TPHA

TPHA 200 72503 500 72504 ΚΙΤ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΚΑΙ ΗΜΙΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ TREPONEMA PALLIDUM ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ Ή ΤΟ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΠΛΑΣΜΑ ΜΕΣΩ ΠΑΘΗΤΙΚΗΣ ΑΙΜΟΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ 883683 2014/12

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ... 3 2. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ... 3 3. ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ... 3 4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ... 4 5. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ... 4 6. ΔΕΙΓΜΑΤΑ... 6 7. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ... 6 8. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ... 10 9. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ... 11 10. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ.... 13 [GR] 2

1. ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Τα κιτ TPHA προορίζονται για χρήση για την ποιοτική και ηµιποσοτική ανίχνευση αντισωµάτων έναντι του Treponema pallidum στον ανθρώπινο ορό ή το ανθρώπινο πλάσµα. Το προϊόν µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον έλεγχο αιµοδοτών και να συµβάλει στη διάγνωση ασθενών για τους οποίους υπάρχει υποψία µόλυνσης από σύφιλη. 2. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Η σύφιλη είναι µια χρόνια λοίµωξη που εξελίσσεται σε διακριτά στάδια µόλυνσης: πρωτογενές, δευτερογενές, τριτογενές και τεταρτογενές. Αυτά τα στάδια συνοδεύονται από διάφορα κλινικά συµπτώµατα, τα οποία δηµιουργούν συνήθως αρχικά έλκη, γνωστά ως συφιλιδικά έλκη, και εν συνεχεία συφιλιδικά εξανθήµατα που ακολουθούνται από µακροχρόνιες περιόδους λανθάνουσας κατάστασης. Εάν η λοίµωξη δεν αντιµετωπιστεί, ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα την εµφάνιση καρδιαγγειακών προβληµάτων και νευρικής σύφιλης. Η λοίµωξη προκαλείται από τη σπειροχαίτη Treponema pallidum και µεταδίδεται κυρίως µέσω σεξουαλικής επαφής, παρόλο που η ασθένεια µπορεί να µεταδοθεί µέσω µετάγγισης µολυσµένου αίµατος. Είναι επίσης δυνατή η ενδοµήτρια µόλυνση. Η καλλιέργεια του οργανισµού σε τεχνητά µέσα έχει αποδειχθεί σχεδόν αδύνατη και η διάγνωση της λοίµωξης συνήθως εξαρτάται από τη διαπίστωση της παρουσίας αντισωµάτων στο αίµα, τα οποία εµφανίζονται σύντοµα µετά την αρχική µόλυνση και ενδέχεται να εξακολουθήσουν να υπάρχουν για πολλά χρόνια. Οι εξετάσεις για τη σύφιλη χωρίζονται σε τέσσερις κατηγορίες: άµεση εξέταση στο µικροσκόπιο, εξετάσεις για αντισώµατα έναντι τρεπονήµατος, εξετάσεις για αντισώµατα διαφορετικά από αυτά έναντι του τρεπονήµατος και άµεσες εξετάσεις αντιγόνων. Λόγω των µακροχρόνιων περιόδων λανθάνουσας κατάστασης και της µη συγκεκριµένης φύσης των εξετάσεων για αντισώµατα διαφορετικά από αυτά έναντι του τρεπονήµατος, οι µέθοδοι που ανιχνεύουν συγκεκριµένα αντισώµατα έναντι του τρεπονήµατος στα δείγµατα αίµατος γίνονται ολοένα δηµοφιλέστερες στους σχετικούς ελέγχους. Η εξέταση TPHA είναι µια τέτοια εξέταση. 3. ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Τα κιτ TPHA χρησιµοποιούν διατηρηµένα ερυθροκύτταρα πτηνών επικαλυµµένα µε αντιγόνα T. pallidum (στέλεχος Nichols), τα οποία δεσµεύονται από το συγκεκριµένο αντίσωµα που βρίσκεται στον ορό ή το πλάσµα του ασθενούς. Τα κύτταρα υποβάλλονται σε εναιώρηση σε ένα µέσο που περιέχει συστατικά για την εξουδετέρωση µη συγκεκριµένων αντιδράσεων. Οι θετικές αντιδράσεις εµφανίζονται µέσω συγκόλλησης των κυττάρων, ενώ οι αρνητικές αντιδράσεις µέσω της διευθέτησης των κυττάρων σε µια κηλίδα ή έναν µικρό δακτύλιο. Παρόλο που αυτά τα κιτ προορίζονται κυρίως για χρήση ως ποιοτικές εξετάσεις, τα επίπεδα αντισωµάτων µπορούν να τιτλοδοτηθούν µέσω διπλάσιων αραιώσεων. Τα µοτίβα συγκόλλησης µπορούν να ερµηνευτούν διά γυµνού οφθαλµού ή µέσω αναγνώστη πλακών µε δυνατότητα ανάγνωσης µοτίβων συγκόλλησης. Για προσαρµογές και ειδικές διαδικασίες, επικοινωνήστε µε τη σχετική εταιρεία. [GR] 3

4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ R1 R2 4.1. Περιγραφή Αναγνωριστικά στοιχεία ετικέτας Test Cells Control Cells Diluent Περιγραφή Κύτταρα εξέτασης Εναιώρηµα ερυθροκυττάρων πτηνών επικαλυµµένων µε αντιγόνα T. pallidum, το οποίο περιέχει Αλβουµίνη βόειου ορού (BSA) Κύτταρα ελέγχου Εναιώρηµα ερυθροκυττάρων πτηνών, το οποίο περιέχει BSA Αραιωτικό Αλατούχο διάλυµα που περιέχει ορό κονίκλου Παρουσίαση 72503 72504 200 εξετάσεις 500 εξετάσεις 2 φιαλίδια 7,8 ml 2 φιαλίδια 7,8 ml 2 φιαλίδια 20 ml 2 φιαλίδια 20 ml 1 φιαλίδιο 20 ml 1 φιαλίδιο 125 ml R4 R5 Positive Control Negative Control Δείγµα ελέγχου θετικού Ανθρώπινος ορός που περιέχει αντισώµατα έναντι του T. pallidum, αρνητικός για αντιγόνο HBs, αντισώµατα έναντι του HIV1/2 και έναντι του HCV, αραιωµένος σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού άλατος Δείγµα ελέγχου αρνητικού Ορός κονίκλου σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού άλατος 1 φιαλίδιο 1 ml 1 φιαλίδιο 1 ml 1 φιαλίδιο 1 ml 1 φιαλίδιο 1 ml 4.2. Απαιτήσεις αποθήκευσης και χειρισµού Αυτό το κιτ θα πρέπει να αποθηκεύεται στους +2-8 C. Φυλάσσετε τις φιάλες σε όρθια θέση. Μην τις καταψύχετε. Κάθε στοιχείο του κιτ το οποίο διατηρείται στους +2-8 C µπορεί να χρησιµοποιηθεί έως την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στη συσκευασία. Μετά το άνοιγµα και εφόσον δεν υπάρχει επιµόλυνση, τα αντιδραστήρια R1, R2,, R4 και R5 που έχουν συντηρηθεί στους +2-8 C µπορούν να χρησιµοποιηθούν έως την ηµεροµηνία λήξης που υποδεικνύεται στην ετικέτα. 5. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Για διαγνωστική χρήση in vitro. Για χρήση από επαγγελµατίες στον χώρο της υγειονοµικής περίθαλψης. 5.1. Προφυλάξεις υγείας και ασφαλείας: Ο χειρισµός του παρόντος κιτ εξέτασης θα πρέπει να διεξάγεται µόνο από ειδικευµένο προσωπικό, καταρτισµένο στις εργαστηριακές [GR] 4

διαδικασίες και εξοικειωµένο µε τους δυνητικούς κινδύνους τους. Φορέστε κατάλληλο προστατευτικό ρουχισµό, γάντια και προστατευτικά για τα µάτια/το πρόσωπο και χειριστείτε τον εξοπλισµό σύµφωνα µε την απαιτούµενη Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. Τα υλικά ελέγχου που παρέχονται προέρχονται από ανθρώπινο ορό. Έχουν εξεταστεί σε επίπεδο δότη και έχουν διαπιστωθεί αρνητικά για αντιγόνο HBs, αντισώµατα έναντι του HIV1/2 και έναντι του HCV. Καµία γνωστή µέθοδος εξέτασης δεν µπορεί να εξασφαλίσει την πλήρη απουσία µολυσµατικών παραγόντων. Για τον λόγο αυτό, η διαχείριση όλων των παραγώγων του ανθρώπινου αίµατος, των αντιδραστηρίων και των ανθρώπινων δειγµάτων θα πρέπει να γίνεται ως ικανών να µεταδώσουν µολυσµατικές ασθένειες, ακολουθώντας τις συνιστώµενες Γενικές Προφυλάξεις για µεταδιδόµενα διά του αίµατος παθογόνα, όπως αυτές ορίζονται από τοπικούς, περιφερειακούς και εθνικούς κανονισµούς. Εκχύσεις βιολογικών υλικών: Οι εκχύσεις υλικών ανθρώπινης προέλευσης θα πρέπει να αντιµετωπίζονται ως δυνητικά µολυσµατικές. Οι εκχύσεις που δεν περιέχουν οξύ θα πρέπει να απολυµανθούν άµεσα, µαζί µε την περιοχή έκχυσης, τα υλικά και όλες τις επιµολυσµένες επιφάνειες ή τον εξοπλισµό, µε κατάλληλο χηµικό απολυµαντικό το οποίο είναι αποτελεσµατικό για δυνητικά βιολογικά επικίνδυνα υλικά που σχετίζονται µε τα χρησιµοποιούµενα δείγµατα (συνήθως χλωρίνη οικιακής χρήσης αραίωσης 1:10, αιθανόλη ή ισοπροπανόλη 70-80%, κάποιο ιωδοφόρο [όπως Wescodyne Plus 0,5%] κλπ.) και να σκουπιστούν καλά. Οι εκχύσεις που περιέχουν οξύ θα πρέπει να απορροφηθούν κατάλληλα (να σκουπιστούν) ή να εξουδετερωθούν, ενώ η περιοχή πρέπει να καθαριστεί καλά µε νερό και να σκουπιστεί τελείως. Τα υλικά που χρησιµοποιήθηκαν για την απορρόφηση της έκχυσης ενδεχοµένως να πρέπει να απορριφθούν ως βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα. Στη συνέχεια, η περιοχή θα πρέπει να απολυµανθεί µε κάποιο χηµικό απολυµαντικό. Σηµείωση: Μην τοποθετείτε διαλύµατα που περιέχουν χλωρίνη µέσα στο αυτόκαυστο! Απορρίπτετε όλα τα δείγµατα και τα υλικά που χρησιµοποιούνται για τη διεξαγωγή της εξέτασης ως εάν περιείχαν µολυσµατικό παράγοντα. Η διαχείριση και η απόρριψη των εργαστηριακών, των χηµικών ή των βιολογικά επικίνδυνων αποβλήτων πρέπει να γίνεται σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς και εθνικούς κανονισµούς. Το Δελτίο Δεδοµένων Ασφαλείας διατίθεται στη διεύθυνση www.biorad.com. [GR] 5

5.2. Προφυλάξεις ως προς τη διαδικασία 5.2.1. Προετοιµασία Η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων εξαρτάται από τη σωστή εφαρµογή της παρακάτω Ορθής Εργαστηριακής Πρακτικής: Μην αναµιγνύετε ή συσχετίζετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες σε µία εκτέλεση της εξέτασης. Μην χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια που έχουν λήξει. Πριν από τη χρήση, περιµένετε για 30 λεπτά µέχρι τα αντιδραστήρια να σταθεροποιηθούν σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C). 5.2.2. Επεξεργασία Μην αλλάζετε τη διαδικασία της δοκιµασίας. Χρησιµοποιείτε νέο ρύγχος κατανοµής για κάθε δείγµα. 6. ΔΕΙΓΜΑΤΑ Τα δείγµατα ορού ή πλάσµατος (EDTA, κιτρικό νάτριο, ηπαρίνη και ACD) θα πρέπει να µην περιέχουν ερυθρά αιµοσφαίρια και εµφανή µικροβιακή επιµόλυνση. Είναι δυνατή η αποθήκευσή τους στους +2-8 C για έως 7 ηµέρες πριν από την εξέταση. Τα δείγµατα που χρειάζονται πιο µακρόχρονη αποθήκευση θα πρέπει να καταψύχονται στους -20 C ή σε χαµηλότερη θερµοκρασία. Τα κατεψυγµένα δείγµατα θα πρέπει να έχουν αποψυχθεί και να είναι καλά αναµεµιγµένα πριν από την εξέταση. Μην επαναλαµβάνετε περισσότερους από 5 κύκλους κατάψυξης/απόψυξης. Τα δείγµατα που θερµαίνονται στους 56 C για 3 ώρες δεν επηρεάζουν τα αποτελέσµατα. Τα δείγµατα που περιέχουν έως 100 mg/l χολερυθρίνης, έως 36 g/l τριγλυκεριδίων και έως 10 g/l αιµοσφαιρίνης δεν επηρεάζουν τα αποτελέσµατα. Ωστόσο, δεν συνιστάται η χρήση υπερλιπαιµικού ορού ή πλάσµατος ή ορού ή πλάσµατος που έχει υποστεί υπεραιµόλυση. Εάν τα δείγµατα πρόκειται να µεταφερθούν, πρέπει να συσκευάζονται σύµφωνα µε τους κανονισµούς που ισχύουν σχετικά µε τη µεταφορά αιτιολογικών παραγόντων και, κατά προτίµηση, να µεταφέρονται κατεψυγµένα. 7. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα Δείγµατα ελέγχου θετικού και αρνητικού (R4 και R5) του κιτ πρέπει να εκτελούνται µε κάθε εκτέλεση εξετάσεων. 7.1. Απαιτούµενα υλικά που δεν παρέχονται Αποσταγµένο νερό Υποχλωριώδες νάτριο (χλωρίνη οικιακής χρήσης) και διττανθρακικό νάτριο. Απορροφητικό χαρτί Γάντια µίας χρήσης Προστατευτικά γυαλιά Σωλήνες µίας χρήσης [GR] 6

Αυτόµατες ή ηµιαυτόµατες, ρυθµιζόµενες ή σταθερές πιπέτες ή πολυκάναλες πιπέτες που µπορούν να µετρούν και να χορηγούν 10 µl,, 75 µl και 190 µl. Αναδευτήρας µικροπλάκας Μορφή πλάκας U µε κοιλότητες (µικροπλάκες µε 96 κοιλότητες) Κωδικός 83375 (5 πλάκες) Δοχείο βιολογικά επικίνδυνων αποβλήτων 7.2. Διαδικασία δοκιµασίας (Χειροκίνητη τεχνική) 7.2.1. Ποιοτική δοκιµασία Για κάθε δείγµα χρειάζονται τρεις κοιλότητες από τη µικροπλάκα U. Το Κιτ TPHA 500 (Αρ. προϊόντος 72504) προορίζεται για τον έλεγχο µεγάλων αριθµών δειγµάτων και περιέχει µόνο έναν µικρό όγκο Κυττάρων ελέγχου. Στόχος είναι ο έλεγχος των δειγµάτων να πραγµατοποιείται µόνο µε χρήση Κυττάρων εξέτασης κατά την πρώτη φορά, ενώ τα Κύτταρα ελέγχου θα πρέπει να χρησιµοποιούνται κατά την επανάληψη των εξετάσεων σε δείγµατα, εµφανίζοντας θετικό αποτέλεσµα κατά την πρώτη εξέταση. a. Αραίωση Δείγµατος και Δειγµάτων ελέγχου (σε 1 προς 20) Προσθέστε 190 µl του αραιωτικού () σε µια κοιλότητα. Προσθέστε 10 µl του δείγµατος ή του Δείγµατος ελέγχου θετικού (R4) ή του Δείγµατος ελέγχου αρνητικού (R5) στην ίδια κοιλότητα. Αναµίξτε καλά. b. Εξέταση Μεταφέρετε αραιωµένου δείγµατος ελέγχου ή αραιωµένου δείγµατος από το βήµα αραίωσης στην κοιλότητα εξέτασης. Μεταφέρετε αραιωµένου δείγµατος ελέγχου ή αραιωµένου δείγµατος από το βήµα αραίωσης στην κοιλότητα ελέγχου. Επαναλάβετε ξανά την εναιώρηση των Κυττάρων εξέτασης (R1) και των Κυττάρων ελέγχου (R2), ανακινώντας το φιαλίδιο. Εξετάστε αν η εναιώρηση είναι πλήρης. Προσθέστε 75 µl Κυττάρων εξέτασης (R1) στην κοιλότητα εξέτασης και 75 µl Κυττάρων ελέγχου (R2) στην κοιλότητα ελέγχου. Η αραίωση του τελικού δείγµατος είναι 1: 80. Αναµίξτε καλά τις κοιλότητες. Επωάστε σε θερµοκρασία δωµατίου (15-30 C) σε επιφάνεια χωρίς δονήσεις για τουλάχιστον 45 λεπτά. Διαβάστε τα µοτίβα διευθέτησης. Τα µοτίβα συγκόλλησης είναι σταθερά για τουλάχιστον τρεις ώρες, εάν παραµείνουν ανενόχλητα. 7.2.2. Ηµιποσοτική δοκιµασία Για κάθε δείγµα χρειάζονται 9 κοιλότητες από τη µικροπλάκα U: Μία κοιλότητα για την αραίωση του δείγµατος ή του δείγµατος ελέγχου και 8 κοιλότητες για την τιτλοδότηση. [GR] 7

Σηµείωση: Τα Δείγµατα ελέγχου θετικού και αρνητικού (R4 και R5) πρέπει να εκτελούνται µε κάθε εκτέλεση εξετάσεων µέσω της παρακάτω διαδικασίας. a. Αραίωση Δείγµατος και Δειγµάτων ελέγχου (σε 1 προς 20) Προσθέστε 190 µl του αραιωτικού () σε µια κοιλότητα. Προσθέστε 10 µl δείγµατος ή Δείγµατος ελέγχου αρνητικού (R5) ή Δείγµατος ελέγχου θετικού (R4) στην ίδια κοιλότητα. Αναµίξτε καλά. b. Τιτλοδότηση Αφήνοντας την πρώτη κοιλότητα κενή, προσθέστε αραιωτικού () σε καθεµία από τις υπόλοιπες 7 κοιλότητες. 190µl () + 10 µl δείγµατος ή (R4) ή (R5) Αραιώσεις δειγµάτων ή δειγµάτων ελέγχου 0 1 2 3 4 5 6 7 8 8 κοιλότητες για τιτλοδότηση Μεταφέρετε αραιωµένου δείγµατος ελέγχου ή δείγµατος στην 1η κοιλότητα και στη 2η κοιλότητα και, εν συνεχεία, αναµίξτε. Κατόπιν, αραιώστε κατά σειρά στην ακολουθία των κοιλοτήτων, απορρίπτοντας τα επιπλέον από την τελική κοιλότητα. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 190 µl () + 10 µl Δείγµατος ή (R4) ή (R5) Αραιώσεις δειγµάτων ή δειγµάτων ελέγχου αραιωµένου δείγµατος ελέγχου + αραιωµένου δείγµατος ελέγχου 8 κοιλότητες για τιτλοδότηση Απόρριψη επιπλέον c. Εξέταση Αναµίξτε ελαφρά τα Κύτταρα εξέτασης (R1), για να διασφαλίσετε την καλή επανάληψη της εναιώρησης. Προσθέστε 75 µl Κυττάρων εξέτασης (R1) σε κάθε κοιλότητα. Το εύρος αραίωσης του τελικού δείγµατος έπειτα από την προσθήκη των κυττάρων είναι 1: 80 1:10240. Αναµίξτε καλά. [GR] 8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 190 µl () + 10 µl Δείγµατος ή (R4) ή (R5) Αραιώσεις δειγµάτων ή δειγµάτων ελέγχου αραιωµένου δείγµατος ελέγχου + 75 µl R1 αραίωσης + 75 µl R1 αραίωσης + 75 µl R1 αραίωσης + 75 µl R1 αραίωσης + 75 µl R1 αραίωσης + 75 µl R1 αραίωσης + 75 µl R1 αραίωσης + 75 µl R1 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240 8 κοιλότητες για τιτλοδότηση Επωάστε σε θερµοκρασία δωµατίου (15-30 C) σε επιφάνεια χωρίς δονήσεις για τουλάχιστον 45 λεπτά. Διαβάστε τα µοτίβα διευθέτησης. Τα µοτίβα συγκόλλησης είναι σταθερά για τουλάχιστον τρεις ώρες, εάν παραµείνουν ανενόχλητα. Ο τίτλος του δείγµατος είναι το αντίστροφο της υψηλότερης αραίωσης που παρουσιάζει συγκόλληση. 7.3. Ποιοτικός έλεγχος Τα κιτ Δειγµάτων ελέγχου πρέπει να παρουσιάζουν το σωστό αποτέλεσµα. Το Δείγµα ελέγχου αρνητικού (R5) είναι αρνητικό και το Δείγµα ελέγχου θετικού (R4) είναι θετικό. Όταν τιτλοδοτείται το κιτ Δείγµατος ελέγχου θετικού (R4), το αναµενόµενο τελικό σηµείο είναι 1:640. 7.4. Ερµηνεία των αποτελεσµάτων και Κριτήρια επικύρωσης εξέτασης Θετικό Διφορούµ Αρνητικό ενο Κύτταρα εξέτασης Θετικό: Έντονα Πλήρες µοτίβο κυττάρων καλύπτει τον πυθµένα της κοιλότητας. Αδύναµα θετικό Το µοτίβο των κυττάρων καλύπτει περίπου το 1/3 του πυθµένα της κοιλότητας Διφορούµενο Το µοτίβο των κυττάρων εµφανίζει ένα ευκρινώς ανοιχτό κέντρο. Αρνητικό Τα κύτταρα διευθετούνται σε µια συµπαγή κηλίδα, συνήθως µε ένα µικρό διαυγές κέντρο. Μη συγκεκριµένη Θετική αντίδραση. αντίδραση Κύτταρα ελέγχου Αρνητική κηλίδα Αρνητική κηλίδα Αρνητική κηλίδα Αρνητική κηλίδα Θετική αντίδραση [GR] 9

Ένα δείγµα όπου η κοιλότητα των Κυττάρων εξέτασης δεν είναι αντιδραστική θα πρέπει να θεωρείται αρνητικό για T. pallidum. Η αντιδραστικότητα που είναι µικρότερη από διφορούµενη θεωρείται αρνητική. Τα δείγµατα που δίνουν διφορούµενα ή θετικά αποτελέσµατα θα πρέπει να θεωρούνται θετικά και η διαδικασία εξέτασης θα πρέπει να επαναλαµβάνεται όπως παραπάνω, εις διπλούν, προσθέτοντας τα Κύτταρα ελέγχου (R2) που παρέχονται στη µία οµάδα κυττάρων και τα Κύτταρα εξέτασης (R1) στην άλλη. Εάν τουλάχιστον σε µία από τις κοιλότητες µε Κύτταρα εξέτασης (R1) το αποτέλεσµα είναι διφορούµενο ή θετικό, το δείγµα θα πρέπει να θεωρείται θετικό για T. pallidum. Για µη συγκεκριµένη αντίδραση, εάν η συγκόλληση είναι µεγαλύτερη στα Κύτταρα εξέτασης (R1) από ό,τι στα Κύτταρα ελέγχου (R2), τότε το δείγµα θεωρείται θετικό και η εξέταση θα πρέπει να επαναληφθεί όπως παραπάνω. Όταν ένα δείγµα έχει µεγαλύτερη ή ίση συγκόλληση στα Κύτταρα ελέγχου (R2), τότε το δείγµα θα πρέπει να απορροφάται µέσω της ακόλουθης διαδικασίας. 7.5. Απορρόφηση µη συγκεκριµένων αντιδράσεων (Διαδικασία που πρέπει να χρησιµοποιείται, εάν η συγκόλληση παρατηρείται τόσο στα Κύτταρα εξέτασης όσο και στα Κύτταρα ελέγχου). 1. Προσθέστε 10 µl δείγµατος σε 190 µl Κυττάρων ελέγχου που έχουν εναιωρηθεί ξανά, αναµίξτε καλά και επωάστε σε θερµοκρασία δωµατίου για 30 λεπτά. 2. Πραγµατοποιήστε φυγοκέντρηση για απόθεση των κυττάρων σε 1500 g κατ' ελάχιστο για 3 λεπτά. 3. Προσθέστε υπερκείµενου υγρού από το βήµα 2 σε 2 κοιλότητες. 4. Αναµίξτε ελαφρά τα Κύτταρα εξέτασης και ελέγχου, για να διασφαλίσετε την καλή επανάληψη της εναιώρησης. Προσθέστε 75 µl Κυττάρων εξέτασης στην 1η κοιλότητα. Προσθέστε 75 µl Κυττάρων ελέγχου στη 2η κοιλότητα. 5. Βεβαιωθείτε ότι έχουν αναµιχθεί καλά και επωάστε σε θερµοκρασία δωµατίου για 45 λεπτά τουλάχιστον. 6. Διαβάστε και ερµηνεύστε τα µοτίβα διευθέτησης όπως παραπάνω. 8. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Δεν διατίθενται µεµονωµένες εξετάσεις ή οριστικά πρότυπα αναφοράς για κάθε στάδιο της ασθένειας. Ως εκ τούτου, η διάγνωση της σύφιλης βασίζεται κυρίως στις ορολογικές εξετάσεις και απαιτεί αποτελέσµατα τόσο από µεθόδους αντισωµάτων διαφορετικών από αυτά έναντι του τρεπονήµατος όσο και από µεθόδους αντισωµάτων έναντι του τρεπονήµατος. Καµιά διαγνωστική εξέταση δεν εξασφαλίζει απόλυτα πως ένα δείγµα δεν περιέχει χαµηλά επίπεδα αντισωµάτων έναντι του T.pallidum, όπως αυτά που υπάρχουν σε ιδιαίτερα πρώιµα στάδια της λοίµωξης. Συνεπώς, ένα αρνητικό αποτέλεσµα ανά πάσα στιγµή δεν αποκλείει την πιθανότητα έκθεσης σε µόλυνση από σύφιλη. Όλα τα αποτελέσµατα εξετάσεων αντισωµάτων έναντι του τρεπονήµατος τείνουν να παραµένουν αντιδραστικά έπειτα από τη µόλυνση από τρεπόνηµα, εποµένως, δεν [GR] 10

θα πρέπει να χρησιµοποιούνται για την αξιολόγηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία. Λόγω της εξακολούθησης της αντιδραστικότητας, συνήθως εφ' όρου ζωής του ασθενούς, οι εξετάσεις αντισωµάτων κατά του τρεπονήµατος δεν χρησιµεύουν στον προσδιορισµό υποτροπής ή εκ νέου µόλυνσης σε ασθενείς που παρουσίασαν αντιδραστικό αποτέλεσµα. Σε αυτήν την περίπτωση, συνιστάται η χρήση άλλων δοκιµασιών: Syphilis Total Ab, Syphilis IgM EIA και RPR. 9. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ 9.1. Μελέτη ακριβείας Η µελέτη ακριβείας πραγµατοποιήθηκε εξετάζοντας 3 δείγµατα (1 αρνητικό, 1 χαµηλό θετικό και 1 θετικό) σε 10 όµοια αντίγραφα κατά την ίδια εκτέλεση (επαναληψιµότητα) και σε 2 όµοια αντίγραφα κατά τη διάρκεια 5 ηµερών σε 2 διαφορετικές παρτίδες και µε ανάγνωση από 2 χειριστές (ενδιάµεση ακρίβεια). Επαναληψιµότητα: Τα 3 δείγµατα έδωσαν πανοµοιότυπα αποτελέσµατα, όταν επαναλήφθηκαν 10 φορές. Ενδιάµεση ακρίβεια/ακρίβεια µεταξύ παρτίδων: Τα 3 δείγµατα έδωσαν πανοµοιότυπα αποτελέσµατα, όταν εξετάστηκαν σε διαφορετικές συνθήκες (40 φορές). 9.2. Κλινική απόδοση Οι αποδόσεις της δοκιµασίας TPHA προσδιορίστηκαν µέσω της εξέτασης δειγµάτων από τυχαίους αιµοδότες, νοσηλευόµενους ασθενείς, ασθενείς που έχουν προσβληθεί από σύφιλη και σε δείγµατα θετικά για δείκτες που δεν σχετίζονται µε τη µόλυνση από το T. pallidum. Οι µελέτες διεξήχθησαν σε 2 τοποθεσίες αιµοδοσίας και στις εγκαταστάσεις της Bio-Rad. 9.2.1. Προσδιοριστικότητα Μελετήθηκε ένα σύνολο 5032 δειγµάτων από αιµοδότες τα οποία συλλέχθηκαν προοπτικά σε 2 διαφορετικές τοποθεσίες. Τα δείγµατα ήταν ορός (3626), EDTA K2 (539) ή πλάσµα ηπαρίνης λιθίου (867) τα οποία εξετάστηκαν σε µια περίοδο µικρότερη των 7 ηµερών µετά τη δειγµατοληψία και συγκρίθηκαν µε τη δοκιµασία ελέγχου που χρησιµοποιήθηκε στο εργαστήριο. [GR] 11

Πίνακας 1: Πληθυσµός αιµοδοτών Τοποθεσ ία Τοποθεσία 1 Αριθµό ς Αρχικά αντιδραστικά δείγµατα (IR) Αντιδραστικά δείγµατα κατ' επανάληψη (RR) 2519 18 7 Προσδιοριστι κότητα (%) 99,72% (2512/2519) Διάστηµα αξιοπιστίας 95% 99,43% 99,89% Τοποθεσία 2 2513* Σύνολο 5032 20 38 (8 θετικά, 30 διφορούµενα) 7 14 (3 θετικά, 11 διφορούµενα) 99,72% (2505/2512) 99,72% (5017/5031) *:ένα δείγµα (αληθώς θετικό) αποσύρθηκε από τον υπολογισµό. 99,43% 99,89% 99,53% 99,85% Η συνολική προσδιοριστικότητα στον πληθυσµό της τράπεζας αίµατος ισοδυναµεί µε 99,72% (5017/5031) µε διάστηµα αξιοπιστίας 95% [99,53% 99,85%]. Ανάµεσα στα 14 ψευδώς θετικά δείγµατα, 11 διαπιστώθηκαν διφορούµενα κατ' επανάληψη. Διεξήχθη επίσης µια αναδροµική µελέτη σε 201 κατεψυγµένα δείγµατα ασθενών από ένα Κέντρο σεξουαλικά µεταδιδόµενων νοσηµάτων ή από προµηθευτές, τα οποία διαπιστώθηκε ότι ήταν αρνητικά για σύφιλη. Η προσδιοριστικότητα σε αυτά τα δείγµατα βρίσκεται στο 99,5% (200/201) µε διάστηµα αξιοπιστίας 95% [97,3% - 100,0%]. 9.2.2. Ευαισθησία Η µελέτη ευαισθησίας διεξήχθη σε 435 αναδροµικά κατεψυγµένα δείγµατα ορού από το εργαστήριο του Κέντρου σεξουαλικά µεταδιδόµενων νοσηµάτων ή από κατεψυγµένα δείγµατα από προµηθευτές. Αυτά τα δείγµατα χαρακτηρίστηκαν θετικά από δοκιµασίες ανοσοπροσδιορισµού, δοκιµασία FTA, δοκιµασία RPR/ VDRL ή δοκιµασίες TPHA σύµφωνα µε την προέλευσή τους. Όλα τα δείγµατα δοκιµάστηκαν πρώτα µε τη δοκιµασία TPHA µε πιστοποίηση CE και, εν συνεχεία, µε τη δοκιµασία Bio-Rad TPHA 500 (72504). Η ευαισθησία σε αυτόν τον πληθυσµό βρίσκεται στο 100% (435/435) µε διάστηµα αξιοπιστίας 95% [99,2% - 100,0%]. 9.3. Αναλυτική ευαισθησία Η αναλυτική ευαισθησία εξετάστηκε σε σχέση µε το Διεθνές Πρότυπο του ΠΟΥ για τη Σύφιλη NIBSC κωδικός 05/132. Χρησιµοποιώντας το ηµιποσοτικό πρωτόκολλο, η ευαισθησία διαπιστώθηκε στα 0,05 IU/mL. 9.4. Αναλυτική προσδιοριστικότητα/μελέτη διασταυρούµενης αντιδραστικότητας 210 δείγµατα δυνητικής παρεµβολής τα οποία περιείχαν αντισώµατα κατά παθογόνων που θα µπορούσαν να οδηγήσουν σε µολυσµατικές ασθένειες [GR] 12

(κυτταροµεγαλοϊός, ιός Epstein Barr, VZV, ιός ερυθράς, ιός ηπατίτιδας C, ιός ηπατίτιδας B, HIV 1/2, HTLV 1/2, Toxoplasma gondii, Dengue, ελονοσία, λεπτοσπείρωση), δείγµατα από έγκυες γυναίκες και πολύτοκες γυναίκες ή δείγµατα από ασθενείς µε διαταραχές του ανοσοποιητικού συστήµατος (αυτοαντισώµατα (ΣΕΛ), ρευµατοειδείς παράγοντες), εξετάστηκαν µε τη δοκιµασία TPHA. Τέσσερα (4) αληθώς θετικά δείγµατα απορρίφθηκαν από τον υπολογισµό. Ένα δείγµα διαπιστώθηκε θετικό κατ' επανάληψη µε την εξέταση TPHA. Η προσδιοριστικότητα που παρατηρήθηκε σε αυτόν τον πληθυσµό-στόχο της τάξεως του 99,5% (205/206) ήταν παρόµοια µε την προσδιοριστικότητα των κλινικών δειγµάτων. 9.5. Φαινόµενο προζώνης Η ύπαρξη πιθανού φαινοµένου προζώνης µελετήθηκε µε την εξέταση 3 δειγµάτων υψηλής τιτλοδότησης (>= 1:20480) σε διαφορετικές αραιώσεις. Η ισοδυναµία των αποτελεσµάτων που παρατηρήθηκε µεταξύ µη αραιωµένων και αραιωµένων δειγµάτων υποδεικνύει την απουσία του φαινοµένου προζώνης. 10. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ. 1. Daguet G.L. - Diagnostic Biologique de la Syphilis. Technique et Biologie, 1995 ; 120 :5-30. 2. Houng H. - Syphilis: new diagnostic directions. Intern. J. STD and AIDS 1992; 3 : 391-413.8. 3. Larsen S.A., Hambie E.A., et coll., Specificity, sensitivity and reproducibility among the fluorescent treponemal antibody absorption test, the microhemagglutination assay for Treponema pallidum antibodies, and the hemagglutination treponemal test for syphilis. J. Clin. Microbiol., 1981 ; 14 : 441 445. 4. North MLet Guntz Ph. Serodiagnostic de la syphilis. La Revue Française des Laboratoires, 1997 ; 294 : 51-58. 5. Paris Hamelin, A., Dreux P. et coll. Treponematoses : aspects cliniques et biologiques. Feuill. Biol. 1991a ; 23 : 88-89. 6. Rathlev T. - Haemagglutination tests utilizing antigens from pathogenic and apathogenic Treponema pallidum WHO/VDT/RES 1965 ; 77 : 65. 7. Rathlev T. - Haemagglutination test utilizing pathogenic Treponema pallidum for the serodiagnosis of syphilis. Br J Vener Dis 1967 ; 43 : 181-5. 8. Sequeira P,J,L. Eldridge A,E. - Treponemal Haemagglutination test. Br J Vener Dis 1973 ; 49 : 242-8. [GR] 13

9. Sluis J.J. Van Der. - Laboratory Techniques in the diagnosis of syphilis: a review. Genitourin Med. 1992 ; 68 : 413-9. 10. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med. 2009. 47:596-606. 11. Tomizawa T, Kasamatsu S. - Haemagglutination tests for diagnosis of syphilis. A preliminary report. Japan. J. Med. Sci. Biol. 19, 305-308, 1966. 12. Tomizawa T. Kasamatsu S. Yamaya S. - Usefulness of the haemagglutination test using Treponema pallidum antigen (TPHA) for the serodiagnosis of syphilis. Jap J Med Sci Biol 1969 ; 22 : 341-50. [GR] 14

[GR] 15

Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette Γαλλία Τηλ.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Φαξ: +33 (0) 1 47 41 91 33 12/2014 www.bio-rad.com 883683 [GR] 16