QUANTA Lite TM ASCA (S. cerevisiae) IgG 708865 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM ASCA (S. cerevisiae) IgG 708865 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση To QUANTA Lite TM ASCA (S. cerevisiae) IgG είναι μία ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση (ELISA) για την ημι-ποσοτική ανίχνευση των αντισωμάτων αντι-saccharomyces cerevisiae (ASCA) της τάξης IgG στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των αντισωμάτων ASCA (S. cerevisiae) IgG, σε συνδυασμό με τα κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές δοκιμασίες, μπορεί να βοηθήσει στη διάγνωση ασθενών με νόσο του Crohn. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Φλεγμονώδης νόσος των εντέρων (IBD) είναι ένας γενικός όρος που χρησιμοποιείται για την περιγραφή παθήσεων που προκαλούν φλεγμονή των εντέρων. Η νόσος του Crohn (CD) και η ελκώδης κολίτιδα (UC) αποτελούν τις δύο κύριες φλεγμονώδεις νόσους των εντέρων (IBD). Στη νόσο του Crohn, η φλεγμονή συνήθως εντοπίζεται στο κατώτερο τμήμα του λεπτού εντέρου (τελικός ειλεός), αλλά μπορεί να προσβάλλει οποιοδήποτε τμήμα της πεπτικής οδού. Η φλεγμονή στη νόσο του Crohn εισχωρεί βαθιά στον ιστό που έχει προσβληθεί, σε αντίθεση με την ελκώδη κολίτιδα, η οποία προκαλεί φλεγμονή και ελκώσεις στις ανώτερες στοιβάδες της εσωτερικής επένδυσης του κόλου και του ορθού. Η φλεγμονή στη νόσο του Crohn είναι ασύμμετρη και τμηματική, με περιοχές τόσο υγιούς όσο και πάσχοντος ιστού, σε αντίθεση με την ελκώδη κολίτιδα όπου η φλεγμονή είναι συμμετρική και αδιάλειπτη από την περιοχή του ορθού. 1-3 Τόσο η νόσος του Crohn όσο και η ελκώδης κολίτιδα είναι χρόνιες παθήσεις, επηρεάζουν άνδρες και γυναίκες περίπου σε ίσα ποσοστά και παρατηρούνται συχνότερα στη βόρεια Ευρώπη και στη Βόρεια Αμερική. Κατά προσέγγιση 20% των πασχόντων από τη νόσο του Crohn έχουν εξ αίματος συγγενή με κάποια μορφή IBD. Η ηλικία εμφάνισης της νόσου του Crohn είναι συνήθως μεταξύ 15-30 ετών ενώ μία δεύτερη μικρότερη κορυφή εμφάνισης παρατηρείται μεταξύ των ηλικιών 50-70 ετών. Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας, διάφορες μελέτες επισήμαναν μία αύξηση στις περιπτώσεις νόσου του Crohn σε διάφορες γεωγραφικές περιοχές. 4-7 Αν και υπάρχουν πολλές θεωρίες σχετικά με τα αίτια της νόσου του Crohn και της ελκώδους κολίτιδας, καμία δεν έχει αποδειχθεί. Καθώς πολλά από τα συμπτώματα της νόσου του Crohn και της ελκώδους κολίτιδας είναι όμοια, η διάγνωση είναι συχνά δύσκολη, χρονοβόρα και αιματηρή (επεμβατική). 1-3 Κατά προσέγγιση το 10-12% των περιπτώσεων δεν μπορούν να ταξινομηθούν αρχικά και αναφέρονται ως ακαθόριστη κολίτιδα. Με την πάροδο του χρόνου, περίπου το ήμισυ αυτών των ασθενών ταξινομούνται τελικά ως CD (νόσος του Crohn) ή UC (ελκώδης κολίτιδα). 8-10 Τα αντισώματα αντι-saccharomyces cerevisiae (ASCA) βρέθηκε ότι είναι σημαντικά περισσότερα σε ασθενείς με νόσο του Crohn απ ό,τι σε ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα ή σε υγιή άτομα ελέγχου. 8-14 Αυτά τα αντισώματα, τα οποία μπορεί να συμπεριλαμβάνουν αντισώματα τόσο της τάξης IgG όσο και IgA, εμφανίζονται να στρέφονται έναντι ακολουθιών μαννόζης στο mannan κυτταρικού τοιχώματος των Saccharomyces cerevisiae. 14-16 Η παρουσία ASCA IgG ή IgA αποδείχθηκε ότι έχει υψηλή ειδικότητα για τη νόσο του Crohn. Μία πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η παρουσία ASCA τόσο IgG όσο και IgA ήταν 100% ειδική για τη νόσο του Crohn. 8 Η ανίχνευση ASCA μπορεί να είναι χρήσιμη στη διαφοροποίηση της νόσου του Crohn από την ελκώδη κολίτιδα σε ορισμένους ασθενείς. 8-10 Μία υποομάδα ασθενών με νόσο του Crohn φαίνεται να μην έχουν αντισώματα ASCA. Το εάν αυτά τα άτομα αποτελούν υποομάδα ασθενών με ειδικά κλινικά χαρακτηριστικά είναι άγνωστο προς το παρόν. Αρχη Μεθοδου Μερικώς καθαρό και διαχωρισμένο αντιγόνο S. cerevisiae έχει δεσμευτεί στα τοιχώματα μίας πλάκας μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου υπό συνθήκες που διατηρούν το αντιγόνο στην καθαρή του κατάσταση. Αυτο είναι συνδεδεμένο στις εμβαθύνσεις της μικροπλάκας από πολυστυρένιο υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι προτυποι οροί (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στις εμβαθύνσεις επιτρέποντας τα αντισώματα ASCA IgG να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινη IgG σφαιρίνη. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG ενζύμου με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου ASCA. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων ASCA. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων ASCA συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των προτύπων ορών αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο ASCA (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα ASCA IgG) 3. ASCA IgG ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ASCA IgG, προαραιωμένο, 1.2ml 4. ASCA IgG ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο ASCA IgG, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml 1

Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 17 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 ASCA ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 2

1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος ASCA IgG Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος ASCA IgG High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Το ASCA IgG ELISA (Low Positive), το ASCA IgG ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) θα πρέπει να εξετάζονται με κάθε φορά για να επιβεβαιωθεί ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες γίνονται κανονικά. 2. Σημειώστε ότι εφόσον το ASCA IgG ELISA χαμηλό Θετικό (Low Positive), το ASCA IgG ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) είναι προ-αραιωμένα, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της εξέτασης, πρέπει να ισχύουν όλα τα παρακάτω κριτήρια. Εάν δεν ισχύει κάποιο από αυτά, το τεστ πρέπει να θεωρηθεί άκυρα και να επαναληφθεί η διαδικασία. 3

α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυ NCCLS για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. 18 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του ASCA IgG ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του ASCA IgG ELISA Low. Η τιμή του ASCA IgG ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X ASCA IgG oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. ASCA IgG ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα μπορεί στη συνέχεια να ταξινομηθεί ως αρνητικό (για αντίσωμα IgG σε S. cerevisiae), αμφίβολο ή θετικό (ανιχνεύθηκε αντίσωμα IgG σε S. cerevisiae) σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Μονάδες Αρνητικό <20 Αμφίβολο 20.1-24.9 θετικό >20-39 Τα αμφίβολα δείγματα πρέπει να αναλύονται ξανά πριν την αναφορά των αποτελεσμάτων. 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδηλώνει την παρουσία αντισωμάτων ASCA IgG υποδεικνύοντας την πιθανότητα νόσου του Crohn. 2. Ένα δείγμα με αμφίβολα επίπεδα ASCA IgG δεν μπορεί να αξιολογηθεί για κατάσταση αντισωμάτων. Εάν τα αποτελέσματα παραμένουν αμφίβολα μετά από την επανάληψη της δοκιμασίας, το αποτέλεσμα πρέπει να αναφερθεί ως αμφίβολο ή/και να πραγματοποιηθεί επιπρόσθετη δειγματοληψία. 3. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει την απουσία των αντισωμάτων του ASCA IgG ή επίπεδα χαμηλότερα από την αρνητική αποκοπή της ανάλυσης. 4. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM ASCA IgG ELISA. Οι τιμές ASCA IgG που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία των άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων ανοσοσφαίρινων στο δείγμα του ασθενή μπορεί να προκαλέσει ένα αυξημένο επίπεδο μη-συγκεκριμένης σύνδεσης και να παράγουν ψευδή θετικά σε αυτή την ανάλυση. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα ASCA IgG δεν αποκλείει την παρουσία νόσου του Crohn. 3. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα αντισώματος ASCA IgG δεν αποκλείει την παρουσία αντισωμάτων ASCA, καθώς η συγκέντρωση αντισώματος ενδέχεται να είναι χαμηλότερη από το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης. 4. Ένα θετικό αποτέλεσμα δοκιμασίας υποδηλώνει μόνο την παρουσία αντισώματος σε S. cerevisiae και δεν υποδεικνύει απαραίτητα την παρουσία νόσου του Crohn. 5. Τα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της ανάλυσης έχουν καθιερωθεί μόνο για ορό. 6. Η απόδοση της ανάλυσης δεν έχει αποδειχθεί για παιδιατρικούς ασθενείς με νόσο του Crohn ή ελκώδη κολίτιδα. 7. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 4

Αναμενόμενες Τιμές Οι περιπτώσεις εμφάνισης νόσου του Crohn υπολογίζονται από 10 έως 198 άτομα/100.000 με τάση αύξησης 4-7. Η νόσος του Crohn απαντάται συχνότερα στους πληθυσμούς της βόρειας Ευρώπης και Βόρειας Αμερικής. Επηρεάζει άνδρες και γυναίκες κατά προσέγγιση σε ίσα ποσοστά. Φυσιολογικές Τιμές Ένα συνδυασμένο σύνολο 501 δειγμάτων που συλλέχθηκαν από ασυμπτωματικά, υγιή άτομα στην Καλιφόρνια, Νέα Υόρκη, Αυστρία, Λουξεμβούργο και Βέλγιο αναλύθηκε με το κιτ QUANTA Lite TM ASCA IgG ELISA. Το εύρος ηλικίας του πληθυσμού κυμάνθηκε από 1 έως 75 έτη. Για τους 5 περιφερειακούς πληθυσμούς, η εμφανής ειδικότητα κυμάνθηκε από 92 έως 100% (μέση τιμή 95.2%). Κανένα (0/501) από τα δείγματα δεν ήταν θετικό και για τα δύο αντισώματα ASCA IgG και ASCA IgA. Η ειδικότητα της ανάλυσης ASCA IgG, συμπεριλαμβανομένων όλων των μη θετικών για νόσο του Crohn δειγμάτων (οροί ελέγχου υγιών ατόμων συν οροί παθολογικής κατάστασης), ήταν 93.2% (663/711). Ευαισθησία και Ειδικότητα Κλινικά καθορισμένα δείγματα ασθενών από νόσο του Crohn, ελκώδη κολίτιδα και υγιή άτομα αναλύθηκαν με χρήση του κιτ QUANTA Lite TM ASCA IgG. Από τους 102 ασθενείς οι οποίοι ήταν θετικοί και για τα δύο αντισώματα ASCA IgG και IgA, όλοι εκτός από 2 ήταν γνωστό ότι ήταν πάσχοντες από τη νόσο του Crohn. Κανένα από τα φυσιολογικά δείγματα ελέγχου δεν ήταν θετικό και μόνο 2 από τα δείγματα ελκώδους κολίτιδας ήταν θετικά τόσο για ASCA IgG όσο και IgA. Τα εύρη ηλικίας για τις κλινικές ομάδες νόσου του Crohn και ελκώδους κολίτιδας ήταν 17-64 και 19-71 ετών αντίστοιχα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ QUANTA Lite TM ASCA ELISA Κλινική ομάδα N= IgG Θετ. IgA Θετ. IgG ή IgA Θετ. IgG και IgA Θετ. Νόσος του Crohn 215 74.4% (157/211) 49.0 (103/210) 76.2% (160/210) 47.6% (100/210) Ελκώδης κολίτιδα 161 14.2% (22/156) 1.9% (3/158) 14.6% (23/156) 1.3% (2/156) Υγιή δείγματα ελέγχου 148 4.1% (6/145) 1.4% (2/147) 5.6% (8/144) 0% (0/144) Σημείωση: τα αμφίβολα αποτελέσματα αποκλείστηκαν από τους υπολογισμούς. Μελέτη Aληλεπίδρασης Οροί από 75 ασθενείς με αντισώματα αυτοάνοσων ή μολυσματικών ασθενειών και διάφορες κλινικές καταστάσεις αναλύθηκαν για διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με τη μέθοδο QUANTA Lite TM ASCA (S. cerevisiae) IgG ELISA. Τα αποτελέσματα που συνοψίζονται παρακάτω περιέχουν συνδυασμένα δεδομένα από διάφορες κλινικές τοποθεσίες. Τύπος δείγματος n= ASCA IgG Θετικό IgA γλιαδίνης θετικό 12 0 IgG γλιαδίνης θετ. 8 2 (25%) IgA τρανσγλουταμινάσης 7 0 Αντιπυρηνικό αντίσωμα (ANA) θετ. 8 0 Αυτοάνοσος ηπατίτιδα (AIH), τύπου1 15 1 (6.6%) H. pylori θετικό 10 0 Ασκίτης αλκοολικής κίρρωσης 1 0 Αλκοολική ηπατίτιδα 2 2 (100%) Χρόνια ηπατίτιδα C 6 1 (16.7%) Χρόνια ηπατική νόσος 2 0 Κοκκιωματώδης ηπατίτιδα.s/pbcg immuno rx blad.cancer 1 1 (100%) Ηπατίτιδα NOS 1 0 Μη λοιμώδης γαστρεντερίτιδα 1 0 Οισοφάγειοι κιρσοί με αιμορραγία 1 0 Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση κατά τη διάρκεια της ανάλυσης για τη μέθοδο QUANTA Lite TM ASCA (S. cerevisiae) IgG ELISA αξιολογήθηκε μέσω της ανάλυσης 6 δειγμάτων 15 φορές το καθένα. Δείγμα A Δείγμα B Δείγμα C Δείγμα D Δείγμα E Δείγμα F Μέση τιμή 75.6 13.1 116.6 29.9 10.4 44.8 SD 2.8 0.7 3.0 1.2 0.5 1.7 CV% 3.7 5.2 2.6 4.1 4.5 3.8 Η διακύμανση μεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε μέσω της ανάλυσης, εις διπλούν, ενός συνόλου 8 δειγμάτων δύο φορές την ημέρα για 3 ημέρες. Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα 5 Δείγμα 6 Δείγμα 7 Δείγμα 8 Μέση τιμή 47.7 11.7 123.5 38.8 49.3 117.7 14.9 6.6 SD 1.4 0.4 6.7 1.4 1.2 5.8 0.4 0.3 CV% 3.0 3.5 5.4 3.6 2.4 4.9 2.6 5.0 5

Βιβλιογραφία 1. Merck Manual of Diagnosis and Therapy. 1999. Whitehouse Station, NJ. (www.merck.com/pubs/mmanual). 2. Coche J-C and J-F Colombel. Heterogeneity of Inflammatory Bowel Disease: Clinical Subgroups of Patients. Res. Clin. Forums 20(1): 135-145, 1998. 3. National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK). Crohn s Disease. NIH Publication No. 98-3410, 1998. 4. (www.niddk.nih.gov/health/digest/pubs/crohns/crohns.htm). 5. Bernstein CN, Blanchard JF, Rawsthorne P and A Wajda. Epidemiology of Crohn s disease in a central Canadian province: a population-based study. Am. J. Epidemiol. 149(10): 916-924, 1999. 6. Loftus EV Jr, Silverstein MD, Sandborn WJ, Tremaine WJ, Harmsen WS and AR Zinsmeister. Crohn s disease in Olmsted County, Minnesota, 1940-1993: incidence, prevalence, and survival. Gastroenterol. 114(6): 1161-1168, 1998. 7. Niv Y, Abuksis G and GM Fraser. Epidemiology of Crohn s disease in Israel: a survey of Israeli kibbutz settlements. Am J. Gastroenterol. 94 (10): 2961-2965,1999. 8. Shivananda S, Lennard-Jones J, Logan R, Fear N, Price A, Carpenter L and M van Blankenstein. Incidence of inflammatory bowel disease across Europe: is there a difference between north and south? Results of the European Collaborative Study on Inflammatory Bowel Disease (EC-IBD). Gut 39:690-697, 1996. 9. Ruemmele FM, Targan SR, Levy G, Dubinsky M, Braun J and ER Seidman. Diagnostic accuracy of serological assays in pediatric inflammatory bowel disease. Gastroenterol. 115: 822-829, 1998. 10. Rutgeerts P and S Vermeire. Clinical value of the detection of antibodies in the serum for diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease. Gastroenterol. 115:1006-1022, 1998. 11. Panaccione R and WJ Sanborn. Is antibody testing for inflammatory bowel disease clinically useful? Gastroenterol. 116:1001-1008, 1999. 12. Main J, McKenzie H, Yeaman GR, Kjerr MA, Robson D and Pennington CR, et al. Antibody to Saccharomyces cerevisiae (baker s yeast) in Crohn s disease. Brit. J. Med. 297:1105-1106, 1988. 13. McKenzie H, Main J, Pennington CR and D Parrat. Antibody to selected strains of Saccharomyces cerevisiae (baker s and brewer s yeast) and Candida ablicans in Crohn s Disease. Gut 31:536-538, 1990. 14. Lindberg E, Magnusson K-E, Tysk C and G Jarnerot. Antibody (IgG, IgA, and IgM) to baker s yeast (Saccharomyces cerevisiae), yeast mannan, gliadin, ovalbumin and betalactoglobulin in monozygotic twins with inflammatory bowel disease. Gut 33: 909-913, 1992. 15. Sendid B, Colombel JF, Jacquinot PM, Faille C, Fruit J, Cortot A, Lucidarme D, Camus D and D Poulain. Specific antibody response to oligomannosidic epitopes in Crohn s Disease. Clin. Diag. Lab. Immunol. 3(2):219-226, 1996. 16. Quinton J-F, Sendid B, Reumaux D, Duthilleul P, Cortot A, Grandbastien B, Charrier G, Targan SR, Colombel J-F and D Poulain. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies combined with antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in inflammatory bowel disease: prevalence and diagnostic role. Gut 42:788-791, 1998. 17. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). 18. National Committee for Clinical Laboratory Standards.1991. Internal quality control: Principles and definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6). Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628865 May 2005 Revision GRC7 6