ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ ΕΞΩ ΓΟΝΑΤΩ Η ΠΥΡΗΝΑ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΒΛΑΒΕΣ ΠΡΟΣΑΓΩΓΩΝ ΚΑΙ ΑΠΑΓΩΓΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΟΜΗΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΩΝ ΖΩΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΘΕΤΙ ΑΣ Γ. ΖΑΧΑΡΑΚΗ Κτηνιάτρου ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ ΕΞΩ ΓΟΝΑΤΩ Η ΠΥΡΗΝΑ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΒΛΑΒΕΣ ΠΡΟΣΑΓΩΓΩΝ ΚΑΙ ΑΠΑΓΩΓΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΙΝΩΝ ΤΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΑΥΤΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

2

3 ΘΕΤΙ ΑΣ Γ. ΖΑΧΑΡΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ ΕΞΩ ΓΟΝΑΤΩ Η ΠΥΡΗΝΑ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΒΛΑΒΕΣ ΠΡΟΣΑΓΩΓΩΝ ΚΑΙ ΑΠΑΓΩΓΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΙΝΩΝ ΤΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΑΥΤΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στην Κτηνιατρική Σχολή, Τοµέας οµής και Λειτουργίας των Ζωικών Οργανισµών Ηµεροµηνία Προφορικής Εξέτασης: Εξεταστική Επιτροπή Επίκουρη Καθηγήτρια Ι. ωρή Καθηγητής Α. Ντινόπουλος Καθηγητής Ι. Παρναβέλας Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Καθηγήτρια Ε. Καλδρυμίδου Καθηγητής Α. Μάνθος Αν. Καθ. Ι. Αντωνόπουλος Αν. Καθ. Ε. Μιχαλούδη Λέκτορας Α. Τσιγκοτζίδου Εξετάστρια Εξεταστής Εξεταστής Εξετάστρια Εξετάστρια

4 Θέτις Γ. Ζαχαράκη Α.Π.Θ. ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ ΕΞΩ ΓΟΝΑΤΩ Η ΠΥΡΗΝΑ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΒΛΑΒΕΣ ΠΡΟΣΑΓΩΓΩΝ ΚΑΙ ΑΠΑΓΩΓΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΙΝΩΝ ΤΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΑΥΤΗΣ ISBN «Η έγκριση της παρούσης ιδακτορικής ιατριβής από την Κτηνιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως». (Νόµος 5343/1932, άρθρο 202 παρ. 2)

5 Στους γονείς μου Γιώργο και Ρέα Στο σύζυγό μου Λουκά Στα παιδιά μου Θανάση και Ρέα

6

7 Πίνακας Περιεχοµένων ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ...7 Α. ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ LGN...7 Β. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ dlgn ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ dlgn ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΤΟΥ dlgn ΝΕΥΡΟΧΗΜΙΚΟΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ dlgn ΣΥΝ ΕΣΕΙΣ ΤΟΥ dlgn ΠΡΟΣΑΓΩΓΕΣ ΙΝΕΣ Α ΠΡΟΣΑΓΩΓΕΣ ΙΝΕΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙ Η ΧΙΤΩΝΑ ΤΟΥ ΟΦΘΑΛΜΟΥ Α 1 ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙ ΟΥΣ ΧΙΤΩΝΑ Α 2 ΟΠΤΙΚΟ ΧΙΑΣΜΑ ΚΑΙ ΟΠΤΙΚΗ ΤΑΙΝΙΑ Α 3 ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΤΩΝ ΠΡΟΣΑΓΩΓΩΝ ΙΝΩΝ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑµΧ ΣΤΟΝ dlgn Β ΠΡΟΣΑΓΩΓΕΣ ΙΝΕΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΟΠΤΙΚΟ ΦΛΟΙΟ Γ ΠΡΟΣΑΓΩΓΕΣ ΙΝΕΣ ΑΠΟ ΥΠΟΦΛΟΙΙΚΕΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ Γ 1 ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΠΟΥ ΑΝΗΚΟΥΝ ΣΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Γ 2 ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΠΟΥ ΕΝ ΑΝΗΚΟΥΝ ΣΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΑΠΑΓΩΓΕΣ ΙΝΕΣ ΣΥΝΑΠΤΙΚΗ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ dlgn ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΟΥ dlgn...21 Γ. ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΕΝΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗ ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΤΟΥ PCD ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ ΤΟΥ PCD ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ.40 i

8 Πίνακας Περιεχοµένων 4. Η ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΤΩΝ ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΣΤΟ ΚΝΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΤΡΑΥΜΑΤΙΚΗ ΒΛΑΒΗ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ...46 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟ ΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΜΕΘΟ ΟΣ TUNEL ΜΕΘΟ ΟΣ ΑΒΙ ΙΝΗΣ ΒΙΟΤΙΝΗΣ ΜΕΘΟ ΟΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΙ Α ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ Β ΜΕΘΟ ΟΣ ΙΠΛΗΣ ΣΗΜΑΝΣΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΙ ΣΥΛΛΟΓΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΜΕΘΟ ΟΣ TUNEL ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ ΜΕΘΟ ΟΣ ΙΠΛΗΣ ΣΗΜΑΝΣΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ...70 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...73 ΣΧΟΛΙΑ ΓΙΑ ΤΙΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΤΟΥΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΣΜΟΥΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Α ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ A 1 ΜΕΘΟ ΟΣ TUNEL A 2 ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ Β ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ ΤΩΝ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ...84 ii

9 Πίνακας Περιεχοµένων 2. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΚΑΤΑΣΤΡΟΦΗ ΤΩΝ ΠΡΟΣΑΓΩΓΩΝ ΙΝΩΝ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑµΧ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΤΟΥ ΒΟΛΒΟΥ ΤΟΥ ΟΦΘΑΛΜΟΥ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΒΛΑΒΗΣ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Α ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Α 1 ΜΕΘΟ ΟΣ TUNEL Α 2 ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ Β ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Α ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΤΟΥ ΒΟΛΒΟΥ ΤΟΥ ΟΦΘΑΛΜΟΥ ΤΗ Μ Β ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΤΟΥ ΒΟΛΒΟΥ ΤΟΥ ΟΦΘΑΛΜΟΥ ΣΕ ΜΕΤΑΓΕΝΕΣΤΕΡΑ ΣΤΑ ΙΑ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΤΩΝ «ΖΩΝΤΑΝΩΝ» ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΟΝ dlgn ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ ΤΩΝ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΒΛΑΒΗ ΤΟΥ ΦΛΟΙΟΥ ΤΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΒΛΑΒΗΣ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Α ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΒΛΑΒΗ ΤΟΥ ΦΛΟΙΟΥ ΤΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ ΤΗ Μ Α 1 ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ - ΜΕΘΟ ΟΣ TUNEL Α 1 ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ - ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ Α 2 ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΗΛΕΚΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ iii

10 Πίνακας Περιεχοµένων 3.2Β ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΒΛΑΒΗ ΤΟΥ ΦΛΟΙΟΥ ΤΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ ΣΕ ΜΕΤΑΓΕΝΕΣΤΕΡΑ ΣΤΑ ΙΑ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ ΣΤΟΝ dlgn ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΙΝΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΤΥΠΟΥ Η ΑΠΟΠΤΩΣΗ ΣΤΟΝ dlgn ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΥΜΒΑΙΝΕΙ ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΗΣ ΜΕΤΑΓΕΝΝΗΤΙΚΗΣ ΕΒ ΟΜΑ ΑΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΙΠΤΕΙ ΧΡΟΝΙΚΑ ΜΕ ΤΗΝ ΠΕΡΙΟ Ο ΩΡΙΜΑΣΗΣ ΤΩΝ ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΤΟΥ ΚΑΙ Ε ΡΑΙΩΣΗΣ ΤΩΝ ΣΥΝ ΕΣΕΩΝ ΤΟΥ ΜΕ ΤΟΝ ΑµΧ ΚΑΙ ΤΟΝ ΟΠΤΙΚΟ ΦΛΟΙΟ Ο ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ ΣΤΟΝ dlgn ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΒΛΑΒΕΣ ΤΩΝ ΣΥΝ ΕΣΕΩΝ ΤΟΥ ΕΙΝΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΤΥΠΟΥ Η ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΤΟΥ ΒΟΛΒΟΥ ΤΟΥ ΟΦΘΑΛΜΟΥ ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΑΥΞΗΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ ΕΤΕΡΟΠΛΑΓΙΟ dlgn Η ΟΠΟΙΑ ΟΜΩΣ ΕΝ ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΤΟΝ ΤΕΛΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΠΛΗΘΥΣΜΟ TOY ΠΥΡΗΝΑ Η ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΤΟΥ ΦΛΟΙΟΥ ΤΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΜΕΓΑΛΗ ΑΥΞΗΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ ΟΜΟΠΛΑΓΙΟ dlgn ΚΑΙ Ο ΗΓΕΙ ΣΤΗΝ ΕΚΦΥΛΙΣΗ TOY ΠΥΡΗΝΑ Η ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΩΝ ΥΟ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΑΠΟΚΑΛΥΠΤΕΙ ΟΤΙ Η ΑΠΟΠΤΩΣΗ ΣΤΟΝ dlgn ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΒΛΑΒΕΣ ΤΩΝ ΣΥΝ ΕΣΕΩΝ ΤΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟ ΕΙ ΟΣ ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΚΤΑΣΗ ΤΩΝ ΣΥΝ ΕΣΕΩΝ ΠΟΥ ΚΑΤΑΣΤΡΕΦΟΝΤΑΙ ΣΠΟΥ ΑΙΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ iv

11 Πρόλογος ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο έξω γονατώδης πυρήνας ή πυρήνας του έξω γονατώδους σώµατος (Lateral Geniculate Nucleus, LGN) βρίσκεται στο έξω ραχιαίο τµήµα του θαλάµου και αποτελεί περιοχή της οπτικής οδού. Απαρτίζεται από δύο επιµέρους πυρήνες, τον ραχιαίο (dlgn) και τον κοιλιακό (vlgn), ανάµεσα στους οποίους παρεµβάλλεται το µεσογονατώδες φύλλο (IGL), µία λεπτή ζώνη νευρικών κυττάρων και ινών. Από το σύνολο των πυρήνων που συγκροτούν το οπτικό σύστηµα, ο dlgn είναι ο µοναδικός που προβάλλει στον φλοιό των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων, στέλνοντας ίνες που διανέµονται σχεδόν αποκλειστικά στον πρωτοταγή οπτικό φλοιό του οµοπλάγιου ηµισφαιρίου. Επιπλέον, δέχεται προσαγωγές ίνες από τον αµφιβληστροειδή χιτώνα και των δύο οφθαλµών, τον οπτικό φλοιό και υποφλοιικά κέντρα του εγκεφάλου. Ο προγραµµατισµένος κυτταρικός θάνατος είναι θεµελιώδης διεργασία της ανάπτυξης του νευρικού συστήµατος (ΝΣ) και παίζει ρόλο στον καθορισµό του τελικού αριθµού των νευρικών κυττάρων και την οργάνωση των µεταξύ τους συνδέσεων. Ποικίλες µελέτες έχουν δείξει ότι οι πυρήνες του θαλάµου υφίστανται απώλεια κυττάρων µετά από κρανιοεγκεφαλικές κακώσεις, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις καταστροφής του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων. Οι µηχανισµοί που ενεργοποιούνται στις καταστάσεις αυτές έχει αποδειχθεί ότι σχετίζονται άµεσα µε εκείνους που διέπουν τις διεργασίες της ανάπτυξης του ΝΣ και ειδικότερα µε τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, ο οποίος αποτελεί τον επικρατέστερο τύπο προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου. Η απόπτωση των κυττάρων του θαλάµου αποδίδεται στην καταστροφή των συνδέσεών τους και στην επακόλουθη άρση της τροφικής τους υποστήριξης από πολυπεπτιδικούς τροφικούς παράγοντες. Οι παράγοντες αυτοί προάγουν την επιβίωση των νευρώνων στους οποίους 1

12 Πρόλογος µεταφέρονται κυρίως µέσω προσαγωγών και απαγωγών συστηµάτων ινών. Μεταξύ αυτών, αδιαµφισβήτητη νευροπροστατευτική δράση ασκούν οι νευροτροφικοί παράγοντες. Η έλλειψή τους πυροδοτεί την απόπτωση των κυττάρων, µέσω πολύπλοκων µηχανισµών και αλυσιδωτών αντιδράσεων. Πολλοί είναι οι παράγοντες που καθορίζουν την έκβαση µιας κρανιοεγκεφαλικής κάκωσης, µεταξύ των οποίων κυρίαρχη θέση κατέχουν ο βαθµός της ωρίµασης του ΝΣ κατά τη χρονική στιγµή της κάκωσης και το είδος των συνδέσεων που καταστρέφονται. Προκειµένου να διερευνηθούν οι παράγοντες που συµµετέχουν και οι µηχανισµοί που ενεργοποιούνται σε κάθε περίπτωση, γίνεται προσπάθεια για την in vivo αξιολόγησή τους µε την ανάπτυξη ποικίλων πειραµατικών προτύπων. Η καταστροφή των συνδέσεων του dlgn προσφέρει ένα χρήσιµο πειραµατικό πρότυπο για τη διερεύνηση της απόπτωσης µετά από κρανιοεγκεφαλικές κακώσεις. Αυτό οφείλεται στην οργάνωση των συνδέσεων του dlgn, που επιτρέπει τη µελέτη των επιπτώσεων που έχει η καταστροφή συγκεκριµένων συστηµάτων ινών σε νευρώνες του κεντρικού νευρικού συστήµατος (ΚΝΣ). Στην εργασία αυτή µελετήθηκε το φαινόµενο της απόπτωσης στον dlgn κατά την ανάπτυξη και µετά από βλάβες προσαγωγών και απαγωγών συστηµάτων ινών της περιοχής αυτής. Ειδικότερα, οι βλάβες αυτές αφορούσαν στην αφαίρεση του βολβού του ενός οφθαλµού ή στην αφαίρεση του οπτικού φλοιού του ενός εγκεφαλικού ηµισφαιρίου, σε διάφορα στάδια της ανάπτυξης. Οι στόχοι της παρούσας µελέτης ήταν οι εξής: 1) Να περιγραφεί το φαινόµενο της απόπτωσης στον dlgn κατά την ανάπτυξη και να προσδιοριστεί ο φαινότυπος των κυττάρων που αποπίπτουν, 2) να πιστοποιηθεί ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος µε µορφολογικά κριτήρια και µε τη µελέτη της έκφρασης των ειδικών γονιδίων που προάγουν την απόπτωση, λόγου χάριν του γονιδίου που 2

13 Πρόλογος κωδικοποιεί την κασπάση-3 και 3) να διερευνηθούν οι επιπτώσεις που έχει η καταστροφή προσαγωγών και απαγωγών συνδέσεων του dlgn στη βιωσιµότητα των κυττάρων του και να γίνει συσχετισµός των επιπτώσεων αυτών µε αναπτυξιακές διεργασίες της περιοχής αυτής. Η παρούσα εργασία αποτελείται από τέσσερις ενότητες. Στην πρώτη ενότητα γίνεται ανασκόπηση των βιβλιογραφικών δεδοµένων σχετικά µε τα µορφολογικά και βιοχηµικά χαρακτηριστικά των νευρώνων του dlgn, τις συνδέσεις που σχηµατίζουν µε τις άλλες περιοχές του ΝΣ, καθώς και µε το χρονοδιάγραµµα των αναπτυξιακών διεργασιών που παρατηρούνται στον πυρήνα. Επιπλέον, περιγράφονται οι κατηγορίες και οι µορφολογικοί τύποι του προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου και οι παράγοντες που ρυθµίζουν την απόπτωση των κυττάρων τόσο κατά την ανάπτυξη όσο και µετά από τραυµατικές κακώσεις του εγκεφάλου. Στη δεύτερη ενότητα, περιγράφονται οι µέθοδοι που χρησιµοποιήθηκαν, το πειραµατικό υλικό και ο τρόπος ανάλυσης των αποτελεσµάτων. Στην τρίτη ενότητα, γίνεται αναλυτική περιγραφή των αποτελεσµάτων που προέκυψαν και στην τελευταία ενότητα η µελέτη ολοκληρώνεται µε τη συζήτηση και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων και το συσχετισµό τους µε τα αποτελέσµατα άλλων ερευνών µε συναφές αντικείµενο. Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Ανατοµικής, Ιστολογίας και Εµβρυολογίας της Κτηνιατρικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη της Επίκουρης Καθηγήτριας κυρίας Ιωάννας ωρή, στην οποία οφείλω να εκφράσω τις ειλικρινείς µου ευχαριστίες για την πολύτιµη ευκαιρία που µου έδωσε µε την ανάθεση της παρούσας διατριβής, τη συνεχή παρακολούθηση, την έµπειρη καθοδήγηση και τη βοήθεια που µου προσέφερε τόσο κατά τη διάρκεια του πειραµατικού µέρους όσο και κατά 3

14 Πρόλογος τη συγγραφή, αλλά και για την αµέριστη και πολύπλευρη υποστήριξή της καθόλη τη διάρκεια της ερευνητικής µου προσπάθειας. Θερµότατα ευχαριστώ τον Καθηγητή κ. Αθανάσιο Ντινόπουλο, µέλος της συµβουλευτικής επιτροπής, όχι µόνο για την πολύτιµη βοήθεια που µου προσέφερε κατά τη διάρκεια των πειραµάτων και τις εποικοδοµητικές συµβουλές και παρατηρήσεις του κατά τη διάρκεια της συγγραφής, αλλά και για την πάντα πρόθυµη και διαρκή του στήριξη στην επίλυση των επιστηµονικών προβληµατισµών µου. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Καθηγητή κ. Ιωάννη Παρναβέλα, µέλος της συµβουλευτικής επιτροπής, για την επιστηµονική καθοδήγηση και την ουσιαστική συµβολή του στην διεξαγωγή σηµαντικού µέρους των πειραµάτων. Επίσης, ευχαριστώ θερµά τον Καθηγητή Οικονοµίας Ζωικής Παραγωγής και Εφαρµοσµένης Στατιστικής κ. Χρήστο Μπάτζιο για τη συµβολή του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων. Τις ειλικρινείς µου ευχαριστίες εκφράζω στον Πρύτανη του Α.Π.Θ Καθηγητή κ. Αναστάσιο Μάνθο, στην Καθηγήτρια κα Ελένη Καλδρυµίδου, στον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Ιωάννη Αντωνόπουλο, στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα Ελένη Μιχαλούδη και στη Λέκτορα κα Αναστασία Τσιγκοτζίδου, µέλη της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής, για το ειλικρινές ενδιαφέρον τους και τις διεξοδικές και εύστοχες παρατηρήσεις και συµβουλές τους κατά τη διόρθωση των δοκιµίων. Ένα µεγάλο ευχαριστώ οφείλω από καρδιάς στα µέλη του εργαστηρίου Ανατοµικής και Ιστολογίας κα Μαρία Χιωτέλλη, κ. Χρήστο ρόσο, κα Άννα Τσιπηνιά και κ. Γιώργο Φαρδέλλα τόσο για την πολύτιµη συνεισφορά τους σε τεχνικά θέµατα όσο και για την αγάπη και υποστήριξή τους καθώς, επίσης, και στους κ.κ. Θεοδόση Ζλάτη, Πολυχρόνη Τσουµπελίδη, Κώστα Φαρδέλλα και στην κα Ευαγγελία Τασούλη για τη βοήθεια που µου προσέφεραν. Θέλω, ακόµη, να 4

15 Πρόλογος ευχαριστήσω ιδιαίτερα τις καλές µου φίλες και συνεργάτιδες Βιβή Σοφού και Μαρία Λάτσαρη που µε βοήθησαν σηµαντικά καθόλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής µου, αλλά και που µοιράστηκαν µαζί µου τις χαρές και τις αγωνίες µου. Θερµά ευχαριστώ και τους συναδέλφους µου Γιάννη Γρίβα, Γιάννη Λιαγκούρα, Κλεάνθη Μέλλιο, Χρύσα Μπεκιάρη και Asraf Awaad για τη συµπαράσταση και την υποµονή τους. Θα ήταν παράλειψη να µην ευχαριστήσω ειλικρινά την αγαπηµένη µου φίλη και συνάδελφο Παναγιώτα Κατίκου για τις πολύωρες συζητήσεις µας επί επιστηµονικών θεµάτων, τις εύστοχες παρατηρήσεις και τις χρήσιµες συµβουλές της, όπως και για τον χρόνο που διέθεσε κατά την διάρκεια της αρχικής διόρθωσης του κειµένου της παρούσας διατριβής. Ολόψυχα ευχαριστώ τον σύζυγό µου, Λουκά Μπουρσινό για την πολύωρη και ουσιαστική βοήθεια, διαρκή στήριξη και ενθάρρυνσή του για την επίτευξη του στόχου µου, την οικογένειά του που στάθηκε πλάι µου µε αγάπη και κατανόηση, καθώς και τα παιδιά µου, Θανάση και Ρέα, για τη δύναµη που µου χάρισαν. Τέλος, τη βαθειά ευγνωµοσύνη µου εκφράζω στους αγαπηµένους µου γονείς γιατί µε την αγάπη, τη φροντίδα, την υποµονή τους καθώς και µε τις αρχές που µου δίδαξαν πραγµατοποιήθηκε κάθε προσπάθεια της ζωής µου. 5

16

17 Εισαγωγή ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α. ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ LGN Ο έξω γονατώδης πυρήνας ή πυρήνας του έξω γονατώδους σώµατος (Lateral Geniculate Nucleus, LGN) είναι σύµπλεγµα πυρήνων του διάµεσου εγκεφάλου και βρίσκεται στην έξω-ραχιαία µοίρα του οπίσθιου θαλάµου. Μαζί µε τον έσω γονατώδη πυρήνα απαρτίζουν, σε κάθε ηµισφαίριο, τον µεταθάλαµο. Ο LGN αποτελείται από δύο σχεδόν ισοµεγέθεις επιµέρους πυρήνες, τον dlgn και τον vlgn, ανάµεσα στους οποίους παρεµβάλλεται το IGL. Τα τµήµατα αυτά του LGN παρουσιάζουν διαφορές τόσο ως προς την ανατοµική οργάνωση όσο και ως προς τη λειτουργία τους. Ωστόσο, ο vlgn και το IGL θεωρείται από κάποιους ερευνητές ότι αποτελούν σύµπλεγµα πυρήνων µε κοινά αναπτυξιακά, νευροχηµικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά και ότι έχουν ελάχιστες οµοιότητες µε τον dlgn (Holcombe και Guillery, 1984 Ηarrington, 1997). Ο dlgn είναι σταθµός της οπτικής οδού που εξυπηρετεί την επεξεργασία και τη διαβίβαση οπτικών πληροφοριών από τον αµφιβληστροειδή χιτώνα του οφθαλµού (ΑµΧ) στον πρωτοταγή οπτικό φλοιό. Από το σύνολο των πυρήνων που συµµετέχουν στο οπτικό σύστηµα, ο dlgn είναι ο µοναδικός που προβάλλει στον φλοιό των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων. Για το λόγο αυτό, ο dlgn χαρακτηρίζεται ως ο σταθµός αναµετάδοσης των πληροφοριών από τον ΑµΧ προς τον οπτικό φλοιό. Ο vlgn και το IGL δέχονται προσαγωγές ίνες από τον ΑµΧ και έχουν αµοιβαίες συνδέσεις µε υποφλοιικές περιοχές του εγκεφάλου. Οι περιοχές αυτές συµµετέχουν στη ρύθµιση των αντανακλαστικών κινήσεων του οφθαλµού στα οπτικά ερεθίσµατα και 7

18 Εισαγωγή των κιρκάδιων βιολογικών ρυθµών (Parnavelas και συν., 1989 Harrington, 1997 Groenewegen και Witter, 2004). Β. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ dlgn 1. ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ dlgn Χαρακτηριστικό γνώρισµα του dlgn των πρωτευόντων, όπως είναι ο πίθηκος και ο άνθρωπος, και πολλών σαρκοφάγων θηλαστικών, όπως είναι η γάτα, αποτελεί η στιβαδωτή του οργάνωση. Στα είδη αυτά, σε εγκάρσιες τοµές χρωµατισµένες µε τη µέθοδο Nissl, ο πυρήνας εµφανίζει έξι κυτταρικές στιβάδες, στις οποίες απολήγουν εναλλάξ χιαστές και αχίαστες ίνες της οπτικής ταινίας (Hickey και Guillery, 1979 Garey και συν., 1991). Αντίθετα, ο dlgn στον επίµυ δεν παρουσιάζει εµφανή στιβαδοποίηση. Εντούτοις, πολλοί ερευνητές υποστηρίζουν την ύπαρξη µιας «κρυφής στιβαδοποίησης» στον dlgn του επίµυος, µε την εντόπιση µιας διόφθαλµης ανατοµικής και λειτουργικής οργάνωσης των προσαγωγών συστηµάτων του, παρόµοιας µε τα προαναφερθέντα είδη (Hayhow και συν., 1962 Brauer και συν., 1979 Reese, 1988). Ο dlgn του επίµυος χωρίζεται σε δύο κύριες περιοχές (Reese, 1988). Την εξωτερική στιβάδα ή «κέλυφος», που καταλαµβάνει την έξω µοίρα του θαλάµου και βρίσκεται δίπλα στην οπτική ταινία, και την εσωτερική στιβάδα ή «πυρήνα», προς τα έσω και οπισθίως της προηγούµενης. Η πρώτη δέχεται προσαγωγές ίνες µόνο από τον ετεροπλάγιο οφθαλµό, ενώ η δεύτερη χωρίζεται σε δύο επιµέρους περιοχές, µια εσωτερική που δέχεται προσαγωγές ίνες από τον ετεροπλάγιο οφθαλµό και µια εξωτερική, περιορισµένης έκτασης, που δέχεται προσαγωγές ίνες από τον οµοπλάγιο οφθαλµό. Η οργάνωση αυτή του «πυρήνα» αφορά στα 3 πρόσθια τεταρτηµόριά του, όπου υπάρχει 8

19 Εισαγωγή διόφθαλµη αντιπροσώπευση του οπτικού πεδίου. Στο οπίσθιο τεταρτηµόριο του «πυρήνα», οι προσαγωγές ίνες προέρχονται µόνο από τον ετεροπλάγιο οφθαλµό (Reese, 1988). 2. ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΤΟΥ dlgn Ο κυτταρικός πληθυσµός του dlgn στον επίµυ είναι σχετικά οµοιογενής (Groenewegen και συν., 2004). Μελέτες ερευνητών µε τη µέθοδο Golgi (Grossman και συν., 1973 Parnavelas και συν., 1977) και τη µέθοδο της υπεροξειδάσης (HRP) (Webster και Rowe, 1984) αποκάλυψαν δύο µεγάλες κατηγορίες νευρικών κυττάρων, µε βάση το µέγεθος του κυτταρικού σώµατος και το πρότυπο οργάνωσης των αποφυάδων τους. Η πρώτη κατηγορία, οι γονατωδο-φλοιικοί προβλητικοί νευρώνες ή κύτταρα της τάξης Α ή τύπου Ι του Golgi, αποτελούν την πλειονότητα των νευρώνων του dlgn και αντιπροσωπεύουν το 78% του συνόλου των νευρώνων του πυρήνα (Gabbott και συν., 1986). Είναι πολύπολα κύτταρα µε στρογγυλό ή ωοειδές κυτταρικό σώµα διαµέτρου µm, ο νευράξονας των οποίων απολήγει στον οπτικό φλοιό. Φέρουν τρεις έως οχτώ λείους πρωτοταγείς δενδρίτες µε πολλούς κλάδους, οι οποίοι φέρουν ακανθοειδείς προεξοχές. Οι νευρώνες της κατηγορίας αυτής παρουσιάζουν µορφολογικές διαφορές µεταξύ τους, εντούτοις δεν είναι δυνατή η διάκρισή τους σε σαφείς επιµέρους υποοµάδες, όπως συµβαίνει στον πίθηκο και στη γάτα. Κατανέµονται σε όλη την έκταση του dlgn, µε τα µικρότερα κύτταρα να εµφανίζουν µεγαλύτερη συγκέντρωση στο «κέλυφος» και τα µεγαλύτερα στον «πυρήνα» (Grossman και συν., 1973 Parnavelas και συν., 1977 Webster και Rowe, 1984 Sefton και συν., 2004). 9

20 Εισαγωγή Στον πίθηκο, διακρίνονται δύο κατηγορίες προβλητικών νευρώνων, µε βάση το µέγεθος του κυτταρικού σώµατος: τα µεγάλα κύτταρα Μ και τα µικρά κύτταρα Ρ. Τα πρώτα εντοπίζονται στις δύο εν τω βάθει (1 και 2) στιβάδες του πυρήνα, οι οποίες για το λόγο αυτό χαρακτηρίζονται ως µεγαλοκυτταρικές, ενώ τα δεύτερα βρίσκονται στις επιπολής, µικροκυτταρικές στιβάδες 3 έως 6 (Marrocco και συν., 1982). Στη γάτα, οι προβλητικοί νευρώνες κατατάσσονται σε τρεις µορφολογικά διακριτές κατηγορίες: τα µεγάλα Υ, τα µεσαίου µεγέθους Χ και τα µικρά κύτταρα W. Οι δύο πρώτες κατηγορίες διαµορφώνουν τις τρεις επιπολής στιβάδες (Α, Α1 και C), ενώ η τρίτη τις τρεις εν τω βάθει στιβάδες (C1, C2 και C3) (Guillery, 1966 Friedlander και συν., 1981 Crunelli και συν., 1986). Η δεύτερη κατηγορία, οι διάµεσοι νευρώνες ή τα κύτταρα της τάξης Β ή τύπου ΙΙ του Golgi αποτελούν περίπου το 22% του νευρωνικού πληθυσµού του dlgn (Gabbott και συν., 1986 Gabbott και Bacon, 1994). Είναι µικρά κύτταρα µε ωοειδές ή ατρακτοειδές κυτταρικό σώµα διαµέτρου 10µm, τα οποία εµφανίζονται µε µεγαλύτερη συχνότητα στην περιφέρεια του dlgn (Webster και Rowe, 1984). Οι νευρώνες αυτού του τύπου δεν έχουν νευράξονα, ενώ οι δενδρίτες τους, συνήθως δύο έως τέσσερις, σπάνια διακλαδίζονται και απολήγουν µέσα στον πυρήνα. Σε υπερµικροσκοπικό επίπεδο, ο διαχωρισµός των δύο κυτταρικών τύπων είναι εύκολος. Οι διάµεσοι νευρώνες είναι µικρότεροι σε µέγεθος από τους προβλητικούς, έχουν πυρήνα µε εκκολπώµατα του πυρηνικού περιβλήµατος και µιτοχόνδρια σαφώς µικρότερα από εκείνα των προβλητικών νευρώνων. Επιπρόσθετα, τα σώµατα και οι δενδρίτες των προβλητικών νευρώνων είναι αποκλειστικά µετασυναπτικά στοιχεία, ενώ τα σώµατα και οι δενδρίτες των διάµεσων νευρώνων είναι είτε προσυναπτικά, µε συναπτικά κυστίδια ποικίλης µορφολογίας, είτε 10

21 Εισαγωγή µετασυναπτικά στοιχεία (Lieberman, 1973 Lieberman και Webster, 1974 Parnavelas και συν., 1989). 3. ΝΕΥΡΟΧΗΜΙΚΟΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ dlgn Οι προβλητικοί νευρώνες του dlgn χρησιµοποιούν ως χηµικούς διαβιβαστές τα διεγερτικά αµινοξέα L-γλουταµινικό οξύ (Glu) και D- ασπαραγινικό οξύ (D-Asp) (Johnson και Burkhalter, 1992 Saez και συν., 1998). Οι νευρώνες αυτοί δεν παρουσιάζουν ανοσοδραστικότητα για κανένα από τα νευροδραστικά πεπτίδια που έχουν µελετηθεί έως σήµερα, σε αντίθεση µε τους νευρώνες του vlgn και του IGL, οι οποίοι εκφράζουν τα πεπτίδια ουσία Ρ, λευκίνη-εγκεφαλίνη και νευροπεπτίδιο Υ. Επίσης, δεν εκφράζουν πρωτεΐνες που δεσµεύουν ασβέστιο, όπως είναι η παρβαλβουµίνη, η καλρετινίνη και η καλµπιντίνη D-28K (Takatsuji και Tohyama, 1989 Luth και συν., 1993). Οι διάµεσοι νευρώνες χρησιµοποιούν ως χηµικό διαβιβαστή το ανασταλτικό αµινοξύ γ-αµινοβουτυρικό οξύ (GABA). Περίπου το 43% των νευρώνων αυτών περιέχουν επίσης το ένζυµο διαφοράση του φωσφορυλιωµένου νικοτιναµιδο-αδενινο-δινουκλεοτιδίου (NADPHδιαφοράση), το οποίο είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση του µονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) (Gabbott και Bacon, 1994). Με βάση τα παραπάνω, διακρίνονται δύο τύποι διάµεσων νευρώνων στον dlgn, οι αµιγώς GABA-εργικοί (Β1) και αυτοί που εκφράζουν ταυτόχρονα GABA και NADPH-διαφοράση (Β2), υποδηλώνοντας την παρουσία ενός υποπληθυσµού διάµεσων νευρώνων στον dlgn που παράγει τον νευρωνοτροποποιητή ΝΟ. Το ΝΟ βρέθηκε ότι επηρεάζει τη διεγερσιµότητα και τη µεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων του πυρήνα. Συγκεκριµένα, έχει παρατηρηθεί ότι το ΝΟ προάγει τη 11

22 Εισαγωγή διαβίβαση της οπτικής πληροφορίας από τον ΑµΧ στον οπτικό φλοιό και συµµετέχει στους µηχανισµούς οργάνωσης των συνάψεων του dlgn κατά την ανάπτυξη (Cudeiro και Rivadulla, 1999 Mize και Lo, 2000). Υποστηρίζεται ότι, πέρα από τον ρόλο του στην ανάπτυξη, το ΝΟ συµµετέχει και σε µηχανισµούς πρόκλησης κυτταρικού θανάτου µετά από αποστέρηση της όρασης ή οφθαλµολογικών παθήσεων, όπως είναι το γλαύκωµα (Nucci και συν., 2003). Ο τύπος Β1 των διάµεσων νευρώνων παρουσιάζει οµοιογενή κατανοµή σε όλη την έκταση του πυρήνα. Εντούτοις, ο Β2 περιορίζεται σχεδόν αποκλειστικά στο «κέλυφος» (Gabbott και Bacon, 1994). Επίσης, από τις πρωτεΐνες που δεσµεύουν ασβέστιο, η καλµπιντίνη D-28K εκφράζεται στους διάµεσους νευρώνες που βρίσκονται στο «κέλυφος» (Schmidt-Kastner και συν., 1992 Luth και συν., 1993). 4. ΣΥΝ ΕΣΕΙΣ ΤΟΥ dlgn Όπως προαναφέρθηκε, ο dlgn αποτελεί σταθµό της οπτικής οδού. έχεται προσαγωγές ίνες που προέρχονται από τα γαγγλιακά κύτταρα του ΑµΧ, οι οποίες συνιστούν τις κύριες αισθητικές ίνες, και έχει αµοιβαίες συνδέσεις µε τον πρωτοταγή οπτικό φλοιό του οµοπλάγιου ηµισφαιρίου. Επίσης, δέχεται προσαγωγές ίνες από υποφλοιικές περιοχές του διάµεσου και του µέσου εγκεφάλου. Για την ολοκληρωµένη περιγραφή των συνδέσεων του dlgn και του ρόλου του στην επεξεργασία και διαβίβαση των οπτικών ερεθισµάτων, θεωρείται σκόπιµη µια σύντοµη ανασκόπηση βασικών ανατοµικών στοιχείων της οπτικής οδού. 12

23 Εισαγωγή 4.1 ΠΡΟΣΑΓΩΓΕΣ ΙΝΕΣ 4.1Α ΠΡΟΣΑΓΩΓΕΣ ΙΝΕΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙ Η ΧΙΤΩΝΑ ΤΟΥ ΟΦΘΑΛΜΟΥ 4.1Α 1 ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙ ΟΥΣ ΧΙΤΩΝΑ Ο ΑµΧ είναι ο έσω χιτώνας του τοιχώµατος του βολβού του οφθαλµού και αποτελεί το υποδεκτικό όργανο της όρασης. Τα νευρικά στοιχεία του ΑµΧ συνθέτουν την εξειδικευµένη περιοχή του οπτικού συστήµατος, η οποία είναι υπεύθυνη για την υποδοχή και τη διαβίβαση της οπτικής πληροφορίας. Η επεξεργασία της οπτικής πληροφορίας ξεκινάει από τη διέγερση των οπτικών κυττάρων ή φωτοϋποδοχέων του ΑµΧ. Τα κύτταρα αυτά έχουν την ιδιότητα να µετατρέπουν τα οπτικά σήµατα που προσλαµβάνουν σε ηλεκτρικά. Τα σήµατα αυτά µεταδίδονται σε µικρότερο αριθµό δίπολων κυττάρων και στη συνέχεια σε ακόµη µικρότερο αριθµό γαγγλιακών κυττάρων, τα οποία αντιστοιχούν στον πρώτο και στον δεύτερο αισθητικό νευρώνα της οπτικής οδού, αντίστοιχα. Τα γαγγλιακά κύτταρα του ΑµΧ διακρίνονται µορφολογικά και λειτουργικά σε κατηγορίες, αναλόγα µε το είδος στο οποίο ανήκουν. Στον ΑµΧ του επίµυος έχουν αναγνωριστεί τρεις µορφολογικά διακριτές κατηγορίες γαγγλιακών κυττάρων, µε βάση το µέγεθος του κυτταρικού σώµατος, τα µεγάλα Ι, τα µεσαία ΙΙ και τα µικρά κύτταρα ΙΙΙ (Fukuda, 1977 Perry, 1979 Martin, 1986 Huxlin και Goodchild, 1997 Sefton και Dreher, 2004). Οι νευράξονες των γαγγλιακών κυττάρων κάθε κατηγορίας διαφέρουν στη διάµετρο και στην ταχύτητα αγωγής των νευρικών ώσεων, δηµιουργώντας τρία παράλληλα δίκτυα νευρικών ινών µε διαφορετικές λειτουργικές ιδιότητες. Οι νευράξονες των κυττάρων αυτών σχηµατίζουν το οπτικό νεύρο. 13

24 Εισαγωγή 4.1Α 2 ΟΠΤΙΚΟ ΧΙΑΣΜΑ ΚΑΙ ΟΠΤΙΚΗ ΤΑΙΝΙΑ Το οπτικό χίασµα είναι η περιοχή χιασµού των οπτικών νεύρων, όπου ένα ποσοστό των ινών κάθε οπτικού νεύρου κατευθύνεται προς το ετεροπλάγιο ηµισφαίριο. Το ποσοστό αυτό, το οποίο διαφέρει ανάλογα µε το είδος του ζώου, είναι 98-99% στον επίµυ (Sefton και Dreher, 2004). Μετά το οπτικό χίασµα, το οπτικό νεύρο σχηµατίζει την οπτική ταινία, η οποία αποτελείται από το σύνολο των χιασµένων και αχίαστων ινών κάθε οπτικού νεύρου. Η οπτική ταινία κάθε ηµισφαιρίου απολήγει κυρίως στον LGN, στο πρόσθιο διδύµιο, την προτετραδυµική περιοχή και στον υπερχιασµατικό πυρήνα του θαλάµου. Από τις περιοχές αυτές, µόνο ο dlgn αποτελεί σταθµό αναµετάδοσης των οπτικών πληροφοριών προς τον οπτικό φλοιό και, εποµένως, οι νευρώνες του αποτελούν τον τρίτο αισθητικό νευρώνα της οπτικής οδού. 4.1Α 3 ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΤΩΝ ΠΡΟΣΑΓΩΓΩΝ ΙΝΩΝ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑµΧ ΣΤΟΝ dlgn Λόγω του υψηλού ποσοστού χιασµού των ινών του οπτικού νεύρου, ο dlgn στον επίµυ δέχεται ίνες από τον ΑµΧ του ετεροπλάγιου, κυρίως, οφθαλµού. Οι προσαγωγές αυτές ίνες διανέµονται σε όλη την έκταση του dlgn, µε εξαίρεση την περιορισµένης έκτασης περιοχή της απόληξης των ινών από τον ΑµΧ του οµοπλάγιου οφθαλµού (Hayhow και συν., 1962 Giolli και Creel, 1974 Reese, 1988). Η κατανοµή των προσαγωγών αυτών ινών στον dlgn γίνεται µε τοπογραφικά οργανωµένο τρόπο, έτσι ώστε κάθε τεταρτηµόριο του ΑµΧ να προβάλλει σε διαφορετική περιοχή του πυρήνα (Lund και συν., 1974 Parnavelas και συν., 1989). Οι προσαγωγές ίνες από τον ΑµΧ σχηµατίζουν ασύµµετρες συνάψεις (τύπου Ι κατά Gray, Gray, 1959) µε τους δενδρίτες των προβλητικών και των διάµεσων νευρώνων του dlgn. Το σύνολο των ανατοµικών στοιχείων που σχηµατίζουν τις συνάψεις αυτές βρίσκονται 14

25 Εισαγωγή συχνά εγκυστωµένα µέσα σε ειδικές κατασκευές, που ονοµάζονται σπειράµατα (glomeruli), το εξωτερικό τοίχωµα των οποίων σχηµατίζεται από αποφυάδες νευρογλοιακών κυττάρων (Lieberman και Webster, 1974). Παρά το γεγονός ότι και οι τρεις τύποι των γαγγλιακών κυττάρων του ΑµΧ εννευρώνουν τον dlgn, µόνο δύο τύποι νευρικών ινών έχουν αναγνωριστεί στον πυρήνα. Ο τύπος 2a παρουσιάζει αραιή κατανοµή και περιλαµβάνει τελικά κλωνία µεγάλης διαµέτρου που απολήγουν στα δύο πρόσθια τριτηµόρια του dlgn σε µεγάλα τελικά κοµβία. Ο τύπος 2b περιλαµβάνει µικρότερα κλωνία που απολήγουν σε τελικά κοµβία µε πυκνότερη κατανοµή σε όλη την έκταση του dlgn. Οι ίνες τύπου 2a αποτελούν παράπλευρα κλωνία ινών που προέρχονται από τα γαγγλιακά κύτταρα τύπου Ι του ΑµΧ και απολήγουν και στο πρόσθιο διδύµιο, ενώ οι ίνες τύπου 2b είναι νευρικές απολήξεις ινών που προέρχονται από τα γαγγλιακά κύτταρα τύπου ΙΙ και ΙΙΙ του ΑµΧ και απολήγουν αποκλειστικά στον dlgn (Brauer και συν., 1979 Garey και συν., 1991 Sefton και συν., 2004). Οι προσαγωγές ίνες από τον ΑµΧ έχουν διεγερτική δράση η οποία ασκείται µέσω των χηµικών διαβιβαστών Glu και L-ασπαραγινικό οξύ (L-Asp) (Crunelli και συν., 1987). Επιπλέον, οι ίνες τύπου 2a εκφράζουν παρβαλβουµίνη και οι ίνες τύπου 2b καλρετινίνη, πρωτεΐνες που δεσµεύουν ασβέστιο (Luth και συν., 1993). 4.1Β ΠΡΟΣΑΓΩΓΕΣ ΙΝΕΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΟΠΤΙΚΟ ΦΛΟΙΟ Ο οπτικός φλοιός βρίσκεται στον ινιακό λοβό κάθε εγκεφαλικού ηµισφαιρίου και περιλαµβάνει τρεις επιµέρους περιοχές, τις περιοχές 17, 18 και 18α (Krieg, 1946). Η περιοχή 17 καλείται και πρωτοταγής οπτικός φλοιός και είναι η µεγαλύτερη σε έκταση από τις άλλες δύο, οι οποίες συνιστούν τον δευτεροταγή οπτικό φλοιό. 15

26 Εισαγωγή Μελέτες µε τη χρήση τεχνικών ανίχνευσης µε HRP έδειξαν ότι ο dlgn δέχεται προσαγωγές ίνες κυρίως από την περιοχή 17 του οπτικού φλοιού και σε µικρότερη έκταση από τις περιοχές 18 και 18α του οµοπλάγιου ηµισφαιρίου (Sefton, 1981). Οι ίνες αυτές αποτελούν τους νευράξονες των πυραµιδοειδών κυττάρων που βρίσκονται στην επιπολής (VIα) και στην εν τω βάθει (VIβ) υποστιβάδα της στιβάδας VI του οπτικού φλοιού (Bourassa και Deschênes, 1995). Οι φλοιόφυγες ίνες παρέχουν πυκνή εννεύρωση µε οµοιογενή κατανοµή στον dlgn. Οι νευρικές αυτές ίνες είναι µικρής διαµέτρου και απολήγουν µε τοπογραφικά οργανωµένο τρόπο, που σχετίζεται µε την περιοχή του φλοιού από την οποία προέρχονται (Montero και Guillery, 1968 Jacobson και Trojanowski, 1975 Jones, 1985 Garey και συν., 1991). Οι ίνες αυτές σχηµατίζουν ασύµµετρες συνάψεις µε τους προβλητικούς νευρώνες του dlgn (Lieberman και Webster, 1974) και οι χηµικοί διαβιβαστές που χρησιµοποιούν είναι τα διεγερτικά αµινοξέα Glu (Lund και συν., 1978) και D-Asp (Johnson και Burkhalter, 1992). 4.1Γ ΠΡΟΣΑΓΩΓΕΣ ΙΝΕΣ ΑΠΟ ΥΠΟΦΛΟΙΙΚΕΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ Σηµαντικό ρόλο στην επεξεργασία των οπτικών πληροφοριών στον dlgn παίζουν προσαγωγά συστήµατα ινών από υποφλοιικές περιοχές του εγκεφάλου που ανήκουν στο οπτικό σύστηµα ή είναι ανεξάρτητες από αυτό. 4.1Γ 1 ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΠΟΥ ΑΝΗΚΟΥΝ ΣΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ vlgn. Η εξωτερική στιβάδα του vlgn που δέχεται ίνες από τον ΑµΧ και τον οπτικό φλοιό προβάλλει στον dlgn (Kolmac και συν., 2000). ικτυωτός πυρήνας του θαλάµου. Ο dlgn δέχεται ίνες από την οπτική περιοχή του οµοπλάγιου δικτυωτού πυρήνα του θαλάµου, η 16

27 Εισαγωγή οποία εννευρώνεται από τον οπτικό φλοιό. Οι ίνες αυτές είναι GABA-εργικές και σχηµατίζουν συµµετρικές συνάψεις (τύπου ΙΙ κατά Gray) µε τους προβλητικούς νευρώνες του dlgn (Ohara και συν., 1980). Πρόσθιο διδύµιο. H επιπολής φαιή στιβάδα του πρόσθιου διδυµίου, που εννευρώνεται από τον ΑµΧ, προβάλλει στο περιφερικό τµήµα του «κελύφους» του οµοπλάγιου dlgn (Perry, 1980 Reese, 1984). Παραδιδυµικός πυρήνας. Ο ετεροπλάγιος και, σε µικρότερη έκταση, ο οµοπλάγιος παραδιδυµικός πυρήνας, που εννευρώνονται από το σύστοιχο πρόσθιο διδύµιο και τον ΑµΧ, προβάλλουν στο περιφερικό τµήµα του «κελύφους» του dlgn. Οι ίνες αυτές είναι χολινεργικές (Mackey-Sim και συν., 1983 Sefton και Martin, 1984 Harting και συν., 1991). Προτετραδυµικοί πυρήνες. ύο προτετραδυµικοί πυρήνες που εννευρώνονται από τον ΑµΧ στέλνουν ίνες στον dlgn: o πυρήνας της οπτικής ταινίας που προβάλλει στον οµοπλάγιο dlgn (Mackey-Sim και συν., 1983) και ο ελαϊκός προτετραδυµικός πυρήνας που προβάλλει αµφοτερόπλευρα. Οι ίνες αυτές είναι GABA-εργικές (Turlejski και συν., 1993). Υποθάλαµος. Ο dlgn δέχεται ισταµινεργικές ίνες από το πρόσθιο τµήµα του έξω υποθαλάµιου πυρήνα, περιοχή που εννευρώνεται από τον ΑµΧ (Turlejski και συν., 1993). 4.1Γ 2 ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΠΟΥ ΕΝ ΑΝΗΚΟΥΝ ΣΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Υποµέλανας τόπος. Οι νευρώνες της περιοχής αυτής χορηγούν αµφοτερόπλευρα ένα πυκνό, διάχυτο νοραδρενεργικό δίκτυο (Lindvall και συν., 1974 Kromer και Moore, 1980). Η πλειονότητα των νοραδρενεργικών αυτών ινών απολήγουν στον dlgn χωρίς να 17

28 Εισαγωγή σχηµατίζουν συνάψεις, ενώ ένα µικρό ποσοστό σχηµατίζει συµµετρικές συνάψεις µε τους προβλητικούς και τους διάµεσους νευρώνες του dlgn (Latsari και συν., 2004). Ραχιαίος πυρήνας της ραφής. Οι νευρώνες της περιοχής αυτής χορηγούν αµφοτερόπλευρα στον dlgn σεροτονινεργικές ίνες, οι οποίες έχουν περιορισµένη κατανοµή (Mackey-Sim και συν., 1983 Cropper και συν., 1984). Η πλειονότητα των ινών αυτών απολήγουν στον dlgn χωρίς να σχηµατίζουν συνάψεις, ενώ ένα µικρό ποσοστό σχηµατίζει ασύµµετρες συνάψεις και µε τους δύο τύπους κυττάρων του dlgn (Dinopoulos και συν., 1995). Επιπλέον, οι νευρώνες της περιοχής αυτής είναι πιθανό να χορηγούν και ντοπαµινεργικές ίνες, οι οποίες έχουν περιορισµένη κατανοµή στον dlgn (Sefton και συν., 2004). ικτυωτός σχηµατισµός του µέσου εγκεφάλου. Από την περιοχή αυτή πιθανολογείται ότι απολήγουν αµφοτερόπλευρα στον dlgn ντοπαµινεργικές ίνες (Mackey-Sim και συν., 1983 Papadopoulos και Parnavelas, 1990). Σκελιαιογεφυρικός πυρήνας και έξω ραχιαίος πυρήνας της καλύπτρας. Οι νευρώνες των περιοχών αυτών είναι χολινεργικοί και προβάλλουν αµφοτερόπλευρα στον dlgn (Mackey-Sim και συν., 1983 Woolf και Butcher, 1986 Rye και συν., 1987 Turlejski και συν., 1994). Κεντρική φαιά ουσία της καλύπτρας. Η έξω ραχιαία νευρική στήλη της περιοχής αυτής προβάλλει αµφοτερόπλευρα στον dlgn Ο νευροχηµικός φαινότυπος των ινών αυτών δεν έχει διευκρινιστεί (Turlejski και συν., 1993 Sefton και συν., 2004). 18

29 Εισαγωγή 4.2 ΑΠΑΓΩΓΕΣ ΙΝΕΣ Οι νευράξονες των προβλητικών νευρώνων του dlgn συνιστούν τις απαγωγές ίνες του πυρήνα, οι οποίες σχηµατίζουν την οπτική ακτινοβολία. ιανέµονται αποκλειστικά στο οµοπλάγιο ηµισφαίριο και απολήγουν κυρίως στη στιβάδα IV του πρωτοταγούς οπτικού φλοιού, όπου κατανέµονται µε τοπογραφικά οργανωµένο τρόπο, χορηγώντας µικρής έκτασης παράπλευρη εννεύρωση στο οπτικό τµήµα του οµοπλάγιου δικτυωτού πυρήνα του θαλάµου. Οι απαγωγές ίνες του dlgn σχηµατίζουν ασύµµετρες συνάψεις µε τους νευρώνες της στιβάδας IV, οι οποίοι συνιστούν τις στήλες οφθαλµικής επικράτησης και αποτελούν τον τελευταίο αισθητικό νευρώνα της οπτικής οδού (Hubel και Wiesel, 1972). Οι νευράξονες των προβλητικών νευρώνων του dlgn προβάλλουν επίσης σε µικρότερη έκταση στις στιβάδες III, VI και Ι του πρωτοταγούς οπτικού φλοιού (Ribak και Peters, 1975 Peters και Feldman, 1976 Perry, 1980), όπως και στις περιοχές 18 και 18α (Ribak και Peters, 1975). Από τα παραπάνω συνάγεται ότι µεταξύ του πρωτοταγούς οπτικού φλοιού και του dlgn υπάρχει ισχυρή αµοιβαία σύνδεση. 5. ΣΥΝΑΠΤΙΚΗ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ dlgn Χαρακτηριστικό στοιχείο της συναπτικής οργάνωσης του dlgn αποτελούν τα σπειράµατα (Lieberman και Webster, 1974 Parnavelas και συν., 1989 Sefton και συν., 2004). Τα σπειράµατα είναι οµάδες νευρωνικών αποφυάδων που συνδέονται µεταξύ τους µε διαδοχικές συνάψεις και περιβάλλονται από µια λεπτή ζώνη αστροκυτταρικών αποφυάδων. Σχηµατίζονται από τα εξής στοιχεία: 19

30 Εισαγωγή Α) Τα τελικά κλωνία των νευραξόνων των γαγγλιακών κυττάρων του ΑµΧ (R-boutons), τα οποία στις απολήξεις τους φέρουν διογκώσεις µε σφαιρικά συναπτικά κυστίδια και ηλεκτρονικώς αχνά µιτοχόνδρια και σχηµατίζουν ασύµµετρες συνάψεις µε τους δενδρίτες των προβλητικών και των διάµεσων νευρώνων. Τα R-boutons, που είναι τα µεγαλύτερα σε µέγεθος τελικά κοµβία του πυρήνα, βρίσκονται και εκτός των σπειραµάτων. Β) Τις ακανθοειδείς προεξοχές των δενδριτικών απολήξεων των διάµεσων νευρώνων (P-boutons), οι οποίες έχουν συναπτικά κυστίδια ποικίλης µορφολογίας και σχηµατίζουν συµµετρικές συνάψεις µε τους δενδρίτες των προβλητικών νευρώνων και µε άλλα P-boutons. Επιπλέον, αποτελούν µετασυναπτικούς στόχους για τα R-boutons, άλλα P-boutons και τα F-boutons που περιγράφονται παρακάτω. Γ) Μια οµάδα τελικών κοµβίων µε ελλειψοειδή συναπτικά κυστίδια (F-boutons) που σχηµατίζουν συµµετρικές συνάψεις µε τους προβλητικούς νευρώνες και τα P-boutons. Είναι αποκλειστικά προσυναπτικά και δεν αποτελούν σταθερό στοιχείο του σπειράµατος. Τα F-boutons που συνάπτονται µε τους προβλητικούς νευρώνες είναι τελικά κοµβία προσαγωγών ινών από τον δικτυωτό πυρήνα του θαλάµου, ενώ η προέλευση εκείνων που συνάπτονται µε τους διάµεσους νευρώνες δεν έχει διευκρινιστεί (Sefton και συν., 2004). Οι συνάψεις στα σπειράµατα είναι εξαιρετικά πολύπλοκες, εξαιτίας της διπλής (προσυναπτικής και µετασυναπτικής) φύσης των P- boutons σε διαδοχικές συνάψεις. Στον dlgn του επίµυος έχει περιγραφεί η τριπλή σύναψη, ένας χαρακτηριστικός τύπος διαδοχικής σύναψης. Στη σύναψη αυτή, το R-bouton συνάπτεται µε τον δενδρίτη ενός προβλητικού νευρώνα και ταυτόχρονα µε ένα P-bouton, το οποίο συνάπτεται µε τον ίδιο δενδρίτη. Ωστόσο, συνάψεις οι οποίες σχηµατίζονται από όλα τα προαναφερθέντα στοιχεία παρατηρούνται και εκτός σπειραµάτων. 20

31 Εισαγωγή Επιπλέον, τα τελικά κοµβία των νευραξόνων που προέρχονται από τον οπτικό φλοιό των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων (SR-boutons) περιέχουν επίσης σφαιρικά συναπτικά κυστίδια αλλά είναι µικρότερα σε µέγεθος από τα R-boutons και έχουν ηλεκτρονικώς πυκνά µιτοχόνδρια. Τα SRboutons δηµιουργούν ασύµµετρες συνάψεις µε τους δενδρίτες των προβλητικών νευρώνων αλλά όχι µε τους διάµεσους νευρώνες και βρίσκονται πάντα εκτός των σπειραµάτων (Lieberman και Webster, 1974 Parnavelas και συν., 1989 Sefton και συν., 2004). Μελέτες της ποσοστιαίας κατανοµής των συνάψεων που σχηµατίζονται στους προβλητικούς νευρώνες του dlgn στη γάτα έδειξαν ότι µόνο το 7% του συνολικού ποσοστού των συνάψεων σχηµατίζεται από ίνες που προέρχονται από τον ΑµΧ (Sherman και Guillery, 1996, 1998). Οι υπόλοιπες συνάψεις σχηµατίζονται από τους δενδρίτες των διάµεσων νευρώνων και τις προσαγωγές ίνες από τον φλοιό και τις υποφλοιικές περιοχές. Οι ίνες αυτές συνιστούν συνολικά ένα δίκτυο νευρικών ινών υπεύθυνο για την επεξεργασία και τη ρύθµιση της µετάδοσης της οπτικής πληροφορίας προς τον οπτικό φλοιό (Van Horn και συν., 2000). 6. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΟΥ dlgn Το διάµεσο εγκεφαλικό κυστίδιο του µυελικού σωλήνα, το οποίο σχηµατίζεται την εµβρυϊκή ηµέρα (Ε)11 στον επίµυ, αποτελεί την καταβολή του διάµεσου εγκεφάλου. Από το κυστίδιο αυτό, µετά τον σχηµατισµό της αύλακας της ηνίας την Ε12, προέρχονται τέσσερις επιµέρους περιοχές ο ραχιαίος θάλαµος, ο κοιλιακός θάλαµος, ο επιθάλαµος και ο υποθάλαµος (Alvarez-Bolado και Swanson, 1996). Από τις νευροβλάστες του ραχιαίου θαλάµου γεννιούνται οι νευρώνες του 21

32 Εισαγωγή dlgn, ενώ από τις νευροβλάστες του κοιλιακού θαλάµου οι νευρώνες του vlgn (Jones, 1985). Αυτοραδιογραφικές µέθοδοι στις οποίες χρησιµοποιήθηκε θυµιδίνη σεσηµασµένη µε τρίτιο έδειξαν ότι οι νευρώνες του dlgn γεννιούνται την Ε14 και την Ε15 (Altman και Bayer, 1989). Η γέννηση των νευρογλοιακών κυττάρων του dlgn αρχίζει επίσης την Ε14, ολοκληρώνεται όµως µεταγεννητικά µε την εµφάνιση δύο κορυφών στην καµπύλη ανάπτυξής τους η πρώτη τη µεταγεννητική ηµέρα (Μ)7 και η δεύτερη τη Μ16 (Biensold και συν., 1976). Tο ραχιαίο τµήµα του νευροεπιθηλίου που περιβάλλει την τρίτη κοιλία αποτελεί την καταβολή των νευρώνων του dlgn. Η µετανάστευση των µεταµιτωτικών νευρώνων ακολουθεί ένα χωροχρονικό πρότυπο, σύµφωνα µε το οποίο οι νευρώνες που γεννιούνται νωρίτερα εγκαθίστανται στο επιπολής τµήµα του πυρήνα, ενώ εκείνοι που γεννιούνται αργότερα στο εν τω βάθει τµήµα του (Altman και Bayer, 1989). Η εγκατάσταση των µεταµιτωτικών νευρώνων στις τελικές τους θέσεις ολοκληρώνεται την Ε16, οπότε ο dlgn διαφοροποιείται από τους υπόλοιπους πυρήνες του θαλάµου (Lund και Bunt, 1976 Sanderson, 1991). Οι ίνες των δύο οπτικών νεύρων φτάνουν στον dlgn από την Ε16 µέχρι τη γέννηση (Μ0) (Lund και Mustari, 1976 Altman και Bayer, 1989). Στη συνέχεια, ο αριθµός των ινών αυτών στον dlgn µειώνεται σηµαντικά (περίπου κατά 60%) µέχρι τη Μ6 και σταθεροποιείται στα επίπεδα που παρατηρούνται στο ενήλικο (Lam και συν., 1982). Η µείωση αυτή οφείλεται σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των γαγγλιακών κυττάρων του ΑµΧ κατά την πρώτη µεταγεννητική εβδοµάδα (Perry και συν., 1983 Cellerino και συν., 2000 Mayordomo και συν., 2003). Μελέτες µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού έδειξαν ότι ο διαχωρισµός των ινών που προέρχονται από τα δύο οπτικά νεύρα στον dlgn ολοκληρώνεται τη Μ10 (Menna και συν., 2003). 22

33 Εισαγωγή Μελέτες µε τη µέθοδο Golgi έδειξαν ότι κατά τη γέννηση υπάρχουν ανώριµες µορφές τόσο των προβλητικών όσο και των διάµεσων νευρώνων. Η µεταγεννητική διαφοροποίηση των νευρώνων αυτών ολοκληρώνεται µέχρι τη Μ18 (Parnavelas και συν., 1977). Συγκεκριµένα, βρέθηκε ότι η ανάπτυξη των προβλητικών νευρώνων εµφανίζει δύο φάσεις µέγιστου ρυθµού ανάπτυξης, οι οποίες χαρακτηρίζονται από σηµαντική ανάπτυξη του περικαρύου και των δενδριτικών αποφυάδων. Η πρώτη παρατηρείται µεταξύ Μ4 και Μ6 και συµπίπτει µε την πρώτη περίοδο της έντονης γλοιογένεσης στον dlgn (Biensold και συν., 1976) και τη σταθεροποίηση του αριθµού των ινών του οπτικού νεύρου (Lam και συν., 1982) στον πυρήνα. Η δεύτερη παρατηρείται µεταξύ Μ14 και Μ15, περίοδο που συµπίπτει µε τη δεύτερη περίοδο της έντονης γλοιογένεσης στον πυρήνα (Biensold και συν., 1976) και το άνοιγµα των οφθαλµών. Η οπτική εµπειρία µε το άνοιγµα των οφθαλµών τη Μ14 σηµατοδοτεί την έναρξη µιας σηµαντικής χρονικής περιόδου για την ανάπτυξη του dlgn και ολόκληρου του οπτικού συστήµατος, που ονοµάζεται κρίσιµη περίοδος, η οποία χαρακτηρίζεται από την εδραίωση των λειτουργικών συνδέσεων που εξυπηρετούν την όραση. Κατά τη διάρκεια της κρίσιµης περιόδου που διαρκεί µέχρι τη Μ45, τα νευρωνικά κυκλώµατα του οπτικού συστήµατος είναι ευµετάβλητα στα οπτικά ερεθίσµατα και αναδιαµορφώνονται για να σχηµατίσουν τις κατάλληλες συνδέσεις (Rothblat και συν., 1978). Η αποστέρηση της όρασης του ενός οφθαλµού κατά τη διάρκεια της κρίσιµης περιόδου προκαλεί νευροχηµικές, µορφολογικές και λειτουργικές µεταβολές στον ΑµΧ, τέτοιες ώστε οι απολήξεις των προσαγωγών ινών από τους προβλητικούς νευρώνες του dlgn, οι οποίες µεταφέρουν πληροφορίες από τον ΑµΧ του κλειστού οφθαλού στη στιβάδα IV του οπτικού φλοιού, να συρρικνώνονται, λόγω µειωµένης δραστηριότητας. Ταυτόχρονα, η 23

34 Εισαγωγή συγκριτικά µεγαλύτερη δραστηριότητα των προβλητικών νευρώνων του dlgn που δέχονται ερεθίσµατα από τον ανοικτό οφθαλµό προκαλεί την υπέρµετρη εξάπλωση των τελικών απολήξεων των νευραξόνων τους στη στιβάδα IV του οπτικού φλοιού εις βάρος των προηγουµένων. Η ευπλαστότητα των στηλών οφθαλµικής επικράτησης αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγµα πλαστικότητας του αναπτυσσόµενου εγκεφάλου (Hensch, 2004). Η συναπτογένεση στον dlgn επιτελείται κατά τις τρεις πρώτες µεταγεννητικές εβδοµάδες και διαιρείται σε τρία στάδια (Aggelopoulos και συν., 1989). Το πρώτο στάδιο καλύπτει το χρονικό διάστηµα µεταξύ της γέννησης και της Μ4 κατά το οποίο παρατηρείται µόνο µικρός αριθµός ανώριµων συνάψεων. Ακολουθεί το δεύτερο στάδιο, από τη Μ5 µέχρι τη Μ8, το οποίο χαρακτηρίζεται από έντονη συναπτογένεση στον dlgn και την εµφάνιση των πρώτων συναπτικών σπειραµάτων. Κατά το τρίτο στάδιο, από τη Μ10 µέχρι τη Μ20, παρατηρείται µυελίνωση και ολοκλήρωση της συναπτογένεσης, η οποία χαρακτηρίζεται από τη σηµαντική αύξηση του αριθµού και την ωρίµαση του συνόλου των συναπτικών σχηµατισµών, αλλά και από την εκφύλιση των ανώριµων µορφωµάτων τους. Οι νευράξονες των προβλητικών νευρώνων του dlgn οδηγούνται ήδη από την Ε17 προς τον αναπτυσσόµενο οµοπλάγιο οπτικό φλοιό και την Ε18 οι πρώτες ίνες εντοπίζονται στην υποφλοιική πλάκα της αρχέγονης περιοχής 17. Στο νεογέννητο, οι ίνες εντοπίζονται στις στιβάδες VI και V του αναπτυσσόµενου οπτικού φλοιού και τη Μ1 εισέρχονται στο εν τω βάθει τµήµα της φλοιικής πλάκας, όπου έρχονται σε επαφή µε τα κύτταρα που θα σχηµατίσουν τη στιβάδα IV τη Μ2. Ταυτόχρονα, λίγες ίνες διασχίζουν τη φλοιική πλάκα και εισέρχονται στην επιχείλια ζώνη. Μέχρι τη Μ3 έχει ολοκληρωθεί η ανάπτυξη των ινών των προβλητικών νευρώνων του dlgn προς τον κύριο στόχο τους, 24

35 Εισαγωγή δηλαδή τη στιβάδα IV της περιοχής 17 του οπτικού φλοιού (Kageyama και Robertson, 1993). Οι φλοιόφυγες ίνες των πυραµιδοειδών κυττάρων της στιβάδας VI του οπτικού φλοιού που διανέµονται στον dlgn απολήγουν στον πυρήνα σχηµατίζοντας µικρά τελικά κοµβία (SR-boutons). Κοµβία του τύπου αυτού είναι ανιχνεύσιµα ήδη από το νεογέννητο (Aggelopoulos και συν., 1989). Γ. ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΕΝΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗ Η ανάπτυξη του ΝΣ επιτυγχάνεται σταδιακά µέσω πολύπλοκων, διαδοχικών και γενετικά προκαθορισµένων διεργασιών. Συνοπτικά, οι διεργασίες αυτές περιλαµβάνουν τη γέννηση και τον πολλαπλασιασµό των πρόδροµων νευρικών κυττάρων, τη µετανάστευση των µεταµιτωτικών κυττάρων στις τελικές τους θέσεις, τη διαφοροποίησή τους και την εδραίωση των λειτουργικών τους συνδέσεων. Μια άλλη διεργασία, ο προγραµµατισµένος κυτταρικός θάνατος (Programmed Cell Death, PCD), είναι απαραίτητη και καθοριστική τόσο στη µορφογένεση του ΝΣ όσο και στην ανάπτυξη του φαινοτύπου, των συνδέσεων και της λειτουργικότητας του ώριµου ΝΣ (Burek και Oppenheim, 1996). Με τον όρο PCD περιγράφεται ο τύπος του κυτταρικού θανάτου που οδηγεί στην αυτοκαταστροφή των κυττάρων, ακολουθώντας ένα γονιδιακά ελεγχόµενο πρόγραµµα στερεότυπων βιοχηµικών και µορφολογικών µεταβολών (Krantic και συν., 2005). Ο PCD αποτελεί σηµαντικό µηχανισµό φυσικής επιλογής που διατηρήθηκε στην εξέλιξη των ειδών µε πρωταρχικό σκοπό τον καθορισµό του τελικού µεγέθους των κυτταρικών πληθυσµών που συνιστούν το ΝΣ του ενηλίκου (Buss και συν., 2006). Θεωρείται θεµελιώδης διεργασία της ανάπτυξης, 25

36 Εισαγωγή παρατηρείται σε µεγάλη έκταση σε όλες σχεδόν τις περιοχές του κεντρικού και του περιφερικού ΝΣ και αφορά σε όλους τους τύπους των νευρικών και των νευρογλοιακών κυττάρων. Συνεπώς, παρά το γεγονός ότι οι ενήλικοι νευρώνες αποτελούν τη µακροβιότερη µορφή κυτταρικού τύπου, οι ανώριµοι νευρώνες πεθαίνουν σε υψηλά ποσοστά µέσω της διεργασίας του PCD (Yuan και Yankner, 2000). Σύµφωνα µε την ευρέως αποδεκτή θεωρία της «ποσοτικής αντιστοίχισης», κατά τα πρώτα στάδια της ανάπτυξης, οι νευρώνες παράγονται σε περίσσεια και ανταγωνίζονται µεταξύ τους για τη δέσµευση ικανής ποσότητας τροφικών παραγόντων, οι οποίοι προάγουν την επιβίωσή τους. Λόγω όµως της περιορισµένης παραγωγής των παραγόντων αυτών, επιβιώνουν µόνο οι νευρώνες εκείνοι που προσλαµβάνουν επαρκείς ποσότητες τροφικών παραγόντων, ενώ οι υπόλοιποι αποµακρύνονται µέσω της διεργασίας του PCD. Ο κυτταρικός αυτός θάνατος συχνά καταλήγει στην απώλεια µέχρι και του ηµίσεος του συνολικού νευρωνικού πληθυσµού που είχε αρχικά δηµιουργηθεί (Oppenheim, 1991 Burek και Oppenheim, 1996). Ο µηχανισµός αυτός της υπερπαραγωγής και της επακόλουθης µείωσης των κυττάρων αποτελεί τον πιο αποτελεσµατικό µηχανισµό του οργανισµού για τη διασφάλιση του ενδεδειγµένου µεγέθους των κυτταρικών πληθυσµών που συνδέονται µεταξύ τους και αναπτύσσονται ανεξάρτητα. 1. ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΤΟΥ PCD Οι έρευνες των τελευταίων ετών, σχετικά µε τους µηχανισµούς που διέπουν τη διεργασία του PCD κατά την ανάπτυξη, αποκάλυψαν δύο κατηγορίες PCD, ανάλογα µε το στάδιο της ανάπτυξης και µε τους πληθυσµούς των νευρώνων στους οποίους παρατηρείται η διεργασία αυτή. Η πρώτη κατηγορία ή «πολλαπλασιαστικός» PCD παρατηρείται 26

37 Εισαγωγή στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης, σε µη διαφοροποιηµένους νευρωνικούς πληθυσµούς, που είτε βρίσκονται στο στάδιο του πολλαπλασιασµού είτε αποτελούνται από ανώριµους µεταµιτωτικούς νευρώνες (de la Rosa και de Pablo, 2000 Kuan και συν., 2000 Roth και D Sa, 2001 Lossi και Merighi, 2003 Yeo και Gautier, 2004). Στον µυ, ο «πολλαπλασιαστικός» PCD εντοπίζεται στον αναπτυσσόµενο νευρικό ιστό ήδη από την Ε6,5 (Manova και συν., 1998) και από την Ε9 στο αναπτυσσόµενο οπτικό σύστηµα (Laemle και συν., 1999). Στους νευρώνες της κοιλιακής και της ενδιάµεσης ζώνης του αναπτυσσόµενου φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων παρατηρείται µεταξύ των Ε12 και Ε16 (Blaschke και συν., 1996, 1998 Thomaidou και συν., 1997). Μελέτες στις οποίες έγινε χρήση διαγονιδιακών προτύπων πειραµατοζώων, που φέρουν µεταλλάξεις στα γονίδια που σχετίζονται µε τον µηχανισµό του PCD, στοιχειοθέτησαν τη συµβολή του «πολλαπλασιαστικού» PCD στην ανάπτυξη του ΝΣ (Oppenheim και συν., 2001 Depaepe και συν., 2005 Putz και συν., 2005). Αν και ο ακριβής λειτουργικός του ρόλος δεν έχει ακόµη διευκρινιστεί (Boya και de la Rosa, 2005), πιστεύεται ότι ο «πολλαπλασιαστικός» PCD εξυπηρετεί κατά κύριο λόγο τον καθορισµό του µεγέθους των πρόδροµων νευρωνικών πληθυσµών και δευτερευόντως την αποµάκρυνση των κυττάρων που φέρουν µεταλλάξεις, είναι επιβλαβή, έχουν µεταναστεύσει σε λάθος θέση ή είναι αποτέλεσµα αρνητικής επιλογής (Yeo και Gautier, 2004 Buss και συν., 2006). Η δεύτερη κατηγορία ή «νευροτροφικός» PCD παρατηρείται σε µεταγενέστερα στάδια της ανάπτυξης, σε πλήρως διαφοροποιηµένους νευρωνικούς πληθυσµούς στους οποίους έχουν ολοκληρωθεί οι διαδικασίες της γέννησης και της µετανάστευσης. O «νευροτροφικός» PCD εµφανίζεται σε νευρώνες κατά τη διάρκεια της εδραίωσης των προσαγωγών και των απαγωγών συνδέσεών τους ή αµέσως µετά τη 27

38 Εισαγωγή διεργασία αυτή (Burek και Oppenheim, 1999). Η ανωτέρω παρατήρηση υποδηλώνει ότι η επιβίωση ή ο κυτταρικός θάνατος των νευρώνων εξαρτάται από τις κυτταρικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των περιοχών που συνδέονται µεταξύ τους. Ο PCD στην περίπτωση αυτή ρυθµίζεται από σήµατα που προάγουν την επιβίωση των νευρώνων και µεταφέρονται µέσω προσαγωγών ή απαγωγών ινών. Συνεπώς, ο λειτουργικός ρόλος της κατηγορίας αυτής του PCD αφορά, αφ ενός, στον καθορισµό του τελικού αριθµού των νευρώνων, αφ ετέρου, στην οργάνωση και εδραίωση των συνδέσεων διαφόρων περιοχών του ΝΣ. Πράγµατι, η πειραµατική αλλαγή του µεγέθους µιας περιοχής-στόχου επηρεάζει την επιβίωση του αριθµού των κυττάρων που συνδέονται µε την περιοχή αυτή (Oppenheim, 1991 Burek και Oppenheim, 1996). Στις περισσότερες περιπτώσεις, η σχέση µεταξύ του αριθµού των προσυναπτικών νευρώνων που επιβιώνουν κατά την περίοδο του PCD και των µετασυναπτικών κυττάρων είναι αναλογική και γραµµική (Tanaka και Landmesser, 1986 Herrup και Sunter, 1987 Herrup και συν., 1996 Zanjani και συν., 2004). 2. ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ ΤΟΥ PCD Αν και δεν υπάρχει οµοφωνία µεταξύ των ερευνητών σχετικά µε την ταξινόµηση των µορφολογικών τύπων του PCD, έχει παρατηρηθεί ότι οι µορφολογικές αλλοιώσεις του πυρήνα των κυττάρων που πεθαίνουν µέσω του PCD διαφέρουν ανάλογα µε τους βιοχηµικούς µηχανισµούς που ενεργοποιούνται σε κάθε περίπτωση (Leist και Jäättelä, 2001 Jäättelä, 2002). Συγκεκριµένα, µε βάση το µέγεθος κατακερµατισµού της χρωµατίνης, έχουν περιγραφεί τρεις µορφολογικοί τύποι PCD: α) ο αποπτωτικός τύπος ή κλασική απόπτωση (έντονος κατακερµατισµός), β) ο παρόµοιος µε απόπτωση τύπος (µέτριος 28

39 Εισαγωγή κατακερµατισµός) και γ) ο παρόµοιος µε νέκρωση τύπος (απουσία κατακερµατισµού). Ο αποπτωτικός τύπος χαρακτηρίζεται µορφολογικά από την έντονη συµπύκνωση και την κατάτµηση της χρωµατίνης σε δρεπανοειδείς ή σφαιρικούς σχηµατισµούς που κατανέµονται στην περιφέρεια του πυρήνα, προς τα έσω του πυρηνικού περιβλήµατος, και αποτελούνται από διαµεσονουκλεοσωµατικά θραύσµατα DNA ζευγών βάσεων. Η ενεργοποίηση µιας οικογένειας κυστεϊνικών πρωτεολυτικών ενζύµων, των κασπασών, αποτελεί τη βιοχηµική σφραγίδα της απόπτωσης (Samali και συν., 1999 Stefanis, 2005). Οι κασπάσες, µέσω µιας αλληλουχίας αντιδράσεων, διασπούν βασικές για την επιβίωση του κυττάρου πρωτεΐνες και ενεργοποιούν ένζυµα, όπως είναι η ενδονουκλεάση CAD (Caspase-Activated-Dnase), τα οποία συµµετέχουν στην καταστροφή του κυττάρου. Το ειδικό αυτό ένζυµο καταλύει τη διάσπαση του DNA σε διαµεσονουκλεοσωµατικά θραύσµατα, µετά την πρωτεολυτική διάσπαση του αναστολέα του (ICAD) από την κασπάση-3 (Enari και συν., 1998). Όταν το DNA των αποπτωτικών κυττάρων αναλυθεί ηλεκτροφορητικά σε γέλη αγαρόζης τα θραύσµατα αυτά εµφανίζονται µε χαρακτηριστική µορφή «βαθµίδων» (Cohen και συν., 1994). Οι υπόλοιπες µορφολογικές αλλαγές του αποπτωτικού τύπου περιλαµβάνουν τη συρρίκνωση του πυρήνα και του κυτταροπλάσµατος και τον σχηµατισµό εκκολπωµάτων στην κυτταρική µεµβράνη, µε αποτέλεσµα την αποκόλληση του κυττάρου από τον υπόλοιπο ιστό. Σηµαντικός θεωρείται ο ρόλος των µιτoχονδρίων, στα οποία συντελούνται σηµαντικές βιοχηµικές αλλαγές λόγω της µεταβολής της διαπερατότητας της εξωτερικής τους µεµβράνης. Εντούτοις, η δοµή τους, όπως και των υπόλοιπων οργανιδίων, διατηρείται άθικτη. Η αποπτωτική διεργασία ολοκληρώνεται µε τον σχηµατισµό των αποπτωτικών 29

40 Εισαγωγή σωµατίων, τα οποία αποτελούνται από κυτταρικά θραύσµατα που περιβάλλονται από ακέραιη κυτταρική µεµβράνη. Τα αποπτωτικά σωµάτια αναγνωρίζονται από γειτονικά µικρονευρογλοιακά κύτταρα και αποµακρύνονται µε κυτταροφαγία, χωρίς την πρόκληση φλεγµονώδους αντίδρασης (Kerr και συν., 1972 Wyllie και συν., 1981 Ellis και συν., 1991 Häcker, 2000 Bredesen, 2000). Η απόπτωση αποτελεί τον επικρατέστερο τύπο PCD κατά την ανάπτυξη του ΝΣ (Los και συν., 1999). Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος συµµετέχει στην αιτιοπαθογένεια πληθώρας παθολογικών καταστάσεων, όπως είναι τα ισχαιµικά εγκεφαλικά επεισόδια (Isenmann και συν., 1998), οι τραυµατικές βλάβες του εγκεφάλου (Clark και συν., 1997 Liou και συν., 2003) και οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως είναι οι νόσοι Alzheimer, Parkinson, χορεία Huntington και πλάγια µυατροφική σκλήρυνση (Yuan και Yanker, 2000 Mattson, 2000). Ο παρόµοιος µε απόπτωση τύπος PCD ενεργοποιείται όταν αναστέλλεται η δράση των κασπασών λόγω ενεργειακής ένδειας, µεταλλάξεων ή ενεργοποίησης άλλων πρωτεασών, για να διασφαλιστεί η ασφαλής αποµάκρυνση του κυττάρου (Leist και Jäättelä, 2001 Lockshin και Zakeri, 2004). Στον τύπο αυτό χαρακτηριστική είναι η µερική συµπύκνωση και ο κατακερµατισµός της χρωµατίνης σε µεγαλύτερα τµήµατα µεγέθους ζευγών βάσεων (Hong και συν., 2004 Krantic και συν., 2005), τα οποία προκύπτουν από τη δράση των ενδονουκλεασών G και κυκλοφιλίνης Α. Υπεύθυνη για την ενεργοποίηση των ενδονουκλεασών αυτών είναι µια φλαβοπρωτεΐνη των µιτοχονδρίων, ο παράγοντας που διεγείρει την απόπτωση (Apoptosis Inducing Factor, AIF). Ο AIF εντοπίζεται στα µιτοχόνδρια και αποτελεί βασικό ένζυµο της οξειδοαναγωγικής αντίδρασης. Όταν όµως ενεργοποιείται από την πολυµεράση της πολυadp ριβόζης -1 (PARP-1) µετά από εκτεταµένη 30

41 Εισαγωγή βλάβη του DNA, µεταφέρεται στον πυρήνα, συµµετέχοντας στην καταστροφή του κυττάρου (Modjtahedi και συν., 2006). Σύµφωνα µε γενετικές µελέτες, ο AIF εµπλέκεται στον πολλαπλασιαστικό PCD (Joza και συν., 2001) και στον PCD που παρατηρείται σε βλάβες του εγκεφάλου µετά από ισχαιµικά επεισόδια ή υπερβολική έκθεση σε διεγερτικά αµινοξέα, σε περιπτώσεις που αναστέλλεται η δράση των κασπασών (Jäättelä και Tschopp, 2003 Bröker και συν., 2005). Στον παρόµοιο µε νέκρωση τύπο PCD συµµετέχουν δύο διαφορετικές οµάδες πρωτεασών, οι καθεψίνες και οι καλπαΐνες, οι οποίες βρίσκονται στα λυσοσωµάτια και το ενδοπλασµατικό δικτυωτό, αντίστοιχα. Η δράση τους δεν προκαλεί κατάτµηση και συµπύκνωση της χρωµατίνης αλλά τον σχηµατισµό άφθονων κυτταροπλασµατικών κυστιδίων. Αν και οι υπεύθυνοι µοριακοί µηχανισµοί δεν έχουν διευκρινισθεί πλήρως, έχουν περιγραφεί δύο µορφολογικές παραλλαγές του τύπου αυτού: η παράπτωση, που ξεκινάει µε προοδευτική διόγκωση των µιτοχονδρίων και του ενδοπλασµατικού δικτυωτού, καταλήγοντας στον σχηµατισµό κυτταροπλασµατικών κενοτοπίων (Sperandio και συν., 2000 Bröker και συν., 2005) και ο αυτοφαγικός θάνατος, στον οποίο τα κυστίδια είναι λυσοσωµατικής προέλευσης και περιβάλλονται από διπλή µεµβράνη (Chi και συν., 1999 Kroemer και Jäättelä, 2005). Οι µορφολογικές αλλοιώσεις που χαρακτηρίζουν τον PCD προκύπτουν ως αποτέλεσµα της ενεργοποίησης ενός ενδοκυτταρικού µηχανισµού µε σκοπό την ελεγχόµενη καταστροφή και την ασφαλή αποµάκρυνση του κυττάρου. Πρόκειται για µια ενεργητική κατηγορία κυτταρικού θανάτου που απαιτεί τη συνεργιστική δράση µιας πληθώρας παραγόντων (σηµατοδοτικών µορίων, υποδοχέων, ενζύµων, γονιδιακά ελεγχόµενων πρωτεϊνών) και, ως εκ τούτου, τη λειτουργική ακεραιότητα του κυττάρου (Fan και συν., 2005). Η διαπίστωση αυτή προήλθε από µελέτες που αποδείκνυαν ότι η αναστολή της σύνθεσης mrna και 31

42 Εισαγωγή πρωτεϊνών ήταν δυνατόν να αποτρέψει τον κυτταρικό θάνατο που προκαλούσε η αποστέρηση τροφικών παραγόντων (Martin και συν., 1988). Η νέκρωση αποτελεί µια άλλη κατηγορία κυτταρικού θανάτου, η οποία είναι αποτέλεσµα παθητικής διεργασίας, όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε οξείες τραυµατικές ή χηµικές προσβολές. Αν και οι µοριακοί µηχανισµοί που διέπουν τη διεργασία της νέκρωσης δεν είναι πλήρως διευκρινισµένοι, πειραµατικές µελέτες υποδηλώνουν ότι η αύξηση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης των ιόντων ασβεστίου (Ca 2+ ) πυροδοτεί τους µηχανισµούς νέκρωσης των νευρώνων, ενώ τα πρωτεολυτικά ένζυµα που ενεργοποιούνται είναι οι καλπαΐνες και οι λυσοσωµατικές καθεψίνες (Artal-Sanz και Tavernarakis, 2005). Οι µορφολογικές µεταβολές που οδηγούν στη νέκρωση χαρακτηρίζονται ως «όγκωση» (Majno και Joris, 1995 Van Cruchten και Van Den Broeck, 2002) και περιλαµβάνουν την διόγκωση του κυττάρου και ιδιαιτέρως των µιτοχονδρίων και του ενδοπλασµατικού δικτυωτού, τη δηµιουργία κενοτοπίων στο κυτταρόπλασµα, χωρίς τον σχηµατισµό εκκολπωµάτων στην κυτταρική µεµβράνη και την κατάτµηση του DNA σε τυχαίες θέσεις. Την οιδηµατική αυτή µορφολογία, διαδέχεται η λύση του κυττάρου και η απελευθέρωση του περιεχοµένου του στον εξωκυτταρικό χώρο, µε αποτέλεσµα τη βλάβη των γύρω ιστών και την πρόκληση φλεγµονώδους αντίδρασης (Leist και Jäättelä, 2001 Syntichaki και Tavernarakis, 2003). Παρά το γεγονός ότι η µορφολογική διάκριση µεταξύ απόπτωσης και νέκρωσης είναι δυνατή, σε κάποιες περιπτώσεις η διαχωριστική γραµµή είναι λιγότερο σαφής (Syntichaki και Tavernarakis, 2003). Η απόπτωση, η νέκρωση καθώς και ενδιάµεσοι φαινότυποι είναι δυνατόν να παρατηρηθούν ταυτόχρονα στον ίδιο κυτταρικό πληθυσµό υπό την επίδραση του ίδιου ερεθίσµατος. Η σταδιακή αυτή φαινοτυπική έκφραση 32

43 Εισαγωγή του κυτταρικού θανάτου καθορίζεται από διάφορους παράγοντες, µεταξύ των οποίων περιλαµβάνονται η ένταση του ερεθίσµατος, η διαθεσιµότητα του κυττάρου σε ενέργεια και η ενεργοποίηση των κασπασών (Zeiss, 2003 Artal-Sanz και Tavernarakis, 2005). Παραδείγµατος χάριν, το φαινόµενο αυτό παρατηρείται σε περιπτώσεις κυτταρικού θανάτου µετά από υπερβολική έκθεση σε διεγερτικά αµινοξέα, δηµιουργείται µετά από ισχαιµία, υποξία, υπογλυκαιµία ή χορήγηση τοξικών ουσιών, και οφείλεται στην υπερβολική διέγερση των γλουταµινικών υποδοχέων, όπως είναι οι υποδοχείς NMDA (Portera-Cailliau και συν., 1997a, b Martin και συν., 1998). Οι ιοντοτρόποι αυτοί υποδοχείς λειτουργούν ως δίαυλοι ιόντων ασβεστίου, η αυξηµένη ενδοκυτταρική συγκέντρωση των οποίων οδηγεί στον κυτταρικό θάνατο (Nicotera και συν., 1999). 3. ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ Οι πολύπλοκοι µοριακοί µηχανισµοί που οδηγούν στην απόπτωση των κυττάρων ελέγχονται από ενδοκυτταρικούς και εξωκυτταρικούς παράγοντες. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα γονίδια, οι πρωτεΐνες και οι υποδοχείς των κυττάρων που συµµετέχουν στον αποπτωτικό µηχανισµό. Στην δεύτερη κατηγορία εξέχουσα θέση κατέχουν οι νευροτροφικοί παράγοντες. 3.1 ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Αντικείµενο εκτεταµένης έρευνας αποτέλεσαν τα τελευταία χρόνια οι µοριακοί µηχανισµοί που ελέγχουν τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και έχουν διατηρηθεί στη φυλογενετική εξέλιξη των ειδών. Γενετικές µελέτες στον νηµατώδη σκώληκα Caenorhabditis elegans οδήγησαν στην ταυτοποίηση 4 γονιδίων, των ced-3, ced-4, ced-9 και egl-1 και των προϊόντων τους που ρυθµίζουν τους µοριακούς µηχανισµούς της 33

44 Εισαγωγή απόπτωσης και αντιπροσωπεύονται από αντίστοιχα οµόλογα στα θηλαστικά (για βιβλιογραφικές αναφορές βλ. Horvitz, 2003). Οι κασπάσες, από το ακρωνύµιο των λέξεων Cytosolic Aspartate Specific Cysteine Proteases / Caspases (Alnemri και συν., 1996), αντιπροσωπεύουν για τα θηλαστικά τα οµόλογα προϊόντα του γονιδίου ced-3 του C. elegans και είναι οι κύριοι εκτελεστές της απόπτωσης, ανεξάρτητα από το ερέθισµα που ενεργοποιεί τον αποπτωτικό µηχανισµό (Hengartner, 2000 Becker και Bonni, 2004). Όπως οι περισσότερες πρωτεάσες, οι κασπάσες συντίθενται στο κυτταρόπλασµα µε τη µορφή ενζυµατικώς ανενεργών ζυµογόνων, των προκασπασών, και για την ενεργοποίηση τους απαιτείται η πρωτεολυτική τους διάσπαση από τα ίδια ή άλλα µέλη της οικογένειας. Φυλογενετικές αναλύσεις απέδειξαν ότι 7 από τα 14, έως σήµερα, ταυτοποιηµένα µέλη της οικογένειας, οι κασπάσες -2, -3, -6, -7, -8, -9 και -10, αποτελούν τους κύριους ρυθµιστές του αποπτωτικού µηχανισµού ενώ οι κασπάσες -1, -4, -5, -11, -12 και -13 φαίνεται να συµµετέχουν σε µηχανισµούς πρόκλησης φλεγµονής και συγκεκριµένα στην ενεργοποίηση των προφλεγµονωδών κυτοκινών (Zimmermann και συν., 2001 Denault και Salvesen, 2002 Yakovlev και Faden, 2004). Σε αντίθεση µε τις υπόλοιπες κασπάσες, η πρωτεολυτική δράση της κασπάσης -14 σχετίζεται µε τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων (Krajewska και συν., 2005). Οι κασπάσες -2, -8, - 9 και -10 χαρακτηρίζονται ως «εναρκτήριες» διότι προκαλούν τη διέγερση του αποπτωτικού µηχανισµού µέσω της ενεργοποίησης των κασπασών -3, -6 και -7, που αποτελούν τις «δραστικές» κασπάσες και ευθύνονται για τις χαρακτηριστικές µορφολογικές αλλοιώσεις της απόπτωσης. Συστηµατικές αναλύσεις του πρωτεώµατος των αποπτωτικών κυττάρων, οδήγησαν στην ταυτοποίηση τουλάχιστον 280 πρωτεϊνών που διασπώνται από τις κασπάσες, οι περισσότερες των οποίων διασπώνται από την κασπάση-3 (Fischer και συν., 2003). Η 34

45 Εισαγωγή κασπάση-3 χαρακτηρίζεται ως πρωτεάση ειδική της απόπτωσης (Porter και Jänicke, 1999 Marklund και συν., 2006) επειδή τα βιοχηµικά και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης προκύπτουν µετά την πρωτεολυτική διάσπαση πληθώρας πρωτεϊνών βασικών για την επιβίωση του κυττάρου από την κασπάση-3. Παραδείγµατος χάριν, πέρα από την ενεργοποίηση της υπεύθυνης για την απόπτωση DNΑάσης CAD, η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 προκαλεί πρωτεολυτική διάσπαση των πυρηνικών λαµινών (δοµικές πρωτεΐνες του πυρηνικού περιβλήµατος) και των κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών φιλαµίνης, φοδρίνης και γελσολίνης, µε αποτέλεσµα τη συρρίκνωση του πυρήνα και του κυτταροπλάσµατος, αντίστοιχα (Rao και συν., 1996 Kothakota και συν., 1997 Buendia και συν., 1999 Eldadah και Faden, 2000 Fischer και συν., 2003). Επιπλέον, η κασπάση-3 ευθύνεται για την αποδόµηση πρωτεϊνών που σχετίζονται µε την επιδιόρθωση του DNA, όπως είναι η PARP-1 και η εξαρτηµένη από το DNA πρωτεϊνική κινάση (Lazebnik και συν, 1994 Song και συν., 1996). Υποστηρίζεται ότι υπάρχουν δύο διαφορετικές οδοί δράσης των κασπασών. Στην πρώτη ή «εξωτερική» οδό ενεργοποιούνται οι ειδικοί υποδοχείς επιφάνειας της οικογένειας του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (TNF), TNF-RI και Fas/Apo-1/CD95 από τα αποπτωτικά σηµατοδοτικά µόρια TNF-2 και FasL, αντίστοιχα (Fan και συν., 2005). Οι υποδοχείς αυτοί, που συχνά αναφέρονται και ως υποδοχείς θανάτου, περιλαµβάνουν την περιοχή DD (Death Domain), η οποία ευθύνεται για την ενεργοποίηση του αποπτωτικού µηχανισµού (Strasser και συν., 2000). Η σύνδεση των σηµατοδοτικών µορίων µε την περιοχή DD προκαλεί τη δηµιουργία ενός µοριακού συµπλόκου, του σηµατοδοτικού συµπλέγµατος επαγωγής θανάτου (DISC) και στη συνέχεια τη συσσώρευση και την ενεργοποίηση των εναρκτήριων κασπασών -2, -8 και -10 (Hengartner, 2000). 35

46 Εισαγωγή Στη δεύτερη ή «εσωτερική» οδό καθοριστικό ρόλο παίζουν τα µιτοχόνδρια. Τα αποπτωτικά ερεθίσµατα µεταβάλλουν τη διαπερατότητα της εξωτερικής µιτοχονδριακής µεµβράνης, γεγονός που χαρακτηρίζεται ως το «σηµείο χωρίς επιστροφή» για την απόπτωση (Chipuk και συν., 2006), διότι προκαλεί την έκλυση διαφόρων πρωτεϊνικών παραγόντων από τον διαµεµβρανικό χώρο των µιτοχονδρίων στο κυτταρόπλασµα. Μεταξύ αυτών περιλαµβάνονται παράγοντες που επάγουν την απόπτωση, όπως είναι το κυτόχρωµα c, ο παράγοντας Smac/DIABLO και ο HtrA2/OMI, και παράγοντες που επάγουν τον παρόµοιο µε απόπτωση τύπο PCD, όπως είναι ο AIF και η ενδονουκλεάση G (Shiozaki και Shi, 2004 Armstrong, 2006). Σηµαντικότερος παράγοντας µεταξύ αυτών για την ενεργοποίηση των κασπασών, είναι το κυτόχρωµα c, το οποίο όταν βρεθεί στο κυτταρόπλασµα, παρουσία datp ή ATP, δρα ως συνένζυµο στο σχηµατισµό ενός πρωτεϊνικού συµπλόκου που είναι γνωστό ως αποπτόσωµα. Συγκεκριµένα, το κυτόχρωµα c καταλύει τον ολιγοµερισµό του παράγοντα Apaf-1 ή παράγοντα ενεργοποίησης της αποπτωτικής πρωτεάσης, ο οποίος αντιπροσωπεύει το οµόλογο για τα θηλαστικά προϊόν του γονιδίου ced-4, σε ένα επταµερές σύµπλοκο µαζί µε µόρια προκασπάσης -9 σε αναλογία 1:1 (Hill και συν., 2003 Adrain και συν., 2006). Με τον σχηµατισµό του αποπτοσώµατος, καταλύεται η ενεργοποίηση των µορίων της κασπάσης -9 και ακολούθως των «δραστικών» κασπασών -3 και -7 (Green, 2005 Bao και Shi, 2007). Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 αποτελεί τον τελικό στόχο και το σηµείο σύγκλισης των δύο οδών δράσης των κασπασών. Ο ρόλος της κασπάσης-3 στην απόπτωση έχει υποστηριχθεί σε µελέτες µε διαγονιδιακούς µυς, που φέρουν µη λειτουργικές µεταλλάξεις στο γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη αυτή (κασπάση-3 -/- ) τόσο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (Kuida και συν., 1996) όσο και µετά από παθολογικές καταστάσεις, όπως είναι τα ισχαιµικά επεισόδια, οι 36

47 Εισαγωγή κρανιοεγκεφαλικές κακώσεις (Clark και συν., 2000 Keane και συν., 2001 Sullivan και συν., 2002) και οι νευροεκφυλιστικές διαταραχές (Marklund και συν., 2006). Η ενζυµατική δραστηριότητα των κασπασών -3, -7 και -9 αναστέλλεται από την πρωτεϊνική οικογένεια των αναστολέων των αποπτωτικών πρωτεϊνών (IAPs) ή αναστολέων των κασπασών. Οι IAPs βρέθηκε ότι προάγουν την επιβίωση των κυττάρων σε πολλά πειραµατικά πρότυπα τόσο in vitro όσο και in vivo (για βιβλιογραφικές αναφορές βλ. LaCasse και συν., 1998). Μέχρι σήµερα, τουλάχιστον 8 IAPs έχουν ταυτοποιηθεί στα θηλαστικά (XIAP, c-iap1, c-iap2, NAIP, ML-IAP, ILP-2, SURVIVIN και Bruce/apollan), εκ των οποίων ο αναστολέας XIAP έχει την πιο ισχυρή αντιαποπτωτική δράση (Holcik και συν., 2001 Saelens και συν., 2004 Twomey και McCarthy, 2005). Οι ενεργές του περιοχές BIR-2 και BIR-3 δεσµεύουν τις ενεργές κασπάσες -3, -7 και -9 και την προκασπάση -9, αναστέλλοντας τη δράση τους (Shi, 2002). Οι παράγοντες Smac/DIABLO και HtrA2/OMI, που εκλύονται από τα µιτοχόνδρια, αποτελούν έναν πρόσθετο µηχανισµό «ασφάλειας» που αναπτύσσει το αποπτωτικό κύτταρο για την αποµάκρυνση των IAPs (Verhagen και συν., 2000 Suzuki και συν., 2000 Du και συν., 2000). Η µεταβολή της διαπερατότητας της εξωτερικής µιτοχονδριακής µεµβράνης, όπως αναφέρθηκε, πυροδοτεί τον αποπτωτικό µηχανισµό και οδηγεί στον θάνατο του κυττάρου. Στη µεταβολή αυτή, καθοριστικό ρόλο παίζει η αλληλεπίδραση µεταξύ των µελών της πρωτεϊνικής οικογένειας Bcl-2 (Green και Kroemer, 2004). Τα µέλη της οικογένειας αυτής διακρίνονται σε δύο λειτουργικές κατηγορίες, ανάλογα µε το αν προάγουν (αποπτωτικά) ή αναστέλλουν (αντιαποπτωτικά) την απόπτωση και αντιπροσωπεύουν τα οµόλογα προϊόντα των γονιδίων ced-9 και egl-1 του C. elegans. οµικά, κάθε µέλος της οικογένειας αυτής απαρτίζεται από µία έως τέσσερις οµόλογες περιοχές Bcl, τις περιοχές BH1-4. Οι 37

48 Εισαγωγή περιοχές αυτές καθορίζουν τη λειτουργική ιδιότητα της κάθε πρωτεΐνης. Οι αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες Bcl-2, Bcl-x L, Mcl-1, A1 και Bcl-w εκφράζουν και τις 4 περιοχές και είναι ισχυροί αναστολείς της «εσωτερικής» οδού, ενώ σε όλα τα αποπτωτικά µέλη απουσιάζει η υπεύθυνη για την αντιαποπτωτική δράση περιοχή BH4. Τα αποπτωτικά µέλη διακρίνονται σε εκείνα που περιλαµβάνουν τις περιοχές BH1-3 και σε εκείνα που εκφράζουν µόνο την περιοχή BH3. Εκπρόσωποι της πρώτης κατηγορίας είναι οι πρωτεΐνες Bax, Bak και Bok, υπεύθυνες για την αλλαγή της διαπερατότητας της εξωτερικής µιτοχονδριακής µεµβράνης, ενώ στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν οι πρωτεΐνες Bad, Bid, Bim, Bmf, Hrk, Nbk, Bnip3, Noxa και Puma, (Danial και Korsmeyer, 2004 Twomey και McCarthy, 2005). Οι πρωτεΐνες της δεύτερης κατηγορίας θεωρούνται υπεύθυνες είτε για την απενεργοποίηση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών (πρωτεΐνες Bad και Noxa) είτε για την ενεργοποίηση των αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax και Bak (πρωτεΐνες Bid, Bim και Puma) (Green, 2005 Lucken-Ardjomande και Martinou, 2005). Οι παράγοντες που συµµετέχουν στους µηχανισµούς ενεργοποίησης των πρωτεϊνών Bcl-2 δεν είναι πλήρως γνωστοί, εντούτοις, ερευνητικά δεδοµένα υποδεικνύουν µια πληθώρα αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως είναι τα µέλη της οικογένειας (Bähr, 2000 Rosenquist, 2003), η ουµανίνη (Guo και συν., 2003), ο επιδιορθωτικός παράγοντας του DNA Ku70 (Sawada και συν., 2003), οι σαπερόνες (πρωτεΐνες συνοδοί) θερµικού σοκ Hsp70, αα-κρυσταλλίνη και αβ-κρυσταλλίνη (Lucken-Ardjomande και Martinou, 2005). Οι πρωτεΐνες αυτές αναστέλλουν τη δράση των αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax και Bak, ενώ µεταξύ των παραγόντων που προάγουν τη δράση τους, σηµαντική θέση κατέχει η πρωτεΐνη p53 (Moll και συν., 2005). Η ογκο-κατασταλτική πρωτεΐνη p53 αποτελεί µεταγραφικό παράγοντα που συµµετέχει σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες, όπως είναι 38

49 Εισαγωγή η σύνθεση και η επιδιόρθωση του DNA, η ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου και ο κυτταρικός θάνατος (Hofseth και συν., 2004). Βλάβη του DNA, αποστέρηση τροφικών παραγόντων ή επίδραση κυτταροτοξικών ουσιών είναι ορισµένοι από τους παράγοντες που προκαλούν αύξηση της έκφρασης της p53 (Culmsee και Mattson, 2005), γεγονός που προκαλεί τον θάνατο του κυττάρου µέσω της διέγερσης των γονιδίων που κωδικοποιούν τις αποπτωτικές πρωτεΐνες Puma, Noxa, Bax και Bid, αλλά και της καταστολής γονιδίων αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως είναι η Bcl-2 και ο IAP SURVIVIN (Moll και συν., 2006). Η πρωτεϊνική οικογένεια στην οποία ανήκει η p53 περιλαµβάνει επίσης τις ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες p63 και p73, µε ισοµορφές τόσο οµόλογου όσο και ανταγωνιστικού χαρακτήρα ως προς την p53. Έχει υποστηριχθεί η άποψη ότι η δράση των πρωτεϊνών αυτών είναι συνεργιστική και ότι µικρές µεταβολές στα επίπεδα έκφρασής τους είναι καθοριστικής σηµασίας για την επιβίωση ή την απόπτωση των κυττάρων (Jacobs και συν., 2006). Τέλος, στους µηχανισµούς της απόπτωσης συµµετέχουν και άλλοι µεταγραφικοί παράγοντες, όπως είναι ο πυρηνικός παράγοντας kappab (NF-κB) και ο c-jun. Η ενεργοποίηση του NF-κB στους νευρώνες ευνοεί την επιβίωση τους, µέσω της διέγερσης των γονιδίων των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 και Bcl-xl και των IAPs. Αντίθετα, η ενεργοποίησή του στα νευρογλοιακά κύτταρα προάγει τον θάνατο των νευρώνων, µέσω της ενεργοποίησης της παραγωγής προφλεγµονωδών κυτοκινών (Mattson, 2005 Mattson και Meffert, 2006). H ενεργοποίηση του c-jun διεγείρει την έκφραση του γονιδίου της αποπτωτικής πρωτεΐνης Bim και προάγει την απόπτωση των νευρώνων (Putcha και συν., 2001). 39

50 Εισαγωγή 3.2 ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Οι νευροτροφικοί παράγοντες αποτελούν κατηγορία πολυπεπτιδικών αυξητικών παραγόντων που προάγουν τις διεργασίες της ανάπτυξης και της ωρίµασης του ΝΣ, συµβάλλουν στην επιβίωση των κυτταρικών πληθυσµών και στην εδραίωση και διατήρηση των συνδέσεών τους και, τέλος, στην αναδιοργάνωση και επιδιόρθωση των νευρωνικών δικτύων σε παθολογικές καταστάσεις (Terenghi, 1999 Chao και συν., 2006 Cui, 2006). Πειραµατικές µελέτες έχουν δείξει ότι η έλλειψη των παραγόντων αυτών έχει ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση του γενετικού προγράµµατος της απόπτωσης. Το ευρύ φάσµα των βιολογικών δράσεων των νευροτροφικών παραγόντων αποτέλεσε ισχυρό κίνητρο για ενδελεχή έρευνα µε αντικείµενο τη χρήση τους ως θεραπευτικών παραγόντων σε παθολογικές καταστάσεις. Παραδείγµατα τέτοιων καταστάσεων αποτελούν οι τραυµατικές και οι ισχαιµικές βλάβες του ΝΣ (Abe, 2000) και νευροεκφυλιστικές ασθένειες όπως είναι οι νόσοι Alzheimer, Parkinson, χορεία Huntington, πλάγια µυατροφική σκλήρυνση και διάφορες περιφερικές νευροπάθειες (Thoenen και Sendtner, 2002 Dawbarn και Allen, 2003). Η ταυτοποίηση του πρώτου νευροτροφικού παράγοντα, του αυξητικού παράγοντα των νεύρων (NGF), από τη Rita Levi-Montalcini στις αρχές της δεκαετίας του 1950 (για βιβλιογραφικές αναφορές βλ. Levi-Montalcini, 1987) αποτέλεσε ορόσηµο στην ανάπτυξη των νευροεπιστηµών διότι έθεσε τις βάσεις για τη διατύπωση της νευροτροφικής θεωρίας. Σύµφωνα µε τη θεωρία αυτή, οι αναπτυσσόµενοι µεταµιτωτικοί νευρώνες ανταγωνίζονται µεταξύ τους για τη δέσµευση και την ανάδροµη µεταφορά των περιορισµένων σε διαθεσιµότητα νευροτροφικών παραγόντων που παράγονται από τις περιοχές-στόχους των νευρώνων αυτών. Οι νευρώνες που 40

51 Εισαγωγή προσλαµβάνουν επαρκείς ποσότητες νευροτροφικών παραγόντων επιβιώνουν, ενώ οι υπόλοιποι αποµακρύνονται µέσω του PCD (Clarke, 1985 Oppenheim, 1991 Clarke και συν., 1998). Μέσω του µηχανισµού αυτού επιτυγχάνεται η ποσοτική αντιστοίχιση µεταξύ των νευρωνικών πληθυσµών και των περιοχών-στόχων τους κατά την ανάπτυξη του ΝΣ (Freeman και συν., 2004). Ο NGF ανήκει στην οικογένεια των νευροτροφινών, την ευρύτερα µελετηµένη από τις οικογένειες των νευροτροφικών παραγόντων. Στις νευροτροφίνες ανήκουν επίσης ο προερχόµενος από τον εγκέφαλο νευροτροφικός παράγοντας (BDNF) (Barde και συν., 1982), η νευροτροφίνη 3 (NT-3) (Ernfors και συν., 1990) και η νευροτροφίνη 4/5 (NT-4/5) (Hallbook και συν., 1991) στα θηλαστικά, καθώς και οι νευροτροφίνες 6 και 7 (NT-6, NT-7), οι οποίες έχουν εντοπιστεί µόνο στους ιχθύς (Gotz και συν., 1994 Cui, 2006). Η βιολογική δράση των νευροτροφινών βασίζεται στην ιδιότητά τους να συνδέονται σε δύο δοµικά διαφορετικές κατηγορίες διαµεµβρανικών υποδοχέων, τους υποδοχείς της οικογένειας των κινασών της τυροσίνης (Trk) και τον νευροτροφικό υποδοχέα p75 (p75 NTR ) (Teng και Hempstead, 2004). Οι υποδοχείς της οικογένειας Trk περιλαµβάνουν τις ισοµορφές Α, Β και C, που παρουσιάζουν υψηλή ειδικότητα σύνδεσης υποδοχέα προσδέτη και χαρακτηρίζονται ως υποδοχείς υψηλής συγγένειας (Barbacid, 1994 Kaplan και Stephens, 1994). Συγκεκριµένα, ο NGF συνδέεται ειδικώς µε τον TrkA, ο BDNF και ο NT-4/5 µε τον TrkB και ο NT-3 µε τον TrkC (Thoenen και Sendtner, 2002). Αντίθετα, ο υποδοχέας p75 NTR, που ανήκει στην οικογένεια των υποδοχέων του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (TNF), αναφέρεται ως υποδοχέας χαµηλής συγγένειας (Chao, 1994). Στον p75 NTR αποδίδονται πολλαπλοί ρόλοι. Ο p75 NTR µπορεί να προσδέσει όλες τις νευροτροφίνες και να επάγει είτε την επιβίωση είτε τον 41

52 Εισαγωγή κυτταρικό θάνατο των νευρώνων, µεταβάλλοντας τη συγγένεια των υποδοχέων της οικογένειας Trk µε τους ειδικούς προσδέτες τους (Miller και Kaplan, 2001 Chao και συν., 2006), γεγονός που, τουλάχιστον εν µέρει, εξαρτάται από τα ποσοστά έκφρασης των υποδοχέων Trk στους νευρώνες (Davies, 2003). Πέρα από τις νευροτροφίνες, στην κατηγορία των νευροτροφικών παραγόντων ανήκουν και άλλες οικογένειες πρωτεϊνών που προάγουν την επιβίωση των νευρώνων τόσο κατά την ανάπτυξη όσο και µετά από διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Σε αυτές περιλαµβάνονται: η οικογένεια των προερχόµενων από τα νευρογλοιακά κύτταρα νευροτροφικών παραγόντων (GDNF), εκπρόσωποι της οποίας είναι η νευροτουρίνη, η αρτεµίνη και η περσεφίνη, η οικογένεια του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών (FGF), η οποία περιλαµβάνει όξινα (a-fgf) και βασικά (b-fgf) µέλη, η οικογένεια των νευροτροφικών κυτοκινών, στην οποία ανήκουν ο ακτινοειδής νευροτροφικός παράγοντας (CNTF), ο ανασταλτικός παράγοντας της λευχαιµίας (LIF), η καρδιοτροφίνη-1 (CT- 1), η ογκοστατίνη-m (OSM) και η ιντερλευκίνη-6 (IL-6), η οικογένεια των ηπατοκυτταρικών αυξητικών παραγόντων, εκπρόσωποι της οποίας είναι ο ηπατικός αυξητικός παράγοντας (HGF) και ο παράγοντας ενεργοποίησης των µακροφάγων (MSP), η οικογένεια των παρόµοιων µε την ινσουλίνη αυξητικών παραγόντων (IGF) και των αυξητικών παραγόντων µεταµόρφωσης βήτα (TGF-β), και, τέλος, οι αιµοπεταλιακοί αυξητικοί παράγοντες ΑΑ, ΑΒ και ΒΒ (PDGF-AΑ, PDGF-AΒ, PDGF- ΒB) (Yuen και Mobley, 1996 Abe, 2000 Davies, 2003). Μεταξύ αυτών, ιδιαίτερα αποτελεσµατική για την επιβίωση των νευρώνων και την αναγέννηση των αποφυάδων τους αποδείχτηκε η δράση των παραγόντων CNTF, LIF, GDNF και των παραγόντων της οικογένειας FGF (Cui, 2006). Για τους τελευταίους βρέθηκε ότι αναστέλλουν τους µηχανισµούς της απόπτωσης, προάγοντας την έκφραση των αποπτωτικών πρωτεϊνών 42

53 Εισαγωγή Bcl-2 και Bcl-xl ή καταστέλλοντας την έκφραση της κασπάσης-3 (Miho και συν., 1999 Desire και συν., 2000) Οι νευροτροφικοί παράγοντες, όπως και πολλοί αυξητικοί παράγοντες, συντίθενται µε τη µορφή πρόδροµων µορίων µεγαλύτερου µεγέθους, τα οποία απαιτούν την πρωτεολυτική τους αποδόµηση, ώστε να ελευθερώσουν τους ενεργούς προσδέτες τους. Ωστόσο, έχει προταθεί και ένας ενεργός λειτουργικός ρόλος για την πρόδροµη µορφή του NGF, του προ-ngf, διαφορετικός από εκείνον της ώριµης µορφής του (Fahnestock και συν., 2004). Ο προ-ngf βρίσκεται σε αφθονία µέσα στο ΚΝΣ και έχει 5 φορές ισχυρότερη συγγένεια προς τον υποδοχέα p75 NTR σε σύγκριση µε τον NGF και µηδενική συγγένεια προς τους υποδοχείς TrkA, γεγονός που ενδεχοµένως σχετίζεται µε την ιδιότητά του να προάγει τον κυτταρικό θάνατο (Davies, 2003). Σύµφωνα µε την αρχική διατύπωση της νευροτροφικής θεωρίας, οι νευροτροφικοί παράγοντες συντίθενται στα µετασυναπτικά κύτταρα των περιοχών-στόχων, εκλύονται σε ποσότητες ανάλογες µε την πυκνότητα εννεύρωσης της περιοχής (Harper και Davies, 1990) και δεσµεύονται από τους αντίστοιχους υποδοχείς στις απολήξεις των προσυναπτικών κυττάρων. Στη συνέχεια, µεταφέρονται ανάδροµα κατά µήκος του νευράξονα των νευρώνων αυτών, πιθανώς µέσα σε ενδοσωµάτια, µε στόχο την αποδόµησή τους στο περικάρυο, όπου ασκείται και η βιολογική τους δράση (Howe και συν., 2001). Η κλασική αυτή άποψη ενισχύθηκε από νεότερα πειραµατικά δεδοµένα σύµφωνα µε τα οποία οι νευροτροφικοί παράγοντες µπορούν να µεταφερθούν και ορθόδροµα από τα προσυναπτικά προς τα µετασυναπτικά κύτταρα (Linden, 1994), αλλά και µέσω παρακρινών και αυτοκρινών µηχανισµών (Davies, 2003). Ανοσοϊστοχηµικές in vivo και in vitro µελέτες έδειξαν ότι οι νευροτροφίνες και οι υποδοχείς τους εντοπίζονται σε πολλές περιοχές του οπτικού συστήµατος κατά την ανάπτυξη και επηρεάζουν τον 43

54 Εισαγωγή πολλαπλασιασµό, την επιβίωση και τη µορφολογική και νευροχηµική διαφοροποίηση των κυττάρων του (για βιβλιογραφικές αναφορές βλ. von Bartheld, 1998). Παραδείγµατος χάριν, στον dlgn του αναπτυσσόµενου και του ενήλικου επίµυος ανιχνεύονται mrnas για τις νευροτροφίνες NGF (Lauterborn και συν., 1994), BDNF και NT-3 (Schoups και συν., 1995) και για τους υποδοχείς TrkB και TrkC (Ringstedt και συν., 1993 Schoups και συν., 1995). Το mrna για τον υποδοχέα p75 NTR ανιχνεύεται µόνο στον dlgn του αναπτυσσόµενου επίµυος (Yan και Johnson, 1988). Ανιχνεύσιµα επίπεδα του mrna των παραγόντων NGF και BDNF εντοπίζονται από την Μ5, χωρίς να παρουσιάζουν διακυµάνσεις σε όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης, ενώ ο NT-3 ανιχνεύεται παροδικά κατά τη διάρκεια της πρώτης µεταγεννητικής εβδοµάδας. Αντίθετα, στον οπτικό φλοιό, οι NGF, BDNF και NT-4/5 ανιχνεύονται στο νεογέννητο και διατηρούνται σε χαµηλά, αλλά σταδιακά αυξανόµενα επίπεδα τα οποία µεγιστοποιούνται την τρίτη µεταγεννητική εβδοµάδα (Schoups και συν., 1995). Από τους παράγοντες αυτούς, ξεχωριστή θέση έχει ο NT-4/5, τα επίπεδα του οποίου αυξάνονται ταχύτερα και σε τιµές υψηλότερες από εκείνες των υπολοίπων (Patz και Wahle, 2006). Στα γαγγλιακά κύτταρα του ΑµΧ του επίµυος, το mrna του BDNF ανιχνεύεται στο νεογέννητο, ενώ το mrna του NT-3 ανιχνεύεται σε µεταγενέστερες ηλικίες (von Bartheld, 1998). Οι νευρώνες του dlgn τροφοδοτούνται από τον οπτικό φλοιό µε τις ανάδροµα µεταφερόµενες νευροτροφίνες NGF και NT-4/5 (Wahle και συν., 2003) και από τα γαγγλιακά κύτταρα του ΑµΧ µε τις ορθόδροµα µεταφερόµενες νευροτροφίνες BDNF και NT-3 (von Bartheld, 1998). Το είδος του νευροτροφικού παράγοντα και η οδός µεταφοράς του είναι παράµετροι κρίσιµες και καθοριστικές για το αποτέλεσµα της παρεχόµενης νευροπροστασίας. Παραδείγµατος χάριν, έχει βρεθεί ότι η ανάδροµη µεταφορά του NT-4/5 και του NGF, αλλά όχι του BDNF, από 44

55 Εισαγωγή τον οπτικό φλοιό αυξάνει το µέγεθος του κυτταρικού σώµατος και επιταχύνει την ανάπτυξη των νευρώνων του dlgn κατά την ανάπτυξη (Wahle και συν., 2003). Ωστόσο, ο BDNF που µεταφέρεται ορθόδροµα από τον ΑµΧ είναι απαραίτητος για την εδραίωση των συνδέσεων µεταξύ ΑµΧ και dlgn, προάγοντας την ανάπτυξη και την εξειδίκευση των προβολών των γαγγλιακών κυττάρων του ΑµΧ στον dlgn (Menna και συν., 2003). Πληθώρα βιβλιογραφικών αναφορών τις τελευταίες δεκαετίες έδειξε ότι η βιολογική δράση των νευροτροφικών παραγόντων έχει καθοριστική σηµασία στις διεργασίες της επιβίωσης των νευρώνων και της αναγέννησης των νευρωνικών δικτύων του οπτικού συστήµατος µετά από παθολογικές καταστάσεις (Turner και Glaze, 1977 Glaze και Turner, 1978 Turner και συν., 1980, 1981 Yip και Grafstein, 1982 Johnson και συν., 1986 Humphrey, 1988 Thanos και συν., 1989 Cohen και συν., 1994 Hallböök και συν., 1996). Παραδείγµατος χάριν, η ανάδροµη µεταφορά του NT-4/5 από τον οπτικό φλοιό αναστέλλει την ατροφία των νευρώνων του dlgn που παρατηρείται µετά από αποστέρηση της όρασης από τον ένα οφθαλµό (Riddle και συν., 1995). Επίσης, η χορήγηση των παραγόντων bfgf και CNTF προάγει την επιβίωση των προβλητικών νευρώνων του dlgn µετά από διατοµή των νευραξόνων τους (Agarwala και Kalil, 1998a). Επιπλέον, ο BDNF που χορηγείται εξωγενώς και µεταφέρεται ορθόδροµα, διαµέσου του οπτικού νεύρου, αναστέλλει τον µηχανισµό της απόπτωσης των νευρώνων του dlgn, µετά από βλάβη του οµοπλάγιου οπτικού φλοιού, καταστέλλοντας την έκφραση της κασπάσης-3 (Caleo και συν., 2003 Madeddu και συν., 2004a, b). Επιπλέον, ο BDNF προάγει την επιβίωση των νευρώνων και σε άλλα πειραµατικά πρότυπα τραυµατικών βλαβών του εγκεφάλου, όπως είναι η ισχαιµία/υποξία και η διατοµή του οπτικού νεύρου (Han και Holtzman, 2000 Klocker και συν., 2000). 45

56 Εισαγωγή Τέλος, πέρα από τους νευροτροφικούς παράγοντες, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης οι νευρώνες δέχονται τροφική υποστήριξη και από ορισµένους χηµικούς διαβιβαστές (Nguyen και συν., 2001), µεταξύ των οποίων το GABA και το γλουταµινικό οξύ. Η τροφική επίδραση των χηµικών αυτών διαβιβαστών οφείλεται στη λειτουργική ενεργοποίηση των υποδοχέων τους πολύ νωρίτερα από τον σχηµατισµό των συνάψεων (Lugan και συν., 2005). Το GABA, µέσω παρακρινών οδών, ρυθµίζει τις διεργασίες του πολλαπλασιασµού των πρόδροµων νευρικών κυττάρων, της µετανάστευσης των µεταµιτωτικών νευρώνων και της ωρίµασης των δενδριτών τους (Antonopoulos και συν., 1997 Represa και Ben-Ari, 2005), ενώ η δράση του γλουταµινικού οξέος συµβάλλει στην επιβίωση των νευρώνων που έχουν σχηµατίσει τις κατάλληλες συνδέσεις (Balazs, 2006). 4. Η ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΤΩΝ ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΣΤΟ ΚΝΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΤΡΑΥΜΑΤΙΚΗ ΒΛΑΒΗ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ Ως τραυµατική βλάβη του εγκεφάλου (Traumatic Brain Injury, TBI) περιγράφεται η ανοικτή ή κλειστή κρανιοεγκεφαλική κάκωση που προκαλείται από εξωτερικούς φυσικούς παράγοντες και έχει ως συνέπεια την απώλεια νευρικών κυττάρων του εγκεφάλου. Ο κυτταρικός θάνατος µετά από TBI εκδηλώνεται µε τη µορφή της απόπτωσης ή της νέκρωσης µέσω πολύπλοκων µηχανισµών δύο ταχυτήτων (Sullivan και συν., 2002). Κατά την αρχική µετατραυµατική περίοδο παρατηρούνται πρωτογενή αποπτωτικά και νεκρωτικά κύτταρα στην περιοχή της άµεσης προσβολής, ενώ σε µεταγενέστερα χρονικά στάδια ο κυτταρικός θάνατος αναφέρεται ως δευτερογενής και εκδηλώνεται σε περιοχές περισσότερο αποµακρυσµένες, που συνδέονται µε την περιοχή της βλάβης (Raghupathi, 2004). Υποστηρίζεται ότι η µορφή του κυτταρικού θανάτου 46

57 Εισαγωγή σε κάθε περιοχή εξαρτάται από το ενεργειακό περιεχόµενο του κυττάρου που πεθαίνει, γεγονός που σε µεγάλο βαθµό καθορίζεται από το είδος και την ένταση της προσβολής (Tsujimoto, 1997). Συχνά, ο δευτερογενής θάνατος είναι αποπτωτικός και συµβαίνει µέσω της ανάδροµης εκφύλισης νευρώνων, λόγω της αποστέρησης νευροτροφικών παραγόντων από τις περιοχές µε τις οποίες συνδέονται (Conti και συν., 1998 Northington και συν., 2001 a, b). Ο θάλαµος αποτελεί περιοχή του εγκεφάλου µε υψηλά ποσοστά δευτερογενούς απώλειας νευρικών κυττάρων µετά από TBI, λόγω των ισχυρών και αµοιβαίων συνδέσεών του µε τον φλοιό των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων (Adams και συν., 2000). Έρευνες που έγιναν σε αναπτυσσόµενους επίµυς απέδειξαν ότι ο κυτταρικός αυτός θάνατος είναι αποπτωτικού τύπου (Bittigau και συν., 1999 Pohl και συν., 1999). Οι έρευνες αυτές απέδειξαν, επίσης, πόσο µεγάλη σηµασία έχει το χρονικό διάστηµα που παρεµβάλλεται από την αρχική προσβολή µέχρι την εµφάνιση των αποπτωτικών κυττάρων για την πρόληψη ή τον περιορισµό της απώλειας των νευρικών κυττάρων (Bayly και συν., 2006). Για τη µελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν την επιβίωση ή τον κυτταρικό θάνατο των νευρώνων µετά από TBI, αναπτύχθηκαν διάφορα πειραµατικά πρότυπα. Εντούτοις, ελάχιστα είναι τα πρότυπα εκείνα στα οποία µπορούν να µελετηθούν οι επιπτώσεις της καταστροφής αµοιβαίων συνδέσεων σε νευρώνες του ΚΝΣ (Al-Abdulla και συν., 1998 Martin και συν., 1998). Η αφαίρεση του οπτικού φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων αποδείχθηκε πολύ χρήσιµο πειραµατικό πρότυπο διότι οδηγεί στην εκτεταµένη απώλεια των νευρώνων του dlgn, λόγω της καταστροφής των ισχυρών αµοιβαίων συνδέσεων µεταξύ των δύο αυτών περιοχών. Στο πειραµατικό αυτό πρότυπο, η µελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν την επιβίωση των νευρώνων του dlgn εστιάζεται στην άρση της τροφικής υποστήριξης των 47

58 Εισαγωγή κυττάρων αυτών από τους νευροτροφικούς παράγοντες που προέρχονται από τον οπτικό φλοιό, όπως είναι ο NGF και ο NT-4/5 (Wahle και συν., 2003 Patz και Wahle, 2006). Όπως αναφέρθηκε προηγουµένως, ο dlgn δέχεται προσαγωγές ίνες από τον ΑµΧ. Μια ενδιαφέρουσα βλάβη στην οποία µπορούν να µελετηθούν µεµονωµένα οι επιπτώσεις της καταστροφής των προσαγωγών συνδέσεων στην επιβίωση ή τον κυτταρικό θάνατο των νευρώνων του dlgn είναι η διατοµή των νευραξόνων του οπτικού νεύρου. Η συγκεκριµένη βλάβη προκαλεί στους νευρώνες του dlgn την καταστροφή σηµαντικού ποσοστού προσαγωγών συνδέσεων και την επακόλουθη άρση της ορθόδροµα µεταφερόµενης νευροτροφικής υποστήριξης που προέρχεται από τα γαγγλιακά κύτταρα του ΑµΧ. Ωστόσο, η ίδια βλάβη προκαλεί στα γαγγλιακά κύτταρα του ΑµΧ πλήρη καταστροφή των συνδέσεών τους µε το σύνολο των περιοχών στις οποίες αυτά προβάλλουν, δηλαδή πληθώρας πυρήνων που ανήκουν στο οπτικό σύστηµα. Μεταξύ αυτών περιλαµβάνονται ο LGN, το πρόσθιο διδύµιο, ο παραδιδυµικός πυρήνας, οι προτετραδυµικοί πυρήνες και ο υποθάλαµος. Για το λόγο αυτό, η διατοµή του οπτικού νεύρου χρησιµοποιήθηκε ως πειραµατικό πρότυπο από πολλούς ερευνητές για τη µελέτη των µοριακών µηχανισµών και της µορφολογίας του κυτταρικού θανάτου που παρατηρείται στα γαγγλιακά κύτταρα του ΑµΧ, µετά από αποστέρηση των ανάδροµα µεταφερόµενων νευροτροφικών παραγόντων που προέρχονται από τις ανωτέρω περιοχές-στόχους (Cohen και συν., 1994). Σε αναπτυσσόµενους επίµυς, η διατοµή του οπτικού νεύρου προκαλεί ταχεία απώλεια των γαγγλιακών κυττάρων του ΑµΧ (Miller και Oberdorfer, 1981 Carpenter και συν., 1986), ενώ σε ενήλικα πειραµατόζωα η διεργασία παρουσιάζει πιο αργή εξέλιξη (Grafstein και Ingoglia, 1982 Allcutt και συν., 1984 Misantone και συν., 1984 Barron και συν., 1986 Villegas-Pirez και συν., 1993). Όπως συµβαίνει και κατά 48

59 Εισαγωγή τη διάρκεια της ανάπτυξης, ο κυτταρικός θάνατος των γαγγλιακών κυττάρων του ΑµΧ µετά από διατοµή του οπτικού νεύρου είναι αποπτωτικού τύπου (Berkelaar και συν., 1994 Rabacchi και συν., 1994 Isenmann και συν., 1997 Cellerino και συν., 2000). 49

60

61 Υλικά και Μέθοδοι ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Η απόπτωση στον dlgn µελετήθηκε ποιοτικά και ποσοτικά τόσο κατά την ανάπτυξη όσο και µετά από καταστροφή προσαγωγών και απαγωγών συστηµάτων ινών. Για την ταυτοποίηση και καταµέτρηση του αριθµού των αποπτωτικών κυττάρων του dlgn χρησιµοποιήθηκε ένα τροποποιηµένο πρωτόκολλο της µεθόδου TUNEL, ενώ για την πιστοποίηση των µορφολογικών χαρακτηριστικών της απόπτωσης έγινε µελέτη υλικού µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Επιπλέον, χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της ανοσοϊστοχηµείας για να διερευνηθεί εάν η απόπτωση πραγµατοποιείται µέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης-3, η οποία θεωρείται ένας αξιόπιστος αποπτωτικός δείκτης. Τέλος, για τον προσδιορισµό του φαινοτύπου των αποπτωτικών κυττάρων στον dlgn έγινε διπλή σήµανση τοµών µε τη µέθοδο TUNEL µε φθορισµό και µε την τεχνική του ανοσοφθορισµού. 1. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟ ΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ 1.1 ΜΕΘΟ ΟΣ TUNEL Η µέθοδος TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase - mediated dutp-biotin Nick End Labeling) προτάθηκε από τους Gavrieli και τους συνεργάτες του (1992) για την in situ σήµανση των διαµεσονουκλεοσωµατικών θραυσµάτων του DNA των αποπτωτικών κυττάρων. Συγκαταλέγεται ανάµεσα στις ευρέως διαδεδοµένες τεχνικές για την ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων σε ιστολογικές τοµές και σε συνδυασµό µε την προσεκτική και ενδελεχή ανάλυση των µορφολογικών χαρακτηριστικών των κυττάρων που πεθαίνουν, στο 51

62 Υλικά και Μέθοδοι επίπεδο του οπτικού και του ηλεκτρονικού µικροσκοπίου, θεωρείται ιδιαιτέρως αξιόπιστη και ευαίσθητη (Stadelmann και Lassmann, 2000). Με τη µέθοδο αυτή επιτυγχάνεται η σήµανση των 3 -OH ελεύθερων άκρων του κατακερµατισµένου DNA στον πυρήνα των αποπτωτικών κυττάρων µε την ενσωµάτωση του συνδεδεµένου µε βιοτίνη νουκλεοτιδίου δεοξυουριδίνη (b-dutp) στις ελεύθερες 3 -ΟΗ θέσεις κατάτµησης του DNA. Αυτό επιτυγχάνεται µε τη δράση του ενζύµου τελική δεοξυνουκλεοτιδιλική τρανσφεράση (TdT). Η προσπέλαση µορίων στις θέσεις κατάτµησης για ενζυµικές αντιδράσεις είναι µειωµένη λόγω της παρουσίας των πυρηνικών πρωτεϊνών ιστονών. Η πρωτεόλυση των ιστονών, µε τις οποίες συνδέεται το DNA, µε διάλυµα πρωτεϊνάσης Κ επιτρέπει την αποκάλυψη των ειδικών θέσεων σύνδεσης του DNA µε το σεσηµασµένο δεοξυνουκλεοτίδιο. Η ανίχνευση του b-dutp γίνεται είτε µε τη µέθοδο της αβιδίνης-βιοτίνης είτε µε τη µέθοδο του φθορισµού. Σχήµα 1: Σχηµατική απεικόνιση της µεθόδου TUNEL 52

63 Υλικά και Μέθοδοι 1.2 ΜΕΘΟ ΟΣ ΑΒΙ ΙΝΗΣ ΒΙΟΤΙΝΗΣ Η µέθοδος στηρίζεται στην ισχυρή και µη αντιστρεπτή συγγένεια της γλυκοπρωτεΐνης αβιδίνη µε τη βιταµίνη βιοτίνη (βιταµίνη Η ή Β 8 ). Η αβιδίνη βρίσκεται στο λεύκωµα του αβγού και διαθέτει 4 θέσεις δέσµευσης για τη χαµηλού µοριακού βάρους βιοτίνη, η οποία ενώνεται µε µεγάλο αριθµό µορίων υπεροξειδάσης σε ένα τρισδιάστατο σύµπλοκο. Είναι το σύµπλεγµα Αβιδίνης-Βιοτίνης-Υπεροξειδάσης (ABC), στο οποίο τουλάχιστον µια θέση δέσµευσης βιοτίνης παραµένει κενή, ώστε να µπορεί να καλυφθεί από τη βιοτίνη του b-dutp. Το προϊόν της αντίδρασης αυτής ανιχνεύεται όταν η υπεροξειδάση του ABC καταλύει την οξείδωση της αµίνης 3,3 διαµινοβενζιδίνης (DAB), η οποία είναι χρωµογόνος ένωση, από το υπεροξείδιο του υδρογόνου, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία ενός έγχρωµου, µόνιµου και οπτικά πυκνού (καστανού χρώµατος) συµπλόκου. b-dutp Σχήµα 2: Σχηµατική απεικόνιση του συµπλέγµατος Αβιδίνης-Βιοτίνης Υπεροξειδάσης και της οξείδωσης της 3,3 διαµινοβενζιδίνης. Α=Αβιδίνη, b=βιοτίνη, P=Υπεροξειδάση, DAB=3,3 διαµινοβενζιδίνη 53

64 Υλικά και Μέθοδοι Στην οξειδοαναγωγική αυτή αντίδραση, η DAB δρα ως δότης ηλεκτρονίων στο υπεροξείδιο του υδρογόνου. Η οξειδωµένη DAB υποδηλώνει έµµεσα την παρουσία των 3 -OH ελεύθερων άκρων του κατατεµαχισµένου DNA και κατ επέκταση χρωµατίζει τον πυρήνα των αποπτωτικών κυττάρων. Η παρατήρηση γίνεται µε το οπτικό µικροσκόπιο. 1.3 ΜΕΘΟ ΟΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ Ως φθορισµός ορίζεται η εκποµπή ενός ή περισσότερων φωτονίων από ένα µόριο ή άτοµο ενεργοποιηµένο από την απορρόφηση ενός quantum ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας. Η µέθοδος χρησιµοποιεί τα φθορισµοχρώµατα, µια ειδική τάξη µορίων, τα οποία έχουν την ιδιότητα να φθορίζουν όταν διεγερθούν µε ακτινοβολία κατάλληλου µήκους κύµατος (ακτίνες γ, ακτίνες Χ, υπεριώδες, ορατό και υπέρυθρο φως). Χρησιµεύουν ως φθορίζοντες δείκτες συζευγµένοι µε πρωτεΐνες για τη σήµανση ουσιών. Απορροφώντας ηλεκτροµαγνητική ακτινοβολία, τα µόρια διεγείρονται και η επιστροφή στην αρχική τους κατάσταση συνοδεύεται από εκποµπή ακτινοβολίας µεγαλύτερου µήκους κύµατος. Στην εφαρµογή της τεχνικής, η γνώση των φασµατοµετρικών χαρακτηριστικών των φθορισµοχρωµάτων που χρησιµοποιούνται είναι απαραίτητη. Στις θέσεις κατάτµησης του DNA το τροποποιηµένο νουκλεοτίδιο b-dutp ανιχνεύεται µε στρεπταβιδίνη, που χρησιµοποιείται όπως και η αβιδίνη, για την ανίχνευση δεικτών που περιέχουν βιοτίνη. Είναι πρωτεΐνη συγγενής προς την αβιδίνη, µε 4 επίσης θέσεις δέσµευσης για τη βιοτίνη και είναι συνδεδεµένη µε τη φθορίζουσα ουσία Texas Red. Το Texas Red είναι χλωριούχο παράγωγο υποθειώδους ρίζας της σουλφοροδαµίνης 101 και έχει µέγιστο διέγερσης στα 595 nm και 54

65 Υλικά και Μέθοδοι µέγιστο εκποµπής στα 620 nm, µε αποτέλεσµα την εκποµπή ακτινοβολίας κόκκινου χρώµατος στις θέσεις όπου συνδέεται, δηλαδή στους πυρήνες των αποπτωτικών κυττάρων. Η παρατήρηση των τοµών γίνεται µε το µικροσκόπιο φθορισµού. 1.4 ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΙ Είναι τεχνικές in situ σήµανσης και ανίχνευσης αντιγόνων σε ιστούς µε τη χρήση κατάλληλα σεσηµασµένων αντισωµάτων και της ειδικής ανοσολογικής αντίδρασης που βασίζεται στην υψηλή συγγένεια αντιγόνου - αντισώµατος. Το προϊόν της αντίδρασης είναι ανιχνεύσιµο µε το οπτικό µικροσκόπιο. Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της έµµεσης ανοσοϊστοχηµείας µε τη χρήση του συµπλέγµατος αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης για την ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3. Χρησιµοποιήθηκε επίσης η µέθοδος του ανοσοφθορισµού σε συνδυασµό µε τη µέθοδο TUNEL µε φθορισµό για τον προσδιορισµό του φαινοτύπου των αποπτωτικών κυττάρων, η οποία ονοµάστηκε µέθοδος διπλής σήµανσης. Η µονιµοποίηση, η αφυδάτωση και η έγκλειση σε παραφίνη αποτελούν βασικά στάδια προετοιµασίας του ιστού για µικροσκοπική ανάλυση. Ωστόσο, η προετοιµασία αυτή σε πολλές περιπτώσεις προκαλεί µορφολογικές αλλοιώσεις των πρωτεϊνών του ιστού, µε την εκ νέου ανάπτυξη χηµικών δεσµών που ενδεχοµένως να επικαλύπτουν τους αντιγονικούς επιτόπους. Η δοµική αυτή αναµόρφωση των πρωτεϊνών µπορεί να επιφέρει µείωση της αντιγονικότητας του ιστού, γεγονός που αποτελεί µειονέκτηµα στην εφαρµογή των ανοσοϊστοχηµικών µεθόδων (MacIntyre, 2001). Για τον λόγο αυτό, τα τελευταία χρόνια χρησιµοποιείται ευρέως η τεχνική της αποκάλυψης των αντιγονικών επιτόπων (AR) στους ιστούς είτε µε ενζυµικές ή χηµικές µεθόδους είτε 55

66 Υλικά και Μέθοδοι µε µεθόδους που βασίζονται στη θέρµανση. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην υδρόλυση των χηµικών δεσµών που αναπτύσσονται κατά τη µονιµοποίηση και την επαναφορά των πρωτεϊνών του ιστού στην αρχική τους τρισδιάστατη δοµή (Shi και συν., 2001). Στην παρούσα εργασία, για την ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3, χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος AR που βασίζεται στη θέρµανση σε συσκευή µικροκυµάτων. 1.4Α ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ 3 Η τεχνική που χρησιµοποιήθηκε περιλαµβάνει τα εξής στάδια: 1) έσµευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 του ιστού από το πρώτο αντίσωµα (πολυκλωνικό αντίσωµα), το οποίο παράχθηκε κατόπιν ανοσοποίησης ζώου (κουνελιού) εναντίον του προς εξέταση αντιγόνου. 2) Το σύµπλοκο αντιγόνου-πρώτου αντισώµατος δεσµεύεται από το δεύτερο αντίσωµα, το οποίο είναι ειδικό εναντίον των ανοσοσφαιρινών IgG του ζώου που παρήγαγε το πρώτο αντίσωµα και είναι συνδεδεµένο µε βιοτίνη. 3) Ανίχνευση του σεσηµασµένου δεύτερου αντισώµατος µε τη µέθοδο ABC. 1.4Β ΜΕΘΟ ΟΣ ΙΠΛΗΣ ΣΗΜΑΝΣΗΣ Για την ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων και την ταυτοποίηση του φαινοτύπου τους εφαρµόστηκε η µέθοδος ΤUNEL µε φθορισµό, σε συνδυασµό µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού. Για τη σήµανση των TUNEL+ κυττάρων χρησιµοποιήθηκε η στρεπταβιδίνη συνδεδεµένη µε τον φθορίζοντα δείκτη Τexas Red, µε αποτέλεσµα οι πυκνωτικοί πυρήνες των κυττάρων αυτών να διακρίνονται από το έντονο 56

67 Υλικά και Μέθοδοι κόκκινο χρώµα τους στο µικροσκόπιο φθορισµού. Επίσης, χρησιµοποιήθηκαν α) µονοκλωνικά αντισώµατα εναντίον µιας πυρηνικής πρωτεΐνης ειδικής για τη σήµανση νευρώνων (NeuN, Mouse anti Neuronal Nuclei) και β) πολυκλωνικά αντισώµατα εναντίον της όξινης πρωτεΐνης των ινιδίων των αστροκυττάρων (GFAP, Rabbit anti-glial Fibrillary Acidic Protein), που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασµα των αστροκυττάρων. Κατόπιν, χρησιµοποιήθηκαν µονοκλωνικά και πολυκλωνικά δεύτερα αντισώµατα, αντίστοιχα, τα οποία ήταν συνδεδεµένα µε το φθορίζοντα δείκτη ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), ο οποίος εκπέµπει ακτινοβολία πράσινου χρώµατος, µε µέγιστο διέγερσης στα 490 nm και µέγιστο εκποµπής στα 525nm. Βασική προϋπόθεση για την επιτυχία της µεθόδου αποτελεί η µη αλληλοεπικάλυψη του φάσµατος εκποµπής του ενός δείκτη από το φάσµα διέγερσης του άλλου. Η παρατήρηση των αντιγονικών θέσεων έγινε µε µικροσκόπιο φθορισµού και µε συνεστιακό µικροσκόπιο. 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Κατά τη διενέργεια των πειραµάτων ελήφθησε µέριµνα ώστε να χρησιµοποιηθεί ο απολύτως απαραίτητος αριθµός πειραµατοζώων και εφαρµόστηκαν όλα τα αναγκαία µέτρα ώστε να διασφαλιστεί η ευζωία των πειραµατοζώων σε όλα τα στάδια των πειραµατισµών, σύµφωνα µε την οδηγία της Ε.Ε για τη προστασία των πειραµατοζώων (24 th November 1986; 86/609/EEC) και την τροποποίηση αυτής (22th July 2003; 2003/65/ΕC). Τα πειραµατόζωα διαβίωναν σε ειδικά διαµορφωµένους κλωβούς, οι οποίοι εξασφάλιζαν την κατά βούληση λήψη τροφής και νερού, µέσα σε περιβάλλον κλιµατιζόµενο, στο οποίο τηρούνταν οι κατάλληλες συνθήκες καθαριότητας και υγιεινής σε ηµερήσιο κύκλο 12 ωρών φωτός, εναλλασσόµενου µε 12 ώρες σκότους. 57

68 Υλικά και Μέθοδοι Στην εργασία αυτή χρησιµοποιήθηκαν συνολικά 144 επίµυες της φυλής Wistar, οι οποίοι χωρίστηκαν σε τρεις οµάδες: Η Α οµάδα περιελάµβανε 42 πειραµατόζωα στα οποία µελετήθηκε η απόπτωση στον dlgn κατά την ανάπτυξη. Στα 51 πειραµατόζωα της Β οµάδας, έγινε χειρουργική αφαίρεση του δεξιού οφθαλµού και µελετήθηκε ο αποπτωτικός θάνατος στον ετεροπλάγιο dlgn, ενώ στους 51 επίµυς της Γ οµάδας έγινε χειρουργική αφαίρεση του οπτικού φλοιού του δεξιού εγκεφαλικού ηµισφαιρίου µε αναρροφητική αντλία και µελέτη του αποπτωτικού θανάτου στον οµοπλάγιο dlgn. Οι επίµυες των Β και Γ οµάδων κατατάχθηκαν σε τρεις υποοµάδες: Στις Β1 (n=27) και Γ1 (n=27) υποοµάδες οι βλάβες έγιναν σε νεογέννητους επίµυς (Μ0), στις Β2 (n=12) και Γ2 (n=12) υποοµάδες οι βλάβες έγιναν σε επίµυς 7 ηµερών και στις Β3 (n=12) και Γ3 (n=12) υποοµάδες οι βλάβες έγιναν σε επίµυς 14 ηµερών. Για τον εντοπισµό και την καταµέτρηση των αποπτωτικών κυττάρων του dlgn µε τη µέθοδο TUNEL, χρησιµοποιήθηκαν συνολικά 129 επίµυες από όλες τις οµάδες. Η µελέτη πραγµατοποιήθηκε σε 3 πειραµατόζωα για κάθε ηλικία που εξετάστηκε. Σε 36 επίµυς της Α οµάδας εξετάστηκαν 12 στάδια της ανάπτυξης και συγκεκριµένα οι ηλικίες: Ε20, Μ0, Μ1, Μ3, Μ5, Μ7, Μ8, Μ14, Μ15, Μ21, Μ28 και στο ενήλικο (Μ60). Από τους επίµυς της ηλικίας Μ1 χρησιµοποιήθηκαν τοµές για την ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 µε τη µέθοδο της ανοσοϊστοχηµείας. Σε 21 επίµυς της Β1 υποοµάδας οι ηλικίες που εξετάστηκαν ήταν η πρώτη ηµέρα µετά τη βλάβη (ΜΒ1), η ΜΒ3, η ΜΒ5, η ΜΒ7, η ΜΒ14, η ΜΒ21 και η ΜΒ60. Από τους επίµυς της ηλικίας ΜΒ1 χρησιµοποιήθηκαν τοµές για την ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3. Στους 24 συνολικά επίµυς των Β2 και Β3 υποοµάδων οι ηλικίες που εξετάστηκαν ήταν η ΜΒ1, η ΜΒ7, η ΜΒ14 και η ΜΒ60. Σε 24 επίµυς της Γ1 υποοµάδας οι ηλικίες που εξετάστηκαν ήταν οι ΜΒ1 58

69 Υλικά και Μέθοδοι (4-12 ώρες µετά τη βλάβη), ΜΒ1+ (13-24 ώρες µετά τη βλάβη), ΜΒ3 (49-60 ώρες µετά τη βλάβη), ΜΒ3+ (61-72 ώρες µετά τη βλάβη), ΜΒ7, ΜΒ14, ΜΒ21 και ΜΒ60. Από τους επίµυς της ηλικίας ΜΒ1+ χρησιµοποιήθηκαν τοµές για την ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3. Τέλος, στους 24 συνολικά επίµυς των Γ2 και Γ3 υποοµάδων οι ηλικίες που εξετάστηκαν ήταν οι ΜΒ1, ΜΒ7, ΜΒ14 και ΜΒ60. Για τη µελέτη της απόπτωσης µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο χρησιµοποιήθηκαν συνολικά 9 πειραµατόζωα της Α οµάδας και των Β1 και Γ1 υποοµάδων, ηλικιών Μ1, ΜΒ1 και ΜΒ3, αντίστοιχα (n=3 ζώα/ηλικία). Για τη µελέτη του φαινοτύπου των αποπτωτικών κυττάρων µε τη µέθοδο της διπλής σήµανσης χρησιµοποιήθηκαν συνολικά 6 επίµυες της Α οµάδας και της Β1 υποοµάδας, ηλικιών Μ1 και ΜΒ1, αντίστοιχα (n=3 ζώα/ηλικία). 2.1 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΙ Όλες οι επεµβάσεις έγιναν κάτω από γενική αναισθησία. Για τα πειραµατόζωα στα οποία πραγµατοποιήθηκαν βλάβες τη Μ0 και τη Μ7 χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της υποθερµίας µε την τοποθέτησή τους σε πάγο, ενώ για εκείνα µε βλάβες τη Μ14 η αναισθησία έγινε µε χορήγηση αιθυλικού αιθέρα. Οι επίµυες ηλικίας Μ0 και Μ7 που επρόκειτο να υποστούν αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τοποθετούνταν σε πλάγια θέση και µε τη βοήθεια νυστεριού διανοίγονταν τα κλειστά βλέφαρα του δεξιού οφθαλµού µέχρι να αποκαλυφθεί ο βολβός. Στους επίµυες ηλικίας Μ14 η µεσοβλεφάρια σχισµή είχε σχηµατιστεί και τα βλέφαρα διανοίγονταν µε τη βοήθεια ανατοµικής λαβίδας. Κατόπιν, ο βολβός του οφθαλµού αφαιρούνταν µε τη βοήθεια κοχλιαρίου και τα βλέφαρα συγκολλούνταν. 59

70 Υλικά και Μέθοδοι Τα πειραµατόζωα επιστρέφονταν στον κλωβό τους µετά την πλήρη ανάνηψή τους. Τα πειραµατόζωα που προορίζονταν για αφαίρεση του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων τοποθετούνταν σε πρηνή θέση και µετά τη διατοµή του δέρµατος του κρανίου κατά µήκος της µέσης γραµµής και την αποµάκρυνση µικρού τµήµατος του κρανίου γινόταν αναρρόφηση, µε τη βοήθεια ειδικής αναρροφητικής αντλίας, τµήµατος του φλοιού του δεξιού εγκεφαλικού ηµισφαιρίου και ιδιαίτερα του οπτικού φλοιού. Μετά τη συρραφή του δέρµατος, οι επίµυες παρακολουθούνταν µέχρι την πλήρη ανάνηψή τους και, κατόπιν, επιστρέφονταν στον κλωβό τους. Οι επίµυες που θυσιάζονταν µέχρι τη Μ21 επιστρέφονταν στους κλωβούς, όπου διατρέφονταν από τις µητέρες τους. Οι επίµυες που θυσιάζονταν µετά την ηλικία αυτή διαχωρίζονταν µε βάση το φύλο και η διατροφή τους γινόταν κατά βούληση. 2.2 ΣΥΛΛΟΓΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Η ευθανασία των πειραµατοζώων και η µονιµοποίηση των εγκεφάλων που προορίζονταν για τη µελέτη της απόπτωσης στον dlgn µε τη µέθοδο TUNEL, την ανοσοϊστοχηµική µέθοδο για την ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 και τη µελέτη του φαινοτύπου των αποπτωτικών κυττάρων µε τη µέθοδο της διπλής σήµανσης γινόταν µετά από γενική αναισθησία µε εισπνοή αιθυλικού αιθέρα. Με τη βοήθεια ειδικής αντλίας, πραγµατοποιούνταν έγχυση διαµέσου της καρδιάς αρχικά φυσιολογικού ορού χλωριούχου νατρίου 0,9% για την έκπλυση των αγγείων, ακολουθούµενου από µονιµοποιητικό διάλυµα 4% παραφορµαλδεΰδης σε 0,1Μ ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικού νατρίου (PB) µε ph 7,4. Στους ενήλικους επίµυς, η έγχυση του µονιµοποιητικού διαλύµατος γινόταν διαµέσου της πρόσθιας αορτής µετά 60

71 Υλικά και Μέθοδοι από αποκλεισµό της οπίσθιας αορτής µε αιµοστατική λαβίδα. Η διαδικασία µονιµοποίησης των εγκεφάλων που προορίζονταν για εξέταση µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο, όπως και η περαιτέρω διαδικασία που ακολουθήθηκε, περιγράφεται παρακάτω. Ο όγκος του µονιµοποιητικού διαλύµατος, που χρησιµοποιούνταν ήταν συνάρτηση της ηλικίας θανάτωσης των πειραµατοζώων (Πίνακας 1). Μετά την ευθανασία των πειραµατοζώων, οι εγκέφαλοι αφαιρούνταν από το κρανίο και τοποθετούνταν σε µονιµοποιητικό διάλυµα 4% παραφορµαλεΰδης για 2 ώρες στους 4 ο C. Στη συνέχεια, γινόταν έκπλυση των εγκεφάλων µε PB. Πίνακας 1. Όγκος µονιµοποιητικού διαλύµατος ανά ηλικία θυσίας των πειραµατοζώων Ηλικία Όγκος (ml) Μ1 - Μ3 200 Μ5 - Μ8 250 Μ14 - Μ Μ Μ Οι εγκέφαλοι που προορίζονταν να εξεταστούν µε τη µέθοδο TUNEL και την ανοσοϊστοχηµική µέθοδο για την ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 αφυδατώνονταν µε µεταφορά τους σε σειρά διαλυµάτων αιθυλικής αλκοόλης αυξανόµενης πυκνότητας, από 50% έως 100% κ.ο. Στη συνέχεια, µεταφέρονταν σε χλωροφόρµιο και κατόπιν σε µίγµα χλωροφορµίου και υγρής παραφίνης σε αναλογία 1:1 και σε θερµοκρασία 58 ο C. Ακολούθως, οι εγκέφαλοι παρέµεναν σε ρευστοποιηµένη παραφίνη στην ίδια θερµοκρασία και τέλος εγκλείονταν σε παραφίνη. Ο χρόνος παραµονής των εγκεφάλων στα παραπάνω 61

72 Υλικά και Μέθοδοι διαλύµατα ήταν ανάλογος του µεγέθους τους, το οποίο ήταν συνάρτηση της ηλικίας που θυσιάζονταν τα πειραµατόζωα (Πίνακας 2). Ακολουθούσε η λήψη διαδοχικών εγκάρσιων τοµών των εγκεφάλων πάχους 10 µm µε µικροτόµο παραφίνης. Για κάθε τοµή ανά 200µm εφαρµόστηκε η ιστοχηµική µέθοδος Nissl για τον καθορισµό των ορίων του dlgn. Μέσα στα όρια του πυρήνα και σε όλη τη έκτασή του συλλέγονταν, για κάθε µέθοδο, 4 ισοµερώς κατανεµηµένες τοµές από κάθε εγκέφαλο, οι οποίες τοποθετούνταν σε αντικειµενοφόρους πλάκες επικαλυµµένες µε ζελατίνη. Πίνακας 2. Χρόνος παραµονής των εγκεφάλων στα διαλύµατα ανά ηλικία θυσίας των πειραµατοζώων Ηλικία ιαλύματα ιαλύματα αιθυλικής αλκοόλης Χλωροφόρμιο Χλωροφόρμιο Παραφίνη 50% 70% 95% 100% 100% 1 2 : παραφίνη Μ1 - Μ5 15ω 1ω 1ω 45λ 45λ 15λ 15λ 15λ 3ω Μ7-Μ8 15ω 1ω 1ω 45λ 1ω 22λ 23λ 15λ 3,5ω Μ14-Μ15 15ω 1ω 1ω 50λ 1ω 30λ 30λ 20λ 4ω Μ21 1ω 15ω 45λ 1ω 90λ 30λ 40λ 20λ 4ω Μ28 1ω 15ω 1ω 75λ 105λ 30λ 30λ 20λ 4ω Μ60 1ω 15ω 1ω 90λ 105λ 30λ 30λ 20λ 4ω ω=ώρα (ες), λ=λεπτά Οι εγκέφαλοι που προορίζονταν να εξεταστούν µε τη µέθοδο της διπλής σήµανσης, µετά τη µονιµοποίηση, τοποθετούνταν σε διάλυµα σουκρόζης 5% κ.β. σε PB, για 1 ώρα και σε 30% κ.β., για 24 ώρες. Η αφυδάτωση που προκαλεί η εµβάπτιση ιστών σε διάλυµα σουκρόζης επιτυγχάνεται µε την προοδευτική αντικατάσταση του Η 2 Ο που περιέχουν οι ιστοί από την παραπάνω ουσία, η οποία έχει και κρυοπροστατευτική δράση. Στη συνέχεια, οι εγκέφαλοι καταψύχονταν σε 62

73 Υλικά και Μέθοδοι ισοπεντάνιο θερµοκρασίας 80 ο C, κατόπιν σε υγρό άζωτο θερµοκρασίας 240 ο C και διατηρούνταν στους 70 ο C. Ακολούθως, γινόταν λήψη συνεχών εγκαρσίων τοµών πάχους 20µm σε κρυοστάτη, στο ύψος του dlgn. Οι τοµές τοποθετούνταν πάνω σε αντικειµενοφόρους πλάκες επικαλυµµένες µε ζελατίνη και διατηρούνταν στους 20 ο C µέσα σε κρυοπροστατευτικό διάλυµα 30% κ.β. σουκρόζης και 30% κ.ο. αιθυλενογλυκόλης σε 0,1 Μ ρυθµιστικού διαλύµατος φωσφορικού νατρίου που περιείχε 0,9% κ.β. χλωριούχου νατρίου (PBS). Η µονιµοποίηση των εγκεφάλων που προορίζονταν για εξέταση µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο περιελάµβανε τη χορήγηση, µε τη διαδικασία που περιγράφηκε προηγουµένως (βλ. σελ. 60), µονιµοποιητικού διαλύµατος περιεκτικότητας 4% κ.β. παραφολµαλδεΰδης και 0,2% κ.ο. γλουταραλδεΰδης, ph 7,4 σε PB. Οι εγκέφαλοι παρέµεναν in situ για 1 ώρα στους 4 ο C, για να τοποθετηθούν στη συνέχεια σε µονιµοποιητικό διάλυµα 4% κ.β. παραφορµαλδεΰδης, ph 7,4 σε PB για 24 ώρες. Μετά από καλή έκπλυση των εγκεφάλων µε PB, γινόταν λήψη εγκάρσιων τοµών πάχους 50µm µε µικροτόµο δονήσεως στο ύψος του dlgn, οι οποίες συλλέγονταν σε PB 0,1M. 2.3 ΜΕΘΟ ΟΣ TUNEL Μετά τη συλλογή των τοµών σε αντικειµενοφόρους πλάκες ζελατίνης γινόταν η αποπαραφίνωσή τους µε εµβάπτιση σε ξυλένιο για 2x15 λεπτά και ενυδάτωσή τους µε µεταφορά σε διαδοχική σειρά διαλυµάτων αιθυλικής αλκοόλης µε µειούµενη πυκνότητα (100%, 95%, 70% και 50% κ.ο. για 5 λεπτά σε κάθε διάλυµα) και κατόπιν σε αποσταγµένο νερό για 5 λεπτά. Ακολουθούσε η εµβάπτιση των τοµών σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιείχε 76mM Tris/HCl και 26mM CaCl 2, µε ph 7,6 για 5 λεπτά (ρυθµιστικό διάλυµα pk) µε στόχο την προεργασία 63

74 Υλικά και Μέθοδοι των ιστών για επώαση σε διάλυµα πρωτεϊνάσης Κ (Sigma), η οποία ενσταλαζόταν στη συνέχεια σε συγκέντρωση 2µg/ml ρυθµιστικού διαλύµατος pk, για 15 λεπτά, µε σκοπό την απογύµνωση του πυρηνικού DNA από τις ιστόνες. Μετά την έκπλυσή τους για 2x15 λεπτά µε αποσταγµένο νερό, οι τοµές επωάζονταν σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιείχε 0,2Μ κακοδυλικού νατρίου, 0,025Μ Tris/HCl και 0,25 mg/ml αλβουµίνης ορού βοός µε ph 6,6 (ρυθµιστικό διάλυµα TdT) για 15 λεπτά. Ακολουθούσε η επεξεργασία των τοµών µε διάλυµα που περιείχε 1,25mM χλωριούχο κοβάλτιο, 18µΜ b-16-dutp και 150U/ml TdT (διάλυµα TUNEL, Roche) για 1 ½ ώρα σε θερµοκρασία 37 ο C. Η αντίδραση τερµατιζόταν µε την εµβάπτιση των τοµών σε αποσταγµένο νερό και κατόπιν σε διάλυµα PBS, ph 7,4 για 2x5 λεπτά. Προκειµένου να καλυφθούν οι µη ειδικές αντιγονικές θέσεις, οι τοµές επωάζονταν µε φυσιολογικό ορό αίγας (NGS) σε διάλυµα 1% σε PBS για 15 λεπτά. Έπειτα, οι τοµές επωάζονταν στο σύµπλεγµα ABC (Vector Laboratories) σε διάλυµα 1% σε PBS για 2 ώρες σε σκοτεινό περιβάλλον. Μετά την έκπλυση των τοµών µε PBS για 2x5 λεπτά και µε ρυθµιστικό διάλυµα Tris 0,1Μ, ph 7,4 (ΤΒ) για 5 λεπτά, µεταφέρονταν σε διάλυµα DAB 0,075% σε ΤΒ για 5 λεπτά και κατόπιν σε όµοιο διάλυµα DAB το οποίο περιείχε επιπλέον 0,01% Η 2 Ο 2 για 15 λεπτά. Κατόπιν, οι τοµές πλένονταν µε ΤΒ και ΡΒ για 15 λεπτά και αποσταγµένο νερό για 5 λεπτά και αντιχρωµατίζονταν µε διάλυµα 10% κυανού της τολουιδίνης για 3 δευτερόλεπτα. Τέλος, οι τοµές αφυδατώνονταν σε σειρά διαλυµάτων αιθυλικής αλκοόλης αυξανόµενης πυκνότητας (50%, 70%, 95%, 2x100%, 5 λεπτά σε κάθε διάλυµα), γινόταν διαύγαση σε ξυλένιο, έγκλειση σε DPX και παρατήρηση µε το οπτικό µικροσκόπιο. Προκειµένου να διαπιστωθεί η ακρίβεια της µεθόδου TUNEL έγινε χρήση θετικών και αρνητικών µαρτύρων. Ως θετικοί µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν τοµές οι οποίες επωάστηκαν µε το ένζυµο 64

75 Υλικά και Μέθοδοι δεοξυριβονουκλεάση ΙΙ 5% (DNAase ΙΙ), το οποίο προκαλεί τη διάσπαση του DNA σε 3 ολιγονουκλεοτίδια, ενώ στους αρνητικούς µάρτυρες παραλείφθηκε η προσθήκη του ενζύµου TdT κατά την επεξεργασία. Στους θετικούς µάρτυρες όλα τα κύτταρα ήταν σεσηµασµένα, σε αντίθεση µε τους αρνητικούς, στους οποίους δεν βρέθηκαν σεσηµασµένα κύτταρα. 2.4 ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ 3 Μετά τη συλλογή των τοµών σε αντικειµενοφόρους πλάκες ζελατίνης, γινόταν αποπαραφίνωσή τους µε εµβάπτιση σε ξυλένιο για 2x15 λεπτά και ενυδάτωση µε µεταφορά τους σε διαδοχική σειρά διαλυµάτων αιθυλικής αλκοόλης µε µειούµενη πυκνότητα (100%, 95%, 70% και 50% κ.ο για 5 λεπτά σε κάθε διάλυµα) και κατόπιν σε αποσταγµένο νερό για 5 λεπτά. Ακολουθούσε η µέθοδος της αποκάλυψης των αντιγονικών επιτόπων του ιστού µε θέρµανση των τοµών σε συσκευή µικροκυµάτων. Οι τοµές εµβαπτίζονταν αρχικά σε κιτρικό ρυθµιστικό διάλυµα 10mM, ph=6, που αποτελούνταν από 1,2% διαλύµατος κιτρικού οξέος 0,1Μ και 8,8% διαλύµατος κιτρικού νατρίου 0,1Μ. Στη συνέχεια, οι τοµές υφίσταντο επεξεργασία µε τη χρησιµοποίηση συσκευής µικροκυµάτων ως εξής: 1) Θέρµανση για 5 λεπτά σε πρόγραµµα ισχύος 500W. 2) Παραµονή σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά. 3) Αναθέρµανση στο παραπάνω πρόγραµµα µέχρι βρασµού. 4) Επανάληψη του σταδίου 2. 5) Επανάληψη του σταδίου 3. 6) Αναθέρµανση σε πρόγραµµα ισχύος 90W για 2 ½ λεπτά. 7) Παραµονή σε θερµοκρασία δωµατίου για 30 λεπτά. 65

76 Υλικά και Μέθοδοι Στη συνέχεια, οι τοµές πλένονταν σε PBS, ph 7,4 για 3x5 λεπτά και επωάζονταν σε διάλυµα NGS 10% σε PBS για 15 λεπτά, για την κάλυψη των µη ειδικών αντιγονικών θέσεων. Έπειτα, οι τοµές επωάζονταν σε διάλυµα που περιείχε το πολυκλωνικό αντίσωµα εναντίον της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 (Chemicon) σε συγκέντρωση 1:50 σε PBS που περιείχε 0,5% της απορρυπαντικής ουσίας Triton-X (TX-100). Η επώαση των τοµών γινόταν για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, κατόπιν για 20 ώρες στους 4 ο C, και τέλος για ακόµη 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθούσε η πλύση των τοµών µε PBS για 3x5 λεπτά και η επώαση στο δεύτερο αντίσωµα (Vector Laboratories), σε συγκέντρωση 1:200 σε PBS µε 0,5% ΤΧ-100 ειδικό εναντίον πολυκλωνικών αντισωµάτων και συνδεδεµένο µε βιοτίνη για 2 ώρες. Κατόπιν, οι τοµές πλένονταν σε PBS για 3x5 λεπτά και επωάζονταν στο σύµπλεγµα ABC (Vector Laboratories) σε διάλυµα 1% σε PBS για 1½ ώρα σε σκοτεινό περιβάλλον. Μετά την έκπλυση των τοµών µε PBS για 2x5 λεπτά και µε ρυθµιστικό διάλυµα Tris 0,1Μ, ph 7,4 (ΤΒ) για 5 λεπτά, γινόταν µεταφορά τους σε διάλυµα DAB 0,075% σε ΤΒ για 5 λεπτά και κατόπιν σε όµοιο διάλυµα DAB το οποίο περιείχε επιπλέον 0,01% Η 2 Ο 2 για 15 λεπτά. Κατόπιν, οι τοµές πλένονταν µε ΤΒ και ΡΒ για 15 λεπτά και αποσταγµένο νερό για 5 λεπτά. Τέλος, γινόταν αφυδάτωσή τους µέσα από σειρά διαλυµάτων αιθυλικής αλκοόλης αυξανόµενης πυκνότητας (50%, 70%, 95%, 2x100%, 5 λεπτά σε κάθε διάλυµα), διαύγαση σε ξυλένιο, έγκλειση σε DPX, και παρατήρηση µε το οπτικό µικροσκόπιο. Στις δοκιµές στις οποίες παραλείφθηκε το πολυκλωνικό αντίσωµα εναντίον της ενεργοποιηµένης κασπάσης 3 ή το δεύτερο αντίσωµα χάθηκε τελείως η ανοσοδραστικότητα των κυττάρων. 66

77 Υλικά και Μέθοδοι 2.5 ΜΕΘΟ ΟΣ ΙΠΛΗΣ ΣΗΜΑΝΣΗΣ Οι τοµές αρχικά πλένονταν σε PBS, ph 7,4 για 3x10 λεπτά και µετά επωάζονταν σε διάλυµα TdT για 15 λεπτά. Κατόπιν, γινόταν επεξεργασία τους µε τη µέθοδο TUNEL, όπως ακριβώς περιγράφηκε παραπάνω. Ακολουθούσαν οι πλύσεις των τοµών για 3x5 λεπτά σε PBS, ph 7,4 και κατόπιν επωάζονταν µέσα σε διάλυµα NGS 1% σε PBS για 15 λεπτά, για την κάλυψη των µη ειδικών αντιγονικών θέσεων. Έπειτα, το ήµισυ του συνόλου των τοµών επωάζονταν σε διάλυµα που περιείχε το µονοκλωνικό αντίσωµα εναντίον του NeuN (Chemicon) σε συγκέντρωση 1:50 σε PBS που περιείχε 0,2% TX-100. Οι υπόλοιπες τοµές επωάζονταν σε διάλυµα που περιείχε το πολυκλωνικό αντίσωµα εναντίον του GFAP (Dako Scientific) σε συγκέντρωση 1:100 σε PBS µε 0,2% TX-100. Η επώαση των τοµών γινόταν για 1½ ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, κατόπιν για 20 ώρες στους 4 ο C, και τέλος για ακόµη 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθούσε η πλύση των τοµών µε PBS για 3x5 λεπτά. Η ανοσοδραστικότητα των NeuN και GFAP ανιχνευόνταν µετά από επώαση µε δεύτερο αντίσωµα ειδικό εναντίον των ανοσοσφαιρινών IgG του ζώου που παρήγαγε το πρώτο αντίσωµα (antimouse 1:50, Vector Laboratories ή antirabbit 1:100, Vector Laboratories, αντίστοιχα) συνδεδεµένo µε τον φθορίζοντα δείκτη FITC, ενώ η σήµανση των TUNEL+ κυττάρων επιτυγχάνονταν µετά από επώαση µε στρεπταβιδίνη ενωµένη µε τον φθορίζοντα δείκτη Texas Red (1:100, Amersham). Όλα τα αντιδραστήρια τοποθετούνταν στο ίδιο διάλυµα και η επώαση διαρκούσε 3 ώρες σε σκοτεινό περιβάλλον. Μετά την επεξεργασία, οι τοµές πλένονταν για 30 λεπτά µε PBS και PB, εγκλείονταν σε Cityfluor και παρατηρούνταν σε µικροσκόπιο φθορισµού και σε συνεστιακό µικροσκόπιο. Στις δοκιµές στις οποίες παραλείφθηκε το πρώτο ή το δεύτερο αντίσωµα και το ένζυµο TdT από το διάλυµα 67

78 Υλικά και Μέθοδοι TUNEL χάθηκε τόσο η ανοσοδραστικότητα όσο και η σήµανση των αποπτωτικών κυττάρων. 2.6 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ Μετά τη συλλογή τους οι τοµές τοποθετούνταν σε διάλυµα 1% τετροξειδίου του οσµίου, ph 7,4 για 30 λεπτά. Κατόπιν, πλένονταν σε διάλυµα οξικού νατρίου 0,1Μ για 2x5 λεπτά, χρωµατίζονταν σε υδατικό διάλυµα οξικού ουρανυλίου 1% για 30 λεπτά και πλένονταν ξανά µε διάλυµα οξικού νατρίου 0,1Μ για 2x5 λεπτά. Ακολούθως, αφυδατώνονταν σε σειρά διαλυµάτων αιθυλικής αλκοόλης αυξανόµενης πυκνότητας (25% 2 λεπτά, 50% 2 λεπτά, 70% 10 λεπτά, 95% 2x7 λεπτά, 100% 2x15 λεπτά), διαυγάζονταν σε οξείδιο του προπυλενίου για 5 λεπτά και παρέµεναν σε διάλυµα 1:1 οξειδίου του προπυλενίου και εποξειδικής ρητίνης για 12 ώρες. Έπειτα, οι τοµές τοποθετούνταν σε νέα ρητίνη, µεταφέρονταν σε αντικειµενοφόρους πλάκες και παρέµεναν στους 60 ο C για 48 ώρες. Στη συνέχεια, µε τη βοήθεια ειδικής συσκευής σχεδίασης (Camera lucida), προσαρτηµένης σε οπτικό µικροσκόπιο, γινόταν χαρτογράφηση των ορίων του dlgn. Έπειτα, οι τοµές µεταφέρονταν κάτω από στερεοσκόπιο και αποκόπτονταν τα τµήµατα των τοµών που αντιστοιχούσαν στον dlgn, τα οποία τοποθετούνταν στην κορυφή µικρών κυλίνδρων από πολυµερισµένη ρητίνη. Από τα τεµάχια αυτά λαµβάνονταν ηµίλεπτες τοµές πάχους 0,5µm, οι οποίες χρωµατίζονταν µε κυανό της τολουϊδίνης και παρατηρούνταν µε το οπτικό µικροσκόπιο µε σκοπό τον εντοπισµό των θέσεων όπου υπήρχαν πυκνωτικά κύτταρα. Στη συνέχεια, γινόταν η λήψη υπέρλεπτων τοµών πάχους περίπου 90 nm από τις θέσεις αυτές για παρατήρηση της υπερµικροσκοπικής δοµής των πυκνωτικών κυττάρων και την ταυτοποίηση του τύπου του κυτταρικού 68

79 Υλικά και Μέθοδοι θανάτου. Μετά τη συλλογή τους, οι υπέρλεπτες τοµές χρωµατίζονταν µε υδατικό διάλυµα οξικού ουρανυλίου και κιτρικού µολύβδου και παρατηρούνταν µε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο διέλευσης (Zeiss EM 9S). 3. ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Τα µορφολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων µε πυκνωτικό πυρήνα µελετήθηκαν αναλυτικά µε το οπτικό και το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Η µελέτη αυτή έδειξε ότι τα κύτταρα µε πυκνωτικό πυρήνα παρουσίαζαν τα τυπικά µορφολογικά γνωρίσµατα των αποπτωτικών κυττάρων. Επιπλέον, µε τη µέθοδο της ανοσοϊστοχηµείας, έγινε µελέτη της έκφρασης ειδικών γονιδίων που προάγουν την απόπτωση, όπως αυτού που κωδικοποιεί την κασπάση-3, η οποία θεωρείται αξιόπιστος αποπτωτικός δείκτης. Τέλος, µελετήθηκε ο φαινότυπος των αποπτωτικών κυττάρων µε τη µέθοδο της διπλής σήµανσης. 4. ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η ποσοτική µελέτη του φαινοµένου της απόπτωσης έγινε µε την καταµέτρηση των σεσηµασµένων µε τη µέθοδο TUNEL πυρήνων (TUNEL+) στο σύνολο των τοµών που προέρχονταν από εγκεφάλους επιµύων κατά την ανάπτυξη και µε αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού. Συνολικά χρησιµοποιήθηκαν 12 τοµές ανά εξεταζόµενη ηλικία σε κάθε κατηγορία, µέσα στα όρια του dlgn. Προκειµένου να προσδιοριστούν τα όρια του dlgn χρησιµοποιήθηκαν οι σεσηµασµένες µε τη µέθοδο Nissl τοµές και οι ειδικοί άτλαντες του εγκεφάλου του αναπτυσσόµενου και ενηλίκου επίµυος (Paxinos και Watson, 1986 Paxinos και συν., 1991). Όλες οι µετρήσεις έγιναν µε χαρτογράφηση των τοµών µε τη βοήθεια της συσκευής Camera Lucida προσαρτηµένης σε οπτικό 69

80 Υλικά και Μέθοδοι µικροσκόπιο, µε τη χρήση αντικειµενικού φακού Χ25, σε σταθερό εµβαδόν τοµής µεγέθους 0,1 mm 2. Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων προσδιορίζουν την πυκνότητα των αποπτωτικών κυττάρων και εκφράζονται ως οι µέσοι όροι του αριθµού των TUNEL+ κυττάρων ανά τοµή (TC/sect). Επιπλέον, στις ίδιες τοµές και στο ίδιο εµβαδόν, η πυκνότητα των αποπτωτικών κυττάρων εκφράστηκε και ως ο µέσος όρος των λόγων των TUNEL+ κυττάρων ανά «ζωντανά» κύτταρα (TC/LC). Ως «ζωντανά» κύτταρα θεωρούνταν τα µη σεσηµασµένα (TUNEL ) κύτταρα που είχαν εµφανή πυρηνίσκο ή πυρήνα στο επίπεδο εστίασης και δεν παρουσίαζαν πυκνωτική ή άλλη εκφυλιστική µορφολογία. Για τον σκοπό αυτό, σε σταθερό εµβαδόν τοµής µεγέθους 0,1 mm 2, έγινε καταµέτρηση των «ζωντανών» κυττάρων και προσδιορίστηκε µε αναγωγή η πυκνότητα των αποπτωτικών κυττάρων στον dlgn που αντιστοιχεί σε «ζωντανά» κύτταρα του πυρήνα. Για την ποσοτική ανάλυση των κυττάρων που εµφάνιζαν ανοσοδραστικότητα για την ενεργοποιηµένη κασπάση-3, ο αριθµός τους υπολογίστηκε σε 12 τοµές από τον dlgn επιµύων ηλικίας Μ1 της οµάδας Α και σε 12 τοµές από τον dlgn επιµύων ηλικίας ΜΒ1 της υποοµάδας Β1, σε πεδία εµβαδού 0,1 mm 2. Τέλος, πραγµατοποιήθηκαν µετρήσεις του αριθµού των «ζωντανών» κυττάρων σε 12 τοµές από τον dlgn ενήλικων επιµύων της οµάδας Α και σε 12 τοµές ανά υποοµάδα από τον dlgn ενήλικων επιµύων της οµάδας Β, σε σταθερό εµβαδόν τοµής µεγέθους 0,1 mm ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκαν παραµετρικές και µη παραµετρικές µέθοδοι. Ειδικότερα, η οµοιογένεια των διακυµάνσεων ελέγχθηκε µε τη µέθοδο 70

81 Υλικά και Μέθοδοι Levene, ενώ για τον έλεγχο της κανονικότητας των διακυµάνσεων έγινε µετατροπή των αποτελεσµάτων σε log e, log 10 και sqrt. Η µέθοδος Kruskal-Wallis εφαρµόστηκε προκειµένου να διαπιστωθεί η σηµαντικότητα των διαφορών της πυκνότητας των αποπτωτικών κυττάρων µεταξύ διαφορετικών ηλικιών στην ίδια οµάδα και µεταξύ αντίστοιχων ηλικιών για όλες τις οµάδες πειραµατοζώων. Η δοκιµή Mann-Whitney U-test έγινε για τον έλεγχο της σηµαντικότητας της διαφοράς της πυκνότητας των αποπτωτικών κυττάρων κατά διαδοχικά ζεύγη. Η παραµετρική µέθοδος της ανάλυσης των διακυµάνσεων µιας κατεύθυνσης (One-way ANOVA) εφαρµόστηκε για τη σύγκριση των διαφορών της πυκνότητας των «ζωντανών» νευρώνων µεταξύ ενήλικων επιµύων της πρώτης και της δεύτερης πειραµατικής οµάδας. 71

82

83 Αποτελέσµατα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΧΟΛΙΑ ΓΙΑ ΤΙΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΤΟΥΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΣΜΟΥΣ Στην παρούσα εργασία µελετήθηκε ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος στον dlgn τόσο στον αναπτυσσόµενο και στον ενήλικο επίµυ όσο και σε πειραµατικά πρότυπα επιµύων στα οποία είχαν προκληθεί βλάβες των συνδέσεων του πυρήνα. Για την ταυτοποίηση και την καταµέτρηση του αριθµού των αποπτωτικών κυττάρων, χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος TUNEL, µε την οποία ανιχνεύονται in situ οι θέσεις κατάτµησης του DNA του πυρήνα των κυττάρων (Gavrieli και συν., 1992). Η µέθοδος αυτή έχει χρησιµοποιηθεί ευρέως για τη σήµανση των αποπτωτικών κυττάρων σε ιστολογικές τοµές και σε κυτταροκαλλιέργειες (Barth και συν., 2002). Πολλοί ερευνητές έχουν διατυπώσει επιφυλάξεις σχετικά µε την ειδικότητα της µεθόδου (Charriaut-Marlangue και Ben-Ari, 1995 Grasl-Kraupp και συν., 1995), κυρίως διότι ο κατακερµατισµός του πυρηνικού DNA παρατηρείται και σε άλλους τύπους κυτταρικού θανάτου, όπως είναι ο παρόµοιος µε απόπτωση τύπος PCD και η νέκρωση (Stadelmann και Lassmann, 2000 Leist και Jäättelä, 2001). Εντούτοις, λόγω της ύπαρξης σηµαντικά µεγαλύτερου αριθµού θραυσµάτων DNA στον πυρήνα των αποπτωτικών κυττάρων συγκριτικά µε εκείνον που παρατηρείται στους άλλους τύπους κυτταρικού θανάτου (βλ. Εισαγωγή, Κεφ. Γ-2), υποστηρίζεται από πολλούς ερευνητές ότι η µέθοδος TUNEL έχει µεγαλύτερη ευαισθησία στην ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων. Το γεγονός αυτό βασίζεται στην ύπαρξη περισσότερων θέσεων σύνδεσης του σεσηµασµένου νουκλεοτιδίου που χρησιµοποιείται στην TUNEL, µε αποτέλεσµα την αυξηµένη ένταση της σήµανσης (Christina και συν., 2006). Η προσεκτική αξιολόγηση των µορφολογικών χαρακτηριστικών των σεσηµασµένων κυττάρων κατά την παρατήρηση µε το οπτικό µικροσκόπιο συµβάλλει 73

84 Αποτελέσµατα στη διάκριση µεταξύ απόπτωσης και νέκρωσης, όχι όµως µεταξύ απόπτωσης και παρόµοιου µε απόπτωση τύπου PCD. Σαφής διαχωρισµός µεταξύ των παραπάνω τύπων κυτταρικού θανάτου γίνεται µε τη µελέτη της έκφρασης των ειδικών γονιδίων που προάγουν την απόπτωση, όπως αυτού που κωδικοποιεί την κασπάση-3. Η ανάλυση των υπερµικροσκοπικών µορφολογικών χαρακτηριστικών των κυττάρων που βρίσκονται σε διαδικασία κυτταρικού θανάτου µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο πιστοποιεί αδιαµφισβήτητα τον τύπο του θανάτου (Stadelmann και Lassmann, 2000). Τα TUNEL+ κύτταρα που παρατηρήθηκαν στον dlgn µε το οπτικό µικροσκόπιο παρουσίαζαν τα χαρακτηριστικά µορφολογικά γνωρίσµατα των αποπτωτικών κυττάρων (Kerr και συν., 1972 Wyllie και συν., 1981 Ellis και συν., 1991 Häcker, 2000 Bredesen, 2000 Leist και Jäättelä, 2001), κάτι που, για τα κύτταρα µε πυκνωτικό πυρήνα, επιβεβαιώθηκε µε την εξέταση στο επίπεδο του ηλεκτρονικού µικροσκοπίου (Al-Abdulla και συν., 1998 Martin και συν., 1998). Επιπλέον, µε τη χρήση της ανοσοϊστοχηµείας διαπιστώθηκε ότι η απόπτωση στον dlgn επιτυγχάνεται µέσω της ενεργοποίησης της κασπάσης-3, η οποία θεωρείται ένας αξιόπιστος αποπτωτικός δείκτης (Porter και Jänicke, 1999 Marklund και συν., 2006). Εποµένως, θεωρήθηκε ότι ο κυτταρικός θάνατος που παρατηρείται στον dlgn τόσο κατά την ανάπτυξη όσο και µετά από καταστροφή των συνδέσεών του είναι αποπτωτικού τύπου και συνεπώς οι όροι TUNEL+ και αποπτωτικά κύτταρα χρησιµοποιούνται στην εργασία αυτοί ως ταυτόσηµοι. Επιπλέον, πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα διπλής σήµανσης µε τη µέθοδο TUNEL µε φθορισµό και τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού, προκειµένου να διευκρινιστεί εάν τα αποπτωτικά κύτταρα στον dlgn κατά την ανάπτυξη και µετά από βλάβες των συνδέσεών του είναι νευρικά ή νευρογλοιακά. 74

85 Αποτελέσµατα Για να διερευνηθούν οι επιπτώσεις που µπορεί να έχουν οι βλάβες κύριων προσαγωγών και απαγωγών συστηµάτων στην επιβίωση των νευρώνων του dlgn, πραγµατοποιήθηκαν δύο σειρές πειραµάτων. Στην πρώτη, έγινε διατοµή των προσαγωγών ινών από τον ΑµΧ, µε αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού. Στη δεύτερη, πραγµατοποιήθηκε καταστροφή αµοιβαίων συνδέσεων του dlgn, µε αφαίρεση του οπτικού φλοιού. Οι βλάβες πραγµατοποιήθηκαν σε επίµυς κατά τη γέννηση και σε συγκεκριµένα στάδια της µεταγεννητικής ανάπτυξης, για να διερευνηθεί επιπλέον εάν ο βαθµός ωρίµασης του dlgn σχετίζεται µε την ικανότητα των κυττάρων του για επιβίωση µετά από καταστροφή των συνδέσεών του µε τις παραπάνω περιοχές. Τα στάδια της ανάπτυξης στα οποία πραγµατοποιήθηκαν οι βλάβες επιλέχθηκαν µε γνώµονα την ολοκλήρωση κρίσιµων για την ανάπτυξη του dlgn διεργασιών, όπως είναι η µορφολογική και η νευροχηµική διαφοροποίηση των κυττάρων του, η συναπτογένεση και η εδραίωση των προσαγωγών και απαγωγών του συνδέσεων. Οι διεργασίες αυτές σχετίζονται µε την προοδευτική αύξηση της τροφοδότησης των κυττάρων του dlgn µε νευροτροφικούς παράγοντες. Επιπρόσθετα, προκειµένου να διερευνηθεί εάν και κατά πόσον η απόπτωση που προκλήθηκε στον dlgn από τη βλάβη των προσαγωγών συνδέσεών του επηρεάζει τον τελικό αριθµό των κυττάρων του, έγινε καταµέτρηση των «ζωντανών» κυττάρων του dlgn σε ενήλικα πειραµατόζωα που είχαν υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού σε διάφορα στάδια της ανάπτυξης και σύγκρισή τους µε τον αριθµό των «ζωντανών» κυττάρων σε µάρτυρες. Η καταµέτρηση αυτή θεωρήθηκε σκόπιµη προκειµένου να γίνει συνολική εκτίµηση των επιπτώσεων της αποστέρησης των νευροτροφικών παραγόντων που προέρχονται από τον ΑµΧ στην επιβίωση των νευρώνων του πυρήνα. Τέτοια εξέταση δεν ήταν εφικτή στα πειραµατόζωα που είχαν υποστεί αφαίρεση του φλοιού των 75

86 Αποτελέσµατα εγκεφαλικών ηµισφαιρίων λόγω της εκτεταµένης υποπλασίας του dlgn, η οποία ήταν συνέπεια της βλάβης. 76

87 Αποτελέσµατα 1.ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ 1.1 ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 1.1Α ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Τα αποπτωτικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν µε τη µέθοδο TUNEL και την ανοσοϊστοχηµική µέθοδο για την ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3. Η έντονη και επιλεκτική σήµανση των πυρήνων των αποπτωτικών κυττάρων µε τις παραπάνω µεθόδους επέτρεψε το διαχωρισµό τους από τα µη σεσηµασµένα «ζωντανά» κύτταρα, τα οποία ήταν ευδιάκριτα λόγω του αντιχρωµατισµένου µε τολουϊδίνη κυτταροπλάσµατός τους. Στις ηλικίες στις οποίες βρέθηκαν σεσηµασµένα κύτταρα, η κατανοµή τους ήταν οµοιογενής σε όλη την έκταση του dlgn. 1.1A 1 ΜΕΘΟ ΟΣ TUNEL Τα TUNEL+ κύτταρα ήταν συρρικνωµένα και µερικώς αποκολληµένα από το νευροπίληµα. Οι πυρήνες των σεσηµασµένων κυττάρων ήταν πυκνωτικοί, καστανού χρώµατος και εµφάνιζαν διαφορετικά µεγέθη και ποικίλα µορφολογικά χαρακτηριστικά που υποδηλώνουν διαφορετικά αποπτωτικά στάδια, όπως αυτά έχουν περιγραφεί σε άλλες µελέτες (Häcker, 2000). Σε αρχικά στάδια της απόπτωσης, οι σεσηµασµένοι πυρήνες ήταν, στην πλειοψηφία τους, στρογγυλοί µε κέντρο σχετικά διαυγές, ενώ το προϊόν σήµανσης είχε δρεπανοειδή µορφή στην περιφέρεια του πυρήνα. Σε µεταγενέστερα στάδια, οι σεσηµασµένοι πυρήνες παρουσίαζαν οµοιογενή διάχυτο χρωµατισµό, ενώ σε τελικά στάδια της απόπτωσης, ορισµένοι πυρήνες εµφάνιζαν δορυφορικές προεκβολές της χρωµατίνης ή αποτελούνταν από 77

88 Αποτελέσµατα δύο έως τρία θραύσµατα ενωµένα µεταξύ τους. Το κυτταρόπλασµα των TUNEL+ κυττάρων συνήθως δεν ήταν ορατό, σπανίως όµως είχε τη µορφή λεπτού αντιχρωµατισµένου δακτυλίου που περιέβαλλε τον πυρήνα (Εικόνα 1). Τα τελικά στάδια της απόπτωσης χαρακτηρίζονταν από µεγάλο αριθµό αποπτωτικών σωµατίων, δηλαδή θραυσµάτων των αποπτωτικών κυττάρων τα οποία περιβάλλονταν από κυτταρική µεµβράνη. Α Β Εικόνα 1. Μικροφωτογραφίες στις οποίες φαίνονται διαφορετικά µορφολογικά χαρακτηριστικά των TUNEL+ κυττάρων στον dlgn του επίµυος, ηλικίας Μ1. Τα βέλη δείχνουν τους αποπτωτικούς πυρήνες. Στην Α ένας πυρήνας έχει οµοιογενή διάχυτο χρωµατισµό (µαύρο βέλος ). Στις Α και Β σε ορισµένα TUNEL+ κύτταρα το προϊόν σήµανσης έχει δρεπανοειδή µορφή στην περιφέρεια του πυρήνα (λευκά βέλη), ενώ στη Β φαίνεται ένας πυρήνας µε δορυφορικές προεκβολές της χρωµατίνης (ασπρόµαυρο βέλος). Ράβδος = 20µm. 1.1A 2 ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ -3 Όπως προαναφέρθηκε (βλ. Εισαγωγή, Κεφ. Γ-3.1), η ενεργοποίηση των κασπασών αποτελεί τη βιοχηµική σφραγίδα της απόπτωσης (Samali και συν., 1999 Stefanis, 2005). Η κασπάση-3 θεωρείται ειδική της απόπτωσης διότι η ενεργοποίησή της προκαλεί την πρωτεολυτική διάσπαση σηµαντικών πρωτεϊνών για την επιβίωση του κυττάρου και ευθύνεται για τα βιοχηµικά και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά της 78

89 Αποτελέσµατα απόπτωσης (Porter και Jänicke, 1999 Fischer και συν., 2003 Marklund και συν., 2006). Η µελέτη της έκφρασης της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 έγινε ανοσοϊστοχηµικά, µε τη χρήση πολυκλωνικών αντισωµάτων σε αναπτυσσόµενους επίµυς ηλικίας Μ1, στάδιο κατά το οποίο παρατηρήθηκε ο µέγιστος αριθµός αποπτωτικών κυττάρων µε τη µέθοδο TUNEL. Κατά την παρατήρηση των τοµών µε το οπτικό µικροσκόπιο παρατηρήθηκαν σεσηµασµένα κύτταρα στον dlgn, τα οποία εµφάνιζαν µορφολογικά χαρακτηριστικά τυπικά της απόπτωσης. Τα κύτταρα αυτά ήταν συρρικνωµένα, σφαιρικά ή µε ανώµαλη επιφάνεια και το προϊόν σήµανσης εντοπιζόταν στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασµα (Εικόνα 2). Α Β Εικόνα 2. Ανοσοϊστοχηµική έκφραση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 στον dlgn αναπτυσσόµενου επίµυος τη Μ1. Στο πλαίσιο της Α απεικονίζεται περιοχή του dlgn, η οποία περιέχει δύο κύτταρα σεσηµασµένα για την ενεργοποιηµένη κασπάση-3. Η περιοχή αυτή απεικονίζεται σε µεγαλύτερη µεγέθυνση στη Β, όπου διακρίνονται τα µορφολογικά χαρακτηριστικά των σεσηµασµένων κυττάρων (βέλη). Τα κύτταρα αυτά είναι συρρικνωµένα και έχουν σφαιρικό (µαύρο βέλος) ή ακανόνιστο (άσπρο βέλος) σχήµα. Τα σεσηµασµένα κύτταρα βρίσκονται ανάµεσα σε αντιχρωµατισµένα, «ζωντανά» κύτταρα. Ράβδος = 50µm (Α), 20µm (Β). 79

90 Αποτελέσµατα 1.1Β ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Η εξέταση υπέρλεπτων τοµών από τον dlgn του αναπτυσσόµενου επίµυος µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο πραγµατοποιήθηκε προκειµένου να επιβεβαιωθεί ο τύπος του κυτταρικού θανάτου στα κύτταρα µε πυκνωτικό πυρήνα. Για το σκοπό αυτό, η συλλογή του υλικού έγινε από επίµυς που θυσιάστηκαν τη Μ1, ηλικία κατά την οποία παρατηρήθηκε ο µεγαλύτερος αριθµός αποπτωτικών κυττάρων µε τη µέθοδο TUNEL. Κατά την ανάλυση του υλικού, παρατηρήθηκαν κύτταρα µε τυπικά αποπτωτικά µορφολογικά χαρακτηριστικά, σε διαφορετικά στάδια της απόπτωσης, όπως έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία (Al-Abdulla και συν., 1998 Martin και συν., 1998). Συγκεκριµένα, σε αρχικά στάδια της απόπτωσης, οι πυρήνες των κυττάρων εµφάνιζαν πολυάριθµες πυκνωτικές µάζες χρωµατίνης δρεπανοειδούς ή σφαιρικού σχήµατος, οι οποίες ήταν προσκολληµένες στο πυρηνικό περίβληµα. Τα κύτταρα είχαν ελαφρώς συρρικνωµένο κυτταρόπλασµα και ακέραιη κυτταρική µεµβράνη, η οποία σχηµάτιζε προεκβολές και εκκολπώµατα. Σε µεταγενέστερα στάδια, τα κύτταρα εµφανίζονταν συχνά αποκολληµένα από το νευροπίληµα, µε ηλεκτρονικά πυκνό πυρήνα και συρρικνωµένο κυτταρόπλασµα, ενώ διατηρούσαν τη δοµή των κυτταρικών οργανιδίων. Σε τελικά στάδια της απόπτωσης, παρατηρούνταν αποπτωτικά σωµάτια, δηλαδή θραύσµατα των κυττάρων περιβαλλόµενα από ακέραιη κυτταρική µεµβράνη. Τα αποπτωτικά σωµάτια, βρίσκονταν συχνά σε επαφή ή ήταν εγκολπωµένα από µικρονευρογλοιακά κύτταρα (Εικόνα 3). Σε αρχικά στάδια της απόπτωσης, στα οποία ήταν εφικτή η διάκριση µεταξύ νευρώνων και νευρογλοιακών κυττάρων, διαπιστώθηκε ότι η συντριπτική πλειονότητα των αποπτωτικών κυττάρων ήταν νευρώνες. 80

91 Αποτελέσµατα Α Β ΝΓ Ν Γ Εικόνα 3. Μικροηλεκτρονιογραφίες στις οποίες φαίνονται κύτταρα µε χαρακτηριστική αποπτωτική µορφολογία από τον dlgn επίµυος τη Μ1 σε διαφορετικά αποπτωτικά στάδια. Στα αρχικά στάδια, ο πυρήνας χαρακτηρίζεται από την παρουσία πολλαπλών δρεπανοειδών ή στρογγυλών πυκνωτικών µαζών χρωµατίνης (Α, Β), ενώ σε µεταγενέστερα στάδια το κύτταρο εµφανίζει πυκνωτικό οµοιογενή πυρήνα και συρρικνωµένο κυτταρόπλασµα (Γ, ). Στη Γ διακρίνεται επίσης ο πυρήνας ενός «ζωντανού» νευρώνα (Ν) δίπλα στο αποπτωτικό κύτταρο. Σε τελικά στάδια, τα αποπτωτικά κύτταρα βρίσκονται συχνά σε επαφή µε µικρονευρογλοιακά κύτταρα (ΝΓ στη ). Ράβδος = 1,15µm (Α,Γ, ), 0,38µm (Β). 1.2 ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Στον dlgn του επίµυος, αποπτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της πρώτης µεταγεννητικής εβδοµάδας. Σε έµβρυα ηλικίας 20 ηµερών και σε νεογέννητα πειραµατόζωα δεν παρατηρήθηκαν αποπτωτικά κύτταρα. 81

92 Αποτελέσµατα Αποπτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά τη Μ1, ηλικία κατά την οποία η πυκνότητά τους παρουσίασε τη µέγιστη τιµή. Ακολούθησε σηµαντική µείωση της πυκνότητας των TUNEL+ κυττάρων τη Μ3, η οποία συνεχίστηκε σταδιακά µέχρι τη Μ7 (Εικόνα 4). Σε όλες τις ηλικίες που εξετάστηκαν από το τέλος της πρώτης µεταγεννητικής εβδοµάδας έως το ενήλικο δεν παρατηρήθηκαν αποπτωτικά κύτταρα. Α Β Γ Εικόνα 4. Μικροφωτογραφίες στις οποίες φαίνεται η τοπογραφική κατανοµή των TUNEL+ κυττάρων στον dlgn του αναπτυσσόµενου επίµυος στις ηλικίες Μ1(Α), Μ3(Β), Μ5(Γ), Μ7( ). Με τη διακεκοµµένη γραµµή (Α) απεικονίζονται τα όρια του dlgn. Ράβδος = 100µm. 82

93 Αποτελέσµατα Η ποσοτική ανάλυση της πυκνότητας των αποπτωτικών κυττάρων φαίνεται στο ιάγραµµα 1 και στον Πίνακα 3. ιάγραµµα 1 6 TC/sect TC/LC ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ TUNEL+ ΚΥΤΤΑΡΩΝ * * 0 Μ1 Μ3 Μ5 Μ7 Μ8 Μ14 Μ15 Μ21 Μ28 Μ60 ΗΛΙΚΙΑ Η πυκνότητα των ΤUNEL+ κυττάρων στον dlgn κατά την ανάπτυξη εµφανίζει µέγιστη τιµή τη Μ1. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τους µέσους όρους ± τυπικό σφάλµα του µέσου. TC/sect: µέσος όρος του αριθµού των ΤUNEL+ κυττάρων ανά τοµή, ανά 0,1mm 2 (µαύρες στήλες), TC/LC: µέσος όρος των λόγων των ΤUNEL+ κυττάρων ανά «ζωντανά» κύτταρα, ανά τοµή, ανά 0,1mm 2 (λευκές στήλες). Η µείωση τη Μ3 και τη Μ5 είναι στατιστικά σηµαντική (*p 0.05). Η στατιστική ανάλυση του διαγράµµατος φαίνεται στον Πίνακα 3. 83

94 Αποτελέσµατα Πίνακας 3. Πυκνότητα των αποπτωτικών κυττάρων στον dlgn κατά την ανάπτυξη. Ηλικία Πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων TC/sect TC/LC M1 2,92 ± 0,259 α 5,09 ± 0,196 α M3 1,58 ± 0,148 β 2,99 ± 0,148 β M5 0,58 ± 0,148 γ 1,59 ± 0,409 γ M7 0,25 ± 0,130 γ 0,76 ± 0,399 γ M8 0 0 M M M M Μ Μ: Μεταγεννητική ηµέρα. TC/sect: µέσος όρος του αριθµού των TUNEL+ κυττάρων ανά τοµή, ανά 0,1 mm 2. TC/LC: µέσος όρος των λόγων των ΤUNEL+ κυττάρων ανά «ζωντανά» κύτταρα, ανά τοµή, ανά 0,1mm 2. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τους µέσους όρους ± τυπικό σφάλµα του µέσου. Οι µέσοι όροι της ίδιας στήλης µε διαφορετικό εκθέτη παρουσιάζουν στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ τους (p#0,05). 1.3 ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ ΤΩΝ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Σε επίµυς ηλικίας Μ1, στάδιο κατά το οποίο παρατηρήθηκε η µέγιστη συχνότητα των αποπτωτικών κυττάρων, πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα διπλής σήµανσης προκειµένου να ταυτοποιηθεί ο φαινότυπος των αποπτωτικών κυττάρων. Στα πειράµατα αυτά χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος TUNEL µε φθορισµό σε συνδυασµό µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού. Για την ταυτοποίηση των νευρώνων χρησιµοποιήθηκαν αντισώµατα εναντίον της πρωτεΐνης NeuN και για την 84

95 Αποτελέσµατα Α ταυτοποίηση των αστροκυττάρων αντισώµατα εναντίον της πρωτεΐνης GFAP. Η ταυτοποίηση των TUNEL+ κυττάρων έγινε σε µικροσκόπιο φθορισµού µε βάση τον έντονο κόκκινο χρωµατισµό του πυρήνα τους. Στην πλειονότητά τους οι σεσηµασµένοι πυρήνες ήταν στρογγυλοί και εµφάνιζαν δρεπανοειδή ή δακτυλιοειδή σήµανση στην περιφέρεια ή παρουσίαζαν οµοιογενή διάχυτο χρωµατισµό (Εικόνα 5Α). Ταυτόχρονα, όσα από τα TUNEL+ κύτταρα ήταν νευρώνες, ήταν σεσηµασµένα και µε το αντίσωµα εναντίον της πρωτεΐνης NeuN. Τα κύτταρα αυτά διακρίνονταν από τον έντονο πράσινο χρωµατισµό του πυρήνα τους (Εικόνα 5Β), ενώ τα αστροκύτταρα που επισηµαίνονταν µε το αντίσωµα εναντίον της GFAP είχαν πράσινο προϊόν σήµανσης, που ήταν, ωστόσο, εντοπισµένο αποκλειστικά στο κυτταρόπλασµα. Η εξέταση των τοµών µε το µικροσκόπιο φθορισµού έδειξε ότι τα αποπτωτικά κύτταρα ήταν στην πλειοψηφία τους νευρώνες, ενώ εντοπίστηκε ένας πολύ µικρός αριθµός αποπτωτικών αστροκυττάρων. Α Β Εικόνα 5. Μικροφωτογραφίες ανοσοφθορισµού από τον dlgn αναπτυσσόµενου επίµυος ηλικίας Μ1, στις οποίες φαίνονται τα ίδια κύτταρα σεσηµασµένα µε τη µέθοδο TUNEL (Α) και µε αντισώµατα εναντίον της NeuN (Β). Ράβδος = 20µm. Α Β 85

96 Αποτελέσµατα 2. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΚΑΤΑΣΤΡΟΦΗ ΤΩΝ ΠΡΟΣΑΓΩΓΩΝ ΙΝΩΝ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑµΧ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΤΟΥ ΒΟΛΒΟΥ ΤΟΥ ΟΦΘΑΛΜΟΥ 2.1 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΒΛΑΒΗΣ Η αφαίρεση του βολβού του δεξιού οφθαλµού είχε ως συνέπεια τη διατοµή των νευραξόνων των γαγγλιακών κυττάρων του ΑµΧ, οι οποίοι, όπως αναφέρθηκε (βλ. Εισαγωγή, Κεφ. Β-4.1Α 1 ) σχηµατίζουν το δεξιό οπτικό νεύρο και απολήγουν κυρίως στον ετεροπλάγιο dlgn (Σχήµα 3). Σκοπός της βλάβης αυτής ήταν η µελέτη της αποστέρησης των νευροτροφικών παραγόντων που µεταφέρονται ορθόδροµα από τον ΑµΧ στον dlgn στην επιβίωση των κυττάρων του πυρήνα. Οι βλάβες αυτές πραγµατοποιήθηκαν σε 3 διαφορετικά στάδια ανάπτυξης. Σχήµα 3. Σχηµατική απεικόνιση της καταστροφής των συνδέσεων του ΑµΧ του δεξιού οφθαλµού του επίµυος µε τον ετεροπλάγιο dlgn µετά από αφαίρεση του βολβού. ΑµΧ: Αµφιβληστροειδής χιτώνας του οφθαλµού, ΟΝ: Οπτικό νεύρο, OX: οπτικό χίασµα, ΟΤ: Οπτική ταινία dlgn: Ραχιαίος έξω γονατώδης πυρήνας, ΟΑ: Οπτική ακτινοβολία, ΟΦ: Οπτικός φλοιός. 86

97 Αποτελέσµατα 2.2 ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 2.2Α ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ 2.2Α 1 ΜΕΘΟ ΟΣ TUNEL Μετά από αφαίρεση του βολβού του οθφαλµού, αποπτωτικά κύτταρα στον ετεροπλάγιο dlgn αναγνωρίστηκαν από την επιλεκτική και έντονη χρώση του πυρήνα τους (Εικόνα 6Α) και εµφάνιζαν τα τυπικά µορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης (βλ. Αποτελέσµατα, Κεφ. 1.1Α 1 ). Στις ηλικίες στις οποίες παρατηρήθηκαν σεσηµασµένα κύτταρα, η κατανοµή τους ήταν οµοιογενής σε όλη την έκταση του πυρήνα. 2.2Α 2 ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ -3 Η ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 πραγµατοποιήθηκε ανοσοϊστοχηµικά σε επίµυς που είχαν υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0 και θυσιάστηκαν τη ΜΒ1, ηλικία κατά την οποία παρατηρήθηκε η µέγιστη πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων (βλ. Αποτελέσµατα, Κεφ. 2.3Α). Κατά τη µελέτη των τοµών, παρατηρήθηκαν σεσηµασµένα κύτταρα στον dlgn στα οποία το προϊόν σήµανσης ήταν εντοπισµένο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασµα (Εικόνα 6Β). 87

98 Αποτελέσµατα Α Β Εικόνα 6. Μικροφωτογραφίες στις οποίες φαίνεται η τοπογραφική κατανοµή των σεσηµασµένων κυττάρων µε τη µέθοδο TUNEL (Α) και µε τη µέθοδο της ανοσοϊστοχηµείας για την ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 (Β) στον dlgn επίµυος που είχε υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0 και θυσιάστηκε τη ΜΒ1. Το βέλος στη Β δείχνει το αποπτωτικό κύτταρο που απεικονίζεται σε µεγαλύτερη µεγέθυνση στο ένθετο. Ράβδος = 100 µm (Α, Β), 10 µm (ένθετο). 2.2Β ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Η συλλογή του υλικού έγινε από επίµυς που είχαν υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0 και θυσιάστηκαν τη ΜΒ1, ηλικία κατά την οποία παρατηρήθηκε ο µεγαλύτερος αριθµός TUNEL+ κυττάρων. Η εξέταση υπέρλεπτων τοµών µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο επιβεβαίωσε ότι όλα τα κύτταρα µε πυκνωτικό πυρήνα που εξετάστηκαν παρουσίαζαν τα τυπικά µορφολογικά χαρακτηριστικά όλων των σταδίων της απόπτωσης. Επιπλέον, η συντριπτική πλειονότητα των κυττάρων αυτών εµφάνιζε υπερµικροσκοπικά µορφολογικά χαρακτηριστικά των νευρώνων (Εικόνα 7). 88

99 Αποτελέσµατα Α Β ΝΓ Ν Γ Εικόνα 7: Μικροηλεκτρονιογραφίες στις οποίες φαίνονται κύτταρα µε χαρακτηριστική αποπτωτική µορφολογία σε διαφορετικά στάδια της απόπτωσης στον dlgn επίµυος που είχε υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0 και θυσιάστηκε τη ΜΒ1. Σε αρχικά στάδια της απόπτωσης (Α και Β), ο πυρήνας παρουσιάζει πυκνωτικές µάζες χρωµατίνης σφαιρικού ή δρεπανοειδούς σχήµατος. Σε µεταγενέστερα στάδια, το κύτταρο εµφανίζει πυκνωτικό πυρήνα µε οµοιογενή κατανοµή της χρωµατίνης και µε συµπυκνωµένο και συρρικνωµένο κυτταρόπλασµα (Γ). Σε τελικά στάδια της απόπτωσης ( ), το αποπτωτικό σωµάτιο είναι εγκολπωµένο από ένα µικρονευρογλοιακό κύτταρο (ΝΓ). ίπλα στα κύτταρα αυτά φαίνεται ένας «ζωντανός» νευρώνας (Ν). Ράβδος = 1,15µm. Παρατηρήθηκαν κύτταρα συρρικνωµένα και αποκολληµένα από το νευροπίληµα, τα οποία εµφάνιζαν πύκνωση και κατακερµατισµό της χρωµατίνης του πυρήνα σε δρεπανοειδείς ή σφαιρικούς οµοιογενείς σχηµατισµούς, ακεραιότητα των κυτταρικών οργανιδίων και της 89

100 Αποτελέσµατα κυτταρικής µεµβράνης. Παρατηρήθηκαν, επίσης, αποπτωτικά σωµάτια στο νευροπίληµα ή εγκυστωµένα σε µικρονευρογλοιακά κύτταρα. 2.3 ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 2.3Α ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΤΟΥ ΒΟΛΒΟΥ ΤΟΥ ΟΦΘΑΛΜΟΥ ΤΗ Μ0 Μετά από αφαίρεση του βολβού του δεξιού οφθαλµού στον νεογέννητο επίµυ, η πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων στον ετεροπλάγιο dlgn αυξήθηκε σηµαντικά τη ΜΒ1. Στην ηλικία αυτή, η πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων παρουσίασε τη µέγιστη τιµή της, η οποία διέφερε σηµαντικά από εκείνη που υπολογίστηκε στους φυσιολογικούς επίµυς. Επιπλέον, τα σεσηµασµένα κύτταρα παρουσίαζαν τυπικά µορφολογικά χαρακτηριστικά αντιπροσωπευτικά διαφόρων σταδίων της απόπτωσης. Συγκεκριµένα, παρατηρήθηκαν αποπτωτικά κύτταρα που βρίσκονταν τόσο σε αρχικά στάδια όσο και σε µεταγενέστερα στάδια της απόπτωσης. Τη ΜΒ3, η πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων µειώθηκε σηµαντικά και παρουσίασε συνεχή αλλά σταδιακή µείωση έως το τέλος της πρώτης µεταγεννητικής εβοµάδας. Στις ηλικίες αυτές δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στα χειρουργηµένα ζώα και στους µάρτυρες. Στις ηλικίες ΜΒ14, ΜΒ21 και ΜΒ60 δεν παρατηρήθηκαν αποπτωτικά κύτταρα. Η σύγκριση της πυκνότητας των TUNEL+ κυττάρων στον αριστερό dlgn µεταξύ των επιµύων που είχαν υποστεί αφαίρεση του βολβού του δεξιού οφθαλµού τη Μ0 και των µαρτύρων φαίνεται στο ιάγραµµα 2. Η ποσοτική ανάλυση της πυκνότητας των αποπτωτικών κυττάρων επιµύων σε διάφορα στάδια της ανάπτυξης µετά από αφαίρεση του βολβού του δεξιού οφθαλµού τη Μ0 φαίνεται στον Πίνακα 4 και η τοπογραφική τους κατανοµή στην Εικόνα 8. Επιπλέον, στον Πίνακα 5 90

101 Αποτελέσµατα φαίνονται τα αποτελέσµατα της ποσοτικής ανάλυσης της πυκνότητας των TUNEL+ κυττάρων και των κυττάρων που εµφάνισαν ανοσοδραστικότητα για την ενεργοποιηµένη κασπάση-3 (κασπάση-3+). Η σύγκριση έγινε ανάµεσα σε φυσιολογικώς αναπτυσσόµενους επίµυς που εξετάστηκαν τη Μ1 και σε επίµυς στους οποίους είχε αφαιρεθεί ο βολβός του δεξιού οφθαλµού τη Μ0 και εξετάστηκαν τη ΜΒ1. ιάγραµµα 2 ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ TUNEL+ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (TC/s) * ΜΑΡΤΥΡΕΣ ΒΛΑΒΗ ΤΗ Μ0 Μ1/MB1 Μ3/MB3 Μ5/MB5 Μ7/MB7 Μ14/MB14 Μ21/MB21 Μ60/MB60 ΗΛΙΚΙΑ Σύγκριση της πυκνότητας των ΤUNEL+ κυττάρων στον dlgn µεταξύ των φυσιολογικών επιµύων (λευκές στήλες) και των επιµύων µε αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0 (µαύρες στήλες). Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τους µέσους όρους ± τυπικό σφάλµα του µέσου. TC/sect: µέσος όρος του αριθµού των ΤUNEL+ κυττάρων ανά τοµή, ανά 0,1mm 2. Η αύξηση τη ΜΒ1 είναι στατιστικά σηµαντική (*p 0.05). 91

102 Αποτελέσµατα Πίνακας 4. Πυκνότητα των αποπτωτικών κυττάρων στον dlgn επιµύων µε αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0. Ηλικία Πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων TC/sect TC/LC MΒ1 16,25 ± 0,391 α 27,97 ± 0,469 α MΒ3 2,00 ± 0,213 β 3,63 ± 0,218 β MΒ5 0,75 ± 0,130 γ 1,81 ± 0,319 γ MΒ7 0,25 ± 0,130 δ 0,82 ± 0,428 γ MΒ MΒ ΜΒ ΜΒ: ηµέρα µετά τη βλάβη. TC/sect: µέσος όρος του αριθµού των TUNEL+ κυττάρων ανά τοµή, ανά 0,1 mm 2. TC/LC: µέσος όρος των λόγων των ΤUNEL+ κυττάρων ανά «ζωντανά» κύτταρα, ανά τοµή, ανά 0,1mm 2. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τους µέσους όρους ± τυπικό σφάλµα του µέσου. Οι µέσοι όροι της ίδιας στήλης µε διαφορετικό εκθέτη παρουσιάζουν στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ τους (p#0,05). 92

103 Αποτελέσµατα Πίνακας 5. Πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων και των κασπάση-3+ κυττάρων στον dlgn επιµύων κατά την ανάπτυξη και µετά από αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0. Κατηγορία Πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων Πυκνότητα των κασπάση-3+ κυττάρων Ανάπτυξη, Μ1 2,92 ± 0,259 α 1,58 ± 0,228 α Βλάβη του οφθαλμού τη Μ0, ΜΒ1 16,25 ± 0,391 β 7,41 ± 0,287 β Μ: µεταγεννητική ηµέρα. ΜΒ: ηµέρα µετά τη βλάβη. TC/sect: µέσος όρος του αριθµού των TUNEL+ κυττάρων ανά τοµή, ανά 0,1 mm 2. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τους µέσους όρους ± τυπικό σφάλµα του µέσου. Οι µέσοι όροι της ίδιας στήλης µε διαφορετικό εκθέτη παρουσιάζουν στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ τους (p#0,05). 93

104 Αποτελέσµατα Α Β Γ Εικόνα 8. Μικροφωτογραφίες στις οποίες φαίνεται η τοπογραφική κατανοµή των TUNEL+ κυττάρων στον dlgn επιµύων που είχαν υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0 και θυσιάστηκαν στις ηλικίες ΜΒ1(Α), ΜΒ3(Β), ΜΒ5(Γ), ΜΒ7( ). Ράβδος = 100µm. 94

105 Αποτελέσµατα 2.3Β ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΑΦΑΙΡΕΣΗ ΤΟΥ ΒΟΛΒΟΥ ΤΟΥ ΟΦΘΑΛΜΟΥ ΣΕ ΜΕΤΑΓΕΝΕΣΤΕΡΑ ΣΤΑ ΙΑ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Η αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ7 είχε ως αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση της πυκνότητας των TUNEL+ κυττάρων στον ετεροπλάγιο dlgn τη ΜΒ1 συγκριτικά µε τους µάρτυρες (Εικόνα 9). Τη ΜΒ7 παρατηρήθηκε πολύ µικρός αριθµός TUNEL+ κυττάρων. Σε επίµυς ηλικίας ΜΒ14 και ΜΒ60 δεν παρατηρήθηκαν αποπτωτικά κύτταρα (Πίνακας 6). Α Β Εικόνα 9. Μικροφωτογραφίες στις οποίες φαίνεται η τοπογραφική κατανοµή των TUNEL+ κυττάρων στον dlgn επίµυος που είχε υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ7 και θυσιάστηκε τη ΜΒ1(Α), συγκριτικά µε µάρτυρα ίδιας ηλικίας (Β) Ράβδος = 100µm. Η αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ14 προκάλεσε µικρή αύξηση στην πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων στον ετεροπλάγιο dlgn τη ΜΒ1 (Εικόνα 10), ενώ τη ΜΒ7, τη ΜΒ14 και τη ΜΒ60 δεν παρατηρήθηκαν αποπτωτικά κύτταρα (Πίνακας 6). Στο ιάγραµµα 3 φαίνεται η σύγκριση της πυκνότητας των ΤUNEL+ κυττάρων ανά τοµή στον dlgn επιµύων που είχαν υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0, τη Μ7 και τη Μ14. Σε όλες τις οµάδες πειραµατοζώων, η πυκνότητα των αποπτωτικών κυττάρων εµφάνιζε µέγιστη τιµή τη ΜΒ1. Ωστόσο, η πυκνότητα των αποπτωτικών 95

106 Αποτελέσµατα κυττάρων τη ΜΒ1 ήταν αντιστρόφως ανάλογη της ηλικίας στην οποία πραγµατοποιήθηκε η βλάβη. Επιπλέον, αντιστρόφως ανάλογη είναι η σχέση µεταξύ της πυκνότητας των αποπτωτικών κυττάρων και της ηλικίας µετά τη βλάβη στην οποία εξετάστηκαν τα πειραµατόζωα. Α Β Εικόνα 10. Μικροφωτογραφίες στις οποίες φαίνεται η τοπογραφική κατανοµή των TUNEL+ κυττάρων στον dlgn επίµυος που είχε υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ14 και θυσιάστηκε τη ΜΒ1(A), συγκριτικά µε µάρτυρα ίδιας ηλικίας (B). Ράβδος = 200µm. Πίνακας 6. Πυκνότητα των αποπτωτικών κυττάρων στον dlgn επιµύων µε αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού σε µεταγενέστερα στάδια της ανάπτυξης. Πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων Ηλικία Βλάβη τη Μ7 Βλάβη τη Μ14 TC/sect TC/LC TC/sect TC/LC MΒ1 8,67 ± 0,284 α 30,74 ± 0,423 α 0,58 ± 0,148 2,59 ± 0,661 MΒ7 0,33 ± 0,142 β 1,48 ± 0,632 β 0 0 MΒ MΒ ΜΒ: ηµέρα µετά τη βλάβη. TC/sect: µέσος όρος του αριθµού των TUNEL+ κυττάρων ανά τοµή, ανά 0,1 mm 2. TC/LC: µέσος όρος των λόγων των ΤUNEL+ κυττάρων ανά «ζωντανά» κύτταρα, ανά τοµή, ανά 0,1mm 2. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τους µέσους όρους ± τυπικό σφάλµα του µέσου. Οι µέσοι όροι της ίδιας στήλης µε διαφορετικό εκθέτη παρουσιάζουν στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ τους (p#0,05). 96

107 Αποτελέσµατα ιάγραµµα 3 ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ TUNEL+ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (TC/s) * ΒΛΑΒΗ ΤΗ Μ0 ΒΛΑΒΗ ΤΗ Μ7 ΒΛΑΒΗ ΤΗ Μ14 0 MB1 MB7 MB14 ΗΜΕΡΕΣ ΜΕΤΑ ΤΗ ΒΛΑΒΗ Σύγκριση της πυκνότητας των ΤUNEL+ κυττάρων στον dlgn επιµύων µετά από αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0 (λευκές στήλες), Μ7 (γκρι στήλες) και Μ14 (γραµµοσκιασµένες στήλες). Σε κάθε οµάδα πειραµατοζώων η πυκνότητα των αποπτωτικών κυττάρων εµφανίζει τη µέγιστη τιµή της τη ΜΒ1. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τους µέσους όρους ± τυπικό σφάλµα του µέσου. TC/sect: µέσος όρος του αριθµού των ΤUNEL+ κυττάρων ανά τοµή, ανά 0,1mm 2. Υπάρχει στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ των οµάδων τη ΜΒ1(*p 0,05). 2.4 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΤΩΝ «ΖΩΝΤΑΝΩΝ» ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΟΝ dlgn Προκειµένου να διερευνηθεί εάν και κατά πόσον η απώλεια των νευρώνων του dlgn µετά από την καταστροφή των προσαγωγών ινών του από τον ΑµΧ οδηγεί σε αλλαγές στον τελικό αριθµό των κυττάρων του dlgn, πραγµατοποιήθηκαν µετρήσεις του αριθµού των «ζωντανών» κυττάρων στον dlgn ενήλικων επιµύων από τους οποίους αφαιρέθηκε ο βολβός του οφθαλµού σε διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης (Μ0, Μ7 και Μ14). Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν ενήλικοι φυσιολογικοί επίµυες (Πίνακας 7). 97

108 Αποτελέσµατα Πίνακας 7. Πυκνότητα των «ζωντανών» νευρώνων στον dlgn φυσιολογικών επιµύων και επιµύων που είχαν υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού σε διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης. Πειραματική Ομάδα Μάρτυρες Βλάβη τη Μ0 Βλάβη τη Μ7 Βλάβη τη Μ14 LC 146,50 ± 2,294 α 149,42 ± 4,316 α 151,92 ± 4,088 α 150,42 ± 3,136 α LC: µέσος όρος του αριθµού των «ζωντανών» κυττάρων, ανά τοµή, ανά 0,1 mm 2. Οι τιµές αντιπροσωπεύουν τους µέσους όρους ± τυπικό σφάλµα του µέσου. Οι µέσοι όροι µε ίδιο εκθέτη δεν παρουσιάζουν στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ τους (p>0,05). Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων έδειξε ότι δεν υπάρχει σηµαντική διαφορά στον αριθµό των νευρώνων του dlgn µεταξύ φυσιολογικών ενήλικων επιµύων και ενήλικων επιµύων που είχαν υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0, Μ7 και Μ ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ ΤΩΝ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Για τον προσδιορισµό του φαινοτύπου των αποπτωτικών κυττάρων στον dlgn, µετά από αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού, πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα διπλής σήµανσης στα οποία χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος TUNEL µε φθορισµό σε συνδυασµό µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού. Για την ταυτοποίηση των νευρώνων χρησιµοποιήθηκαν αντισώµατα εναντίον της πυρηνικής πρωτεΐνης NeuN και για την ταυτοποίηση των αστροκυττάρων αντισώµατα εναντίον της πρωτεΐνης GFAP. Τα πειράµατα πραγµατοποιήθηκαν σε επίµυς που είχαν υποστεί αφαίρεση του βολβού του οφθαλµού τη Μ0 και 98

109 Αποτελέσµατα θυσιάστηκαν τη ΜΒ1, ηλικία κατά την οποία παρατηρήθηκε η µέγιστη πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων. Η εξέταση των τοµών µε το µικροσκόπιο φθορισµού έδειξε ότι η πλειονότητα των TUNEL+ κυττάρων ήταν σεσηµασµένα µε το αντίσωµα εναντίον της NeuN (Εικόνα 11). TUNEL+ κύτταρα σεσηµασµένα µε το αντίσωµα εναντίον της GFAP εντοπίστηκαν σε µικρό αριθµό και ταυτοποιήθηκαν ως αστροκύτταρα (Εικόνα 12). Α Β Εικόνα 11. Μικροφωτογραφίες ανοσοφθορισµού από τον dlgn επίµυος που είχε υποστεί βλάβη του ΑµΧ τη Μ0 και θυσιάστηκε τη ΜΒ1, στις οποίες φαίνονται τα ίδια κύτταρα µε πυρήνες σεσηµασµένους µε τη µέθοδο TUNEL (Α) και µε αντισώµατα εναντίον της NeuN (Β). Ράβδος = 20µm. 99

110 Αποτελέσµατα Α Β Γ Εικόνα 12. Μικροφωτογραφίες από συνεστιακό µικροσκόπιο από τον dlgn επίµυος που είχε υποστεί βλάβη του ΑµΧ τη Μ0 και θυσιάστηκε τη ΜΒ1, στις οποίες φαίνονται κύτταρα σεσηµασµένα µε τη µέθοδο TUNEL (Α) και µε αντισώµατα εναντίον της GFAP (Β). Η συνεστιακή απεικόνιση των Α και Β αποκαλύπτει ότι ένας µικρός αριθµός TUNEL+ κυττάρων είναι σεσηµασµένος µε το αντίσωµα GFAP (βέλη) (Γ). Ράβδος = 100µm. 100

111 Αποτελέσµατα 3. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΒΛΑΒΗ ΤΟΥ ΦΛΟΙΟΥ ΤΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ 3.1 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΒΛΑΒΗΣ Η πρόκληση της βλάβης πραγµατοποιήθηκε µε αναρρόφηση µεγάλου τµήµατος του φλοιού του δεξιού εγκεφαλικού ηµισφαιρίου. Σε κάθε πειραµατόζωο γινόταν προσπάθεια να αφαιρεθούν όλες οι περιοχές του φλοιού που καταλαµβάνουν το οπίσθιο ηµιµόριο του ηµισφαιρίου (Σχήµα 4). Α Β Σχήµα 4: Α. Σχηµατογράφηµα της ραχιαίας όψης των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων επίµυος στο οποίο φαίνονται οι επιµέρους περιοχές του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων όπως περιγράφηκαν από τον Krieg (1946). Το σκιασµένο τµήµα στον φλοιό του δεξιού εγκεφαλικού ηµισφαιρίου δείχνει τις περιοχές οι οποίες αφαιρέθηκαν. Β. Μικροφωτογραφία εγκάρσιας τοµής εγκεφάλου επίµυος χρωµατισµένης µε τη µέθοδο Nissl στην οποία φαίνεται η περιοχή του φλοιού που αφαιρέθηκε (στικτή γραµµή, διπλό βέλος). Το µονό βέλος δείχνει τη θέση του dlgn. Η βλάβη έγινε τη Μ0 και το ζώο θυσιάστηκε τη ΜΒ3+. Η ράβδος (600 µm) αντιστοιχεί στο Β. 101

112 Αποτελέσµατα Συγκεκριµένα, οι βλάβες περιελάµβαναν την αφαίρεση ολόκληρου του ινιακού λοβού (περιοχές 17, 18, 18α) και τµηµάτων του φλοιού του κροταφικού (µερική αφαίρεση των περιοχών 41, 36) και του βρεγµατικού (µερική αφαίρεση των περιοχών 2, 39 και 7) λοβού και της έλικας του προσαγωγίου (ολική αφαίρεση της περιοχής 29c και µερική της 29b). Με τον τρόπο αυτό διασφαλιζόταν η ολική αφαίρεση του οπτικού φλοιού, ο οποίος αποτελείται από τον πρωτοταγή (περιοχή 17) και τον δευτεροταγή (περιοχές 18, 18α) οπτικό φλοιό (Krieg, 1946). Οι βλάβες εκτείνονταν σε όλες τις στιβάδες του φλοιού, στην υποκείµενη λευκή ουσία και στο µεγαλύτερο τµήµα του ιπποκάµπου. Η εκτίµηση της βλάβης σε κάθε πειραµατόζωο γινόταν µε εξέταση τοµών χρωµατισµένων µε την ιστοχηµική µέθοδο Nissl (Σχήµα 4Β). Εξετάστηκαν µόνο εγκέφαλοι που είχαν συγκρίσιµες βλάβες. Η αφαίρεση του οπτικού φλοιού είχε ως αποτέλεσµα τη διατοµή των νευραξόνων των νευρώνων του dlgn που προβάλλουν στον φλοιό, και την καταστροφή των νευρώνων της στιβάδας VI του οπτικού φλοιού που προβάλλουν στον dlgn. Η καταστροφή των συνδέσεων του dlgn µε τον οπτικό φλοιό είχε ως στόχο τη µελέτη της αποστέρησης των νευρώνων του dlgn από τους νευροτροφικούς παράγοντες που προέρχονται από τον φλοιό στην επιβίωση των κυττάρων του πυρήνα. Η αφαίρεση του οπτικού φλοιού πραγµατοποιήθηκε σε 3 διαφορετικά στάδια ανάπτυξης. 3.2 ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η απόπτωση στον dlgn του επίµυος µετά από αφαίρεση του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων στα 3 στάδια της ανάπτυξης (βλάβη τη Μ0, Μ7 και Μ14) αξιολογήθηκε ποιοτικά, µε στόχο τον προσδιορισµό του τύπου του κυτταρικού θανάτου, του 102

113 Αποτελέσµατα χρονοδιαγράµµατος που αυτή ακολουθεί και των συνολικών επιπτώσεων που έχει η αφαίρεση οπτικού φλοιού στον κυτταρικό πληθυσµό του πυρήνα. Η ποσοτική µελέτη της απόπτωσης στον dlgn δεν ήταν εφικτή λόγω της έξαρσης του κυτταρικού θανάτου και της επακόλουθης ταχείας υποπλασίας του dlgn. 3.2Α ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΒΛΑΒΗ ΤΟΥ ΦΛΟΙΟΥ ΤΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ ΤΗ Μ0 3.2Α 1 ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ - ΜΕΘΟ ΟΣ TUNEL Μετά από αφαίρεση του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων, τα αποπτωτικά κύτταρα στον οµοπλάγιο dlgn (Εικόνα 13 και 14Α) αναγνωρίστηκαν από την επιλεκτική και έντονη χρώση του πυρήνα τους και εµφάνιζαν τα τυπικά µορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης (βλ. Αποτελέσµατα, Κεφ. 1.1Α 1 ). Στις ηλικίες στις οποίες παρατηρήθηκαν σεσηµασµένα κύτταρα, η κατανοµή τους ήταν οµοιογενής σε όλη την έκταση του πυρήνα. Μετά από αφαίρεση του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων τη Μ0 παρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση της απόπτωσης στον οµοπλάγιο dlgn, η οποία ξεκινούσε τη ΜΒ1 και σε διάστηµα τριών ηµερών οδηγούσε στην απώλεια περίπου του 90% των κυττάρων του dlgn. Στο διάστηµα αυτό, η απόπτωση ήταν µαζική και είχε ως αποτέλεσµα την υποπλασία του πυρήνα έως το τέλος της πρώτης µεταγεννητικής εβδοµάδας. Η παρατήρηση της εντυπωσιακής και ταχείας ολοκλήρωσης του φαινοµένου οδήγησε στη µελέτη της απόπτωσης στον dlgn σε στάδια της ανάπτυξης που απείχαν µόνο µερικές ώρες µεταξύ τους. Αναλυτικά, σε διάστηµα από 4 έως 12 ώρες µετά τη βλάβη (ΜΒ1 ) δεν παρατηρήθηκαν αποπτωτικά κύτταρα στον dlgn, ενώ σε διάστηµα µεταξύ 13 και 24 ωρών µετά τη βλάβη (ΜΒ1+), σηµειώθηκε σηµαντική 103

114 Αποτελέσµατα αύξηση της πυκνότητας των TUNEL+ κυττάρων. Στα κύτταρα αυτά, οι σεσηµασµένοι πυρήνες εµφάνιζαν, στην πλειονότητά τους, τυπική µορφολογία αρχικών σταδίων της απόπτωσης, µε το προϊόν σήµανσης να εντοπίζεται στην περιφέρεια του πυρήνα και το κέντρο να είναι σχετικά διαυγές. Μαζική αύξηση του αριθµού των TUNEL+ κυττάρων στον dlgn σηµειώθηκε ώρες µετά τη βλάβη (ΜΒ3 ). Η µορφολογία της πλειονότητας των κυττάρων αυτών ήταν αντιπροσωπευτική µεταγενέστερων και τελικών σταδίων της απόπτωσης, µε πυκνωτικό πυρήνα που εµφάνιζε οµοιογενή διάχυτο χρωµατισµό. Μικρή µείωση της πυκνότητας των TUNEL+ κυττάρων και ταυτόχρονη µείωση του µεγέθους του dlgn παρατηρήθηκε ώρες µετά τη βλάβη (ΜΒ3+). Ο µαζικός κυτταρικός θάνατος οδήγησε στη βαθµιαία υποπλασία του dlgn µέχρι τη ΜΒ7 (Εικόνα 13). Στην ηλικία αυτή ήταν σπάνιος ο εντοπισµός TUNEL+ κυττάρων, ενώ σε µεταγενέστερες ηλικίες που µελετήθηκαν (ΜΒ14, ΜΒ21 και ΜΒ60) δεν βρέθηκαν αποπτωτικά κύτταρα. Αξιοσηµείωτη είναι η παρατήρηση ότι η συγκεκριµένη βλάβη του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων προκάλεσε εκτεταµένη απώλεια κυττάρων που οδηγούσε σε υποπλασία και σε άλλους πυρήνες του θαλάµου οι οποίοι συνδέονται µε την περιοχή που αφαιρέθηκε, παραδείγµατος χάριν του οπίσθιου κοιλιακού πυρήνα. Αντίθετα, η βλάβη δεν προκάλεσε αύξηση του κυτταρικού θανάτου και δεν επηρέασε το µέγεθος πυρήνων του θαλάµου που δεν προβάλλουν στον οπτικό φλοιό του δεξιού εγκεφαλικού ηµισφαιρίου, παραδείγµατος χάριν του οµοπλάγιου vlgn και του ετεροπλάγιου dlgn. 104

115 Αποτελέσµατα Α Β Γ Εικόνα 13. Μικροφωτογραφίες στις οποίες φαίνεται η τοπογραφική κατανοµή των TUNEL+ κυττάρων στον dlgn επιµύων που είχαν υποστεί βλαβη του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων την Μ0 και θυσιάστηκαν στις ηλικίες ΜΒ1+(Α), ΜΒ3 (Β), ΜΒ3+ (Γ) και ΜΒ7( ). Στη, τα βέλη δείχνουν τα όρια του συρρικνωµένου dlgn. Ράβδος = 100µm. 3.2Α 1 ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΟΠΤΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ - ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΚΑΣΠΑΣΗΣ -3 Η ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 πραγµατοποιήθηκε ανοσοϊστοχηµικά σε επίµυς που είχαν υποστεί αφαίρεση του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων τη Μ0 και θυσιάστηκαν τη ΜΒ1+, ηλικία κατά την οποία η πλειονότητα των TUNEL+ κυττάρων εµφάνιζε τυπική µορφολογία που χαρακτηρίζει τα αρχικά στάδια της απόπτωσης. Η ηλικία αυτή επιλέχθηκε ως η πλέον κατάλληλη για την ανοσοϊστοχηµική αυτή µελέτη, διότι σύµφωνα µε τα βιβλιογραφικά δεδοµένα η 105

116 Αποτελέσµατα ενεργοποίηση της κασπάσης-3 πραγµατοποιείται σε αρχικά στάδια της απόπτωσης (Stadelmann και Lassmann, 2000). Κατά τη µελέτη των τοµών παρατηρήθηκαν κασπάση-3+ κύτταρα σε όλη την έκταση του dlgn στα κύτταρα αυτά το προϊόν σήµανσης ήταν εντοπισµένο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασµά τους (Εικόνα 14Β). Α Β Εικόνα 14. Μικροφωτογραφίες στις οποίες φαίνεται η τοπογραφική κατανοµή των σεσηµασµένων κυττάρων µε τη µέθοδο TUNEL (Α) και µε την ανοσοϊστοχηµική µέθοδο για την ανίχνευση της ενεργοποιηµένης κασπάσης-3 (Β) από τον dlgn επίµυος που είχε υποστεί βλάβη του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων τη Μ0 και θυσιάστηκε τη ΜΒ1+. Ράβδος = 100 µm. 3.2Α 2 ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΕ ΤΟ ΗΛΕΚΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Η συλλογή του υλικού έγινε από επίµυς που είχαν υποστεί βλάβη του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων τη Μ0 και θυσιάστηκαν τη ΜΒ3, ηλικία κατά την οποία παρατηρήθηκε η µέγιστη πυκνότητα των TUNEL+ κυττάρων. Η εξέταση του υλικού µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο επιβεβαίωσε ότι στον dlgn τα κύτταρα που είχαν πυκνωτικό πυρήνα παρουσίαζαν όλα τα τυπικά µορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης. Η συντριπτική πλειονότητα των κυττάρων αυτών εµφάνιζε πυκνωτικό πυρήνα µε οµοιογενή διάχυτο 106

117 Αποτελέσµατα χρωµατισµό, χαρακτηριστικά που είναι αντιπροσωπευτικά µεταγενέστερων και τελικών σταδίων της απόπτωσης (Εικόνα 15). Ν Α Β ΝΓ Γ Ν Εικόνα 15: Μικροηλεκτρονιογραφίες στις οποίες φαίνονται κύτταρα µε χαρακτηριστική αποπτωτική µορφολογία από τον dlgn επίµυος που είχε υποστεί βλάβη του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων την Μ0 και θυσιάστηκε την ΜΒ3. Στην Α φαίνονται δύο αποπτωτικά κύτταρα (βέλη). Το αποπτωτικό κύτταρο που βρίσκεται αριστερά εµφανίζει πυκνωτικό πυρήνα. Στη Β φαίνεται ένα αποπτωτικό κύτταρο µε πυκνωτικό πυρήνα και συµπυκνωµένο κυτταρόπλασµα. ίπλα στο αποπτωτικό αυτό κύτταρο ξεχωρίζει ο πυρήνας ενός «ζωντανού» νευρώνα (Ν). Στη Γ ένα αποπτωτικό κύτταρο (βέλος) και ένα αποπτωτικό σωµάτιο (διπλό βέλος) είναι εγκολπωµένα από ένα µικρονευρογλοιακό κύτταρο (ΝΓ). Στη ο πυκνωτικός πυρήνας (µαύρο βέλος) περιβάλλεται από αποφυάδες µικρονευρογλοιακής προέλευσης (λευκά βέλη). Ράβδος = 1,15µm. 107

118 Αποτελέσµατα 3.2Β ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΣΤΟΝ dlgn ΕΠΙΜΥΩΝ ΠΟΥ ΕΙΧΑΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΒΛΑΒΗ ΤΟΥ ΦΛΟΙΟΥ ΤΩΝ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΩΝ ΗΜΙΣΦΑΙΡΙΩΝ ΣΕ ΜΕΤΑΓΕΝΕΣΤΕΡΑ ΣΤΑ ΙΑ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Η αφαίρεση του οπτικού φλοιού τη Μ7 και τη Μ14 προκάλεσε τη σηµαντική αύξηση του αριθµού των TUNEL+ κυττάρων στον οµοπλάγιο dlgn την ΜΒ1 και την επακόλουθη µείωση του µεγέθους του dlgn έως την ΜΒ7 (Εικόνα 16). Αποπτωτικά κύτταρα δεν βρέθηκαν σε µεταγενέστερες ηλικίες που µελετήθηκαν (ΜΒ14, ΜΒ21 και ΜΒ60). Α Β Γ Εικόνα 16. Μικροφωτογραφίες στις οποίες φαίνεται η τοπογραφική κατανοµή των TUNEL+ κυττάρων στον dlgn επιµύων που είχαν υποστεί βλαβη του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων τη Μ7(Α, Γ) και τη Μ14 (Β, ) και θυσιάστηκαν στις ηλικίες ΜΒ1(Α, Β),και ΜΒ7(Γ, ). Τα βέλη δείχνουν τα όρια του dlgn. Και στις δύο περιπτώσεις σηµειώνεται σηµαντική αύξηση των αποπτωτικών κυττάρων τη ΜΒ1 και σηµαντική συρρίκνωση του dlgn τη ΜΒ7. Ράβδος = 100µm. 108