ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «Αναλυτική Χημεία και Νανοτεχνολογία» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Παρασκευή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και νανοσωματιδίων» Παναγιώτα Μ. Καλλιγοσφύρη Χημικός Επιβλέπων: Θεόδωρος K. Χριστόπουλος, Καθηγητής ΠΑΤΡΑ, 2017
Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Χημείας, Καλλιγοσφύρη Παναγιώτα 2017 - Με την επιφύλαξη παντός δικαιώματος ii
SCHOOL OF NATURAL SCIENCES DEPARTMENT OF CHEMISTRY MASTER OF SCIENCE IN: Analytical Chemistry and Nanotechnology MASTER S THESIS «Synthesis of recombinant proteins and nanoparticles» Panagiota M. Kalligosfyri Chemist Supervisor: Theodore K. Christopoulos, Professor Patras, 2017 iii
University of Patras, Department of Chemistry, Kalligosfyri Panagiota 2017 All rights reserved iv
Μέλη Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής: Χριστόπουλος Θεόδωρος Καθηγητής, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Καλογιάννη Δέσποινα Λέκτορας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Πουλόπουλος Παναγιώτης Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Επιστήμης των Υλικών, Πανεπιστήμιο Πατρών iv
Three Member Examination Committee: Christopoulos Theodoros, Professor, Department of Chemistry, University of Patras Kalogianni Despina Lecturer, Department of Chemistry, University of Patras Poulopoulos Panagiotis Associate Professor, Department of Materials Science, University of Patras v
Η παρούσα ΜΔΕ αφιερώνεται Στους γονείς μου Μιχάλη και Γεωργία vi
Πρόλογος Η παρούσα ΜΔΕ εκπονήθηκε στο Τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη του κ. Θεοδώρου Χριστόπουλου. Πρώτα απ όλους θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή κ. Θεόδωρο Χριστόπουλο για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε κατά τη διάρκεια του μεταπτυχιακού διπλώματος, για τις γνώσεις και τις ιδέες που μοιράστηκε μαζί μου αλλά και για τη βοήθεια που μου προσέφερε. Επίσης, ένα μεγάλο ευχαριστώ στην λέκτορα κα Δέσποινα Καλογιάννη για την πολύ σημαντική υποστήριξη και βοήθεια της όλο αυτό το χρονικό διάστημα και την πολύτιμη παρουσία της στον εργαστηριακό χώρο, καθώς και για το ότι δέχτηκε να αξιολογήσει την μεταπτυχιακή διπλωματική μου εργασία. Στην συνέχεια, ευχαριστώ πολύ τον κ. Παναγιώτη Πουλόπουλο, αναπληρωτή καθηγητή του τμήματος Επιστήμης των Υλικών του Πανεπιστημίου Πατρών, που δέχτηκε να αξιολογήσει την μεταπτυχιακή μου εργασία. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην υπόλοιπη ομάδα του εργαστηρίου και ιδιαίτερα στην, πλέον, κάτοχο μεταπτυχιακού διπλώματος, Έλενα Σπύρου για την πολύτιμη βοήθειά της στο ξεκίνημα της πειραματικής μου δραστηριότητας. Ακόμη ένα μεγάλο ευχαριστώ στην υποψήφια για το μεταπτυχιακό της δίπλωμα Αρετή Σεβαστού για τις ωραίες στιγμές που μοιραστήκαμε τόσο εντός όσο και εκτός του εργαστηρίου. Την ευχαριστώ για την υποστήριξη της σε όποια δυσκολία προέκυπτε αλλά και επειδή απέκτησα μία πολύ καλή φίλη. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τέλος όλους τους φίλους αλλά και την αδερφή μου, Χριστίνα, που με υποστήριζαν και ανέχονταν τα παράπονα μου στις δυσκολίες που εμφανίζονταν και μου έδιναν δύναμη να συνεχίσω. Ευχαριστώ τη Φωτεινή Μοσχονά και την Κατερίνα Σταθακοπούλου για τη βοήθεια τους όσον αφορά το σχεδιασμό των σχημάτων που περιέχονται στη διπλωματική μου εργασία. Το τελευταία και μεγαλύτερο ευχαριστώ στους γονείς μου, που χωρίς τη συνεχή υποστήριξή τους δεν θα είχα καταφέρει να υλοποιήσω τους στόχους μου.. vii
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι φωταυγάζουσες πρωτεΐνες και τα φθορίζοντα νανοσωματίδια αποτελούν αντικείμενα έντονης ερευνητικής δραστηριότητας τα τελευταία χρόνια γιατί έχουν εισαχθεί ως νέοι ιχνηθέτες στις σύγχρονες μεθόδους χημικής ανάλυσης. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια επίσης χρησιμοποιούνται σε πληθώρα αναλυτικών μεθόδων για τον ταχύ και απλό διαχωρισμό μορίων από διάλυμα με τη βοήθεια μαγνητικού πεδίου. Αντικείμενο της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας είναι η πειραματική μελέτη διαφόρων μεθόδων παρασκευής φωτοπρωτεϊνών και νανοσωματιδίων. Συγκεκριμένα η εργασία πραγματεύεται τα εξής: (A) Υπερέκφραση, απομόνωση και καθαρισμό ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης σε βακτήρια. Αρχικά υπερεκφράζεται η αποπρωτεΐνη αποαικουορίνη σε E. coli χρησιμοποιώντας πλασμιδιακό φορέα, ο οποίος φέρει το πεπτίδιο οδηγό της πρωτεΐνης Α έτσι ώστε η αποαικουορίνη μετά τη σύνθεσή της να οδηγείται στον περιπλασμικό χώρο του κυττάρου. Ακολουθεί απομόνωση της αποαικουορίνης με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου, συμπλοκοποίηση (ενεργοποίηση) με σελεντεραζίνη και καθαρισμός της ενεργής αικουορίνης με χρωματογραφία υδρόφοβων ομάδων. Η ενεργότητα της αικουορίνης προσδιορίζεται με βάση την ένταση της εκπεμπόμενης βιοφωταύγειας μετά από προσθήκη ιόντων Ca 2+. Η απόδοση της μεθόδου είναι 4 φορές μεγαλύτερη από προηγούμενη μέθοδο που περιλάμβανε έκφραση της αποαικουορίνης στο κυτταρόπλασμα, διαλυτοποίηση των σχηματιζόμενων συσσωματωμάτων εγκλεισμού και χρωματογραφικό διαχωρισμό. (B) Παρασκευή φθοριζόντων ημιαγώγιμων νανοκρυστάλλων (κβαντικές τελείες, quantum dots, QDs). Μελετήθηκαν μέθοδοι σύνθεσης QDs είτε σε οργανικούς διαλύτες ή σε υδατικό περιβάλλον με έμφαση την παρασκευή τους σε υδατικά διαλύματα γιατί είναι συμβατά με τις συνθήκες ανάλυσης βιομορίων. Παρουσιάζεται η σύνθεση κβαντικών τελειών CdSe σε οργανικούς διαλύτες και η σύνθεση κβαντικών τελειών CdS σταθεροποιημένων με μερκαπτοπροπιονικό οξύ σε υδατικό περιβάλλον σε διάφορες συνθήκες. Ακολουθεί χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων με τη λήψη φασμάτων εκπομπής φθορισμού. viii
(Γ) Παρασκευή νανοπλειάδων χρυσού με την πρωτεΐνη αλβουμίνη, οι οποίες παρουσιάζουν χαρακτηριστικό φθορισμό. (Δ) Σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου είτε με συγκαταβύθιση αλάτων Fe 3+ και Fe 2+ ή με οξείδωση Fe 2+ σε αλκαλικό περιβάλλον. Στη συνέχεια μελετήθηκε η χημική τροποποίηση της επιφάνειας των νανοσωματιδίων. Έγινε εισαγωγή πρωτοταγών αμινομάδων αντιδρώντας με αμινοπροπυλοτριαιθοξυσιλάνιο και περαιτέρω βιοτινυλίωση των αμινομάδων. Τα νανοσωματίδια χαρακτηρίζονται με ηλεκτρονική μικροσκοπία διαπερατότητας (TEM). Η επιβεβαίωση της παρουσίας της βιοτίνης στην επιφάνεια των σωματιδίων πραγματοποιήθηκε με πρόσδεση του συζεύγματος στρεπταβιδίνη-αλκαλική φωσφατάση και δοκιμασία της ενεργότητας του ενζύμου μετά από προσθήκη του φωσφορικού εστέρα της π-νιτροφαινόλης ως χρωμογόνου υποστρώματος. Λέξεις κλειδιά: Βιοφωταύγεια, Φωτοπρωτεΐνες, Φθορίζοντα νανοσωματίδια, Κβαντικές τελείες, Νανοπλειάδες, χρυσού, Μαγνητικά νανοσωματίδια ix
SUMMARY In recent years, photoproteins and fluorescent nanoparticles have become the focus of intensive research due to their potential as excellent reporters in modern analytical methods. Magnetic nanoparticles have also been introduced in a plethora of analytical methods because they enable the simple and rapid separation of molecules from the liquid phase with the help of a magnetic field. The objective of the present MSc work is to study, experimentally, various methods of preparation of recombinant photoproteins and nanoparticles. More specifically, this thesis includes the following: (A) Overexpression, isolation and purification of recombinant photoprotein aequorin in bacteria. First, the apoprotein apoaequorin is expressed in E. coli by using a plasmid vector that allows expression of apoaequorin fused with ompa peptide. The ompa peptide leads the synthesized protein to the periplasmic space thereby facilitating its purification. Apoaequorin is isolated by immobilized metal ion affinity chromatography and then the fully active aequorin is prepared through complexation of apoaequorin with coelenterazine. Aequorin is further purified by hydrophobic chromatography. The activity of aequorin is measured by the characteristic bioluminescent reaction upon the addition of Ca 2+. The yield is about 4 times higher than the method previously reported by our laboratory that involves expression in the cytoplasm, solubilization of inclusion bodies, chromatographic separation and activation of the protein. (B) Preparation of fluorescent semiconductor nanocrystals (quantum dots, QDs). We studied synthetic methods performed either in organic solvents or in aqueous solution. Emphasis was given in the aqueous media because of their compatibility with biomolecular analysis. The synthesis of CdSe quantum dots in organic solvents and the synthesis of CdS quantum dots, stabilized with mercaptopropionic acid, in aqueous solution are presented. The nanoparticles were characterized by fluorescence spectroscopy. (C) Preparation of gold nanoclusters with the protein albumin. These nanoparticles exhibit interesting fluorescence properties. x
(D) Synthesis of iron oxide magnetic nanoparticles either by coprecipitation of Fe 3+ and Fe 2+ salts in alkaline solution or by the alkaline oxidation of Fe 2+. We also studied the chemical modification of the surface of the synthesized nanoparticles. Primary amino groups were introduced via the reaction with aminopropyltriethoxysilane. The amino groups were then biotinylated. The nanoparticles were characterized by transmission electron microscopy (TEM). The confirmation of the presence of biotin moieties on the surface of the particles was accomplished by reacting with alkaline phosphatase-conjugated streptavidin. The activity of nanoparticle-attached phosphatase was revealed through the addition of the chromogenic substrate p- nitrophenyl phosphate. Key words: Bioluminescence, Photoproteins, Fluorescent nanoparticles, Quantum Dots, Gold nanoclusters, Magnetic nanoparticles xi
ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΟΙ LB-broth O/N E.Coli RT Amp RPM Cell spreader TAE buffer RXN bp IMAC Ni-NTA DTT QDs MPA NCs MNPs SA-ALP Luria-Bertani Ολονύκτια επώαση Escherichia Coli Room Temperature αμπικιλλίνη Reps per minute (περιστροφές ανά λεπτό) διανομέας κυττάρων Tris-acetate-EDTA buffer reaction base pairs Ion metal affinity chromatography Nickel-nitrilotriacetic acid Dithiothreitol Quantum Dots Mercaptopropionic acid Nanoclusters Magnetic Nanoparticles Σύζευγμα στρεπταβιδίνης αλκαλικής φωσφατάσης xii
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: Βιοφωταύγεια - Φωτοπρωτεΐνη αικουορίνη... 2 1.1. Βιοφωτάυγεια - Βιοφωταυγείς πρωτεΐνες... 2 1.2. Αικουορίνη... 4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: Νανοσωματίδια με νέες ιδιότητες... 9 2.1. Νανοσωματίδια... 9 2.2.i.Νανοσωματίδια χρυσού: Δομή, ιδιότητες και σύνθεση... 14 2.2.ii. Φθορίζοντες νανοκρύσταλλοι - κβαντικές κουκίδες...21 2.2.iii. Νανοσωματίδια με μαγνητικές ιδιότητες...32 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 41 Όργανα-Υλικά, Αντιδραστήρια, Διαλύματα...42 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: Έκφραση, απομόνωση και καθαρισμός ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης... 47 3.1. Παρασκευή και καλλιέργεια μετασχηματισμένων βακτηρίων E.coli W802... 49 3.1.1. Καλλιέργεια βακτηρίων E.Coli WA802 σε στερεό θρεπτικό υλικό... 49 3.1.1.1.Παρασκευή υγρής καλλιέργειας βακτηρίων E.coli WA802...49 3.1.1.2. Παρασκευή στερεής καλλιέργειας βακτηρίων E.coli WA802 σε τρυβλία...50 3.1.2. Παρασκευή επιδεκτικών κυττάρων προς εισαγωγή ανασυνδυασμένου DNA..50 3.1.2.1. Επιδεκτικά κύτταρα...51 3.1.2.2. Μετασχηματισμός (transformation)...52 3.1.3. Αποτελέσματα- συμπεράσματα...53 3.2.Απομόνωση και ταυτοποίηση του πλασμιδίου pam-he από τα μετασχηματισμένα κύτταρα της E.coli...54 3.2.1. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA...56 3.2.2. Ταυτοποίηση του πλασμιδιακού DNA με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης...57 3.2.2.1.Πέψη του πλασμιδιακού DNA με το περιοριστικό ένζυμο EcoR1...57 3 2.2.2.Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζη...58 xiii
3.2.3. Αποτελέσματα- Συμπεράσματα...59 3.3. Έκφραση, απομόνωση και ποσοτικός προσδιορισμός της ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αποαικουορίνης...62 3.3.1. Έκφραση της ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης ( His-Cys4- aequorin)...62 3.3.2. Απομόνωση της αικουορίνης με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου (IMAC) με στήλη Ni-NTA αγαρόζης...62 3.3.3. Μέθοδος Bradford...63 3.3.4. Αποτελέσματα-Συμπεράσματα...64 3.4. Ενεργοποίηση της αποαικουορίνης, καθαρισμός της αικουορίνης, προσδιορισμός της ποσότητας και της ενεργότητας της... 69 3.4.1. Ενεργοποίηση της αποαικουρίνης σε αικουορίνη... 69 3.4.2. Καθαρισμός της ενεργοποιημένης αικουορίνης με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων... 69 3.4.3. Ποσοτικός προσδιορισμός και προσδιορισμός της ενεργότητας των επιμέρους εκλουσμάτων με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων...70 3.4.3.i. Ποσοτικός προσδιορισμός με τη μέθοδο Bradford...70 3.4.3.ii.Προσδιορισμός της ενεργότητας με προσθήκη Ca 2+...70 3.4.4. Αποτελέσματα-συμπεράσματα...71 3.4.4.i. Ποσοτικός προσδιορισμός με τη μέθοδο Bradford...72 3.4.4.ii. Προσδιορισμός της ενεργότητας με προσθήκη Ca 2+...77 3.4 5. Γενικά συμπεράσματα... 80 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: Σύνθεση κβαντικών τελειών (qds) σε οργανικούς διαλύτες και υδατικά διαλύματα... 84 4.1. Οργανική σύνθεση CdSe-OLA κβαντικών κουκίδων QDs... 85 4.1.1. Πειραματική πορεία... 85 4.1.2. Αποτελέσματα-συμπεράσματα... 86 4.2. Σύνθεση κβαντικών κουκίδων CdS σταθεροποιημένων με μερκαπτοπροπιονικό οξύ (MPA)... 88 4.2.1. Πειραματική πορεία... 88 4.2.2. Αποτελέσματα-συμπεράσματα... 90 4.2.2.1. Συγκέντρωση Cd 2+ 20 mm και MPA 114 mm, ph 10 (1η σειρά πειραμάτων)... 90 4.2.2.2. Συγκέντρωση Cd 2+ 20 mm και MPA 114 mm, ph 10 (2η σειρά πειραμάτων)... 91 xiv
4.2.2.3. Συγκέντρωση Cd 2+ 20 mm και MPA 114 mm, ph 10 (3η σειρά πειραμάτων)... 92 4.2.2.4. Συγκέντρωση Cd 2+ 5 mm και MPA 28,5 mm, ph 10 (3η σειρά πειραμάτων)... 94 4.2.2.5. Παραλλαγές στην πειραματική πορεία των CdS QDs...96 4.3. Παρασκευή κβαντικών τελειών CdS επικαλυμμένων με μερκαπτοπροπιονικό οξύ (MPA)...... 97 4.3.1. Πειραματική πορεία...97 4.3.2. Αποτελέσματα-συμπεράσματα...98 4.3.2.1. Σύνθεση QDs CdS επικαλυμμένων με MPA σε ph 9...98 4.3.2.2.. Σύνθεση QDs CdS επικαλυμμένων με MPA σε ph 12...100 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: Σύνθεση νανο-πλειάδων χρυσού-βόειας αλβουμίνης (BSA-Au nanoclusters)... 104 5.1. Σύνθεση νανο-πλειάδων χρυσού-βόειας αλβουμίνης (BSA-Au nanoclusters)...104 5.1.1. Πειραματική πορεία... 104 5.1.2. Αποτελέσματα - συμπεράσματα... 105 5.1.2.i. Συγκέντρωση 50 mg/ml BSA και 10 mm HAuCl 4...106 5. 1.2.ii. Συγκέντρωση 25mg/mL BSA και 10mM HAuCl 4...106 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6: Σύνθεση μαγνητικών σωματιδίων... 113 6.1. Μέθοδος Α : Συγκαταβύθιση σε αλκαλικό περιβάλλον... 113 6.2. Μέθοδος Β: Οξειδωτική αλκαλική υδρόλυση ιόντων σιδήρου σε θερμοκρασία περιβάλλοντος... 114 6.3. Μέθοδος C: Οξειδωτική αλκαλική υδρόλυση ιόντων σιδήρου σε υψηλή θερμοκρασία... 115 6.4. Σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων Fe3O4 με συγκαταβίθυση σε αλκαλικό περιβάλλον... 115 6.4.1. Πειραματική πορεία σύνθεσης... 115 6.4.2. Τροποποίηση των MNPs με αμινομάδες:... 116 6.4.3. Βιοτινυλίωση επικαλυμμένων με APTES Fe 3 O 4 NPs.... 117 6.4.4. Αποτελέσματα-συμπεράσματα... 118 6.4.4.i.Μέθοδος Α...118 6.4.4.ii. Μέθοδος Β...118 xv
6.4.4.iii. Μέθοδος C...119 6.4.4.iv. Γενικά συμπεράσματα μεθόδων Α,Β, C...119 6.4.4.v.Νανοσωματίδια Fe 3 O 4...122 Βιβλιογραφία... 130 xvi
Θεωρητικό μέρος 1
Κεφάλαιο 1 1. Βιοφωταύγεια - Φωτοπρωτεΐνη αικουορίνη 1.1. Βιοφωταύγεια - Βιοφωταυγείς πρωτεΐνες Η χημειοφωταύγεια είναι το φαινόμενο κατά το οποίο χημική αντίδραση παράγει ένα ηλεκτρονικά διεγερμένο σωματίδιο, το οποίο εκπέμπει φως κατά την επιστροφή του στη βασική κατάσταση ή όταν μεταφέρει την ενέργειά του σε ένα άλλο σωματίδιο, το οποίο με τη σειρά του εκπέμπει φως (Prendergast et al., 2000). Οι χημειοφωταυγείς αντιδράσεις συμβαίνουν και σε βιολογικά συστήματα. Σε αυτή την περίπτωση, όπου η εκπομπή φωτός είναι αποτέλεσμα χημικών αντιδράσεων από ζωντανούς οργανισμούς, η χημειοφωταύγεια ονομάζεται βιοφωταύγεια. Η εκπομπή ακτινοβολίας στα βιολογικά συστήματα συνδέεται με την οξείδωση ενός χρωμογόνου υποστρώματος που ονομάζεται λουσιφερίνη, από το ένζυμο φωτοφεράση (λουσιφεράση), αλλά και από πρωτεΐνες που ονομάζονται φωτοπρωτεΐνες. Το φαινόμενο της βιοφωταύγειας παρουσιάζεται σε πολλούς οργανισμούς αρκετά διαφορετικούς μεταξύ τους, όπως η πυγολαμπίδα, ο θαλάσσιος πανσές, ορισμένες μέδουσες, βακτήρια, πρωτόζωα και οστρακόδερμα. Οι διάφοροι οργανισμοί παράγουν φως κυρίως με σκοπό την κάλυψη, την προσέλκυση, τον αντιπερισπασμό, την επικοινωνία κ.α (Kricka et al., 1991). Αρκετές φορές το φαινόμενο της βιοφωταύγειας, συγχέεται λανθασμένα με το φωσφορισμό. Στο φαινόμενο του φωσφορισμού η ενέργεια για την εκπομπή του φωτός αποτελεί συνέπεια της απορρόφησης φωτός και όχι μίας χημικής αντίδρασης. Ο φθορισμός επίσης βασίζεται στην απορρόφηση φωτός, όμως ο φθορισμός και ο φωσφορισμός διαφέρουν στο ότι o φωσφορισμός παραμένει για ένα μικρό χρονικό διάστημα ύστερα από την απομάκρυνση της πηγής διέγερσης, κάτι που δε συμβαίνει με τον φθορισμό. Παρά το γεγονός ότι ορισμένα βιοφωταυγή συστήματα είναι φθορίζοντα, αυτό δεν συμβαίνει πάντα, με αποτέλεσμα η παρουσία ή η απουσία φθορισμού να μην είναι ενδεικτική της ύπαρξης ή μη βιοφωταύγειας (Widder et al., 2014). Οι βιοφωταυγείς πρωτεΐνες χρησιμοποιούνται σε μια πληθώρα αναλυτικών μεθόδων για την ανάπτυξη υπερευαίσθητων δοκιμασιών και απεικόνιση διάφορων διαδικασιών των 2
κυττάρων. Κατά καιρούς έχουν μελετηθεί οι μηχανισμοί τους, τα υποστρώματα που απαιτούν αλλά και οι βιοφωταυγείς ιδιότητές τους. Οι ερευνητικές ομάδες τις χωρίζουν σε δύο κατηγορίες τις φωτοπρωτεΐνες και τις λουσιφεράσες (Rowe et al., 2009). Η ενζυμική αντίδραση γνωστή ως αντίδραση λουσιφερίνης-λουσιφεράσης, κατά την οποία λαμβάνει χώρα οξειδωτική αντίδραση με τη χρήση μοριακού οξυγόνου και η δημιουργία της οξυλουσιφερίνης καταλύεται από το ένζυμο λουσιφεράση. Το ATP και το ιόν Mg 2+, προκαλούν την αδενυλίωση της λουσιφερίνης. Αυτό ακολουθείται από την οξείδωση της λουσιφερίνης, την κυκλοποίηση και την αποκαρβοξυλίωση της ένωσης αδενυλ-λουσιφερίνης. Τα παραπάνω οδηγούν σε εκπομπή φωτός και CO 2 (Rowe et al., 2009). Στις φωτοπρωτεΐνες λαμβάνει χώρα ενδομοριακός μετασχηματισμός, που είναι υπεύθυνος για την εκπομπή φωτός (Shimomura et al., 2005). Το ιόν Ca 2+ προκαλεί μια αλλαγή στη διαμόρφωση του μακρομορίου που σταθεροποιεί την υπεροξυσελεντεραζίνη που σχηματίζεται όταν η σελεντεραζίνη ενσωματώνεται στην πρωτεΐνη. Η σταθεροποίηση οδηγεί σε αποκαρβοξυλίωση και εκπομπή φωτός και CO 2 (Rowe et al., 2009). Μερικές από τις φωτοπρωτεΐνες που έχουν απομονωθεί από ζωντανούς οργανισμούς είναι οι mnemiopsin και berovin που έχουν απομονωθεί από τη μέδουσα (χτενοειδής) Mnemiopsis και την Beroe lovata (Rowe et al., 2009), αντίστοιχα, η πρωτεΐνη από το σκουλήκι Chaetopterus variopedatus, η συμπλεκτίνη από το καλαμάρι Symplectoteuthis oualaniensis, η πρωτεΐνη phiopsila από τον αστερία Photoprotein Ophiopsila californica κ.ά (Daunert et al., 2006). Οι πιο γνωστοί βιοφωταυγείς ιχνηθέτες είναι η αικουορίνη η οποία απομονώνεται από την μέδουσα Aequoria Victoria, και η λουσιφεράση που απομονώνεται από την πυγολαμπίδα Photinus Pyralis (Rowe et al., 2009). Οι διάφοροι ιχνηθέτες συζευγνύονται με τα επιθυμητά μόρια στόχους. Συνήθως το στοιχείο αναγνώρισης προσκολλάται στο C- or N-τελικό άκρο, συγκεκριμένων αμινοξέων στην αλληλουχία της πρωτεΐνης, μέσω συστημάτων αλληλεπίδρασης όπως βιοτίνης-στρεπταβιδίνης ή απτένιο-αντίσωμα. Όμως πλέον αναπτύσσονται και δοκιμασίες όπου χρησιμοποιούνται μοριακοί διακόπτες, έχοντας ως αρχή την ειδική αναγνώριση των αναλυτών και το σχηματισμό προϊόντων που εκπέμπουν φως (Rowe et al., 2009). 3
Οι βιοφωταυγείς και οι φθορίζουσες πρωτεΐνες βρίσκουν μεγάλη εφαρμογή και στην έρευνα σχετικά με την γονιδιακή έκφραση, με κυρίαρχη την φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP (πράσινη ακτινοβολία με μήκος κύματος εκπομπής λ=509nm). Η βιοφωταυγής δράση της GFP μπορεί να αποτελέσει δείκτη της έκφρασης μιας πρωτεΐνης στόχου. Αυτό επιτυγχάνεται με την εισαγωγή της αλληλουχίας που είναι υπεύθυνη για την έκφραση της GFP, δίπλα στο γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη στόχο. Με την εισαγωγή του γενετικού υλικού, που περιέχει τις αλληλουχίες αυτές, σε κύτταρα ξενιστές, η GFP και η πρωτεΐνη στόχος εκφράζονται μαζί. Το φαινόμενο της βιοφωταύγειας έχει εφαρμοστεί για τη μελέτη μολυσματικών ασθενειών, μέσω της παρακολούθησης της πορείας της λοίμωξης in vivo, σε περιβαλλοντικές δοκιμές για μελέτη της τοξικότητας, στην παρακολούθηση και την απεικόνιση της μετανάστευσης, του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης των κυττάρων. Επιπλέον η βιοφωταύγεια κατέχει σημαντική θέση, όσον αφορά την παρακολούθηση καρκινικών κυττάρων σε ζωντανούς οργανισμούς. Η εισαγωγή γονιδίων που εκφράζουν βιοφωταυγείς πρωτεΐνες σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και η μετέπειτα εισαγωγή των τελευταίων σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια έχει καταστήσει δυνατή την εκτίμηση της αποτελεσματικότητας των χημειοθεραπειών in vivo ( Widder et al., 2014). 1.2. Αικουορίνη Η αικουορίνη είναι μια φωτοπρωτεΐνη που παρουσία ιόντων Ca 2+ εκπέμπει φως. Ο μηχανισμός της αντίδρασης βιοφωταύγειας της αικουορίνης, φαίνεται να μην είναι ακόμα πλήρως αποσαφηνισμένος. Αυτό που πιθανά συμβαίνει είναι η τροποποίηση της δομής της πρωτεΐνης και η μετατροπή της σε οξειδάση, η οποία καταλύει την οξείδωση της σελεντεραζίνης (Σχήμα 1.1) προς διεγερμένο σελεντεραμίδιο, με παραγωγή CO 2 (Cormier et al., 1989). 4
Σχήμα 1.3 : Δομή σελεντεραζίνης. Το οξυγόνο που συμμετέχει στην αντίδραση βρίσκεται δεσμευμένο με τη μορφή υπεροξειδίου (Σχήμα 1.2). Η ομάδα υπεροξειδίου βρίσκεται στη θέση C2 της σελεντεραζίνης και προστατεύεται από το διαλύτη αλλά και από την πρωτεΐνη. Κάθε αντίδραση με τα κατάλοιπα της πρωτεΐνης, που μπορεί να μεταβάλει τη δομή της, οδηγεί και σε διάσπαση του δεσμού μεταξύ υπεροξειδίου και σελεντεραζίνης (Daunert et al., 2006). Σχήμα 1.2: Ο μηχανισμός της αντίδρασης βιοφωταύγειας της αικουορίνης. (Cormier et al., 1989). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.2 με τη δέσμευση των κατιόντων ασβεστίου, η δομή της πρωτεΐνης αλλάζει. Αυτό οδηγεί στην κυκλοποίηση του υπεροξειδίου με τη σελεντεραζίνη. Το ενδιάμεσο αυτό προϊόν ονομάζεται διοξετανόνη. Το προϊόν αυτό στιγμιαία διασπάται και οδηγεί στην παραγωγή σελεντεραμιδίου και διοξειδίου του άνθρακα (Daunert et al., 2006). Όταν το σελεντεραμίδιο επιστρέψει στη θεμελιώδη κατάσταση εκπέμπει ακτινοβολία, με διάρκεια περίπου 3s (Σχήμα 1.2) (Cormier et al., 1989). Η αικουορίνη προέρχεται από έναν θαλάσσιο οργανισμό, τη μέδουσα Aequoria Victoria (Σχήμα 1.3). 5
Σχήμα 1.3: Αριστερά απεικονίζεται η δομή της πρωτεΐνης και δεξιά η μέδουσα Aequoria Victoria από την οποία απομονώνεται η πρωτεΐνη. (https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/6b/aequorin_1ej3.png,https://upload.wiki media.org/wikipedia/commons/thumb/7/73/aequorea4.jpg/800px-aequorea4.jpg) Η ακριβής δομή της έχει βρεθεί και εξηγεί περαιτέρω το μοριακό μηχανισμό της χημειοφωταύγειας. Αποτελείται από ένα αποπρωτεϊνικό τμήμα (αποαικουορίνη), μια πολυπεπτιδική αλυσίδα 189 αμινοξέων με μοριακή μάζα 21 kda, μια υδρόφοβη ομάδα και τη χρωμοφόρο ομάδα σελεντεραζίνη (Σχήμα 1.1) που έχει μοριακή μάζα 400 Da. Η αποαικουορίνη διαθέτει 3 θέσεις δέσμευσης ιόντων Ca 2+ (Chiesa et al., 2001). H σελεντεραζίνη θωρακίζεται στην κεντρική κοιλότητα της πρωτεΐνης και η ομάδα υπεροξειδίου του τμήματός της σταθεροποιείται με δεσμούς υδρογόνου μέσω των πρωτεϊνικών καταλοίπων της Τυροσίνης 184. Οι θέσεις δέσμευσης των Ca 2+, σχηματίζονται από τις E και F έλικες της πρωτεΐνης (EF- hand regions). 6
Σχήμα 1.4: Απεικονίζεται η πρωτοταγής δομή της αικουορίνης και οι θέσεις δέσμευσης του Ca 2+. (http://www.cell.com/cms/attachment/529586/3614679/gr1.jpg) Η δέσμευση των ιόντων Ca 2+ προκαλεί τη δημιουργία ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ της αποπρωτεΐνης και της υδρόφοβης ομάδας, ο οποίος συνδέεται με την εκπομπή ενός φωτονίου. Το μήκος κύματος εκπομπής της ακτινοβολίας είναι λ=470 nm (Inouye et al., 1985). Η απόδοση αυτή της αντίδρασης εξαρτάται από την συγκέντρωση του ασβεστίου που εκτίθεται η αικουορίνη. Η αντίδραση πραγματοποιείται ακαριαία όταν κορεσμένο διάλυμα ιόντων ασβεστίου ( 10 μm) προστεθεί στο διάλυμα τη πρωτεΐνης. Η κλωνοποίηση του cdna της αικουορίνης άνοιξε το δρόμο για πολλές εφαρμογές για δύο βασικούς λόγους. Πρώτον το DNA της ανασυνδυασμένης αποαικουορίνης μπορεί να εισαχθεί και να εκφρασθεί σε μεγάλη ποικιλία κυττάρων όπως θηλαστικών κυττάρων, φυτικών, βακτηριακών κλπ. Η ενεργοποίησή της, σε αικουορίνη, γίνεται με την παρουσία μοριακού οξυγόνου, σελεντεραζίνης και 2-μερκαπτοαιθανόλης ή διθειοθρεϊτόλης (Dunert et al., 2006). Ο ρόλος των 2 τελευταίων είναι να προστατεύουν τις σουλφυδρυλομάδες της αποαικουορίνης κατά την ενεργοποίηση. Δεύτερος λόγος είναι η μοριακή τροποποίηση της επιφάνειας της αικουορίνης, με ειδικές αλληλουχίες ανιχνευτές (Chiesa et al., 2001). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία υπάρχουν τα εξής είδη αικουορίνης: ισοαικουορίνες, ετερογενές μίγμα ισοαικουορινών σε διαφορετικές αναλογίες, και ημισυνθετικές αικουορίνες. Οι ημισυνθετικές αποτελούνται από ανασυνδυασμένη αποαικουορίνη με διαφορετικά ανάλογα σελεντεραζίνης η κάθε μία, 15 από τις οποίες είναι οι πιο σημαντικές, παρουσιάζουν διαφορετική ευαισθησία στα Ca 2+, δηλαδή διαφορές στην ποσότητα πρόσδεσης των ιόντων ασβεστίου. Για παράδειγμα εάν η αρχική υδροξυφαινυλομάδα της σελεντεραζίνης αντικατασταθεί με μία μεγαλύτερη αρωματική ομάδα, τότε η ευαισθησία της πρωτεΐνης μειώνεται. Αντίθετα με αντικατάστασή της με μία μικρή μη-αρωματική ομάδα η ευαισθησία σε Ca 2+ αυξάνεται (Shimomura et al., 1993). Ανάλογα με το είδος της αικουορίνης η μοριακή της μάζα κυμαίνεται μεταξύ 20-23 kda. Το ισοηλεκτρικό της σημείο είναι από 4,2-4,9 και παρουσία ιόντων ασβεστίου 1 mg καθαρής αικουορίνης εκπέμπει (4,3-5,2) * 10 15 φωτόνια. Τα πρώτα βήματα απομόνωσης της αικουορίνης από τη μέδουσα Aequorea Victoria έγιναν από τους Shimomura και Johnson (1962). Αυτοί χρησιμοποίησαν ψαλίδι για την απομάκρυνση ιστών που δεν χρειάζονταν και για τη δημιουργία λωρίδων, από το σώμα 7
της μέδουσας, που περιείχαν φωτογενείς ουσίες. Οι λωρίδες πιέζονταν και το υγρό συλλεγόταν. Ακολουθούσε φιλτράρισμα με αποτέλεσμα να απομακρύνεται το 99% ανεπιθύμητων ουσιών και οργανιδίων της μέδουσας (Shimomura et al. 1962). Η απομόνωση 100-200 mg καθαρής πρωτεΐνης απαιτούσε τη συλλογή 2,5 τόνων μεδουσών ή 50000 ζωντανών οργανισμών. Η δυσκολία αυτή οδήγησε στην ανάγκη αξιοποίησης των τεχνικών του ανασυνδυασμένου DNA και επομένως στην επιτυχή κλωνοποίηση και έκφραση του cdna της αποαικουορίνης (Shimomura et al. 1993). Αυτό επιτεύχθηκε το 1985 από 2 ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες. Η πρώτη ανέλυσε το cdna της αικουορίνης και προέβλεψε ότι η πρωτεΐνη είχε μοριακή μάζα 21,4 kda και αποτελούνταν από 189 αμινοξέα, με Ν-τελικό άκρο τη βαλίνη και C-τελικό άκρο το αμινοξύ προλίνη (Inouye et al, 1985). Η δεύτερη ομάδα κλωνοποίησε και εξέφρασε την αποπρωτεΐνη σε βακτηριακά κύτταρα της Escherichia coli, η οποία αποτελούταν από 196 αμινοξέα και είχε μοριακή μάζα 20,6 kda (Prasher et al. 1985, 1987). Έρευνες που πραγματοποιήθηκαν αργότερα απέδειξαν ότι οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες που προέκυψαν από τις δύο ομάδες ήταν πρακτικά πανομοιότυπες (Daunert et al., 2006). Η δυνατότητα να παραχθεί ανασυνδυασμένη αικουορίνη σε ζωντανά κύτταρα, όπως αυτά της Escherichia coli, με την εισαγωγή ειδικών φορέων, δηλαδή των πλασμιδίων που περιείχαν το cdna, αποδείχθηκε ιδιαίτερα χρήσιμη καθώς η διαδικασία απομόνωσης από τις μέδουσες ήταν επίπονη, χρονοβόρα και υψηλού κόστους (Shimomura et al., 2005). 8
Κεφάλαιο 2 Νανοσωματίδια με νέες ιδιότητες 2.1. Νανοσωματίδια Το πρόθεμα "nano", που σημαίνει 10-9 m, κατοχυρώθηκε από το σύστημα μονάδων SI το 1960 στην 11 η γενική συνεδρίαση του Διεθνούς Γραφείου Μέτρων και Σταθμών (Taylor et al., 2008). Ο όρος νανοτεχνολογία έχει αρχίσει να εξαπλώνεται ταχύτατα από τη δεκαετία του 1980. Ο τομέας αυτός ασχολείται με την κατανόηση και τον έλεγχο των μοναδικών φαινομένων της ύλης σε ατομικό ή μοριακό επίπεδο για διαστατικά μεγέθη που κυμαίνονται από 1 nm έως 100 nm (Park et al., 2007). Όταν το μέγεθος των σωματιδίων μειώνεται από τη μικροκλίμακα στην κλίμακα του νανομέτρου, εμφανίζονται διαφορετικές ιδιότητες όπως : μεγάλη ελεύθερη επιφάνεια, μηχανική αντοχή και σκληρότητα, ικανότητες διάχυσης, καλύτερη ειδική θερμότητα, καλύτερη ηλεκτρική αντίσταση και βελτιωμένες μαγνητικές ικανότητες (Kaur et al., 2012). Τα νανοσωματίδια (NPs) έχουν μέγεθος μικρότερο από το μήκος κύματος του ορατού φωτός και μπορούν να παρασκευασθούν από το συνδυασμό διαφορετικών ατόμων είτε από τη διάσπαση συμπαγών υλικών (Yacaman et al., 2015). Τα NPs κατηγοριοποιούνται στις εξής κατηγορίες: στις ημιαγώγιμες κβαντικές τελείες, στα μαγνητικά, πολυμερικά, μεταλλικά νανοσωματίδια και στις δομές με βάση τον άνθρακα. Ανάλογα με τις ιδιότητες και τις διαστάσεις των υλικών, όσον αφορά τη νανοκλίμακα, έχουν εισαχθεί κάποιοι σχετικοί ορισμοί, οι οποίοι περιγράφονται παρακάτω. Οι σύμπλοκες ενώσεις τύπου συσσωματωμάτων (πλειάδες- cluster), που αποτελούνται από 3 έως 3*10 7 άτομα και περιβάλλονται από έναν ηλεκτρονιακό φλοιό ο οποίος τα σταθεροποιεί. Τα κολλοειδή διαλύματα που είναι μια υγρή φάση με νανοσωματίδια της τάξεως μεγέθους 1-1000 nm. Οι νανοκρύσταλλοι που έχουν μέγεθος 1 nm. Τα υλικά νανοδομής, δηλαδή οποιοδήποτε υλικό που έχει διαστάσεις της τάξεως του νανομέτρου. 9
Οι κβαντικές τελείες (quantum dots). Στα σωματίδια αυτά η επίδραση του μεγέθους κβάντωσης επηρεάζει μια τουλάχιστον διάσταση. Για τις κβαντικές τελείες θα γίνει εκτενέστερη αναφορά σε επόμενη ενότητα του κεφαλαίου. Τα νανοσωματίδια, με μέγεθος 1-100 nm, που είναι στερεά, μη κρυσταλλικά ή συσσωματώματα κρυστάλλων (Klabunde et al., 2001). Τα διάφορα νανοσωματίδια ( NPs ) κατατάσσονται σε 4 διαφορετικές κατηγορίες : Νανοσύρματα /Νανοΐνες: Είναι γραμμικές δομές με συγκεκριμένη κατεύθυνση ανάπτυξης, των οποίων οι πλαϊνές όψεις και το σχήμα της διατομής τους μπορεί να μην είναι πολύ καλά καθορισμένα και ομοιόμορφα. Νανοσωλήνες: Έχουν κοίλο εσωτερικό. Νανοράβδοι: Είναι παρόμοιας δομής με τα νανοσύρματα αλλά έχουν μικρότερο μήκος. Νανοζώνες/ Νανοκορδέλες: Οι νανοζώνες έχουν καλά καθορισμένες πλάγιες όψεις που είναι πιο καλά σχηματισμένες και ομοιόμορφες από αυτές των νανοσυρμάτων (Ding et al., 2004). Οι πορείες σύνθεσης νανοσωματιδίων που έχουν πραγματοποιηθεί, συχνότερα, κατά καιρούς είναι οι εξής: (1) διασπορά προσχηματισμένων πολυμερών, (2) πολυμερισμός μονομερών και (3) ιονική πηκτωματοποίηση ή κροκίδωση υδρόφιλων πολυμερών (Mohanraj et al., 2006). Μέχρι σήμερα έχουν αναπτυχθεί διάφοροι τρόποι σύνθεσης και επεξεργασίας νανοϋλικών. Ένας γενικός τρόπος σύνθεσης ξεκινάει από μεγάλα μεγέθη και στηρίζεται στη μείωση του μεγέθους για την δημιουργία υλικών νανομετρικής διάστασης. Οι νανοδομές προέρχονται από συμπαγή υποστρώματα, από τα οποία αφαιρείται προοδευτικά υλικό μέχρι το επιθυμητό αποτέλεσμα. Κυρίαρχη τεχνική είναι αυτή της λιθογραφίας, η οποία χρησιμοποιώντας μία δέσμη ηλεκτρονίων ή φωτός πραγματοποιεί επιλεκτική αφαίρεση υποστρώματος. Ένας άλλος τρόπος βασίζεται σε ακριβώς αντίθετη διαδικασία, δηλαδή έχει αφετηρία την ατομική διάσταση και οδηγεί σε νανοδομημένα υλικά βασιζόμενος στη χημική σύνθεση και στην οργάνωση της δομής, μέχρι το επιθυμητό υλικό. Τέτοιες μέθοδοι είναι οι εξής: Κάποιες από τις μεθόδους που κατηγοριοποιούνται στις bottom-up είναι οι εξής: 10
Μέθοδος λύματος πηκτής (Sol-gel Method) Μέθοδος μικκυλίων και αντίστροφων μικκυλίων (Micelle and Inverse Micelle Methods) Μέθοδος λύματος (Sol Method) Υδροθερμική μέθοδος ( Hydrothermal Method ) Σολβοθερμική μέθοδος (παρόμοια με την υδροθερμική ) (Solvothermal Method) Μέθοδος άμεσης / κατευθυνόμενης οξείδωσης (Direct Oxidation Method) Χημική εναπόθεση ατμών (Chemical Vapor Deposition) Φυσική εναπόθεση ατμών (Physical Vapor Deposition) Ηλεκτροαπόθεση (Electrodeposition) Σύνθεση μέσω υπερήχων (Sonochemical Method ) Μέθοδος μικροκυμάτων (Microwave Method) Η πιο διαδεδομένη μέθοδος είναι η «sol-gel» λόγω των ανταγωνιστικών της πλεονεκτημάτων (Chen et al., 2007). Όλες αυτές οι μέθοδοι σύνθεσης νανοσωματιδίων και επομένως νανοϋλικών με σημαντικές νέες ιδιότητες και τους ερευνητές να έχουν μια πιο διευρυμένη εικόνα για τη σύνθεση τους, άνοιξαν δρόμους για ένα μεγάλο εύρος εφαρμογών τους στον επιστημονικό κόσμο. Σχήμα 2.1: Καινοτόμες εφαρμογές των νανοσωματιδίων. Παραπάνω αναφέρονται εν συντομία διάφορες σημαντικές εφαρμογές τους (Σχήμα 2.1) (Bhattacharyya1et al., 2009). 11
Μία από τις εφαρμογές που έχουν αρχίσει να αναπτύσσονται είναι η χρήση των NPs, που είναι κυρίως δενδριμερή δηλαδή διακλαδισμένα μόρια, ως μεταφορείς φαρμάκων, όσον αφορά τη θεραπεία διάφορων ασθενειών, την αναγνώριση κυτταρικού θανάτου κ.ά. Ως στόχο έχουν τη σταθερότητά τους στον οργανισμό, την επιλεκτική πρόσδεση στα κύτταρα και την απελευθέρωση των δραστικών ουσιών τη σωστή στιγμή και στο επιθυμητό σημείο. Τα νανο-υμένια ( nano films ) παρασκευάζονται από λεπτές στρώσεις νανοσωματιδίων, τα οποία τους προσδίδουν ιδιότητες όπως: αδιάβροχα, αντι-εύφλεκτα, αυτοκαθαριζόμενα υλικά, αντιμικροβιακά, αντιθαμβωτικά, αλέκιαστα, υλικά ανθεκτικά στην UV ακτινοβολία κ.ά. Χρησιμοποιούνται ιδιαιτέρως σε γυαλιά ηλίου, οθόνες υπολογιστών και φακούς φωτογραφικών μηχανών, ρούχα και υφάσματα. Στον τομέα των ηλεκτρονικών, της οπτικής αλλά και της αρχιτεκτονικής χρησιμοποιούνται οι νανοσωλήνες άνθρακα, οι οποίοι είναι αλλοτροπικές μορφές άνθρακα με κυλινδρικούς μονοκρυστάλλους. Προσδίδουν στα διάφορα υλικά αξιοσημείωτη αντοχή και εξαιρετικές ηλεκτρικές ιδιότητες ενώ ταυτόχρονα είναι και καλοί αγωγοί της θερμότητας. Οι νανο-κρυσταλλοτρίοδοι (transistors) είναι διακόπτες, οι οποίοι ελέγχουν τη ροή του ηλεκτρικού ρεύματος και χρησιμοποιούνται σε υπολογιστές. Ακόμη τα NPs χρησιμοποιούνται για τη βελτίωση των οθονών και για την αύξηση του αποθηκευτικού χώρου σε ψηφίδες chips (Bhattacharyya1et al., 2009). Επιπλέον εφαρμογές των NPs είναι οι εξής: σε οικοδομικά υλικά όπως κεραμίδια, μπογιές και επιστρώσεις προστατεύοντας τις κατασκευές από τη διάβρωση και την ανάπτυξη μικροβίων. Όσον αφορά τον τομέα των καλλυντικών, η νανοτεχνολογία χρησιμοποιείται σε διάφορα προϊόντα για τα μαλλιά και το δέρμα. Δύο είναι οι κύριες χρήσεις: για προστασία από την υπεριώδη ακτινοβολία με NPs TiO 2 και ZnO, και ως μεταφορείς σημαντικών ουσιών. Στην βιομηχανία τροφίμων και στον τομέα της γεωργίας, χρησιμοποιούνται ως συντηρητικά και ως μεταφορείς θρεπτικών ουσιών ή εντομοκτόνων αντίστοιχα. Για παράδειγμα το διοξείδιο του πυριτίου, που αντιστοιχεί στο πρόσθετο E551, χρησιμοποιείται στα τρόφιμα ως αντι-αφριστικός παράγοντας, σαν παράγοντας αντι-συσσωμάτωσης αλλά και για την απομάκρυνση πρωτεϊνών από τη μπύρα. Ένα ακόμη παράδειγμα είναι η χρήση πορωδών νανοσωματιδίων σίλικας για την ελεγχόμενη μεταφορά του υδατοδιαλυτού φαρμάκου βαλιδαμυκίνης (validamycin). 12
Επιπλέον οι νανο-αισθητήρες μπορούν να συμβάλλουν στην ανίχνευση ασθενειών των φυτών, αλλά και να ανοίξουν δρόμο για την τελειοποίηση της ποιότητας της συσκευασίας των διάφορων τροφίμων (Kashyap et al., 2015). Τα μεταλλικά NPs χρησιμοποιούνται τόσο στην ετερογενή όσο και στην ομογενή κατάλυση χάρη στη μεγάλη ειδική τους επιφάνεια, αλλά και στην ικανότητα τροποποίησης της επιφάνειάς τους με επιθυμητούς υποκαταστάτες. Αυτά που χρησιμοποιούνται πιο συχνά είναι NPs οξειδίων μετάλλων, σουλφιδίων ή πυριτικών οξειδίων (Mohanraj et al., 2006). Τέλος η νανοτεχνολογία καθιστά τις μεταβάσεις στο διάστημα πιο πρακτικές, δημιουργώντας ελαφριά ηλιακά ιστία στους σχεδιαζόμενους διαστημικούς ανελκυστήρες (space elevators), με αποτέλεσμα να χρειάζονται λιγότερα καύσιμα. Επιπλέον μπορούν να προσδώσουν νέες ιδιότητες όπως ανθεκτικότητα, λιγότερη μάζα κ.ά. στον εξοπλισμό που απαιτείται ανάλογα για τη μετάβαση στο φεγγάρι και σε διάφορους πλανήτες (NASA). Παρόλο που τα NPs διαθέτουν πολύ σημαντικές ιδιότητες, υπάρχουν και μερικά μειονεκτήματα που παρουσιάζει η χρήση τους όσον αφορά την ανθρώπινη υγεία και το περιβάλλον. Καθώς τα NPs ενσωματώνονται στο έδαφος, στα φυτά, στον υδροφόρο ορίζοντα, δεν είναι ακόμη γνωστό αν θα αποτελέσουν έναν ακόμη μη βιοδιασπώμενο ρύπο. Έτσι θα πρέπει να ανακυκλώνονται ή να απορρίπτονται σαν απόβλητα όταν βρίσκονται ενσωματωμένα σε προϊόντα και διάφορες ουσίες. Το θέμα της υγείας και του περιβάλλοντος συνδυάζονται, καθώς οι άνθρωποι που εργάζονται στο τομέα της νανοτεχνολογίας ή και όχι ενδέχεται να εκτίθενται καθημερινά σε αιωρούμενα νανοσωματίδια. Μπορούν λοιπόν να προσβληθούν με σοβαρές ασθένειες, λόγω της πιθανής τοξικότητάς τους. Έτσι λοιπόν είναι απαραίτητο να μελετηθεί ο κύκλος ζωής και η κατάληξη των NPs (Tsuji et al., 2006). 13
2.2.i. Νανοσωματίδια χρυσού: Δομή, ιδιότητες και σύνθεση Τα μεταλλικά σωματίδια, σε σύγκριση με τις υπόλοιπες κατηγορίες νανοσωματιδίων που αναφέρθηκαν, πλεονεκτούν όσον αφορά την ευκολία σύνθεσης αλλά και τον έλεγχο της δομής, του μεγέθους και του σχήματος τους, για τη δημιουργία υλικών με βελτιωμένες ιδιότητες. Στην κατηγορία μεταλλικών νανοσωματιδίων ανήκουν και τα νανοσωματίδια χρυσού (AuNPs). Ο χρυσός είναι ένα μαλακό, ελατό και όλκιμο μέταλλο της 11ης ομάδας του περιοδικού πίνακα και είναι ένα από τα πιο αδρανή στοιχεία. Τα AuNPs παρουσιάζουν εξαιρετικές ηλεκτρονικές, οπτικές, καταλυτικές και θερμικές ιδιότητες οι οποίες βρίσκουν εφαρμογές σε πολλούς τομείς, όπως στην κλινική χημεία, στη γενετική, στη φαρμακευτική και στην ιατρική, αλλά και στην επιστήμη υλικών γενικότερα. Το μέγεθος των σωματιδίων, καθορίζει και τις ιδιότητες που θα εμφανίσουν. Τα AuNPs της τάξης μεγέθους 2-15 nm παρουσιάζουν μεγάλη βιοσυμβατότητα και έχουν μεγάλη αναλογία επιφάνειας προς όγκου. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται σε δοκιμασίες με υβριδοποιήσεις και σαν βιοδείκτες. Τα AuNPs με μέγεθος 20-60 nm βρίσκουν εφαρμογή στην ανίχνευση και καθαρισμό περιβαλλοντικών ρύπων, στη μεταφορά φαρμάκων, σαν χημικοί αισθητήρες αλλά και στην ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων. Τα μεγάλα AuNPs (80-250 nm) χρησιμοποιούνται στην εγκληματολογία, σε ηλεκτρονικές συσκευές, στη μαστογραφία αλλά και σε κατασκευαστικά υλικά (Shah et al., 2014). 14
Σχήμα 2.2: Παρουσιάζονται οι πιο συχνές μορφολογίες των AuNPs. Τα AuNPs έχουν διαφορετικές ιδιότητες από το συμπαγή χρυσό, όπως το χρώμα των διαλυμάτων τους. Των AuNPs είναι κόκκινο έως και βαθύ μπλε ενώ του χρυσού, κίτρινο. Οι αλλαγές αυτές στο χρώμα των AuNPs, οφείλονται στα ελεύθερα d ηλεκτρόνια του χρυσού, τα οποία μπορούν να ταλαντώνονται στην ζώνη αγωγιμότητας. Η συχνότητα ταλάντωσης των ηλεκτρονίων παρατηρείται στην περιοχή του ορατού για τον χρυσό και είναι γνωστή ως συντονισμός επιφανειακού πλασμονίου (Surface Plasmon Resonance-SPR ). Διάφορες αλλαγές στο σχήμα και το μέγεθος των νανοσωματιδίων χρυσού προκαλούν αλλαγές στην γεωμετρία της επιφάνειας του υλικού, οδηγώντας σε μετατόπιση της κορυφής απορρόφησης του SPR που παρατηρείται στην περιοχή του ορατού (Khan et al., 2014). Η γεωμετρία και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στις ιδιότητές τους. Τα νανοσωματίδια παρουσιάζουν διάφορες μορφολογίες (Σχήμα 4) όπως είναι τα σφαιρικά, ακανόνιστο σχήμα, τετραεδρικά και οκταεδρικά, ράβδοι, πλειάδες, αστέρια (πολυγωνικά) κ.ά. Τα AuNPs γενικά είναι πιο κατάλληλα από τα ανόργανα NPs για βιοϊατρικές εφαρμογές, χάρη στη βιοσυμβατότητά τους, αλλά και τη χρήση αλάτων του Au σε περιπτώσεις αρθρίτιδας, άσθματος ή ψωρίασης (Shah et al., 2014). Τα κολλοειδή νανοσωματίδια χρυσού παρουσιάζουν τα εξής πλεονεκτήματα: δεν είναι τοξικά, δεν είναι φωτοευαίσθητα όπως οι περισσότερες οργανικές χρωστικές, έχουν μεγάλο χρόνο ζωής είτε σε στερεή είτε σε υγρή μορφή και ταυτόχρονα το κολλοειδές διάλυμα είναι ιδιαίτερα σταθερό, παρουσιάζουν υψηλή ευαισθησία ως ιχνηθέτες και είναι χαμηλού κόστους, η σύνθεσή τους είναι σχετικά εύκολη και επιπλέον είναι βιοσυμβατά με τα ανθρώπινα κύτταρα αλλά και με μόρια με τα οποία μπορούν να συζευχθούν όπως με πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα, αμίνες, καρβοξυλομάδες κ.ά (Seydack et al., 2005). Η μέθοδος Turkevich (Σχήμα 2.3) περιγράφθηκε για πρώτη φορά το 1951, και είναι η πιο συχνή μέθοδος σύνθεσης AuNPs της τάξεως των 10 nm- 20 nm. Η αρχή της μεθόδου είναι η αναγωγή του τρισθενούς χρυσού (Au 3+ ) σε ουδέτερο άτομο χρυσού (Au 0 ), παρουσία αναγωγικού παράγοντα όπως το κιτρικό ανιόν, αμινοξέα ασκορβικού οξέος ή UV ακτινοβολίας. Το μέγεθος των σωματιδίων σταθεροποιείται με περαιτέρω επεξεργασία της επιφάνειάς τους (Turkevich et al., 1951). 15
Σχήμα 2.3: a) Η αντίδραση κατά μέθοδο Turkevich, b) η αντίδραση αναγωγής του Au 3+ που λαμβάνει χώρα παρουσία του αναγωγικού μέσου. Η μέθοδος αυτή είχε ένα περιορισμό στο εύρος μεγέθους των σωματιδίων. Έτσι το 1973, ο Frens παρατήρησε ότι αυξάνοντας την αναλογία αναγωγικού μέσου και σταθεροποιητικών παραγόντων, δημιουργούνται σωματίδια συγκεκριμένου μεγέθους από 16 nm- 147 nm. Στη συνέχεια μελετήθηκε και ο ρόλος του ph, της θερμοκρασίας και της συγκέντρωσης του κιτρικού νατρίου στο μέγεθος των AuNPs (Tapan et al., 2001). Το 1994 εισήχθη μία νέα μέθοδος από το Brust. Είναι μία μέθοδος δύο φάσεων κατά την οποία δημιουργούνται AuNPs μεγέθους 1.5 nm-5.2 nm, με τη χρήση οργανικών διαλυτών, με αύξηση της αναλογίας της θειόλης με το χρυσό. Σχήμα 2.4: Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου Brust (1994). Η μέθοδος αυτή βασίστηκε στο σύστημα δύο φάσεων του Faraday. Αυτή περιλαμβάνει τη μεταφορά άλατος χρυσού από υδατικό διάλυμα σε έναν οργανικό διαλύτη π.χ. 16
τολουόλιο, χρησιμοποιώντας ένα αναγωγικό μέσο με το οποίο θα γίνει η μεταφορά (πχ. Tetraoctylammonium bromide -TOAB) (Shah et al., 2014). Η αναγωγή του χρυσού γίνεται παρουσία του αναγωγικού αντιδραστηρίου NaBH 4 και δωδεκανοθειόλης ως σταθεροποιητή. Το χρώμα του μίγματος της αντίδρασης από πορτοκαλί μετατρέπεται σε καφέ. Η σταθεροποίηση τους κολλοειδούς γίνεται λόγο της μεγάλης χημικής συγγένειας του χρυσού ως προς το θείο (Tapan et al., 2001). Παρόλο που οι μέθοδοι Turkevich και Brust δημιουργούν σφαιρικά AuNPs, αυτά μπορούν να συντεθούν σε πληθώρα νανοδομών. Η πιο γνωστή μέθοδος για αυτό το σκοπό είναι η ανάπτυξη AuNPs με τη μεσολάβηση "σπόρων" Au. Αυτοί είναι μονοκρύσταλλοι που αποτελούν τον πυρήνα κρυστάλλωσης και τη δημιουργία μίας μεγαλύτερης μάζας μέσα σε ένα υπέρκορο διάλυμα. Αρχή της μεθόδου είναι η αναγωγή αλάτων χρυσού, με ισχυρά αναγωγικούς παράγοντες όπως το NaBH 4. Οι "σπόροι" χρυσού εισάγονται σε ένα διάλυμα άλατος του μετάλλου, παρουσία κάποιου ασθενούς αναγωγικού μέσου για την επιτάχυνση της ανισότροπης ανάπτυξης AuNPs. Για τα κιτρικά σταθεροποιημένα σωματίδια χρυσού η προσθήκη ενός άλατος, όπως του NaCl, εξουδετερώνει το φορτίο της επιφάνειάς τους και μειώνει την απόσταση μεταξύ τους. Αυτό οδηγεί στην εκλεκτική κατακρήμνιση και δημιουργία πυρήνων των AuNPS. Η γεωμετρία τους εξαρτάται από τις αλλαγές στις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων και των υπόλοιπων αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται (Murphy et al., 2005). Κάποιες άλλες εναλλακτικές μέθοδοι σύνθεσης των AuNPs είναι οι εξής: ωρίμανση Ostwald, με την οποία από πολυδιάσπαρτα σωματίδια δημιουργούνται ομοιογενή σε υψηλές θερμοκρασίες (Shah et al., 2014), και οι εξής φυσικές μέθοδοι: με υπερήχους και μικροκύματα οι οποίες χαρακτηρίζονται και σαν πράσινες μέθοδοι, η σολβοθερμική μέθοδος, και τέλος η ηλεκτροχημική και η φωτοχημική αναγωγή (Herizchi et al., 2014). Άλλος τρόπος δημιουργίας AuNPs είναι η βιοσύνθεση. Η τοξικότητα των οργανικών διαλυτών που καθιστά τα σωματίδια λιγότερο συμβατά με τους οργανισμούς οδήγησε στη ανάπτυξη αυτής της μη-τοξικής μεθόδου. Αυτό οδήγησε στη δημιουργία βιοδιασπώμενων αντιδραστηρίων, στον περιορισμό των παραπροϊόντων και σε ήπιες συνθήκες σύνθεσης (πίεση και θερμοκρασία). Τα αντιδρώντα που σταθεροποιούν τα σωματίδια μπορεί να είναι βιομόρια όπως λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες και αμινοξέα τα οποία προσθέτουν χρήσιμες λειτουργικές ομάδες στα AuNPs, φυτοστερόλες, φλαβονοειδή και κινόνες από εκχυλίσεις των φυτικών οργανισμών (πχ. Aloe Vera, Magnolia kobus, Rosa hybrid κ.ά.) (Colvin et al., 2003). O Umesh Kumar et 17
al (2011) παρουσίασαν μια πράσινη μέθοδο σύνθεσης AuNPs χρησιμοποιώντας εκχύλισμα κρεμμυδιού. Η βιταμίνη C του κρεμμυδιού αξιοποιήθηκε σαν αναγωγικός παράγοντας. Ακόμα, έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι για τη σύνθεση από μικροοργανισμούς είτε εξωκυτταρικά είτε ενδοκυτταρικά (πχ Escherichia Coli, Streptomyces viridogens, Pseudomonas fluorescens κ.ά.), και ένζυμα. Ο Rashmi Sanghi et al.(2011) παρουσίασαν τη σύνθεση AuNPs από τον μύκητα Phanerochaete chrysosporium. Τα AuNPs ήταν ελεγχόμενου μεγέθους και σχηματίζονταν με την ενσωμάτωσή τους στο μύκητα αυτό. Οι οπτικές ιδιότητες των μεταλλικών νανοσωματιδίων, όπως και του χρυσού, καθορίζονται από τη συλλογική ταλάντωση των αγώγιμων ηλεκτρονίων στις επιφάνειές τους, τα οποία βρίσκονται σε συντονισμό με την αντίστοιχη ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία. Το φαινόμενο αυτό είναι γνωστό ως συντονισμός πλασμονίων επιφάνειας (Surface Plasmon Resonance-SPR). Η θέση της ζώνης αυτής στο φάσμα της ηλεκτρονικής ακτινοβολίας εξαρτάται από τα μεγέθη των διάφορων σωματιδίων. Όσον αφορά το χρυσό, η συχνότητα συντονισμού της ταλάντωσης, η οποία εξαρτάται από το υλικό σύνθεσης και την απόσταση των σωματιδίων (διεπιφάνειες), βρίσκεται στην ορατή περιοχή του φάσματος στα 510-550 nm. Όσο αυξάνεται το μέγεθος των σωματιδίων τόσο μετατοπίζεται και η κορυφή σε μεγαλύτερα μήκη κύματος. Η συχνότητα συντονισμού των πλασμονίων είναι ευαίσθητη στην αλλαγή του δείκτη διάθλασης άρα και της διεπιφάνειας με το μέσο που βρίσκεται. Οποιαδήποτε αλλαγή στο περιβάλλον των σωματιδίων προκαλεί ευδιάκριτη αλλαγή στο χρώμα τους, δημιουργώντας πληθυσμούς με ποικίλα χρώματα. Το διάλυμα των σωματιδίων μεγέθους 10-40 nm είναι κόκκινα ενώ τα μεγαλύτερα μπλε. Για το παραπάνω λόγο τα AuNPs χρησιμοποιούνται ευρέος ως χρωματομετρικοί αισθητήρες (Liz-Marzain et al., 2004). Οι εξαιρετικές βελτιωμένες ιδιότητες των AuNPs είχαν σαν αποτέλεσμα την τροποποίησης της επιφάνειάς τους, για τη χρήση τους σε πληθώρα αναλυτικών εφαρμογών σαν ιχνηθέτες. Η σύζευξη λειτουργικών ομάδων στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων γίνεται με ποικίλους τρόπους. Παρακάτω παρατίθενται κάποια παραδείγματα σύζευξης AuNPs με διάφορες λειτουργικές ομάδες. 18
Σχήμα 2.5: Παρουσιάζονται μερικές από τις πιο σημαντικές τροποποιήσεις της επιφάνειας των AuNPs, που βρίσκουν εφαρμογή σε φθορισμομετρικές αναλύσεις και ως μεταφορείς ουσιών πχ φαρμάκων (Peg:πολυαιθυλενογλυκόλη). Για την λειτουργική τροποποίηση της επιφάνειας των AuNPs αξιοποιούνται οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις ή η ομοιοπολικοί δεσμοί όπως αυτός του Au-S και οι εξειδικευμένες μοριακές αναγνωρίσεις όπως αυτές του αντισώματος-αντιγόνου, βιοτίνης--στρεπταβιδίνης κ.ά. Η προσρόφηση των διάφορων μορίων στην επιφάνεια των AuNPs γίνεται μέσω δυνάμεων Van der Waals και ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Η επιφάνειά τους είναι ιδανική για προσρόφηση καθώς είναι ομοιόμορφη, μεγάλη, με υψηλό επιφανειακό φορτίο, με αποτέλεσμα να υπάρχουν πολλές διαθέσιμες θέσεις δέσμευσης. Οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις αποτελούν γρήγορη διαδικασία ακινητοποίησης υποκαταστατών, μειονεκτούν όμως στην ισχύ του δεσμού με αποτέλεσμα να δημιουργούνται μη ειδικές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στους ιχνηθέτες Au και τους διάφορους αναλύτες. Τα άτομα του Au έχουν μηδενικό σθένος και δεν σχηματίζουν δεσμούς με άλλα άτομα. Τα κολλοειδή σωματίδια του χρυσού όμως παρουσιάζουν μεγάλη συγγένεια με τα άτομα θείου και δημιουργούν ισχυρούς δεσμούς (Daniel et al., 2004). Κάποια παραδείγματα τροποποίησης των AuNPs είναι τα ακόλουθα. Η κυκλοπροσθήκη αζιδίων και αλκινίων που καταλύεται με τη χρήση Cu(I), χρησιμοποιείται σε ανοσοδοκιμές με CuO-ιχνηθετημένα αντισώματα όπου απελευθερώνεται ο χαλκός και προκαλείται η συσσωμάτωση των AuNPs. Η τροποποίηση της επιφάνειας με αμινοξέα 19
πραγματοποιείται μέσω των Au-S. Τα αμινοξέα παρουσιάζουν ισχυρές αλληλεπιδράσεις με μεταλλικά ιόντα όπως για παράδειγμα τα ιόντα Hg 2+ και Pb 2+ με την αργινίνη ή τη λυσίνη. Η τεχνική αυτή εφαρμόζεται σε γρήγορες φωτομετρικές μεθόδους ανάλυσης. Η κατεργασία της επιφάνειας με ενώσεις που περιέχουν σουλφυδρυλομάδες όπως σπιροπυράνιο, το οποίο έχει φωτοχημικές ιδιότητες, μπορεί να εφαρμοσθεί στην ανίχνευση τρισθενών ιόντων μετάλλων όπως Fe 3+, Al 3+, και Cr 3+ για περιβαλλοντικές μελέτες (Conde et al., 2014). 20
2.2.ii. Φθορίζοντες νανοκρύσταλλοι - κβαντικές κουκίδες Η σύνθεση νανοσωματιδίων που φθορίζουν έχει αναπτυχθεί τις τελευταίες δεκαετίες, λόγω των σημαντικών οπτικών ιδιοτήτων τους και του εύρους των εφαρμογών που μπορούν να αξιοποιηθούν. Εκτός από τις κβαντικές τελείες, που είναι φθορίζοντες νανοκρύσταλλοι και τις οργανικές χρωστικές, έχει αρχίσει και εξερευνάται και αναπτύσσεται η χημεία διάφορων φθοριζόντων νανοσωματιδίων. Τα σημαντικότερα από αυτά είναι τα νανοδιαμάντια (NDs), οι νανοτελείες άνθρακα και οι νανοσωλήνες άνθρακα (C-dots και CNTs αντίστοιχα), το οξείδιο του γραφενίου (GO), νανοσωματίδια βασισμένα στις λανθανίδες, πλειάδες (nanoclusters) αδρανών μετάλλων κ.ά. Κάθε είδος νανοσωματιδίου που αναφέρθηκε παρουσιάζει τις δικές του ιδιότητες, πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα (Sun et al., 2014). Για παράδειγμα οι οργανικές χρωστικές είναι εξειδικευμένες όμως επιρρεπής στο φωτοαποχρωματισμό (photobleaching), ενώ ο αριθμός τους είναι περιορισμένος όσον αφορά τις πολυαναλυτικές μεθόδους, λόγω αλληλοεπικάλυψης των φασμάτων εκπομπής τους. Τα NDs είναι ανθεκτικά στον φωτοαποχρωματισμό, έχουν μεγάλη κβαντική απόδοση, ωστόσο δεν είναι εύκολο να ελεγχθούν. Το GO είναι ανθεκτικό στον φωτοαποχρωματισμό και υδατοδιαλυτό, όμως το φάσμα εκπομπής του είναι αρκετά ευρύ. Ο μηχανισμός των C-dots δεν είναι ακόμα κατανοητός παρόλο που παρουσιάζουν σημαντικά πλεονεκτήματα, όπως και τα nanoclusters που δεν μπορούν εύκολα να παρασκευαστούν ώστε να παρουσιάζουν συγκεκριμένες ιδιότητες κάθε φορά. Οι QDs, που αναπτύσσονται αναλυτικότερα στη συνέχεια, έχουν μεγάλη ένταση φθορισμού, γεγονός που τις καθιστά κατάλληλους ιχνηθέτες για μεθόδους που απαιτούν μεγάλη ευαισθησία, είναι φωτοσταθερές, ενδείκνυνται για πολυαναλυτικές μεθόδους αλλά και στους βιοαισθητήρες ως ιχνηθέτες (Petryayeva et al., 2013). Οι κβαντικές τελείες (QDs) είναι κολλοειδείς, ημιαγώγιμοι νανοκρύσταλλοι. Οι διαστάσεις τους κυμαίνονται από 1-10 nm. Συνήθως παρασκευάζονται από στοιχεία των ομάδων II-VI ( CdS, CdSe, CdTe, PbS, PbSe, PbTe ) ή των ομάδων III-V ( AlSb, GaP, GaAs, InP, InAs ). Η κβαντική τελεία περιέχει ένα μικρό καθορισμένο αριθμό (της τάξης 1-100) από ηλεκτρόνια της ζώνης αγωγιμότητας, οπές της ζώνης σθένους ή εξιτόνια, δηλαδή έναν καθορισμένο αριθμό από στοιχειώδη ηλεκτρικά φορτία. Το σχήμα τους είναι συνήθως σφαιρικό έτσι ώστε να προσεγγίζουν τη μορφή ατόμων (ευκολότερος υπολογισμός της εξίσωσης Schrödinger). 21
Τα εξιτόνια που παράγονται μετά την απορρόφηση ακτινοβολίας και σε συνδυασμό με τις οπές ηλεκτρονίων οδηγούν στο φθορισμό των QDs. Η οπή ηλεκτρονίων δημιουργείται όταν ένα ηλεκτρόνιο έχει διεγερθεί από τη ζώνη σθένους στη ζώνη αγωγιμότητας ενός ημιαγωγού και αφήνει πίσω μία κενή κατάσταση στη ζώνη σθένους, η οποία εμφανίζει θετικό φορτίο. Το κενό μεταξύ των δυο ζωνών είναι το ενεργειακό χάσμα. Το χάσμα αυτό είναι ίσο με την ελάχιστη ενέργεια που πρέπει να έχει ένα ηλεκτρόνιο για να μεταπηδήσει από την ζώνη σθένους στην ζώνη αγωγιμότητας (Woggon et al., 1996). Σχήμα 2.6 : Παρουσιάζονται τα χάσματα ζωνών σθένους και αγωγιμότητας για τους αγωγούς, τους ημιαγωγούς και τους μονωτές. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2.6, στους αγωγούς παρουσιάζεται μια αλληλοεπικάλυψη μιας κενής ζώνης και μίας που έχει συμπληρωθεί και το ενεργειακό χάσμα είναι μηδέν. Στους ημιαγωγούς και στους μονωτές η ζώνη σθένους είναι πλήρως συμπληρωμένη και διαχωρίζεται από τη ζώνη αγωγιμότητας που είναι κενή από e -. Η διαφορά τους είναι ότι στους ημιαγωγούς το ενεργειακό χάσμα είναι σχετικά στενό, ενώ στους μονωτές αρκετά ευρύ με αποτέλεσμα τα e - να μη μπορούν να το περάσουν και να καταστούν ελεύθερα (Peygharnbarian et al., 1993). Το ενεργειακό χάσμα που καθορίζει την ενέργεια φθορισμού και συνεπώς και το χρώμα του φθορισμού είναι αντιστρόφως ανάλογο µε το τετράγωνο του μεγέθους της κβαντικής τελείας. Μεγάλες κβαντικές τελείες έχουν περισσότερα ενεργειακά επίπεδα µε μικρότερη απόσταση μεταξύ τους. Αυτό σημαίνει ότι μπορούν µόνο να απορροφούν 22
φωτόνια µε λιγότερη ενέργεια και κυρίως αυτά που βρίσκονται στην κόκκινη περιοχή του φάσµατος (Petryayeva et al., 2013). Μια από τις πιο σημαντικές ιδιότητες είναι η εκπομπή φθορισμού. Όταν QDs διάφορων μεγεθών διεγείρονται με ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος, εκπέμπουν ακτινοβολία σε διάφορα χρώματα (διαφορετικά μήκη κύματος). Ο φθορισμός οφείλεται στο μέγεθος και όχι στο υλικό και σχετίζεται με τα ενεργειακά επίπεδα. Όσο μικρότερες είναι σε μέγεθος τόσο φθορίζουν προς την μπλε περιοχή, ενώ όσο μεγαλύτερες είναι οι κβαντικές τελείες φθορίζουν προς το κόκκινο (Σχήμα 2.7). Σχήμα 2.7: Διακρίνονται τα διάφορα μεγέθη QDs και οι αντίστοιχες περιοχές εκπομπής τους στο ορατό φάσμα, καθώς και το εύρος του μήκους κύματος εκπομπής των QDs ZnSe, CdSe, CdTe. Η διάρκεια του φθορισμού καθορίζεται από το μέγεθος των κβαντικών τελειών. Οι μεγαλύτερες τελείες έχουν πιο πυκνή διάταξη των επιπέδων ενέργειας στην οποία ζεύγος ηλεκτρονίου οπής μπορεί να παγιδευτεί. Ως εκ τούτου τα ζεύγη ηλεκτρονίωνοπών σε μεγαλύτερες κβαντικές τελείες, παραμένουν διεγερμένα περισσότερο. Όπως και ένα μόριο έτσι και μια κβαντική τελεία έχει κβαντισμένο ενεργειακό φάσμα και κβαντισμένη πυκνότητα ηλεκτρονικών καταστάσεων κοντά στην άκρη του χάσματος (Korvink et al., 2002). Επιπλέον οι QDs χαρακτηρίζονται από φωτο-σταθερότητα. Εκπέμπουν σταθερό σήμα για πολύ μεγαλύτερο χρονικό διάστημα σε σχέση με άλλες ενώσεις όπως διάφορες οργανικές χρωστικές. Έχοντας υπόψη τα παραπάνω, οι κβαντικές τελείες μικρού μεγέθους απορροφούν ακτινοβολία μεγάλης ενέργειας και καθώς το μέγεθός τους αυξάνεται το φάσμα 23
απορρόφησης που παρουσιάζουν μετακινείται σε μικρότερες ενέργειες, προσεγγίζοντας αυτό του αντίστοιχου συμπαγούς κρυστάλλου. Συνεπώς τις κβαντικές τελείες τις χαρακτηρίζει η μονοχρωματικότητα. Δηλαδή έχουν ευρύ φάσμα απορρόφησης (>100nm) και στενό φάσμα εκπομπής (20-40nm). Σχήμα 2.8: Η φασματική αλληλοεπικάλυψη κατά το φαινόμενο FRET. Οι QDs μπορούν να χρησιμοποιηθούν και στους οπτικούς αισθητήρες ως ιχνηθέτες αξιοποιώντας το φαινόμενο μεταφοράς ενεργείας φθορισμού μέσω συντονισμού (FRET). Ο μηχανισμός FRET απαιτεί ένα ζεύγος ενεργειακού δότη και δέκτη που διαθέτουν την απαιτούμενη φασματική επικάλυψη (στα φάσματα εκπομπής του δότη και διέγερσης του δέκτη) και βρίσκονται σε απόσταση 1-10 nm (Σχήμα 2.8 ). Σχήμα 2.9: Παρουσιάζεται το φαινόμενο FRET μεταξύ της τελείας-δότη (donor) και του στόχου-δέκτη (acceptor). 24
Στο φαινόμενο αυτό ενέργεια μεταβιβάζεται από τον διεγερμένο δότη στον δέκτη με μη ακτινοβόλο τρόπο μέσω μιας αλληλεπίδρασης διπόλου-διπόλου, ενώ η απόδοση της μεταφοράς είναι αντιστρόφως ανάλογη προς την έκτη δύναμη της απόστασης μεταξύ τους. Κατά το φαινόμενο FRET η τελεία-δότης (donor) συνδέεται ή βρίσκεται σε πολύ κοντινή απόσταση με το στόχο-δέκτη (acceptor). Όταν το μόριο-στόχος δεν είναι συνδεδεμένος ή σε κοντινή απόσταση με την κβαντική τελεία τότε δεν εμφανίζεται το φαινόμενο αυτό (Σχήμα 2.9). Οι κβαντικές τελείες χαρακτηρίζονται από υψηλή κβαντική απόδοση ( >60-70%) (Resch-Genger et al., 2008). Όσον αφορά τη σύνθεση των QDs έχουν αναπτυχθεί ποικίλες φυσικές και χημικές μέθοδοι. Οι φυσικές μέθοδοι όπως η λιθογραφία, η επιλεκτική ανάπτυξη, η μεταλλική εξάχνωση, η μέθοδος λειοτρίβησης (ball milling) η οποία λειτουργεί με βάση τις δυνάμεις πρόσκρουσης και τριβής, η ηλεκτροαπόθεση κ.ά. παρουσιάζουν πλεονεκτήματα στη σύνθεση των νανοκρυστάλλων όσον αφορά τη μεγάλη καθαρότητα και το ελεγχόμενο μέγεθός τους. Η σύνθεση όμως μονοδιάσπαρτων (ομοιόμορφων) QDs είναι δύσκολη με τις παραπάνω μεθόδους (Petryayeva et al., 2013). Οι χημικές μέθοδοι στηρίζονται στη δημιουργία κολλοειδών διαλυμάτων, με την καθίζηση κολλοειδών νανοσωματιδίων. Η καθίζηση οφείλεται στην ελεγχόμενη απελευθέρωση ιόντων, είτε στην υδρόλυση κατάλληλων πρόδρομων ενώσεων παρουσία σταθεροποιητικών παραγόντων. Οι παράγοντες αυτοί είναι ουσίες που χρησιμοποιούνται για τη σταθεροποίηση των σωματιδίων και τον έλεγχο του μεγέθους τους. Κατά καιρούς έχουν συντεθεί ομοιόμορφοι νανοκρύσταλλοι με συγκεκριμένο σχήμα και μέγεθος. Οι βασικές μέθοδοι, ανάλογα με την εκάστοτε αρχή σύνθεσης, είναι: η αναγωγή, θερμική αποσύνθεση ή θερμόλυση, και η μέθοδος sol-gel (λύματοςπηκτής) (Park et al., 2007). Η σύνθεση των QDs έχει ξεκινήσει πάνω από 30 χρόνια πριν. Οι πρώτες προσεγγίσεις που έγιναν αφορούσαν τη σύνθεσή τους με τη χρήση αλάτων σαν πρόδρομες ενώσεις και στη συνέχεια την προσπάθεια σύνθεσης των σωματιδίων με ελεγχόμενο μέγεθος αξιοποιώντας τη μέθοδο ανάπτυξης μικκυλίων (κολλοειδή σωματίδια) (Rossetti et al., 1984). Το 1993 ο Murray et al. εισήγαγε την έννοια του κβαντικού άλματος. Το κβαντικό άλμα είναι η ασυνεχής αλλαγή της κατάστασης ενός ηλεκτρονίου σε ένα άτομο ή μόριο από το ένα επίπεδο ενέργειας σε ένα άλλο. Αυτό συσχετιζόταν με την ποιότητα και το 25
ελεγχόμενο μέγεθος ομοιόμορφων νανοκρυστάλλων CdSe. Η σύνθεση των νανοκρυστάλλων αυτών πραγματοποιήθηκε με την πυρόλυση, σε υψηλές θερμοκρασίες, οργανομεταλλικών πρόδρομων ενώσεων με το επιφανειοδραστικό αντιδραστήριο, οξείδιο τριοκτυλοφωσφίνης (TOPO). Η προσθήκη των αντιδραστηρίων γίνεται με εμβολιασμό τους σε ένα οργανικό διαλύτη σε υψηλή θερμοκρασία. Η αργή ανάπτυξη και ωρίμανση των σωματιδίων οδηγεί σε ομοιόμορφα σωματίδια, τόσο επιφανειακά όσο και στον πυρήνα τους. Ακολούθησαν περαιτέρω προσπάθειες βελτίωσης της σύνθεσης των QDs με αλλαγή του TOPO σε TOP και τριβουτυλοφωσφίνη (TBP), αλλαγές στις μοριακές αναλογίες, τη θερμοκρασία και την εισαγωγή αδρανών συνθηκών π.χ. ατμόσφαιρα αερίου αργού (Murray et al., 1993). Σημαντικές παράμετροι για τον έλεγχο τόσο του μεγέθους αλλά και της κατανομής του μεγέθους στις QDs είναι οι εξής: η θερμοκρασία και ο χρόνος της αντίδρασης, η θερμοκρασία τον προστιθέμενων αντιδραστηρίων και ειδικά στις hot-injection μεθόδους, η δραστικότητα και οι συγκεντρώσεις των αντιδρώντων, το ph κ.ά (Chang et al., 2014). Για παράδειγμα μια μελέτη που έγινε για τη σύνθεση QDs με κάδμιο και N,N-διμεθυλ-σεληνουρία (N,N-dimethylselenourea), σαν πηγή θείου, οδήγησε στο συμπέρασμα ότι με το πέρας του χρόνου αντίδρασης τα σωματίδια μεγαλώνουν συνεπώς μεταβάλλεται και το μήκος κύματος εκπομπής τους. Η συγκέντρωση του σταθεροποιητικού, το οποίο ήταν κιτρικό νάτριο, έπαιξε επίσης σημαντικό ρόλο. Όσο πιο μικρή ήταν η μοριακή αναλογία καδμίου-κιτρικού, τόσο μεγαλύτερα ήταν τα νανοσωματίδια. Η ιδανική τιμή ph ήταν το 9, καθώς σε υψηλότερα ph εμφανίζονταν μη επιθυμητά ιζήματα (Williams et al., 2009). Ο σχηματισμός των κβαντικών τελειών σε υδατικά διαλύματα καθιστά ικανή τη σύζευξή τους με βιομόρια. Έτσι παρουσιάζονται πολλές υποσχόμενες εφαρμογές τους ως ιχνηθέτες, για απεικόνιση ιστών, για ιχνηθέτηση μορίων σε διάφορες αναλυτικές μεθόδους αλλά και σαν δότες ενέργειας κατά το φαινόμενο μεταφοράς ενέργειας FRET. Παρά τις προσπάθειες, λοιπόν, για απόκτηση υψηλής ποιότητας υδρόφοβων QDs, έγινε επιτακτική η ανάγκη διαλυτοποίησης ή σύνθεσής τους σε υδατικά διαλύματα. Από το 1998 άρχισαν να εμφανίζονται μέθοδοι για τη παρασκευή υδατοδιαλυτών QDs (Chan et al., 1998). Ύστερα από βελτιώσεις στον τρόπο καθαρισμού των QDs έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι τροποποίησης της επιφάνειάς τους, οι οποίοι τις καθιστούν υδατοδιαλυτές, με την διατήρηση των οπτικών ιδιοτήτων τους και προσδίδοντας την ικανότητα 26
ομοιοπολικής σύζευξης με βιομόρια. Κάποιες από αυτές τις επιφανειακές τροποποιήσεις είναι (σχήμα 12) : i. αλλαγή της οργανικής επικάλυψης με υδατοδιαλυτή με την προσθήκη διάφορων λειτουργικών ομάδων όπως θειολικές ή διθειολικές επικαλύψεις, γλουταθειονίνη, πεπτίδιο με τελικό αμινοξύ την κυστεΐνη, σιλοξάνια με θειολομάδες, δενδρόνια (ανηγμένη μορφή δενδρομερούς) με καρβοξυλομάδες, ii. η διπλή επικάλυψη των οργανικών QDs με φωσφολιπίδια ή δισυσταδικά συμπολυμερή (Tyrakowski et al., 2014). Οι QDs που χρησιμοποιούνται σε βιοεφαρμογές είναι αποκλειστικά κολλοειδείς νανοκρύσταλλοι. Οι QDs που έχουν αποδειχτεί οι πιο κατάλληλες για τέτοιου είδους εφαρμογές, λόγω καλής γνώσης των ιδιοτήτων τους από την ερευνητική κοινότητα, είναι αυτές που παρασκευάζονται από πυρήνα καδμίου και σεληνίου (CdSe) με φλοιό θειούχου ψευδαργύρου (ZnS) (Dabbousi et al., 1997). Η επικάλυψη με ZnS προστατεύει τις QDs από την οξείδωση, αποτρέπει την μεταφορά Cd/Se στο περιβάλλον διάλυμα και ταυτόχρονα αυξάνει σημαντικά την κβαντική απόδοση και τη σταθερότητα του φθορισμού (Hines et al., 1996). Όσον αφορά τις υδατικές συνθέσεις των QDs παρουσιάζουν πολλά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τις οργανομεταλλικές λόγο κόστους, ασφάλειας και ευκολίας της εφαρμογής των σχηματιζόμενων νανοσωματιδίων σε βιολογικά υγρά. Παρακάτω παρατίθενται κάποιοι ενδεικτικοί τρόποι σύνθεσης. Η παρασκευή των QDs από CdS μπορεί να γίνει με φωσφορικά, θειόλες, ή υδρόφιλα πολυμερή σαν επικάλυψη, και απαιτεί επιπλέον πηγές θείου, αφού αυτά χρησιμοποιούνται σαν σταθεροποιητικά αντιδραστήρια. Για την ολοκλήρωση της αντίδρασης πραγματοποιείται θερμόλυση με επαναρροή με κάθετο ψυκτήρα (reflux) ή τη μέθοδο των μικροκυμάτων. Στο σχήμα 2.11 παρουσιάζεται η σύνθεση QDs με κάδμιο και σαν πηγή θείου το μερκαπτοπροπιονικό οξύ (MPA). Το MPA χρησιμοποιείται και σαν σταθεροποιητικό αφού προσδίδει στην επιφάνεια των QDs καρβοξυλομάδες. Αυτό συμβαίνει κατά τη διάσπαση των δεσμών που έχουν δημιουργηθεί με το Cd και το O. 27
Σχήμα 2.10: Παρουσιάζονται οι πιθανές τροποποιήσεις της επιφάνειας των οργανικών QDs για την εφαρμογή τους σε βιοαναλύσεις. MPA Σχήμα 2.11: Σύνθεση QDs με Cd και MPA. Μία μέθοδος (Σχήμα 2.12) χωρίς επιπλέον προσθήκης πηγής θείου είναι η παρασκευή QDs CdSe με επικάλυψη μερκαπτο-οξικού οξέος (MΑA), και QDs από CdS με επικάλυψη μερκαπτοπροπιονικού οξέος (MPA) (Han et al., 2006). Το MPA χρησιμοποιείται και σαν πηγή θείου και σαν σταθεροποιητικό ταυτόχρονα. Η σύνθεση αυτή προσθέτει καρβοξυλομάδες στην επιφάνεια των QDs διευκολύνοντας έτσι την 28
παρασκευή συζευγμάτων με βιομόρια για περαιτέρω εφαρμογές σε διάγνωση ασθενειών (Kumar et al., 2012). Σχήμα 2.12: Παρουσιάζονται οι δομές του a) MAA και b) MPA Η σύνθεση των υδατικών CdS QDs, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, έχει γίνει και με τις εξής ενώσεις ως σταθεροποιητικές των νανοκρυστάλλων: μερκαπτοηλεκτρικό οξύ, γλουταθειονίνη, θειογλυκολικό οξύ, L-κυστεΐνη. Η N-ακέτυλο-L-κυστεΐνη (NAC) έχει αναφερθεί ομοίως σε συνθέσεις των QDs. Οι αντιοξειδωτικές της ιδιότητες καθιστούν τις σχηματιζόμενες QDs βιοσυμβατές, σε αντίθεση με άλλες που είναι κυτταροτοξικές (Wei et al., 2015). Η σύζευξης των QDs με βιομόρια μπορεί να γίνει είτε με ομοιοπολικό δεσμό ή με ηλεκτροστατική προσρόφηση ( Goldman et al., 2002). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία οι QDs έχουν χρησιμοποιηθεί σαν ιχνηθέτες: (α) ολιγονουκλεοτιδίων, για πολυαναλυτικές μεθόδους με τις οποίες ανιχνεύονται πολλοί αναλύτες ταυτόχρονα (Resch-Genger et al., 2008), και (β) αντισωμάτων και άλλων πρωτεϊνών (π.χ. ανίχνευση παθογόνων βακτηρίων) (Xuea et al., 2009). Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζεται ένα εύρος παραδειγμάτων συζευγμάτων των QDs με βιομόρια, καθώς και οι αντίστοιχες εφαρμογές τους. Πίνακας 2.1: Παρουσιάζονται κάποια αντιπροσωπευτικά παραδείγματα συζευγμάτων των βιοσυμβατών QDs CdSe/ CdSe-ZnS capped, οι in vitro στόχοι τους καθώς και οι εφαρμογές τους (Biju et al., 2008). a/a Σύζευγμα QDs Στόχος (Τarget) Εφαρμογές 1 Ολιγονουκλεοτίδιο Συμπληρωματικό DNA τμήμα Κυτταρική ιχνηθέτηση 29
a/a Σύζευγμα QDs Στόχος (Τarget) Εφαρμογές 2 Στρεπταβιδίνη Βιοτινυλιωμένοι υποδοχείς αμινοξέων Κυτταρική μεταφορά σημάτων 3 Antimouse Ανοσοσφαιρίνη Αντιγόνο (πρόσδεση) Ιχνηθέτηση ερυθροκυττάρων 4 Σεροτονίνη Υποδοχέας σεροτονίνης Κυτταρική μεταφορά σημάτων 5 Τριπεπτίδιο Arg-Gly-Asp Ιντεγκρίνη (διαμεμβρανικός υποδοχέας) Ιχνηθέτηση βλαστοκυττάρων 6 Αβιδίνη Βιοτινυλιωμένο αντι- P- Γλυκοπρωτεΐνης αντίσωμα Πολύχρωμη απεικόνιση 7 Αντίσωμα στρεπταβιδίνης Her2 υποδοχέας Δείκτης καρκίνου του μαστού 8 Κονκαναβαλίνη Α ή Antimouse Ανοσοσφαιρίνη Γλυκοπρωτεΐνη Καρκινικός δείκτης 9 Αντίσωμα PSMA PSMA (αντιγόνο προστάτη) Καρκινικός δείκτης 10 Αυξητικός παράγοντας νεύρων Υποδοχείς στην κυτταρική επιφάνεια Διαφοροποίηση Οι QDs βρίσκουν εφαρμογές σε πολλές τεχνικές στον τομέα του βιο-χαρακτηρισμού, στη βιοανάλυση και στην ιατρική. Αξιοποιώντας τις ιδιότητές τους μπορεί να πραγματοποιηθεί γρήγορη και ταυτόχρονη ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών και τοξινών καθώς και απεικόνιση κυττάρων είτε in vivo είτε in vitro, το οποίο δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί αποτελεσματικά με τις συμβατικές μεθόδους και τους κλασικούς ιχνηθέτες. Έτσι επιτυγχάνεται η καλύτερη κατανόηση αλληλεπίδρασης διάφορων μορίων και της βιολογίας του κυττάρου. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται και η μεταφορά γονιδίων και γενικότερα η εξερεύνηση του DNA αλλά και του νευρικού συστήματος. Χρησιμοποιούνται ακόμα για οπτική κωδικοποίηση και ανάλυση γονιδίων και πρωτεϊνών. 30
Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί μέθοδοι με QDs για την έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου. Οι QDs με τις κατάλληλες τροποποιήσεις στην επιφάνεια τους υπόσχονται ότι θα ανιχνεύουν και θα καταστρέφουν επιλεκτικά τους καρκινικούς στόχους, χωρίς υπολείμματα που μπορεί να βλάψουν αλλά μέρη του οργανισμού ή να προκαλέσουν μετάσταση. Επιπλέον χρησιμοποιούνται για τη μεταφορά φαρμάκων είτε άμεσα είτε έμμεσα, από τα αιμοφόρα αγγεία (Petryayeva et al., 2013). Εκτός από τα σημαντικά πλεονεκτήματα τους οι QDs παρουσιάζουν και κάποια μειονεκτήματα. Η βιοσυμβατότητά τους, όπως συμβαίνει και με τις οργανικές χρωστικές, μελετάται ακόμα για βελτιστοποιήσεις. Στις QDs κάποιες μη ιδανικές συνθήκες μπορούν να οδηγήσουν στην κροκίδωση των νανοσωματιδίων, με αποτέλεσμα την απώλεια των οπτικών ιδιοτήτων τους. Παρά το πλεονέκτημα των πολλαπλών θέσεων που παρέχουν οι QDs, όσον αφορά τη σύζευξη βιομορίων, αυτό μπορεί να προκαλέσει μη ειδικές προσδέσεις άλλων βιομορίων, εκτός των επιθυμητών, είτε να επηρεάσει τη σταθερότητά τους. Επιπλέον το μεγάλο, σχετικά με τα οργανικά μόρια, μέγεθος των QDs μπορεί να προκαλέσει δυσκολία στην πρόσβαση σε κυτταρικούς στόχους. Έτσι η λειτουργικότητα των συζευγμάτων QD-βιομορίων είναι αναγκαίο να ελέγχεται πλήρως (Algar et al., 2011). Τέλος η τοξικότητα των QDs αποτελεί ένα επιπλέον θέμα. Η πλειοψηφία των QDs αποτελούνται από ημιαγώγιμα υλικά, υψηλής τοξικότητας, με αποτέλεσμα να δυσχεραίνονται οι in vivo μελέτες. Ακόμα και με την κατάλληλη βιοσυμβατή επικάλυψη των QDs, από λειτουργικές ομάδες και βιομόρια, είναι πιθανό να απελευθερωθούν τοξικά ιόντα από τον πυρήνα τους. Για όλα λοιπόν τα παραπάνω προκύπτουν ερωτήματα και λύσεις που χρειάζεται να ερευνηθούν (Zhang et al., 2011). 31
2.2.iii. Νανοσωματίδια με μαγνητικές ιδιότητες Τα μαγνητικά υλικά διακρίνονται σε τρείς βασικές κατηγορίες ανάλογα με την ανταπόκριση που έχουν στην εφαρμογή ενός μαγνητικού πεδίου. Αυτές είναι τα σιδηρομαγνητικά που έλκονται ισχυρά από ένα μαγνητικό πεδίο, τα παραμαγνητικά που έλκονται ασθενώς και τα διαμαγνητικά που απωθούνται ασθενώς. Τα διαμαγνητικά υλικά έχουν μία ασθενή απωστική απόκριση προς τα μαγνητικά πεδία. Αυτό είναι αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης του πεδίου με την τροχιακή στροφορμή των e -. Τα υλικά αυτά δεν συγκρατούν τις μαγνητικές τους ιδιότητες όταν το εξωτερικό πεδίο σταματά να αλληλεπιδρά μαζί τους. Όλα τα e - βρίσκονται σε ζεύγη (συμπληρωμένες ηλεκτρονιακές στοιβάδες) για αυτό η μαγνητική τους ροπή είναι μηδενική. Τα περισσότερα στοιχεία του περιοδικού πίνακα είναι παραμαγνητικά όπως για παράδειγμα το τιτάνιο, το μολυβδένιο, ο χαλκός και το κοβάλτιο. Τα παραμαγνητικά υλικά έχουν ασθενή, θετική επιδεκτικότητα, η οποία εξαρτάται από τη θερμοκρασία, προς τα εφαρμοσμένα μαγνητικά πεδία. Δηλαδή αυτά έλκονται ελαφρώς δεν διατηρούν όμως τις ιδιότητες τους μετά την απομάκρυνση του μαγνητικού πεδίου, καθώς ο προσανατολισμός των μαγνητικών ροπών είναι τυχαίος. Οι παραμαγνητικές ιδιότητες είναι αποτέλεσμα της παρουσίας αδέσμευτων e - και του επαναπροσανατολισμού αυτών, όταν ασκείται μαγνητική δύναμη. Στα παραμαγνητικά υλικά περιλαμβάνονται το μαγνήσιο, το μολυβδένιο, το λίθιο και το ταλάντιο. Στην κατηγορία των σιδηρομαγνητικών υλικών θα μπορούσαμε να εντάξουμε και τα αντισιδηρομαγνητικά. Αυτά εμφανίζουν μικρή θετική επιδεκτικότητα σε όλες τις θερμοκρασίες. Έχουν μαγνητικές συμπεριφορές στα άτομα, ίδιας έντασης και αντιπαράλληλου spin. Με τη μείωση της θερμοκρασίας η επιδεκτικότητα αυξάνεται, μετά όμως από μία κρίσιμη θερμοκρασία, που χαρακτηρίζεται ως θερμοκρασία Neel, συμπεριφέρονται σαν παραμαγνητικά. Τα αντισιδηρομαγνητικά υλικά αποτελούνται από αιματίτη, οξείδια μετάλλων μετάπτωσης όπως το νικέλιο, χρώμιο κά. (Weissleder et al., 2001). Όσον αφορά τα σιδηρομαγνητικά υλικά, έλκονται ισχυρά από ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο και ταυτόχρονα διατηρούν τη μαγνητική τους ιδιότητα μετά την απομάκρυνση του πεδίου. Το φαινόμενο αυτό εμφανίζεται μόνο σε παραμαγνητικά υλικά με ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Οι ιδιότητες τους είναι ισχυρές καθώς αποτελούνται από μαγνητικούς τομείς που είναι παράλληλοι μεταξύ τους. Ο σίδηρος, το νικέλιο και το 32
κοβάλτιο είναι μερικά από τα υλικά που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία (www.ndeed.org). Τα υλικά που κρατούν μόνιμα τις μαγνητικές τους ιδιότητες και στην απουσία μαγνητικού πεδίου είναι γνωστά ως ισχυροί μαγνήτες. Μία ακόμα κατηγορία είναι τα σιδηριμαγνητικά υλικά. Αυτά εμφανίζουν μαγνητικές ροπές που είναι αντιπαράλληλες μεταξύ τους και αυθόρμητη μαγνήτιση, κάτω όμως από μια κρίσιμη θερμοκρασία, σιδηριμαγνητική θερμοκρασία Neel. Πάνω από αυτή τη θερμοκρασία καθίστανται παραμαγνητικά. Παρουσιάζουν, όπως και οι σιδηρομαγνήτες, φαινόμενα υστέρησης και μαγνητικού κορεσμού. Παραδείγματα τέτοιων υλικών είναι οι φερρίτες, τα Fe 3 O 4, Fe 3 S 4 κ.ά (Rudin et al., 2003). Οι μαγνητικές αλληλεπιδράσεις δημιουργούνται από την κίνηση των σωματιδίων που έχουν μάζα και ηλεκτρικά φορτία. Αυτά είναι ηλεκτρόνια, οπές, πρωτόνια, θετικά και αρνητικά φορτισμένα ιόντα. Ένα ηλεκτρικά φορτισμένο σωματίδιο που περιστρέφεται, δημιουργεί ένα μαγνητικό δίπολο που ονομάζεται μαγνητόνιο. Στα σιδηρομαγνητικά υλικά αυτά βρίσκονται συγκεντρωμένα σε ομάδες (Qu et al., 2001). Ένας μαγνητικός τομέας (domain) αναφέρεται σε έναν όγκο σιδηρομαγνητικού υλικού όπου όλα τα μαγνητόνια είναι προσανατολισμένα προς την ίδια κατεύθυνση. Αυτός ο τομέας διαχωρίζει το σιδηρομαγνητισμό από το παραμαγνητισμό. Η δομή του τομέα καθορίζει την εξάρτηση του μεγέθους του υλικού από τις μαγνητικές ιδιότητές του. Όταν το μέγεθος του υλικού μειώνεται κάτω από μία κρίσιμη τιμή τότε γίνεται ένας τομέας. Έτσι παρατηρείται ομοιομορφία στη μαγνήτιση σε μικρά σωματίδια και ανομοιομορφία σε μεγαλύτερα. Τα τελευταία αποκαλούνται σωματίδια πολλαπλών τομέων (Hines et al., 1996). Το κρίσιμο μέγεθος των σωματιδίων ενός τομέα, λέγεται ότι εξαρτάται από παράγοντες όπως ο μαγνητικός κορεσμός, η δύναμη της κρυσταλλικής ανισοτροπίας και των δυνάμεων ανταλλαγής, η ενέργεια της επιφάνειας ή του τοίχους του τομέα και το σχήμα των νανοσωματιδίων. Η απόκριση των σιδηρομαγνητικών υλικών σε ένα εφαρμοσμένο μαγνητικό πεδίο χαρακτηρίζεται από δύο παραμέτρους: την απομαγνητίζουσα δύναμη (coercivity) και την παραμονή της μαγνήτισης (remanence). Όσο το μέγεθος των σωματιδίων μειώνεται (10-20 nm) τόσο η αντίσταση στην απώλεια αυξάνεται και μετά τείνει προς το μηδέν. Τότε αυτά μετατρέπονται σε υπερπαραμαγνητικά. Ο υπερπαραμαγνητισμός προκαλείται από θερμικά φαινόμενα. 33
Τα μαγνητικά νανοσωματίδια (Magnetic Nanoparticles, MNPs) που μετατρέπονται σε μαγνητικά παρουσία μαγνήτη αλλά μεταβάλλονται σε μη-μαγνητικά όταν αυτός απομακρυνθεί, μένουν "ανενεργά", γεγονός που τους δίνει ένα μοναδικό πλεονέκτημα σε βιολογικά περιβάλλοντα (Akbarzadeh et al., 2012). Τα μαγνητικά σωματίδια που χρησιμοποιούνται σε βιολογικές εφαρμογές έχουν απαιτήσεις όπως υψηλή μαγνητική ροπή και σταθερότητα, ύπαρξη υπερπαραμαγνητικής συμπεριφοράς η οποία σχετίζεται με τη μεταβαλλόμενη μαγνητική κατάσταση υπό την επίδραση της θερμοκρασίας και με την απουσία παραμένουσας μαγνήτισης, που μπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία συσσωματωμάτων. Τα σωματίδια αυτά αποτελούνται συνήθως από οξείδια σιδήρου. Ιδιαίτερες ιδιότητες εμφανίζουν και τα νανοσωματίδια Fe, Co, FeCo και FePt τόσο για in vivo όσο και για in vitro εφαρμογές, ωστόσο δεν χρησιμοποιούνται καθώς εμφανίζουν σημαντικά ποσοστά τοξικότητας (Hilger et al., 2002). Ο υπερπαραμαγνητισμός παρουσιάζεται σε μαγνητικά υλικά αποτελούμενα από πολύ μικρούς κρυσταλλίτες όπως τα νανοσωματίδια σιδήρου που γίνονται υπερπαραμαγνητικά σε μεγέθη < 25nm. Η ολική μαγνητική ροπή του νανοσωματιδίου, μπορεί να θεωρηθεί σαν μια γιγάντια μαγνητική ροπή, συνισταμένη όλων των μεμονωμένων μαγνητικών ροπών των ατόμων των νανοσωματιδίων. Για το λόγο αυτό ο συγκεκριμένος μαγνητισμός έχει αυτό το όνομα, μοιάζει με τον παραμαγνητισμό αλλά με αρκετά μεγαλύτερες μαγνητικές ροπές. Σ ένα παραμαγνητικό υλικό η θερμική ενέργεια ξεπερνάει τις δυνάμεις συνοχής γειτονικών ατόμων προκαλώντας τυχαίες διακυμάνσεις στις διευθύνσεις μαγνήτισης με τελικό συνολικό αποτέλεσμα μηδενική μαγνήτιση. Όμως σ ένα υπερπαραμαγνητικό υλικό οι διακυμάνσεις επηρεάζουν τη διεύθυνση της μαγνήτισης ολόκληρων των κρυσταλλιτών (Κουτσοσπύρου, 2015). Όταν τα σιδηρομαγνητικά ή τα σιδηριμαγνητικά νανοσωματίδια είναι με τη μορφή κολλοειδούς διαλύματος, ονομάζονται σιδηρορευστά (ferrofluids). Η παρασκευή αυτών των διαλυμάτων, πραγματοποιείται σε οποιοδήποτε φορέα υπό συνθήκες κατάλληλου ιξώδους, επιφανειακής τάσης και θερμοκρασίας. Τα σιδηρορευστά εμφανίζουν ιδιότητες τόσο των ρευστών όσο και μαγνητικές. Τα διαλύματα αυτά περιέχουν σωματίδια μεγέθους 10 nm. Σε αυτό το μέγεθος είναι μαγνήτες, ενός τομέα, και αλληλεπιδρούν με τα γειτονικά τους σωματίδια γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στη συσσωμάτωση και στη δημιουργία ιζήματος. Τα σιδηρορευστά που προορίζονται για βιολογικές in vivo εφαρμογές θα πρέπει να είναι πολύ σταθερά. Για το λόγο αυτό 34
μελετώνται όλοι οι παράγοντες που μπορεί να επηρεάσουν τη σταθερότητά τους (Pappell et al., 1965). Η χρήση των MNPs σε βιολογικές εφαρμογές βασίζεται στις αξιοσημείωτες ιδιότητές τους. Μπορούν να συντεθούν σε μεγέθη που είναι συγκρίσιμα με αυτά ενός ιού, πρωτεΐνης ή γονιδίου. Επίσης, έχουμε τη δυνατότητα χειρισμού τους με τη βοήθεια ενός εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, το οποίο εφαρμόζεται γύρω από το στόχο με αποτέλεσμα τη συγκέντρωση των MNPs σε αυτόν. Έχουν μεγάλη επιφάνεια άρα και περισσότερες θέσεις πρόσδεσης βιομορίων. Η μαγνητική τους ροπή μπορεί να εφαρμοστεί σε σκιαγραφήσεις ιστών (με μαγνητική υπερθερμία) (Τσιτρούλη, 2011). Για τη σύνθεση ομοιόμορφων και σταθερών σιδηρομαγνητικών σωματιδίων έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι όπως: πυρόλυση με laser, η αυτο-οργάνωση των σωματιδίων, η συγκαταβύθιση, η μέθοδος μικρογαλακτώματος (κολλοειδών συστημάτων), η θερμική αποσύνθεση, η σολβοθερμική, η μέθοδος απόθεσης, η μέθοδος υπερήχων, η σύνθεση με καύση, κ.ά (Weissleder et al., 2001). Αυτά τα νανοσωματίδια συνήθως αποτελούνται από οξείδια σιδήρου, αδρανή μέταλλα, δομές με περίβλημα και πυρήνα και άλλες σύνθετες δομές. Παρακάτω περιγράφονται μέθοδοι με τις οποίες παραλαμβάνονται ομοιόμορφα σωματίδια όσον αφορά το σχήμα και το μέγεθος (Jana et al., 2004). Οι χημικές συνθέσεις έχουν ως αρχή την καταβύθιση των MNPs από ένα υπέρκορο διάλυμα και τα σωματίδια που προκύπτουν είναι κατά κύριο λόγο ομοιόμορφα. Προκύπτουν με βάση το μοντέλο του LaMer και Dinegar (1950) (Σχήμα 2.12). Αυτό εξηγεί την ανάπτυξη των σωματιδίων με βάση μία κινητική προσέγγιση. Μετά από μια κρίσιμη συγκέντρωση αρχίζει η αυθόρμητη δημιουργία πυρήνων (ραγδαία), χωρίς να δημιουργούνται νέοι. Οι σχηματιζόμενοι πυρήνες αρχίζουν να αναπτύσσονται ομοιόμορφα και τα σωματίδια είναι μονοδιάσπαρτα. Τα MNPs που σχηματίζονται έχουν υψηλή επιφανειακή ενέργεια με αποτέλεσμα να συσσωματώνονται εύκολα και να μειώνεται η ενέργειά τους. Η συσσωμάτωσή τους μπορεί να παρεμποδισθεί με τη χρήση επιφανειακών παραγόντων (Segal et al., 1989) 35
Σχήμα 2.12: Παρουσιάζεται το μοντέλο Lamer -Dinegar. Όσον αφορά τη μέθοδο θερμικής αποσύνθεσης, πραγματοποιείται χημική αποσύνθεση των ουσιών με υψηλές θερμοκρασίες. Σε αυτή τη μέθοδο λαμβάνει χώρα διάσπαση των χημικών δεσμών. Οι ενώσεις που χρησιμοποιούνται για αυτή τη σύνθεση είναι κυρίως οργανομεταλλικές σε οργανικούς διαλύτες, σε συνδυασμό με επιφανειοδραστικά αντιδραστήρια όπως το ολεϊκό οξύ, η πολυβινυλική πυρρολιδίνη (PVP), η εξαδεκυλαμίνη κ.ά. Οι πρόδρομες ενώσεις που χρησιμοποιούνται αλλά και ο χρόνος αντίδρασης, σε αυτή τη μέθοδο, είναι καθοριστικές για το τελικό μέγεθος και τη μορφολογία των μαγνητικών νανοδομών, οι οποίες έχουν εύρος μεγέθους 4-45 nm και δομή κυβική ή σφαιρική (Khan et al., 2015). Με τη μέθοδο αυτή έχουν συντεθεί ελεγχόμενου μεγέθους σωματίδια μαγνητικών οξειδίων σιδήρου. Για να μπορέσουν να εφαρμοστούν σε βιολογικά δείγματα απαιτείται η τροποποίηση της επιφάνειάς τους και η μετατροπή τους σε υδρόφιλα σωματίδια (Jana et al., 2004). Μία ακόμη σημαντική χημική μέθοδος σύνθεσης MNPs είναι η υδροθερμική μέθοδος, η οποία παρέχει εξαιρετική ικανότητα ελέγχου του σχήματος και του μεγέθους τους. Η μέθοδος περιλαμβάνει τη σύνθεση νανοσωματιδίων από υδατικά διαλύματα υψηλού σημείου ζέσεως υπό υψηλή πίεση ατμών. Με αυτή τη μέθοδο παρασκευάζονται μεταλλικοί νανοκρύσταλλοι, ημιαγωγοί, διηλεκτρικά υλικά κ.ά. Η μέθοδος μικροκυμάτων είναι μία χημική μέθοδος σύνθεσης νανοσωματιδίων, κατά την οποία ηλεκτρονική ακτινοβολία χρησιμοποιείται για την θέρμανση των διάφορων υλικών. Αυτό επιτυγχάνει τη πόλωση μορίων σε διαλύματα και την φόρτιση ιόντων σε στερεά. Σε σχέση με άλλες θερμικές μεθόδους αυτή έχει περισσότερο ερευνητικό 36
ενδιαφέρον λόγω του λίγου χρόνου και ταυτόχρονα της υψηλής της απόδοσης. Η μέθοδος αυτή έχει χρησιμοποιηθεί για τη σύνθεση μαγνητίτη (Fe 3 O 4 ) και αιματίτη (α- Fe 2 O 3 ) (Wang et al., 2007). Τα MNPs παρασκευάζονται και με την χρήση διάφορων εκμαγείων (προτύπων) από πορώδη υλικά. Οι πυρήνες δημιουργούνται στις οπές με αποτέλεσμα τα σωματίδια να έχουν ίδιο μέγεθος και σχήμα. Πολύπλοκες νανοδομές όπως οι νανοράβδοι, τα νανοπρίσματα, εξαγωνικοί και οκταεδρικοί νανοκρύσταλλοι μπορούν να συντεθούν με μεγαλύτερη ευκολία (Hurst et al., 2006). Τέλος, ένας άλλος τρόπος παρασκευής MNPs είναι η αυτοοργάνωση, και περιλαμβάνει την οργάνωση μέσω της θερμοδυναμικής των ατόμων. Η αυτοοργάνωση μπορεί να γίνει είτε με τη βοήθεια υποστρώματος είτε με την εφαρμογή εξωτερικών μαγνητικών πεδίων, για τον προσανατολισμό των σωματιδίων. Από αυτή τη μέθοδο προκύπτουν σωματίδια, πολύπλοκου σχήματος, τα οποία είναι σταθερά στην καταστρεπτική θερμική αποσύνθεση μέσω των δυνάμεων στη νανοκλίμακα. Ο μαγνητίτης (Fe 3 O 4 ) και ο μαγεμίτης (γ-fe 2 O 3 ) είναι τα πιο αντιπροσωπευτικά παραδείγματα MNPs (Σχήμα 2.13). Σχήμα 2.13 : Η κρυσταλλική δομή του μαγνητίτη(αριστερά) και του μαγεμίτη (δεξιά). (http://www.emg.tu-bs.de/forschung/material/maghemite_d.html, https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f7/magnetite_structure.jpg/200px- Magnetite_structure.jpg) Πρόκειται για βιοσυμβατά και βιοδιασπώμενα σωματίδια τα οποία βρίσκουν εφαρμογές στο ιατρικό και φαρμακευτικό πεδίο. Αυτά τα κολλοειδή χαρακτηρίζονται από κρυσταλλικές δομές σπινελίων (μορφή διδυμίας) όπου τα κατιόντα παίρνουν θέσεις στο πλέγμα γύρω από τα ανιόντα. Ο μαγνητίτης κρυσταλλώνεται στο κυβικό σύστημα, έχει 37
χρώμα μαύρο και μεταλλική λάμψη. Ο μαγεμίτης κρυσταλλώνεται στο κυβικό σύστημα (με τετραγωνική υπερκυψελίδα) και είναι καφέ. Και τα δύο αυτά οξείδια σιδήρου είναι σιδηριμαγνητικά υλικά (Harivardhan et al., 2012). Όπως και όλα τα νανοσωματίδια έτσι και τα μαγνητικά μπορούν να υποστούν περαιτέρω τροποποίηση όσον αφορά την επιφάνειά τους. Αυτό τα καθιστά βιοσυμβατά καθώς έχουν τη δυνατότητα εξειδικευμένης πρόσδεσης με διάφορα βιομόρια, ενισχύει τη σταθερότητά τους, επειδή προστατεύονται και αυξάνει την υδατοδιαλυτότητά τους. Η παρουσία κατάλληλων λειτουργικών ομάδων στην επιφάνειά τους, δίνει την ικανότητα αξιοποίησης τους σε πληθώρα εφαρμογών. Για το λόγο αυτό έχει πολύ σημαντικό ρόλο τόσο η επιλογή τους όσο και ο προσανατολισμός των λειτουργικών ομάδων τους πάνω στα MPNs (Liu et al., 2008). Η τροποποίηση των MNPs μπορεί να γίνει άμεσα ή έμμεσα. Η άμεση περιλαμβάνει τη φυσική ή χημική πρόσδεση μορίων και πολυμερών, στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων. Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι οι δεξτράνες, διάφορα συνθετικά πολυμερή όπως πολυβινυλική αλκοόλη (PVA) και το πολυακρυλικό οξύ (PAA), η πολυ-αιθυλενο-γλυκόλη (PEG) κ.ά. Τα πολυμερικά υλικά όταν χρησιμοποιούνται σαν σταθεροποιητικοί παράγοντες, δημιουργούν και ένα περίβλημα που εμποδίζει τα σωματίδια να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και αποτρέπουν τη συσσωμάτωση. Η σύνδεση των επιφανειακών τροποποιητών επιτυγχάνεται μέσω παρουσίας χημικών ομάδων (π.χ. φωσφορικές ή καρβοξυλικές) οι οποίες συζευγνύονται ισχυρά στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου. Σε άλλες περιπτώσεις η πρόσδεση γίνεται μέσω χημικών ομάδων οι οποίες αναπτύσσουν δεσμούς υδρογόνου με τις επιφάνειες των μαγνητικών νανοσωματιδίων (Lu et al., 2007). Οι πολυσακχαρίτες είναι ενώσεις που σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με τα MNPs. Οι δεξτράνες (σχήμα 2.13) είναι ο πιο κοινός βιοδιασπώμενος και βιοσυμβατός φυσικός πολυσακχαρίτης που χρησιμοποιείται για την επίστρωση της επιφάνειας των MNPs. Οι δεξτράνες έχουν μεγάλη συγγένεια ως προς τα οξείδια σιδήρου (μέσω χηλικών δεσμών). Ο μεγάλος αριθμός καρβοξυλικών ομάδων που έχουν οι δεξτράνες οδηγεί στο σχηματισμό ισχυρών δεσμών υδρογόνου (Singh at al., 2014 ). 38
Σχήμα 2.13: Δομή καρβοξυδεξτράνης (https://en.wikipedia.org/wiki/dextran#/media/file:dextran-2.png) Επιπλέον τα ανόργανα μέταλλα όπως ο χρυσός προσδίδουν σημαντικές ιδιότητες στην επιφάνεια των σωματιδίων. Ο χρυσός παρέχει τη δυνατότητα πρόσδεσης αλκοολών ή καρβοξυλικών ομάδων μέσω θειολών. Τα σωματίδια είναι σταθερά σε διαλύματα με όξινο ή ουδέτερο ph. Τα μη μεταλλικά υλικά όπως ο γραφίτης προστατεύουν τα MNPs από την οξείδωση και βελτιώνουν τη διαλυτότητά τους. Η τοξικότητα βέβαια και η βιοσυμβατότητα των δύο τελευταίων είναι αναγκαίο να μελετηθούν (Di Marco et al., 2006). Η έμμεση επιφανειακή τροποποίηση περιλαμβάνει τον εγκλωβισμό μαγνητικών νανοσωματιδίων σε λιποσώματα, μικκύλια και τεχνητά καψίδια πολυηλεκτρολυτών. Τα λιποσώματα έχουν τη δυνατότητα να ενσωματώνουν μεγάλες συγκεντρώσεις MNPs. Το πλεονέκτημα του συστήματος αυτού είναι ότι δεν απαιτείται επεξεργασία της επιφάνειας των σωματιδίων πριν εισαχθούν στα λιποσώματα. Το μέγεθος και το σχήμα των MNPs είναι καθοριστικό για τη σταθερότητά τους αλλά και για την in vivo και in vitro απόκρισή τους. Το μέγεθος επηρεάζει σημαντικά την απόκρισή τους σε μαγνητικά πεδία και τις μαγνητικές τους ιδιότητες. Μετρήσεις έχουν δείξει, για τα οξείδια σιδήρου, ότι ο μαγνητικός κορεσμός μειώνεται όσο μειώνεται και το μέγεθος. Η μείωση του μεγέθους των σωματιδίων οδηγεί σε αύξηση της επιφάνειας και σε αλλαγή των μαγνητικών τους ιδιοτήτων. Όμως τα πολύ μικρά σωματίδια μπορούν να εμφανίσουν και υπερπαραμαγνητικές ιδιότητες (Indira et al., 2010). Τα μαγνητικά νανοσωματίδια έχουν κεντρίσει το ενδιαφέρον της ερευνητικής κοινότητας λόγω των ιδιοτήτων τους. Έχουν αρχίσει και αξιοποιούνται σε μεγάλο εύρος εφαρμογών τόσο στην κατάλυση και τα ηλεκτρονικά συστήματα όσο και σε 39
βιοεφαρμογές. H μεγάλη ειδική επιφάνεια των νανοσωματιδίων οδηγεί στη δημιουργία καταλυτών με αυξημένη ενεργότητα. Χρησιμοποιούνται σε μελάνια, σε συσκευές αποθήκευσης και καταγραφής, σαν καταλύτες για την απομάκρυνση των οργανικών βαφών, σε αισθητήρες αερίων, σε μπαταρίες και σε επεξεργασία λυμάτων. Λόγω των νανο-διαστάσεων μπορούν να προσκολληθούν σε κύτταρα αλλά και να εισαχθούν στο αίμα. Ωστόσο τα MNPs που χρησιμοποιούνται στις βιοεφαρμογές θα πρέπει να έχουν ελέγχονται για τα εξής: η χημική τους σύνθεση, η μη τοξική και η αντιαλλεργική τους σύσταση, το μέγεθος, η ομοιογένεια των κρυσταλλικών δομών, η διαλυτότητά τους, η βιοσυμβατότητα και οι μαγνητικές τους ιδιότητες. Κάποιες από τις πιο σημαντικές εφαρμογές αναφέρονται αναλυτικότερα παρακάτω (Khan et al., 2015): Χρήση υπερπαραμαγνητικών σωματιδίων, οξειδίου του σιδήρου, για τη θεραπεία φλεγμονών στις αρθρώσεις και ως εξειδικευμένων ιχνηθετών για διάφορους βιοδείκτες. Ιχνηθέτηση κυττάρων ή παρακολούθηση της κυτταρικής διαίρεσης, αποτοξίνωση των βιολογικών υγρών, αποκατάσταση των ιστών, απεικόνιση με μαγνητικό συντονισμό πχ καρκινικών κυττάρων, θεραπεία με υπερθερμίας. Η στοχευμένη μεταφορά φαρμάκων στις επιθυμητές περιοχές δράσης και η απελευθέρωσή τους με ελεγχόμενο τρόπο. Αυτά χορηγούνται ενδοφλεβίως με την φαρμακευτική ουσία και έπειτα με την εφαρμογή εξωτερικού μαγνητικού πεδίου καθοδηγούνται στην περιοχή που είναι επιθυμητή η δράση του φαρμάκου. Έτσι επιτυγχάνεται ο έλεγχος της πορείας και της διαδρομής του φαρμάκου στον οργανισμό. Η χορήγησή τους γίνεται ενδοφλεβίως πχ χημειοθεραπεία ή από το δέρμα. Απεικόνιση ιστών μέσω μαγνητικού συντονισμού ή και ενίσχυση των σημάτων στις μαγνητικές τομογραφίες (Indira et al., 2010). 40
Πειραματικό μέρος 41
Όργανα-Υλικά Πεχάμετρο 692 ph/ion Meter, Metrohm Αυτόματες Πιππέτες Nichiryo Συσκευή περιδίνησης (Vortex) Labnet International Επωαστήρας/ Αναδευτήρας Heidolph incubator 1000 Επιτραπέζια φυγόκεντρος Centrifuge 5415 D, Eppendorf Ψυχόμενη φυγόκεντρος Universal 320R, Hettich Zentrifuger Συσκευή υπερήχων Sonifier Cell Disruptor, Branson Sonic Power (0-300W) Αυτόκαυστο, Webeco Λουμινόμετρο PhL Mediators συνδεδεμένο με Η/Υ Θάλαμος υπεριώδους ακτινοβολίας. Κιτ απομόνωσης πλασμιδιακού DNA - NucleoSpin Plasmid, Macherey-Nagel Φούρνος μικροκυμάτων, Moulinex. Ψηφιακή κάμερα, KODAK DC 120. Αναλυτικός ζυγός ακρίβειας 4 δεκαδικών ψηφίων ΑΒ104-5, ευαισθησίας 1mg- 110g, Mettler, Toledo. Φασματοφωτόμετρο IMPLEN. Συσκευή υπερκάθαρου νερού, Millipore. Parafilm Μανδύας θέρμανσης Σφαιρικές φιάλες Ψυκτήρας Φθορισμόμετρο, Perkin Elmer LS50B Μαγνητικός αναδευτήρας με θέρμανση Διπλότοιχο ποτήρι ζέσεως Πεχαμετρικό χαρτί Μαγνήτης 42
Λουτρό υπερήχων, Bianson Ultrasonics Corporation (Danbury, USA) Buchi R-200 Rotavapor System Αντιδραστήρια: Εκχύλισμα ζύμης - Yeast extract, CAS 8013-01-2, Sigma-Aldrich Τρυπτόνη - Tryptone Biochemica, LOT 2M007007, Applichem NaCl, CAS 7647-14-5, Sigma-Aldrich Άγαρ - Agar, CAS 9002-18-0, Sigma Αμπικιλλίνη, (amp), CAS Number 69-52-3, Sigma E. coli strain WA802 Πλασμίδιο - Plasmid pam-he CaCl 2 * 2H 2 O, CAS 10035-04-8, Sigma Απόλυτη αιθανόλη 100%, Fluka Γλυκερόλη, CAS 56-81-5, Carlo Erba Trizma base, CAS 77-86-1, Sigma Υδροχλωρικό οξύ, HCl, CAS 6381-92-6, Merck Στήλη νικελο-αγαρόζης (Ni-NTA), Qiagen Ιμιδαζόλιο EDTA, CAS 67-68-5, Fisher Chemical Διθειοτρεϊτόλη (DTT), EC 222-468-7Sigma Σελεντεραζίνη Στήλη Βουτυλικής Σεφαρόζης (Butyl Sepharose 4 Fast Flow column), GE Healthcare Bio-Sciences (NH 4 ) 2 SO 4, CAS 7783-20-2, Serva 2-Μερκαπτοεθανόλη, 14.26 M EcoR1, Takara BIO INC 43
1 kb DNA Ladder (ready to use), GeneRuler, Fermentas Χρωστική Coomasie Brilliant Blue G-250, CAS 6104-58-1, Serva Βόεια Αλβουμίνη Ορού (BSA), CAS 9048-46-8, SERVA H 3 PO 4 85%, CAS 7664-38-2, Merck Σελήνιο (Se), CAS 7782-49-2, Aldrich Οξείδιο του καδμίου,(cdo), CAS 1306-19-0, Aldrich Τριοκτυλοφωσφίνη (TOP),CAS 4731-53-7, Aldrich 1-Οκταδεκένιο, (ODE),CAS 112-88-9, Aldrich Ολεϊκό οξύ, (OLA), CAS 112-80-1, Aldrich 3- Μερκαπτοπροπιονικό οξύ (3-MPA), CAS 107-96-0, Aldrich Cd(NO 3 ) 2 *4H 2 O, 11714, Riedel de Haen NaOH,, CAS 1310-73-2, Sigma-Aldrich 30% H 2 O 2,Cat 822287, Merck 25-29 % ΝΗ 3, CAS Number 7664-41-7, Sigma-Aldrich 10mM HAuCl 4 Βόεια Αλβουμίνη Ορού (BSA), CAS 9048-46-8, SERVA Μεμβράνη διαπίδυσης κυτταρίνης, D-9277, Sigma FeCl 2 *4H 2 O FeCl 3 (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) 2 *6H 2 O, CAS 7783-85-9, Penta NH 4 Fe(SO 4 ) 2 *12H 2 O, CAS 8595-62-8, Merck KOH pellets, CAS 1310-58-3, Sigma-Aldrich 3-Αμινοπροπυλ-τριαιθόξη σιλάνιο (APTES), CAS 919-30-2, Pierce Na 2 HPO 4 NaH 2 PO 4 *2H 2 O 44
EZ-link sulfo-nhs-lc-lc-biotin, ThermoFisher Scientific Maleic acid Διαιθαινολαμίνη, CAS 111-42-2, Sigma Aldrich p-νιτροφενυλφωσφορικό οξύ, Merck Σύζευγμα στρεπταβιδίνης-αλκαλικής φωσφατάσης, ThermoFisher Διαλύματα: Διάλυμα της χρωστικής Coomasie Brilliant Blue G-250 0,0025 % w/v Coomasie Brilliant Blue G-250 5 % v/v απόλυτη αιθανόλη 10 % v/v H3PO4 85%. Triggering buffer, ph 7.6 50 mm CaCl 2, 50 mm Tris HCl 50x TAE buffer, ph 8 500 mm Tris-HCl ph 8 50 mm EDTA ph 8 Phosphate Buffer (PB), ph 7,4 0,1 M Na 2 HPO 4 0,1 M NaH 2 PO 4 *2H 2 O MAB-0,1 % BSA, ph 7,5 0,1 M maleic acid 0,15 M NaCl 0,1 % BSA 45
46
Κεφάλαιο 3 Έκφραση, απομόνωση και καθαρισμός ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης Το Ε.coli είναι ένα αρνητικό κατά Gram βακτήριο, ραβδοειδούς σχήματος. Πρόκειται για έναν οργανισμό που αναπτύσσεται εύκολα και γρήγορα, δίνοντας μεγάλο αριθμό κυττάρων. Τα στελέχη που χρησιμοποιούνται για την πρωτεϊνοσύνθεση δεν είναι επιβλαβή για τον άνθρωπο ή το περιβάλλον (Κωστοπούλου, 2012). Σχήμα 3.1: Απεικονίζεται η δομή του αρνητικού κατά Gram βακτηρίου E.coli (Tortora et al., 2009). Στην παρούσα διπλωματική εργασία, μελετήθηκε μια ήδη υπάρχουσα μέθοδος (Inouye et al., 2012). Αυτή αφορά την έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης αικουορίνης στον περιπλασμικό χώρο του κυττάρου (σχήμα 3.2). Ο περιπλασμικός χώρος του κυττάρου, είναι ο χώρος που βρίσκεται ανάμεσα στην εξωτερική και την πλασματική μεμβράνη. Εκεί εκφράζεται μόλις το 4% των πρωτεϊνών του βακτηριακού κυττάρου. Στον περιπλασμικό χώρο βρίσκεται και ένα λεπτό στρώμα πεπτιδογλυκάνων. Η πεπτιδογλυκάνη είναι το βασικό μόριο του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων. Είναι πολυμερές και αποτελείται από μόρια γλυκάνης (σάκχαρο) (Tortora et al., 2009). 47
Σχήμα 3.1: Απεικόνιση της δομής του βακτηριακού κυττάρου της E.coli. Στο κεφάλαιο αυτό μελετήθηκε μια μέθοδος (Inouye et al., 2012) για την έκφραση, την απομόνωση και τον καθαρισμό της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης αικουορίνης. Τα βακτηριακά στελέχη W802 της E.coli αρχικά καλλιεργούνται και μετά την παραλαβή τους επεξεργάζονται με διάλυμα παγωμένου CaCl 2, ώστε να γίνουν επιδεκτικά. Ακολουθεί μετασχηματισμός των επιδεκτικών βακτηριακών κύτταρων με την εισαγωγή του πλασμιδιακού DNA pam-he. Μετά την εισαγωγή του πλασμιδιακού DNA στα μετασχηματισμένα κύτταρα, γίνεται απομόνωση και ταυτοποίησή του με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Στη συνέχεια τα μετασχηματισμένα κύτταρα καλλιεργούνται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει το αντιβιοτικό αμπικιλλίνη. Η παραλαβή τους γίνεται με φυγοκέντρηση και η λύση τους με υπερήχους. Η πρωτεΐνη αικουορίνη εκφράζεται στον περιπλασμικό χώρο των κυττάρων λόγω του πεπτιδίου οδηγού ompa της εξωκυττάριας πρωτεΐνης Α, το οποίο την οδηγεί εκεί. Η απομόνωση της ανασυνδυασμένης αικουορίνης πραγματοποιείται με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου (IMAC) με στήλη Ni-NTA αγαρόζης. Το έκλουσμα από τη στήλη Ni-NTA περιέχει και τις άλλες πρωτεΐνες που βρίσκονται στον περιπλασμικό χώρο, εκτός από την αποαικουορίνη. Ακολουθεί ενεργοποίηση της πρωτεΐνης σε αικουορίνη, με την προσθήκη σελεντεραζίνης, και ο καθαρισμός με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων με στήλη βουτυλικής σεφαρόζης (Butyl Sepharose). 48
Ο ποσοτικός προσδιορισμός των ολικών πρωτεϊνών στο έκλουσμα από τη στήλη Ni- NTA και στο έκλουσμα της ενεργοποιημένης αικουορίνης από τη στήλη βουτυλικής σεφαρόζης, πραγματοποιείται με τη μέθοδο Bradford. Στη μέθοδο αυτή χρησιμοποιείται η χρωστική Coomasie Brilliant Blue G-250. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη δημιουργία ιοντικών και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των σουλφονυλομάδων της χρωστικής και των πρωτονιωμένων αμινομάδων των πρωτεϊνών σε όξινο περιβάλλον. Οι μετρήσεις απορρόφησης λαμβάνονται σε μήκος κύματος 570 nm. Τέλος γίνεται προσδιορισμός της ενεργότητας της ανασυνδυασμένης αικουορίνης, με την προσθήκη ιόντων Ca 2+. 1. Παρασκευή και καλλιέργεια μετασχηματισμένων βακτηρίων E.coli W802: 1.1. Καλλιέργεια βακτηρίων E.Coli WA802 σε στερεό θρεπτικό υλικό 1.1.1. Παρασκευή υγρής καλλιέργειας βακτηρίων E.Coli WA802: Πειραματική πορεία i. Προετοιμασία θρεπτικού υλικού Α Luria-Bertani (LB-broth) 5 g bacto tryptone 2,5 g yeast extract 5 g NaCl ii. Ρύθμιση pη στην τιμή 7,00 με τη χρήση διαλύματος HCl. iii. Αποστείρωση του θρεπτικού υλικού Α και 2 κωνικών των 500 ml, με τη βοήθεια χύτρας ταχύτητας, για περίπου 20 min στους 120 o C (ή αποστείρωση σε αυτόκαυστο). iv. Μεταφορά των βακτηρίων από το χάρτινο φίλτρο σε 5 ml θρεπτικού υλικού, μέσα σε 50 ml φυγογκεντρικού σωλήνα τύπου falcon (positive sample Α). Επίσης εισάγονται 5 ml θρεπτικό υλικό σε 50 ml falcon (negative sample Α). v. Ολονύκτια (O/N) επώαση, των δύο δειγμάτων με ανακίνηση στους 37 o C. 49
1.1.2. Παρασκευή στερεής καλλιέργειας βακτηρίων E.Coli WA802 σε τρυβλία: i. Στο αποστειρωμένο θρεπτικό υλικό Α προστίθεται 15 g/l bacto-agar. ii. Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 min. iii. Ανάδευση μέχρι να διαλυθεί το άγαρ και μεταφορά στα τρυβλία, προσεκτικά για την αποφυγή φυσαλίδων. iv. Όταν το θρεπτικό μέσο ψυχθεί και γίνει στερεό τότε τα τρυβλία αναποδογυρίζονται και τοποθετούνται στους 4 o C μέχρι την επόμενη χρήση. v. Από το positive sample A, της καλλιέργειας Α, γίνεται επίστρωση στα τρυβλία με τη βοήθεια του μοριακού κρίκου και υπό στείρες συνθήκες (λύχνος Bunsen και χρήση απόλυτης αιθανόλης για απολύμανση). vi. Τα τρυβλία επωάζονται (O/N) στους 37 o C. Παρατηρήσεις: Το κάθε τρυβλίο χρειάζεται 30-35 ml θρεπτικού μέσου. Αν δημιουργηθούν φυσαλίδες μπορούν να απομακρυνθούν πλησιάζοντας το λύχνο Bunsen προς το τρυβλίο. Αν είναι επιθυμητή η προσθήκη θερμοευαίσθητων ουσιών (όπως τα αντιβιοτικά), απαιτείται η ψύξη του θρεπτικού μέσου στους 50 o C. Προστίθεται το αντιβιοτικό αμπικιλλίνη (amp) σε τελική συγκέντρωση 50 μg/ml. Τα τρυβλία πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για περίπου 1-2 ώρες πριν τη χρήση για την αποφυγή δημιουργίας υδρατμών, κατά την επώαση στους 37 o C, ή μόλυνσης. 1.2. Παρασκευή επιδεκτικών κυττάρων προς εισαγωγή ανασυνδυασμένου DNA. Από τα τρυβλία του κεφαλαίου 1.1.2. παραλαμβάνεται μία μόνο αποικία, με τη χρήση του βιολογικού κρίκου, κάτω από άσηπτες συνθήκες, και τοποθετείται σε 5 ml θρεπτικού μέσου LB. Στη συνέχεια, τοποθετούνται 5 ml από το αποστειρωμένο 50
θρεπτικό υλικό σε ένα καινούριο falcon, το οποίο αντιπροσωπεύει το τυφλό δείγμα. Ακολουθεί επώαση O/N στους 37 o C με ανακίνηση. Την επόμενη μέρα πραγματοποιείται επέκταση της καλλιέργειας. Το θρεπτικό μέσο LB ( 500 ml) μοιράζεται σε δύο αποστειρωμένες κωνικές φιάλες, οι οποίες περιέχουν 300 ml και 200 ml LB αντίστοιχα. Στην κωνική με τα 300 ml LB-broth προστίθενται τα 5 ml θρεπτικού που περιέχουν την αποικία. Τα 200 ml LB χρησιμοποιούνται σαν τυφλό δείγμα. Σε όλη τη διάρκεια της επώασης λαμβάνονται μετρήσεις απορρόφησης (ουσιαστικά είναι θολερομετρία ή θολωσιμετρία) ανά τακτά χρονικά διαστήματα σε μήκος κύματος 570 nm. Όταν η απορρόφηση φτάσει την επιθυμητή τιμή των 0,6-0,7, οι οποίες αντιστοιχούν στην εκθετική φάση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων τότε η επώαση σταματά και συνεχίζεται περαιτέρω επεξεργασία για τη δημιουργία επιδεκτικών κυττάρων. 1.2.1. Επιδεκτικά κύτταρα: i. Παρασκευή 15 ml διαλύματος 50 mm CaCl 2 σε αποστειρωμένο falcon των 50 ml και φύλαξη σε πάγο. ii. Τοποθέτηση 10 ml κυττάρων από την εκθετική φάση (mid-log phase) σε 2 falcon των 15 ml. iii. Φυγοκέντρηση των falcon στις 2000-4000 rpm για 10 min. iv. Απόρριψη του υπερκειμένου χωρίς την διαλυτοποίηση του ιζήματος (pellet) των κυττάρων. v. Πλήρες στέγνωμα του ιζήματος, χτυπώντας ήπια το κάθε falcon σε ένα καθαρό κομμάτι χαρτί. Αποστείρωση του στομίου του falcon με το λύχνο Bunsen και τοποθέτηση του πώματος. vi. Προσθήκη 5 ml από το παγωμένο διάλυμα CaCl 2 στο ίζημα. vii. Ανακίνηση του falcon με το χέρι ('finger vortex'), μέχρι την πλήρη διαλυτοποίηση του ιζήματος των βακτηριακών κυττάρων. viii. Επώαση των falcon στον πάγο για 20 min. ix. Φυγοκέντρηση στις 2000-4000 rpm για 5 min. 51
x. Απόρριψη του υπερκειμένου χωρίς την διαλυτοποίηση του κυτταρικού ιζήματος. xi. Ασηπτική προσθήκη 1 ml παγωμένου διαλύματος CaCl 2. xii. Ανακίνηση του falcon με το χέρι ('finger vortex'), μέχρι την πλήρη διαλυτοποίηση του ιζήματος. xiii. Φύλαξη των επιδεκτικών κυττάρων σε πάγο και στο ψυγείο (0 o C). Παρατηρήσεις: Η διαλυτοποίηση του ιζήματος στο στάδιο (vii) είναι σημαντική καθώς δεν πρέπει να παραμείνουν κύτταρα ή συσσωματώματά τους Το διάλυμα του CaCl 2 θα πρέπει να έχει παρασκευασθεί πρόσφατα, για την αποφυγή επιμολύνσεων. Η τήρηση των ασηπτικών συνθηκών (λύχνος Bunsen, αιθανόλη, γάντια κλπ) είναι απαραίτητη σε αυτό το στάδιο. Η επώαση τους στους 0 o C για πάνω από 24 hr ( Seasoning ) αυξάνει την απόδοσή τους. 1.2.2. Μετασχηματισμός (transformation): i. Ασηπτικά τοποθετούνται 200 μl από το διάλυμα των επιδεκτικών κυττάρων σε ένα falcon των 15 ml. Τοποθέτηση στον πάγο. ii. Προσθήκη 10 μl από το διάλυμα των 5 μg/ml του πλασμιδιακού DNA pam-he, στο διάλυμα των κυττάρων. iii. Ανακίνηση του falcon του βήματος (i), με το χέρι ('finger vortex'), με αποφυγή φυσαλίδων ή μεταφορά του διαλύματος στα τοιχώματα του falcon. iv. Επώαση του διαλύματος στον πάγο για 20 min. v. Μεταφορά του παγόλουτρου κοντά σε υδατόλουτρο. Άμεση μεταφορά του falcon στους 42 o C για 90 s. Γρήγορη επιστροφή στο παγόλουτρο για τουλάχιστον 1 min. vi. Προσθήκη 800 μl LB broth στο falcon. 'Finger vortex'. vii. Επώαση στους 25-30 o C για 60 min. viii. Προσθήκη 100 μl από το διάλυμα των κυττάρων σε τρυβλίο με LB-amp agar. 52
ix. Αποστείρωση του διασκορπιστή/σπάτουλα κυττάρων (cell spreader), με αιθανόλη και πέρασμα από το λύχνο Bunsen. Ψύξη του spreader με τριβή στην επιφάνεια του LB-agar,, λήψη κυττάρων και διασπορά τους στην επιφάνεια του στερεού θρεπτικού υλικού. x. Αντιστροφή των τρυβλίων και επώαση των αποικιών σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 o C) για 12-24 ώρες. xi. Μετά τη δημιουργία των αποικιών, φύλαξη των τρυβλίων στους 4 o C μέχρι την επόμενη χρήση. Παρατηρήσεις: Τα κύτταρα υφίστανται θερμικό "shock" ώστε να γίνει πιο χαλαρή η μεμβράνη τους και να επιτευχθεί η εισαγωγή του πλασμιδίου στα κύτταρα. Η θερμοκρασία 25-30 o C είναι συγκεκριμένα μόνο για τα στελέχη WA802 των κυττάρων της E.coli. Οι αποικίες εμφανίστηκαν περίπου μετά από 30 ώρες επώαση. Κάποια ποσότητα του θρεπτικού υλικού με τα μετασχηματισμένα κύτταρα αποθηκεύτηκε στους -80 o C σε 15% γλυκερόλη, για μελλοντική χρήση. 1.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Το LB-broth από την κωνική φιάλη που δεν περιέχει βακτήρια χρησιμοποιείται σαν τυφλό (blank) για το μηδενισμό του φασματοφωτομέτρου σε κάθε μέτρηση απορρόφησης. Κατά την επώαση λαμβάνονταν τιμές απορρόφησης ανά τακτά χρονικά διαστήματα στα 570 nm. Οι επιθυμητές τιμές είναι από 0,6-0,7, οι οποίες αντιστοιχούν στην εκθετική φάση πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Αυτή είναι η φάση b του παρακάτω διαγράμματος. Τα κύτταρα πλέον αναπτύσσονται και αυξάνονται εκθετικά (κυτταρική διαίρεση). Πίνακας 3.1: Περιλαμβάνονται οι τιμές απορρόφησης στα 570 nm, καθώς και τα χρονικά διαστήματα στα οποία έγινε η λήψη τους. 53
α/α Απορρόφηση Χρονικό Διάστημα (min) 1 0,189 10 2 0,259 30 3 0,439 70 4 0,549 80 5 0,586 90 6 0,628 100 Στη φάση a του παρακάτω διαγράμματος τα κύτταρα προσαρμόζονται σε νέες περιβαλλοντικές συνθήκες. Αφομοιώνουν θρεπτικά συστατικά και παράγουν τα κατάλληλα ένζυμα, πρωτεΐνες. Επειδή στη φάση αυτή δεν παρατηρείται αύξηση του αριθμού των κυττάρων, ονομάζεται λανθάνουσα φάση. Η φάση c ονομάζεται φάση στασιμότητας. Εδώ η βακτηριακή ανάπτυξη επιβραδύνεται και τελικά σταματάει, λόγω έλλειψης θρεπτικών ουσιών, ή λόγω αντίξοων περιβαλλοντικών συνθηκών (ph, οξυγόνο, θερμοκρασία, μικροβιακός ανταγωνισμός, κλπ). Τέλος στη φάση d τα κύτταρα θανατώνονται με αυτόλυση (μη αντιστρεπτός προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος) και για αυτό ονομάζεται φάση θανάτου. 54
Σχήμα 3.3: Διάγραμμα των φάσεων a, b, c, d, της βακτηριακής ανάπτυξης. Τα αρνητικό δείγμα, το οποίο περιείχε μόνο το θρεπτικό υλικό (LB), χρησιμοποιείται και κατά τη στερεή αλλά και την υγρή καλλιέργεια για τον έλεγχο πιθανής επιμόλυνσης. Έτσι θόλωμα στην υγρή καλλιέργεια ή αποικίες (LB-agar plates), θα πρέπει να παρατηρούνται μόνο στα θετικά δείγματα και όχι στο αρνητικό, κάτι που πιστοποιεί την ανάπτυξη μόνο των επιθυμητών βακτηρίων και αποκλείει την πιθανότητα επιμόλυνσης. Οι αποικίες των μετασχηματισμένων κυττάρων με το πλασμίδιο εμφανίστηκαν περίπου σε 30 ώρες επώαση. Στο LB-agar προστέθηκε αμπικιλλίνη για την αποφυγή ανάπτυξης άλλων, μη επιθυμητών, βακτηρίων. Το πλασμίδιο pam-he, που εισήχθη στα βακτηριακά κύτταρα περιέχει αλληλουχία DNA που καθιστά τα κύτταρα ανθεκτικά στην amp. Επομένως σε θρεπτικό μέσο με amp θα επιβιώσουν μόνο τα μετασχηματισμένα κύτταρα όπως φαίνεται στο σχήμα 3.4. Σχήμα 3.4: Στερεή καλλιέργεια με θρεπτικό μέσο κυττάρων E.coli. LB-agar με amp μετασχηματισμένων 55
2. Απομόνωση και ταυτοποίηση του πλασμιδίου pam-he από τα μετασχηματισμένα κύτταρα της E.coli Μετά τον μετασχηματισμό των βακτηριακών κυττάρων της E.coli με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, ακολούθησε η διαδικασία απομόνωσης του ώστε να εξακριβωθεί εάν εισήχθη στα κύτταρα. Πειραματική πορεία: Από τα τρυβλία της ενότητας 1.2.2 επιλέχθηκε μία μόνο αποικία και με τη βοήθεια του βιολογικού κρίκου προστέθηκε σε 10 ml θρεπτικού μέσου LB-amp. Στη συνέχεια, τοποθετούνται 5 ml από το αποστειρωμένο θρεπτικό υλικό σε ένα καινούριο falcon, το οποίο αντιπροσωπεύει το τυφλό δείγμα. Ακολουθεί επώαση για 18 ώρες στους 25-30 o C με ανακίνηση. Η απομόνωση του πλασμιδιακού DNA έγινε με τη βοήθεια του κιτ απομόνωσης NucleoSpin Plasmid, Macherey-Nagel. Χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο υψηλής πολλαπλότητας πλασμιδιακού DNA. 2.1.Απομόνωση πλασμιδιακού DNA: i. 1-5 ml από την παραπάνω καλλιέργεια τοποθετούνται σε μικροφυγοκεντρικούς σωλήνες τύπου eppensdorf (eppendorfs) και χρησιμοποιούνται στην απομόνωση του πλασμιδιακού DNA. ii. Φυγοκέντρηση για 30 s στις 11, 000 g σε RT. iii. Απόρριψη του υπερκειμένου και αφαίρεση όσο το δυνατόν περισσότερου υγρού. iv. Προσθήκη 250 μl από το Buffer A1. Πλήρης επαναδιαλυτοποίηση του κυτταρικού ιζήματος με vortex. Δεν πρέπει να υπάρχουν συσσωματώματα πριν την προσθήκη του Buffer A2. v. Προσθήκη 250 μl από το Buffer A2 (λύση κυττάρων). Ήπια ανάδευση αντιστρέφοντας το eppendorf 6-8 φορές. Αποφυγή του vortex καθώς υπάρχει κίνδυνος αποδιάταξης του γενετικού υλικού. vi. Επώαση για 5min σε RT μέχρι το διάλυμα να γίνει διαυγές. 56
vii. Προσθήκη 300 μl από το Buffer A3. Ήπια ανάδευση αντιστρέφοντας το eppendorf 6-8 φορές, μέχρι το διάλυμα να μετατραπεί από μπλε σε διαυγές. viii. Φυγοκέντρηση για 5 min στις 11,000 g σε RT. Επανάληψη του βήματος σε περίπτωση που το υπερκείμενο δεν είναι διαυγές. ix. Το υπερκείμενο 750 μl, μεταφέρεται σε ηθμό NucleoSpin Plasmid, ο οποίος έχει τοποθετηθεί σε στήλη συλλογής δείγματος και φυγοκεντρείται για 1 min στις 11,000 g. x. Απόρριψη διηθήματος και τοποθέτηση του ηθμού πίσω στη στήλη συλλογής. Επανάληψη του βήματος για προσθήκη του εναπομείναντος υπερκειμένου. xi. Προσθήκη 600 μl από το Buffer A4 (στο οποίο έχει προστεθεί απόλυτη αιθανόλη) xii. Φυγοκέντρηση του ηθμού για 1 min στις 11,000 g. xiii. Απόρριψη διηθήματος και φυγοκέντρηση του ηθμού για 2 min στις 11,000 g, για την πλήρη απομάκρυνση του υγρού από τον ηθμό. xiv. Τοποθέτηση του ηθμού σε καινούριο eppendorf και προσθήκη 50 μl από το Buffer AE. Επώαση για 1 min σε RT. xv. Φυγοκέντρηση για 1 min στις 11,000 g και φύλαξη του διηθήματος. Διαλύματα που χρησιμοποιούνται: Buffer A1: διάλυμα ανασύστασης του κυτταρικού ιζήματος. Buffer A2: διάλυμα λύσης των κυττάρων, Διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 0.5 2,0 %, CAS 1310-73-2 Buffer A3: εξουδετέρωση διαλύματος λύσης και δημιουργία συνθηκών πρόσδεσης του DNA στον ηθμό, Διάλυμα υδροχλωρικής γουανιδίνης 36 50 %, CAS 50-01-1 Buffer A4 : διάλυμα εκπλύσεων. Buffer AE: διάλυμα έκλουσης, 5 mm Tris / HCl με ph 8.5. 2.2.Ταυτοποίηση του πλασμιδιακού DNA με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2.2.1. Πέψη του πλασμιδιακού DNA με το περιοριστικό ένζυμο EcoR1 57
Για μια αντίδραση: i. 7 μl dd H 2 O ii. 2 μl 10x H Buffer iii. 10 μl πλασμιδιακό DNA iv. 1 μl διαλύματος EcoR1 v. Επώαση του μίγματος της αντίδρασης για 1 h στους 37 ο C 2.2.2. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Για την ανίχνευση του πλασμιδιακού γενετικού υλικού, που προέκυψε από την πέψη με το EcoR1, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης και στη συνέχεια χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Τα βήματα τα οποία ακολουθήθηκαν ήταν τα παρακάτω: i. Παρασκευή ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης (1 ΤΑΕ ρυθμιστικό διάλυμα ), το οποίο αποτελείται από τρις-οξικό οξύ και αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA). [20 ml από το 50 ΤΑΕ ρυθμιστικό διάλυμα και 50 μl βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr) συγκέντρωσης 10 mg/ml αναμιγνύονται και αραιώνονται με dd H2O σε ογκομετρική φιάλη των 1000 ml] ii. Παρασκευή της πηκτής αγαρόζης 2% w/v. Ζυγίζονται και τοποθετούνται σε κωνική φιάλη 0,7 g αγαρόζης στα οποία προστίθενται 35 ml από το 1 TAE buffer και ακολουθεί θέρμανση σε φούρνο μικροκυμάτων για 2 min, για την διαλυτοποίηση του στερεού. iii. Ετοιμασία της διάταξης της ηλεκτροφόρησης. Η θήκη της πηκτής τοποθετείται πάνω σε μια βάση. Ένα ειδικό «χτενάκι» (καλούπι) προσαρμόζεται στις ειδικές υποδοχές της θήκης για να δημιουργηθούν τα φρεάτια στα οποία θα τοποθετηθούν τα δείγματα. Με ένα μικρό αλφάδι ευθυγραμμίζουμε τη βάση της πηκτής. iv. Με γρήγορες κινήσεις και υπό ήπια ανάδευση (για την αποφυγή δημιουργίας φυσαλίδων) προστίθεται στη θήκη της πηκτής το θερμό διάλυμα αγαρόζης. Έπειτα η πηκτή αφήνεται περίπου για 20 min, μέχρι να στερεοποιηθεί. v. Προετοιμασία δειγμάτων : 20 μl δείγματος + 4 μl χρωστικής (gel loading buffer) (ποσότητες για 2 αντιδράσεις) 5 μl Gene ruler 1kb DNA ladder + 10 μl dd H 2 0 58
vi. Όταν η πηκτή έχει πλέον σταθεροποιηθεί, το χτενάκι αφαιρείται πολύ προσεκτικά και η πηκτή μαζί με τη βάση τοποθετείται στη συσκευή της ηλεκτροφόρησης, η οποία γεμίζεται μέχρι την ένδειξη με 1 TAE buffer. vii. Ακολουθεί η προσθήκη των δειγμάτων (12 μl) στα φρεάτια που έχουν σχηματιστεί στην πηκτή και η συσκευή τίθεται σε λειτουργία για 45 min στα 90 V. viii. Μόλις τελειώσει η ηλεκτροφόρηση, η πηκτή ξεπλένεται με απιονισμένο νερό και τοποθετείται στο θάλαμο UV χωρίς τη βάση. ix. Η πηκτή ακτινοβολείται με υπεριώδη ακτινοβολία και λαμβάνεται φωτογραφία με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή χρησιμοποιώντας ειδικό οπτικό φίλτρο που απομονώνει το μήκος κύματος εκπομπής του βρωμιούχου αιθιδίου. 2.3.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Το πλασμίδιο pam-he, όπως φαίνεται στο σχήμα 3.5, αποτελείται από το γονίδιο cdna της β-λακταμάσης που καθιστά το κύτταρο ανθεκτικό στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη, το cdna της αικουoρίνης και την αλληλουχία του πεπτιδίου οδηγού της διαμεμβρανικής πρωτεΐνης Α. Βλέπουμε επίσης τη θέση που δρα το περιοριστικό ένζυμο EcoR1, για την πέψη του πλασμιδιακού DNA. Στις θέσεις a) δρουν τα περιοριστικά ένζυμα Nco1,HindIII, Nde1, στην b) τα Νco1 και BamH1 και στην c) το BamH1. Έτσι η δράση της EcoR1εμποδίζει τη δράση των υπόλοιπων περιοριστικών ενδονουκλεασών. 59
Σχήμα 3.5: Σχηματική απεικόνιση του πλασμιδίου pam-he Ο εκκινητής (Primer) που χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση του cdna (σχήμα 3.6) που κωδικοποιεί την αικουορίνη περιέχει την εξής αλληλουχία: 5 GGC AAG CTT TGT ACT AGT GAC TTC GAC AAC CCA AGA TGG 3. Σχήμα 3.6: Αλληλουχία του γονιδίου που εκφράζει την αικουορίνη Για την έκφραση της πρωτεΐνης στον περιπλασμικό χώρο του κυττάρου, απαιτείται η ύπαρξη ενός πεπτιδίου οδηγού, στην συγκεκριμένη περίπτωση του OmpA (πρωτεΐνη Α), στο αμινοτελικό άκρο της. Τα πεπτίδια οδηγοί αποτελούνται από 20-25 αμινοξέα. Συγκεκριμένα η OmpA έχει μοριακή μάζα 35 kda και αποτελείται από έναν διαμεμβρανικό και έναν περιπλασμικό τομέα. Περιλαμβάνει 3 αναδιπλώσεις στον περιπλασμικό χώρο και 4 υδρόφιλες στον εξωκυττάριο, οι οποίες συνδέουν τις 8 διαμεμβρανικές β-αναδιπλώσεις της (σχήμα 3.7). Σχήμα 3.7: Σχηματική απεικόνιση και τοπολογία του πεπτιδίου οδηγού OmpA. 60
Το C τελικό της άκρο καταλήγει στο περιπλασμικό χώρο. Για να διασχίσει τη μεμβράνη αποτελείται από δαχτυλοειδή λιπίδια. Η OmpA αναγνωρίζει έναν εξειδικευμένο κυτταρικό υποδοχέα πάνω στη μεμβράνη και δημιουργούνται εκκριτικά κανάλια, από τα οποία περνά και το υπόλοιπο 'σώμα' της πρωτεΐνης με αποτέλεσμα να διασχίζει τη μεμβράνη. Με βάση τη βιβλιογραφία το πλασμίδιο pam-he αποτελείται από 3374 ζεύγη βάσεων (bp). Σύμφωνα με τη σύγκριση με τον μοριακό δείκτη όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα το πλασμιδιακό DNA που απομονώθηκε προέκυψε ότι αποτελείται από περίπου 3500 bp. Η ένταση των ζωνών υποδηλώνει τη συγκέντρωση την οποία έχει το δείγμα. Σχήμα 3.8: Φωτογραφία ηλεκτροφόρησης του πλασμιδιακού DNA,ύστερα από ακτινοβόληση της πηκτής με UV. Από τη φωτογραφία της ηλεκτροφόρησης μπορούμε να αποδείξουμε ότι το πλασμίδιο εισήχθη στα επιδεκτικά κύτταρα. Έχοντας λοιπόν δημιουργήσει μετασχηματισμένα κύτταρα της E.coli W802 ακολούθησε η διαδικασία καλλιέργειάς τους με στόχο την έκφραση και απομόνωση της ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης. 61
3. Έκφραση, απομόνωση και ποσοτικός προσδιορισμός της ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αποαικουορίνης 3.1. Έκφραση της ανασυνδυασμένης φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης ( His-Cys4-aequorin) Από τις αποικίες που δημιουργήθηκαν σε τρυβλία (ενότητα Α.2.2) με τα μετασχηματισμένα βακτήρια, επιλέχθηκε μία μόνο αποικία και με τη βοήθεια του βιολογικού κρίκου προστέθηκε σε 10 ml αποστειρωμένου θρεπτικού μέσου LBamp. Σαν τυφλό δείγμα χρησιμοποιήθηκαν 10 ml αποστειρωμένου θρεπτικού μέσου LB-amp. Η amp προστίθεται στο LB broth σε συγκέντρωση 50 μg/ml. Πειραματική πορεία: i. 10 ml κυττάρων τοποθετούνται σε αποστειρωμένο falcon των 15 ml και επωάζονται σε RT ( 25 o C ) για 18 h. ii. Προσθήκη των 10 ml σε 400 ml LB-amp (50 μg/ml), σε μία κωνική φιάλη του 1 L, μετά την ολοκλήρωση της επώασης. iii. Επώαση της επεκταμένης καλλιέργειας για 13.5 h στους 37 o C. iv. Παραλαβή των κυττάρων με φυγοκέντρηση στις 5000 g για 5 min. 3.2. Απομόνωση της αικουορίνης με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου (IMAC) με στήλη Ni-NTA αγαρόζης Πειραματική πορεία: i. Το κυτταρικό ίζημα επαναδιαλυτοποείται σε 40 ml διαλύματος 50 mm Tris HCl (ph 7.6). ii. Λύση των κυττάρων με συσκευή υπερήχων Branson Sonifier Cell Disruptor (0-300 W) (παράμετροι που χρησιμοποιήθηκαν:output 40%, intensity 3).Τα δείγματα τοποθετούνται για 20 s στους υπερήχους και 20 s επωάζονται στον πάγο. Ο συνολικός χρόνος στους υπερήχους είναι 3-5 min. iii. Φυγοκέντρηση στις 12000 g για 20 min στους 4 o C. Παραλαβή τελικού υπερκειμένου το οποίο περιέχει το συνολικό ποσό της πρωτεΐνης. 62
iv. Το υπερκείμενο εφαρμόζεται σε στήλη νικελο-αγαρόζης ( διαστάσεις στήλης: διάμετρος 1,5 cm, ύψος 3,7 cm, όγκος 6,5 ml), η οποία πριν έχει εξισορροπηθεί με διάλυμα 50 mm Tris HCl (ph 7,6), σε RT. v. To Flow through από τη στήλη συλλέγεται και ακολουθεί πλύση της στήλης με 100 ml διαλύματος 50 mm Tris HCl (ph 7,6). Συλλογή και του εκλούσματος έκπλυσης - Wash από τη στήλη. vi. Οι πρωτεΐνες που κρατήθηκαν από τη στήλη εκλούονται με 20 ml διαλύματος 0.1 M ιμιδαζόλιο σε 50 mm Tris HCl (ph 7,6). 3.3. Μέθοδος Bradford Η μέθοδος Bradford, η οποία χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό πρωτεϊνών, στηρίζεται στη δημιουργία ιοντικών και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των σουλφονυλομάδων της χρωστικής Coomasie Brilliant Blue G-250 και των πρωτονιωμένων αμινομάδων των πρωτεϊνών σε όξινο περιβάλλον. Οι μετρήσεις των απορροφήσεων λαμβάνονται στα 570 nm, ενώ το χρώμα που προκύπτει οφείλεται στις ιοντικές αλληλεπιδράσεις και η έντασή του εξαρτάται από τη συγκέντρωση των αμινοξέων λυσίνη και αργινίνη στις πρωτεΐνες. Η ευαισθησία της μεθόδου είναι για ποσά πρωτεΐνης μικρότερα του 1 μg. Σχήμα 3.9: Δομή της χρωστικής Coomasie Brilliant Blue G-250. (https://en.wikipedia.org/wiki/coomassie_brilliant_blue#/media/file:coomassie_brilliant_blu e_r-250.svg) 63
Πειραματική πορεία: i. Παρασκευή διαλύματος της χρωστικής Coomasie Brilliant Blue G-250: 0,0025 % w/v Coomasie Brilliant Blue G-250 5 % v/v απόλυτη αιθανόλη 10 % v/v H 3 PO 4 85%. ii. Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων BSA για βαθμονόμηση. Το εύρος των συγκεντρώσεων ήταν από 0-1 mg/ml (οι συγκεντρώσεις των διαλυμάτων βαθμονόμησης διαφέρουν μεταξύ τους κατά 0,2 mg/ml). Ως αραιωτικό χρησιμοποιήθηκε διάλυμα NaCl 150 mm. iii. Προσθήκη, σε γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες, 1 ml αντιδραστηρίου Bradford και 20 μl από το κάθε διάλυμα αποαικουορίνης που προέκυψε από τη στήλη Ni- NTA (Flow through, wash, elution), συμπεριλαμβανομένων των προτύπων διαλυμάτων. iv. Σε διάφανα φρεάτια μικροτιτλοδότησης τοποθετούνται 250 μl από το κάθε διάλυμα και πραγματοποιείται φωτομέτρηση στο λουμινόμετρο σε μήκος κύματος 570 nm. 3.4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η αρχή στην οποία βασίζεται η χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου είναι ο σχηματισμός ετεροπολικών δεσμών μεταξύ ιόντων των στοιχείων μετάπτωσης και βασικών αμινοξέων των πρωτεϊνών, κυρίως των ιστιδινών. 64
Σχήμα 3.10: Σχηματική απεικόνιση της στήλης νικελοαγαρόζης με υπόστρωμα NTA και της αλληλεπίδρασης των ιόντων νικελίου με τις ιστιδίνες. Στη συγκεκριμένη περίπτωση χρησιμοποιούνται ιόντα νικελίου τα οποία βρίσκονται ακινητοποιημένα σε αδρανές υπόστρωμα νιτριλοτριοξικού οξέος (Ni-NTA) με 4 χηλικούς δεσμούς (σχήμα 3.10). Η αικουορίνη δεσμεύεται στη στήλη μέσω της ουράς ιστιδινών. Κατά την απομόνωση της πρωτεΐνης δεν παρουσιάστηκε μεταβολή στο χρώμα της στήλης Ni-NTA,όπως φαίνεται στο σχήμα 3.10. Η στήλη εξισορροπείται με διάλυμα 50 mm Tris HCl (ph 7,6), δηλαδή το ίδιο διάλυμα που χρησιμοποιείται για την διαλυτοποίηση του κυτταρικού ιζήματος, ώστε να βρίσκονται στις ίδιες συνθήκες. Κατά το πέρασμα του υπερκειμένου που περιέχει το συνολικό ποσό πρωτεΐνης (αποαικουορίνη και άλλες πρωτεΐνες των βακτηριακών κυττάρων) από τη στήλη κατακρατείται η αποαικουρίνη λόγω συγγένειας των ομάδων ιστιδίνης που περιέχει με το νικέλιο, αλλά και άλλες ανεπιθύμητες πρωτεΐνες που ανταγωνίζονται την αποαικουορίνη ως προς την πρόσδεσή της στα μεταλλοϊόντα της στήλης. Η αικουορίνη χάρη στο πεπτίδιο οδηγό της πρωτεΐνης Α (omp), εκφράζεται στον περιπλασμικό χώρο όπου βρίσκεται μόλις το 4% των πρωτεϊνών που παράγει το βακτηριακό κύτταρο. Αυτές παρασύρονται από την πλύση της στήλης με 100 ml διαλύματος 50 mm Tris HCl. Έτσι στο Wash αναμένεται λιγότερη ποσότητα από το Flow through αλλά και από το Elution. Σχήμα 3.11 : Αριστερά η στήλη κατά το Flow through δεξιά η στήλη μετά το wash. Οι διαστάσεις της στήλης Ni-NTA είναι: 1,5 cm διάμετρος, ύψος 3,7 cm, 6,5 ml υλικού. 65
Η αποπρωτεΐνη που έχει αλληλεπιδράσει με τη στήλη Ni-NTA εκλούεται με διάλυμα 0,1 M ιμιδαζολίου σε 50 mm Tris HCl. Το ιμιδαζόλιο λόγω υψηλής συγγένειας με τα ιόντα νικελίου της στήλης χρωματογραφίας, ανταγωνίζεται τις ιστιδίνες με αποτέλεσμα να εκτοπίζει την αποπρωτεΐνη και να πραγματοποιείται έκλουση. Σχήμα 3.12: 1) διάλυμα 0 mg/ml BSA, 2) διάλυμα 0,2 mg/ml BSA, 3) διάλυμα 0,4 mg/ml BSA, 4) διάλυμα 0,6 mg/ml BSA, 5) διάλυμα 0,8 mg/ml BSA, 6) διάλυμα 1mg/mL BSA, 7) υπερκείμενο πριν περάσει τη στήλη S, 8) Flow through, 9) Wash, 10) Elution. Όπως φαίνεται στην παραπάνω εικόνα τα διαλύματα που περιέχουν το αντιδραστήριο Bradford έχουν κατά κύριο λόγω μπλε χρώμα. Η μεγάλη ένταση του χρώματος υποδηλώνει τη μεγάλη συγκέντρωση πρωτεΐνης στο διάλυμα. Έτσι μπορούμε να παρατηρήσουμε τη διαφορά μεταξύ των σωλήνων 6) διάλυμα 1mg/mL BSA και 2) διάλυμα 0,2 mg/ml BSA. Επιπλέον παρατηρούμε τους σωλήνες 9) Wash και 10) Elution, όπου το διάλυμα στο σωλήνα 9 είναι σχετικά άχρωμο ενώ στον 10 μπλε, όπως ήταν αναμενόμενο. Για τον υπολογισμό της αποπρωτεΐνης στα διάφορα εκλούσματα, και τελικά στο Elution, το οποίο περιέχει τη συνολική πρωτεΐνη, κατασκευάστηκε μια καμπύλη βαθμονόμησης. Τα επιμέρους διαλύματα βαθμονόμησης της BSA παρασκευάσθηκαν ως εξής: 1 mg/ml προσθήκη 1 ml δ/τος BSA 1 mg/ml 0,8mg/mL προσθήκη 0,8 ml δ/τος BSA 1 mg/ml + 200 μl 150 mm NaCl 0,6 mg/ml προσθήκη 0,6 ml δ/τος BSA 1 mg/ml + 400 μl 150 mm NaCl 66
0,4 mg/ml προσθήκη 0,4 ml δ/τος BSA 1 mg/ml + 600 μl 150 mm NaCl 0,2 mg/ml προσθήκη 0,2 ml δ/τος BSA 1 mg/ml + 800 μl 150 mm NaCl 0 mg/ml προσθήκη 1000 μl 150 mm NaCl Πίνακας 3.2: Παρουσιάζονται οι τιμές απορρόφησης (A 1,2 ) από το λουμινόμετρο, και οι διορθωμένες τιμές (A') απορρόφησης των διαλυμάτων, διάφορων συγκεντρώσεων (0-1 mg/ml), της καμπύλης αναφοράς στα 570 nm. Διαλύματα BSA (mg/ml) Α 1 Α 2 Α' 0 0,18 0,169 0 0,2 0,24 0,256 0,074 0,4 0,345 0,356 0,176 0,6 0,37 0,37 0,196 0,8 0,408 0,408 0,234 1 0,471 0,474 0,298 67
A 0,30 y =0,02086 + 0,28429 * x 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 BSA [mg/ml] Σχήμα 3.13: Παρουσιάζεται η καμπύλη βαθμονόμησης της BSA με εξίσωση ευθείας την y= 0,02086 + 0,28429 *x (R= 0,98) Πίνακας 3.3: Παρουσιάζονται οι τιμές απορρόφησης (A 1,2 ) από το λουμινόμετρο στα 570 nm, και οι διορθωμένες τιμές (A') απορρόφησης των διαλυμάτων πριν και μετά τη διέλευση από τη στήλη Ni-NTA. Διαλύματα Α 1 Α 2 Α' S * 0,563 0,559 0,387 Flow Through* 0,494 0,481 0,313 Wash 0,245 0,246 0,071 Elution (20 ml) 0,422 0,417 0,245 Οι τιμές των δειγμάτων του S (το υπερκείμενο του κυτταρικού ιζήματος πριν την εφαρμογή του στη στήλη) αλλά και του Flow through (το ίδιο διάλυμα αφού πέρασε από το στήλη) είναι εκτός ορίων της γραμμικότητας της καμπύλης. Αυτό είναι λογικό καθώς εκεί υπάρχουν και άλλες μη επιθυμητές πρωτεΐνες. Μπορούμε να παρατηρήσουμε ότι A S >A FT, που σημαίνει ότι αν αντιστοιχίσουμε την απορρόφηση με συγκέντρωση διαπιστώνουμε ότι κάποιο ποσό πρωτεΐνης κατακρατήθηκε από τη στήλη. 68
A 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 Sample Flow Though Elution 0,1 0,05 0 Wash 1 2 3 4 fractions Σχήμα 3.14: Παρουσιάζεται η κλιμάκωση των απορροφήσεων, των διαλυμάτων πριν και αφού εφαρμοστούν στη στήλη Ni-NTA. συγκέντρωσης πρωτεΐνης στα δείγματα από Flow Through έως και Elution 5. Σύμφωνα με την εξίσωση (1) της γραφικής παράστασης 1 η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο διάλυμα Elution είναι 0,79 mg/ml. Ο συνολικός όγκος του εκλούσματος είναι 20 ml άρα κι η συνολική μάζα της πρωτεΐνης είναι 15,8 mg (His-Cys4- apoaequorin). 4. Ενεργοποίηση της αποαικουορίνης, καθαρισμός της αικουορίνης, προσδιορισμός της ποσότητας και της ενεργότητάς της 4.1.Ενεργοποίηση της αποαικουορίνης σε αικουορίνη Στο έκλουσμα που περιέχει το συνολικό ποσό της αποαικουορίνης (His-Cys4- apoaequorin), έγινε η ενεργοποίηση σε His-Cys4-aequorin με τη βοήθεια της σελεντεραζίνης. Πειραματική πορεία: 69
i. Στο έκλουσμα ( 1,2 μmol πρωτεΐνης) προστίθενται 30 ml διαλύματος 50 mm Tris HCl (ph 7,6) 10 mm EDTA, που περίεχουν 20 mg DTT και 0,52 mg, (1,2 μmol) σελεντεραζίνης σε 0,65 ml απόλυτης αιθανόλης. ii. Το παραπάνω μίγμα αντίδρασης επωάζεται στους 4 o C για 16 h. Η μοριακή αναλογία αποπρωτεΐνης - σελεντεραζίνης είναι 1:1. Υπό αυτές τις συνθήκες η ενεργοποίηση της σε His-Cys4-aequorin πραγματοποιείται ποσοτικά. 4.2.Καθαρισμός της ενεργοποιημένης αικουορίνης με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων i. Εξισορρόπηση της στήλης Βutyl Sepharose 4 Fast Flow (1 cm διάμετρος, 2,6 cm ύψος, δηλαδή 2,04 ml υλικού) με 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 σε 10 mm Tris HCl (ph 7,6) 2 mm EDTA. ii. Το διάλυμα ενεργοποιημένης αικουορίνης, 50 ml, εφαρμόζεται στη στήλη. Συλλέγεται το Flow though. iii. Η στήλη πλένεται με 84 ml διαλύματος 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 σε 10 mm Tris HCl (ph 7,6) 2 mm EDTA. Συλλογή του διαλύματος Wash. iv. Έκλουση της πρωτεΐνης με διάλυμα 0,8 M (NH 4 ) 2 SO 4 σε 10 mm Tris HCl (ph 7,6) 2 mm EDTA. Συλλογή κλασμάτων του 1 ml. v. Τα κλάσματα που περιέχουν την πρωτεΐνη φυλάσσονται στους -80 o C μέχρι την επόμενη χρήση.. 4.3.Ποσοτικός προσδιορισμός και προσδιορισμός της ενεργότητας των επιμέρους εκλουσμάτων με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων 4.3.i. Ποσοτικός προσδιορισμός με τη μέθοδο Bradford Η πειραματική πορεία της μεθόδου Bradford αναφέρθηκε στην ενότητα Γ.3. Συνοπτικά έχει ως εξής: a. Παρασκευή διαλύματος της χρωστικής Coomasie Brilliant Blue G-250. b. Παρασκευή προτύπων διαλυμάτων BSA για την καμπύλη βαθμονόμησης. Για την αραίωση της πρωτεΐνης χρησιμοποιείται το διάλυμα 0,8 M (NH 4 ) 2 SO 4 σε 10 70
mm Tris HCl (ph 7,6)-2 mm EDTA (το διάλυμα με το οποίο εκλούστηκε η πρωτεΐνη). c. Προσθήκη, σε γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες, 1 ml αντιδραστηρίου Bradford και 20 μl από το κάθε έκλουσμα αικουορίνης που προέκυψε από τη στήλη Butyl Sepharose (32 elutions), συμπεριλαμβανομένων των προτύπων διαλυμάτων. d. Σε διάφανα φρεάτια μικροτιτλοδότησης τοποθετούνται 250 μl από το κάθε διάλυμα και πραγματοποιείται μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 570 nm. 4.3.ii. Προσδιορισμός της ενεργότητας με προσθήκη Ca 2+ Μέτρηση ενεργότητας των επιμέρους κλασμάτων με προσθήκη διαλύματος 50 mm CaCl 2 σε 50 mm Tris HCl (ph 7,6) (Triggering buffer), σε λουμινόμετρο. Σε λευκά αδιαφανή φρεάτια μικροτιτλοδότησης προστίθενται από 50 μl από τα x10 4 αραιωμένα επιμέρους εκλούσματα, ενώ ως τυφλό χρησιμοποιείται ποσότητα 50 μl από το διάλυμα 0,8 M (NH 4 ) 2 SO 4 σε 10 mm Tris HCl (ph 7,6)-2 mm EDTA. Με το πρόγραμμα Mediators PhL ρυθμίζεται η ποσότητα Triggering Buffer που προστίθεται σε κάθε φρεάτιο, η οποία ισούται με 50 μl (συνολικός όγκος αντίδρασης 100 μl). 4.4.Αποτελέσματα-συμπεράσματα Η στήλη βουτυλικής σεφαρόζης αποτελείται από στατική φάση πολυμερούς. Στη συγκεκριμένη περίπτωση από 4% πηκτή αγαρόζης με διασταυρωμένες πολυμερικές αλυσίδες. Ο αλειφατικός υποκαταστάτης, εδώ βουτυλομάδες, συνδέεται στο υπόστρωμα με αιθερικούς -C-O-C- δεσμούς και δεν φέρει φορτισμένες ομάδες δημιουργώντας ένα υδρόφοβο περιβάλλον. Η πρωτεΐνη συγκρατείται στους υποκαταστάτες της πηκτής λόγω της υδροφοβικότητας. 71
Σχήμα 3.15: Αρχή της χρωματογραφίας υδρόφοβων αλληλεπιδράσων (Li J et al., 2013). Μια πρωτεΐνη μπορεί να είναι διαλυμένη σε υδατικά διαλύματα χωρίς την παρουσία αλάτων. Όταν η συγκέντρωση του άλατος αυξάνεται, τα μόρια του νερού καταλαμβάνονται και οι πρωτεΐνες τείνουν να συσσωματώνονται και να καταβυθίζονται. Με μια ήπια συγκέντρωση άλατος, οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μορίων της πρωτεΐνης δεν είναι τόσο ισχυρές ώστε να προκαλέσουν την καταβύθισή της. Σε ενδιάμεσες συγκεντρώσεις άλατος οι πρωτεΐνες μπορούν να προσροφηθούν από το υδρόφοβο υπόστρωμα (Σχήμα 3.15) (Li J et al., 2013). Κατά την εφαρμογή του διαλύματος ενεργοποίησης στη στήλη βουτυλικής σεφαρόζης παρατηρήθηκε αλλαγή του χρώματος από λευκό σε κίτρινο, όπως φαίνεται στο σχήμα 3.16. Μετά από της πλύσεις και την έκλουση της πρωτεΐνης η κίτρινη αυτή ζώνη προχωρούσε στο κάτω μέρος της στήλης. Η έκλουση της αικουορίνης από τη στήλη γίνεται με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα μειούμενης συγκέντρωσης άλατος (οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις γίνονται πιο ισχυρές με την αύξηση της ιονικής ισχύος, αύξηση της συγκέντρωσης επιφανειοδραστικών και 72
ελάττωση ph). Στο πείραμα χρησιμοποιήθηκε διάλυμα 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 σε 10 mm Tris HCl (ph 7,6) 2 mm EDTA και κατά την έκλουση της πρωτεΐνης μειώθηκε η συγκέντρωση του άλατος (NH 4 ) 2 SO 4 από 2 M σε 0,8 M. Σχήμα 3.16: α) Η στήλη βουτυλικής σεφαρόζης στην αρχή της διαδικασίας, b) Η στήλη μετά την πλύση, κατά τη διάρκεια έκλουσης της ενεργοποιημένης αικουορίνης. 4.4.i. Ποσοτικός προσδιορισμός με τη μέθοδο Bradford Τα πρότυπα διαλύματα της BSA παρασκευάστηκαν με το διάλυμα που βρίσκονται τα εκλούσματα, δηλαδή το elution buffer (0.8 M (NH 4 ) 2 SO 4 σε10 mm Tris HCl (ph 7,6)- 2 mm EDTA.) 1 mg/ml προσθήκη 1 ml δ/τος BSA 1 mg/ml (σε elution buffer) 0,8mg/mL προσθήκη 0,8 ml δ/τος BSA 1 mg/ml + 0,2 ml elution buffer 0,6 mg/ml προσθήκη 0,6 ml δ/τος BSA 1 mg/ml + 0,4 ml elution buffer 0,4 mg/ml προσθήκη 0,4 ml δ/τος BSA 1 mg/ml + 0,6 ml elution buffer 0,2 mg/ml προσθήκη 0,2 ml δ/τος BSA 1 mg/ml + 0,8 ml elution buffer 0 mg/ml BSA, προσθήκη 1mL elution buffer 73
A Πίνακας 3.4: Παρουσιάζονται οι τιμές απορρόφησης (A) και οι διορθωμένες τιμές (A') απορρόφησης των διαλυμάτων, διάφορων συγκεντρώσεων (0-1 mg/ml), της καμπύλης βαθμονόμησης, στα 570 nm. Διαλύματα BSA(mg/mL) Α 1 Α 2 Α' 0 0,221 0,213 0 0,2 0,246 0,265 0,0385 0,4 0,309 0,294 0,0845 0,6 0,358 0,342 0,133 0,8 0,364 0,365 0,1475 1 0,429 0,431 0,213 0,25 0,20 y=-1,42857*10-4 + 0,20579x R=0,99253 0,15 0,10 0,05 0,00 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 C BSA [mg/ml] Σχήμα 3.17: Παρουσιάζεται η καμπύλη βαθμονόμησης της BSA με εξίσωση ευθείας την y=- 1,42857*10-4 + 0,20579* x (2) (με R=0,99253 ). Πίνακας 3.5: Παρουσιάζονται οι τιμές απορρόφησης (A) και οι διορθωμένες τιμές (A') απορρόφησης των 32 κλασμάτων, καθώς και η συγκέντρωσή τους. Η συγκέντρωση αυτή προέκυψε από την εξίσωση ευθείας y=-1,42857*10-4 + 0,20579* x (σχήμα 3.17). 74
Elutions A 1 A 2 A' C [mg/ml] 1 0,226 0,224 0,008 0,040 2 0,581 0,572 0,359-3 0,647 0,67 0,4415-4 0,395 0,408 0,1845 0,897 5 0,319 0,277 0,081 0,394 6 0,275 0,272 0,0565 0,275 7 0,257 0,235 0,029 0,142 8 0,223 0,221 0,005 0,025 9 0,233 0,234 0,0165 0,081 10 0,243 0,246 0,0275 0,134 11 0,22 0,236 0,011 0,054 12 0,24 0,248 0,027 0,132 13 0,203 0,24 0,0045 0,023 14 0,233 0,23 0,0145 0,071 15 0,219 0,23 0,0075 0,037 16 0,234 0,249 0,0245 0,120 17 0,231 0,229 0,013 0,064 18 0,254 0,235 0,0275 0,134 19 0,218 0,227 0,0055 0,027 20 0,215 0,211-0,004-21 0,199 0,21-0,0125-22 0,206 0,221-0,0035-23 0,226 0,23 0,011 0,054 24 0,23 0,255 0,0255 0,125 25 0,205 0,215-0,007-26 0,212 0,211-0,0055-27 0,212 0,219-0,0015-28 0,21 0,21-0,007-29 0,221 0,232 0,0095 0,045 30 0,214 0,228 0,004 0,020 75
Elutions A 1 A 2 A' C [mg/ml] 31 0,225 0,214 0,0025 0,013 32 0,211 0,199-0,012 - Οι τιμές των κλασμάτων 2 και 3 βρέθηκαν εκτός της γραμμικότητας της καμπύλης. Ύστερα από αραίωσή τους 240 φορές (5 μl στα 1,02 ml αντί για 20 μl). Δημιουργήθηκε νέα καμπύλη βαθμονόμησης και υπολογίσθηκε η συγκέντρωση μετά την αραίωσή τους. Πίνακας 3.6: Παρουσιάζονται οι τιμές απορρόφησης (A) από το λουμινόμετρο, και οι διορθωμένες τιμές (A') απορρόφησης των διαλυμάτων, διάφορων συγκεντρώσεων (0-1 mg/ml), της καμπύλης αναφοράς στα 570 nm. Ακόμα οι αντίστοιχες τιμές των 2 εκλουσμάτων (elution 2 και 3). Διαλύματα Α 1 Α 2 Α' 0 mg/ml BSA 0,221 0,213 0 0,2 mg/ml BSA 0,246 0,265 0,0385 Διαλύματα Α 1 Α 2 Α' 0,4 mg/ml BSA 0,309 0,294 0,0845 0,6 mg/ml BSA 0,358 0,342 0,133 0,8 mg/ml BSA 0,364 0,365 0,1475 1 mg/ml BSA 0,429 0,431 0,213 el2 0,385 0,369 0,19 el3 0,453 0,467 0,273 76
A' 0,35 0,30 y= -0,00131 + 0,33879*x R= 0,9953 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00-0,05 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 BSA [mg/ml] Σχήμα 3.18: Παρουσιάζεται η καμπύλη βαθμονόμησης της BSA με εξίσωση ευθείας την y= - 0,00131 + 0,33879*x (R=0,9953). Σύμφωνα με την εξίσωση y = -0,00131 + 0,33879*x (σχήμα 3.18) η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στα εκλούσματα 2 και 3 είναι 0,56 και 0,81 mg/ml αντίστοιχα. Οι συγκεντρώσεις αυτές πολλαπλασιάζονται επί τον παράγοντα αραίωσης, 4 φορές στην προκειμένη περίπτωση για να βρεθεί η συγκέντρωση των εκλουσμάτων. Τελικά οι συγκεντρώσεις είναι 2,26 mg/ml (elution 2) και 3,24 mg/ml (elution 3). 77
Σχήμα 3.19: Παρουσίαζεται η συγκέντρωση των επιμέρους κλασμάτων σε mg/ml, από τις αντίστοιχες τιμές του Πίνακα. 3.6. Όπως φαίνεται στο διάγραμμα του σχήματος 3.19, που παρουσιάζονται οι επιμέρους συγκεντρώσεις των εκλουσμάτων. Περισσότερη πρωτεΐνη εκλούεται στα πρώτα 12 κλάσματα (1 ml το καθένα). Για το υπολογισμό της συνολικής πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν όλα τα εκλούσματα και όχι μόνο αυτά με την περισσότερη πρωτεΐνη Μετά την προσθήκη των εκλουσμάτων, η συνολική πρωτεΐνη είναι (κάθε έκλουσμα έχει περίπου όγκο 1 ml ) 8,15 mg. 4.4.ii. Προσδιορισμός της ενεργότητας της πρωτεΐνης με προσθήκη Ca 2+ Πίνακας 3.7: Περιλαμβάνει τους κωδικούς των επιμέρους εκλουσμάτων (όγκος 1mL το καθένα), τις τιμές των RLU και τις διορθωμένες RLU', τη συγκέντρωση του κάθε κλάσματος σε mg/ml καθώς και την ενεργότητα σε RLU/mg. Εκλούσματα Ενεργότητα RLU RLU'(-τυφλό) C [mg/ml] (Αραιώσεις x10 4 ) (RLU/μg) blank 0,000779 0 - - S1 1998,8 1970 0,040 9,9*10 6 S2 134000 133972 2,26 1,53*10 7 S3 186000 185972 3,24 1,48*10 7 S4 50006 49977 0,90 1,11*10 7 S5 15699 15671 0,39 8*10 6 S6 8084 8056 0,28 5,7*10 6 S7 1101 1100 0,14 1,6*10 6 S8 1030 1029 0,025 8*10 6 S9 554 553 0,080 1*10 6 S10 342 341 0,13 5,1*10 5 S11 246 245 0,054 9,1*10 5 S12 259 258 0,13 3,9*10 5 S13 217 216 0,02 1,9*10 6 S14 233 232 0,07 6,5*10 5 S15 72 71 0,037 3,8*10 5 78
Εκλούσματα Ενεργότητα RLU RLU'(-τυφλό) C [mg/ml] (Αραιώσεις x10 4 ) (RLU/μg) S16 121 120 0,12 2*10 5 S17 72 71 0,064 2,3*10 5 S18 65 64 0,13 9,7*10 5 S19 32 31 0,028 2,3*10 5 S20 35 34 - - S21 22 21 - - S22 22 21 - - S23 23 22 0,054 8,5*10 4 S24 25 24 0,12 4*10 4 S25 44 43 - - S26 14 13 - - S27 15 14 - - S28 11 10 - - S29 6 5 0,047 2,6*10 4 S30 11 10 0,020 1,1*10 5 S31 11 10 0,013 1,7*10 5 S32 37 36 - - 79
RLUs 1,6x10 7 1,4x10 7 1,2x10 7 1,0x10 7 8,0x10 6 RLUs/ g 6,0x10 6 4,0x10 6 2,0x10 6 0,0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 elutions (1 ml each) Σχήμα 3.20: Παρουσιάζονται τα RLUs/μg πρωτεΐνης στα επιμέρους εκλούσματα (του 1mL), που προέκυψαν από τη στήλη σεφαρόζης, από τις αντίστοιχες τιμές του Πίνακα 3.7. 10 13 10 12 10 11 10 10 10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 eluted fractions 1 ml (each) Σχήμα 3.21: Παρουσιάζεται η ενεργότητα σε RLUs των επιμέρους κλασμάτων που προέκυψαν από τη στήλη βουτυλικής σεφαρόζης, από τις αντίστοιχες τιμές του Πίνακα 3.7. 80
Από το σχήμα 3.20 και από τον αντίστοιχο πίνακα 3.7, παρατηρούμε ότι η ενεργότητα δεν εξαρτάται από την ποσότητα της πρωτεΐνης. Για παράδειγμα το elution S1 μπορεί να έχει σχετικά μικρή συγκέντρωση 0,04 mg/ml (40 μg/ml ), περιέχει όμως αρκετά ενεργή αικουορίνη 9,9*10 6 RLUs/μg. Και σε αυτήν την περίπτωση παρατηρείται ότι τα πρώτα εκλούσματα, εδώ τα 1-19 είναι κυρίως δείγματα σημαντικής ενεργότητας. 5. Γενικά συμπεράσματα Η συνολική πρωτεΐνη που συλλέγεται από τα επιμέρους εκλούσματα της πρωτεΐνης (κάθε έκλουσμα έχει περίπου όγκο 1 ml ), είναι 8,15 mg. Η ενεργότητα των επιμέρους κλασμάτων της ενεργοποιημένης αικουορίνης κυμαίνεται από 10 4-10 7 RLU/μg. Τα κλάσματα που περιείχαν αικουορίνη με σημαντική τιμή ενεργότητας, ήταν κυρίως τα 1-18, όπως φαίνεται και στο σχήμα 3.21. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη που εκφράζεται και απομονώνεται από κύτταρα E.coli, φέρει μία ομάδα -SH, κάτι που την καθιστά κατάλληλη για σύζευξη με βιοτίνη, αβιδίνη, αντίσωμα κλπ, για τη χρήση της ως ιχνηθέτη. Η αικουορίνη εκφράζεται στον περιπλασμικό χώρο του κυττάρου, λόγω του πεπτιδίου οδηγού της εξωκυττάριας πρωτεΐνης ompa, όπως αναφέρεται παραπάνω στην Ενότητα 2.3 και όχι στα συσσωματώματα εγκλεισμού. Το πεπτίδιο αυτό βρίσκεται στο αμινοτελικό άκρο της αικουορίνης και οδηγεί την πρωτεΐνη στον περιπλασμικό χώρο του κυττάρου. Πολλές φορές στην προσπάθεια να επιτευχθούν υψηλά επίπεδα πρωτεϊνοσύνθεσης, γίνεται υπερέκφραση πρωτεϊνών και δημιουργείται ένα φαινόμενο που οφείλεται στη μη σωστή αναδίπλωσή τους και τη δημιουργία συμπαγών και αδιάλυτων δομών, που ονομάζονται συσσωματώματα εγκλεισμού (inclusion bodies) (Σχήμα 3.22). Η αιτία για τη δημιουργία τους φαίνεται πως είναι η ανάπτυξη υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ πλευρικών ομάδων ορισμένων αμινοξέων. Λόγω αυτών των συσσωματωμάτων η πρωτεΐνη παράγεται στην ανενεργή της μορφή. (Κωστοπούλου,2012) 81
Σχήμα 3.22: Απεικονίζεται η δημιουργία των συσσωματωμάτων, συμπαγών και αδιάλυτων δομών, λόγω της μη σωστής αναδίπλωσης της πρωτεΐνης. Αυτά δημιουργούνται στο περιφερειακό τμήμα του κυττάρου (Tyedmers et al., 2010). Στο πειραματικό μέρος, της παρούσας διπλωματικής εργασίας μελετήθηκε η μέθοδος του Inouye et al. (2012), η οποία περιλαμβάνει την έκφραση της πρωτεΐνης αικουορίνης στον περιπλασμικό χώρο και την απομόνωσή της από αυτόν. Παρακάτω γίνεται σύγκριση της μεθόδου αυτής με μία άλλη που έχει μελετηθεί στο εργαστήριο, της Glynou et al.(2003), η οποία περιλαμβάνει την έκφραση της πρωτεΐνης στα συσσωματώματα εγκλεισμού. Πίνακας 3.8: Παρουσιάζεται η σύγκριση της μεθόδου Α (Glynou et al., 2003) με τη μέθοδο Β (Inouye et al., 2012), ως προς τα στάδια έκφρασης, ενεργοποίησης και καθαρισμού της ανασυνδυασμένης αικουορίνης. Πειραματική πορεία Μέθοδος Α (Glynou et al., 2003) Μέθοδος Β (Inouye et al., 2012) Χρήση επαγωγέα IPTG Όχι Ώρες που χρειάζονται για την παραλαβή των κυττάρων, που έχουν εκφράσει την πρωτεΐνη Μοριακή αναλογία πρωτεΐνης:σελεντεραζίνης για την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Παραλαβή πρωτεΐνης 23 h 31 h 1:2,5 1:1 συσσωματώματα εγκλεισμού περιπλασμικός χώρος Μετουσιωτικές συνθήκες NaCl, Ουρία όχι 82
Πειραματική πορεία Απόδοση μεθόδου σε mg πρωτεΐνης (από 300 ml υγρής καλλιέργειας) Μέθοδος Α (Glynou et al., 2003) Μέθοδος Β (Inouye et al., 2012) 1-2 mg 6-8 mg Καθαρισμός της πρωτεΐνης μετά την απομόνωση με διαπίδυση με χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων Στη μέθοδο Β δεν χρησιμοποείται ο επαγωγέας IPTG, που είναι σχετικά τοξικός για τα βακτηριακά κύτταρα, σε αντίθεση με τη μέθοδο Α. Για την έκφραση όμως της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης στα κύτταρα της E.coli, όσον αφορά τη μέθοδο Β απαιτούνται 8 ώρες παραπάνω από τη μέθοδο Α. Τα οπερόνια στο γονιδίωμα των προκαρυωτικών κυττάρων αποτελούν ομάδες που περιλαμβάνουν τα γονίδια των ενζύμων, τα οποία παίρνουν μέρος σε μία μεταβολική οδό, όπως η διάσπαση της λακτόζης. Τα γονίδια αυτά βρίσκονται το ένα δίπλα στο άλλο και υπόκεινται σε κοινό έλεγχο της έκφρασής τους. Ένα οπερόνιο εκτός από τα δομικά γονίδια, περιέχει επίσης ένα ρυθμιστικό γονίδιο καθώς και έναν χειριστή. Το ρυθμιστικό γονίδιο συνήθως παράγει την πρωτεΐνη-καταστολέα. Αυτή εμποδίζει την έκφραση των δομικών γονιδίων όταν το κύτταρο δεν χρειάζεται τα ένζυμα που αυτά κωδικοποιούν. Ο ισοπροπυλοθειογαλακτοζίτης (IPTG), είναι ένας επαγωγέας του οπερονίου της λακτόζης. Αυτός προσδένεται στην πρωτεΐνη-καταστολέα και την απενεργοποιεί, χωρίς όμως να μεταβολίζεται από τα προϊόντα του οπερονίου της λακτόζης, με αποτέλεσμα να μην απαιτείται η συνεχής του ανανέωση στο θρεπτικό μέσο καθώς τα κύτταρα αναπτύσσονται. (Hansen et al., 1998) Για την ενεργοποίηση της αποαικουορίνης απαιτείται σελεντεραζίνη σε μοριακή αναλογία 1:1 αντίστοιχα, σε αντίθεση με προηγούμενα πρωτόκολλα που η μοριακή αναλογία ήταν 1:2,5 (η σελεντεραζίνη βρίσκεται σε περίσσεια). Επιπλέον δεν χρησιμοποιούνται διαλύματα ουρίας (6 Μ) ή διαλύματα NaCl αφού δεν υπάρχουν συσσωματώματα εγκλεισμού και δεν απαιτείται η δημιουργία μετουσιωτικού περιβάλλοντος. 83
Ο καθαρισμός της αικουορίνης στη μέθοδο Α είναι ταχύτερος, καθώς στον περιπλασμικό χώρο παράγεται μόλις το 4% των πρωτεϊνών των βακτηριακών κυττάρων. Αποφεύγεται λοιπόν ο καθαρισμός με διαπίδυση. Σε σύγκριση με τη μέθοδο Α, η μέθοδος Β έχει υψηλότερη απόδοση (4-5 φορές), όσον αφορά την ποσότητα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. 84
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΒΑΝΤΙΚΩΝ ΤΕΛΕΙΩΝ (QDs) ΣΕ ΟΡΓΑΝΙΚΟΥΣ ΔΙΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΥΔΑΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Η σύνθεση και χρήση των κβαντικών τελειών QDs, αναπτύσσονται ραγδαία και χάρη στις ιδιότητές τους μπορούν να αξιοποιηθούν σε μεγάλο εύρος βιοεφαρμογών. Μέχρι τώρα οι περισσότεροι μέθοδοι σύνθεσης των QDs οδηγούν στο σχηματισμό υδρόφοβων κρυστάλλων. Λόγω αυτού, είναι ιδιαίτερα σημαντική η σύνθεση των QDs σε υδατικά διαλύματα ώστε να καθίστανται βιοσυμβατές. Στην ενότητα 4.1 που ακολουθεί, πραγματοποιείται σύνθεση QDs CdSe, στον οργανικό διαλύτη ολεϊκό οξύ (Nordell et al., 2005), ώστε να αποκτηθεί εμπειρία όσον αφορά τη γενική πειραματική πορεία. Το σελήνιο διαλύεται σε οκταδεκένιο και τριοκτυλοφωσφίνη (TOP) ενώ το κάδμιο σε ολεϊκό οξύ (OLA). Το OLA, ως υδρόφοβο μόριο εμποδίζει τη συσσωμάτωση των QDs. Η τριοκτυλοφωσφίνη χρησιμοποιείται σαν σταθεροποιητικό των σχηματιζόμενων QDs. Οι QDs που στην επιφάνειά τους έχουν τον υποκαταστάτη TOP μπορούν να επεξεργαστούν περαιτέρω αφού η TOP, μπορεί να αντικατασταθεί από θειολομάδες. Επιπλέον η TOP παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση του μεγέθους και της γεωμετρίας των QDs. Στις ενότητες 4.2 (Kumar et al., 2012) και 4.3 (Mahapatra et al., 2014) μελετάται η μέθοδος σύνθεσης QDs CdS που είναι σταθεροποιημένες με μερκαπτοπροπιονικό οξύ (MPA). Έπειτα γίνεται μελέτη των συνθηκών αντίδρασης, οι οποίες επηρεάζουν σημαντικά τη σύνθεση των QDs, όσον αφορά το μέγεθος των νανοκρυστάλλων αλλά και τις ιδιότητές τους. Οι συνθήκες αυτές είναι ο χρόνος της αντίδρασης, το ph του μίγματος της αντίδρασης, οι συγκεντρώσεις των αντιδρώντων αλλά και οι μοριακές τους αναλογίες. Το MPA εκτός από πηγή θείου αποτελεί και σταθεροποιητικό παράγοντα για τις QDs CdS. Στη μέθοδο αυτή δεν υπάρχει άλλη πηγή θείου εκτός από το MPA, για αυτό και ο ρόλος του είναι διπλός. Το MPA συμπλοκοποιείται με το Cd 2+ μέσω 2 δεσμών θείου και 2 οξυγόνου. Με την αύξηση της θερμοκρασίας και με το πέρας του χρόνου της αντίδρασης, πραγματοποιείται θερμόλυση και σχηματίζονται οι QDs CdS. Το MPA 85
προσδίδει στην επιφάνεια των QDs καρβοξυλομάδες ( COOH). Οι ομάδες αυτές είναι υδρόφιλες και καθιστούν τις QDs βιοσυμβατές. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα να μπορούν να αξιοποιηθούν για συζεύξεις με βιομόρια σε αναλυτικές μεθόδους. 1. Οργανική σύνθεση CdSe-OLA κβαντικών κουκίδων QDs Ένα από τα πρώτα πειράματα που έλαβαν χώρα στο εργαστήριο, για την εξοικείωση με τη σύνθεση κβαντικών κουκίδων ήταν η οργανική σύνθεση QDs CdSe (καδμίουσεληνίου). 1.1.Πειραματική πορεία Το πείραμα πραγματοποιείται στον απαγωγό. 1. Παρασκευή stock διαλύματος σεληνίου: Προσθήκη 30 mg (0,03 g) Se σε 5 ml οκταδεκένιο (ODE). Προσθήκη 0.4 ml τριοκτυλοφωσφίνης (TOP) (332 mg, d=0,831 g/ml). Διάλυση των αντιδρώντων και θέρμανση στους 200 o C -250 o C και διαλυτοποίηση με υπερήχους για περίπου 5 min και στη συνέχεια ψύξη του διαλύματος. (SolB) Το stock διάλυμα μπορεί να διατηρηθεί, καθώς είναι σταθερό, για μερικούς μήνες. 2. Σε μία σφαιρική φιάλη των 25 ml προστίθενται 13 mg (0,013 g) CdO, 0,6 ml (με μία πλαστική πιπέτα ή σύριγγα) ολεϊκού οξέος (OLA) και 10 ml οκταδεκένιο (με έναν ογκομετρικό κύλινδρο των 10 ml ) (SolA). Εισάγεται θερμόμετρο στη σφαιρική φιάλη και το μίγμα θερμαίνεται στους 225 C, με τη χρήση μανδύα θέρμανσης. 3. Όταν η θερμοκρασία του SolA φτάσει τους 225 C, εισάγονται άμεσα 0,5 ml του SolB στη θερμαινόμενη φιάλη. Έπειτα από την εισαγωγή του διαλύματος του σεληνίου (SolB), αρχίζει η χρονομέτρηση. Το μέγεθος των νανοσωματιδίων εξαρτάται από το χρόνο της αντίδρασης. 4. Κάθε 10-20 s, παραλαμβάνονται δείγματα του 1 ml (με τη χρήση σταγονόμετρου) και τοποθετούνται σε παγωμένους δοκιμαστικούς σωλήνες. Η 86
χαμηλή θερμοκρασία βοηθά στο γρήγορο τερματισμό της αντίδρασης (σωματίδια παρόμοιου μεγέθους). Συνολικά λήφθηκαν 9 δείγματα (S1-S9). 5. Λήψη φασμάτων εκπομπής και διέγερσης με φθορισμόμετρο. 1.2.Αποτελέσματα-συμπεράσματα Ο υποκαταστάτης TOP, όταν προστίθεται με το σελήνιο, αντικαθιστά το ολεϊκό οξύ. Το σελήνιο δημιουργεί τους νανοκρυστάλλους καθώς συμπλοκοποιείται με το κάδμιο, ενώ η TOP καλύπτει την επιφάνειά τους και τους σταθεροποιεί. Σχήμα 4.1: Απεικόνιση της πειραματικής διάταξης για τη σύνθεση των QDs από CdSe καθώς και οι δομές των αντιδραστηρίων οκταδεκένιο (ODE), ολεϊκό οξύ (OLA) και τριοκτυλοφωσφίνη (TOP). Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης συλλέγονται κλάσματα του 1 ml με διαφορά 10-20 s (τελικός όγκος αντίδρασης περίπου τα 10 ml). Το κλάσμα S 9 αφέθηκε για περισσότερο χρόνο σε υψηλή θερμοκρασία και παρατηρήθηκε αλλαγή του λmax αλλά και οπτικά το διάλυμα από πορτοκαλί που ήταν έγινε υποκίτρινο και με τη διέγερση με UV ακτινοβολία εξέπεμσε μπλε αντί για πράσινο φθορισμό, όπως φαίνεται στις εικόνες. που ακολουθούν 87
Σχήμα 4.2: Αριστερά βλέπουμε το S8 (λ em= 536,5 nm) με πράσινο φθορισμό και δεξιά το S9 (λ em= 410 nm) με μπλε φθορισμό, μετά την διέγερσή τους με ακτινοβολία UV. Για τα επιμέρους δείγματα που συλλέχθηκαν, χωρίς να αραιωθούν λήφθηκαν φάσματα κρατώντας σταθερό το μήκος κύματος διέγερσης στα 320 nm. Πίνακας 4.1: Περιλαμβάνει το κωδικό των διαλυμάτων που συλλέγονταν κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, το χρόνο συλλογής τους, το εκάστοτε μήκος κύματος εκπομπής καθώς και τον αντίστοιχο φθορισμό σε μήκος κύματος διέγερσης 320 nm. a/a S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 S 8 S 9 λ max (nm) 525 533 539 544 544 546 543 536 410 time(s) 20 40 60 80 100 120 140 160 600 F max 733,4 673,2 684,9 686,4 668,81 658,2 632,5 612,4 537,6 88
Intensity [a.u.] 800 700 600 500 400 300 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 200 100 0 450 500 550 600 650 wavelength (nm) Σχήμα 4.3: Φάσμα εκπομπής των δειγμάτων που συλλέχθηκαν ανά συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια σχηματισμού των κβαντικών κουκίδων, με λ ex = 320 nm. Από τον παραπάνω Πίνακα και το φάσμα εκπομπής των επιμέρους δειγμάτων παρατηρούμε ότι μετά από κάποιο χρονικό διάστημα, συγκεκριμένα 100'' από την έναρξη του reflux, η ένταση του φθορισμού είναι μέγιστη (F=686) και το μήκος κύματος εκπομπής 544 nm. Στη συνέχεια της αντίδρασης παρατηρείται μείωση του μήκους κύματους εκπομπής (έως και 410 nm), άρα μειώνεται και το μέγεθος των νανοσωματιδίων. Η ένταση του φθορισμού μειώνεται αλλά όχι σημαντικά. Όσον αφορά το τελευταίο δείγμα, περίπου 10 min από τη στιγμή που άρχισε το reflux, όπως φαίνεται και στο φάσμα το μήκος κύματος εκπομπής άλλαξε κατά πολύ. 2. Σύνθεση κβαντικών κουκίδων CdS σταθεροποιημένων με μερκαπτοπροπιονικό οξύ (MPA) 2.1.Πειραματική πορεία: 1. 50 ml υδατικού διαλύματος 0.02 M Cd(NO 3 ) 2 *4H 2 O προστίθενται αρχικά σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml. 2. 0,5 ml διαλύματος MPA προστίθενται υπό ήπια ανάδευση. 89
3. 20 mm Cd(NO 3 ) 2 *4H 2 O και 114 mm MPA ( μοριακή αναλογία ίση με 5,7) 4. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται στο 10,0 με τη χρήση διαλύματος 1 M NaOH. 5. Το μίγμα της αντίδρασης τοποθετείται σε σφαιρική φιάλη των 100 ml. 6. 150 μl διαλύματος 30% H 2 O 2 προστίθεται στάγδην στο παραπάνω διάλυμα. 7. Στη συνέχεια πραγματοποιείται reflux στους 100 o C. 8. Στην αρχή του reflux συλλέγεται το πρώτο δείγμα. 9. Περισσότερα δείγματα συλλέγονται σε διάφορα χρονικά διαστήματα (για τη μελέτη της επίδρασης του χρόνου αντίδρασης στο μέγεθος των σχηματιζόμενων QDs). 10. Οι σχηματιζόμενοι νανοκρύσταλλοι φυγοκεντρούνται και ακολουθείται πλύση με αιθανόλη για την απομάκρυνση των ιόντων που ήταν σε περίσσεια. 11. Οι νανοκρύσταλλοι επαναδιαλυτοποιούνται σε απεσταγμένο νερό. Παρατηρήσεις: Πριν την αντίδραση, όλα τα υαλικά καθαρίζονται καλά με βασιλικό νερό (HCl:HNO 3 =3) και στη συνέχεια με dd H 2 O. Ακολουθεί πλύση με ακετόνη και στέγνωμα σε φούρνο. Κάθε δείγμα τοποθετείται σε παγωμένο δοκιμαστικό σωλήνα, για τον τερματισμό της αντίδρασης και την παραλαβή ομοιόμορφων νανοσωματιδίων. Παραλλαγές στην πορεία σύνθεσης των QDs CdS Η παραπάνω πειραματική πορεία πραγματοποιήθηκε σε μικρούς όγκους (0,5 ml αντί για 50 ml διαλυμάτων Cd 2+, 0,01 ml MPA και προσθήκη διαλύματος 1M NaOH για ρύθμιση ph) και με τις εξής διαφορετικές συνθήκες: i. Στις ίδιες συνθήκες με αλλαγή στις συγκεντρώσεις Cd 2+ σε 5mM και MPA σε 28,5 mm, διατηρώντας σταθερή τη μοριακή αναλογία MPA:Cd 2+ ίση με 5,7. ii. Σε ρυθμιστικό διάλυμα NH 3 -NH + 4 (αντί για NaOH) 0,1 M (ολική συγκέντρωση) ph 10,0 με συγκεντρώσεις Cd 2+ 1 mm και MPA 5,7 mm. iii. Σε ρυθμιστικό διάλυμα NH 3 -ΝΗ + 4 1M (ολική συγκέντρωση) ph 10,0 με συγκεντρώσεις αντιδρώντων: 20 mm Cd 2+, 114 mm MPA (5,7 μοριακή αναλογία) 5 mm Cd 2+, 29 mm MPA (5,7 μοριακή αναλογία) 1 mm Cd 2+, 5,7 mm MPA (5,7 μοριακή αναλογία) 90
iv. Σε ρυθμιστικά NH 3 -ΝΗ + 4 1M ph 8,0 και ph 9,0, σε συγκεντρώσεις αντιδρώντων 5 mm Cd 2+ και 29 mm MPA (μοριακή αναλογία 5,7). v. Σε διάλυμα 0,1 M EDTA σε 1M NH 3 και ρύθμιση του ph με τη χρήση διαλύματος HCl σε 10,0, 9,0 και 8,0 με 20 mm Cd 2+ και 114 mm MPA (5,7 μοριακή αναλογία). Σε όλες τις παραπάνω παραλλαγές της πειραματικής πορείας 2.1. προστέθηκε και η ανάλογη ποσότητα 30% H 2 O 2. 2.2. Αποτελέσματα-συμπεράσματα 2.2.1. Συγκέντρωση Cd 2+ 20 mm και MPA 114 mm, ph 10,0 (1η σειρά πειραμάτων) Το παραπάνω πρωτόκολλο πραγματοποιήθηκε αρχικά, δοκιμαστικά, σε μικρότερη κλίμακα, με συνολικό όγκο αντίδρασης 10 ml. Η μοριακή αναλογία είναι MPA:Cd 2+ = 5,7. Η αντίδραση αφέθηκε 30 min από την αρχή του reflux. Μετά το πέρας των 30 min η σφαιρική φιάλη τοποθετήθηκε σε παγόλουτρο για τον τερματισμό της αντίδρασης. Το δείγμα παρατηρήθηκε οπτικά. Υπό την επίδραση UV ακτινοβολίας, όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα, προέκυψε κίτρινος φθορισμός. Σχήμα 4.4: Φαίνεται το διάλυμα QDs CdS ύστερα από 30 min reflux, μετά την διέγερση με ακτινοβολία UV. 91
Intensity [a.u] 2.2.2. Συγκέντρωση Cd 2+ 20 mm και MPA 114 mm, ph 10,0 (2η σειρά πειραμάτων) Στη συνέχεια το πείραμα πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο αντίδρασης 50 ml. Ακολούθησε συλλογή των δειγμάτων. Πιο συγκεκριμένα τα δείγματα 1-10 συλλέγονταν ανά 20 s μετά την έναρξη του reflux, τα δείγματα 11-20 ανά 40 s, τα 21-30 ανά 1 min και τέλος τα δείγματα 31-35 ανά 2 min. 160 140 Sample 5 em = 527 nm 120 100 80 60 40 20 0-20 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 [nm] Σχήμα 4.5: Φάσμα διέγερσης (ενδεικτικά) για το Sample 5 με λ εκπομπής 527 nm, το οποίο συλλέχθηκε 100 s από την αρχή του reflux. Από το φάσμα διέγερσης του σχήματος 4.5 διαπιστώνεται ότι λex = 380 nm. Πίνακας 4.2: Περιλαμβάνει τον αριθμό του δείγματος, το χρόνο συλλογής τους, το μέγιστο μήκος κύματος και τον αντίστοιχο φθορισμό. Δείγματα 2 5 10 14 20 25 30 32 35 Τελικό(f) Χρόνος(s) 40 100 200 360 600 900 1200 1440 1800 >1800 λ max (nm) 522 527 537 542 549 550 551 553 555 555 Fmax 97,8 152,8 149,5 362,7 353,2 321,1 289,9 264,8 246,7 225,3 92
Intensity [a.u] Μετά τα 6 min reflux παρατηρείται μέγιστη τιμή φθορισμού (S 5 ) ενώ σε μεγαλύτερο χρόνο μειώνεται η ένταση του φθορισμού και ταυτόχρονα αυξάνεται το μήκος κύματος. Οι πληθυσμοί των σωματιδίων που συλλέχθηκαν είναι διαφορετικοί καθώς το μέγεθός τους, άρα και το μήκος κύματος εκπομπής, αυξάνει όσο αυξάνεται ο χρόνος της αντίδρασης. Όμως μετά από τα 30 min reflux δεν παρατηρείται περαιτέρω αύξηση του μήκους κύματος. 400 350 300 250 200 150 S 2 S 5 S 10 S 14 S 20 S 25 S 30 S 32 S 35 S F 100 50 0 400 450 500 550 600 650 [nm] Σχήμα 4.6: Φάσματα εκπομπής των δειγμάτων, που συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα από την αρχή του reflux. λex= 380 nm. Από το παραπάνω φάσμα εκπομπής (σχήμα 4.6) των δειγμάτων μπορούμε να παρατηρήσουμε και τη μετατόπιση του μήκους κύματος αλλά και τη μείωση της έντασης του φθορισμού. 2.2.3. Συγκέντρωση Cd 2+ 20 mm και MPA 114 mm, ph 10,0 (3η σειρά πειραμάτων) Η τρίτη σειρά πειραμάτων περιελάμβανε τα πειράματα των ενοτήτων 2.1 και 2.1.1.i, τα οποία πραγματοποιήθηκαν την ίδια μέρα. Οι μοριακές αναλογίες και οι υπόλοιπες συνθήκες κρατήθηκαν σταθερές εκτός από τις συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων που ήταν κατά 4 φορές μικρότερες (2.1.1.i). 93
Intensity (a.u.) Τα δείγματα αραιώθηκαν 100 φορές για την λήψη των φασμάτων εκπομπής διατηρώντας σταθερό το μήκος κύματος διέγερσης στα 350 nm. Πίνακας 4.3: Περιλαμβάνει τον αριθμό των 100 φορές αραιωμένων δειγμάτων, το χρόνο συλλογής τους, το μέγιστο μήκος κύματος εκπομπής και τον αντίστοιχο φθορισμό, την τιμή φθορισμού πολλαπλασιασμένη με το παράγοντα αραίωσης (100). Δείγματα 2 5 9 τελικό Χρόνος (min) 2,67 9,67 25,67 35,67 λ max (nm) 546 548 552 555 F max ( dil ) 34,4 38,0 36,7 35,2 F max 3440 3800 3670 3520 40 35 30 25 20 Time after reflux 2' 40" 9' 40" 25' 40" 35' 40" 15 10 5 0 400 450 500 550 600 650 [nm] Σχήμα 4.7: Φάσμα εκπομπής των επιμέρους δειγμάτων, που συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα από την αρχή του reflux με λ max ex= 350 nm. Από τα παραπάνω δεδομένα του πίνακα και του φάσματος εκπομπής παρατηρούμε ότι μετά από περίπου 10 min reflux, όπου και σημειώνεται η μέγιστη ένταση φθορισμού (στο δείγμα S5), η ένταση του φθορισμού μειώνεται σε αντίθεση με το μήκος κύματος εκπομπής που συνεχίζει να αυξάνεται μέχρι τα 555 nm. Αυτό σημαίνει ότι το μέγεθος των νανοσωματιδίων αυξάνεται. 94
Το ίδιο μήκος κύματος εκπομπής (555 nm) παρατηρήθηκε και στα προηγούμενα πειράματα με τις ίδιες συγκεντρώσεις αντιδραστηρίων. Η διαφορά στην ένταση του φθορισμού, περίπου δέκα φορές μεγαλύτερη, σε σχέση με τα αποτελέσματα της 2ης σειράς πειραμάτων της ενότητας 2.2.2., πιθανότατα οφείλεται στη ρύθμιση του ph. Ο ρόλος που έχει η τιμή του ph είναι πολύ σημαντικός στη συγκεκριμένη πειραματική πορεία, όσον αφορά τη δημιουργία ιζημάτων και κατά συνέπεια τη παρεμπόδιση του φθορισμού. Εκτενέστερη αναφορά γίνεται παρακάτω στα συμπεράσματα. 2.2.4. Συγκέντρωση Cd 2+ 5 mm και MPA 28,5 mm, ph 10,0 (3η σειρά πειραμάτων) Η συλλογή των δειγμάτων έγινε στους ίδιους χρόνους με το πείραμα της ενότητας 2.2.3. Τα δείγματα αραιώθηκαν 10 φορές πριν την λήψη φασμάτων. Το μήκος κύματος διέγερσης διατηρήθηκε σταθερό στα 350 nm. Πίνακας 4.4: Περιλαμβάνει τον αριθμό των 10 φορές αραιωμένων δειγμάτων, το χρόνο συλλογής τους, το μέγιστο μήκος κύματος εκπομπής και τον αντίστοιχο φθορισμό, την τιμή φθορισμού πολλαπλασιασμένη με το παράγοντα αραίωσης (10). Δείγματα 5 9 τελικό Χρόνος (min) 9,67 25,67 35,67 λ max (nm) 554 555 563 Fmax(dil) 70,3 71,7 69,1 Fmax 703 717 691 Από τον παραπάνω πίνακα παρατηρείται μέγιστος φθορισμός στα 26 περίπου λεπτά reflux. Οι διαφορές στις εντάσεις του φθορισμού είναι σχετικά μικρές στα διάφορα δείγματα. Το μήκος κύματος μέχρι το τέλος της αντίδρασης συνεχίζει να αυξάνεται, όπως φαίνεται και από τη μετατόπιση των φασμάτων εκπομπής στο παρακάτω σχήμα. 95
Excitation Intensity (a.u) 100 90 80 70 time after reflux 9' 40" 25' 40" 35' 40" 60 50 40 30 20 10 0-10 400 450 500 550 600 650 [nm] Σχήμα 4.8 : Φάσμα εκπομπής των επιμέρους δειγμάτων, που συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα από την αρχή του reflux με λmax ex =350 nm. 120 100 9' 40" after reflux em 550 nm 80 60 40 20 0 300 350 400 450 500 [nm] Σχήμα 4.9: Ενδεικτικό φάσμα διέγερσης για το δείγμα 5 που συλλέχθηκε 9,67 λεπτά μετά την έναρξη του reflux, διατηρώντας σταθερό το μήκος κύματος εκπομπής στα 550 nm. Το μήκος κύματος εκπομπής φτάνει μέχρι και τα 563 nm, κατά 8 nm μεγαλύτερο από το μήκος κύματος εκπομπής που επιτυγχάνεται με τα 20 mm Cd 2+ και 114 mm MPA. Αυτό σημαίνει ότι τα νανοσωματίδια που δημιουργούνται από το πείραμα με τη 96
συγκέντρωση 5 mm Cd 2+ και 28,5 mm MPA, είναι ελαφρώς μεγαλύτερα. Λόγω της χαμηλότερης συγκέντρωσης των αντιδρώντων δημιουργούνται λιγότερα QDs. Σε αυτό οφείλεται και η χαμηλότερη ένταση που παρατηρείται στο φθορισμό. Για παράδειγμα για το δείγμα 9 από τους Πίνακες 4.3 και 4.4 βλέπουμε ότι για τον ίδιο χρόνο reflux έχουμε ένταση φθορισμού 3670 και 717 αντίστοιχα. Επιπλέον για τον ίδιο λόγο υπάρχει δυνατότητα αύξησης του μεγέθους τους μέσα στο διάλυμα της αντίδρασης. Έτσι έχουμε δημιουργία λιγότερων σωματιδίων, μεγαλύτερης όμως διαμέτρου. 2.2.5. Παραλλαγές στην πειραματική πορεία των CdS QDs i. Για την αποφυγή της ρύθμισης του ph στο μίγμα της αντίδρασης + χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα NH 3 -ΝΗ 4 με ph 10,0, ενώ οι συγκεντρώσεις Cd 2+ 1 mm και MPA 5,7 mm (S 1 ). Ο όγκος της αντίδρασης ήταν περίπου 500 μl. Μετά από 30 min επώαση στους 100 ο C δεν παρατηρήθηκε, μετά από διέγερση του δείγματος με ακτινοβολία UV, φθορισμός. ii. Σε ρυθμιστικό διάλυμα NH 3 -ΝΗ + 4 ph 10,0 με συγκεντρώσεις αντιδρώντων: 20 mm Cd 2+, MPA 114 mm MPA (μοριακή αναλογία 5,7), S 2 5 mm Cd 2+, 29 mm MPA (μοριακή αναλογία 5,7), S 3 1 mm Cd 2+, 5,7 mm MPA (μοριακή αναλογία 5,7), S 4 Και σε αυτή την περίπτωση ο όγκος της αντίδρασης ήταν περίπου 500 μl. Η αντίδραση έγινε στους 100 ο C για 30 min. Από τις παραπάνω διαφορετικές συγκεντρώσεις, έπειτα από τη διέγερση των επιμέρους δειγμάτων με UV παρατηρήθηκε ότι το δείγμα S 2, και S 3 παρουσίασαν φθορισμό. Μεγαλύτερη ένταση είχε το δείγμα S 2. Αντίθετα το S 4, όπως συνέβη και στο ρυθμιστικό + διάλυμα NH 3 -ΝΗ 4 με το διάλυμα S 1, δεν παρουσίασε φθορισμό. + iii. Σε ρυθμιστικό NH 3 -ΝΗ 4 ph 8,0 (S 5 ) και 9 (S 6 ), 5 mm Cd 2+ και 29 mm MPA (μοριακή αναλογία 5,7). Μετά την παρατήρηση φθορισμού στο S 3 ακολούθησε η επανάληψη του ίδιου πειράματος με τις ίδιες συγκεντρώσεις με διαφορετικό όμως ph του ρυθμιστικού διαλύματος αμμωνίας. Τόσο στο S 5 όσο και στο S 6 παρατηρήθηκε δημιουργία λευκού ιζήματος μετά και την προσθήκη του MPA. Αυτό οφείλεται στην καθίζηση υδροξειδίου του καδμίου. 97
iv. Σε διάλυμα 0,1 M EDTA σε 1M NH 3 και ρύθμιση του ph με τη χρήση διαλύματος HCl σε ph=10,0 (S 7 ), ph=9,0 (S 8 ), ph =8,0 (S 9 ) και σε 20 mm Cd 2+ και 114 mm MPA (μοριακή αναλογία 5,7). Αφού παρουσιάστηκε ίζημα στα δείγματα S 5 και S 6, έγινε επανάληψη του ίδιου πειράματος με προσθήκη όμως στο ρυθμιστικό διάλυμα 0,1 M EDTA. Αυτό έγινε με τη σκέψη ότι το EDTA θα δεσμεύσει το Cd 2+ σχηματίζοντας ευδιάλυτα σύμπλοκα. Τα δείγματα όμως S 7-9 δεν παρουσίασαν και πάλι φθορισμό, έπειτα από διέγερσή τους με ακτινοβολία UV. 3. Παρασκευή κβαντικών τελειών CdS επικαλυμμένων με μερκαπτοπροπιονικό οξύ (MPA) 3.1.Πειραματική πορεία: 1. 10 ml υδατικού διαλύματος 2,35 mm Cd(NO 3 ) 2 προστίθενται αρχικά σε ποτήρι ζέσεως των 25 ml. 2. 10 μl διαλύματος MPA 5,75 M ( 5,7 mm τελική συγκέντρωση) προστίθενται υπό ήπια ανάδευση. (μοριακή αναλογία 2,4). 3. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται σε ph 9,0 και ph 12,0 σε πεχάμετρο με την προσθήκη διαλύματος 1 M NaOH 4. Το μίγμα της αντίδρασης τοποθετείται σε σφαιρική φιάλη των 25 ml και ακολουθείται ολονύχτια επώαση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 5. Στη συνέχεια πραγματοποιείται reflux στους 100 o C (8-10 ώρες). 6. Στην αρχή του reflux συλλέγεται το πρώτο δείγμα. 7. Περισσότερα δείγματα συλλέγονται ανά χρονικά διαστήματα 1 ώρας περίπου για τη μελέτη της επίδρασης του χρόνου αντίδρασης στο μέγεθος των σχηματιζόμενων QDs. 8. Λαμβάνονται φάσματα διέγερσης και εκπομπής για τα επιμέρους δείγματα. Παρατηρήσεις: Όλα τα υαλικά καθαρίζονται καλά με βασιλικό νερό (HCl:HNO 3 =3) και στη συνέχεια με ddh 2 O. Ακoλουθεί πλύση με ακετόνη και στέγνωμα σε φούρνο. 98
Κάθε δείγμα τοποθετείται σε παγωμένο δοκιμαστικό σωλήνα, για τον τερματισμό της αντίδρασης και την παραλαβή ομοιόμορφων νανοσωματιδίων. 3.2.Αποτελέσματα-συμπεράσματα 3.2.1. Σύνθεση QDs CdS επικαλυμμένων με MPA σε ph 9,0 Το MPA χρησιμοποιείται ως σταθεροποιητικό των QDs, αλλά και ως πηγή θείου στην αντίδραση καθώς δεν προστίθεται διάλυμα θειούχων αλάτων. Το κάδμιο συμπλοκοποιείται με τα άτομα θείου και οξυγόνου. Μετά το reflux ακολουθεί υδρόλυση των δεσμών με το οξυγόνο. Έτσι δημιουργούνται σωματίδια με καρβοξυλομάδες στην επιφάνειά τους Σχήμα 4.10: Απεικονίζεται η αντίδραση που λαμβάνει χώρα μεταξύ καδμίου και MPA. Μετά το πέρας της O/N επώασης το μίγμα της αντίδρασης υποβλήθηκε σε reflux. Μισή ώρα από την αρχή του reflux και στη συνέχεια ανά ώρα συλλέγονταν δείγματα του 1 ml, τα οποία τοποθετούνταν σε παγωμένους δοκιμαστικούς σωλήνες για τον άμεσο τερματισμό της αντίδρασης. Τα δείγματα αραιώθηκαν 10 φορές για την λήψη των φασμάτων εκπομπής και διέγερσης. Για κάθε δείγμα έγινε διερεύνηση του μήκους κύματος διέγερσης με το οποίο λήφθηκαν τα φάσματα εκπομπής για κάθε δείγμα. Πίνακας 4.5: Περιλαμβάνει τον αριθμό των 10 φορές αραιωμένων δειγμάτων, το χρόνο συλλογής τους, το μέγιστο μήκος κύματος, το μήκος κύματος διέγερσης, τον αντίστοιχο φθορισμό (Fmax(dil)) και την τιμή φθορισμού πολλαπλασιασμένη με το παράγοντα αραίωσης (10). 99
Intensity (a.u.) Δείγματα 1 5 8 9 (τελικό) Χρόνος (h) 0,5 4 7 8 λ ex (nm) 373 390 390 415 λ max em (nm) 538 561 561 569 Fmax(dil) 32,9 32,6 26,1 23,9 Fmax 329 326 261 239 Και σε αυτό το πείραμα σύνθεσης QDs παρατηρείται ένα μέγιστο φθορισμού σε συγκεκριμένο μήκος κύματος εκπομπής τα 561 nm. Δηλαδή 4 ώρες από την αρχή του reflux σημειώνεται μείωση της έντασης του φθορισμού. Το μήκος κύματος όμως, άρα και το μέγεθος των σωματιδίων, συνεχίζει να αυξάνεται. 35 30 25 20 15 time after reflux S 1 30' S 5 4 h S 8 7 h S 9 8 h 10 5 0 450 500 550 600 650 [nm] Σχήμα 4.11: Φάσματα εκπομπής των επιμέρους δειγμάτων S 1, S 5, S 8, S 9, που συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα από την αρχή του reflux, διατηρώντας σταθερά τα αντίστοιχα μήκη κύματος διέγερσης (Πίνακας 4.5). 100
Excitation 60 50 40 30' w em = 540 nm 4 h w em = 560 nm 7 h w em = 560 nm 8 h w em = 570 nm 30 20 10 0 300 350 400 450 500 [nm] Σχήμα 4.12: Φάσματα διέγερσης των επιμέρους δειγμάτων S 1, S 5, S 8, S, που συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα από την αρχή του reflux, διατηρώντας σταθερά τα αντίστοιχα, μήκη κύματος εκπομπής. Από τα φάσματα του σχήματος 4.11 και 4.12 μπορούμε να παρατηρήσουμε σταδιακά και τη μετατόπιση των μηκών κύματος εκπομπής και διέγερσης, και ιδιαίτερα της διέγερσης. Αυτό σημαίνει ότι τα σωματίδια που συλλέχθηκαν ανήκαν σε διαφορετικούς πληθυσμούς με διαφορετικό μέγεθος, ένταση φθορισμού άρα και ιδιότητες. 3.2.2. Σύνθεση QDs CdS επικαλυμμένων με MPA σε ph 12 Μετά το πέρας της O/N επώασης το μίγμα της αντίδρασης υποβλήθηκε σε reflux. Μισή ώρα από την αρχή του reflux και στη συνέχεια ανά ώρα συλλέγονταν δείγματα του 1 ml, τα οποία τοποθετούνταν σε παγωμένους δοκιμαστικούς σωλήνες για τον άμεσο τερματισμό της αντίδρασης. Τα δείγματα αραιώθηκαν 10 φορές για την παραλαβή των φασμάτων εκπομπής και διέγερσης. Για κάθε δείγμα λήφθηκαν τα φάσματα εκπομπής, διατηρώντας σταθερά τα μήκη κύματος διέγερσης για κάθε δείγμα. Πίνακας 4.6: Περιλαμβάνει τον αριθμό των 10 φορές αραιωμένων δειγμάτων, το χρόνο συλλογής τους, το μέγιστο μήκος κύματος, το μήκος κύματος διέγερσης, τον αντίστοιχο φθορισμό (Fmax(dil)) και την τιμή φθορισμού πολλαπλασιασμένη με το παράγοντα αραίωσης (10). 101
Intensity Δείγματα 1 2 3 4 5 6 7 8 Χρόνος (h) 1 2 3 4 5 6 7 8 λ ex (nm) 360 360 350 408 350 350 350 350 λ max em (nm) 520 528 571 581 570 577 575 576 Fmax(dil) 89,6 58,9 68,8 50,2 61,1 56,1 48,6 33,8 Fmax 869 589 688 502 611 561 486 338 Όσον αφορά τα μήκη κύματος διέγερσης, έγινε διερεύνησή τους για κάθε δείγμα. Αρχικά από τα επιμέρους φάσματα εκπομπής του σχήματος 4.12 λήφθηκαν τα μέγιστα μήκη κύματος εκπομπής. Έτσι διατηρώντας τα σταθερά λήφθηκαν και τα φάσματα διέγερσης του σχήματος 4.13. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 400 450 500 550 600 650 700 [nm] Samples after reflux: S 1 1 h S 2 2 h S 3 3 h S 4 4 h S 5 5 h S 6 6 h S 7 7 h 8 h S 8 Σχήμα 4.13: Φάσμα εκπομπής των επιμέρους δειγμάτων S 1, S 5, S 8, S 9, που συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα από την αρχή του reflux, διατηρώντας σταθερά τα αντίστοιχα μήκη κύματος διέγερσης (Πίνακας 4.6). 102
excitation 100 80 S 1 S 2 S 3 60 S 4 S 5 S 6 40 S 7 S 8 20 0 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 [nm] Σχήμα 4.14: Φάσματα διέγερσης των επιμέρους δειγμάτων S 1, S 5, S 8, S 9, που συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα από την αρχή του reflux, διατηρώντας σταθερά τα αντίστοιχα, πειραματικά μήκη κύματος εκπομπής. Σε αντίθεση με αποτελέσματα προηγούμενων πειραμάτων σύνθεσης QDs, δεν παρατηρείται ένα μήκος κύματος με μέγιστο φθορισμό αλλά κατά τη διάρκεια του reflux υπάρχει αυξομείωση στην ένταση του φθορισμού. Μόνο με την ολοκλήρωση των 6 ωρών reflux παρατηρείται μείωση της έντασης του φθορισμού και αύξηση του μήκους κύματος εκπομπής, άρα και του μεγέθους των νανοσωματιδίων. Σε σύγκριση με την ίδια πειραματική πορεία η οποία πραγματοποιήθηκε σε ph 9,0 παρατηρούμε ότι έχουμε αύξηση του μήκους κύματος κατά 7 nm, από 569 nm σε ph 9,0 σε 576 nm σε ph 12,0. Άρα σχηματίστηκαν ελαφρώς μεγαλύτερα νανοσωματίδια σε ph 12,0. Όσον αφορά την ένταση του φθορισμού παρουσιάστηκε μεγαλύτερη σε ph 12,0 από ότι σε ph 9,0, με μέγιστο φθορισμό σε όλη τη διάρκεια του reflux 869 και 329, αντίστοιχα. 103
Πίνακας 4.7: Περιλαμβάνει τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων και τη μοριακή τους αναλογία, το ph, το χρόνο reflux,το μέγιστο μήκος κύματος που προέκυψε κατά τη διάρκεια του reflux, τον αντίστοιχο φθορισμό που προέκυψε κατά το reflux. Πείραμα [Cd 2+ ] (mm) [MPA] (mm) ph molar ratio χρόνος reflux(h) λ max em (nm) Ένταση φθορισμού (a.u) 1 20 114 555 3800 10 5,7 0,5 2 5 29 563 717 3 9 569 329 2,35 5,7 2,4 8 4 12 581 869 Αν συγκρίνουμε συνολικά τα πρωτόκολλα που εκτελέστηκαν, παρατηρούμε ότι μεγαλύτερο μήκος κύματος εκπομπής παρατηρείται στο πείραμα 4 (Πίνακας 4.6) ενώ μεγαλύτερη ένταση φθορισμού στο πείραμα 1. Τα πειράματα 1 και 2 έχουν το πλεονέκτημα του λιγότερου χρόνου reflux καθώς πραγματοποιείται για μισή ώρα σε αντίθεση με το πείραμα 3 και 4 που απαιτούν 8 ώρες reflux και O/N επώαση πριν από αυτό. Συμπερασματικά οι βέλτιστες συνθήκες που προέκυψαν από τις παραπάνω μελέτες ήταν οι εξής: ph 10,0, χρόνος αντίδρασης 30 min, μοριακή αναλογία Cd 2+ :MPA = 5,7 και συγκεντρώσεις αντιδρώντων 5 mm Cd 2+ και 29 mm MPA. Ο χρόνος αντίδρασης των 8 h απέδιδε στις QDs μήκος κύματος εκπομπής περίπου 20 nm παραπάνω από τις πειραματικές πορείες των 30 min (Πίνακας 4.7). Η διαφορά τους είναι σχετικά μικρή για αυτό και σαν βέλτιστος χρόνος αντίδρασης επιλέγονται τα 30 min, βέβαια η επιλογή των αντίστοιχων πρωτοκόλλων για περαιτέρω χρήση των νανοκρυστάλλων που δημιουργούνται, γίνεται ανάλογα με τις απαιτήσεις του κάθε ερευνητή όσον αφορά την ένταση φθορισμού των σωματιδίων. 104
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Σύνθεση νανο-πλειάδων χρυσού-βόειας αλβουμίνης (BSA-Au nanoclusters) Τα σωματίδια χρυσού λόγω των εξαιρετικών ηλεκτρονικών, οπτικών, καταλυτικών και θερμικών ιδιοτήτων τους αλλά και λόγω της μεγάλης αναλογίας επιφάνειας προς όγκου χρησιμοποιούνται σε δοκιμασίες με υβριδοποιήσεις και σαν βιοδείκτες. Στη συγκεκριμένη πειραματική πορεία η βόεια αλβουμίνη ορού (BSA) χρησιμοποιείται σαν σταθεροποιητικός παράγοντας (Wang et al., 2011). Οι νανοπλειάδες χρυσού (AuNCs) εγκλωβίζονται στη BSA, καθώς αυτή αναδιπλώνεται γύρω τους, με αποτέλεσμα να έχουν στην επιφάνειά τους σουλφυδρυλομάδες. Με τη ρύθμιση του ph στην τιμή 12,0 αυξάνεται η αναγωγική ικανότητα της BSA. Αυτός ο τρόπος σύνθεσης προσεγγίζει τη διαδικασία παραγωγής μετάλλων από μικροοργανισμούς στη φύση (biomineralization). Η μέθοδος αυτή είναι φιλική προς το περιβάλλον, έχει χαμηλό κόστος και δίνει τη δυνατότητα στα AuNCs να τροποποιηθούν περεταίρω για τη σύζευξή τους με άλλα βιομόρια (Xie J et al., 2009). 1. Σύνθεση νανο-πλειάδων χρυσού-βόειας αλβουμίνης (BSA-Au nanoclusters) 1.1.Πειραματική πορεία 1. 4 ml διαλύματος HAuCl 4 (10mM, 37 C) προστίθενται σε 4 ml διαλύματος βόειας αλβουμίνης (BSA) (50mg/mL ή 25 mg/ml, 37 o C), υπό μαγνητική ανάδευση. Επώαση για 1-2 min. 2. Προσθήκη 0,4 ml διαλύματος 1M NaOH στο μίγμα της αντίδρασης. 3. Το τελικό μίγμα επωάζεται στους 37 o C, υπό έντονη ανάδευση για 24 h. Το ποτήρι ζέσεως καλύπτεται με parafilm για την αποφυγή της εξάτμισης. 4. Το χρώμα του διαλύματος μεταβάλλεται από ανοιχτό κίτρινο σε σκούρο καφέ. Η αντίδραση τότε έχει ολοκληρωθεί. 5. Το διάλυμα υφίσταται καθαρισμό με διαπίδυση έναντι ddh 2 0 για 48 h ώστε να απομακρυνθεί η περίσσεια του HAuCl 4 και του NaOH. 6. Το τελικό διάλυμα φυλάσσεται στους 4 o C μέχρι την επόμενη χρήση. 105
Παρατηρήσεις: Το διάλυμα της BSA φυγοκεντρείται, αν είναι απαραίτητο. Η μεμβράνη διαπίδυσης βυθίζεται σε ddh 2 0 για 30 min πριν από τη χρήση της. Όλα τα υαλικά καθαρίζονται με πρόσφατα παρασκευασμένο βασιλικό νερό (HCl:HNO 3 = 3:1 v/v), και ξεπλένονται με ddh 2 0 πριν από τη χρήση τους. 1.2.Αποτελέσματα - συμπεράσματα Τα νανοσωματίδια χρυσού που δημιουργούνται στην συγκεκριμένη πειραματική πορεία ονομάζονται νανο-πλειάδες. Αυτά αποτελούνται από 25 άτομα χρυσού και σταθεροποιούνται με τη βοήθεια των μορίων της BSA (Σχήμα 5.1) (Xie J et al., 2009). Σε αντίθεση με άλλα φθορίζοντα σωματίδια, δεν είναι τοξικά, είναι χαμηλού κόστους και βιοσυμβατά, γεγονός που τα καθιστά ικανά για περαιτέρω επεξεργασία της επιφάνειάς τους με λειτουργικές ομάδες για δημιουργία χρήσιμων συζευγμάτων (Wang et al., 2011). Σχήμα 5.1: Απεικόνιση της σύνθεσης των νανο-πλειάδων χρυσού και της σύζευξής τους με την BSA. Τα Au-NCs που συντίθενται και σταθεροποιούνται με θειολομάδες, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, παρουσίασαν ίδιες ιδιότητες με τα BSA-Au NCs της παραπάνω πειραματικής πορείας. Λόγω αυτού θεωρείται πως ίσως έχουν και την ίδια δομή, λαμβάνοντας υπόψη την παρουσία 35 θειολομάδων σε ένα μόριο BSA, από τα αντίστοιχα κατάλοιπα κυστεΐνης. Η ενσωμάτωση των Au NCs ( 0.8 nm) στα μόρια της BSA, επηρεάζει ελάχιστα τη δομή της. 106
1.2.i. Συγκέντρωση 50 mg/ml BSA και 10 mm HAuCl 4 Οι τελικές συγκεντρώσεις των BSA και HAuCl 4 ήταν 25 mg/ml και 5 mm αντίστοιχα. Το ph της αντίδρασης πριν και μετά την επώαση τους μίγματος αντίδρασης στους 37 o C ήταν 11,0. Το μίγμα της αντίδρασης στην αρχή της επώασης, στους 37 o C, είχε αρχικά υποκίτρινο χρώμα. Το χρώμα μετά την επώαση των 24 h, άλλαξε σε σκούρο καφέ. Η αλλαγή είχε γίνει ήδη αισθητή μετά το πέρας των 18 h. Μετά το καθαρισμό του δείγματος με τη διαπίδυση το ph ήταν 6,0. Ο όγκος του διαλύματος ήταν συνολικά 6 ml μετά την ολοκλήρωση του καθαρισμού. Συνεπώς υπάρχουν 150 mg BSA στο διάλυμα. Σχήμα 5.2: Αριστερά στην εικόνα παρουσιάζεται το υποκίτρινο διάλυμα BSA-Au NCs στην έναρξη της επώασης στους 37 o C. Δεξιά φαίνεται η αλλαγή του χρώματος σε σκούρο καφέ, μετά το πέρας των 24 h. 107
Intensity [a.u] excitation 300 250 max emission =616 nm sample after cleaning 200 150 100 50 250 300 350 400 450 500 [nm] Σχήμα 5.3: Φάσμα διέγερσης του δείγματος, μετά τον καθαρισμό με διαπίδυση. λem=616 nm. Αρχικά η λήψη φάσματος εκπομπής για το δείγμα μετά το καθαρισμό έγινε σε μήκος κύματος διέγερσης 320 nm. Στη συνέχεια από το μέγιστο μήκος εκπομπής λήφθηκε το φάσμα του σχήματος 5.3. 500 450 400 max ex =335 nm BSA-AuNCs before cleaning cleaned BSA-AuNCs Blank 350 300 250 200 150 100 50 0-50 350 400 450 500 550 600 650 700 750 Wavelength (nm) 108
Σχήμα 5.4: Φάσμα εκπομπής των δειγμάτων πριν και μετά το καθαρισμό με τη μεμβράνη διάλυσης, καθώς και του τυφλού δείγματος σε μήκος κύματος διέγερσης τα 335 nm. Από το φάσμα του σχήματος 5.4 διαπιστώνεται πως το μήκος κύματος εκπομπής είναι 619 nm. Με τη διέγερση του δείγματος, πριν και μετά τη διαδικασία της διαπίδυσης, με ακτινοβολία UV, παρατηρείται κόκκινος φθορισμός (οπτικά). Σχήμα 5.5: Το διάλυμα των νανο-πλειάδων BSA-Au υπό τη διέγερση UV. Το blank (τυφλό δείγμα) παρασκευάστηκε από 25 mg/ml και την αντίστοιχη προσθήκη NaOH στο διάλυμα, χωρίς όμως να υποστεί τη διαδικασία της διαπίδυσης. Από τα φάσματα του σχήματος 5.4 παρατηρούμε ότι η ένταση του φθορισμού αυξάνεται μετά τον καθαρισμό του διαλύματος BSA-Au NCs, από 227 σε 282. Είναι ευρέως γνωστό ότι το αμινοξύ τρυπτοφάνη είναι η κύρια πηγή φθορισμού της BSA, και εκπέμπει στα ~350 nm. Οι πρωτεΐνες ορού δεν αποτελούνται από χρωμοφόρες ομάδες οι οποίες μπορούν να απορροφήσουν το ορατό φως. Παρόλα αυτά από τη βιβλιογραφία έχει προκύψει ότι οι πρωτεΐνες αυτές εκπέμπουν στο ορατό φως. Με μήκος κύματος διέγερσης τα 360 nm παρατηρείται ένα μέγιστο μήκος κύματος εκπομπής ~450 nm συγκεντρώσεις από ~5 μm. Η ένταση αυξάνεται όσο αυξάνει και η συγκέντρωση, της BSA στη συγκεκριμένη περίπτωση. Προκύπτει λοιπόν ότι η κορυφή στα 450 nm είναι αποτέλεσμα μεγάλης συγκέντρωσης της BSA και κατ' επέκταση της δημιουργίας συσσωματωμάτων. Στη συγκεκριμένη πειραματική πορεία η τελική 109
συγκέντρωση της BSA είναι 25 mg/ml ή 370 μm (Mr BSA= 67000) (Sarkar et al., 2014). 1.2.ii. Συγκέντρωση 25mg/mL BSA και 10mM HAuCl 4 Το πείραμα εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε παραπάνω αλλά οι τελικές συγκεντρώσεις των BSA και HAuCl 4 ήταν 12,5 mg/ml και 5 mm αντίστοιχα. Το μίγμα της αντίδρασης στην αρχή της επώασης, στους 37 o C, είχε αρχικά υποκίτρινο χρώμα. Το χρώμα μετά την επώαση των 24 h, άλλαξε σε καφέ. Με τη διέγερση του δείγματος πριν και μετά τον καθαρισμό της μεμβράνης με ακτινοβολία UV, παρατηρείται πορτοκαλί φθορισμός (οπτικά) (Σχήμα 5.6). Το ph της αντίδρασης πριν και μετά την επώαση τους μίγματος αντίδρασης στους 37 o C ήταν 10,0. Μετά το καθαρισμό του δείγματος με τη μεμβράνη διαπίδυσης το ph ήταν 6,0. Ο όγκος του διαλύματος που χρησιμοποιήθηκε για καθαρισμό ήταν συνολικά 6,5 ml μετά την ολοκλήρωση του καθαρισμού. Συνεπώς υπάρχουν 81,25 mg BSA στο διάλυμα. Σχήμα 5.6 : Το διάλυμα των νανο-πλειάδων BSA-Au, με συγκεντρώσεις 12,5 mg/ml BSA και 5mM HAuCl 4, υπό τη διέγερση UV. 110
Intensity [a.u.] Excitation 120 110 100 em =600 nm after dialysis 25mg/mL BSA 90 80 70 60 50 40 300 350 400 450 500 [nm] Σχήμα 5.7: Φάσμα διέγερσης του δείγματος, μετά τον καθαρισμό με μεμβράνη διαπίδυσης για λem=600 nm. 250 200 (l) ex =386 nm Blank- 25mg/mL BSA, 1M NAOH Sample before dialysis Sample after dialysis 150 100 50 0 400 450 500 550 600 650 [nm] Σχήμα 5.8: Φάσμα εκπομπής των δειγμάτων πριν και μετά το καθαρισμό με τη μεμβράνη διαπίδυσης, καθώς και του τυφλού δείγματος σε μήκος κύματος διέγερσης τα 386 nm. 111
Το blank (τυφλό δείγμα) παρασκευάσθηκε από 12,5 mg/ml και την αντίστοιχη προσθήκη NaOH στο διάλυμα, χωρίς όμως να υποστεί τη διαδικασία της διαπίδυσης. Και σε αυτό το πείραμα παρατηρείται στο φάσμα εκπομπής, μία κορυφή στα 450 nm, ίσως λόγω αυξημένης συγκέντρωσης της πρωτεΐνης. Στη συγκεκριμένη πειραματική πορεία η τελική συγκέντρωση της BSA είναι 12.5 mg/ml ή 187 μm (Mr BSA= 67000) (Sarkar et al., 2014). Από τα φάσματα του Σχήματος 5.8 παρατηρούμε ότι η ένταση του φθορισμού δεν αυξάνεται μετά τον καθαρισμό του διαλύματος BSA-Au NCs. Το μήκος κύματος διέγερσης είναι 386 nm. Η ένταση φθορισμού της BSA στα 454 nm, βλέπουμε ότι είναι μεγαλύτερη από ότι των νανοπλειάδων BSA-Au στα 598 nm. Επιπλέον η κορυφή στα 598 nm είναι αρκετά διευρυμένη. Αυτό συμβαίνει λόγω της δημιουργίας διαφορετικών μεγεθών των BSA-Au NCs. 500 400 Blank 25 mg/ml BSA Blank 12,5 mg/ml BSA Sample after dialysis 12,5 mg/ml BSA Sample after dialysis 25 mg/ml BSA 300 Intensity [a.u.] 200 100 0 400 450 500 550 600 650 700 750 nm Σχήμα 5.9: Σύγκριση των φασμάτων εκπομπής των πειραμάτων με τα 25 mg/ml BSA και 25 mg/ml - 10mM HAuCl 4, 12,5 mg/ml BSA και 12,5 mg/ml BSA -5mM HAuCl 4. Στο σχήμα 5.9 παρουσιάζονται συνοπτικά τα φάσματα εκπομπής για το τυφλό δείγμα και για τα 25 mg/ml BSA - 10 mm HAuCl 4 όπου για μήκος κύματος διέγερσης τα 335 nm, το μήκος κύματος εκπομπής είναι 425 nm και 619 nm αντίστοιχα. Παρουσιάζονται 112
επίσης και τα φάσματα για το τυφλό 12,5 mg/ml BSA και για τα 12,5 mg/ml BSA- 5mM HAuCl 4, όπου για μήκος κύματος διέγερσης τα 386 nm, το μήκος κύματος εκπομπής ήταν 450 nm και 598 nm αντίστοιχα. Τα σωματίδια του δεύτερου πειράματος που σχηματίστηκαν με τις συγκεντρώσεις 12,5 mg/ml BSA - 5 mm HAuCl 4, ήταν μικρότερα. Αυτό φαίνεται και από τη μετατόπιση της κορυφής στο φάσμα εκπομπής, αλλά και οπτικά καθώς δίνει πορτοκαλί φθορισμό έναντι του κόκκινου φθορισμού του δείγματος με συγκεντρώσεις 25 mg/ml BSA- 10 mm HAuCl 4. Η αλλαγή αυτή στο χρώμα, συνδέεται με το φαινόμενο του συντονισμού των επιφανειακών πλασμονίων (Surface Plasmon Resonance-SPR). Με την αλλαγή της συγκέντρωσης των αντιδρώντων, σχηματίζονται διαφορετικού μεγέθους και διαφορετικής συμμετρίας νανοπλειάδες. Αυτό οδηγεί σε μετατόπιση της κορυφής απορρόφησης του SPR που παρατηρείται στην περιοχή του ορατού (Lyon et al., 1998) Από τα παραπάνω αποτελέσματα συμπεραίνουμε ότι οι νανοπλειάδες που συντέθηκαν με συγκεντρώσεις 25 mg/ml BSA- 10mM HAuCl 4, φάνηκε να έχουν περισσότερη ομοιομορφία μεταξύ τους. Αυτό προκύπτει από την σχετικά στενή κορυφή στο φάσμα εκπομπής στα 619 nm. Επιπλέον η κορυφή που εμφανίζεται στα περίπου 450 nm και οφείλεται στη BSA έχει μικρότερη ένταση φθορισμού από ότι το δείγμα των νανοπλειάδων. Αντίθετα στις νανοπλειάδες που σχηματίσθηκαν με συγκεντρώσεις αντιδρώντων 12,5 mg/ml BSA -5mM HAuCl 4, η κορυφή της BSA φαίνεται να έχει μεγαλύτερη ένταση φθορισμού σε σχέση με τις νανοπλειάδες χρυσού στα 598 nm. Αυτό ίσως παρεμποδίζει το φθορισμό των BSA-Au NCs. 113
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Σύνθεση μαγνητικών σωματιδίων Στο κεφάλαιο αυτό μελετήθηκαν διάφορες μέθοδοι σύνθεσης μαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου (Fe 3 O 4 ). Η μέθοδος Α περιελάμβανε τη συγκαταβύθιση των μαγνητικών νανοσωματιδίων σε αλκαλικό περιβάλλον και σε θερμοκρασία δωματίου, η μέθοδος B την οξειδωτική αλκαλική υδρόλυση των ιόντων σιδήρου σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και η μέθοδος C την οξειδωτική αλκαλική υδρόλυση ιόντων σιδήρου αλλά σε υψηλή θερμοκρασία. Και οι 3 μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση χλωριούχων και θειούχων αλάτων σιδήρου. Στην Ενότητα 4 του κεφαλαίου περιγράφεται η σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων Fe 3 O 4 με τη μέθοδο A. Στα συγκεκριμένα MNPs ακολουθεί περεταίρω επεξεργασία της επιφάνειάς τους με αμινομάδες, με τη χρήση του αντιδραστηρίου 3-αμινο πρόπυλτριαιθόξυσιλάνιο (3-Aminopropyltriethoxysilane - APTES). Τα μη τροποποιημένα MNPs αλλά και αυτά που τροποποιήθηκαν χαρακτηρίστηκαν με την τεχνική ηλεκτρονική μικροσκοπίας διαπερατότητας (TEM). Ακολούθησε βιοτινυλίωση των αμινομάδων που βρίσκονται στην επιφάνεια των MNPs, και σύζευξης των βιοτινυλιωμένων MNPs με το σύζευγμα στρεπταβιδίνης-αλκαλικής φωσφατάσης, το οποίο περιγράφεται αναλυτικά παρακάτω. Η διαδικασία αυτή πιστοποιεί την ύπαρξη των αμινομάδων στην επιφάνεια των MNPs. 1. Μέθοδος Α : Συγκαταβύθιση σε αλκαλικό περιβάλλον Πειραματική πορεία: i. Παρασκευή διαλύματος 10 ml 0,0125M FeCl 2 *4H 2 O (Fe 2+ ) και 0,025M FeCl 3 (Fe 3+ ). ii. Ζύγιση 24.88 mg FeCl 2 *4H 2 O και 40,63 mg FeCl 3. iii. Ανάδευση του διαλύματος με vortex. iv. Προσθήκη πυκνής NH 3 25-29% με ρυθμό 0,2 ml/min για την ρύθμιση του ph σε 10,0 (απαιτούνται περίπου 0,5-0,6 ml). v. Η παραλαβή των μαγνητικών σωματιδίων γίνεται με μαγνητικό διαχωρισμό (χρήση ισχυρού μαγνήτη) και απομάκρυνση του διαλύματος με πιπέτα. 114
vi. Πλύση των μαγνητικών σωματιδίων με 10mL απεσταγμένο νερό, 3 φορές, και από 2 φορές με 10mL απόλυτης αιθανόλης. vii. Ξήρανση των σωματιδίων σε RT. Παρατηρήσεις : Η μοριακή αναλογία των κατιόντων σιδήρου είναι Fe 3+ : Fe 2+ =2 Η διαδικασία της καταβύθισης έλαβε χώρα σε RT. Επιπλέον η παραπάνω πειραματική πορεία πραγματοποιήθηκε, με τα ίδια ακριβώς βήματα, και αντικαθιστώντας τα χλωριούχα άλατα σιδήρου με θειικά. Δηλαδή οι συγκεντρώσεις των αντιδρώντων ήταν 0,0125 Μ (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) 2 *6H 2 O και 0,025 Μ NH 4 Fe(SO 4 ) 2 *12H 2 O. 2. Μέθοδος Β: Οξειδωτική αλκαλική υδρόλυση ιόντων σιδήρου σε θερμοκρασία περιβάλλοντος i. Παρασκευή διαλύματος, σε απιονισμένο νερό, 10 ml 0,05M FeCl 2 *4H 2 O (Fe 2+ ). ii. Ανάδευση του διαλύματος με vortex. iii. Προσθήκη διαλύματος 1M KOH για την δημιουργία υδατικού εναιωρήματος Fe(OH) 2. iv. Ρύθμιση ph σε 7.9 8,0, υπό ανάδευση με vortex. v. Η καταβύθιση λαμβάνει χώρα σε RT, για 2 h, υπό ανάδευση με vortex. vi. Η παραλαβή των μαγνητικών σωματιδίων γίνεται με μαγνητικό διαχωρισμό (χρήση ισχυρού μαγνήτη) και απομάκρυνση του διαλύματος με πιπέτα. viii. Πλύση των μαγνητικών σωματιδίων με 10 ml απιονισμένο νερό, 3 φορές, και από 2 φορές με 10 ml απόλυτης EtOH. vii. Ξήρανση των σωματιδίων σε RT. Παρατηρήσεις: Επιπλέον η παραπάνω πειραματική πορεία πραγματοποιήθηκε, με τα ίδια ακριβώς βήματα, αλλά με την αντικατάσταση του χλωριούχου άλατος σιδήρου με θειικό. Δηλαδή 0,05 Μ (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) 2 *6H 2 O. 115
3. Μέθοδος C: Οξειδωτική αλκαλική υδρόλυση ιόντων σιδήρου σε υψηλή θερμοκρασία Η πειραματική πορεία της μεθόδου Γ είναι ίδια με αυτή της μεθόδου Β της ενότητας 6.2. Η διαφορά είναι ότι η καταβύθιση του εναιωρήματος δεν γίνεται σε RT αλλά στους 90 o C για 2 ώρες υπό ανάδευση με vortex. Η συγκεκριμένη πορεία σύνθεσης μαγνητικών σωματιδίων πραγματοποιήθηκε και με θειικό άλας σιδήρου. 4. Σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων Fe 3 O 4 με συγκαταβίθυση σε αλκαλικό περιβάλλον 4.1.Πειραματική πορεία σύνθεσης i. Προετοιμασία 10 ml διαλύματος 0.5 M NaOH, σε μία τρίλαιμη σφαιρική φιάλη των 25 ml. ii. Απαέρωση του παραπάνω διαλύματος με He, υπό ανάδευση σε RT για 30 min. iii. Προετοιμασία υδατικού διαλύματος 0,4 M HCl και απαέρωση για 30 min. iv. Προσθήκη 0,163 g FeCl 3 (10-3 mol, Mr=162,5) και 0,0995 g FeCl 2 4H 2 O (5x10-4 mol, Mr=199) σε1 ml διαλύματος 0.4 M HCl και ανάδευση για 15 min. v. Θέρμανση του διαλύματος NaOH στους 40 C και προσθήκη του διαλύματος σιδήρου στάγδην, χρησιμοποιώντας σύριγγα. vi. Ανάδευση του μίγματος της αντίδρασης στους 80 C για 1 h. vii. Διαχωρισμός των σωματιδίων από την υγρή φάση με τη χρήση ισχυρού μαγνήτη, απόχυση του διαλύματος. viii. Πλύση του προϊόντος, 4 φορές, με 10 ml αιθανόλη ή νερό και ανάδευση σε λουτρό υπερήχων για 10 min. Διαχωρισμός του προϊόντος με μαγνήτη και απομάκρυνση του υπερκειμένου. ix. Ξήρανση υπό κενό στους 60 o C σε περιστρεφόμενη συσκευή ταχείας εξάτμισης (rotary evaporator). Η αναμενόμενη απόδοση είναι 0,12 g. 116
Παρατηρήσεις: Τα διαλύματα των αλάτων σιδήρου, είναι σημαντικό να χρησιμοποιούνται αμέσως μετά την παρασκευή τους για την αποφυγή της ωρίμανσης του Fe 3+ και της δημιουργίας γκαιτίτη (goethite, α-feooh). 4.2.Τροποποίηση των MNPs με αμινομάδες: i. Ανασύσταση των Fe 3 O 4 NPs (0,050 g) σε διάλυμα 15 ml καθαρής αιθανόλης με ανάδευση σε λουτρό υπερήχων για 1 h. ii. Προσθήκη του 3- αμινο πρόπυλ-τριαιθόξυσιλάνιο (3-Aminopropyltriethoxysilane - APTES) 0,3 ml και ανάδευση με υπερήχους για 1 h. iii. Χρήση μαγνήτη για διαχωρισμό του προϊόντος και απομάκρυνση του υπερκειμένου. iv. Πλύση του προϊόντος, με διάλυμα 2 ml καθαρής αιθανόλης, με τη χρήση λουτρού υπερήχων και μαγνητικός διαχωρισμός ή φυγοκέντρηση στις 1400 g για 10 min σε RT. Επανάληψη της διαδικασίας 4 φορές. v. Ξήρανση υπό κενό στους 60 C για 1h, σε rotary evaporator. Η απόδοση που αναμένεται είναι 45 mg. vi. Χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων με TEM, EDX ή FTIR. Παρατηρήσεις: Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλοι διαλύτες που αναμιγνύονται με το νερό όπως ακετονιτρίλιο, φορμαλδεϋδη, ισοπροπανόλη, τετραϋδροφουράνιο ή μεθανόλη. Οι διαλύτες αυτοί θα πρέπει να περιέχουν ίχνη νερού για την κατάλυση της αντίδρασης. Η αντίδραση μπορεί να πραγματοποιηθεί και για περισσότερη ώρα. Αυτό όμως αυξάνει τον κίνδυνο πολυμερισμού του σιλανίου και επιμόλυνσης της αντίδρασης. 117
4.3.Βιοτινυλίωση επικαλυμμένων με APTES Fe 3 O 4 NPs. i. Επαναιώρηση 1-2 mg MNPs σε 200 μl H2O, ανάδευση με υπερήχους για 15 min. ii. Παραλαβή 20 μl από το αιώρημα των σωματιδίων. Απομάκρυνση του υπερκειμένου και προσθήκη 200 μl 0,1 M διαλύματος φωσφορικών (phosphate buffer, ph 7,4). iii. Σε ένα γυάλινο δοκιμαστικό σωλήνα προστίθενται 1-2 mg sulfo-nhs-lc- Biotin και διαλυτοποιούνται σε 20 μl DMSO. Μεταφορά του διαλύματος στο αιώρημα των MNPs. iv. Επώαση για 2 h σε RT με ανακίνηση (vortex ή sonication). v. Πλύσεις με 200 μl phosphate buffer (PB). Ανάδευση με υπερήχηση (sonication) για 5 min. Επανάληψη του βήματος 4 φορές. vi. Απομάκρυνση του PB και προσθήκη 100 μl MAB-0,1 % BSA για blocking. Επώαση για 30 min με ανάδευση σε RT. Επανάληψη του βήματος (v). vii. Απομάκρυνση του PB. Προσθήκη 100μL του συζεύγματος στρεπταβιδίνηςαλκαλικής φωσφατάσης (SA-ALP) ( 10000 αραιωμένο σε MAB-0,1 % BSA). Επώαση για 30 min με ανάδευση (vortex) σε RT. viii. Επανάληψη του βήματος (v). Απομάκρυνση του PB. ix. Προσθήκη 100 μl 1 mm υποστρώματος π-νιτροφαίνυλο φωσφορικού εστέρα (p-nitrophenyl phosphate - pnpp) σε 0,01 M διαλύματος διαιθανολαμίνης (DEA) ph 10,0. x. Επώαση για 30 min. Παρατήρηση αλλαγής του χρώματος του διαλύματος σε κίτρινο. Παρατηρήσεις: Η απομάκρυνση των διαλυμάτων από τα MNPs έγινε με τη βοήθεια μαγνήτη. Από το αιώρημα των MNPs παραλαμβάνονται και 20 μl στα οποία δεν θα γίνει βιοτινυλίωση. Η πειραματική πορεία γίνεται όπως παραπάνω εκτός από το βήμα (iii). Το δείγμα αυτό θα αποτελεί το αρνητικό δείγμα (negative). 118
4.4. Αποτελέσματα-συμπεράσματα 4.4.i. Μέθοδος Α Κατά την προσθήκη του διαλύματος της πυκνής NH 3 στο διάλυμα χλωριούχων αλάτων σιδήρου, για τη ρύθμιση του ph, το διάλυμα από πορτοκαλί έγινε επιφανειακά μαύρο και με ανάδευση με vortex μετατράπηκε σε σκούρο καφέ. Μετά την ρύθμιση του ph σε 8,0 παρατηρήθηκε, με τη χρήση μαγνήτη, έντονη μαγνήτιση των σωματιδίων. Κάποια από τα σωματίδια συνέχιζαν να αιωρούνται. Αυτά απομακρύνθηκαν μαζί με το υπόλοιπο διάλυμα. Πιθανώς αυτά δεν είχαν μαγνητικές ιδιότητες. Δεν παρατηρήθηκε μαγνήτιση των σχηματισθέντων σωματιδίων, όταν αυτά βρίσκονταν εκτός διαλύματος. Η μαγνήτιση παρατηρήθηκε μόνο όταν υπήρχε διάλυμα είτε αιθανόλης είτε απιονισμένου νερού. Κατά την προσθήκη NH 3 για ρύθμιση του ph, στο διάλυμα των θειικών αλάτων σιδήρου, το διάλυμα από πορτοκαλί έγινε σκούρο καφέ. Στη συνέχεια με τη χρήση μαγνήτη παρατηρήθηκε μέτρια μαγνήτιση. Μετά από μερικά λεπτά τα σωματίδια συγκεντρώθηκαν στην επιφάνεια του δοκιμαστικού σωλήνα που βρισκόταν ο μαγνήτης. Εξαιτίας αυτού παρουσιάστηκε δυσκολία κατά τη διάρκεια των εκπλύσεων καθώς τα σωματίδια που δεν μαγνητίζονταν καθίζαναν στο κάτω μέρος του δοκιμαστικού σωλήνα. Μετά την ξήρανση των νανοσωματιδίων παρατηρήθηκε μαγνήτιση και εκτός διαλύματος. 4.4.ii. Μέθοδος Β Όταν προστέθηκε διάλυμα 1Μ ΚΟΗ, για ρύθμιση ph με τη χρήση πεχαμέτρου, το διάλυμα από ανοιχτό πορτοκαλί έγινε επιφανειακά μαύρο και με την ανάδευση με vortex έγινε σκούρο καφέ. Μετά την ρύθμιση του ph με την βοήθεια μαγνήτη παρατηρήθηκε έντονη μαγνήτιση. Η μαγνήτιση έγινε πιο γρήγορα από ότι στην Μέθοδο Α, διότι τα σωματίδια συγκεντρώθηκαν σχεδόν αμέσως στο τοίχωμα του δοκιμαστικού που τοποθετήθηκε ο μαγνήτης. Κατά τη διάρκεια των εκπλύσεων με νερό και αιθανόλη παρουσιάστηκε δυσκολία καθώς τα σχηματισθέντα σωματίδια κολλούσαν στα τοιχώματα του δοκιμαστικού 119
σωλήνα. Τα σωματίδια δεν παρουσίαζαν μαγνητικές ιδιότητες όταν βρίσκονταν εκτός του διαλύματος. Η ξήρανση έγινε με τον ίδιο τρόπο σε RT. Όταν προστέθηκε ΚΟΗ 1Μ,στο διάλυμα του δισθενούς θειικού σιδήρου για ρύθμιση του ph, το διάλυμα από κίτρινο άλλαξε σε πράσινο. Με τη χρήση παρατηρήθηκε ασθενής έως καθόλου μαγνήτιση των σχηματισθέντων σωματιδίων. Αυτό καθιστούσε τη διαδικασία πλύσης εξαιρετικά δύσκολη με αποτέλεσμα τα σωματίδια να μη μπορούν να απομακρυνθούν από το διάλυμα. Το διάλυμα με το εναιώρημα των σωματιδίων φυλάχθηκε στους 25. 4.4.iii. Μέθοδος C Κατά την διαδικασία διαλυτοποίησης του στερεού σε απιονισμένο H 2 O με θέρμανση, το διάλυμα από ανοιχτό πορτοκαλί μετατράπηκε σε έντονο καφέ. Όταν προστέθηκε ΚΟΗ, 1Μ, για ρύθμιση ph, το χρώμα του διαλύματος άλλαξε σε μαύρο. Κατά τη διάρκεια των πλύσεων παρουσιάστηκε η ίδια δυσκολία με τη μέθοδο Β καθώς τα σωματίδια κολλούσαν πιο έντονα στα τοιχώματα του δοκιμαστικού με αποτέλεσμα να μην μαγνητίζονται ομοιογενώς και να μην μπορεί να απομακρυνθεί το διάλυμα χωρίς την απώλεια των σωματιδίων. Αυτό μπορεί να οφείλεται είτε στην μη αντίδραση του Fe 2+, είτε στην δημιουργία νανοσωματιδίων και άρα στην ασθενή μαγνήτισή τους. Τα σχηματισμένα μαγνητικά σωματίδια παραλαμβάνονται και επεξεργάζονται με τον ίδιο τρόπο. Ομοίως τα σωματίδια δεν παρουσίαζαν μαγνητικές ιδιότητες όταν βρίσκονταν εκτός διαλύματος. Όταν προστέθηκε ΚΟΗ 1Μ,στο διάλυμα του δισθενούς θειικού σιδήρου για ρύθμιση του ph, το διάλυμα από κίτρινο άλλαξε σε έντονο πράσινο. Μετά την θέρμανση στους 90 ο C το διάλυμα από σκούρο πράσινο άλλαξε σε μαύρο. Κατά τη διάρκεια των πλύσεων με νερό και αιθανόλη παρουσιάστηκε και εδώ δυσκολία καθώς τα σχηματισθέντα σωματίδια κολλούσαν στα τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα. Τα σωματίδια ξηράνθηκαν και αποθηκεύτηκαν. 4.4.iv. Γενικά συμπεράσματα μεθόδων Α,Β, C: Όλα τα σωματίδια που συντέθηκαν, μετά τις πλύσεις και την ξήρανση αποθηκεύτηκαν σε μικροφυγοκεντρικούς σωλήνες τύπου eppendorf. 120
Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα στις παραπάνω πειραματικές πορείες είναι οι εξής: Μέθοδος Α: 2 Fe 3+ + Fe 2+ + + 8 NH 3 + 4 H 2 O Fe 3 O 4 + 8 NH 4 Μέθοδος Β: Fe 2+ +2OH- Fe(OH) 2 (I) 3Fe(OH) 2 +1/2O 2 Fe(OH) 2 + 2FeOOH+ H 2 O (II) Fe(OH) 2 +2FeOOH Fe 3 O 4 +2H 2 O (III) Μέθοδος C: 3 Fe(OH) 2 Fe 3 O 4 + H 2 +2H 2 O Στις πειραματικές πορείες που χρησιμοποιήθηκαν τα χλωριούχα άλατα σιδήρου συγκριτικά με τις μεθόδους Α και Β, παρουσιάστηκε πιο έντονη μαγνήτιση των σωματιδίων στη μέθοδο C. Σχήμα 6.1: Σύνθεση μαγνητικών σωματιδίων από χλωριούχα άλατα δισθενούς και τρισθενούς σιδήρου. Απεικονίζονται οι μέθοδοι Α και Β κατά τη διαδικασία μαγνήτισης με τη βοήθεια του μαγνήτη. 121
Σχήμα 6.2: Παρουσιάζονται τα σχηματισθέντα σωματίδια της μεθόδου C κατά τη θέρμανση και κατά τη διαδικασία μαγνήτισης. Όσον αφορά τις πειραματικές πορείες που εκτελέστηκαν με τα θειικά άλατα δισθενούς κι τρισθενούς σιδήρου, παρατηρήθηκε με τη βοήθεια μαγνήτη εντονότερη μαγνήτιση από Α και C μέθοδο. Στη μέθοδο Β τα σωματίδια δεν μαγνητίστηκαν σχεδόν καθόλου. Σχήμα 6.3: Σύνθεση μαγνητικών σωματιδίων από θειικά άλατα δισθενούς και τρισθενούς σιδήρου. Απεικονίζονται οι μέθοδοι Α, Β και C κατά τη διαδικασία μαγνήτισης, με τη βοήθεια του μαγνήτη. Συγκριτικά στις μεθόδους Α, Β και C με τα χλωριούχα άλατα σιδήρου η μαγνήτιση γινόταν πιο γρήγορα και πιο έντονα. Στις μεθόδους Α και C με τα θειικά η μαγνήτιση ήταν πιο αργή, αφού χρειάστηκε χρόνος περίπου 1-2 λεπτά παραπάνω για να συγκεντρωθούν στο τοίχωμα του δοκιμαστικού σωλήνα που βρισκόταν τοποθετημένος ο μαγνήτης. Επιπλέον η δυσκολία αυξανόταν καθώς τα σωματίδια προσκολλούσαν έντονα στα τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα. 122
Η μη ομοιογενής μαγνήτιση των σωματιδίων οφείλεται στους διαφορετικούς πληθυσμούς σωματιδίων που συντέθηκαν, όπως η δημιουργία νανοσωματιδίων στα διαλύματα που δεν έγιναν διαυγή μετά τη χρήση μαγνήτη. Ακόμα μπορεί να οφείλεται στην μη ολοκλήρωσης της αντίδρασης III. 4.4.v. Νανοσωματίδια Fe 3 O 4 Κατά την προσθήκη του διαλύματος των χλωριούχων αλάτων σιδήρου, με αναλογία Fe 3+ :Fe 2+ = 2, παρατηρείται επιφανειακά ο σχηματισμός δομών μαύρου χρώματος. Με ανάδευση όλο το διάλυμα μετατρέπεται σε μαύρο. Τα σωματίδια που συντέθηκαν μετά τη ξήρανση ζύγιζαν 118 mg. Από αυτά χρησιμοποιήθηκαν τα 50,4 mg για περεταίρω επεξεργασία με το αντιδραστήριο APTES. Τα τροποποιημένα σωματίδια μετά την ξήρανσή τους ζύγιζαν 46 mg. Σχήμα 6.4: Απεικονίζεται το διάλυμα των σχηματιζόμενων ΜNPs, της ενότητας 6.4, με τη μέθοδο της συγκαταβύθισης σε αλκαλικό περιβάλλον (1). Στις εικόνες 2 και 3 παρουσιάζεται ο μαγνητικός διαχωρισμός του προϊόντος κατά τη διάρκεια των πλύσεων. 123
Σχήμα 6.5: Απεικονίζεται το διάλυμα των τροποποιημένων με APTES, Fe-NH 2 NPs (1). Στις εικόνες 2 και 3 παρουσιάζεται ο μαγνητικός διαχωρισμός του προϊόντος κατά τη διάρκεια των πλύσεων. Τα σωματίδια που σχηματίστηκαν έλκονταν ισχυρά από το μαγνήτη τόσο πριν όσο και μετά την τροποποίηση της επιφάνειάς τους (Σχήμα 6.3 και 6.4 αντίστοιχα). Στη συνέχεια τα NPs τροποποιούνται επιφανειακά, με τη χρήση του αντιδραστηρίου APTES. Το αντιδραστήριο αυτό προσθέτει στην επιφάνεια των σωματιδίων αμινομάδες, με αποτέλεσμα να τα καθιστά βιοσυμβατά για περεταίρω συζεύξεις με διάφορα βιομόρια. Σχήμα 6.6: Στις εικόνες Α παρουσιάζονται τα Fe 3 O 4 και τα Fe 3 O 4 -NH 2 (τροποποιημένα με αμινομάδες) σε κλίμακα 50 nm. Στις εικόνες Β παρουσιάζονται τα Fe3O4 και τα Fe3O4-NH 2 σε κλίμακα 20 nm. 124
Τόσο τα τροποποιημένα όσο και τα μη τροποποιημένα MNPs, χαρακτηρίστηκαν με την τεχνική της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διαπερατότητας (TEM). Τα δείγματα διαλύθηκαν σε νερό και στη συνέχεια ξηράνθηκαν σε RT, πάνω σε φύλλα χαλκού. Από το Σχήμα 6.6 παρατηρούμε ότι και τα 2 δείγματα δεν διαφέρουν όσον αφορά το σχήμα τους και τη διάταξή τους. Στα τροποποιημένα σωματίδια δεν παρατηρείται κάποιο περίβλημα, λόγω του αντιδραστηρίου APTES. Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι τα νανοσωματίδια είχαν κατά μέσο όρο μέγεθος περίπου 10 nm. Στα MNPs που τροποποιήθηκαν με αμινομάδες, από το αντιδραστήριο APTES, ακολούθησε βιοτινυλίωση (σχήμα 6.7). Σχήμα 6.7: Παρουσιάζονται τα τροποποιημένα με APTES Fe 3 O 4 NPs και η σύζευξη με την Sulfo-NHS-LC-LC- Βιοτίνη. Σχήμα 6.8 : Παρουσιάζονται τα βιοτινυλιωμένα NPs και η σχηματική απεικόνιση της αντίδρασης με το σύζευγμα SA-ALP. 125
Η στρεπταβιδίνη αποτελείται από τέσσερις πανομοιότυπες υπομονάδες, καθεμία από τις οποίες περιέχει μια θέση δέσμευσης για τη βιοτίνη (Σχήμα 6.9). Η αλληλεπίδραση της βιοτίνης με τη στρεπταβιδίνη είναι μια από τις ισχυρότερες που απαντώνται στη φύση, με σταθερά διάστασης 10-15 Μ. Λόγω της υψηλής αυτής συγγένειας, το σύζευγμα μένει σταθερό σε υψηλές τιμές ph. (Chaiet et al., 1964). Σχήμα 6.9: Απεικονίζεται το τετραμερές της στρεπταβιδίνης με 2 προσδεμένες βιοτίνες, καθώς και η δομή της βιοτίνης. (https://en.wikipedia.org/wiki/streptavidin#/media/file:tetramer.png, https://en.wikipedia.org/wiki/biotin#/media/file:biotin_structure.svg) Όπως φαίνεται στο σχήμα 6.7 η στρεπταβιδίνη είναι συζευγμένη με την αλκαλική φωσφατάση (ALP). Η ALP ανήκει στην κατηγορία των υδρολασών, δηλαδή χρησιμοποιεί μόρια ύδατος για να διασπάσει έναν εστερικό δεσμό φωσφορικού οξέος. Η παρουσία του ενζύμου, σε αλκαλικό περιβάλλον διαιθανολαμίνης (DEA), στη συγκεκριμένη πειραματική πορεία σε ph 10,0, καταλύει την υδρόλυση του υποστρώματος π- φωσφορικού νιτροφαινυλο εστέρα (p-npp) προς σχηματισμό της έγχρωμης ένωσης π-νιτροφαινόλη (pnp) και φωσφορικού οξέος. 126
Η αντίδραση που λαμβάνει χώρα κατά την υδρόλυση του υποστρώματος p-npp, από την ALP, σε p-np (σχήμα 6.10) έχει ως αποτέλεσμα την μετατροπή του διαλύματος από διαγές σε κίτρινο. Το τελικό έγχρωμο προϊόν της υδρόλυσης της pnpp, η π-νιτροφαινόλη απορροφά στα 405 nm, όπως φαίνεται και από το φάσμα απορρόφησής της στο σχήμα 6.11. Σχήμα 6.10: Παρουσιάζεται η αντίδραση υδρόλυσης του υποστρώματος pnpp από την ALP, προς το σχηματισμός του έγχρωμου προϊόντος pnp και φωσφορικού οξέος. Οι τελικές συνθήκες για την ποσότητα των βιοτινυλιωμένων NPs, του blocking, αλλά και της συγκέντρωσης του συζεύγματος SA-ALP, προέκυψαν ύστερα από διάφορες δοκιμές οι οποίες περιγράφονται παρακάτω. 127
Σχήμα 6.11: Παρουσιάζεται το φάσμα απορρόφησης της π-νιτροφαινόλης, που παράγεται κατά την υδρόλυση του υποστρώματος pnpp, σε αλκαλικό ph (Shokouhimehr M, 2015). Αρχικά ζυγίστηκαν περίπου 1 mg τροποποιημένων με APTES NPs. Τα σωματίδια ανασυστάθηκαν με τη χρήση λουτρού υπερήχων σε 200 μl νερό. Αφού παρατηρήθηκε η δυνατότητα χειρισμού τους με τη χρήση μαγνήτη συνέχισε η διαδικασία βιοτινυλίωσής τους. Παρασκευάσθηκε και ένα δείγμα σωματιδίων στα οποία δεν έγινε βιοτινυλίωση (negative). Στη συνέχεια ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο της ενότητας 4.3 του Κεφαλαίου 6, χωρίς όμως τη διαδικασία του blocking, με τη χρήση διαλύματος 0,1 M NaHCO 3 ph 8,4 για πλύσεις και αραίωση του συζεύγματος SA-ALP 1000 φορές. Σύμφωνα με τα παραπάνω η υδρόλυση του υποστρώματος έπρεπε να συμβεί μόνο στα βιοτινυλιωμένα σωματίδια, όμως έντονο κίτρινο χρώμα παρουσιάστηκε και στο αρνητικό δείγμα όπως φαίνεται στο σχήμα 6.12. Σχήμα 6.12 : Παρουσιάζονται τα δείγματα με τα βιοτινυλιωμένα NPs (αριστερά) και το αρνητικό δείγμα (δεξιά). Η πειραματική πορεία ακολουθήθηκε και χωρίς την προσθήκη του συζεύγματος SA- ALP, για αποκλεισμό της πιθανότητας τα NPs του οξειδίου του σιδήρου να καταλύουν το υπόστρωμα pnpp. Δεν παρατηρήθηκε όμως η εμφάνιση κίτρινου χρώματος στο διάλυμα της αντίδρασης. Η παραπάνω διαδικασία πραγματοποιήθηκε ξανά. Τη δεύτερη φορά έγινε blocking τόσο στα βιοτινυλιωμένα NPs όσο και στο αρνητικό δείγμα, καθώς όπως φάνηκε από στο αρνητικό δείγμα γινόταν μη ειδική πρόσδεση της SA-ALP. Αυτή συνέβαινε πιθανώς από το περίβλημα του αντιδραστηρίου APTES που βρισκόταν στην επιφάνεια των NPs. Η διαδικασία του blocking περιλαμβάνει την κάλυψη των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης του συζεύγματος της SA-ALP. Το διάλυμα blocking περιέχει 0,1% BSA, η 128
οποία καταλαμβάνει τις πιθανές, μη ειδικές, θέσεις που θα μπορούσε να προσδεθεί η στρεπταβιδίνη. Το σύζευγμα SA-ALP χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 5000, όμως δε σημειώθηκε καμία αλλαγή αφού το διάλυμα της αντίδρασης του αρνητικού δείγματος έγινε ξανά κίτρινο. Το τελικό πρωτόκολλο προέκυψε ύστερα από δοκιμασία χειρισμού μικρής ποσότητας NPs. Από το αιώρημα του 1 mg των σωματιδίων σε 200 μl νερό έγινε παραλαβή 20 μl. Συνεπώς η μάζα των σωματιδίων μειώθηκε στο 1/10, περίπου. Αφού παρατηρήθηκε ότι τα σωματίδια διαχωρίζονταν εύκολα, με τη χρήση μαγνήτη, ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία Το σύζευγμα SA-ALP δοκιμάστηκε σε αραίωση 5000 και 10000. Παρασκευάσθηκε και αυτή τη φορά αρνητικό δείγμα, όμως αφορούσε τη διαδικασία ή όχι του blocking. Δηλαδή στο αρητικό δείγμα δεν έγινε blocking με διάλυμα MAB- 0,1% BSA. Στη συνέχεια ακολούθησαν, και στα δείγματα με blocking και στα δείγματα χωρίς το διαλυμα blocking, οι εκπλύσεις με NaHCO 3 και η προσθήκη ενζύμου και υποστρώματος. Σε αυτή τη δοκιμή παρατηρήθηκε ότι το blocking λειτούργησε, ίσως λόγω της μικρότερης επιφάνειας των σωματιδίων, και δεν έγινε προσρόφηση του SA- ALP. Έτσι διάλυμα κίτρινου χρώματος εμφανίστηκε μόνο στα βιοτινυλιωμένα νανοσωματίδια που δεν έγινε το blocking (σχήμα 6.13). Σχήμα 6.13: Στον σωλήνα 1 (αριστερά) φαίνεται το διάλυμα των NPs στα οποία έγινε η διαδικασία blocking και στο 2 (δεξιά) φαίνονται τα NPs του οξειδίου του σιδήρου στα οποία δεν έγινε blocking. Η αραίωση του συζεύγματος SA-ALP ήταν 10000. 129
Από τα παραπάνω προέκυψε τελικά η πειραματική πορεία της ενότητας 6.4.3. Το διάλυμα εκπλύσεων άλλαξε από NaHCO 3 και ph 8,4 σε διάλυμα φωσφορικών με ph 7,4. Αυτό προέκυψε από το αντιδραστήριο APTES, το οποίο περιέχει σιλανομάδες. Αυτές σε αλκαλικά ph υδρολύονται, με αποτέλεσμα να καθιστούν το αντιδραστήριο ασταθές. Από το χρονικό διάστημα που προστέθηκε το υπόστρωμα pnpp στο αιώρημα των νανοσωματιδίων, παραλαμβάνονταν φωτογραφίες ανά συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα. Σχήμα 6.14: Παρουσιάζονται το αρνητικό δείγμα και το θετικό δείγμα, ως προς την βιοτινυλίωση, και η αντίδρασης ALP και pnpp σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα. Στο σχήμα 6.14 βλέπουμε φωτογραφίες τόσο του αρνητικού δείγματος όσο και του θετικού, ως προς τη βιοτινυλίωση σε χρόνους επώασης του μίγματος της αντίδρασης 4, 6, 23, 36 και 42 min. Μέχρι και μισή ώρα μετά την επώαση, παρατηρήθηκε ότι το διάλυμα γινόταν όλο και πιο έντονα κίτρινο. Στο αρνητικό δείγμα δεν παρουσιάστηκε αλλαγή του χρώματος του διαλύματος. Στα 23 min επώασης εμφανίστηκε πιο έντονα το κίτρινο διάλυμα, ενώ μετά το πέρας των 30 min παρατηρήθηκε μείωση της έντασής του, ίσως λόγω προσρόφησης του έγχωμου προϊόντος από τα νανοσωματίδια. Συμπερασματικά τα MNPs οξειδίου του σιδήρου φαίνεται να είναι υποσχόμενα για μελλοντικές εφαρμογές, τόσο στην ανάλυση χρησιμοποιώντας και άλλα είδη συζευγμάτων βιομορίων, όσο και αλλού. Η μη τοξική τους σύσταση, το μέγεθος, η διαλυτότητά τους αλλά και η βιοσυμβατότητα, ιδιαίτερα των τροποποιημένων με αμινομάδες MNPs καθιστούν αναγκαία τη μελέτη των ιδιοτήτων τους και την ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων με χρήση των MNPs ως στερεό υπόστρωμα ή ιχνηθέτες. 130