Υπεύθυνη Καθηγήτρια: ΕΥΣΤΡΑΤΙΟΥ ΜΑΡΙΑ- ΑΔΑΜΑΝΤΙΑ ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΗΣ ΘΑΛΑΣΣΑΣ

Υπεύθυνη Καθηγήτρια: ΕΥΣΤΡΑΤΙΟΥ ΜΑΡΙΑ- ΑΔΑΜΑΝΤΙΑ ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΗΣ ΘΑΛΑΣΣΑΣ

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Αριθμός Σελίδας 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1. 1. Μικροβιολογική ποιότητα θαλασσινού νερού 1. 1. 1. Πηγές μικροβιακής μόλυνσης της θάλασσας 1. 2. Παρασιτικά πρωτόζωα σε επιφανειακά και υπόγεια νερά 2 3 4 1. 3. Βιολογικός κύκλος & επιπτώσεις στην υγεία των υπό μελέτη οργανισμών 9 1.3.1. Γένος: Giardia 1.3.2. Γένος: Cryptosporidium 1.3.3. Γένος: Toxoplasma 9 13 15 2. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 20 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 21 3.1. Γεωγραφική τοποθέτηση 3.1.1. Το Νησί της Λέσβου 3.1.2. Πόροι του νησιού 3.2. Μεθοδολογίες 3.2.1. Δειγματοληψία 3.2.2. Κροκύδωση (ιζηματοποιήση) με Al 2 (SO 4 ) 3 3.2.3. Εξαγωγή DNA 21 21 21 28 28 29 30

3.2.3.1. Στάδιο Ι 3.2.3.2. Στάδιο ΙΙ 30 32 3.2.4. Πολλαπλασιασμός DNA 3.2.4.1. Πολλαπλασιασμός DNA για το Toxoplasma 1. Πρωτογενής ή Εξωτερικός Πολλαπλασιασμός 2. Δευτερογενής ή Εσωτερικός Πολλαπλασιασμός 3.2.4.2. Πολλαπλασιασμός DNA για τη Giardia 1. Πρωτογενής ή Εξωτερικός Πολλαπλασιασμός 2. Δευτερογενής ή Εσωτερικός Πολλαπλασιασμός 3.2.5. Ηλεκτροφόρηση 33 33 33 34 34 34 35 36 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 38 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 47 6. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 53 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 57

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα παρασιτικά πρωτόζωα αποτελούν ιδιαίτερα παθογόνους μικροοργανισμούς, ειδικά όταν βρεθούν στο εσωτερικό του σώματος του ξενιστή τους και καταλήξουν στην εντερική χώρα. Το φυσικό περιβάλλον, που τις περισσότερες των περιπτώσεων προσφέρει αντίξοες συνθήκες, όχι απλά για την ανάπτυξη, αλλά και για την επιβίωση των περισσότερων ειδών μικροοργανισμών, φαίνεται πως -έως ένα βαθμό- συντηρεί ή επιτρέπει την επιβίωση των περισσοτέρων παρασιτικών πρωτόζωων. Αυτό συμβαίνει διότι οι συγκεκριμένοι μικροοργανισμοί είναι γενικά πιο ανθεκτικοί σε μη- ιδανικές συνθήκες από ότι άλλες κατηγορίες, όπως επί παραδείγματι τα μονήρη (Χαραλαμπίδης, 1994). Η ιδιότητα αυτή των παρασιτικών πρωτόζωων τα καθιστά σοβαρούς παθογόνους παράγοντες, σε περίπτωση εισαγωγής τους σε σώμα ξενιστή. Παρόλα αυτά, όταν βρεθούν στο φυσικό περιβάλλον, πρακτικά είναι ακίνδυνοι, εφόσον απαραίτητη προϋπόθεση για την περαιτέρω επιβίωση και ανάπτυξή τους είναι το σώμα ενός ξενιστή. Κατά συνέπεια δεν έχει παρατηρηθεί καμία επίδραση των παρασιτικών πρωτόζωων στο φυσικό περιβάλλον, όπως αναφορικά έχουν οι μύκητες ως φυσικοί αποικοδομητές (Χαραλαμπίδης 1995). Πάρα ταύτα, η παρουσία τους προκαλεί έμμεσα αποτελέσματα όταν εισαχθούν στο τροφικό πλέγμα, προκαλώντας ασθένειες σε ζώα και ανθρώπους, επιφέροντας συνεχείς επιμολύνσεις. Τα παρασιτικά πρωτόζωα εντοπίζονται στη φύση κυρίως στο υδάτινο περιβάλλον, σε νερά χειμάρρων και ποταμών, σε λίμνες καθώς και σε υπόγεια ύδατα και σπανίως στη θάλασσα (Χαραλαμπίδης, 1995). Αυτό συμβαίνει διότι το θαλάσσιο περιβάλλον είναι ιδιαίτερα αφιλόξενο στους αλλόχθονους μικροοργανισμούς, λόγω της διαφοράς της θερμοκρασίας και της αλατότητας, μεταβολής της θερμοκρασίας μεταξύ της χέρσου και της θάλασσας και, όσον αφορά στον ελληνικό χώρο, λόγω της ηλιοφάνειας. Ένας άλλος λόγος που δεν υπάρχουν στοιχεία για την παρουσία παρασιτικών πρωτόζωων στη θάλασσα είναι ότι δεν έχουν γίνει πολλές έρευνες σχετικές με την ανίχνευση τους στο θαλάσσιο περιβάλλον, τουλάχιστον βάσει της διαθέσιμης βιβλιογραφίας. Μελλοντικά ενδεχομένως, η θάλασσα να αποτελέσει πόλο έλξης επιστημονικών μελετών, σχετικών με τους εξεταζόμενους μικροοργανισμούς.

1. 1. Μικροβιολογική ποιότητα θαλασσινού νερού Η μικροβιολογική ποιότητα του θαλασσινού νερού, σε ότι αφορά μικροοργανισμούς παθογόνους για τον άνθρωπο, εξαρτάται από το μέγεθος των εισροών από τη χέρσο. Επίσης, η έκταση της μόλυνσης εξαρτάται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες, τη ροή και διασπορά των οργανισμών ως αποτέλεσμα της παράκτιας υδροδυναμικής, το ρυθμό θανάτου ως συνέπεια της έκθεσης σε UVακτινοβολία (Solic and Krstulovic, 1992), και του ρυθμού απόθεσης (Obiri- Danso and Jones, 2000). Στη σχετική βιβλιογραφία αναφέρεται πληθώρα μελετών που συσχετίζουν τις μικροβιακές βακτηριακές συγκεντρώσεις με τις εισροές από τη χέρσο και άλλα περιβαλλοντικά φαινόμενα, όπως η βροχόπτωση. Οι Crowther et al. (2000), διεξήγαγαν μελέτη στη δυτική ακτή Fylde στη Μ. Βρετανία με σκοπό την ανίχνευση μικροβιολογικών δεδομένων, σε συνδυασμό με δεδομένα που περιγράφουν τις περιβαλλοντικές συνθήκες πριν τη δειγματοληψία. Στόχος ήταν η δημιουργία πληρέστερης αντίληψης όσον αφορά τις περιόδους και τις συνθήκες κατά την κολυμβητική περίοδο (Μάιος- Σεπτέμβριος), όταν η ποιότητα του νερού κολύμβησης είναι εκτός προδιαγραφών, τη σχετική σημασία των διαφορετικών τύπων πηγών μόλυνσης και τους περιβαλλοντικούς παράγοντες που επηρεάζουν τη διασπορά, την καθίζηση και το θάνατο των μικροβιακών οργανισμών στην παράκτια ζώνη. Διαπιστώθηκε ότι οι υψηλότερες βακτηριακές συγκεντρώσεις σχετίζονται στενά με προηγηθείσα βροχόπτωση, καθώς και με τις απορροές λυμάτων. Παρόμοια μελέτη των Crowther et al. (2002), που αφορούσε στη διασπορά των δεικτών κοπρανώδους μόλυνσης στην παράκτια ζώνη κατά την κολυμβητική περίοδο από το Μάιο έως το Σεπτέμβριο, έδειξε ότι ειδικά υπό συνθήκες υψηλής ροής, χείμαρροι και ποτάμια, μεταφέρουν υψηλότερους αριθμούς εισερχομένων οργανισμών στη θάλασσα, από ότι οι εκροές λυμάτων. Κατά συνέπεια, επενδύσεις που έγιναν στην υποδομή του αποχετευτικού συστήματος, και τις εργασίες επεξεργασίας λυμάτων των παράκτιων πόλεων στη Μ. Βρετανία, κάποιες φορές απέτυχαν να βελτιώσουν επαρκώς τη μικροβιακή ποιότητα υδάτων των παράκτιων περιοχών. Έχει γίνει αποδεκτό σήμερα ότι οι αποπλύσεις αγροτικής γης αποτελούν σημαντική μη σημειακή πηγή μόλυνσης (Obiri- Danso and Jones, 2000).

1. 1. 1. Πηγές μικροβιακής μόλυνσης της θάλασσας 1. Μη σημειακές πηγές μόλυνσης Οι μη σημειακές πηγές μόλυνσης αποτελούν ένα σημαντικό περιβαλλοντικό πρόβλημα στη διαχείριση της ποιότητας των υδάτων. Τέτοιο είδος μόλυνσης δημιουργείται από τη βροχόπτωση, το λιώσιμο του χιονιού ή όταν το νερό των αρδεύσεων ρέει στη χέρσο ή εισχωρεί στο έδαφος, παρασύρει επιμολυντές, και τους αποθέτει στα ποτάμια, τις λίμνες και τα παράκτια ύδατα ή τα εισάγει στα υπόγεια ύδατα (Bhuyan et al., 2003). Παρόλα αυτά, λίγα είναι γνωστά για τις χωρικές και χρονικές κατανομές των συγκεντρώσεων των δεικτών κοπρανώδους μόλυνσης για τα πεδία- αποδέκτες στη Μ. Βρετανία, ή για τις πηγές και τους καθοριστικούς παράγοντες που τους επηρεάζουν. 2. Σημειακές πηγές μόλυνσης Στις ανεπτυγμένες χώρες τον 20ό αιώνα κατασκευάστηκαν πολυάριθμα αποχετευτικά συστήματα και συστήματα επεξεργασίας των λυμάτων. Τις τελευταίες δεκαετίες, η ταχεία αστική ανάπτυξη οδήγησε σε χαρακτηριστικές αλλαγές σχετικά με τις τεχνικές αρχές του σχεδιασμού και της λειτουργίας των αποχετευτικών συστημάτων. Στην πράξη, πολλά νέα προβλήματα εμφανίστηκαν, όπως η μείωση της ποιότητας του νερού ως συνέπεια των συνενωμένων ή μερικώς διαχωρισμένων δικτύων αποχέτευσης, τα οποία χρησιμοποιούνται σε άλλες περιοχές περισσότερο και σε άλλες χώρες λιγότερο συχνά. Αυτές οι ροές μεταφέρουν σημαντικά φορτία μόλυνσης, λόγω των αργών ρυθμών διάλυσης και απόπλυσης των επιμολυντών από τη λεκάνη απορροής και την επαναιώρηση υλικών που προηγουμένως είχαν καθιζήσει (Ferreira et al., 2002). Στην μεσογειακή λεκάνη πιο συγκεκριμένα, ο πληθυσμός είναι συγκεντρωμένος στις αστικές περιοχές κυρίως, κτισμένες στην εγγύς παράκτια ζώνη. Οι εκροές των οικιακών λυμάτων συχνά καταλήγουν στη θάλασσα, με χαρακτηριστικές επιπτώσεις μόλυνσης των περιοχών κολύμβησης. Ένας επιπλέον παράγοντας που αποτελεί πιθανό κίνδυνο για τη δημόσια υγεία είναι οι αστικοί χείμαρροι. Οι αστικοί χείμαρροι είναι σημαντικά στοιχεία των πόλεων, αλλά συχνά περιέχουν κακής ποιότητας ύδατα. Οι γνώσεις για την επιρροή των βροχοπτώσεων επί των αστικών ποτάμιων υδάτων, των απορροών και κυρίως της μεταφοράς λεπτόκοκκων ιζημάτων, είναι περιορισμένες.

1. 2. Παρασιτικά πρωτόζωα σε επιφανειακά και υπόγεια νερά Τα παρασιτικά πρωτόζωα είναι μικροοργανισμοί που έχουν κινήσει το ενδιαφέρον, κυρίως λόγω του ότι είναι παθογόνοι στον άνθρωπο καταρχήν, και κατά δεύτερο λόγο στα οικόσιτα ζώα, μέσω των οποίων μολύνονται και νοσούν και οι άνθρωποι. Η μικροβιολογική μόλυνση του γλυκού νερού οφείλεται στις ατμοσφαιρικές κατακρημνίσεις, την απόπλυση των λεκανών απορροής, τις εισροές αστικών και γεωργικών λυμάτων. Τα γεωργικά λύματα εμφανίζονται ως μια απειλή μόλυνσης για τα οικοσυστήματα γλυκού νερού καθώς και για την ανθρώπινη υγεία. Η μεταπολεμική εντατικοποίηση της γεωργίας είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της ανησυχίας για τις συνέπειές της επί της ποιότητας των υδάτων (Hooda et al., 2001). Στη Σκοτία, ένα 26% των σοβαρά μολυσμένων χειμάρρων οφείλεται στη διάχυση των γεωργικών λυμάτων και έχει προβλεφθεί να είναι η μόνη σημαντική πηγή μόλυνσης του γλυκού νερού έως το 2010. Σήμερα είναι αποδεκτό ότι το εύρος των ενδεχόμενων παθογόνων παραγόντων είναι τεράστιο και πολύπλοκο αλλά περιέχει τους οργανισμούς E. coli, Salmonella, Giardia, Cryptosporidium, εκ των οποίων όλοι προκαλούν σοβαρές ασθένειες όταν είναι παρόντες στο πόσιμο νερό (Geldreich, 1989). Η έρευνα των Rodgers et al. (2003), στον παραπόταμο Newmills Burn, ένα μικρό αλλά γεωργικά υπέρ- αξιοποιημένο παραπόταμο του ποταμού Don στο Aberdeenshire της Σκοτίας, έδειξε ότι κατά τη διάρκεια της ροής μέσα από την περιοχή απόπλυσης, το νερό του ποταμοχειμάρρου υπέστη σοβαρή μόλυνση από κοπρανώδη κολοβακτηρίδια. Αυτά προέρχονταν από τις κύριες εισροές εκτάσεων γης που έχουν αξιοποιηθεί ως βοσκότοποι και από την απελευθέρωση οργανικών καταλοίπων. Σημειακές πηγές κοπρανωδών κολοβακτηριδίων, όπως τα λύματα από αγροικίες, εμφανίζονται ως σημαντικές στην ενίσχυση του χωρικού προτύπου της μόλυνσης. Σαφής χρονική μεταβολή παρατηρήθηκε σε σχέση με την υδρολογική συμπεριφορά της λεκάνης απορροής. Μεγαλύτερη ροή και πιο συχνές αποπλύσεις των βακτηρίων κατά τους χειμερινούς και εαρινούς μήνες οδήγησαν σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις κοπρανωδών κολοβακτηριδίων από είχαν ανιχνευθεί κατά το θέρος. Οι μέγιστες συγκεντρώσεις κοπρανωδών κολοβακτηριδίων μετρήθηκαν κατά τη διάρκεια φαινομένων βροχόπτωσης, και οι ποικίλες επιπτώσεις που σχετίζονταν με αυτή

βοήθησαν στον προσδιορισμό της σημασίας των διαφορετικών πηγών βακτηρίων στη λεκάνη απορροής και των μηχανισμών μεταφοράς αυτών. Η συνολική επίπτωση στην ποιότητα των υδάτων του Newmills Burn θεωρήθηκε η ενδεχόμενη σοβαρή απειλή για την υγεία όσων χρησιμοποιούν τον ποταμό Don για ψυχαγωγικό σκοπό, καθώς και για την υγεία μεγάλου ποσοστού του τοπικού πληθυσμού που υδρεύεται από ιδιωτικές παροχές νερού. Στη Μεγάλη Βρετανία επίσης, πρόσφατα αναγνωρίστηκε η μόλυνση των υπογείων υδάτων από ωοκύστεις του παρασιτικού πρωτόζωου Cryptosporidium, ως κίνδυνος για την ασφάλεια και την ποιότητα υπόγειων υδάτων που αποτελούν σημαντικές πηγές πόσιμου νερού στη Μ. Βρετανία (Morris and Foster, 2000). Στο Hong- Kong δυο αντιπροσωπευτικά ποτάμια, το Shing Mun και το Lam Tsuen, μελετήθηκαν (Ho and Tam, 1998) για 13 συνεχείς μήνες ως προς τα επίπεδα του μικροοργανισμού E. coli, των κυστών Giardia και των ωοκύστεων Cryptosporidium, με προοπτική την παροχή επαρκών δεδομένων ώστε να αποδειχθεί και υποστηριχθεί η ανάγκη της ανάπτυξης σχετικών οδηγιών για την ποιότητα υδάτων. Και τα δυο ποτάμια βρέθηκαν μολυσμένα με υψηλές συγκεντρώσεις E. coli. Οι ωοκύστεις Cryptosporidium σπανίως ανιχνεύθηκαν και στα δυο ποτάμια. Οι κύστες Giardia συχνά βρέθηκαν σε τιμές χαμηλότερες των 10 κυστών/ λίτρο από σημεία δειγματοληψίας σε αραιοκατοικημένες περιοχές στο ποτάμι Lam Tsuen. Σε όλα τα σημεία δειγματοληψίας στο κατώτερο μέρος του ποταμού, όπου καταλήγουν επεξεργασμένα λύματα από ένα πυκνοκατοικημένο αστικό διαμέρισμα και από έναν αριθμό αγροικιών που εξυπηρετούνται από εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων, οι κύστες Giardia βρέθηκαν συχνότατα σε πολύ υψηλότερα επίπεδα, έως και 468 κύστεις/ λίτρο. Οι συγκεντρώσεις των κυστών Giardia στα τρία σημεία δειγματοληψίας του ποταμού Shing Mun είχαν εύρος από μη ανιχνεύσιμες έως 100 κύστεις/ λίτρο. Τα επίπεδα των κύστεων Giardia επίσης φαίνονταν να σχετίζονται με τον τύπο των μεθόδων επεξεργασίας λυμάτων που εφαρμόζονται από τους οικισμούς και τις πόλεις στις όχθες του ποταμού. Παρόλα αυτά, τα επίπεδα ανίχνευσης των κύστεων Giardia και στα δυο ποτάμια δεν βρέθηκε να συσχετίζονται με τις μετρηθείσες τιμές του βακτηρίου E. coli. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το παρασιτικό πρωτόζωο Giardia θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της αποτελεσματικής επεξεργασίας για την αφαίρεση των παρασίτων από τα λύματα.

Η Miller (2002) μελέτησε τη σχέση μεταξύ απορροών γλυκών υδάτων και παρασιτικών μολύνσεων σε θαλάσσιες ενυδρίδες. Σύμφωνα με δημοσίευση του National Sea Grant College Program, Davis, Η.Π.Α., βρήκε ένα πιθανό αίτιο για τη μείωση του πληθυσμού των θαλάσσιων ενυδρίδων στην California. Υπάρχει ισχυρή απόδειξη ότι το Toxoplasma gondii, ευθύνεται για την κατάσταση. Το παρασιτικό πρωτόζωο προκαλεί εγκεφαλικές μολύνσεις στις θαλάσσιες ενυδρίδες. Η μελέτη εξέτασε ένα σύνολο 223 ζώων κατά μήκος της ακτής της California για την ύπαρξη του T. gondii. Από τις 116 ζωντανές ενυδρίδες, το 42% εμφάνισαν σημάδια μόλυνσης, και από τις πρόσφατα νεκρές το 62%. Τα περισσότερα ζώα ήταν εκτεθειμένα σε μέρη με μεγάλη εισροή γλυκών υδάτων από τη χέρσο. Παρόμοιες μελέτες έχουν γίνει και στον ελληνικό χώρο (Karanis and Kimura, 2002; Χρόνης, 2003).. Οι Karanis and Kimura (2002) μελέτησαν τη διασπορά των κύστεων Giardia και ωοκύστεων Cryptosporidium σε φυσικά και πόσιμα ύδατα, και σε ύδατα αναψυχής στη Βορειοδυτική Ελλάδα Μελετήθηκαν 5 ποταμοί (Αωός, Άραχθος, Καλαμάς, Λούρος και Βοϊδομάτης) και η λίμνη Παμβώτιδα κατά τη διάρκεια 10 μηνών. Σε κανένα σημείο δειγματοληψίας δεν ανιχνεύθηκε το παρασιτικό πρωτόζωο Giardia. Ωοκύστεις Cryptosporidium βρέθηκαν σε 15 από τα 27 εξετασθέντα δείγματα της λίμνης Παμβώτιδας. Αρκετά χαμηλότεροι αριθμοί ωοκύστεων βρέθηκαν στους ποταμούς Άραχθο (1/5) και Βοϊδομάτη (1/5), στα δείγματα πόσιμου νερού (1/7) και σε νερά αναψυχής (1/9). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως, με εξαίρεση τη λίμνη Παμβώτιδα των Ιωαννίνων, όπου παρατηρήθηκε μόλυνση σε υψηλό επίπεδο, οι πηγές φυσικών υδάτων της περιοχής έχουν χαμηλά επίπεδα ρύπανσης, και συνεπώς μικρή μόλυνση από παράσιτα. Σε άλλη μελέτη (Karanis et al., 1998) και πάλι στα ποτάμια της βόρειο-δυτικής Ελλάδας, η παρουσία των πρωτόζωων ήταν φτωχή σε σχέση με την περιοχή μελέτης. Στους ποταμούς Αλιάκμονα, Αξιό και Λουδία έγινε παλαιότερη αντίστοιχη μελέτη (Αρβανιτίδου και συν., 1992) η οποία έδειξε ελάχιστη μόλυνση από τα πρωτόζωα. Ο Χρόνης (2003), στα πλαίσια διπλωματικής εργασίας στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, μελέτησε τους ποταμούς Αλιάκμονα, Αξιό, Λουδία, Μαυρονέρι και Πηνειό, από τον Ιούνιο 2002 έως το Μάρτιο του 2003. Η κατάσταση της ποιότητας των υδάτων στα πέντε ποτάμια στη περιοχή μελέτης, όπως αυτή διαπιστώθηκε μέσα από τις μεθόδους ανίχνευσης των επιλεγμένων παραμέτρων, ήταν η εξής: κανένας ποταμός εκ των

πέντε δεν μπορεί να προμηθεύσει πόσιμο νερό για ανθρώπινη κατανάλωση, με οποιαδήποτε μορφή, αφού δεν τηρεί τις ελάχιστες προϋποθέσεις σύμφωνα με την οδηγία 98/83 της Ε.Ε (E.U. 1998). Τόσο στο Πηνειό όσο και στο Μαυρονέρι πρέπει να ληφθούν μέτρα για το περιορισμό των πρωτόζωων. Η παρουσία τους είναι άφθονη και εγκυμονεί κινδύνους για τη δημόσια υγεία. Απαραίτητη κρίθηκε η λήψη μέτρων για τον περιορισμό της ρύπανσης και της ρήψης λυμάτων στο ποταμό Μαυρονέρι ώστε να αντιμετωπισθεί άμεσα η μικροβιακή μόλυνση που παρατηρείται. Η κατάσταση της ποιότητας των υδάτων των ποταμών Αλιάκμονα, Αξιού και Λουδία ήταν σε ανεκτό επίπεδο, σύμφωνα με τις μικροβιολογικές παραμέτρους, χρήζουν όμως προστασίας και περισσότερο μελετημένης διαχείρισης, αφού κρύβουν ένα σπουδαίο οικοσύστημα, το οποίο άρχισε να προστατεύεται τα τελευταία χρόνια.

1. 3. Βιολογικός κύκλος & επιπτώσεις στην υγεία των υπό μελέτη οργανισμών Στην εργασία αυτή μελετήθηκαν τα εξής παρασιτικά πρωτόζωα: 1. Giardia 2. Cryptosporidium 3. Toxoplasma gondii Η επιλογή των συγκεκριμένων οργανισμών έγινε λόγω του ενδιαφέροντος που παρουσιάζουν ως παθογόνοι παράγοντες στον άνθρωπο. 3.3.1. Γένος: Giardia ΕΙΔΟΣ ΠΑΡΑΣΙΤΟΥ Giardia spp. ΝΟΣΗΜΑ Τζαρντίωση ή λαμπλίωση Κατάταξη Βασίλειο: Protista Συνομοταξία: Protozoa Φύλο: Sarcomastigophora Οικογένεια: Hexamitidae Γένος: Giardia Το μαστιγοφόρο αυτό παρασιτικό πρωτόζωο απαντάται στο έντερο των θηλαστικών, των πτηνών, των αμφιβίων, καθώς και του ανθρώπου και του πιθήκου (Giardia lamblia ή Giardia intestinalis ή Giardia duodenalis) σε ολόκληρο τον κόσμο. Ορισμένα από τα 40 περίπου είδη του παρασίτου δεν έχουν αυστηρή ειδικότητα ξενιστή και γι αυτό προτάθηκε η διαφοροποίηση του παρασίτου να στηρίζεται στο μέγεθος της τροφοζωικής του μορφής και όχι στο είδος του ξενιστή. Η G. lamblia παρατηρήθηκε για πρώτη φορά από τον Anthony van Leeuwenhoek τον 17 ο αιώνα σε δείγμα κοπράνων του.

Φωτογραφία 1: Τροφοζωίτης που εξάγεται από κύστη. Πηγή: http://lomaprieta.sierraclub.org/pcs/articles/giardia.asp Φωτογραφία 2: Τροφοζωίτης που διαιρείται. Πηγή: http://lomaprieta.sierraclub.org/pcs/articles/giardia.asp Μορφολογία Το παρασιτικό πρωτόζωο απαντάται με τροφοζωική και κυστική μορφή στο λεπτό έντερο του ξενιστή. Η τροφοζωική μορφή (9-21x5-15 μm) έχει επίπεδη κοιλιακή και κυρτή ραχιαία επιφάνεια, οκτώ μαστίγια, δυο πυρήνες, και ένα μυζητήρα ή «δίσκο προσκόλλησης» στην κοιλιακή επιφάνεια. Η ώριμη κυστική μορφή (8-16x5-11 μm) έχει τέσσερις πυρήνες, 2-4 συνήθως δρεπανοειδείς σχηματισμούς και μέχρι οκτώ μαστίγια.

Βιολογικός κύκλος Ο άνθρωπος και τα ζώα μολύνονται με την κατάποση της κυστικής μορφής του παρασιτικού πρωτόζωου μαζί με την τροφή και το νερό. Η μόλυνση του περιβάλλοντος γίνεται άμεσα με τα κόπρανα μολυσμένων ζώων και ανθρώπων ή έμμεσα με τα έντομα. Έχει διαπιστωθεί ότι η κυστική μορφή του παρασιτικού πρωτόζωου ζει στο έντερο της μύγας τουλάχιστον 24 ώρες και στο έντερο της κατσαρίδας 12 μέρες. Μετά την είσοδο της κυστικής μορφής στο ξενιστή το πρωτόζωο ελευθερώνεται στο δωδεκαδάκτυλο, διαιρείται κατά τον επιμήκη άξονα και παράγονται δυο τροφοζωικές μορφές, που πολλαπλασιάζονται επίσης με απλή διαίρεση. Ο πληθυσμός του παρασιτικού πρωτόζωου διπλασιάζεται περίπου κάθε 18 ώρες. Οι οργανισμοί προσκολλώνται με τη βοήθεια του μυζητήρα στην επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων και προσλαμβάνουν θρεπτικά στοιχεία από το περιεχόμενο του εντέρου. Η ανάπτυξη του παρασιτικού πρωτόζωου στο ξενιστή ευνοείται από την παρουσία άλλων παθογόνων παραγόντων, όπως είναι ο μύκητας Candida albicans, ο ιός του AIDS. Η κυστική μορφή του παρασίτου επιβιώνει τουλάχιστον δυο μήνες στο εξωτερικό περιβάλλον, τρεις εβδομάδες στους 21 ο C, τρεις μήνες σε νερό 8 ο C, δυο εβδομάδες στους -13 ο C, αλλά είναι πολύ ευαίσθητη στην ξηρασία (Χαραλαμπίδης, 1994).

Εικόνα 1: Κύκλος ζωής του παρασιτικού πρωτόζωου Giardia. Πηγή: http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/giardiasis.asp?body=frames/g- L/Giardiasis/body_Giardiasis_page1.htm (Τροποποιημένη) Μετάδοση Το παρασιτικό πρωτόζωο Giardia είναι παρόν στα κόπρανα προσβεβλημένων ανθρώπων και ζώων. Μόλυνση προκαλείται όταν ένα άτομο έρθει σε επαφή με προϊόντα απέκκρισης και γίνεται κατάποση του παρασίτου. Η μετάδοση γίνεται όταν τα χέρια δεν είναι επαρκώς πλυμένα, από την κατανάλωση μολυσμένου νερού (σπανίως μολυσμένης τροφής) και με την επαφή με μολυσμένα ζώα. Οι πηγές πόσιμου νερού μολύνονται όταν προϊόντα απέκκρισης που περιέχουν παράσιτα έρχονται σε επαφή με αυτές. Αν η επεξεργασία του νερού είναι ελλιπής, το πόσιμο νερό μπορεί να περιέχει αριθμό παρασίτων ικανό να προκαλέσει ασθένεια.

Giardiasis Η Giardiasis είναι ασθένεια του λεπτού εντέρου κυρίως, και έχει παρατηρηθεί στους ανθρώπους καθώς και στα ζώα. Είναι πιο κοινή στα μικρά παιδιά και στους ενήλικες από 20 έως 40 ετών. Τα πιο κοινά συμπτώματα της Giardiasis είναι διάρροια, κράμπες στο στομάχι, ναυτία, κούραση και απώλεια βάρους (κάποιοι άνθρωποι μπορεί να μην εμφανίζουν συμπτώματα, αλλά να μεταδίδουν την ασθένεια σε άλλους). Τα πρώτα σημάδια της ασθένειας εμφανίζονται σε διάστημα από 3 έως 25 ημέρες μετά τη μόλυνση του ανθρώπου. Παρόλα αυτά το πιο κοινό είναι το διάστημα μεταξύ 7 και 10 ημερών. 1.3.2. Γένος: Cryptosporidium ΕΙΔΟΣ ΠΑΡΑΣΙΤΟΥ Cryptosporidium spp. ΝΟΣΗΜΑ Κρυπτοσποριδίωση Κατάταξη Βασίλειο: Protista Συνομοταξία: Protozoa Φύλο: Apicomplexa Υποκλάση: Coccidia Οικογένεια: Cryptosporidiidae Γένος: Cryptosporidium Κοκκίδια της επιφάνειας των κυττάρων του επιθηλίου του εντέρου, του στομάχου και του αναπνευστικού συστήματος του ποντικού, της αίγας, του προβάτου, των βοοειδών, του χοίρου, του σκύλου, της γάτας, των πτηνών, των ερπετών, των ιχθύων, καθώς και του ανθρώπου σε ολόκληρο τον κόσμο.

Φωτογραφία 3: Ωοκύστεις Cryptosporidium. Πηγή: http://www.centrovetzoos.com/protozoarios.htm Μορφολογία Η άωρη ωοκύστη έχει διάμετρο 1.5-8 μm. Η ώριμη ωοκύστη περιέχει τέσσερα σποροζωίδια (δεν παράγεται σποροκύστη). Βιολογικός κύκλος Ο βιολογικός κύκλος του Cryptosporidium spp. ολοκληρώνεται στην επιφάνεια του επιθηλίου του εντέρου και του αναπνευστικού συστήματος και περιλαμβάνει δυο μέχρι τρεις γενεές μεροζωιδίων, παραγωγή ανισογαμετοκυττάρων, ζυγωτού και αώρων ωοκύστεων που αποβάλλονται στο περιβάλλον με τα κόπρανα ή τις αποχρέμψεις του ξενιστή, περίπου 5 ημέρες μετά τη μόλυνση. Η ώριμη ωοκύστη αναπτύσσεται στο περιβάλλον ή στον αυλό του εντέρου του ξενιστή και μολύνει το ξενιστή με την τροφή και την αναπνοή. Cryptosporidiosis Η ασθένεια μπορεί να μεταδοθεί μέσω του πόσιμου νερού. Η cryptosporidiosis μπορεί να προκαλέσει οξεία διάρροια, κοιλιακό πόνο, εμετούς και πυρετό που διαρκούν έως και δύο εβδομάδες σε υγιείς ενήλικες, αλλά ενδέχεται να είναι χρόνια ή μοιραία σε άτομα μολυσμένα με τον ιό HIV.

Εικόνα 2: Κύκλος ζωής του παρασιτικού πρωτόζωου Cryptosporidium. Πηγή: http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/cryptosporidiosis.htm (Τροποποιημένη) 1.3.3. Γένος: Toxoplasma ΕΙΔΟΣ ΠΑΡΑΣΙΤΟΥ Toxoplasma gondii ΝΟΣΗΜΑ Τοξοπλάσμωση Κατάταξη: Βασίλειο: Protista Συνομοταξία: Protozoa Φύλο: Apicomplexa Υποκλάση: Coccidia Οικογένεια: Toxoplasmidae Γένος: Toxoplasma Είδος: Toxoplasma gondii

Το T. gondii απαντάται σε περισσότερα από 200 είδη θηλαστικών και πτηνών, καθώς και στο 25-100% των ανθρώπων σε ολόκληρο τον κόσμο. Το Toxoplasma gondii είναι υποχρεωτικά ενδοκυτταρικό παράσιτο και είναι ικανό να προσβάλλει θερμόαιμα ζώα και πουλιά. Η μόλυνση προκύπτει από την κατανάλωση ατελώς ψημένου κρέατος, την έκθεση και/ ή την κατάποση ωοκύστεων από τα κόπρανα μολυσμένων γάτων, ή μέσω του πλακούντα από μια μολυσμένη γυναίκα στο έμβρυό της. Φωτογραφία 4: Ωοκύστη Toxoplasma Πηγή: http://workforce.cup.edu/buckelew/ Μορφολογία Το παρασιτικό πρωτόζωο εμφανίζεται με τη μορφή: a. της ώριμης ωοκύστης που είναι 11-14x9-11 μm, περιέχει δυο σποροκύστες (8.5x6 μm) και τέσσερα σποροζωίδια (8x2 μm) ανά σποροκύστη και απαντάται στο εξωτερικό περιβάλλον. b. της κύστης που απαντάται στους ιστούς του τελικού και του ενδιάμεσου ξενιστή, είναι 150-300 μm και περιέχει περίπου 14000 μεροζωίδια. c. του τροφοζωίτη (5-8x1-2 μm) που απαντάται στον τελικό και τον ενδιάμεσο ξενιστή.

Βιολογικός κύκλος Τα διάφορα είδη θηλαστικών ζώων και πτηνών και ο άνθρωπος είναι ενδιάμεσοι ξενιστές του παρασίτου και μολύνονται με την κατάποση: i. ώριμων ωοκύστεων από το έδαφος με την τροφή, όπως ωμά λαχανικά. ii. κύστεων με τη μορφή ατελώς ψημένου κρέατος μολυσμένων χοίρων, μηρυκαστικών, πτηνών, καθώς και iii. με τη διέλευση των τροφοζωιτών στο έμβρυο, κατά την οξεία φάση της μόλυνσης της μητέρας με το παρασιτικό πρωτόζωο (στάδιο παρασιταιμίας). Μετά την άφιξή τους στο έντερο του ενδιάμεσου ξενιστή, τα σποροζωίδια και οι ζωιτοκύστεις εισβάλλουν στα τριχοειδή αγγεία του εντέρου και εισέρχονται σε εμπύρηνα κύτταρα. Πολλαπλασιάζονται με απλή διαίρεση και εκβλάστηση και παράγονται μεροζωίδια ή ταχυζωίτες. Οι ταχυζωίτες προκαλούν τη ρήξη του κυττάρου, ελευθερώνονται, εισβάλλουν σε νέα κύτταρα και πολλαπλασιάζονται. Η καταστροφή των κυττάρων από το παρασιτικό πρωτόζωο επαναλαμβάνεται για 1-2 εβδομάδες μετά, οι ταχυζωίτες εισβάλλουν σε κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήματος, του αμφιβληστροειδούς και των σκελετικών μυών. Πολλαπλασιάζονται και παράγουν κύστες ή ζωιτοκύστεις (και οι οργανισμοί στο εσωτερικό των βραδυζωίτες), οι οποίες παραμένουν μολυσματικές ολόκληρη τη ζωή του ενδιάμεσου ξενιστή. Η γάτα και τα άγρια είδη της οικογένειας Felidae είναι οι τελικοί ξενιστές του παρασιτικού πρωτόζωου. Μολύνονται όπως οι ενδιάμεσοι ξενιστές, με την κατάποση των σποροζωιδίων και των ζωιτοκυστών ή με την είσοδο τροφοζωιτών στο έμβρυο από τη μολυσμένη μητέρα. Ο βιολογικός κύκλος του παρασιτικού πρωτόζωου στον τελικό ξενιστή είναι όμοιος με εκείνο στον ενδιάμεσο ξενιστή, περιλαμβάνει όμως επιπλέον και εγγενή πολλαπλασιασμό του παρασίτου. Κατά τον εγγενή πολλαπλασιασμό, τα παρασιτικά πρωτόζωα εισβάλλουν στα κύτταρα του επιθηλίου του λεπτού εντέρου του τελικού ξενιστή, πολλαπλασιάζονται και παράγουν ταχυζωίτες, χωρίς να είναι γνωστός ο αριθμός των γενεών. Οι ταχυζωίτες της τελευταίας γενεάς εισβάλλουν στα κύτταρα του επιθηλίου του λεπτού εντέρου και παράγουν μακρογαμετοκύτταρα και μικρογαμετοκύτταρα. Τα μακρογαμετοκύτταρα αυξάνονται σε μέγεθος και μετατρέπονται σε μακρογαμέτες, ενώ τα μικρογαμετοκύτταρα πολλαπλασιάζονται με

πολλαπλή διαίρεση και παράγουν 12-32 μικρογαμέτες ανά μολυσμένο κύτταρο. ο μικρογαμέτης (περίπου 3 μm) έχει δυο μαστίγια, εισβάλλει στο μακρογαμέτη και παράγεται το ζυγωτό το οποίο έχει λεπτό τοίχωμα, μετατρέπεται σε άωρη ωοκύστη και αποβάλλεται με τα κόπρανα της γάτας στο εξωτερικό περιβάλλον 2-38 ημέρες μετά τη μόλυνσή της. Στις άωρες ωοκύστεις παράγονται δυο σποροβλάστες και μετά από παραμονή 2-4 ημερών στο εξωτερικό περιβάλλον, οι ωοκύστεις καθίσταται ώριμες και είναι δυνατόν να μολύνουν τα ζώα και τον άνθρωπο. Οι ώριμες ωοκύστεις περιέχουν δυο σποροκύστεις και τέσσερα σποροζωίδια ανά σποροκύστη και επιβιώνουν περίπου 2 έτη σε υγρό έδαφος. Εικόνα 3: Κύκλος ζωής του παρασιτικού πρωτόζωου Toxoplasma. Πηγή: http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/toxoplasmosis.htm (Τροποποιημένη)

Τοξοπλάσμωση Μετάδοση της τοξοπλάσμωσης μπορεί να γίνει μέσω ωοκύστεων ή βραδυζωϊτών. Από τη στιγμή που τα κόπρανα των γάτων είναι η μόνη πηγή ωοκύστεων, η έκθεση στις ωοκύστεις μπορεί να ελαχιστοποιηθεί, αλλά όχι να αποφευχθεί πλήρως. Οι ωοκύστεις είναι ιδιαίτερα ανθεκτικές σε ποικίλες περιβαλλοντικές συνθήκες. Μόλυνση μέσω βραδυζωϊτών προκύπτει όταν καταναλώνεται ωμό ή ατελώς ψημένο κρέας. Υπολογίζοντας την ευρεία εξάπλωση και την ιδιαίτερα χαμηλή ειδίκευση ξενιστή του Toxoplasma, κανένα προϊόν κρέατος δεν μπορεί να θεωρηθεί απολύτως «ασφαλές». Η τοξοπλάσμωση μπορεί να μεταδοθεί μέσω μοσχευμάτων. Συγκριτικά με το συνολικό αριθμό των μολύνσεων, οι συγκεκριμένες αντιστοιχούν σε πολύ μικρό ποσοστό, αλλά έχουν ως αποτέλεσμα κάποιες από τις πιο σοβαρές ασθένειες. Στους ανθρώπους, η τοξοπλάσμωση μεταδίδεται επίσης από την έγκυο στο έμβρυο. Οι ταχυζωίτες διασχίζουν τον πλακούντα και προσβάλλουν τους ιστούς του εμβρύου. Αναλόγως την ηλικία του εμβρύου όταν αυτό μολύνεται και την τοξικότητα του Toxoplasma, αυτό μπορεί να οδηγήσει σε αποβολή, πρόωρο τοκετό, ή παιδί με κάποιο βαθμό πνευματικής ή φυσικής καθυστέρησης. Έτσι, οι γυναίκες προτρέπονται να αποφεύγουν την επαφή με γάτες κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Παρόλα αυτά, οι γυναίκες που εγκυμονούν πρέπει επίσης να έχουν υπόψη τους ότι οι ωοκύστεις δεν είναι η μόνη πηγή μόλυνσης, και να λαμβάνουν επιπλέον μέτρα ώστε να αποφεύγουν τη μόλυνση μέσω ωμού ή ατελώς ψημένου κρέατος.

2. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η παρούσα εργασία έχει ως στόχο τον εντοπισμό παρασιτικών πρωτόζωων σε νερό ποταμοχειμάρρων κυρίως, στη θάλασσα και σε υπόγεια ύδατα. Είναι χρήσιμο να γνωρίζουμε τους περιβαλλοντικούς παράγοντες που επιδρούν στη μικροβιολογική ποιότητα του νερού σε χείμαρρους, όπως οι ατμοσφαιρικές κατακρημνίσεις, οι χρήσεις της λεκάνης απορροής, καθώς η εποχή του έτους. Η θάλασσα και ειδικά η παράκτια ζώνη είναι αποδέκτης των οικιακών λυμάτων που προέρχονται από την κατοίκηση αυτής της περιοχής, με αποτέλεσμα την αύξηση του μικροβιακού φορτίου. Τα υπόγεια ύδατα, και κατά συνέπεια τα πηγάδια, αποτελούν σε κάποιες περιπτώσεις πηγές πόσιμου νερού ή χρησιμεύουν στην άρδευση των περιβολιών, καθιστώντας χρήσιμη τη μελέτη τους ως προς το μικροβιολογικό φορτίο. Επομένως, σκοπός της παρούσας μελέτης είναι: I. Η διερεύνηση της ποιότητας των υδάτων χειμάρρων σε ότι αφορά την παρουσία των παρασιτικών πρωτόζωων Toxoplasma, Giardia, Cryptosporidium. II. Η διερεύνηση του βαθμού επίδρασης των παραγόντων που επιδρούν στη μικροβιολογική ποιότητα του νερού σε χείμαρρους και ιδιαίτερα: i. Την εποχή του έτους, ii. Την προηγηθείσα βροχόπτωση και iii. Τις χρήσεις γης στη λεκάνη απορροής των χειμάρρων. ΙΙΙ. Η ανίχνευση των παρασιτικών πρωτόζωων στον υδροφόρο ορίζοντα (νερό πηγαδιών), σε περιοχές που είναι γνωστό ότι ο υδροφόρος ορίζοντας έχει κοπρανώδη επιβάρυνση. IV. H ανίχνευση παρασιτικών πρωτόζωων σε δείγματα θαλασσινού νερού από. την παράκτια ζώνη της πόλης της Μυτιλήνης.

3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1. Γεωγραφική τοποθέτηση 3.1.1. Το Νησί της Λέσβου Η Λέσβος είναι το τρίτο μεγαλύτερο νησί της Ελλάδας. Έχει εμβαδόν 1630.2 km 2 και το μήκος των ακτών της 370.4 km. Τα 536.8 km 2 ανήκουν στις πεδιάδες. Οι μεγαλύτερες είναι της Καλλονής, του Ίππειους, της Γέρας, της Ερεσού και του Σιγρίου. Οι λόφοι καλύπτουν μεγαλύτερες εκτάσεις, 775.8 km 2 και ακολουθούν τα βουνά με 321.8 km 2 (Αξιώτης, 1992). Ο πληθυσμός του νησιού σύμφωνα με τα στοιχεία του 1991 αγγίζει τις 100000. Χάρτης 1: Γεωγραφική τοποθέτηση της Νήσου Λέσβου. Πηγή: http://www.equal-elva.net/lesvosmap.htm 3.1.2. Πόροι του νησιού Η οικονομία του νησιού στηρίζεται κυρίως στην καλλιέργεια ελαιόδενδρων, την παραγωγή λαδιού και την περαιτέρω αξιοποίηση του καρπού της ελιάς. Τα ελαιόδενδρα αριθμούν περί τα 10.000.000. Το βόριο τμήμα του νησιού έχει αναπτύξει την κτηνοτροφία, αφού δεν φύεται η ελιά σε εκείνα τα εδάφη. Σχετικά με την αλιεία, υπολογίζεται σε 3000 περίπου τόνους ψάρια ετησίως. Τα τελευταία χρόνια αναπτύσσονται και οι υδατοκαλλιέργειες (Αξιώτης, 1992).

Η Λέσβος ήταν γνωστή από την αρχαιότητα για τις πολλές ιαματικές πηγές που ανάβλυζαν στο νησί. Στη Θερμή υπήρχε μια αρχαία λουτρόπολη, όπου λατρευόταν η θεά Άρτεμις Θερμία. Τα θερμά ιαματικά λουτρά ήταν πολύ δημοφιλή και κατά την περίοδο της Τουρκοκρατίας. Σήμερα συνεχίζουν να αποτελούν πόλο έλξης επισκεπτών, χωρίς να είναι τόσο δημοφιλή όσο ήταν στο παρελθόν. Τέλος, ο τουρισμός παρουσιάζει ραγδαία ανάπτυξη εν συγκρίσει με το παρελθόν (Αξιώτης 1992). Χάρτης 2: Σημεία δειγματοληψίας όπου ανιχνεύθηκε το παρασιτικό πρωτόζωο Giardia και οι χρήσεις γης.

Χάρτης 3: Χάρτης της Λέσβου όπου σημειώνονται οι περιοχές δειγματοληψίας

Χάρτης 4: Περιοχή 1, όπου σημειώνονται τα σημεία δειγματοληψίας του χείμαρρου Ασπροπόταμου. Χάρτης 5: Περιοχή 2, όπου σημειώνονται το σημείο δειγματοληψίας του ποταμού Ευεργέτουλα.

Χάρτης 6: Περιοχή 3, όπου σημειώνονται τα σημεία δειγματοληψίας των χείμαρρων Μόριας και Νησέλια Παμφίλων, και το χωριό των Παμφίλων. Χάρτης 7: Περιοχή Μυτιλήνης και η παράκτια περιοχή της.

Χάρτης 8: Περιοχή 4, όπου σημειώνονται τα σημεία δειγματοληψίας των χείμαρρων Καγιανίου και Μύλων Αεροδρομίου. Χάρτης 9: Περιοχή Βαρειάς.

3.2. Μεθοδολογίες Οι μεθοδολογίες που εφαρμόστηκαν στην παρούσα εργασία ήταν οι εξής: 1. Δειγματοληψία με πλαστικές φιάλες των δέκα (10) λίτρων 2. Κροκύδωση (ιζηματοποιήση) με Al 2 (SO 4 ) 3 3. Εξαγωγή και απομόνωση DNA (Εργαστήριο Παρασιτολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Κολωνίας) 4. Πολλαπλασιασμός DNA στην PCR (Εργαστήριο Παρασιτολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Κολωνίας) 5. Ηλεκτροφόρηση (Εργαστήριο Παρασιτολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Κολωνίας) 3.2.1. Δειγματοληψία Τα δείγματα προέρχονται από σημεία δειγματοληψίας στην Ανατολική Λέσβο. Συλλέχθηκαν δείγματα από πηγάδια και από τη θάλασσα. Συνολικά τα δείγματα ήταν 69, 24 εκ των οποίων εξετάστηκαν για τα παρασιτικά πρωτόζωα Toxoplasma, Giardia, Cryptosporidium και τα υπόλοιπα 45 για Giardia, Cryptosporidium. Οι δειγματοληψίες κάλυψαν το χρονικό εύρος ενός έτους, από τις 30.06.03 έως τις 18.05.04, καθώς και ποικίλες καιρικές και περιβαλλοντικές συνθήκες. Επιπλέον, μελετήθηκε το είδος της λεκάνης απορροής κάθε ποταμοχειμάρρου, ώστε να γίνει συσχέτιση της παρουσίας ή όχι παρασιτικών πρωτόζωων με τις εκάστοτε χρήσεις γης και τα μετεωρολογικά δεδομένα. Τα σημεία δειγματοληψίας ήταν τα εξής (χάρτης 4 έως 9): 1. Ποταμός Ευεργέτουλας 2. Χείμαρρος Καγιανίου 3. Χείμαρρος Μύλων Αεροδρομίου 4. Χείμαρρος Μόριας 5. Χείμαρρος Νησελιών Παμφίλων 6. Χείμαρρος Ασπροπόταμου 7. Πηγάδια Παμφίλων 8. Πηγάδια Βαρειάς 9. Παράκτια περιοχή Μυτιλήνης,

καθώς και κάποια άλλα μεμονωμένα σημεία δειγματοληψίας. 3.2.2. Κροκύδωση (ιζηματοποιήση) με Al 2 (SO 4 ) 3 Το δείγμα του νερού (1 λίτρο) τοποθετήθηκε σε αποστειρωμένη κωνική φιάλη του 1 λίτρου, και αναδεύτηκε με την προσθήκη μαγνήτη ανάδευσης. Κατά τη διάρκεια της ανάδευσης σε μέτρια ταχύτητα προστέθηκαν 2 ml διαλύματος Al 2 (SO 4 ) 3. Πάντα υπό συνεχή ανάδευση ρυθμίστηκε το ph στο 5.4-5.8 με την προσθήκη σταγόνων διαλύματος NaOH 1N και 0.1 Ν. Στη συνέχεια, απομακρύνθηκε ο μαγνήτης ανάδευσης (απολυμάνθηκε με αλκοόλη 70% για την επόμενη χρήση) και καλύφθηκε το στόμιο της φιάλης με αλουμινόχαρτο. Η κωνική φιάλη παρέμεινε στο σκοτάδι για 22 h σε θερμοκρασία δωματίου. Την επόμενη μέρα το υγρό στο βάθος της φιάλης ήταν θολό. Η κωνική φιάλη μεταφέρθηκε με ιδιαίτερη προσοχή στον πάγκο εργασίας. Με τη βοήθεια υάλινης πιπέττας Pasteur, αναρροφήθηκε το υπερκείμενο μέχρι την ένδειξη των 200 ml (πάντα αντλώντας επιφανειακά). Έπειτα, το ίζημα μεταφέρθηκε σε 4 σωλήνες φυγοκέντρησης των 50 ml. Η κωνική φιάλη ξεπλύθηκε με λίγο απιονισμένο νερό, αναδεύτηκε ελαφρά με το χέρι και το περιεχόμενό της τοποθετήθηκε στον τελευταίο από τους 4 σωλήνες. Έγινε φυγοκέντρηση των σωλήνων στα 2100 g για 10 min στους 4 ο C. Ύστερα, αντλήθηκε πάλι το υπερκείμενο με την αντλία νερού μέχρι την ένδειξη των 2.5 ml, τα δείγματα αναδεύτηκαν στο Vortex και ενώθηκαν σε έναν σωλήνα. Συμπληρώθηκε απιονισμένο νερό στο σωλήνα μέχρι τον όγκο των 50 ml (Vortex). Έγινε φυγοκέντρηση στα 2100 g για 10 min στους 4 ο C και απομακρύνθηκε το υπερκείμενο με αντλία νερού μέχρι την ένδειξη 1 ml (Vortex). Προστέθηκε 1 ml διαλύματος λύσης (Vortex) και δείγματα παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 h (Vortex κάθε 15 min). Ο όγκος των δειγμάτων συμπληρώθηκε μέχρι τα 50 ml με απιονισμένο νερό (Vortex) και έγινε φυγοκέντρηση στα 2100 g για 10 min στους 4 ο C. Μετά, απομακρύνθηκε το υπερκείμενο με αντλία νερού μέχρι την ένδειξη των 2.5 ml (Vortex) και συμπληρώθηκε ο όγκος μέχρι τα 50 ml με απιονισμένο νερό (Vortex). Τέλος, έγινε η τελευταία φυγοκέντρηση στα 2100 g για 10 min στους 4 ο C και απομακρύνθηκε το υπερκείμενο μέχρι την ένδειξη των 10 ml ακολούθησε καθαρισμός (Vortex). Τα δείγματα φυλάχτηκαν στους 4 ο C.

Η διαδικασία που ακολουθήθηκε αποτελεί μέρος των διδακτορικών διατριβών της Δρ. Χ. Κουρεντή και της υποψήφιας διδάκτορα Σ. Σωτηριάδου, του Εργαστηρίου Παρασιτολογίας, της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Κολωνίας. Ακολουθήθηκε το ίδιο πρωτόκολλο για τα παράσιτα Toxoplasma και Giardia. 3.2.3. Εξαγωγή DNA 3.2.3.1. Στάδιο Ι Τα δείγματα καθαρίστηκαν με τη μέθοδο της βαθμιδωτής σουκρόζης. Σε οκτώ (8) σωλήνες φυγοκέντρησης των 50 ml τοποθετήθηκαν 15 ml διαλύματος Seather s/ PBS 1:2, επιστοιβάχθηκαν 15 ml διαλύματος Seather s/ PBS 1:2. Το δείγμα αναδεύτηκε στη συσκευή Vortex και προστέθηκε στις στοιβάδες Οι σωλήνες φυγοκέντρησης τοποθετήθηκαν στη μεγάλη φυγόκεντρο Herraus αντιδιαμετρικά, με επιλεγμένο τον μεγάλο ρότορα. Λόγω της μεγάλης ευαισθησίας της συσκευής τα δείγματα ήταν ακριβώς ίσου όγκου. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν επί 30 λεπτά στα 1200 g, στους 4 o C. Με το τέλος του προγράμματος της φυγοκέντρου ακολουθεί ο πρώτος καθαρισμός από τη σουκρόζη με απιονισμένο νερό. Το υπερκείμενο δείγμα μεταφέρθηκε σε άλλους σωλήνες φυγοκέντρησης. Αναδεύτηκαν στη συσκευή Vortex και συμπληρώθηκαν με απιονισμένο νερό μέχρι τον όγκο των 50 ml. Έγινε δεύτερη ανάδευση στο Vortex, αναδεύτηκαν ήπια με το χέρι και τοποθετήθηκαν πάλι στη φυγόκεντρο για 10 λεπτά, στους 4 o C, στα 2100 g και 3200 στροφές. Ύστερα το υπερκείμενο αντλήθηκε μέχρι τον όγκο των 5 ml με τη βοήθεια ηλεκτρομηχανικής αντλίας στην άκρη της οποίας εφαρμόστηκε υάλινη πιππέτα Pasteur, διαφορετική για κάθε δείγμα και έγινε ανάδευση στη συσκευή Vortex. Στη συνέχεια ακολούθησε ο δεύτερος καθαρισμός από τη σουκρόζη με απιονισμένο νερό. Οι σωλήνες φυγοκέντρησης συμπληρώθηκαν πάλι μέχρι τον όγκο των 50 ml με απιονισμένο νερό, τοποθετήθηκαν στη φυγόκεντρο στο ίδιο πρόγραμμα όπως παραπάνω.

Με τη βοήθεια της αντλίας αναρροφήθηκε το υπερκείμενο από κάθε σωλήνα μέχρι τον όγκο των 1.5 ml και οι σωλήνες φυγοκέντρησης αναδεύτηκαν στη συσκευή Vortex. Το κάθε δείγμα με αυτόματη μηχανική πιππέτα μοιράστηκε από 750 ml σε δυο σωλήνες Eppendorf των 2 ml και αναδεύτηκαν στο Vortex. Η μια σειρά δειγμάτων φυλάχτηκε στην κατάψυξη στους -20 ο C για ανίχνευση άλλων παρασίτων. Η άλλη σειρά δειγμάτων τοποθετήθηκε στη φυγόκεντρο, στο μικρό ρότορα, για 10 min, στους 4 ο C και στα 2100 g (5200 στροφές). Με την πάροδο των 10 λεπτών αναρροφήθηκε το υπερκείμενο δείγμα, με αυτόματη μηχανική πιππέτα, μέχρι τον όγκο των 200 μl, χρησιμοποιώντας ένα δείκτη για περισσότερη ακρίβεια. Στα δείγματα προστέθηκαν τα εξής: 200 μl TE Buffer (Vortex) 60 μl SDS (Vortex) Στο αρνητικό αντί 200 μl δείγματος προστέθηκαν 200 μl αποστειρωμένο νερό και στο θετικό 183 μl με 100 παράσιτα και 17 μl αποστειρωμένο νερό. Τα δείγματα σφραγίστηκαν parafilm και αναδεύτηκαν στη συσκευή Vortex. Ενσωματώθηκαν σε στρογγυλή βάση από φελιζόλ και αφέθηκαν να βράσουν για 40 λεπτά σε ποτήρι ζέσεως με 600 ml νερό βρύσης. Υγρό άζωτο αντλήθηκε από κυλινδρική δεξαμενή και τοποθετήθηκε σε ειδικό θερμομονωτικό σκεύος. Με το πέρας των 40 λεπτών ξεκίνησε η διαδικασία παγώματος- ξεπαγώματος. Τα δείγματα με τη βοήθεια μακριάς μεταλλικής λαβίδας αφέθηκαν στο υγρό άζωτο και ύστερα επανατοποθετήθηκαν στο ποτήρι ζέσεως. Η παραπάνω διαδικασία επαναλήφθηκε εννέα (9) φορές, ώστε να σπάσουν τα τοιχώματα των παρασίτων. Στη συνέχεια αφαιρέθηκε το parafilm με τη βοήθεια απολυμασμένης λεπίδας και τα δείγματα αναδεύτηκαν στη συσκευή Vortex. Τέλος προστέθηκαν σε κάθε δείγμα 15 μl πρωτεϊνάσης Κ από διάλυμα 20 μg/ ml και αναδεύτηκαν στο Vortex. Αφέθηκαν στον επωαστικό κλίβανο στους 56 ο C για όλη τη νύχτα.

3.2.3.2. Στάδιο ΙΙ Την επόμενη μέρα τα δείγματα εξήχθησαν από τον κλίβανο. Το CTAB αφέθηκε στον κλίβανο στους 62.5 ο C έως ότου από υγρό ρευστοποιηθεί ώστε να συλλέγεται και να «πιπεττάρεται» με ευκολία, κατόπιν αναδεύτηκε στο Vortex. Σε κάθε δείγμα προστέθηκαν 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος NaCl 5M (Vortex) και 80 μl CTAB (Vortex). Με την προσθήκη του CTAB τα δείγματα απέκτησαν ένα γαλακτώδες χρώμα, ακόμη και μετά την ανάδευση στο Vortex. Καθαρισμός με χρήση φαινόλης: Τα δείγματα επωάστηκαν για μια (1) ώρα στους 62.5 ο C με ανά 15 min ανάδευση στο Vortex. Ίσος όγκος διαλύματος φαινόλης: χλωροφορμίου: ισοαμυλικής αλκοόλης (25: 24: 1) ~ 655 μl προστέθηκε σε κάθε δείγμα με ιδιαίτερη προσοχή, και αναδεύτηκαν στη συσκευή Vortex. ( 2 φορές x 20 min). Ύστερα τοποθετήθηκαν στη μικρή συσκευή φυγοκέντρησης Eppendorf, αντιδιαμετρικά για 5 min στις 10000 στροφές/ min. Το υπερκείμενο- η υδάτινη φάση ~ 655μl μεταφέρθηκε σε άλλη σειρά σωλήνων Eppendorf των 2 ml με αυτόματη μηχανική πιππέτα και αναδεύτηκε στο Vortex. ( Προσοχή : το DNA βρίσκεται πάντα στην υδάτινη/ διαφανής φάση ). Καθαρισμός από τη φαινόλη: Προστέθηκε σε κάθε δείγμα ίσος όγκος (~ 655 μl) διάλυμα χλωροφορμίου: ισοαμυλικής αλκοόλης και αναδεύτηκαν στη συσκευή Vortex. Επανατοποθετήθηκαν αντιδιαμετρικά στη μικρή συσκευή φυγοκέντρησης Eppendorf, στο ίδιο πρόγραμμα όπως προηγουμένως. Στη συνέχεια μεταφέρθηκαν τα δείγματα για τελευταία φορά σε άλλη σειρά σωλήνων Eppendorf των 2 ml (Vortex). Προστέθηκαν σε κάθε δείγμα 390 μl ισοπροπανόλης και αναδεύτηκαν ήπια με το χέρι. Καταψύχθηκαν στους 20 ο C για 15 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν 20 min στις 13000 στροφές/ min, στη μικρή συσκευή φυγοκέντρησης Eppendorf, καθώς το AE Buffer βρισκόταν στον κλίβανο στους 72 ο C ώστε να ρευστοποιηθεί. Με το τέλος της φυγόκεντρου, με αυτόματη μηχανική πιππέτα, αφαιρέθηκε το υπερκείμενο και εντός του σωλήνα Eppendorf αφέθηκε μόνο το DNA. Προστέθηκε 1 ml αιθανόλης 70 % σε κάθε δείγμα ώστε να ξεπλυθεί το DNA, αναδεύτηκαν στο

Vortex και τοποθετήθηκαν στη φυγόκεντρο για 5 λεπτά στις 10000 στροφές/ min. Το υπερκείμενο πάλι αναρροφήθηκε με αυτόματη μηχανική πιππέτα, πάντα αντλώντας επιφανειακά. Τέλος, προστέθηκαν σε κάθε δείγμα 20 μl AE Buffer, αναδεύτηκαν στη συσκευή Vortex και διατηρήθηκαν στους 4 ο C. 3.2.4. Πολλαπλασιασμός DNA 3.2.4.1. Πολλαπλασιασμός DNA για το Toxoplasma 1. Πρωτογενής ή Εξωτερικός Πολλαπλασιασμός Παρασκευάστηκε Master- Mix για 11 δείγματα: 8 δείγματα- θετικό- αρνητικόεφεδρική ποσότητα. Η σύσταση του Mix ήταν η εξής: Συστατικό Όγκος σε μl 10x 27.5 MgCl 2 11.0 dntps 11.0 323 F 1 11.0 855 R 2 11.0 Taq 1.1 H 2 O 180.4 Πίνακας 1: Συστατικά μίγματος 1, 2 : Εξωτερικοί primers για τον πρωτογενή πολλαπλασιασμό DNA του Toxoplasma. Τα συστατικά προστέθηκαν σε σωλήνα Eppendorf των 500 μl με τη βοήθεια αυτόματης μηχανικής πιπέττας, διαφορετικού εύρους χωρητικότητας όγκου, ανάλογα με το προστιθέμενο υλικό. Αφού ετοιμάστηκε το Master- Mix, αναδεύτηκε στη συσκευή Vortex, έγινε φυγοκέντρηση με ένα γρήγορο spin και ξανά Vortex.

Στη συνέχεια, μοιράστηκε σε δέκα (10) μικρούς σωλήνες Eppendorf των 200 μl (από 23 μl), στους οποίους προστέθηκαν από 2 μl DNA από τα δείγματα και αναδεύτηκαν στη συσκευή Vortex. Τέλος, τοποθετήθηκαν στη συσκευή της PCR με επιλεγμένο το πρόγραμμα του Toxoplasma για το εξωτερικό τμήμα του DNA. Ο κύκλος ήταν ο εξής: 1 ο βήμα 2 ο βήμα x 40 φορές 3 ο βήμα 94 ο C 10 min 94 ο C 1.5 min 72 ο C 10 min 45 ο C 1.5 min 15 ο C ~ 72 ο C 1.5 min 2. Δευτερογενής ή Εσωτερικός Πολλαπλασιασμός Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία όπως και στον πρωτογενή πολλαπλασιασμό με τις εξής δυο διαφορές: Οι εσωτερικοί primers ήταν οι TGC και 330 F. Το 2 ο βήμα επαναλήφθηκε 30 φορές. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν στη συσκευή της PCR με επιλεγμένο το πρόγραμμα του Toxoplasma για τον πολλαπλασιασμό του εσωτερικού τμήματος του DNA. 3.2.4.2. Πολλαπλασιασμός DNA για τη Giardia 1. Πρωτογενής ή Εξωτερικός Πολλαπλασιασμός Παρασκευάστηκε Master- Mix για 16 δείγματα (9 δείγματα θαλασσινού νερού και 3 από πηγάδια, 2 θετικά- 2 αρνητικά). Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία όπως στο Toxoplasma.

Η σύσταση του Mix ήταν η εξής: Συστατικό Όγκος σε μl 10x 30.0 MgCl 2 6.0 dntps 12.0 GiaF 1 24.0 GiaR 2 24.0 DMSO ** 15.0 Taq 1.2 H 2 O 163.8 Πίνακας 2: Συστατικά μίγματος * 1, * 2 : Εξωτερικοί primers για τον πρωτογενή πολλαπλασιασμό DNA της Giardia. ** : Χρησιμοποιείται για τη διάσπαση των δεσμών C- G. Το πρόγραμμα για τον εξωτερικό πολλαπλασιασμό DNA της Giardia ήταν το εξής: 1 ο βήμα 2 ο βήμα x 35 φορές 3 ο βήμα 96 ο C 4 min 96 ο C 45 sec 72 ο C 4 min 55 ο C 30 sec 15 ο C ~ 72 ο C 30 sec 2. Δευτερογενής ή Εσωτερικός Πολλαπλασιασμός H διαδικασία είναι η ίδια όπως παραπάνω με τις εξής δυο διαφορές: Οι εσωτερικοί primers ήταν οι RH11 και RH4. Το 2 ο βήμα επαναλήφθηκε 25 φορές. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν στη συσκευή της PCR με επιλεγμένο το πρόγραμμα της Giardia για τον πολλαπλασιασμό του εσωτερικού τμήματος του DNA.

Φωτογραφία 5: Τοποθέτηση δειγμάτων στη συσκευή PCR. 3.2.5. Ηλεκτροφόρηση Τελευταία ήταν η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης όπου φάνηκαν και τα αποτελέσματα όλης της εργασίας. 1.7 gr σκόνη αγαρόζης τοποθετήθηκαν σε υάλινη κωνική φιάλη και ζυγίστηκαν, αφού μηδενίστηκε το βάρος της φιάλης. Προστέθηκαν 100 ml αραιού διαλύματος ηλεκτροφόρησης. Η κωνική φιάλη τοποθετήθηκε σε φούρνο μικροκυμάτων, αναδεύοντας τακτικά με το χέρι, έως ότου διαλύθηκε εντελώς η αγαρόζη και το διάλυμα ήταν διάφανο. Αφέθηκε να κρυώσει κάτω από τρεχούμενο νερό βρύσης ώστε να αποκτήσει θερμοκρασία ανεκτή στο χέρι. Στη συνέχεια, το διάλυμα χύθηκε στην ειδική «θήκη» της συσκευής ηλεκτροφόρησης και απομακρύνθηκαν οι φυσαλίδες με μακρόστενο tip Eppendorf. Ειδικές «χτένες» προσαρμόστηκαν εντός του διαλύματος και αφέθηκε να πήξει σε θερμοκρασία δωματίου. Εν τω μεταξύ παρασκευάστηκαν οι δείκτες (markers) ως εξής: 11 μl αποστειρωμένο νερό 2.5 μl Buffer φορτώματος (loading) 1.6 μl δείκτες από 100-1000 ζεύγη βάσεων (ανά 100-200-...) Αφού έπηξε το gel αφαιρέθηκαν οι χτένες και η θήκη πληρώθηκε με αραιό διάλυμα ηλεκτροφόρησης μέχρι το ύψος των διακοπτών, καλύπτοντάς τους έως το μέσο. Και στις δυο σειρές υποδοχέων που σχηματίστηκαν από τις χτένες τοποθετήθηκαν 15 μl δείκτη, 20 μl από κάθε δείγμα, 20 μl θετικό δείγμα και 20 μl αρνητικό δείγμα.

Η αυτόματη μηχανική πιπέττα κρατήθηκε κάθετα με προσοχή για την αποφυγή διαρροής δείγματος μέσα στο διάλυμα και επιμόλυνσης των άλλων δειγμάτων. Με το τέλος της ηλεκτροφόρησης (50 λεπτά) το gel εμβαπτίστηκε σε διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου για 15 λεπτά υπό ήπια ανάδευση και ξεπλύθηκε με απιονισμένο νερό. Ύστερα το gel παρέμεινε σε απιονισμένο νερό για 15 λεπτά υπό ήπια ανάδευση. Το βήμα επαναλήφθηκε για χρόνο 10 λεπτών. Η διαδικασία ολοκληρώθηκε με τη λήψη φωτογραφιών του gel κάτω από UVακτινοβολία. Φωτογραφία 6: Gel με δείγματα κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης.

4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα δείγματα νερού που μελετήθηκαν αφορούν επιφανειακά ύδατα χερσαίας προέλευσης, υπόγεια ύδατα καθώς και δείγματα θαλασσινού νερού. Παρακάτω παρατίθενται πίνακες όπου αναγράφονται τα σημεία και οι ημερομηνίες δειγματοληψίας, η θερμοκρασία, το ph και ο όγκος κάθε δείγματος, καθώς και αν βρέθηκαν ή όχι τα υπό μελέτη παρασιτικά πρωτόζωα. Πίνακας 3 : Χαρακτηριστικά δειγμάτων και ανίχνευση παρασιτικών πρωτόζωων από τον ποταμό Ευεργέτουλα Ημερομηνία Δειγματοληψίας o C Καιρικές ph Όγκος Toxoplasma Giardia Cryptosporidium Δείγματος Συνθήκες Δείγματος Δείγματος σε λίτρα 03.07.03 21 Ήλιος _ 2.35 non- specific - - reaction 08.12.03 12 ήλιος, 8.64 10 n.d. - - σύννεφα 22.12.03 11 σύννεφα 8.39 9 n.d. - - 26.01.04 8 σύννεφα 8.12 8 n.d. - - 15.03.04 15 ήλιος 7.61 9 n.d. - - 19.04.04 16 σύννεφα 7.6 8 n.d. + - 26.04.04 20 ήλιος 7.9 8 n.d. - - 15.05.04 22 ήλιος, σύννεφα 7.25 8 n.d. - - n.d.: not done (δεν έγινε)

Πίνακας 4: Χαρακτηριστικά δειγμάτων και ανίχνευση παρασιτικών πρωτόζωων από το χείμαρρο Νησέλια Παμφίλων Ημερομηνία Δειγματοληψίας o C Καιρικές ph Όγκος Toxoplasma Giardia Cryptosporidium Δείγματος Συνθήκες Δείγματος Δείγματος σε λίτρα 02.07.03 24 ήλιος _ 2.35 - - - 10.11.03 12 ήλιος, 6.2 10 n.d. - - σύννεφα 15.12.03 9.5 βροχή 7.43 10 n.d. - - 22.12.03 8 ήλιος, 7.8 10 n.d. - - σύννεφα 26.01.04 6 σύννεφα 7.18 10 n.d. - - 15.03.04 9 ήλιος 7.53 10 n.d. - - 29.03.04 15 σύννεφα 7.98 8 n.d. - - 19.04.04 15 σύννεφα 7.4 8 n.d. - - 26.04.04 19 ήλιος 8.00 8 n.d. + - 10.05.04 21 ήλιος (μετά 7.45 8 n.d. - - από βροχόπτωση) 18.05.04 19.5 ήλιος, σύννεφα 7.3 8 n.d. - - n.d.: not done (δεν έγινε)

Πίνακας 5: Χαρακτηριστικά δειγμάτων και ανίχνευση παρασιτικών από το χείμαρρο Καγιανίου Ημερομηνία o C Καιρικές ph Όγκος Toxoplasma Giardia Cryptosporidium Δειγματοληψίας Δείγματος Συνθήκες Δείγματος Δείγματος σε λίτρα 30.06.03 _ ήλιος _ 2.35 - + - 15.12.03 12 βροχή 7.43 10 n.d. - - 29.03.04 14 σύννεφα 7.62 8 n.d. - - 26.04.04 14 σύννεφα 7.53 8 n.d. + - 10.05.04 21 ήλιος (μετά από βροχόπτωση) 18.05.04 18 ήλιος, σύννεφα 7.09 8 n.d. + - 8.33 8 n.d. - - n.d.: not done (δεν έγινε) Πίνακας 6: Χαρακτηριστικά δειγμάτων και ανίχνευση παρασιτικών πρωτόζωων από το χείμαρρο Μόριας Ημερομηνία Δειγματοληψίας o C Καιρικές ph Όγκος Toxoplasma Giardia Cryptosporidium Δείγματος Συνθήκες Δείγματος Δείγματος σε λίτρα 02.07.03 22 ήλιος _ 2.35 - - - 10.11.03 11 σύννεφα 6.68 10 n.d. - - 15.12.03 12 σύννεφα 8.48 8 n.d. - - 22.12.03 9 ήλιος, 8.38 10 n.d. - - σύννεφα 26.01.04 7 σύννεφα 7.68 9 n.d. - - 15.03.04 11 ήλιος 7.36 8 n.d. - - 19.04.04 15 σύννεφα 8.2 8 n.d. - - 18.05.04 19.5 σύννεφα 7.02 8 n.d. - - n.d.: not done (δεν έγινε)

Πίνακας 7: Χαρακτηριστικά δειγμάτων και ανίχνευση παρασιτικών πρωτόζωων από το χείμαρρο Μύλων Αεροδρομίου Ημερομηνία Δειγματοληψίας o C Καιρικές ph Όγκος Toxoplasma Giardia Cryptosporidium Δείγματος Συνθήκες Δείγματος Δείγματος σε λίτρα 30.06.03 _ ήλιος _ 2.35 - - - 10.11.03 14 ήλιος, 7.42 9 n.d. - - σύννεφα 15.12.03 14 σύννεφα, 8.78 9 n.d. - - βροχή 22.12.03 10 ήλιος, 8.57 8 n.d. - - σύννεφα 29.03.04 14 σύννεφα 8.02 8 n.d. - - 19.04.04 15 σύννεφα 8.8 8 n.d. - - 26.04.04 15 σύννεφα 8.32 8 n.d. - - 10.05.04 20 ήλιος (μετά 7.13 8 n.d. - - από βροχόπτωση) 18.05.04 18.5 σύννεφα 9.02 8 n.d. - - n.d.: not done (δεν έγινε) Πίνακας 8: Χαρακτηριστικά δειγμάτων και ανίχνευση παρασιτικών πρωτόζωων χειμάρρου Ασπροπόταμου Ημερομηνία Τοποθεσία Δειγματοληψίας 01.07.03 Ασπροποτάμι Μανταμάδου 01.07.03 Ασπροποτάμι, οικισμός 01.07.03 Ασπροποτάμι, Λιμανάκι o C Καιρικές ph Όγκος Toxoplasma Giardia Cryptosporidium Δείγματος Συνθήκες Δείγματος σε λίτρα 22 ήλιος _ 2.35 - - - 21 ήλιος _ 2.35 - - - 22 ήλιος _ 2.35 n.d. - - n.d.: not done (δεν έγινε)

Πίνακας 9: Χαρακτηριστικά δειγμάτων και ανίχνευση παρασιτικών πρωτόζωων από πηγάδια Ημερομηνία Τοποθεσία Δειγματοληψίας 30.06.03 Βαρειά (ιδιοκτήτης: Ταλιάνης) 02.07.03 Πάμφιλα, ιδιοκτήτης: Αντωνέλλος, (εκτός οικισμού) 02.07.03 ομοίως αλλά εντός του οικισμού 24.11.03 Βαρειά (Ταλιάνης) 24.11.03 Πάμφιλα (Κατσιάνου) o C Καιρικές ph Όγκος Toxoplasma Giardia Cryptosporidium Δείγματος Συνθήκες Δείγματος Δείγματος σε λίτρα _ ήλιος _ 2.35 non- - - specific reaction 17 ήλιος _ 2.35 - - - 19 ήλιος _ 2.35 - - - _ ήλιος 7.49 10 n.d. - - _ ήλιος 7.3 10 n.d. - - 24.11.03 Πάμφιλα _ ήλιος 7.2 8 n.d. - - 24.11.03 Βαρειά _ ήλιος 7.16 9 n.d. - - (Λώριετ) 26.01.04 Κεραμειά 15 σύννεφα 6.9 9 n.d. - - (Μαρίνος) 15.03.04 Πάμφιλα 15 ήλιος 7.28 10 n.d. - - (Κατσιάνου) 29.03.04 Παυλάκη 17 ήλιος, σύννεφα 7.62 8 n.d. - - n.d.: not done (δεν έγινε)

Πίνακας 10: Χαρακτηριστικά δειγμάτων και ανίχνευση παρασιτικών πρωτόζωων από τη θάλασσα Ημερομηνία Τοποθεσία Δειγματοληψίας 30.06.03 Μακρύγιαλος, Ναυτικός Όμιλος o C Καιρικές ph Όγκος Toxoplasma Giardia Cryptosporidium Δείγματος Συνθήκες Δείγματος Δείγματος σε λίτρα _ ήλιος _ 2.35 - - - 07.07.03 εμπορικό λιμάνι _ ήλιος _ 2.35 - - - 07.07.03 κολυμβητήριο _ ήλιος _ 2.35 - - - 07.07.03 Παλιό Λιμεναρχείο _ ήλιος _ 2.35 non- specific - - reaction 07.07.03 θέση «Αμφιτρίτης» _ ήλιος _ 2.35 - - - 08.07.03 Μακρύγιαλος, _ ήλιος _ 2.35 non- specific - - Ναυτικός Όμιλος reaction 08.07.03 λιμανάκι μπροστά _ ήλιος _ 2.35 - - - από Ναυτικό Όμιλο 08.07.03 κάτω από το Ξενία _ ήλιος _ 2.35 non- specific - - (κτίρια Παν/μίου) reaction 08.07.03 Βαρειά, αλιευτικό καταφύγιο _ ήλιος _ 2.35 non- specific reaction - - n.d.: not done (δεν έγινε)

Πίνακας 11: Ανίχνευση παρασιτικών πρωτόζωων και χαρακτηριστικά μεμονωμένων δειγμάτων γλυκού νερού Ημερομηνία Τοποθεσία Δειγματοληψίας 01.07.03 δεξαμενή συλλογής όμβριωνπότισμα ζώων, Μανταμάδου 03.07.03 πηγή Τσίγκου, Ευεργέτουλας 03.07.03 πριν την Καρίνη, πηγές Ευεργέτουλα 03.07.03 Άγιος Δημήτριος Πολιχνίτου, πηγές Ευεργέτουλα 10.11.03 βρύση περιοχή Μόριας o C Καιρικές ph Όγκος Toxoplasma Giardia Cryptosporidium Δείγματος Συνθήκες Δείγματος Δείγματος σε λίτρα 23 ήλιος _ 2.35 - - - 18 ήλιος _ 2.35 - - - 16 ήλιος _ 2.35 - - - 16 ήλιος _ 2.35 - - - 17 σύννεφα 6.9 8 n.d. - - n.d.: not done (δεν έγινε)