ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΝΟΣ ΝΕΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΣΗΣ ΣΕ ΙΑΓΟΝΙ ΙΑΚΑ ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΠΟΥ ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΗ RANKL

ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΚΕΝΤΡΟ ΒΙΟΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ «ΑΛΕΞΑΝ ΡΟΣ ΦΛΕΜΙΓΚ» ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΕΤΟΥΣ 2010 ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΝΟΣ ΝΕΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΣΗΣ ΣΕ ΙΑΓΟΝΙ ΙΑΚΑ ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΠΟΥ ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΗ RANKL Επιβλέπων: Ελένη Ντούνη Μέλη οµάδας: Αλεξάνδρα Νίτη Ευάγγελος Ρηνώτας ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΜΕΛΕΤΗΣ ΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2010

ΤΙΤΛΟΣ ΕΡΓΟΥ: ηµιουργία και ανάλυση ενός νέου γενετικού µοντέλου οστεοπόρωσης σε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν την κυτταροκίνη RANKL Περίληψη Η πρωτεΐνη RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κβ Ligand) αποτελεί τον κύριο µεσολαβητή στην οστική απορρόφηση επάγοντας την δηµιουργία οστεοκλαστών. Η υπερπαραγωγή RANKL έχει συσχετιστεί µε οστεολυτικές ασθένειες όπως η οστεοπόρωση και η ρευµατοειδής αρθρίτιδα, ενώ η αναστολή του σε κλινικό επίπεδο παρεµποδίζει αποτελεσµατικά την οστική απώλεια και τα κατάγµατα σε ασθενείς µε οστεοπόρωση. Παρόλα αυτά, δεν υπάρχει ένα ζωικό µοντέλο υπερέκφρασης του ανθρώπινου RANKL για την άµεση δοκιµή νέων αναστολέων του σε προκλινικό επίπεδο. Χρησιµοποιώντας τεχνολογίες αιχµής δηµιουργήσαµε πρόσφατα διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν τον RANKL του ανθρώπου µε σκοπό την µοντελοποίηση της οστικής απώλειας, την µελέτη των παθογενετικών µηχανισµών της επαγόµενης παθολογίας, και την θεραπευτική αντιµετώπισή της. Στα πλαίσια της παρούσας µελέτης αναλύθηκαν τα νέα γενετικά µοντέλα οστεοπόρωσης που προέκυψαν από την υπερέκφραση του RANKL. Η διαγονιδιακή σειρά Tg5516 µε χαµηλή έκφραση εµφάνισε ήπια οστεοπόρωση µε οστική απώλεια στο σπογγώδες και µειωµένη οστική αντοχή σε ηλικία 3 µηνών. Πιο έντονη οστεοπόρωση εκδηλώθηκε στη διαγονιδιακή σειρά Tg5519 που είχε υψηλή έκφραση διαγονιδικού RANKL και χαρακτηριζόταν από σοβαρή οστική απώλεια στο σπογγώδες, πορώδη δοµή στην φλοιώδη µοίρα του οστού και µειωµένη οστική αντοχή σε ηλικία 3 µηνών και στα δύο φύλα. Παρατηρήθηκε επίσης έντονη αύξηση του αριθµού των οστεοκλαστών στο φλοιώδες και των βιοχηµικών δεικτών οστικής απώλειας αλλά και αυξηµένη οστική παραγωγή µε σηµαντική αύξηση των επιπέδων της αλκαλικής φωσφατάσης του ορού. Ο πιο σοβαρός φαινότυπος εµφανίστηκε στον ιδρυτή σειράς Tg5520 που είχε υψηλή έκφραση και χαρακτηριζόταν από σοβαρή απώλεια στο σπογγώδες, πορώδη υφή στο φλοιό και κατάγµατα ενώ δεν έδωσε απογόνους. Ανάλυση της έκφρασης του RANKL διαγονιδίου έδειξε ότι σχετίζεται άµεσα µε την σοβαρότητα της επαγόµενης οστικής απώλειας. Τέλος, µελετήθηκε η επίδραση ενός γνωστού αντι-οστεοπορωτικού φαρµάκου, της αλενδρονάτης, στην πορεία της νόσου στα RANKL διαγονιδιακά µοντέλα όπου φάνηκε ότι η χορήγησή της σε δοσολογία 0.5mg/kg εβδοµαδιαίως ήταν αποτελεσµατική για την αναστολή της οστεοπόρωσης στο διαγονιδιακό µοντέλο ήπιας οστεοπόρωσης Tg5516 και µερικώς αποτελεσµατική στο µοντέλο σοβαρής οστεοπόρωσης Tg5519. Συνοπτικά, τα αποτελέσµατά µας αναδεικνύουν την δηµιουργία νέων γενετικών µοντέλων οστεοπόρωσης που επάγονται από την υπερέκφραση του RANKL. Τα µοναδικά αυτά διαγονιδιακά µοντέλα που υπερεκφράζουν RANKL αποτελούν χρήσιµα

εργαλεία για την µελέτη των παθογενετικών µηχανισµών που εµπλέκονται στην οστεοπόρωση και για την αξιολόγηση νέων αναστολέων έναντι του ανθρώπινου RANKL αλλά και γενικότερα αναστολέων που στοχεύουν την οστεοκλαστική δραστηριότητα, σε προκλινικό επίπεδο. Λεπτοµερής περιγραφή πορείας υλοποίησης έργου Χρησιµοποιώντας τεχνολογίες αιχµής, δηµιουργήσαµε πρόσφατα στο εργαστήριό µας 5 ανεξάρτητες σειρές διαγονιδιακών ποντικιών που φέρουν το ανθρώπινο RANKL γονίδιο (TghuRANKL) ώστε να αναπαράγουµε και να µελετήσουµε τις παθολογίες που επάγονται από υπερέκφραση του RANKL in vivo. Για να επιτύχουµε ένα σωστό πρότυπο έκφρασης του ανθρώπινου RANKL στο ποντίκι, ως διαγονίδιο χρησιµοποιήθηκε ένα γενωµικό τµήµα µεγέθους 200kb που περιείχε ολόκληρο το ανθρώπινο RANKL γονίδιο. Η ταυτοποίηση των διαγονιδιακών ποντικιών που φέρουν στο γονιδίωµά τους το γονίδιο του RANKL του ανθρώπου πραγµατοποιήθηκε µε την µέθοδο υβριδοποίησης Southern blot σε DNA. Συνολικά γεννήθηκαν 21 ποντίκια τα οποία και ελέγχθηκαν για την παρουσία του διαγονιδίου hurankl. Ανιχνεύθηκαν έτσι, 5 ανεξάρτητες σειρές διαγονιδιακών ποντικών TghuRANKL οι Tg5516, Tg5519, Tg5520, Tg5521, και Τg5528 σε καθεµία από τις οποίες υπάρχει διαφορετική θέση ενσωµάτωσης του hurankl διαγονιδίου στο γονιδίωµα του ποντικού. Μελετώντας τις αυτοραδιογραφίες του Southern blot διαπιστώθηκε έντονο σήµα στις σειρές Tg5519, Tg5520, Tg5521, µικρότερο σήµα στην σειρά Tg5516 και χαµηλό σήµα στη σειρά Tg5528. Κάθε ένα από τα αρχικά 5 διαγονιδιακά ποντίκια που ταυτοποιήθηκαν αποτέλεσε τον «ιδρυτή» (founder) της κάθε διαγονιδιακής σειράς που στη συνέχεια διασταυρώθηκε µε καθαρόαιµα φυσικού τύπου ποντίκια C57ΒL/6J, για την δηµιουργία διαγονιδιακών απογόνων. Σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν η ποσοτικοποίηση της έκφρασης του ανθρώπινου RANKL σε κάθε µια από τις διαφορετικές διαγονιδιακές σειρές και η συσχέτισή της µε την επαγόµενη οστική απώλεια µε άµεσο στόχο την καθιέρωση νέων γενετικών µοντέλων οστεοπόρωσης επαγόµενων από την υπερέκφραση του RANKL. Τα διαγονιδιακά αυτά ποντίκια αποτελούν ιδανικά εργαλεία για την µελέτη των µηχανισµών που εµπλέκονται στην οστική απορρόφηση καθώς και τις προκλινικές δοκιµές νέων φαρµακευτικών ουσιών που στοχεύουν ασθένειες µε οστική απώλεια όπως η οστεοπόρωση. Συγκεκριµένα, οι πειραµατικές εργασίες που πραγµατοποιήθηκαν ανά φάση της µελέτης περιγράφονται περιληπτικά παρακάτω.

Φάση 1. Ανάλυση έκφρασης στα TghuRANKL ποντίκια Το πρότυπο έκφρασης του ανθρώπινου RANKL µελετήθηκε σε διάφορους ιστούς των διαφορετικών TghuRANKL διαγονιδιακών σειρών, τόσο σε επίπεδο mrna όσο και πρωτεΐνης. Η ανάλυση αυτή επέτρεψε α) την κατάταξη των 5 διαγονιδιακών σειρών σε σχέση µε τα επίπεδα έκφρασης του ανθρώπινου RANKL και β) την σύγκριση µεταξύ του προτύπου έκφρασης του RANKL διαγονιδίου και του ενδογενή RANKL (murankl) σε διάφορους ιστούς. Πρότυπο έκφρασης: Καθεµία από τις 5 ανεξάρτητες σειρές των διαγονιδιακών ποντικών TghuRANKL ελέγχθηκε για την έκφραση του διαγονιδίου σε διάφορους ιστούς. Πιο συγκεκριµένα, έγινε αποµόνωση RNA από το σπλήνα και τα µακρά οστά και ακολούθησε η ανάλυση της µεταγραφικής ενεργότητας του διαγονιδίου µε PCR αφού πρώτα παράχθηκε cdna µε την µέθοδο της αντίστροφης µεταγραφάσης (RT-PCR). Εικόνα 1. Ανάλυση της έκφρασης του hurankl σε µεταγραφικό επίπεδο στα µακρά οστά και στον σπλήνα στις 5 διαγονιδιακές σειρές. Β2Μ: ενδογενές γονίδιο β2-µικροσφαιρίνης. Η ανάλυση της έκφρασης του διαγονιδίου hurankl σε µεταγραφικό επίπεδο (Εικ. 1) έδειξε υψηλή έκφραση του διαγονιδίου στη σειρά Tg5520 ενώ ακολουθεί η σειρά Tg5519 και η Τg5516. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε έκφραση στις σειρές Tg5521 και Tg5528 οπότε δεν µελετήθηκαν περαιτέρω (Παραδοτέο 1). Επίσης πραγµατοποιήθηκε σύγκριση µε το πρότυπο έκφρασης του ενδογενούς RANKL γονιδίου σε διάφορους ιστούς των σειρών Tg5516, Tg5519 και Tg5520 (Παραδοτέο 2) (Εικ. 2).

Εικόνα 2. Σύγκριση του προτύπου έκφρασης του RANKL διαγονιδίου (hurankl) σε σχέση µε το αντίστοιχο του ενδογενούς RANKL (murankl) σε διάφορους ιστούς (T:θύµος, L:ήπαρ, S:σπλήνας, B;οστά, Br:εγκέφαλος, K:νεφρός, H:καρδιά) των διαγονιδιακών σειρών Tg5516, Tg5519 και Tg5520. Β2Μ: ενδογενές γονίδιο β2-µικροσφαιρίνης. Ανίχνευση hurankl πρωτεΐνης: Τα επίπεδα του διαλυτού ανθρώπινου RANKL προσδιορίστηκαν στον ορό διαγονιδιακών ή φυσικού τύπου ποντικιών µε την δοκιµή Luminex χρησιµοποιώντας το human RANKL single plex kit (Millipore) που αποτελεί την πιο ευαίσθητη διαθέσιµη δοκιµή. Στην σειρά Tg5516 τα επίπεδα του διαλυτού RANKL στον ορό είναι 6,26pg/ml (n=11 ποντίκια) τιµή που βρίσκεται πολύ κοντά στο κατώτατο ανιχνεύσιµο όριο της δοκιµής (4.88 pg/ml). Αντίθετα, στην σειρά Tg5519 τα επίπεδα του διαλυτού ανθρώπινου RANKL στον ορό είναι δραµατικά αυξηµένα µε µέσο όρο τα 1065 pg/ml (n=11 ποντίκια). Επίσης, η συγκέντρωση του διαλυτού RANKL στον ορό του ιδρυτή σειράς Tg5520 ανιχνεύθηκε στα 1003 pg/ml. Τέλος, στον ορό των φυσικού τύπου ποντικιών οι τιµές για τον ανθρώπινο RANKL ήταν όπως αναµενόταν αρνητικές (Παραδοτέο 1). Για την ανίχνευση της διαµεµβρανικής µορφής της RANKL πρωτεΐνης πραγµατοποιήθηκε κυτταροµετρία ροής σε υποπληθυσµούς λευκοκυττάρων των διαγονιδιακών σειρών Tg5516 (µικρός αριθµός αντιγράφων - χαµηλή έκφραση) και Tg5519 (µεγάλος αριθµός αντιγράφων µέτρια έκφραση). Τα αποτελέσµατά µας έδειξαν ότι σε κατάσταση ηρεµίας τα λευκοκύτταρα (Τ, Β λεµφοκύτταρα, µονοκύτταρα, πολυµορφοπύρηνα) δεν έχουν ανιχνεύσιµα επίπεδα διαµεµβρανικού RANKL στην κυτταρική τους µεµβράνη. Επίσης, πραγµατοποιήθηκε western blot σε εκχυλίσµατα διαφόρων κυτταρικών τύπων για την ανίχνευση της ανθρώπινης RANKL πρωτεΐνης αλλά το αντίσωµα που χρησιµοποιήθηκε δεν µπόρεσε να διακρίνει την ανθρώπινη RANKL πρωτεΐνη από αυτή του ποντικού. Αυτό οφείλεται στην µεγάλη οµολογία του RANKL ανάµεσα στα δύο είδη οπότε τα διαθέσιµα αντισώµατα που κυκλοφορούν για western blots προσδένονται και στις δύο πρωτεΐνες.

Συνολικά, τα αποτελέσµατα της ανάλυσης του ανθρώπινου RANKL σε επίπεδο mrna και πρωτεΐνης επέτρεψαν την ταξινόµηση των TghuRANKL διαγονιδιακών σειρών σύµφωνα µε τα επίπεδα έκφρασής του. Συγκεκριµένα, η σειρά Tg5516 έχει χαµηλά επίπεδα έκφρασης, ακολουθεί η σειρά Tg5519 µε πολύ αυξηµένα επίπεδα έκφρασης και η σειρά Tg5520 µε επίσης ιδιαίτερα αυξηµένα επίπεδα έκφρασης. Οι σειρές Tg5521 και Tg5528 δεν εκφράζουν το ανθρώπινο RANKL διαγονίδιο (Παραδοτέο 1). Σε επίπεδο mrna πραγµατοποιήθηκε σύγκριση του διαγονιδίου µε το πρότυπο έκφρασης του ενδογενούς RANKL γονιδίου σε διάφορους ιστούς των σειρών Tg5516, Tg5519 και Tg5520 και διαπιστώθηκε παρόµοιο πρότυπο έκφρασης (Παραδοτέο 2). Παραδοτέα Φάσης 1: Παραδ. 1: Ταξινόµηση των 5 TghuRANKL διαγονιδιακών σειρών σύµφωνα µε τα επίπεδα έκφρασής τους Παραδ. 2: Συγκριτική ανάλυση του προτύπου έκφρασης (επίπεδα, ιστοειδικότητα) µεταξύ του ανθρώπινου RANKL και του ενδογενούς RANKL Φάση 2. Φαινοτυπική ανάλυση Στα πλαίσια της παρούσας µελέτης πραγµατοποιήθηκε ποσοτική εκτίµηση της οστικής απώλειας στις TghuRANKL διαγονιδιακές σειρές Tg5516, Tg5519, Tg5520, Tg5521 και Tg5528. Από τις διαγονιδιακές αυτές σειρές το ενδιαφέρον επικεντρώθηκε στις Tg5516, Tg5519 και Tg5520 οι οποίες εµφάνισαν οστική απώλεια. Περιληπτικά πραγµατοποιήθηκαν οι εξής διαδικασίες φαινοτυπικής ανάλυσης: Ιστοπαθολογική ανάλυση: Στα µακρά οστά (µηριαίο, κνηµιαίο) των διαγονιδιακών σειρών Tg5516, Tg5519 και Tg5520, έγινε µονιµοποίηση, απασβέστωση και έγκλιση σε παραφίνη. Οι τοµές των οστών βάφτηκαν µε αιµατοξυλίνη/ηωσίνη για ιστολογική παρατήρηση, ενώ η χρώση µε TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) επέτρεψε τον εντοπισµό των οστεοκλαστών (6 ποντίκια ανά οµάδα). Βιοχηµικοί δείκτες στον ορό: Προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις βιοχηµικών δεικτών οστικής απώλειας στον ορό ποντικιών ηλικίας 3 µηνών όπως του ασβεστίου, φωσφόρου και TRACP5b (tartrate-resistant acid phosphatase form 5b). Επίσης, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της αλκαλικής φωσφατάσης που αποτελεί δείκτη οστικής παραγωγής. Παράλληλα, πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός µιας σειράς από βιοχηµικούς δείκτες όπως γλυκόζη, κρεατινίνη, ασπαρτική τρανσαµινάση (SGOT-AST), τρανσαµινάση της αλανίνης (SGPT-ALT), ουρία, ολικές πρωτεΐνες, όξινη φωσφατάση, ολική χολερυθρίνη και χοληστερίνη (6 ποντίκια ανά οµάδα).

Οστική µέτρηση: Πραγµατοποιήθηκε ποσοτική εκτίµηση στις διαγονιδιακές σειρές Tg5516, Tg5519 µε microct (µικρο-υπολογιστική τοµογραφία), κάτι που δεν ήταν δυνατόν να επιτευχθεί στην σειρά Tg5520 γιατί δεν έδωσε ποτέ απογόνους λόγω του σοβαρού οστεοπορωτικού φαινοτύπου (6 ποντίκια ανά οµάδα). Κυτταροµετρία ροής: Πραγµατοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισµός των λευκοκυτταρικών υποπληθυσµών (Τ, Β λεµφοκύτταρα, µονοκύτταρα, πολυµορφοπύρηνα) σε θύµο και σπλήνα, µε ειδικά αντισώµατα χρησιµοποιώντας κυτταροµετρία ροής (3 ποντίκια ανά οµάδα). Αιµατολογικές εξετάσεις: Έγινε γενική αίµατος για να προσδιοριστούν οι διάφοροι κυτταρικού υποπληθυσµοί όπως λευκοκύτταρα, ερυθρά αιµοσφαίρια και αιµοπετάλια σε διαγονιδιακά και φυσικού τύπου ποντίκια ηλικίας 3 µηνών (6 ποντίκια ανά οµάδα). Συνοπτικά, η ανάλυση των 3 διαγονιδιακών σειρών µε τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης έδειξε τα παρακάτω αποτελέσµατα: ιαγονιδιακή σειρά Tg5516: Η σειρά αυτή φέρει µικρό αριθµό αντιγράφων του RANKL διαγονιδίου και έχει χαµηλά επίπεδα έκφρασης του ανθρώπινου RANKL. Κλινικά, οι απόγονοι της διαγονιδιακής αυτής σειράς δεν διαφέρουν από τα φυσικού τύπου ποντίκια. Η ιστολογική ανάλυση των οστών έδειξε αυξηµένη οστική απώλεια στο σπογγώδες σε απογόνους της σειράς ηλικίας 3 µηνών (Εικ. 3). Αν και δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στην δοµή του φλοιώδους οστού εντούτοις αποκαλύφθηκε ότι τα µακρά οστά της σειράς Tg5516 είναι λιγότερο ανθεκτικά σε µηχανικές πιέσεις. Τα αποτελέσµατα αυτά επιβεβαιώθηκαν σε ανάλυση microct (Εικ. 4) (Παραδοτέο 3). Η ανάλυση των Tg5516 ποντικιών δεν έδειξε κάποια διαφορά σε σχέση µε τα φυσικού τύπου ποντίκια όσον αφορά τους βιοχηµικούς δείκτες, και τους διάφορους υποπληθυσµούς σε θύµο, σπλήνα και αίµα. Εικόνα 3. Χρώση αιµατοξυλίνης/ηωσίνης στο µηριαίο οστούν δείχνει την ύπαρξη αυξηµένης οστικής απώλειας στο σπογγώδες Tg5516 ποντικιών σε σχέση µε τα φυσιολογικά ποντίκια (WT).

Εικόνα 4. Ποσοτική εκτίµηση της οστικής απώλειας στο σπογγώδες των Tg5516 ποντικιών µε microct. ιαγονιδιακή σειρά Tg5519: Η διαγονιδιακή σειρά Tg5519 φέρει µεγάλο αριθµό αντιγράφων του hurankl διαγονιδίου και έχει υψηλά επίπεδα έκφρασης του ανθρώπινου RANKL. Κλινικά, οι απόγονοι της διαγονιδιακής αυτής σειράς δεν διαφέρουν από τα φυσικού τύπου ποντίκια. Η ιστολογική ανάλυση των οστών έδειξε σοβαρή οστική απώλεια στο σπογγώδες και έντονη οστική απώλεια στο φλοιώδες οστούν που έχει αποκτήσει πορώδη δοµή (cortical porosity) σε ποντίκια ηλικίας 3 µηνών (Εικ. 5). Αυτό οφείλεται στην ύπαρξη πολυάριθµων και µεγάλων οστεοκλαστών όπως προκύπτει από την χρώση µε TRAP (Εικ. 5) κάτι που αντανακλάται από την δραµατική αύξηση των βιοχηµικών δεικτών της οστικής απώλειας όπως του TRACP5b. Τα αποτελέσµατα αυτά επιβεβαιώθηκαν µε ανάλυση microct στο σπογγώδες (Εικ. 6) και στο φλοιώδες (Εικ. 7). Παράλληλα, διαπιστώθηκε αυξηµένη οστική παραγωγή και σηµαντική αύξηση των επιπέδων της αλκαλικής φωσφατάσης του ορού. Επίσης, διαπιστώθηκε µειωµένη οστική αντοχή στα Tg5519 διαγονιδιακά ποντίκια. Ο έντονος αυτός οστεοπορωτικός φαινότυπος παρατηρήθηκε και στα δύο φύλα σε απογόνους ηλικίας 3 µηνών (Παραδοτέο 3). εν παρατηρήθηκε κάποια διαφορά σε σχέση µε τα φυσικού τύπου ποντίκια όσον αφορά τους διάφορους υποπληθυσµούς σε θύµο, σπλήνα και αίµα.

Εικόνα 5. Χρώση µε αιµατοξυλίνη/ηωσίνη αποκαλύπτει την πορώδη δοµή του φλοιώδους οστού στα Tg5519 ποντίκια ενώ η χρώση TRAP αναδεικνύει την ύπαρξη γιγαντιαίων οστεοκλαστών στο φλοιώδες των ποντικιών αυτών. Εικόνα 6. Ανάλυση µε microct αναδεικνύει την χαρακτηριστική δοµή του σπογγώδους σε φυσικού τύπου (WT) ποντίκια και την καταστροφή του στην διαγονιδιακή σειρά Tg5519.

Εικόνα 7. Ποσοτική εκτίµηση της οστικής απώλειας στο φλοιώδες των Tg5519 ποντικιών (µαύρο χρώµα) σε σχέση µε τα φυσικού τύπου ποντίκια (λευκό χρώµα) µε microct. ιαγονιδιακή σειρά Tg5520: Ο ιδρυτής της διαγονιδιακής σειράς Tg5520, µε µεγάλο αριθµό αντιγράφων και την υψηλότερη έκφραση του διαγονιδίου εµφάνισε έναν σοβαρό σκελετικό φαινότυπο χαρακτηριζόµενο από έντονη κύφωση, περιορισµένη κινητικότητα και παραµόρφωση των κάτω άκρων, ένας φαινότυπος που µοιάζει µε τα κλινικά χαρακτηριστικά ασθενών που πάσχουν από οστεοπόρωση. Η συγκεκριµένη σειρά δεν µπόρεσε να αναπαραχθεί και να δώσει απογόνους. Η ιστοπαθολογική ανάλυση των µακρών οστών ανέδειξε την παρουσία µεγάλου αριθµού οστεοκλαστών και εκτεταµένη οστική καταστροφή στο φλοιώδες και στο σπογγώδες που οφείλεται σε αυξηµένη οστική απορρόφηση λόγω της παρουσίας του µεγάλου αριθµού οστεοκλαστών (Εικ. 8). Η µελέτη της αρχιτεκτονικής δοµής της σπογγώδους περιοχής του ισχίου αποκαλύπτει καταστροφή της αυξητικής πλάκας και απουσία του σπογγώδους οστού, παρουσία αυθόρµητων καταγµάτων και εµφάνιση πορώδους δοµής στο φλοιώδες (Παραδοτέο 3). Εικόνα 8. Τοµές ισχίου από διαγονιδιακά ποντίκια Tg5520 και Tg5519 µε χρώση αιµατοξυλίνηςηωσίνης. Παρατηρείται η συµπαγής δοµή του φλοιώδους στα φυσικού τύπου ποντίκια και η χαρακτηριστική πορώδης δοµή του φλοιώδους στα διαγονιδιακά ποντίκια Tg5520 και Tg5519. Συνοπτικά, δηµιουργήθηκαν δύο νέα γενετικά µοντέλα οστεοπόρωσης, το διαγονιδιακό µοντέλο Tg5516 µε ήπια οστεοπόρωση και το µοντέλο Tg5519 µε έντονη οστεοπόρωση (Παραδοτέο 3). Παραδοτέο Φάσης 2: Παραδ. 3: Καθιέρωση νέων γενετικών µοντέλων οστικής απώλειας έπειτα από ποσοτική φαινοτυπική ανάλυση στα TghuRANKL ποντίκια

Φάση 3. Προκλινικές δοκιµές Για να εξετασθεί αν τα TghuRANKL διαγονιδιακά ποντίκια αποτελούν ιδανικά εργαλεία για την αξιολόγηση (αποτελεσµατικότητα και ασφάλεια) νέων αναστολέων της οστικής απορρόφησης επιλέχθηκε η χορήγηση γνωστών φαρµάκων έναντι της οστεοπόρωσης όπως είναι τα διφωσφωνικά. Τα νεότερης γενιάς διφωσφωνικά (αµινοδιφωσφωνικά) αναστέλλουν την αυξηµένη αποδόµηση και απώλεια ασβεστίου από τα οστά που παρατηρείται σε ασθένειες µε αυξηµένη οστική απορρόφηση. Η αντιοστεοκλαστική δράση των διφωσφωνικών αφορά τις µεταβολές στην λειτουργία, την διαφοροποίηση και την απορροφητική ικανότητα των οστεοκλαστών µε τελικό στόχο την απόπτωση τους, επιβραδύνοντας τον ρυθµό της οστικής ανακατασκευής. Με τον τρόπο αυτό αυξάνεται η οστική µάζα και αντοχή και κατά συνέπεια ελαττώνονται τα οστεοπορωτικά κατάγµατα. Στην συγκεκριµένη µελέτη επιλέχθηκε η χορήγηση αλενδρονάτης (αµινοδιφωσφωνικό) τόσο στην διαγονιδιακή σειρά Tg5516 που παρουσιάζει ήπιο οστεοπορωτικό φαινότυπο όσο και στην σειρά Tg5519 που παρουσιάζει έντονο οστεοπορωτικό φαινότυπο. Τα ζώα στα οποία χορηγήθηκε η αλενδρονάτη χωρίσθηκαν σε τέσσερις οµάδες : α. Ζώα φυσικού τύπου στα οποία χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός β. Ζώα φυσικού τύπου στα οποία χορηγήθηκε αλενδρονάτη γ. ιαγονιδιακά ζώα στα οποία χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός δ. ιαγονιδιακά ζώα στα οποία χορηγήθηκε αλενδρονάτη Οι δύο πρώτες οµάδες αποτέλεσαν τις οµάδες ελέγχου. Για την σειρά Tg5516 χρησιµοποιήθηκαν 5 ποντίκια φυσικού τύπου (2 χωρίς και 3 µε αλενδρονάτη) και 6 διαγονιδιακά ποντίκια (3 χωρίς και 3 µε αλενδρονάτη) ανεξαρτήτου φύλου. Για την σειρά Tg5519 χρησιµοποιήθηκαν 16 ποντίκια αγρίου τύπου (8 χωρίς και 8 µε αλενδρονάτη ) και 16 διαγονιδιακά ποντίκια (8 χωρίς και 8 µε αλενδρονάτη). Η χορήγηση του φαρµάκου σε όλα τα ποντίκια ξεκίνησε ταυτόχρονα σε ηλικία 3 εβδοµάδων, όπου δεν υπάρχει ένδειξη οστικής απώλειας, και ολοκληρώθηκε σε ηλικία 3 µηνών, όπου και στις δύο διαγονιδιακές σειρές υπάρχει έντονη οστική απώλεια. Η δόση της αλενδρονάτης που επιλέχθηκε να χορηγηθεί ήταν 0,5 mg/kg σωµατικού βάρους ενώ χορηγήθηκε 0,9% ΝaCl (φυσιολογικός ορός) στις αντίστοιχες οµάδες ελέγχου, που αποτέλεσε και το µέσο του ενέσιµου διαλύµατος αλενδρονάτης. Επιλέχθηκε αυτή η δόση για το πρωταρχικό αυτό πείραµα γιατί έχει δειχθεί ότι είναι αποτελεσµατική σε άλλα µοντέλο οστεοπόρωσης σε ποντίκια (Ohishi et al., Am J Pathology 2009) και επίσης είναι κοντά στην συνιστώµενη εβδοµαδιαία χορήγηση σε οστεοπορωτικούς ασθενείς (περίπου 1mg/Kg). Η χορήγηση της αλενδρονάτης έγινε µε υποδόρεια ένεση, µία φορά την εβδοµάδα. Τα ενέσιµα διαλύµατα τόσο της αλενδρονάτης όσο και του φυσιολογικού ορού παρασκευάστηκαν µε βάση το σωµατικό βάρος των ζώων έτσι ώστε κάθε ζώο κατά µέσο όρο να λαµβάνει περίπου 0,5µg/g/10 µl. Μετά την

ολοκλήρωση του σχήµατος χορήγησης τα ζώα θυσιάστηκαν, έγινε αποµόνωση των µακρών οστών, µονιµοποίηση, απασβέστωση και έγκλιση σε παραφίνη. Ακολούθησαν σειριακές τοµές στις οποίες έγινε χρώση µε αιµατοξυλίνη/ηωσίνη ή TRAP για τους οστεοκλάστες και πραγµατοποιήθηκε ιστολογική ανάλυση. Τα αποτελέσµατα της ιστολογικής ανάλυσης για την σειρά Tg5516 έδειξαν ότι η αλενδρονάτη αναστέλλει την οστική απώλεια ενισχύοντας τη δοµή του σπογγώδους µε οστικές δοκίδες (Εικ. 9). Εποµένως η δοσολογία που χρησιµοποιήθηκε φαίνεται ότι είναι αποτελεσµατική για τη σειρά Tg5516 που εµφανίζει ήπιο φαινότυπο οστεοπόρωσης (Παραδοτέο 4). Στο µέλλον πρόκειται να επαναλάβουµε το πείραµα αυτό µε µεγαλύτερο αριθµό ζώων και να προχωρήσουµε σε ποσοτικοποίηση της οστικής µάζας αλλά και σε τεστ αντοχής των οστών Εικόνα 9. Χρώση τοµών µηριαίου οστού µε αιµατοξυλίνη/ηωσίνη ποντικών της διαγονιδιακής σειράς Tg5516 στα οποία χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός ή αλενδρονάτη. Στην σειρά 5519 µε τον σοβαρό φαινότυπο οστεοπόρωσης παρατηρήθηκε µια µερική δράση της αλενδρονάτης στη δοσολογία που χρησιµοποιήθηκε. Συγκεκριµένα, η δοµή του σπογγώδους εµφανίστηκε ενισχυµένη στα διαγονιδιακά ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε αλενδρονάτη. Επίσης, η αυξητική πλάκα διατηρήθηκε ατόφια σε όλο το µήκος της σε αντίθεση µε τα διαγονιδικά ποντίκια που δεν λάµβαναν αλενδρονάτη (Εικ. 10). Η αλενδρονάτη δεν φαίνεται να εξάλειψε την πορώδη δοµή της φλοιώδους µοίρας αν και παρατηρήθηκε λιγότερη κυτταροβρίθεια (Εικ. 10). (Παραδοτέο 4). Μελλοντικά πρόκειται να γίνει ποσοτικοποίηση της οστικής µάζας και τεστ αντοχής των οστών σε όλες τις οµάδες. Επίσης, πρόκειται να αξιολογηθεί η χορήγηση αλενδρονάτης σε µεγαλύτερη δόση ή πιο συχνή χορήγηση ώστε να ανασταλεί πλήρως ο οστεοπορωτικός φαινότυπος.

Εικόνα 10. Χρώση τοµών µηριαίου οστού µε αιµατοξυλίνη/ηωσίνη (H/E) ή TRAP ποντικών της διαγονιδιακής σειράς Tg5519 στα οποία χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός ή αλενδρονάτη. Συνοπτικά, η χορήγηση της αλενδρονάτης σε δοσολογία 0.5mg/kg εβδοµαδιαίως ήταν αποτελεσµατική για την αναστολή της οστεοπόρωσης στο διαγονιδιακό µοντέλο ήπιας οστεοπόρωσης Tg5516 και µερικώς αποτελεσµατική στο µοντέλο σοβαρής οστεοπόρωσης Tg5519 (Παραδοτέο 4). Παραδοτέο Φάσης 3: Παραδ. 4: Αξιολόγηση αναστολέων οστικής απορρόφησης στα TghuRANKL ποντίκια Φάση 4. ιάδοση των αποτελεσµάτων Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης έχουν συγκεντρωθεί, αξιολογηθεί και είµαστε στην φάση της συγγραφής της δηµοσίευσης και την αποστολή της σε διεθνές επιστηµονικό περιοδικό υψηλού δείκτη απήχησης εντός του 2011 (Παραδοτέο 5). Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης ανακοινώθηκαν στα εξής διεθνή συνέδρια: Niti A, Dacquin R, Rinotas V, Jurdic P, Douni E. (2010). Generation and analysis of a novel genetic model of osteoporosis: Human RANKLexpressing transgenic mice. 3 rd International Conference on Osteoimmunology: Interactions of the immune and skeletal systems. Aegean Conferences, June 20-25, Santorini. Aegean Conference Series vol.49, Abstract No 65. Niti A, Dacquin R, Rinotas V, Jurdic P, Douni E. (2010). A novel genetic model of osteoporosis by overexpression of human RANKL in transgenic

mice. 24 th International Mammalian Genome Conference. 17-21 October, Heraklion. Αυτή η ανακοίνωση βραβεύθηκε από το συνέδριο. (Παραδοτέο 6) Η παρούσα έκθεση περιέχει αδηµοσίευτα αποτελέσµατα και αποτελεί αναλυτική περιγραφή της µελέτης. Τα αποτελέσµατα πρόκειται να δηµοσιευθούν σε επιστηµονικό περιοδικό εντός του 2011 και για τον λόγο αυτό δεν επιθυµούµε τη δηµοσίευση του τελικού κειµένου στην ιστοσελίδα του Ιδρύµατος µέχρι να ολοκληρωθεί η διαδικασία της δηµοσίευσης στο περιοδικό (Παραδοτέο 7).. Παραδοτέα Φάσης 4: Παραδ. 5: Συλλογή αποτελεσµάτων, συγγραφή δηµοσίευσης Παραδ. 6: Ανακοινώσεις σε διεθνή συνέδρια Παραδ. 7: Τελική έκθεση Πρόοδος στην δηµιουργία του τελικού προΐόντος Η µελέτη µας ολοκληρώθηκε επιτυχώς εκπληρώνοντας τους αρχικούς στόχους και τα παραδοτέα και τηρώντας το χρονοδιάγραµµα. Στα πλαίσια της παρούσας µελέτης ολοκληρώθηκε ο χαρακτηρισµός νέων γενετικών µοντέλων οστεοπόρωσης που επάγονται από την υπερέκφραση ανθρώπινου RANKL σε διαγονιδιακά ποντίκια. Η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης σε συνδυασµό µε την ποσοτική εκτίµηση της οστικής απώλειας στις διαφορετικές διαγονιδιακές σειρές, επέτρεψαν την κατηγοριοποίησή τους ανάλογα µε την βαρύτητα του φαινοτύπου της οστικής απώλειας. Για παράδειγµα η διαγονιδιακή σειρά Tg5516 µε την χαµηλότερη έκφραση εµφανίζει έναν ήπιο φαινότυπο οστικής απώλειας στο σπογγώδες, η σειρά Tg5519 µε υψηλή έκφραση εκδηλώνει σοβαρή οστική απώλεια στο σπογγώδες και στο φλοιώδες, ενώ η σειρά Tg5520 µε επίσης υψηλή έκφραση, εµφανίζει σοβαρή οστική απώλεια στο σπογγώδες και στο φλοιώδες, αυξηµένη οστεοκλαστογένεση και αυθόρµητα κατάγµατα. Κάτι τέτοιο αυξάνει τις δυνατότητες επιλογής σε γενετικά µοντέλα µε ήπια ή έντονη οστεοπόρωση. Οι προκλινικές δοκιµές µε αλενδρονάτη έδειξαν ότι η οστική απώλεια παρεµποδίζεται οπότε καθιστούν τα νέα αυτά µοντέλα ιδανικά για την αξιολόγηση νέων αναστολέων έναντι του RANKL αλλά και της οστεοκλαστικής δραστηριότητας γενικότερα. Αναµένεται ότι η δηµοσιοποίηση των αποτελεσµάτων µας µέσω της επικείµενης δηµοσίευσης θα προσελκύσει το ενδιαφέρον της φαρµακοβιοµηχανίας αφενός γιατί δεν υπάρχει άλλο µοντέλο υπερέκφρασης ανθρώπινου RANKL και αφετέρου διότι µόλις πριν λίγους µήνες επιτράπηκε από το FDA η θεραπευτική αντιµετώπιση οστεοπορωτικών ασθενών µε βιολογικό παράγοντα δηλαδή αντίσωµα έναντι του RANKL. Τέλος, σε

ερευνητικό επίπεδο τα TghuRANKL διαγονιδιακά ποντίκια είναι ιδανικά εργαλεία για την κατανόηση των παθογενετικών µηχανισµών της οστεοπόρωσης και γενικότερα παθολογιών που σχετίζονται µε υπερέκφραση του RANKL. Χρονοδιάγραµµα Το χρονοδιάγραµµα ακολουθήθηκε χωρίς τροποποιήσεις. Φάση 1. Ανάλυση έκφρασης στα TghuRANKL ποντίκια (3 µήνες): Παραδ. 1: Ταξινόµηση των 5 TghuRANKL διαγονιδιακών σειρών σύµφωνα µε τα επίπεδα έκφρασής τους Παραδ. 2: Συγκριτική ανάλυση του προτύπου έκφρασης µεταξύ του ανθρώπινου RANKL και του ενδογενούς RANKL Φάση 2. Φαινοτυπική ανάλυση (9 µήνες): Παραδ. 3: Καθιέρωση νέων γενετικών µοντέλων οστικής απώλειας έπειτα από ποσοτική φαινοτυπική ανάλυση στα TghuRANKL ποντίκια Φάση 3. Προκλινικές δοκιµές (6 µήνες): Παραδ. 4: Αξιολόγηση αναστολέων οστικής απορρόφησης στα TghuRANKL ποντίκια Φάση 4. ιάδοση των αποτελεσµάτων (3 µήνες): Παραδ. 5: Συλλογή αποτελεσµάτων, συγγραφή δηµοσίευσης Παραδ. 6: Ανακοινώσεις σε διεθνή συνέδρια Παραδ. 7: Τελική έκθεση ιάρκεια (σε µήνες): 3 6 9 12 ΦΑΣΕΙΣ (συνοπτικά) Ανάλυση έκφρασης στα TghuRANKL ποντίκια Φαινοτυπική ανάλυση Προκλινικές δοκιµές ιάδοση των αποτελεσµάτων

Κατανοµή εργασιών µεταξύ των µελών της ερευνητικής οµάδας Η ρ. Ντούνη είναι επικεφαλής της ερευνητικής οµάδας και ασχολήθηκε µε τον σχεδιασµό των πειραµάτων, την κατανοµή των επιµέρους εργασιών στα µέλη της ερευνητικής οµάδας, την εκπαίδευση των µελών της οµάδας και την επίβλεψη της πειραµατικής διαδικασίας. Φρόντισε ώστε να υλοποιηθούν όλες οι φάσεις, τα παραδοτέα, το χρονοδιάγραµµα και ο οικονοµικός σχεδιασµός της παρούσας µελέτης φέροντας την ευθύνη για την άρτια διεξαγωγή της µελέτης. Επίσης, ασχολήθηκε µε τη συλλογή των αποτελεσµάτων και την συγγραφή εργασίας που θα αποσταλεί σε αναγνωρισµένο διεθνές επιστηµονικό περιοδικό µε υψηλό δείκτη απήχησης. Η κ. Νίτη είναι διδακτορική φοιτήτρια στο εργαστήριο της ρ. Ντούνη και υπότροφος του Φλέµιγκ (2009-2012) και στα πλαίσια της µεταπτυχιακής της εργασίας ασχολήθηκε µε την δηµιουργία και αρχική ανάλυση των διαγονιδιακών ποντικιών που υπερεκφράζουν τον RANKL. Στην παρούσα µελέτη ασχολήθηκε µε τα πειράµατα της ανίχνευσης της RANKL πρωτεΐνης (φάση 1), και της ανάλυσης του ανοσοποιητικού συστήµατος µε κυτταροµετρία ροής (φάση 2). Επίσης, ασχολήθηκε µε την ποσοτική ανάλυση του σκελετικού συστήµατος (φάση 2) και τις προκλινικές δοκιµές (φάση 3). Ο κ. Ρηνώτας είναι επιστηµονικός συνεργάτης στο εργαστήριο της ρ. Ντούνη εδώ και 3 χρόνια. Στην παρούσα µελέτη ασχολήθηκε µε την φύλαξη και γονοτυπική ανάλυση των διαγονιδιακών ποντικών, την ανάλυση του προτύπου έκφρασης σε επίπεδο RNA (φάση 1), την ιστολογία (φάση 2), και τις προκλινικές δοκιµές (φάση 3).

Οικονοµικά στοιχεία Ακολουθεί ο οικονοµικός απολογισµός της µελέτης. Όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα απορροφήθηκε το 100% του προϋπολογισµού. Συγκεκριµένα οι δαπάνες µέχρι 8/12/2010 έχουν ως εξής: Είδος δαπάνης Προϋπολογισµός απάνη Α. Αµοιβές 5.900 5.900 Β. απάνη συµµετοχής σε 500 500 συνέδριο. Αναλώσιµα 3.000 3.000. Κόστος διαβίωσης 600 600 ποντικιών Ε. Παρακράτηση από το 2.000 2000 Ε.ΚΕ.Β.Ε. Αλ. Φλέµιγκ ΣΥΝΟΛΟ 12.000 12.000 Οι αµοιβές αφορούν στην σύµβαση µερικής απασχόλησης του κ. Ευάγγελου Ρηνώτα, µέλους της ερευνητικής οµάδας. Ο κ. Ρηνώτας απασχολήθηκε µερικώς και σε άλλο ερευνητικό πρόγραµµα. Η δαπάνη συµµετοχής σε συνέδριο αφορά στην συµµετοχή της κ. Αλεξάνδρας Νίτη, µέλους της ερευνητικής οµάδας, στο διεθνές συνέδριο «3rd International Conference on Osteoimmunology: Interactions of the Immune and Skeletal Systems». Σαντορίνη 20-25 Ιουνίου 2010. Οι υπόλοιπες δαπάνες αφορούν σε αγορά αναλωσίµων και κόστος διαβίωσης ποντικιών. Έχουν ολοκληρωθεί όλες οι παραγγελίες και υπάρχουν όλα τα παραστατικά εκτός από ένα τιµολόγιο αξίας 325 που µόλις παραληφθεί θα προσκοµιστεί και αυτό. Ευχαριστίες Θα θέλαµε να ευχαριστήσουµε θερµά το Κοινωφελές Ιωάννη Σ. Λάτση για την επιχορήγηση της παρούσας ερευνητικής µελέτης στα πλαίσια των ερευνητικών µελετών 2010. Η επιχορήγηση αυτή έπαιξε καταλυτικό ρόλο στην επιτάχυνση της µελέτης µας και συνέβαλε καθοριστικά στην καθιέρωση των νέων µοντέλων οστεοπόρωσης που δηµιούργησε η ερευνητική µας οµάδα.