Μικροβιολογικός έλεγχος νερού Άσκηση 3η

Μικροβιολογικός έλεγχος νερού Άσκηση 3η

Θεωρητικό μέρος

Το νερό Το νερό είναι βασικό στοιχείο για τη διατήρηση ζωής στον πλανήτη µας. Τόσο το υπόγειο όσο και το επιφανειακό νερό χρησιµοποιείται για ανθρώπινη κατανάλωση. Το νερό που προορίζεται για ανθρώπινη κατανάλωση πρέπει να είναι: από κάθε άποψη αβλαβές για την υγεία των ανθρώπων οργανοληπτικά άµεµπτο και απολύτως καθαρό, απαλλαγµένο από παθογόνους µικροοργανισµούς και οποιεσδήποτε ουσίες σε συγκεντρώσεις που αποτελούν ενδεχόµενο κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία.

Μικροβιακή καταλληλότητα Η μικροβιακή καταλληλότητα του νερού ελέγχεται με την καταμέτρηση των μικροβιακών δεικτών. Οι δείκτες αυτοί είναι μικροοργανισμοί, οι οποίοι περνούν παροδικά μέσα στο υδάτινο οικοσύστημα, προερχόμενοι συνήθως από το γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου και των ζώων.

Μικροβιακοί δείκτες τα ολικά κολοβακτηριοειδή (total coliforms) μια ομάδα μικροοργανισμών στην οποία ανήκουν όλα τα αερόβια και προαιρετικά αναερόβια μη σπορογόνα κατά Gram-αρνητικά βακτήρια. Πολλαπλασιάζονται στους 36±1 C. τα κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή (faecal coliforms) τα οποία έχουν τις ίδιες ιδιότητες με τα κολοβακτηριοειδή. Αυτά μπορούν να πολλαπλασιαστούν στους 44.5±0.2 ο C. Η Escherichia coli είναι το πιο τυπικό είδος της ομάδας των κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών. Η παρουσία τους στο νερό υποδεικνύει ρύπανση κοπρανώδους προέλευσης και πιθανή παρουσία παθογόνων μικροοργανισμών. οι κοπρανώδεις σ τρεπτόκοκκοι (faecal streptococci) οι οποίοι είναι κατά Gram-θετικά βακτήρια. Αυτά μπορούν να πολλαπλασιαστούν στους 36±1 ο C. Η ομάδα αυτή αποτελείται κυρίως από ορισμένα είδη του γένους Streptococous. Η ομάδα των εντεροκόκκων (enterococci) είναι υποομάδα των κοπρανωδών στρεπτόκοκκων. Παρόλο που οι υγειονομικές διατάξεις αναφέρονται στην καταμέτρηση των κοπρανωδών στρεπτόκοκκων υπάρχουν ενδείξεις ότι στα υπάρχοντα θρεπτικά υποστρώματα αναπτύσσονται μόνο τα είδη που περιλαμβάνονται στην υποομάδα των εντεροκόκκων.

Μικροβιολογική εξέταση Η μικροβιολογική εξέταση για την εκτίμηση της καταλληλότητας του εξεταζόμενου πόσιμου νερού περιλαμβάνει 3 στάδια: 1. Σωστή δειγματοληψία. 2. Σωστή και έγκαιρη μεταφορά του δείγματος στο εργαστήριο. 3. Ανίχνευση και ποσοτικοποίηση των μικροβιολογικών δεικτών. Χρησιμοποιούνται δύο μέθοδοι: η μέθοδος των πολλαπλών σωλήνων και η μέθοδος της διήθησης των μεμβρανών

1. Δειγματοληψία νερού Δειγματοληψία πόσιμου νερού το στόμιο της βρύσης αποστειρώνεται με τη φλόγα του λύχνου. Το νερό ρέει πρώτα επί περίπου 5 λεπτά και στη συνέπεια συλλέγεται σε αποστειρωμένη φιάλη. Στην περίπτωση δειγματοληψίας από το δίκτυο ύδρευσης, η φιάλη θα πρέπει να περιέχει αναγωγική ουσία (Na 2 S 2 O 3 ), η οποία προστίθεται πριν την αποστείρωση της φιάλης για να εξουδετερώνει οποιοδήποτε απολυμαντικό (χλώριο) και να προφυλάσσει από τη συνεχιζόμενη αντιμικροβιακή δράση κατά τη διάρκεια μεταφοράς του δείγματος. Δειγματοληψία από επιφανειακά ύδατα γίνεται σε βάθος 25-35 cm κάτω από την επιφάνεια και μακριά από την όχθη, αφού προηγουμένως απομακρυνθεί ο τυχόν επιφανειακός κονιορτός. Η δειγματοληψία για μικροβιολογική εξέταση του νερού από επιθυμητό βάθος, για ερευνητικούς συνήθως σκοπούς, γίνεται με ειδικές συσκευές δειγματοληψίας (π.χ. η συσκευή του Miquel αποτελείται από γυάλινη φύσιγγα, με κενό αέρος, το ένα άκρο της οποίας είναι επίμηκες και στενό και σπάει σε συγκεκριμένο βάθος με το απότομο τράβηγμα σχοινιού.

2. Μεταφορά δειγμάτων Η μεταφορά των δειγμάτων για μικροβιολογική εξέταση είναι άμεση. Τα δείγματα τοποθετούνται υποχρεωτικά μέσα σε φορητό ψυγείο και μεταφέρονται αμέσως στο Εργαστήριο. Μετά τη δειγματοληψία, τα δείγματα 'μαρκάρονται' και συντάσσεται πρωτόκολλο στο οποίο σημειώνονται ημερομηνία δειγματοληψίας, πηγή προέλευσης, καθώς και οποιαδήποτε άλλα στοιχεία που θα φανούν χρήσιμα κατά τον έλεγχο των δειγμάτων.

3. Η μέθοδος των διηθητικών μεμβρανών Η μέθοδος των διηθητικών μεμβρανών είναι ευρέως διαδεδομένη και στηρίζεται στη χρήση ειδικών ηθμών - μεμβρανών (με διάμετρο πόρων 0,45μm) που επωάζονται, μετά τη διήθηση, σε εμπλουτισμένα ειδικά θρεπτικά υποστρώματα. Συγκεκριμένη ποσότητα νερού, π.χ, ΙΟΟml, διηθείται μέσω αποστειρωμένης μεμβράνης η οποία κατακρατεί όλα τα μικρόβια. Η μεμβράνη στη συνέχεια τοποθετείται σε τρυβλίο petri το οποίο περιέχει το ειδικό καλλιεργητικό υπόστρωμα και επωάζεται σε κλίβανο. Ο προσδιορισμός στηρίζεται στην ικανότητα κάθε μικροβίου να σχηματίζει μία αποικία όταν βρεθεί πάνω ή μέσα σε στερεό θρεπτικό υλικό. Επομένως μετράμε τις αποικίες που αναπτύσσονται στις μεμβράνες και εκφράζουμε τα αποτελέσματα σε αποικίες /ΙΟΟ ml νερού (colony forming units ή cfu/100 ml) για κάθε μικροβιακό δείκτη.

Πειραματικό μέρος

Όργανα - Υλικά 1. Συσκευή διήθησης 2. Κλίβανοι επώασης 3. Εκλεκτικά θρεπτικά υλικά για την ανεύρεση των δεικτών 4. Αποστειρωμένες μεμβράνες με διάμετρο πόρων 0,45 μm 5. Λαβίδες 6. Καμινέτο για τη δημιουργία φλόγας 7. Ποτηράκι ζέσεως με οινόπνευμα Θρεπτικά υλικά MF-Endo Broth (36 o C, επώαση 24h) Total Coliforms Dark red with metallic sheen M-FC Broth with Rosolic Acid (44.5±0.2 o C, επώαση 24h) Fecal Coliforms Blue KF Streptococcal Broth (36 o C, επώαση 48h) Fecal Streptocοccus - Red

Πειραματική πορεία 1. Ετοιμάζουμε τα τρία τρυβλία με τα διαφορετικά θρεπτικά υποστρώματα που θα χρησιμοποιηθούν και σημειώνουμε στο κάτω μέρος του κάθε τρυβλίου την ημερομηνία, τον αριθμό του δείγματος και το δείκτη που ελέγχουμε στο αντίστοιχο θρεπτικό υλικό. 2. Με τη βοήθεια του λύχνου αποστειρώνουμε την ανοξείδωτη χοάνη και τον υποδοχέα της μεμβράνης κατακράτησης μικροβίων. Περιμένουμε να κρυώσουν πριν χρησιμοποιηθούν. 3. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια της λαβίδας, η οποία διαβρέχεται με οινόπνευμα και αποστειρώνεται στη φλόγα και τοποθετούμε την αποστειρωμένη μεμβράνη στον υποδοχέα. 4. Πάνω από τη φλόγα αφαιρούμε το πώμα του μπουκαλιού που περιέχει το προς ανάλυση δείγμα και ρίχνουμε στη συσκευή διήθησης 100 ml νερού. 5. Στο τέλος της διήθησης αφαιρούμε με τη χρήση πάλι αποστειρωμένης λαβίδας τη μεμβράνη και την τοποθετούμε στο τρυβλίο πάνω από το θρεπτικό υπόστρωμα.

Πειραματική πορεία 7. Κλείνουμε το τρυβλίο και επωάζουμε στη θερμοκρασία που ενδείκνυται για το συγκεκριμένο δείκτη. 8. Μετά την επώαση στο θάλαμο γίνεται καταμέτρηση των χαρακτηριστικών αποικιών: α) τα κολοβακτηριοειδή που αναπτύσσονται στο υλικό MF-Endo Broth σχηματίζουν αποικίες σκούρου κόκκινου χρώματος με μεταλλική χροιά β) τα κολοβακτηριοειδή κοπρανώδους προελεύσεως που αναπτύσσονται στο υλικό M-FC Broth with Rosolic Acid σχηματίζουν αποικίες μπλε χρώματος γ) οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι που αναπτύσσονται στο υλικό KF Streptococcal Broth σχηματίζουν αποικίες κόκκινου χρώματος 9. Μετά την καταμέτρηση το δείγμα αξιολογείται ως κατάλληλο ή ακατάλληλο σύμφωνα με τις κείμενες διατάξεις της Νομοθεσίας.

Ερώτηση Ποιες οι προδιαγραφές του πόσιμου νερού από μικροβιακή άποψη?