مجله علوم پزشكي دانشگاه آزاد اسلامي دوره 19 شماره 3 پاييز 88 صفحات 154 تا 159 Original Article بررسي اثر سايتوتوكسيسيتي عصاره تام زعفران بر روي سلولهاي كارسينوماي كبد انسان ) 2 (HepG 4 3 2 1 خديجه نژاد شاهرخ آبادي جليل توكل افشاري حسن رخشنده اعظم بروك 1 2 مربي دانشجوي دانشيار 3 4 دكتراي ژنتيك مولكولي گروه زيست شناسي دانشگاه آزاد اسلامي واحد مشهد. دكتراي ايمونوژنتيك پژوهشكده بوعلي مشهد مركز تحقيقات ايمنوژنتيك دانشگاه علوم پزشكي مشهد مربي دكتراي حرفه اي داروسازي بخش فارماكولوژي بيمارستان قاي م مشهد كارشناس زيست شناسي پژوهشكده بوعلي مشهد بخش كشت سلولي دانشگاه علوم پزشكي مشهد چكيده سابقه و هدف: در طي چند سال گذشته خواص ضد سرطاني عصاره زعفران به اثبات رسيده است. در اين تحقيق اثر سايتوتوكسيسيتي عصاره تام زعفران بر روي سلول هاي كارسينوماي كبد انسان ) 2 ( HepG بصورت in vitro مورد بررسي قرار گرفت. روش بررسي: در اين مطالعه تجربي اثر كمي عصاره بر تكثير رده هاي سلولي كارسينوماي كبد انسان ) 2 ( HepG با استفاده از تكنيك رنگسنجي MTT (دي متيل تيازول دي فينل تترازوليوم برومايد) تعيين گرديد. همزمان اثر عصاره بر روي سلول هاي طبيعي فيبروبلاست موش ) 929 L) بعنوان شاهد ارزيابي شد. اين روش سريع حساس و قابل اندازهگيري براي تكثير همه انواع سلولها به روش اسپكترفتومتري است. ميزان عصاره مورد نياز جهت توليد 50 درصد سميت سلول ) 50 (IC توسط رسم نمودار با استفاده از غلظتهاي مختلف عصاره با توجه به درصد سلولهاي زنده مانده در مقايسه با سلولهايي كه هيچ دارويي بر عليه آنها استفاده نشده بود پس از سنجش و مقايسه بدست آمد. يافتهها: غلظت مهاركننده 50 درصد رشد سلولها (50 (IC براي سلولهاي سرطاني 400 ميكروگرم بر ميليليتر بدست آمد. عصاره هيچگونه اثري بر مهار رشد سلولهاي طبيعي نداشت. نتيجهگيري: عصاره تام زعفران ميتواند با تغييرات درون سيتوپلاسمي و هستهاي اثرات سايتوتوكسيسيتي بر سلولهاي توموري داشته باشد. واژگان كليدي: عصاره زعفران هپاتوكارسينوما آنتيتومور رنگسنجي رده سلولي L. 929 1 مقدمه بسياري از ميوهها سبزيجات گياهان يكساله و ادويهها حاوي عواملي بر عليه سرطان هستند كه ميتوانند اثرات خود را در مراحل مختلف شروع و رشد سلولهاي سرطاني اعمال كنند (1). امروزه استراتژي اميدوار كننده براي جلوگيري از سرطان آدرس نويسنده مسي ول: مشهد دانشگاه آزاد اسلامي واحد مشهد گروه زيست شناسي خديجه نژاد شاهرخ آبادي shahrokhabay@yahoo.com) (email: تاريخ دريافت مقاله: 1387/10/26 تاريخ پذيرش مقاله: 1388/4/20 داروهايي هستند كه بطور صناعي يا طبيعي گسترش سرطان را متوقف ميكنند. اكنون پذيرفته شده كه گياهان سبزيجات و ادويههايي كه در ميان مردم استفاده ميشوند و نيز داروهاي سنتي منبع اصلي جلوگيري از سرطان هستند (2). عوامل غذايي نقش مهمي را در مرحله شروع و نيز جلوگيري از پيشرفت سرطان ايفا ميكنند. تعداد بيشماري از بيماران در سراسر دنيا از گياهان دارويي به منظور حفظ سلامتي استفاده ميكنند. بنابراين دانشمندان نگاه عميقي بر خواص بيولوژي قدرت درماني و سلامتي اين محصولات دارند (3). بعنوان مثال
خديجه نژاد شاهرخ آبادي و همكاران/ 155 پاييز 88 دوره 19 شماره 3 امروزه از هر سه نفر آمريكايي يك نفر از گياهان دارويي استفاده ميكند (4). در فرهنگ دارويي قديم زعفران به عنوان يك داروي مفيد براي بسياري از بيماران شهرت يافته است (6 5). سابقه زراعت زعفران به بيش از 2500 سال قبل بر ميگردد. اين گياه ظاهرا بومي يونان و مناطق مديترانهاي است ولي اعتقاد بر اين است كه رويشگاه اوليه زعفران در دامنه كوههاي زاگرس و بويژه ناحيه الوند در ايران است (7). در حال حاضر ايران بزرگترين توليد كننده و صادر كننده زعفران جهان است و بيش از 65 درصد توليد جهاني اين محصول گرانبها به ايران اختصاص دارد (8). كاربردهاي متنوع زعفران خواص دارويي مصرف غذايي و از همه مهمتر نقش عمده آن در زندگي كشاورزي باعث شده كه توجه ويژه اي به مساي ل توليد و بهنژادي آن در سالهاي اخير معطوف شود. اصلاح و دستورزي ژنتيكي گياهان زراعي بويژه زعفران نيزه عمده مطالعات مهم قرن اخير است. اثرات دارويي عصاره زعفران بر سرطان و شناخت تركيبات اصلي آن نيز از جمله تحقيقات مهم است (9-13). زعفران آنتيكارسينوژن است (14-17) و عصاره زعفران فعاليت توموري را در موش به تا خير انداخته است (18-20). مطالعات گوناگوني اثر سيتوتوكسيسيتي عصاره زعفران را بر روي سلولهاي سرطاني بصورت in vitro نشان داده است. قرار دادن سلولهاي سرطاني در معرض عصاره زعفران باعث مهار سنتز اسيدنوكلي يك DNA) ( در سلول ميشود (21-22 11). همچنين تغييرات مرفولوژيكي از قبيل ميزان واكوي له شدن كاهش اندازه و تراكم هسته نيز در سلولهاي تيمار شده با زعفران ديده شده است. در اين تحقيق اثر سيتوتوكسيسيتي عصاره تام زعفران بر روي سلولهاي سرطان كبد اوليه ) 2 (HepG هم از نظر كمي و هم از نظر مرفولوژي مورد بررسي قرار گرفت. مواد و روشها در اين مطالعه تجربي عصاره آبي زعفران تجارتي در بخش فارماكولوژي بيمارستان قاي م مشهد و به روش سوكسله تهيه شد. عصاره آبي تهيه شده به مدت كوتاه در يخچال و براي زمان طولانيتر در فريزر 20- درجه سانتيگراد نگهداري شد. سپس عصاره به روش منجمد و سپس خشك كردن (Lyphilization) با استفاده از دستگاه ليوفيليزر Dry Backman) ( Frez به صورت پودر خشك شده آماده شد. عصاره خشك شده براي تهيه غلظتهاي مختلف در محيط كشت بدون سرم DMEM) ( حل شده و بصورت الكوات در دماي 20- درجه سانتيگراد نگهداري شد. دو رده سلولي مورد نياز سلولهاي سرطاني كبد ) 2 (HepG و سلولهاي طبيعي فيبروبلاست موش ) 929 L) به عنوان شاهد در محيط كشت Dulbeccos Modified Eagles ) DMEM ( Medium به همراه 10 FBS درصد و 1/5 ميليليتر استرپتومايسين و 0/5 ميليليتر پنيسيلين در دماي 37 درجه سانتيگراد درانكوباتور 5 درصد CO 2 با RH=100 رشد داده شدند. براي اطمينان از درصد بالاي سلولهاي زنده در حال رشد تست viability با رنگ تريپانبلو محاسبه شد. درصد سلولهاي زنده بيش از 90 درصد بدست آمد. براي بررسي اثر عصاره تام زعفران بر روي ردههاي سلولي پيش بيني شده آزمايشات در دو مسير انجام شد. ابتدا براي بررسي كيفيت سلولها از نظر مرفولوژي ميزان چسبندگي بر بستر و ميزان گرانوله شدن سيتوپلاسم و هسته تحت تيمار عصاره قرار گرفتند. براي هر رده سلولي 5 فلاسك كوچك حاوي 10 1 6 سلول در 5 ميليليتر محيط كشت در نظر گرفته شد. پس از 24 ساعت كه از چسبندگي سلولها اطمينان حاصل شد نوبت به افزايش عصاره با غلظتهاي صفر 50 100 10 و 200 ميكروگرم در ميلي ليترگرديد. براي تهيه اين غلظتها عصاره ليوفيليزه در محيط كشت بدون سرم حل گرديد. براي مقايسه مرفولوژي سلولها ميزان چسبندگي و ميزان گرانوله شدن آنها از فلاسكهاي حاوي سلولها هر روز به مدت شش روز عكس گرفته شد. عكسها با دوربين ديجيتال Hp-America) (Camera و با درشتنمايي 20 ميكروسكوپ معكوس تهيه شد. عكسها براي مقايسه و نتيجهگيري در كامپيوتر ذخيره گرديد. در مرحله دوم سنجش كميت سلولها به روش رنگسنجي MTT صورت گرفت. رنگ سنجي MTT (دي متيلتيازول دي فينل تترازوليوم برومايد) ابتدا توسط Mosman توصيف شد و سپس توسط Alley و همكاران تغييراتي در آن صورت گرفت (23 24). اين روش براي اندازهگيري لنفوكاينهاي پروليفراتيو ميتوژنها ليز شدن با واسطه كمپلمان تعيين فاكتورهاي رشد T-Cell و بررسي اثرات سايتوتوكسيسيتي مواد و داروهاي مختلف بر روي سلولها به كار ميرود (25). تست MTT براي هر دو رده سلولي به صورت سهتاي ي (Triplicate) و در سه پليت 96 خانهاي جداگانه انجام شد. سوسپانسيون سلولي از هر دو رده سلولي تهيه شد و 200 ميكروليتر از اين سوسپانسيون به هر ول از پليت 96 خانهاي اضافه شد. سلولها به مدت 24 ساعت انكوبه شدند و سپس عصاره رقيق شده با غلظتهاي صفر 200 100 800 600 400 300 و 1000 ميكروگرم در ميليليتر به هر ول اضافه شد. پليتها به ترتيب به مدت 48 24 و 72 ساعت انكوبه شدند. رنگ MTT با غلظت 5 ميليگرم در ميليليتر در PBS استريل حل شد و سپس توسط فيلتر استريل گرديد. به
156/ مجله علوم پزشكي دانشگاه آزاد اسلامي اثر سايتوتوكسيسيتي زعفران بر سلولهاي كارسينوماي كبد شكل 1- تغييرات مرفولوژيكي سلولها. A: سلولهاي نرمال L 929 بدون تاثير عصاره پس از 48 ساعت. B: سلولهاي نرمال L929 در غلظت 200 ميكروگرم در ميليليتر از عصاره پس از روز ششم. C: سلولهاي سرطاني HepG 2 بدون تاثير عصاره پس از 48 ساعت. D: سلولهاي سرطاني در غلظت 200 ميكروگرم در ميليليتر از عصاره پس از روز ششم. ازاء هر 200 ميكروليتر ازمحيط كشت 20 ميكروليتر رنگ MTT به هر ول از پليت 96 خانهاي اضافه شد و به مدت چهارساعت انكوبه گرديد. پس از چهار ساعت با برگرداندن پليت محيط روي سلولها خالي شد. سپس به هر ول 200 ميكروليتر DMSO و 20 ميكروليتر بافر گلايسين اضافه شد. بعد از آنكه ذرات رنگ بخوبي حل شدند جذب نوري در طول موج 570 نانومتر توسط Eliza plate reader قراي ت شد. تحليل آماري با استفاده از نرم افزار SPSS/11.5 انجام شد. در متغيرهايي كه از توزيع نرمال برخوردار بودند از آزمون t و ANOVA و در متغيرهايي كه از توزيع نرمال برخوردار نبودند از آزمون Mann-whitney U استفاده شد. يافتهها سلولهاي طبيعي L 929 شاهدي كه تحت تاثير عصاره قرار گرفته بودند هيچگونه تغييرات مرفولوژيكي مشخصي نسبت به سلولهاي شاهدي كه بدون تاثير عصاره بودند نداشتند (شكل 1). سلولهاي سرطاني بدون تاثير عصاره نيز تغييرات مشخصي را نشان ندادند. اما سلولهاي سرطاني ) 2 (HepG تحت تاثير عصاره در روزهاي مختلف تفاوتهاي بسيار بارز و وابسته به دوز عصاره نشان دادند بطوري كه بتدريج و با افزايش زمان و در دوزهاي بالاتر تغيير شكل سلولي بسيار واضحتر بود. مهار رشد سلولي به طور دستهجمعي يا منفرد به صورت مرفولوژي ستارهاي شكل تحليل رفتگي و افزايش اندازه واكوي ل كاهش سيتوپلاسم و پيگمانه شدن هسته مشخص بود. اين دو تغيير يعني تحليل رفتگي و پيگمانه شدن هسته از ويژگيهاي نهايي مرگ برنامهريزي شده سلول (آپوپتوزيس) است. تغييرات مرفولوژيكي شامل سطوح واكوي له شده و كاهش اندازه تراكم هستهها ميتواند بازتاب تغييرات متابوليكي باشد كه تنها در سطح مولكولي در سلولهاي تيمار شده با زعفران قابل بررسي است. شكلها نشان دادند كه تغييرات درون سيتوپلاسمي و هستهاي تحت تاثير عصاره زعفران ميتواند اثرات سايتوتوكسيسيتي بر سلولهاي توموري داشته باشد (شكل 1).
خديجه نژاد شاهرخ آبادي و همكاران/ 157 نمودارها تاثير عصاره را پس از 48 ساعت و 72 ساعت بر روي سلولها نشان ميدهند. شواهد نشان ميدهند كه عصاره بر روي سلولهاي طبيعي تاثيري ندارد اما برروي سلولهاي سرطاني بهخصوص در غلظتهاي 400-600 ميكروگرم در ميليليتر اثر مهاركنندگي نشان ميدهد. با مقايسه نمودارها غلظت مهاركنندگي 50 درصد رشد سلولها (50 (IC براي سلولهاي سرطاني 400 ميكروگرم در ميليليتر بدست آمد. پاييز 88 دوره 19 شماره 3 بحث نمودار 1- تا ثير غلظتهاي مختلف عصاره پس از 48 ساعت با روش.MTT عصاره تا غلظت 600 ميكروگرم در ميليليتر تا ثيري بر سلول هاي طبيعي ندارد. اما اثر وابسته به دوز بر سلول هاي سرطاني ديده مي شود. محور افقي غلظت هاي مختلف عصاره (μg/ml) و محور عمودي درصد بقاي سلولي را نشان مي دهد. نتايج سنجش رنگ MTT با اندازهگيري جذب نوري (OD) بر اساس غلظت عصاره مورد استفاده در مقايسه با ميزان تكثير مولكولي در نمودارهاي 1 و 2 اراي ه شده است. درصد سلولهاي زنده تحت تاثير عصاره نسبت به سلولهايي كه عصارهاي دريافت نكرده بودند با استفاده از فرمول ذيل محاسبه گرديد (26): جذب نوري سلول هاي تيمار شده با عصاره در هر ول 100 نمودار 2- تا ثير مقادير مختلف عصاره پس از 72 ساعت با روش. MTT اثر مهاركنندگي عصاره بر سلولهاي سرطاني در غلظت هاي مختلف ديده مي شود. محور افقي غلظت هاي مختلف عصاره (μg/ml) و محور عمودي درصد بقاي سلولي را نشان مي دهد. ميانگين جذب نوري سلول هاي كنترل به نظر ميرسد عصاره بعضي از ادويهها داراي مواد متوقف كننده رشد باشد. مطالعات گوناگون دليلي بر قدرت ايجاد سميت سلولي بر عليه سلولهاي توموري گوناگون در عصاره زعفران است (2). بر طبق مطالعات يكي از فعاليتهاي بيولوژيكي زعفران كه بزرگترين كاربرد پزشكي آن محسوب ميشود توانايي آن در مهار سرطانزايي است. مطالعات نشان داده است كه عصاره زعفران داراي فعاليت آنتيتوموري بر عليه تومورهاي جايگزين شده و نيز فعاليت ضدسرطان زايي عليه تحريك و القاء سرطان توسط مواد شيمياي ي به صورت in vivo و هم چنين اثرات سايتوتوكسيك برروي سلول هاي جدا شده از سرطان بصورت in vitro ميباشد (27). زعفران مادهاي است كه فعاليتهاي سه فرايند مهم متابوليكي يعني ساخت RNA DNA و پروتي ين را در سلول هاي زيانآور انساني متوقف و مهار ميكند. اما اثر متوقف كنندهاي بر شكلگيري كلوني ندارد (11). اين يافتهها نشان ميدهد كه اثر بازدارندگي زعفران روي سنتز اسيدنوكلي يك ميتواند يك اساس بيوشيميايي براي اثر بازدارندگي آن روي تكثير سلولهاي توموري را نشان دهد. اين نكته توسط آزمايش اثرات زعفران روي ساخت DNA و RNA در يك سيستم بدون سلول (cell free) كه هستهها ايزوله شده بودند بررسي شد (22). بنابراين تاي يد شد كه عصاره زعفران اثر مستقيم روي واكنشهاي سنتزي ندارد. بطور كلي ميتوان مكانيسمهاي عمل آنتيتومورال زعفران را بطور خلاصه اينگونه بيان نمود: 1- اثر مهاركنندگي كه بر سنتز DNA و RNA دارد اما بر سنتز پروتي ين ندارد. 2- اثر مهاركنندگي زعفران برروي فعل و انفعالات زنجيره راديكال آزاد. زيرا اغلب كارتنوي يدها قابل حل در چربياند و بعنوان اعضاء مرتبط كننده با افيشنتي بالا براي راديكالهاي آزاد عمل ميكنند كه با خواص آنتياكسيداني آنها نيز ارتباط پيدا ميكند. 3- اثر آنتي توموري زعفران كه به صورت طبيعي كارتنوي يدها را به رتنوي يد تبديل ميكند (28).
158/ مجله علوم پزشكي دانشگاه آزاد اسلامي 4- اثر سايتوتوكسيك زعفران كه با ميانكنش كارتنوي يدها با توپوايزومراز II ارتباط دارد بعنوان آنزيمي كه ميانكنش بين پروتي ين و DNA را انجام ميدهد. از طرفي تيمار سلولهاي توموري با زعفران كاهشي را در سطح تركيبات سولفيدريلي داخل سلولي نشان ميدهد كه اين نيز ميتواند يكي از توضيحات براي قدرت سايتوتوكسيسيتي زعفران باشد. مكانيسم پيشنهادي ديگر اثر سايتوتوكسيك كارتنوي يد حاصل از زعفران است كه راه حد واسط آپوپتوزيس است. هم چنين نشان داده شده كه زعفران پايداري زيادي در برابر اشعه گاما دارد كه اين پايداري ميتواند در جستجوي آزمايشاتي براي قدرت دارويي اين ادويه بكار گرفته شود. بنابراين گرچه فرضيات متعددي مطرح است اما مكانيسم واقعي اثر آنتيكارسينوژني و آنتيتوموري زعفران و تركيبات اصلي آن هنوز روشن نشده است. بنابراين شواهد علمي غيرقابل انكار اثر سايتوتوكسيسيتي زعفران بر سلولهاي كارسينوماي كبد پيشنهاد ميكند كه عوامل و فاكتورهاي رژيم گياهي ميتوانند مسير كارسينوژني عوامل سرطانزا را مهار كنند (29). به دليل ارتباطي كه بين زعفران و سرطان بوجود آمده است لازم است كه اطلاعات عميق و مطالعات ضروري در موارد ذيل صورت گيرد: 1- تعيين مكانيسمهايي كه خواص درماني زعفران را آشكار ميكنند. 2- تعيين فعاليت بيولوژيكي تركيبات آناليز شده زعفران. 3- تحقيق و بررسي برروي مسيرهايي كه خواص دارويي ضد سرطاني زعفران را اثبات ميكنند. 4- انجام مطالعات انساني براي تعيين اثربخشي زعفران براي درمان و جلوگيري از شيوع سرطان. تشكر وقدر داني بدين وسيله از كليه همكاران در پژوهشكده بوعلي مشهد كه در اين طرح پژوهشي مارا ياري نمودند سپاسگزاري ميگردد. REFERENCES 1. Abdullaev FI. Riveron-Negretts L. Rotenburd-Belacortu V, Kasumov FJ. Saffron as chemopreventive agent. In: Abdullaev FI. Riveron-Negretts L. Rotenburd-Belacortu V, Kasumov FJ, eds. Food of 21 st century: Food and resource technology environment. China: Ligh Industry Press; 2000; 185-95. 2. Abdullaev FI. Plant-derived agents cancer. In: Gupta SK, ed. Pharmacology and therapeutics in the New Millennium. New Delhi: Narosa Publishing House; 2001; 345-54. 3. Abdullaev FI. Cancer chemopreventive and tumorical properties of saffron (Crocus sativus L.). Mexicocity, Mexico: Laboratory of Experimented Oncology, National Institute of Pediatncs; 2001. 4. Eisenberg D, Kessler RC, Foster C, Norlock FE, Calkins DR. Unconventional medicine in United States: prevalence, cost and patterns of use. N Engl J med 1993; 328:246-52. 5. Bssker D, Neyhi M. The used of saffron. Econ Bot 1983; 37:228-36. 6. Gainer JI, Jones JR. The use of crocetine in experimental atherosclerosis. Experientol 1975; 31:548-49. 7. Coffee M. Saffron: technology of produce and manufacture. Mashhad: The University of Mashhad; 2006. 8. Sabzevari M. Saffron, red gold of brackish. Tehran, Iran: Bank Keshavarzi; 1995. 9. Nair SC, Pannikor B. Antitumor activity of saffron (Crocus sativus L.). Cancer Lett 1991; 57:109-14. 10. Nair SC, Kurumboor SK. Saffron chemoprevention in biology and medicine: a review. Cancer Biother 1995; 10:257-64. 11. Abdullaev FI, Frenkle GD. Effect of saffron on cell colony formation and cellular nucleic acid and protein syntheses. Biofactor 1992; 3:201-204. 12. Abdullaev FI, Gonzales DE, Mejia E. Activated antitumoral decompuestos naturales: Lectines Yazafron. Arch Latinoma 1997; 47:195-202. 13. Abdullaev FI, Frenked GD. Saffron in biological and medical research. U.S.A: Harward Academic Publishers; 1999; 103-13. 14. Fernandez JA, Escribano J. Glycoconjugate from corm of saffron plant inhibits root growth and affects in vitro cell viability. J Exp Bot 2000; 345:731-37. 15. Escribano J, Diaz-Guerra MY. In vitro activation of macrophages from corm of Crocus sativus L. Cancer Lett 1999; 144:107-14. 16. Escribano J, Piqueras A. b. Production of a cytotoxic proteoglycan using callus culture of saffron corns. J Biotech 1999; 73:53-59. 17. Escribano J, Deaz-Guerra MJ.The cytotoxic effect of glucoconjugate extracted in culture. Planta Med 2000; 66:157-62
خديجه نژاد شاهرخ آبادي و همكاران/ 159 پاييز 88 دوره 19 شماره 3 18. Salomi MY, Nair SC. Inhibitory effect of Niyella sativa and saffron on chemical carcinogenesis in mice. Nutr Cancer 1991; 16:67-72. 19. Molnar J, Szabo D. Membrane associated antitumor effects of crocine ginseniside and cannabinoid derivates. Anticancer Res 2000; 20:861-67. 20. Chany VE, Lin YL, Lee MJ, Show SJ. Inhibitory effect of crocetin on benzo(a) pyrece genotoxicity and neoplastic transformation in c 3 H 1 OT ½ Cells. Anticancer Res 1996; 765:3603-608. 21. Abdullaev FI, Frenkel GD. The effect of saffron on intracellular DNA, RNA and protein synthesis in malignant and non-malignant human cells. Biofactors 1991; 4:43-45. 22. Abdullaev FI, Macvicar C, Frenkel GD. Inhibition by selenium of DNA and RNA synthesis in normal and malignant cells in vitro. Cancer Lett 1994; 139:43-49. 23. Alley MC, Scudiero DA, Monks A. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a micro culture tetrazolium assay. Cancer Res 1998; 48:589-601. 24. Mossmann T. Rapid colorimetric assay of cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Immun Method 1983; 65:55-63. 25. Rapaport L, Robinson C. Cell titer 96 and titer 96 AG, non radioactive cell proliferation assay. Promega Notes Magazine 1993; 44:46-47. 26. Carmichael J, Decroff W. Evaluation of a tetrazolium based semiau tomated coloimetric assary. Assessment of radiosensitivity. Cancer Res 1987; 47:943-46. 27. El-Daly ES. Protective effect of cystein and vitamin E Crocus sativus and Niyella sativa extracts on cisplatininduced toxicity in bats. J Pharm Belg 1998; 3:93-95. 28. Dufresene C, Cormier F, Dorion S. In vitro formation of crocetin glucosyl esters by Crocus sativus callas extract. Plant med 1997; 63:1525-30. 29. Escribano J, Alonso GL. Crocin, sofranol and picocrocine from saffron (Crocus sativus L.) inhibit the growth of human cancer cell in vitro. Cancer lett 1996; 100:23-30.