνότητα από ό,τι στον νεογέννητο επίµυ. Η προσυναπτική και η µετασυναπτική µεµβράνη των συνάψεων, στις οποίες συµµετείχαν οι σεσηµασµένες διογκώσεις, διακρίνονταν καλύτερα από ό,τι στη Μ0. Η πλειονότητα των σεσηµασµένων συνάψεων ήταν συµµετρικές και τα µετασυναπτικά στοιχεία ήταν µικρού και µεσαίου µεγέθους δενδρίτες (Εικ. 10β, 11β). Ο αριθµός των διογκώσεων των νοραδρενεργικών ινών αυξήθηκε ακόµη περισσότερο τις επόµενες δύο εβδοµάδες. Στη Μ14 και στη Μ21 οι περισσότερες σεσηµασµένες συνάψεις ήταν συµµετρικές µε δενδρίτες (Εικ. 10γ, 10δ, 11γ, 11η). Στις ηλικίες αυτές παρατηρήθηκαν, επίσης, λίγες ασύµµετρες συνάψεις µε δενδρίτες και ακανθοειδείς προεξοχές (Εικ. 11δ). Σε πολλές περιπτώσεις σεσηµασµένες και µη σεσηµασµένες διογκώσεις εµφανίζονταν να συγκλίνουν σε κοινούς µετασυναπτικούς στόχους οι µετασυναπτικοί αυτοί στόχοι ήταν, συνήθως, δενδρίτες και ακανθοειδείς προεξοχές. Οι σεσηµασµένες διογκώσεις που συµµετείχαν στις σύνθετες αυτές συναπτικές σχέσεις σχηµάτιζαν συµµετρικές συνάψεις (Εικ. 10γ). Παρατηρήθηκε, επίσης, ότι στην περίοδο αυτή της µεταγεννητικής ανάπτυξης, οι διογκώσεις των νοραδρενεργικών ινών βρίσκονταν συχνά σε άµεση γειτνίαση µε µία ή περισσότερες µη σεσηµασµένες διογκώσεις, οι οποίες σε ορισµένες περιπτώσεις σχηµάτιζαν ασύµµετρες συνάψεις µε δενδρίτες και ακανθοειδείς προεξοχές. 54

Εικ.10 Μικροηλεκτρονιογραφίες στις οποίες φαίνονται σεσηµασµένες διογκώσεις στον οπτικό φλοιό στις ηλικίες Μ0 (α), Μ7 (β), Μ14 (γ), Μ21 (δ) και στον ενήλικο επίµυ (ε, ζ). Στην α, µία νοραδρενεργική διόγκωση βρίσκεται σε πολύ στενή επαφή µε έναν δενδρίτη µικρής διαµέτρου. Οι συνάψεις είναι στην πλειονότητά τους συµµετρικές (βέλη) και τα µετασυναπτικά στοιχεία είναι δενδρίτες (D) (β, γ, δ, ε). Στην γ και στην ε, ο ίδιος δενδρίτης δέχεται µία ασύµµετρη σύναψη (κεφαλή βέλους) από ένα µη σεσηµασµένο τελικό κοµβίο (ut). Στην ζ, µία νοραδρενεργική διόγκωση περιβάλλεται από µη σεσηµασµένα τελικά κοµβία, δύο από τα οποία σχηµατίζουν συνάψεις (κεφαλές βελών) µε µη σεσηµασµένους δενδρίτες. Ράβδος= 0,3 µm. 55

1.2.3. Ενήλικος επίµυς Στον ενήλικο επίµυ, οι σεσηµασµένες συνάψεις εµφάνιζαν παρόµοια χαρακτηριστικά µε αυτά των σεσηµασµένων συνάψεων που παρατηρήθηκαν στα νεώτερα ζώα. Οι περισσότερες συνάψεις ήταν συµµετρικές µε δενδρίτες (Εικ. 11ζ), ενώ υπήρχαν και λίγες ασύµµετρες συνάψεις µε δενδρίτες (Εικ. 11θ) και ακανθοειδείς προεξοχές. Οι διογκώσεις των νοραδρενεργικών ινών περιβάλλονταν συχνά, µερικώς ή εξ ολοκλήρου, από µη σεσηµασµένες διογκώσεις, που σε πολλές περιπτώσεις σχηµάτιζαν συνάψεις µε δενδρίτες και ακανθοειδείς προεξοχές (Εικ. 10ζ, 11ε). Επιπλέον, ορισµένες φορές, σεσηµασµένες και µη σεσηµασµένες διογκώσεις σχηµάτιζαν συνάψεις µε τα ίδια µετασυναπτικά στοιχεία που ήταν, κυρίως, δενδρίτες και ακανθοειδείς προεξοχές (Εικ. 10ε). 1.2.4. Ποσοτική ανάλυση Το ποσοστό των σεσηµασµένων διογκώσεων που σχηµάτιζαν συνάψεις στον VC και στον MC του αναπτυσσόµενου και του ενήλικου επίµυος φαίνεται στους Πίνακες 2 και 3, αντίστοιχα. Από τους πίνακες αυτούς προκύπτει ότι µόνο ένα µικρό ποσοστό των σεσηµασµένων διογκώσεων σχηµάτιζαν συνάψεις στις δύο περιοχές, σε όλες τις ηλικίες που εξετάστηκαν. Από τους Πίνακες 2 και 3 και την Εικόνα 12 φαίνεται, Εικ.11 Μικροηλεκτρονιογραφίες στις οποίες φαίνονται σεσηµασµένες διογκώσεις στον κινητικό φλοιό στις ηλικίες Μ0 (α), Μ7 (β), Μ14 (γ), Μ21 (δ, η) και στον ενήλικο επίµυ (ε, ζ, θ). Οι συνάψεις (βέλη) σχηµατίζονται συχνά µε δενδρίτες (D) (α, β, γ, ζ, η, θ) και σπάνια µε ακανθοειδείς προεξοχές (sp) (δ). Οι περισσότερες από τις συνάψεις αυτές είναι συµµετρικές (α, β, γ, ζ, η), παρατηρούνται όµως και λίγες ασύµµετρες συνάψεις (δ, θ). Στην ε, µια νοραδρενεργική διόγκωση περιβάλλεται σχεδόν από µη σεσηµασµένα τελικά κοµβία (ut), τα οποία σχηµατίζουν συνάψεις µε δενδρίτες (κορυφές βελών). Ράβδος= 0,3 µm. 56

57

Πίνακας 2 Αριθµός και ποσοστό των σεσηµασµένων διογκώσεων που σχηµάτιζαν συνάψεις στον οπτικό φλοιό σε διάφορες ηλικίες Ηλικία Επίµυς 1 Επίµυς 2 Επίµυς 3 T m (%) e (%) Μ7 10 11 12 33 5,50 16,18 Μ14 20 16 12 48 8,00 22,85 Μ21 17 19 16 52 8,67 25,50 Ενήλικος επίµυς 20 19 18 57 9,50 28,78 Τα αποτελέσµατα προέκυψαν από τρεις επίµυς για κάθε ηλικία και εξετάστηκαν 200 σεσηµασµένες διογκώσεις ανά πειραµατόζωο. Μ: µεταγεννητική ηµέρα Τ: σύνολο συνάψεων / 600 σεσηµασµένες διογκώσεις m: µέσο ποσοστό σεσηµασµένων συνάψεων στην επιφάνεια µεµονωµένων τοµών e: ποσοστό που προκύπτει µετά την αναγωγή του m στον όγκο µεµονωµένων τοµών. Πίνακας 3 Αριθµός και ποσοστό των σεσηµασµένων διογκώσεων που σχηµάτιζαν συνάψεις στον κινητικό φλοιό σε διάφορες ηλικίες Ηλικία Επίµυς 1 Επίµυς 2 Επίµυς 3 T m (%) e (%) Μ7 14 16 16 46 7,67 23,24 Μ14 20 16 18 54 9,00 27,27 Μ21 20 18 20 58 9,67 26,85 Ενήλικος επίµυς 28 20 24 72 12,00 34,28 Τα αποτελέσµατα προέκυψαν από τρεις επίµυς για κάθε ηλικία και εξετάστηκαν 200 σεσηµασµένες διογκώσεις ανά πειραµατόζωο. Μ: µεταγεννητική ηµέρα Τ: σύνολο συνάψεων / 600 σεσηµασµένες διογκώσεις m: µέσο ποσοστό σεσηµασµένων συνάψεων στην επιφάνεια µεµονωµένων τοµών e: ποσοστό που προκύπτει µετά την αναγωγή του m στον όγκο µεµονωµένων τοµών. 58

40 35 VC MC ΠΟΣΟΣΤΟ ΣΥΝΑΨΕΩΝ (%) 30 25 20 15 10 5 0 Μ7 Μ14 Μ21 Ενήλικος επίµυς ΗΛΙΚΙΑ Εικ.12 Ιστόγραµµα που δείχνει το µέσο ποσοστό (± τυπική απόκλιση) των σεσηµασµένων διογκώσεων που συµµετέχουν στον σχηµατισµό συνάψεων στον οπτικό φλοιό (VC, µπλε µπάρες) και στον κινητικό φλοιό (MC, κίτρινες µπάρες) σε διάφορες ηλικίες. επίσης, ότι το ποσοστό των σεσηµασµένων διογκώσεων που σχηµάτιζαν συνάψεις αυξάνονταν σταδιακά µε την πάροδο της ηλικίας τόσο στον VC όσο και στον MC. Στον MC παρατηρήθηκαν περισσότερες σεσηµασµένες συνάψεις σε σύγκριση µε τον VC σε όλες τις ηλικίες που εξετάστηκαν. Το µεγαλύτερο ποσοστό των σεσηµασµένων διογκώσεων που σχηµάτιζαν συνάψεις (12%) παρατηρήθηκε στον MC του ενήλικου επίµυος. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων φαίνεται στον Πίνακα 4. εν διαπιστώθηκε σηµαντική αλληλεπίδραση µεταξύ ηλικίας και περιοχής 59

(P>0,05). Το µέσο ποσοστό των σεσηµασµένων διογκώσεων που σχηµάτιζαν συνάψεις σε µεµονωµένες τοµές του VC δεν ήταν στατιστικά σηµαντικά διαφορετικό µεταξύ των ηλικιών που εξετάστηκαν. Στον MC, οι τιµές του µέσου αυτού ποσοστού δεν διέφεραν σηµαντικά στις ηλικίες Μ7, Μ14 και Μ21, παρουσίαζαν, όµως, στατιστικά σηµαντική διαφορά µε την αντίστοιχη τιµή του ενήλικου επίµυος. Η σύγκριση του µέσου ποσοστού των σεσηµασµένων διογκώσεων που σχηµάτιζαν συνάψεις µεταξύ των δύο αυτών περιοχών του φλοιού, χωριστά για κάθε ηλικία, έδειξε ότι υπάρχει στατιστικά σηµαντική διαφορά µόνο στην ηλικία Μ7. Η µέση διάµετρος των διογκώσεων των νοραδρενεργικών ινών καθώς και το µέσο µήκος της ενεργού ζώνης των σεσηµασµένων συνάψεων δεν µεταβάλλονταν κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης ούτε στον VC ούτε στον MC (Πίν. 5). Πίνακας 4 Συγκριτική ανάλυση του ποσοστού (%) των σεσηµασµένων διογκώσεων που σχηµατίζουν συνάψεις σε µεµονωµένες τοµές στον οπτικό και στον κινητική φλοιό Ηλικία Οπτικός φλοιός Κινητικός φλοιός Μ7 5,50 ± 0,58 Ba 7,67 ± 0,67 Ab Μ14 8,00 ± 2,31 Ba 9,00 ± 1,15 Aa Μ21 8,67 ± 0,88 Ba 9,67 ± 0,67 Aa Ενήλικος επίµυς 9,50 ± 0,58 Ba 12,00 ± 2,31 Ba Στον πίνακα αυτό δίνονται οι µέσοι όροι ± τυπικό σφάλµα του µέσου. Οι µέσοι όροι της ίδιας στήλης που αφορούν την ίδια περιοχή και δεν έχουν κοινό εκθέτη (A, B) παρουσιάζουν στατιστικά σηµαντική διαφορά (P 0,05). Οι µέσοι όροι της ίδιας γραµµής που αφορούν την ίδια ηλικία και δεν έχουν κοινό εκθέτη (a, b) παρουσιάζουν στατιστικά σηµαντική διαφορά (P 0,05). 60

Πίνακας 5 Μέση διάµετρος (D σε µm) των σεσηµασµένων διογκώσεων και µέσο µήκος (ls σε µm) της ενεργού ζώνης των σεσηµασµένων συνάψεων στον οπτικό και στον κινητικό φλοιό Ηλικία Οπτικός φλοιός Κινητικός φλοιός Μ7 D 0,69 ± 0,10 0,71 ± 0,05 ls 0,23 ± 0,03 0,23 ± 0,02 Μ14 D 0,69 ± 0,08 0,71 ± 0,04 ls 0,24 ± 0,02 0,23 ± 0,01 Μ21 D 0,70 ± 0,09 0,68 ± 0,07 ls 0,24 ± 0,02 0,25 ± 0,02 Ενήλικος επίµυς D 0,70 ± 0,07 0,68 ± 0,04 ls 0,26 ± 0,01 0,24 ± 0,02 Στον πίνακα αυτό δίνονται οι µέσοι όροι ± τυπικό σφάλµα του µέσου. 2. Ανάπτυξη του νοραδρενεργικού συστήµατος στον ραχιαίο έξω γονατώδη πυρήνα του µεταθαλάµου 2.1. Παρατηρήσεις µε το οπτικό µικροσκόπιο Στον νεογέννητο επίµυ, παρατηρήθηκαν λίγες σεσηµασµένες ίνες στον dlgn (Εικ. 13α). Οι περισσότερες από τις ίνες αυτές ήταν βραχείες, χωρίς παράπλευρα κλωνία, µε λίγες διογκώσεις και παχιές, ιδιαίτερα, µάλιστα, αν συγκριθούν µε τις ίνες που παρατηρήθηκαν σε µεγαλύτερες ηλικίες (Εικ. 14α). Νοραδρενεργικές ίνες µε την ίδια µορφολογία, αλλά σε µικρότερο αριθµό, παρατηρήθηκαν και στον vlgn. Στο τέλος της πρώτης µεταγεννητικής εβδοµάδας, παρατηρήθηκε στον dlgn σηµαντική αύξηση των σεσηµασµένων ινών (Εικ. 13β). Στον vlgn, αντίθετα, οι σεσηµασµένες ίνες ήταν λιγότερες. Η διαφορά αυτή 61

στην πυκνότητα της νοραδρενεργικής εννεύρωσης µεταξύ του dlgn και του vlgn παρατηρούνταν σε όλη τη διάρκεια της µεταγεννητικής ανάπτυξης και στον ενήλικο επίµυ. Οι νοραδρενεργικές ίνες ήταν µακριές, οριζόντιες και οµοιόµορφα κατανεµηµένες σε όλη την έκταση του dlgn ορισµένες εµφάνιζαν βραχεία ελικοειδή πορεία (Εικ. 14β). Στην ηλικία αυτή οι νοραδρενεργικές ίνες ήταν στην πλειονότητα τους λεπτότερες και έφεραν περισσότερες διογκώσεις από ό,τι στον νεογέννητο επίµυ (Εικ. 15α). Στο τέλος της δεύτερης µεταγεννητικής εβδοµάδας, οι νοραδρενεργικές ίνες εµφάνιζαν ακόµη µεγαλύτερη πυκνότητα στον dlgn και την τοπογραφική κατανοµή που παρατηρείται στον ενήλικο επίµυ (Εικ. 13γ). Οι ίνες αυτές είχαν πολλούς παράπλευρους κλάδους και σχηµάτιζαν ένα πολύ πυκνό δίκτυο. Στην ηλικία αυτή οι νοραδρενεργικές ίνες γίνονταν ακόµη λεπτότερες και µε περισσότερες διογκώσεις. Οι περισσότερες σεσηµασµένες ίνες είχαν βραχεία ελικοειδή πορεία, υπήρχαν, όµως, και λίγες µακριές ίνες (Εικ. 15β). Στο τέλος της τρίτης µεταγεννητικής εβδοµάδας, οι νοραδρενεργικές ίνες εµφάνιζαν µορφολογία και πυκνότητα παρόµοια µε εκείνη του ενήλικου επίµυος (Εικ. 13δ, 14γ, 14δ, 15γ). Στον ενήλικο επίµυ οι νοραδρενεργικές ίνες ήταν, σχεδόν αποκλειστικά, λεπτές, µε βραχεία ελικοειδή πορεία και έφεραν πολλές διογκώσεις (Εικ. 15δ). Εικ.13 Μικροφωτογραφίες σκοτεινού πεδίου που δείχνουν την πυκνότητα και την τοπογραφική κατανοµή των νοραδρενεργικών ινών στον έξω γονατώδη πυρήνα στις ηλικίες Μ0 (α), Μ7 (β), Μ14 (γ) και Μ21 (δ). Ράβδος= 100 µm. Εικ.14 Μικροφωτογραφίες σκοτεινού πεδίου στις οποίες φαίνεται η πυκνότητα και η τοπογραφική κατανοµή των νοραδρενεργικών ινών στον ραχιαίο έξω γονατώδη πυρήνα στις ηλικίες Μ0 (α), Μ7 (β), Μ21 (γ) και στον ενήλικο επίµυ (δ). Ράβδος= 40 µm 62

63

64

Εικ.15 Μικροφωτογραφίες φωτεινού πεδίου στις οποίες φαίνεται η µορφολογία, η πυκνότητα και η τοπογραφική κατανοµή των νοραδρενεργικών ινών στον ραχιαίο έξω γονατώδη πυρήνα στις ηλικίες Μ7 (α), Μ14 (β), Μ21 (γ) και στον ενήλικο επίµυ (δ). Ράβδος= 40 µm. 65

2.2. Παρατηρήσεις µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο Με το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο παρατηρήθηκαν σεσηµασµένες ίνες και διογκώσεις σε όλη την έκταση του dlgn, σε όλες τις ηλικίες που εξετάστηκαν. Οι διογκώσεις των νοραδρενεργικών ινών εµφανίζονταν είτε ανεξάρτητες είτε κατά µήκος σεσηµασµένων ινών και περιείχαν µικρά κυστίδια και ένα ή περισσότερα µιτοχόνδρια. Παρατηρήθηκε, επίσης, ότι οι σεσηµασµένες συνάψεις δεν συµµετείχαν στον σχηµατισµό των σπειραµάτων. Στον dlgn του νεογέννητου επίµυος, παρατηρήθηκαν λίγες σεσηµασµένες ίνες. Οι ίνες αυτές έφεραν διογκώσεις µεγαλύτερου µεγέθους από ό,τι στις µεγαλύτερες ηλικίες. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι διογκώσεις των νοραδρενεργικών ινών ήταν σε στενή επαφή µε κυτταρικά σώµατα και δενδρίτες, χωρίς να παρεµβάλλονται µεταξύ τους νευρογλοιακές αποφυάδες. Συνάψεις παρατηρήθηκαν σε λίγες µόνο περιπτώσεις. Οι συνάψεις αυτές ήταν συµµετρικές µε δενδρίτες και η προσυναπτική και η µετασυναπτική µεµβράνη τους ήταν περισσότερο ευδιάκριτες συγκριτικά µε τις µεµβράνες των συνάψεων που σχηµάτιζαν µη σεσηµασµένες διογκώσεις. Στο τέλος της πρώτης µεταγεννητικής εβδοµάδας, οι σεσηµασµένες διογκώσεις ήταν περισσότερες, µόνο λίγες, όµως, σχηµάτιζαν συνάψεις. Οι συνάψεις αυτές ήταν κυρίως συµµετρικές µε δενδρίτες, µικρού ή µεσαίου µεγέθους. Παρατηρήθηκαν, επίσης, λίγες ασύµµετρες συνάψεις (Εικ. 16α). Στο τέλος της δεύτερης µεταγεννητικής εβδοµάδας, παρατηρήθηκαν κυρίως συµµετρικές αξονοδενδριτικές συνάψεις (Εικ. 16β, 16γ), καθώς και λίγες ασύµµετρες συνάψεις µε ακανθοειδείς προεξοχές. Στο τέλος της τρίτης µεταγεννητικής εβδοµάδας, η πυκνότητα των σεσηµασµένων διογκώσεων αυξήθηκε. Οι σεσηµασµένες συνάψεις ήταν παρόµοιες µε αυτές που παρατηρήθηκαν τη Μ14 και τα µετασυναπτικά στοιχεία ήταν κυρίως δενδρίτες και σε σπάνιες περιπτώσεις ακανθοειδείς 66

Εικ.16 Μικροηλεκτρονιογραφίες στις οποίες φαίνονται σεσηµασµένες διογκώσεις στον ραχιαίο έξω γονατώδη πυρήνα στις ηλικίες Μ7 (α), Μ14 (β, γ) και Μ21 (δ). Οι διογκώσεις των νοραδρενεργικών ινών σχηµατίζουν συνάψεις (βέλη) κυρίως µε δενδρίτες (D) µικρής διαµέτρου σε όλες τις ηλικίες. Οι περισσότερες από τις συνάψεις αυτές είναι συµµετρικές (β, γ, δ), παρατηρούνται όµως και λίγες ασύµµετρες συνάψεις (α). Ράβδος= 0,3 µm. 67

προεξοχές. Αρκετά συχνά στις ηλικίες Μ14 και Μ21, οι µετασυναπτικοί στόχοι των διογκώσεων των νοραδρενεργικών ινών δέχονταν συνάψεις και από µη σεσηµασµένα τελικά κοµβία, οι οποίες στις περισσότερες περιπτώσεις ήταν ασύµµετρες (Εικ. 16δ). Τα αποτελέσµατα των µετρήσεών µας και το ποσοστό των σεσηµασµένων διογκώσεων που σχηµάτιζαν συνάψεις στον ραχιαίο έξω γονατώδη πυρήνα φαίνονται στους Πίνακες 6 και 7. Το ποσοστό αυτό ήταν πολύ χαµηλό σε όλη τη διάρκεια της µεταγεννητικής ανάπτυξης και αυξανόταν ελάχιστα µε την πάροδο της ηλικίας (Πίν. 6). Η µέση διάµετρος των διογκώσεων των νοραδρενεργικών ινών καθώς και το µέσο µήκος της ενεργού ζώνης των σεσηµασµένων συνάψεων δεν µεταβάλλονταν κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (Πίν. 7). Πίνακας 6 Αριθµός και ποσοστό των σεσηµασµένων διογκώσεων που σχηµάτιζαν συνάψεις σε µεµονωµένες τοµές του ραχιαίου έξω γονατώδους πυρήνα σε διάφορες ηλικίες Ηλικία Επίµυς 1 Επίµυς 2 Επίµυς 3 Τ m (%) e (%) Μ7 7 7 8 22 3,70 10,88 Μ14 7 8 10 25 4,00 11,76 Μ21 10 11 10 31 5,20 14,86 Τα αποτελέσµατα προέκυψαν από τρεις επίµυς για κάθε ηλικία και εξετάστηκαν 200 σεσηµασµένες διογκώσεις ανά πειραµατόζωο. Μ: µεταγεννητική ηµέρα Τ: σύνολο συνάψεων / 600 σεσηµασµένες διογκώσεις m: µέσο ποσοστό σεσηµασµένων συνάψεων στην επιφάνεια µεµονωµένων τοµών e: ποσοστό που προκύπτει µετά την αναγωγή του m στον όγκο µεµονωµένων τοµών. 68

Πίνακας 7 Μέση διάµετρος (D σε µm) των σεσηµασµένων διογκώσεων και µέσο µήκος (ls σε µm) της ενεργού ζώνης των σεσηµασµένων συνάψεων στον ραχιαίο έξω γονατώδη πυρήνα Ηλικία Ραχιαίος έξω γονατώδης πυρήνας Μ7 D 0,68 ± 0,07 ls 0,23 ± 0,01 Μ14 D 0,69 ± 0,10 ls 0,23 ± 0,03 Μ21 D 0,68 ± 0,04 ls 0,24 ± 0,02 Στον πίνακα αυτό δίνονται οι µέσοι όροι ± τυπικό σφάλµα του µέσου. 69