Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Ιατρικής Εργαστήριο Βιοχημείας ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι Ωρολόγιο Πρόγραμμα Αναλυτικό Διάγραμμα Μελέτης Οδηγός Εργαστηριακών Ασκήσεων Σ. Μπονάνου Τζεδάκη, Γ. Σίμος, Ε. Γεωργάτσου, Π. Λιάκος Λάρισα 2010 0
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πληροφορίες 1 Ωρολόγιο Πρόγραμμα 2 Διάγραμμα Μελέτης 4 Βιβλιογραφία 15 Κανόνες Ασφάλειας Εργαστηρίου 17 Άσκηση 1 18 Ανάλυση Αμινοξέων & Πρωτεϊνών Άσκηση 2 25 Προσδιορισμός και Ηλεκτροφόρηση Αιμοσφαιρινών Ασκήσεις 3-5 32 Κινητική Ενζυμικών Αντιδράσεων Άσκηση 3 37 Κινητική Ενζυμικών Αντιδράσεων Α Άσκηση 4 40 Κινητική Ενζυμικών Αντιδράσεων Β Άσκηση 5 49 Κινητική Ενζυμικών Αντιδράσεων Γ Άσκηση 6 54 Προσδιορισμός Τρανσαμινασών - Ουρίας Σελίδα Ευχαριστίες 62 1
ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΓΙΑ ΤΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΤΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Η διδασκαλία των μαθημάτων Βιοχημείας Ι και ΙΙ συνίσταται από διαλέξεις και εργαστηριακές ασκήσεις. Οι διαλέξεις αναπτύσσουν την ύλη που περιγράφεται γενικά στον οδηγό σπουδών και με λεπτομέρεια στην Αναλυτική Ύλη που επισυνάπτεται σε αυτό το Φυλλάδιο μαζί με το Πρόγραμμα των διαλέξεων. Οι εργαστηριακές ασκήσεις αποτελούν την πρακτική άσκηση των φοιτητών και είναι απαραίτητο συμπλήρωμα των διαλέξεων. Σκοπός τους είναι να σας εξοικειώσουν με την χρήση διαφόρων τεχνικών, την λειτουργία διαφόρων οργάνων και την διεξαγωγή διαφόρων δοκιμασιών που χρησιμοποιούνται συχνά στην Βιοχημεία, καθώς και στο να σας βοηθήσουν να κατανοήσετε μερικές έννοιες που δεν γίνονται σαφώς αντιληπτές θεωρητικά. Τις ασκήσεις θα τις κάνετε σε ομάδες τριών φοιτητών. Οι ομάδες σχηματίζονται στην αρχή του εξαμήνου και παραμένετε στην ίδια ομάδα όλο το εξάμηνο. Η συμμετοχή στις ασκήσεις καθώς και η γραπτή αναφορά των αποτελεσμάτων των ασκήσεων, η οποία γίνεται από τους φοιτητές στην διάρκεια των εργαστηρίων στο φυλλάδιο του εργαστηρίου, είναι υποχρεωτική. Οι φοιτητές πρέπει να προσέρχονται στα εργαστήρια κατάλληλα προετοιμασμένοι (έχοντας διαβάσει το Φυλλάδιο) και εξοπλισμένοι (μολύβια, χάρακες, κομπιουτεράκια κλπ) για να εκτελέσουν σωστά τα πειράματα και να επεξεργαστούν τα αποτελέσματα συμπληρώνοντας με επιτυχία την αναφορά των αποτελεσμάτων. Η αναφορά περιλαμβάνει τις μετρήσεις (παρουσιασμένες σε πίνακες, σχεδιαγράμματα κ.λ.π.), και τα συμπεράσματα που βγάζετε (π.χ. αν πήρατε τα αναμενόμενα αποτελέσματα, αν όχι γιατί όχι, πηγές πιθανών λαθών στα πειράματα κ.λ.π) όπως ζητά κάθε άσκηση. Στο τέλος κάθε άσκησης, η γραπτή αναφορά ελέγχεται από τους διδάσκοντες και υπογράφεται, εφόσον έχει συμπληρωθεί σωστά. Η επιτυχής συμμετοχή στην άσκηση πιστοποιείται από την υπογραφή του διδάσκοντος στη γραπτή αναφορά των αποτελεσμάτων. Στο τέλος του εξαμήνου οι φοιτητές εξετάζονται γραπτά στο περιεχόμενο των Εργαστηρίων. Στις εξετάσεις του Εργαστηρίου εξεταστέα ύλη είναι η θεωρία, η μεθοδολογία και οι τρόποι επεξεργασίας αποτελεσμάτων που περιλαμβάνονται στο Φυλλάδιο ή αναπτύσσονται από τους διδάσκοντες κατά την διάρκεια των εργαστηρίων. Δικαίωμα συμμετοχής στις εξετάσεις του Εργαστηρίου έχουν μόνον όσοι συμμετείχαν με επιτυχία στις εργαστηριακές ασκήσεις. Οι εξετάσεις του μαθήματος είναι γραπτές, διάρκειας 3 ωρών, και αποτελούνται από θέματα προς ανάπτυξη ή πολλαπλής επιλογής. Εξεταστέα ύλη αποτελεί η Αναλυτική Ύλη που επισυνάπτεται σε αυτό το Φυλλάδιο. Δικαίωμα συμμετοχής σε αυτές τις εξετάσεις έχουν μόνον όσοι φοιτητές πέρασαν τις εξετάσεις του Εργαστηρίου. Ο τελικός βαθμός του μαθήματος υπολογίζεται κατά 80% από τον βαθμό των γραπτών εξετάσεων του μαθήματος και κατά 20% από τον βαθμό των γραπτών εξετάσεων του Εργαστηρίου. 1
ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι Πρόγραμμα Διδασκαλίας Εαρινού Εξαμήνου Ακαδ. Έτους 2009-2010 Τα Εργαστήρια και τα Φροντιστήρια είναι υποχρεωτικά Ημερομηνία Ώρα Θέμα Αίθουσα Πέμπτη 25/2 13-15 Εισαγωγή στη Βιοχημεία Βιοχημική εξέλιξη ΜΑ1 Παρασκ. 26/2 11-13 Δομή & βιολογικός ρόλος αμινοξέων και πεπτιδίων Αίθ. 1 Τετ. 3/3 9-11 Δομή & βιολογικός ρόλος πρωτεϊνών ΜΑ1 Πέμπτη 4/3 13-15 Μέθοδοι απομόνωσης & μελέτης πρωτεϊνών ΜΑ1 Παρασκ. 5/3 11-13 Χημική & ανοσολογική ανάλυση πρωτεϊνών Αίθ. 1 Τετ. 10/3 9-11 Ένζυμα: Εισαγωγή ΜΑ1 Πέμπτη 11/3 13-15 Εργαστήριο 1 ο : Ανάλυση Αμινοξέων & Πρωτεϊνών -Α Εργ. ΒΧ Παρασκ. 12/3 11-12 Ένζυμα: Κινητική ΜΑ1 Παρασκ. 12/3 12-14 Εργαστήριο 1 ο : Ανάλυση Αμινοξέων & Πρωτεϊνών -Β Εργ. ΒΧ Τετ. 17/3 9-11 Ένζυμα: Στρατηγικές κατάλυσης Ι ΜΑ1 Πέμπτη 18/3 13-15 Ένζυμα: Στρατηγικές κατάλυσης ΙΙ ΜΑ1 Παρασκ. 19/3 11-13 Ένζυμα: Ρύθμιση ενεργότητας Αίθ. 1 Τετ. 24/3 9-11 Πρωτεΐνες μεταφοράς οξυγόνου-αιμοσφαιρίνη ΜΑ1 Πέμπτη 25/3 13-15 --- - Παρασκ. 26/3 11-12 Πρωτεΐνες συνδετικού ιστού-κολλαγόνο ΜΑ1 ΔΙΑΚΟΠΕΣ ΠΑΣΧΑ Τετ. 14/4 9-11 Εργαστήριο 2 ο : Ανάλυση Αιμοσφαιρινών - Α Εργ. ΒΧ Πέμπτη 15/4 13-15 Εργαστήριο 2 ο : Ανάλυση Αιμοσφαιρινών Β Εργ. ΒΧ Παρασκ. 16/4 - Συνέδριο Φοιτητών Ιατρικής - Τετ. 21/4 9-11 Δομή και λειτουργία υδατανθράκων & λιπιδίων ΜΑ1 Πέμπτη 22/4 13-15 Εργαστήριο 3 ο : Κινητική Ενζύμων Ι - Α Εργ. ΒΧ Παρασκ. 23/4 11-12 Σύσταση και λειτουργία βιολογικών μεμβρανών ΜΑ1 Παρασκ. 23/4 13-15 Εργαστήριο 3 ο : Κινητική Ενζύμων Ι - Β Εργ. ΒΧ Τετ. 28/4 9-11 Εισαγωγή στο Μεταβολισμό ΜΑ1 Πέμπτη 29/4 13-15 Εργαστήριο 4 ο : Κινητική Ενζύμων ΙΙ - Α Εργ. ΒΧ Παρασκ. 30/4 11-12 Πέψη και αποικοδόμηση υδατανθρακών - Γλυκόλυση ΜΑ1 Παρασκ. 30/4 12-14 Εργαστήριο 4 ο : Κινητική Ενζύμων ΙΙ - Β Εργ. ΒΧ Τετ. 5/5 9-11 Ρύθμιση Γλυκόλυσης - Γλυκονεογένεση ΜΑ1 Πέμπτη 6/5 13-15 Εργαστήριο 5 ο : Κινητική Ενζύμων ΙΙΙ - Α Εργ. ΒΧ Παρασκ. 7/5 11-12 Ο Κύκλος του Krebs MA1 Παρασκ. 7/5 12-14 Εργαστήριο 5 ο : Κινητική Ενζύμων ΙΙΙ - Β Εργ. ΒΧ 2
Τετ. 12/5 9-11 Οξειδωτική φωσφορυλίωση: Αναπνευστική Αλυσίδα ΜΑ1 Πέμπτη 13/5 13-15 Οξειδωτική φωσφορυλίωση: Σύνθεση ATP ΜΑ1 Παρασκ. 14/5 11-13 Οδός φωσφορικών πεντοζών Αίθ. 1 Τετ. 19/5 9-11 Μεταβολισμός γλυκογόνου ΜΑ1 Πέμπτη 20/5 13-15 Πέψη και αποικοδόμηση λιπιδίων ΜΑ1 Παρασκ. 21/5 11-13 Σύνθεση λιπαρών οξέων Αίθ. 1 Τετ. 26/5 9-11 Πέψη και αποικοδόμηση πρωτεϊνών & αμινοξέων ΜΑ1 Πέμπτη 27/5 13-15 Εργαστήριο 6 ο : Τρανσαμινάσες Ουρία - Α Εργ. ΒΧ Παρασκ. 28/5 11-12 Ολοκλήρωση μεταβολισμού ΜΑ1 Παρασκ. 28/5 12-14 Εργαστήριο 6 ο : Τρανσαμινάσες Ουρία - Β Εργ. ΒΧ Τετ. 2/6 9-11 Ολοκλήρωση μεταβολισμού ΜΑ1 Πέμπτη 3/6 13-15 Φροντιστήριο: Επανάληψη Πρωτεΐνες-Ένζυμα ΜΑ1 Παρασκ. 4/6 11-13 Φροντιστήριο: Επανάληψη Καταβολισμού ΜΑ1 Τετ. 9/6 9-11 Φροντιστήριο: Επανάληψη Ύλης Εργαστηρίων ΜΑ1 Πέμπτη 10/6 13-15 - Παρασκ. 11/6 11-13 ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΑ1/2 3
ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Ι Β ΕΞΑΜΗΝΟ Διάγραμμα Μελέτης Αναλυτική ύλη μαθήματος Οδηγός 2009-2010 4
Σκοποί του μαθήματος Η κατανόηση των βασικών κυτταρικών λειτουργιών σε μοριακό επίπεδο με την μελέτη: της δομής και των ιδιοτήτων των πρωτεϊνών και ενζύμων των τρόπων παραγωγής και αποθήκευσης ενέργειας του ενδιάμεσου μεταβολισμού των κυρίων βιομορίων και των μηχανισμών ρύθμισής τους. Στα πλαίσια του Προγράμματος Αναμόρφωσης των Προπτυχιακών Σπουδών του Τμήματος Ιατρικής του Π. Θ., η ύλη του μαθήματος Βιοχημεία Ι έχει διαμορφωθεί ως εξής: Α. Οι δεξιότητες που πρέπει να αποκτήσουν οι φοιτητές για να θεωρείται επιτυχημένη η παρακολούθηση τους. Β. Η ύλη που πρέπει να γνωρίζουν καλά οι φοιτητές για να επιτύχουν στο μάθημα καθώς και το υλικό που πρέπει να έχουν ακούσει οι φοιτητές για να είναι ολοκληρωμένη η διδασκαλία του μαθήματος. 5
Α. Δεξιότητες που απαιτούνται στα Εργαστήρια της Βιοχημείας Ι Γενικές δεξιότητες Οι δεξιότητες αποκτώνται κατά την υποχρεωτική παρακολούθηση των εργαστηριακών ασκήσεων και φροντιστηρίων. Ο φοιτητής που θα ολοκληρώσει με επιτυχία τα παραπάνω θα πρέπει να έχει αποκτήσει την ικανότητα να παρατηρεί φαινόμενα στο εργαστήριο, να καταγράφει και να αναλύει δεδομένα την ικανότητα να βγάζει συμπεράσματα από δεδομένα την ικανότητα να λύνει προβλήματα την ικανότητα να κατασκευάζει γραφικές παραστάσεις από δεδομένα την ικανότητα να εξάγει πληροφορίες από γραφικές παραστάσεις την ικανότητα να χειρίζεται τον βασικό εξοπλισμό εργαστηρίου Κλινικής Χημείας και Βιοχημείας την ικανότητα να εργάζεται αποτελεσματικά σε μια ομάδα την ικανότητα να εργάζεται με ασφάλεια σε εργαστηριακό περιβάλλον την ικανότητα να ακολουθεί οδηγίες την ικανότητα να αντιλαμβάνεται τα εργαστηριακά λάθη και να αναγνωρίζει τις πηγές τους Ειδικές δεξιότητες Ο φοιτητής θα πρέπει να είναι σε θέση να αναλύσει ένα μίγμα αμινοξέων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας βρίσκει το ισοηλεκτρικό σημείο μιας πρωτεΐνης με βάση τη διαλυτότητά της σε διαφορετικά ph. προσδιορίζει την επίδραση της θερμοκρασίας, του ph και της συγκέντρωσης του υποστρώματος στην ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης. υπολογίζει πειραματικά τις ενζυμικές κινητικές παραμέτρους Km και Vmax. να χρησιμοποιεί την κινητική ανάλυση για να προσδιορίσει το είδος της ενζυμικής ρύθμισης. προσδιορίσει την συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης στο αίμα με την αντίδραση Drabkin αναλύσει τις αιμοσφαιρίνες δείγματος αίματος με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή και να διαγνώσει την ύπαρξη μεταλλαγμένων αιμοσφαιρινών να προσδιορίσει τα επίπεδα τρανσαμινασών και ουρίας στο ορό αίματος 6
Β. Αναλυτική ύλη της θεωρίας του μαθήματος Βιοχημεία Ι Δομή και λειτουργία των πρωτεϊνών Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά την γενική χημική δομή των L-α-αμινοξέων και τις ιοντικές τους ιδιότητες (Zwitterion) την χημική δομή των 20 πρωτεϊνογόνων αμινοξέων και τις φυσικοχημικές ιδιότητες (υδροφοβικοτητα, πολικότητα, φορτίο κλπ) που απορρέουν από αυτή τον σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, τις δομές συντονισμού του και την σημασία τους για τις στερεοχημικές ιδιότητες των πεπτιδίων τις συμβάσεις για την αναπαράσταση και ονοματολογία ενός πεπτιδίου τον βιολογικό ρόλο και τις βασικές ιδιότητες των πρωτεϊνών (αμφολυτικο χαρακτήρα, ισοηλεκτρικο σημείο, διαλυτότητα, οπτική απορρόφηση). τις έννοιες της πρωτοταγούς, δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής των πρωτεϊνών τους δεσμούς που σταθεροποιούν την τρισδιάστατη διαμόρφωση των πρωτεϊνών για τις κύριες δευτεροταγείς δομές: α-έλικα, β-πτυχωτή επιφάνεια για τη τριτοταγή και τεταρτοταγή δομή και τη στερεοδιάταξη των πρωτεϊνών για τη σχέση πρωτοταγούς δομής και τελικής τρισδιάστατης διαμόρφωσης για την αποδιάταξη μετουσίωση, αναδίπλωση πρωτεϊνών Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για το διάγραμμα Rachamandran και τις δυνατές τιμές των γωνιών φ και ψ του πεπτιδικού δεσμού o για τις υπερδευτεροταγείς δομές (μοτίβα) και δομικές επικράτειες των πρωτεϊνών o για τις δομές των πρωτεϊνών: ινσουλίνη, λυσοζύμη, φερρτίνη, κερατίνη, κυτόχρωμα b, μυοσφαιρίνη o για τις τράπεζες πληροφοριών των πρωτεϊνών o για τους μοριακούς συνοδούς και τη δράση τους Μεθοδολογία ανάλυσης των πρωτεϊνών Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τις βασικές αρχές των μεθόδων απομόνωσης, καθαρισμού και ανάλυσης πρωτεϊνών: διαφορική φυγόκεντρηση, κλασματική καθίζηση, διαπίδυση, χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας, χρωματογραφία στήλης, ηλεκτροφόρηση, ισοηλεκτρική εστίαση, υπερφυγοκέντρηση, φασματοσκοπία μαζών. τις βασικές αρχές της μεθοδολογίας προσδιορισμού της αμινοξικής αλληλουχίας τις βασικές αρχές των ανοσολογικών τεχνικών που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση πρωτεϊνών (ELISA, ανοσοαποτύπωση, μικροσκοπία ανοσο-φθορισμού). Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τον ορισμό και σημασία του πρωτεώματος και τη σχέση του με το γονιδίωμα o για την βασική δομή και ιδιότητες των αντισωμάτων o για την σημασία και τον τρόπο παρασκευής μονοκλωνικών αντισωμάτων o για την μεθοδολογία σύνθεσης πεπτιδίων o για την μεθοδολογία προσδιορισμού της δομής με κρυσταλλογραφία μέσω ακτίνων Χ και NMR.. 7
Ένζυμα: Αρχές κατάλυσης και κινητική Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τις διαφορές μεταξύ ένζύμων και τους απλούς καταλύτες ως προς την εξειδίκευση και τους μηχανισμούς κατάλυσης το ρόλο των συνενζύμων και των συμπαραγόντων σε ορισμένα ένζυμα. το μοντέλο των Michaelis-Menten και την εξήγηση των κινητικών ιδιοτήτων των ενζύμων. τι αποκαλύπτουν οι τιμές των σταθερών Km και Vmax για ένα ένζυμο. για την ενζυμική αναστολή και ενζυμικούς στόχους: Αντιστρεπτή και μη αντιστρεπτή αναστολή. Συναγωνιστική και μη συναγωνιστική. Παραδείγματα αναστολέων. για τις στρατηγικές κατάλυσης από τάξεις ενζύμων: Βασικές αρχές κατάλυσης Πρωτεάσες - αργή ταχύτητα κατάλυσης Ανθρακικές ανυδράσες - υψηλή ταχύτητα αντίδρασης Περιοριστικά ένζυμα κατάλυση υψηλής εξειδίκευσης Κινάσες μονοφωσφορικών νουκλεοζιτών - μεταφορά φωσφορικών ομάδων μεταξύ νουκλεοτιδίων Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για το ενεργό κέντρο (σημασία τριτοταγούς δομής πρωτεϊνών), σύνδεση υποστρώματος (μοντέλα) και στερεοειδικότητα. o για θερμοδυναμικές έννοιες (ενεργειακό διάγραμμα, σχέση ΔG o και Κeq ) o ότι οι περισσότερες βιοχημικές αντιδράσεις περιλαμβάνουν πολλαπλά υποστρώματα Ένζυμα: Ρυθμιστικοί μηχανισμοί Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά για τους μηχανισμούς ρύθμισης της ενζυμικής δραστικότητας: Αλλοστερικά ένζυμα : τα χαρακτηριστικά τους, ομότροπες και ετερότροπες επιδράσεις, συνεργατική σύνδεση υποστρώματος με το ένζυμο (μοντέλα), σιγμοειδή διαγράμματα. Αλλοστερική ρύθμιση της ασπαραγινικής τρανσκαρβαμοϋλάσης Ισοένζυμα Ομοιοπολική τροποποίηση-φωσφορυλίωση Πρωτεολυτική ενεργοποίηση - πεπτικά ένζυμα Πρωτεΐνες μεταφοράς οξυγόνου Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά την γενική δομή της αίμης τα χαρακτηριστικά και τα κύρια αμινοξέα του θύλακα της αίμης για την καμπύλη σύνδεσης Ο 2 της μυοσφαιρίνης για τη δομή και τις υπομοναδες της αιμοσφαιρινης για τη καμπύλη σύνδεσης Ο 2 της αιμοσφαιρίνης για τη μοριακή βάση και σημασία του αλλοστερικού φαινόμενου της αιμοσφαιρίνης για την επιδραση του 2,3-ΒPG και το φαινόμενο BOHR 8
για τη μοριακή βάση και ανίχνευση της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας γενικά για τις θαλασσαιμίες. Πρωτεΐνες του συνδετικού ιστού Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τα συστατικά του συνδετικού ιστού τη δομή, χαρακτηριστική σύσταση, τροποποιήσεις, βιοσύνθεση και ρόλο του κολλαγόνου τη δομή, χαρακτηριστική σύσταση, τροποποιήσεις και ρόλο της ελαστίνης τη δομή, χαρακτηριστική σύσταση και ρόλο των πρωτεογλυκανών και των γλυκοζαμινογλυκανών τη δομή και ρόλο της ινοσυνδετίνης τις γενετικές και παθολογικές ανωμαλίες του συνδετικού ιστού (σκορβούτο, λαθυρισμός, σύνδρομα Ehlers-Danlos, ατελή οστεογένεση) Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τους διαφορετικούς τύπους κολλαγόνου o για τον ρόλο των κολλαγόνων μη-ινώδους τύπου o για τον ρόλο του κολλαγόνου στη κατανομή και κίνηση των ινοβλαστών o για τον ρόλο και τη σύσταση του βασικού υμένα (κολλαγόνο τύπου IV, λαμινίνη) o για τη δομή και ρόλο των ιντεγκρινών Λιπίδια, βιολογικές μεμβράνες και μεμβρανική μεταφορά Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τα δομικά χαρακτηριστικά και την ονοματολογία των λιπιδίων τα δομικά χαρακτηριστικά, τη χημική σύσταση και τις ιδιότητες των βιολογικών μεμβρανών τον ρόλο πρωτεϊνών και λιπιδίων στη δομή και λειτουργία των μεμβρανών. τους παράγοντες που επηρεάζουν τη ρευστότητα των μεμβρανών για την κίνηση λιπιδίων και πρωτεϊνών μέσα στις μεμβράνες παραδείγματα δομής μεμβρανικών πρωτεϊνών. για την παθητική και ενεργό μεταφορά διαμέσου των μεμβρανών. για αντλίες ιόντων, συζευγμένους μεταφορείς, μεμβρανικά κανάλια, χασματοσυνδέσεις (δομικά χαρακτηριστικά, τρόπος λειτουργίας, διαφορές και ομοιότητες μεταξύ τους). για τη λειτουργία των καρδιοτονωτικών μέσω της αντλίας καλίου-νατρίου το παράδειγμα της δράσης της ασπιρίνης μέσω αναστολής της μεμβρανικής συνθάσης-1 της προσταγλανδίνης Η 2. Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o παραδείγματα σύστασης μεμβρανών σε λιπίδια o ότι τα λιπίδια έχουν και εξειδικευμένες κυτταρικές λειτουργίες o για τις υδρόφοβες προσθετικές ομάδες πρωτεϊνών o για τις μεθόδους FRAP και FLIP παρακολούθησης της κίνησης των πρωτεϊνών στη μεμβράνη. 9
Εισαγωγή στο Mεταβολισμό Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τις βασικές έννοιες του μεταβολισμού, τη σχέση μεταξύ αναβολισμού και καταβολισμού, τα κοινά μοτίβα αντιδράσεων. για την ελεύθερη ενέργεια αντίδρασης και τη σημασία της για την έννοια της σύζευξης αντιδράσεων. για τον ρόλο του ATP και τους τρόπους παραγωγής του τον ρόλο των οξειδοαναγωγικών συνενζύμων (NAD, νιασίνη, FAD, NADP) και του ακέτυλο-συνένζυμου Α. για το ρόλο της φωσφορικής κρεατίνης στους μυς για τους τρόπους ρύθμισης μεταβολικών πορειών και για το ενεργειακό φορτίο του κυττάρου. Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τους διαφόρους τύπους βασικών αντιδράσεων του μεταβολισμού Γλυκόλυση ` Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τον βιολογικό ρόλο και τη χημική φύση της γλυκόζης τις αντιδράσεις της γλυκόλυσης και τα ένζυμα που τις καταλύουν την ενεργειακή απόδοση της γλυκόλυσης τις μεταβολικές τύχες πυροσταφυλικού και τη διατήρηση του ισοζυγίου οξειδοαναγωγής τη σημασία της γλυκόλυσης ως αναερόβιας οδού, τη σημασία των ισοενζύμων της γαλακτικής δεϋδρογονάσης και την διαχείριση του γαλακτικού από τον ανθρώπινο οργανισμό τον μεταβολισμό της φρουκτόζης και γαλακτόζης για τη γαλακτοζαιμία και τη δυσανεξία σε φρουκτόζη και λακτόζη τη ρύθμιση της γλυκόλυσης: ρύθμιση της φωσφοφρουκτοκινάσης και ο ρόλος της 2,6, διφωσφορικής φρουκτόζης σημασία των ισοενζύμων για την ιστική μεταβολική εξειδίκευση (εξοκινάση/γλυκοκινάση, φωσφοφρουκτοκινάση, κινάση του πυροσταφυλικού) ρύθμιση κατά την μυϊκή ηρεμία και την έντονη μυϊκή άσκηση για τους μεταφορείς γλυκόζης GLUT για τη σημασία της γλυκόλυσης στον καρκίνο Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για την σημασία της υποξίας και του παραγοντα HIF-1 στην ανάπτυξη και καταπολέμηση των συμπαγών όγκων Γλυκονεογένεση Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τα πρόδρομα μόρια σύνθεσης της γλυκόζης 10
τις αντιδράσεις τις γλυκονεογένεσης και το ενεργειακό της κόστος τη ρύθμιση των μη αντιστρεπτών αντιδράσεων για την αντίρροπη ρύθμιση γλυκόλυσης-γλυκονεογένεσης τον κύκλο του Cori και τον κύκλο της αλανίνης. Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τους κύκλους υποστρωμάτων και τη φυσιολογική τους σημασία. Κύκλος του κιτρικού οξέος (Κrebs) Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά για την μετατροπή του πυροσταφυλικού σε ακέτυλο-συνένζυμο Α στα μιτοχόνδρια και τη ρύθμιση της αντίδρασης τις αντιδράσεις του κύκλου του Krebs και τα ένζυμα που τις καταλύουν, τη ρύθμιση των κομβικών ενζύμων και την ενεργειακή απόδοση την ρύθμιση του κύκλου από το ενεργειακό φορτίο και τις ορμόνες τις αναπληρωτικές αντιδράσεις του κύκλου για τα ενδιάμεσα του κύκλου που είναι βιοσυνθετικά πρόδρομα τη βιοχημική βάση της νόσου Μπέρι-μπέρι και της δηλητηρίαση από υδράργυρο ή αρσενικό Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για την σχέση μεταξύ της πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης και της α-κετογλουταρικής αφυδρογονάσης. o για την ακονιτάση ως πρωτεΐνη σιδήρου-θείου o για τον κύκλο του γλυοξυλικού οξέος Αναπνευστική αλυσίδα οξειδωτική φωσφορυλίωση Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τα σύμπλοκα, τους κινητούς μεταφορείς ηλεκτρονίων της αναπνευστικής αλυσίδας και τις προσθετικές ομάδες μεταφοράς ηλεκτρονίων για τη δομή και εξέλιξη του κυτόχρωματος c για την δημιουργία ριζών οξυγόνου (ROS) και την καταπολέμηση τους τι είναι και πως δημιουργείται το χημειοσμωτικό φαινόμενο (υπόθεση Mitchel). τη γενική δομή και λειτουργία της F 0 F 1 -ATPάσης για την πρωτονιοκίνητη δύναμη και τη σύζευξη της αναπνευστικής αλυσίδας με την οξειδωτική φωσφορυλίωση τη ρύθμιση της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης (αναπνευστικός έλεγχος). την αναστολή και αποσύζευξη της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. τους τρόπους μεταφοράς των ηλεκτρονίων του κυτταροπλασματικού NADH στο μιτοχόνδριο (συστήματα φωσφορικής γλυκερόλης και μηλικού/ασπαρτικού) για τη μεταφορά του ΑΤΡ μέσα και έξω από το μιτοχόνδριο. την ενεργειακή απόδοση της αναπνευστικής αλυσίδας και της πλήρους καύσης της γλυκόζης 11
Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τα δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά του μιτοχονδρίου o για τα δυναμικά οξειδοαναγωγής o για τον μηχανισμό μοριακού κινητήρα της F 0 F 1 -ATPάσης o για τις μιτοχονδριακές νόσους και τον ρόλο των μιτοχονδρίων στην απόπτωση, τον καρκίνο και τη γήρανση Οδός των φωσφορικών πεντοζών Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τη σημασία της οδού των φωσφορικών πεντοζών στην παραγωγή NADPH και πεντοζών και τον συντονισμό της με την γλυκόλυση σε ποιους ιστούς είναι ενεργή, πότε και γιατί τις γενικές αντιδράσεις οξειδωτικού και μη οξειδωτικού κλάδου. τις επιπτώσεις και βιοχημική βάση της ανεπάρκειας G6PD (φαρμακοεπαγόμενη αιμολυτική αναιμία, φαβισμός) για την ανεπάρκεια θειαμίνης και το σύνδρομο Wernicke-Korsakoff Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o τις ειδικές αντιδράσεις της οδού των φωσφορικών πεντοζών Μεταβολισμός γλυκογόνου Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τη δομή, φυσικές και χημικές ιδιότητες του γλυκογόνου. για το ρόλο του γλυκογόνου ως αποθήκη γλυκόζης για την αποικοδόμηση του γλυκογόνου και τη ρύθμιση της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου αλλοστερικά και ορμονικά τον ρόλο του κυκλικού ΑΜΡ ως ενδοκυττάριου μηνύματος κα τη σημασία του «καταρράκτη αντιδράσεων» για τη σύνθεση γλυκογόνου και τη ρύθμιση της συνθάσης του γλυκογόνου. για τη σημασία της γλυκογονόλυσης και γλυκογονογένεσης στο ήπαρ και τους μυς για τις νόσους αποθήκευσης γλυκογόνου (γενικά και ειδικά για τις νόσους Von Gierke και McArdle) Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τη γλυκογενίνη o για τη φωσφορυλάση a ως αισθητήριο σύστημα της γλυκόζης στο ήπαρ o για τον ρόλο της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 1 (PP1) στη ρύθμιση του μεταβολισμού του γλυκογόνου Πέψη και αποικοδόμηση λιπιδίων Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τη δομή και ονοματολογία των λιπιδίων για τη πέψη των λιπιδίων της τροφής και τη κινητοποίηση τους από το λιπώδη ιστό για τη σύγκριση της απόδοσης αποθήκευσης ενέργειας σε μορφή τριακυλογλυκερολών ή γλυκογόνου για την αξιοποίηση της γλυκερόλης των λιπιδίων 12
για την ενεργοποίηση των λιπαρών οξέων και την μεταφορά τους στο μιτοχόνδριο (ρόλος καρνιτίνης) για τη β-οξείδωση των λιπαρών οξέων και την ενεργειακής της απόδοση τη σημασία και ρόλο της βιταμίνης Β 12 (κοβαλαμίνης) γιατί από λιπαρά οξέα δεν μπορούμε να συνθέσουμε γλυκόζη (εκτός από εκείνα με περιττό αριθμό ατόμων άνθρακα) για τα κετονοσώματα: παραγωγή, ρόλος, μεταβολισμός και σημασία τους στη νηστεία και το διαβήτη για τη διαβητική κετοξέωση Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για την αποικοδόμηση μονοακόρεστων και πολυακόρεστων λιπαρών οξέων o για τον ρόλο των υπεροξειδοσωματίων και το σύνδρομο Zellweger Σύνθεση λιπαρών οξέων Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τις βασικές αντιδράσεις και ενεργειακό κόστος της βιοσύνθεσης λιπαρών οξέων (διαφορές με την αποικοδόμηση) την προέλευση του ακετυλο-coa και του NADPH για την σύνθεση για τη ρύθμιση και συντονισμό της αποικοδόμησης και σύνθεσης λιπαρών οξέων σαν απόκριση στη διατροφή μέσω της καρβοξυλάσης του ακετυλο-coα για τα απαραίτητα λιπαρά οξέα, τη κυκλοοξυγενάση και τη βιοχημική βάση της δράσης των μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για την επιμήκυνση και δημιουργία διπλών δεσμών κατά τη σύνθεση λιπαρών οξέων o για τη βιολογική δράση του αραχιδονικού και των παράγωγων του Αποικοδόμηση πρωτεϊνών και αμινοξέων κύκλος ουρίας Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τη διαδικασία της πέψης των πρωτεϊνών τη διαδικασία ενδοκυττάριας αποικοδόμησης των πρωτεϊνών τις γενικές αρχές και ιστοειδικότητα του καταβολισμού των αμινοξέων τις αντιδράσεις μεταφοράς και απελευθέρωσης αζώτου: τρανσαμίνωση, οξειδωτική και υδρολυτική απαμίνωση, υδρόλυση γλουταμίνης. τη σημασία και ρόλο της βιταμίνης Β 6 και της φωσφορικής πυριδοξάλης την κλινική σημασία των τρανσαμινασών το ρόλο της αλανίνης και γλουταμίνης στη μεταφορά αμινομάδων στο ήπαρ τις γενικές αρχές της απέκκρισης του αζώτου τις αντιδράσεις του κύκλου της ουρίας τη μοριακή βάση, σημασία και αντιμετώπιση των υπεραμμωνιαιμιών τις γενικές αρχές καταβολισμού του ανθρακικού σκελετού των αμινοξέων. για τις γενετικές ασθένειες του μεταβολισμού των αμινοξέων τη μοριακή βάση, διάγνωση και αντιμετώπιση της φαινυλκετονουρίας. 13
Ο φοιτητής που θα παρακολουθήσει το μάθημα θα πρέπει να έχει ακούσει o για τον μηχανισμό της αντίδρασης τρανσαμίνωσης o για τη δομή της αμινομεταφοράσης του ασπαραγινικού o για τα μονοπάτια καταβολισμού των ομάδων C3, C4 και C5 των αμινοξέων o για τα μονοπάτια καταβολισμού της φαινυλαλανίνης και τυροσίνης Σύνοψη και ολοκλήρωση του μεταβολισμού Ο φοιτητής που θα επιτύχει στο μάθημα θα πρέπει να γνωρίζει καλά τα επαναλαμβανόμενα μοτίβα στη μεταβολική ρύθμιση τις κύριες μεταβολικές πορείες, τις διασυνδέσεις και τις θέσεις ελέγχου τους για τα μόρια σημαντικούς κόμβους: 6-φωσφορική γλυκόζη, πυροσταφυλοκό και ακετυλο-coa τις κύριες μεταβολικές διεργασίες του εγκεφάλου, των μυών (σκελετικών και καρδιακών), του λιπώδους ιστού, των νεφρών και του ήπατος για τις κύριες ορμόνες του μεταβολισμού για τις μεταβολικές αλλαγές σε επίπεδο οργανισμού κατά τη μεταγευματική κατάσταση και τη κατάσταση νηστείας τις μεταβολικές διαταραχές στον σακχαρώδη διαβήτη για τις μεταβολικές αλλαγές κατά την άσκηση και την κατανάλωση αλκοόλ 14
ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Α. ΘΕΩΡΙΑΣ ΜΑΘΗΜΑΤΟΣ Προτεινόμενα συγγράμματα: Berg J. M., Tymoczko J. L. & L. Stryer: ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ Τόμος Ι & II Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης Γεωργάτσου Ι. Γ.: Εισαγωγή στη Βιοχημεία (5 η Έκδοση) Εκδόσεις Γιαχούδη-Γιαπούλη Άλλα συγγράμματα στα Ελληνικά: Baynes J. W. & M. H. Dominiczak: Ιατρική Βιοχημεία (2 η Έκδοση) Επιστημονικές Εκδόσεις ΠΑΡΙΣΙΑΝΟΥ Α.Ε. Branden C. & J. Tooze: Εισαγωγή στη Δομή των Πρωτεϊνών Ακαδημαϊκές Εκδόσεις Devlin Τ. Μ.: Βιοχημεία - Κλινικοί Συσχετισμοί Τόμος Ι & II Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης Koolman J. & K.-H. Roehm: Εγχειρίδιο Βιοχημείας Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης Loeffler G.: Βασικές Αρχές Βιοχημείας με στοιχεία παθοβιοχημείας Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης Nelson D. L. & M. M. Cox : Lehninger, Βασικές Αρχές Βιοχημείας, Τόμος 1, 2 & 3 Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης Γεωργάτσου Ι. Γ. & Π. Ι. Αρζόγλου: Αρχές Κλινικής Χημείας Εκδόσεις Megatype Γεωργάτσου Ι. Γ., Γιουψάνη Τ. Α. & Δ. Α. Κυριακίδη: Ενζυμολογία Εκδόσεις ΖΗΤΗ Τρακατέλλη Α.: Βιοχημεία Εκδόσεις Αφοί Κυριακίδη 15
Β. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ Alexander R. R. & J. M. Griffiths: Basic Biochemical Methods Wiley-Liss Anderson S. C. & S. Cockayne: Clinical Chemistry - Concepts and Applications W. Saunders Co Clark J. M., Jr & R. L. Switzer: Πειραματική Βιοχημεία Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης Dryer R. L. & F. G. Lata: Experimental Biochemistry Oxford University Press Holme D. J. & H. Peck: Analytical Biochemistry Longman Scientific & Technical Marshall W. J.: Clinical Chemistry - Illustrated Textbook Lippincott / Gower Plummer D. Τ.: Practical Biochemistry - An Introduction McGraw-Hill Tietz N. W. (editor): Textbook of Clinical Chemistry W. B. Saunders Co Wilson U. & K. H. Goulding: Principles and Techniques of Practical Biochemistry Edward Arnold 16
ΚΑΝΟΝΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Για την ασφάλεια όλων πρέπει να ακολουθούνται πάντα οι κάτωθι κανόνες: 1) Κανείς δεν πρέπει να εργάζεται μόνος του στο εργαστήριο χωρίς την παρουσία κάποιου μέλους του προσωπικού. 2) Αφήστε εξωτερικά ενδύματα και ογκώδη αντικείμενα (π.χ. σάκους) έξω από το εργαστήριο ή σε ειδικό χώρο του εργαστηρίου. Σκόρπια πράγματα σε πάγκους και πατώματα μπορεί να προκαλέσουν ατύχημα και υπάρχει κίνδυνος να καταστραφούν και τα ίδια. 3) Φοράτε πάντα ποδιά μόλις μπείτε στο εργαστήριο. 4) Απαγορεύεται να καπνίζετε, να τρώτε ή να πίνετε στο εργαστήριο. 5) Διαβάστε το φυλλάδιο που περιγράφει την άσκηση πριν μπείτε στο εργαστήριο και ακολουθήστε προσεκτικά τις οδηγίες που σας δίνονται για την εκτέλεση κάθε άσκησης. Επειδή συχνά δίνονται επιπλέον προφορικές εξηγήσεις στην αρχή του εργαστηρίου, είναι απαραίτητο να προσέρχεστε εγκαίρως. Αργοπορημένοι φοιτητές δεν θα γίνονται δεκτοί. Γενική αρχή κάθε πειραματικής δουλειάς: Σκεφθείτε και προγραμματίσετε πριν ενεργήσετε. 6) Μη ρουφάτε τοξικά αντιδραστήρια με το στόμα - χρησιμοποιείστε τις pi-pumps ή poire που σας δίνονται για χρήση με τα σιφώνια. Αν δεν ξέρετε αν κάτι είναι τοξικό ρωτήστε. Ακόμα καλύτερα: Μη ρουφάτε τίποτα με το στόμα. 7) Χρησιμοποιείστε την απαγωγό εστία και φορέστε γυαλιά ασφαλείας κάθε φορά που χειρίζεστε πολύ καυστικά αντιδραστήρια, π.χ. πυκνά οξέα ή βάσεις, διαλύματα με αποπνικτικούς ατμούς κ.λ.π. 8) Στρέψετε το στόμιο σωλήνων που θερμαίνονται μακριά από σας και άλλα πρόσωπα. Προσοχή πώς πιάνετε θερμά γυαλικά. Μη φέρετε ποτέ εύφλεκτα υλικά (π.χ. αιθανόλη, αιθέρα) κοντά σε γυμνή φλόγα. 9) Αν χύσετε κάτι σκουπίστε το αμέσως με χαρτοπετσέτα - βρεγμένοι πάγκοι και πατώματα είναι επικίνδυνα. Αν χύσετε κάτι τοξικό αναφέρετέ το αμέσως στον υπεύθυνο του εργαστηρίου. 10) Προσοχή στην χρήση βιολογικών υγρών, (αίμα, οροί, κ.λ.π.) - μη ρουφάτε τίποτε με το στόμα, φοράτε γάντια και τοποθετείστε τα μεν αναλώσιμα (π.χ. χαρτικά, πλαστικά) που ήρθαν σε επαφή μαζί τους σε ειδικό σάκο απορριμμάτων, τα δε γυαλικά σε ειδικό δοχείο με απολυμαντικό. 11) Εξοικειωθείτε με την λειτουργία κάθε οργάνου και ακολουθήστε τις οδηγίες χρήσης του. Αν δεν είστε σίγουροι πώς να χρησιμοποιήσετε ένα όργανο ή μία συσκευή συμβουλευτείτε ένα μέλος του προσωπικού - έτσι προλαμβάνεται τυχόν βλάβη που μπορεί να προξενηθεί στο όργανο και εσείς έχετε εμπιστοσύνη στα αποτελέσματα που παίρνετε. 12) Βεβαιωθείτε ότι ξέρετε πού βρίσκονται στο εργαστήριο και πώς χρησιμοποιούνται ο πυροσβεστήρας, το κουτί πρώτων βοηθειών και τα δοχεία για πλύσιμο ματιών. Γρήγορη αντιμετώπιση ενός μικρού ατυχήματος μπορεί να εμποδίσει την δημιουργία ενός μεγάλου. 13) Στο τέλος κάθε άσκησης αφήστε τον πάγκο σας καθαρό και τακτικό. Ξεπλύνετε όλα τα βρώμικα γυαλικά και τοποθετείστε τα στα δοχεία για πλύσιμο και ακολουθήστε ό,τι οδηγίες σας δοθούν σχετικά με τα αντιδραστήρια. 17
ΑΣΚΗΣΗ 1 ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ & ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Εισαγωγή Οι πρωτεΐνες έχουν καθοριστικούς ρόλους σε όλες σχεδόν τις βιολογικές διεργασίες και είναι κυρίως υπεύθυνες για τον φαινότυπο των διαφόρων ειδών. Ο ανθρώπινος οργανισμός εκφράζει πάνω από 30.000 διαφορετικές πρωτεΐνες, που είναι πολυμερή των ίδιων 20 L-αμινοξέων σε διαφορετικούς συνδυασμούς. Στις πρωτεΐνες τα αμινοξέα συνδέονται με πεπτιδικούς δεσμούς, που σχηματίζονται ανάμεσα στην α-αμινομάδα και στην α-καρβοξυλομάδα διαδοχικών αμινοξέων. Τα χαρακτηριστικά των διαφόρων πρωτεϊνών εξαρτώνται από την πρωτοταγή δομή (αλληλουχία αμινοξέων) και τη διαμόρφωση (τρισδιάστατη διάταξη) των πολυπεπτιδικών αλυσίδων που τις αποτελούν και που καθορίζονται από την γενετική πληροφορία του οργανισμού. Τα αμινοξέα κατατάσσονται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες, που σε μεγάλο βαθμό καθορίζονται από τις πλευρικές τους αλυσίδες (υδρόφοβα, υδρόφιλα, φορτισμένα, αφόρτιστα κλπ) και βάσει των οποίων είναι δυνατός ο διαχωρισμός τους. Οι πρωτεΐνες επίσης κατατάσσονται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με τον βιολογικό ρόλο που επιτελούν (π.χ. ένζυμα, δομικές, μεταφορικές, αποθηκευτικές, αμυντικές, ρυθμιστικές πρωτεΐνες), το σχήμα τους (π.χ. ινώδεις, σφαιρικές), την προσθετική ομάδα που τυχόν περιέχουν (π.χ. λιπο-, γλυκο-, νουκλεο-, φωσφο-, μεταλλο- πρωτεΐνες) και άλλα κριτήρια. Οι πρωτεΐνες επίσης διαφέρουν στο μέγεθος (Μοριακό Βάρος) και στο ισοηλεκτρικό σημείο (pi), ανάλογα με τον αριθμό και το είδος των αμινοξέων που περιέχουν. Οι μέθοδοι απομόνωσης, διαχωρισμού, ταυτοποίησης και μελέτης των αμινοξέων και των πρωτεϊνών είναι παρόμοιες και έχουν πολύ μεγάλη σημασία στην Βιοχημεία και στην κλινική πράξη. (Βλέπε Stryer, κεφάλαια 3 και 4). Σκοπός της σημερινής άσκησης είναι να δούμε: Ι) τον διαχωρισμό αμινοξέων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας και την ανίχνευση τους με την χρωστική δοκιμή της νινυδρίνης ΙΙ) πώς επηρεάζεται η διαλυτότητα πρωτεϊνών από α) το ph και β) τη θερμοκρασία Ι. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Διαχωρισμός αμινοξέων με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography TLC) και ταυτοποίηση τους μέσω της τιμής Rf Στη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας η στατική φάση είναι ένα προσροφητικό όπως ξηροπηκτή του διοξειδίου του πυριτίου, το οξείδιο του αργιλίου ή η γη των διατόμων, που εφαρμόζεται σε λεπτή στρώση πάνω σε γυάλινη πλάκα η ένα φύλλο αλουμινίου (σαν στατική φάση λειτουργεί και το νερό που ενυδατώνει σε μεγάλο βαθμό τα υλικά αυτά). Μετά την εναπόθεση των δειγμάτων (π.χ. μίγμα αμινοξέων), η πλάκα χρωματογραφίας τοποθετείται σε δοχείο (θάλαμος ανάπτυξης), το οποίο περιέχει ποσότητα μίγματος οργανικών διαλυτών (κινητή φάση) και το επίπεδο του οποίου βρίσκεται κάτω από το σημείο εφαρμογής του προς διαχωρισμό μίγματος των ουσιών. Το δοχείο κλείνει ερμητικά ώστε ο θάλαμος να κορεστεί με τους ατμούς της κινητής φάσης. Ο διαλύτης ανέρχεται με τριχοειδή δράση και συμπαρασύρει τις εναποτεθείσες ουσίες. Η ταχύτητα κίνησης της κάθε ουσίας εξαρτάται από την συγγένεια της προς τις δυο φάσεις. Δηλαδή, μια ουσία υδρόφιλη κινείται σχετικά αργά (διότι αλληλεπιδρά ισχυρότερα με την πολική-υδρόφιλη στατική φάση) ενώ μια ουσία υδρόφοβη 18
κινείται σχετικά γρήγορα (διότι αλληλεπιδρά ισχυρότερα με την οργανική-υδρόφοβη κινητή φάση). Η χρωματογραφία σταματά όταν το μέτωπο του διαλύτη φθάσει κοντά στο πάνω άκρο της πλάκας. Μετά από κατάλληλη επεξεργασία ανιχνεύουμε τη θέση των ουσιών επάνω στην πλάκα και προσδιορίζεται η τιμή του Rf που είναι χαρακτηριστική παράμετρος για κάθε ουσία κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες διαχωρισμού. Rf = (απόσταση της ουσίας από την αρχή)/(απόσταση μετώπου διαλύτη από την αρχή). Η ταυτοποίηση των αμινοξέων γίνεται με την βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων αμινοξέων που χρωματογραφούνται ταυτόχρονα με το δείγμα. Η ανίχνευση των αμινοξέων γίνεται με το αντιδραστήριο νινυδρίνης. Αντίδραση Νινυδρίνης. Διάφορες χρωστικές αντιδράσεις χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ελευθέρων αμινοξέων ή αυτών που βρίσκονται συνδεδεμένα στις πρωτεΐνες. Αυτές οι αντιδράσεις είναι γενικές ή ειδικές. Γενική αντίδραση είναι η αντίδραση νινυδρίνης (βλέπε παρακάτω) στην οποία είναι δυνατόν να δώσουν σχεδόν όλα τα ελεύθερα αμινοξέα γιατί για την αντίδραση αυτή είναι σημαντική η γενική χημική δομή των αμινοξέων. Οι ειδικές αντιδράσεις αντίθετα γίνονται στην πλάγια αλυσίδα αμινοξέων (R ομάδα) επομένως την δίνουν τόσο τα ελεύθερα όσο και τα συνδεμένα στις πρωτεΐνες αντίστοιχα αμινοξέα. Όλα τα ελεύθερα α-αμινοξέα αντιδρούν με νινυδρίνη και δίνουν CO 2, μία αλδεΰδη που περιέχει ένα άτομο άνθρακα λιγότερο από το αμινοξύ και μια κυανοϊώδη χρωστική. O O O NH 2 C OH C C H R C COOH + 2 C C N=C + CO 2 + R C=O H C OH C C O OH O Νινυδρίνη Η αντίδραση αυτή είναι γενική και δίνεται σε pη 5-7 από όλα τα α-αμινοξέα που έχουν ελεύθερη αμινομάδα. Η αντίδραση είναι επίσης θετική και για τις πρωτοταγείς αμίνες και την αμμωνία, αλλά χωρίς την παραγωγή CO 2. Τα αμινοξέα προλίνη και υδροξυπρολίνη αντιδρούν με την νινυδρίνη αλλά δίνουν ένα παράγωγο που έχει κίτρινο χρώμα. Η αντίδραση νινυδρίνης είναι πολύ ευαίσθητη και ιδανική για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό αμινοξέων που βρίσκονται ελεύθερα στο αίμα και στα ούρα ή που προέρχονται από υδρόλυση πρωτεϊνών και διαχωρισμό με χρωματογραφικές μεθόδους. Με την αντίδραση νινυδρίνης ανιχνεύεται έως 1μg αμινοξέος, αλλά ο προσδιορισμός ng ποσοτήτων είναι δυνατός με την αντίδραση της φθορεσκαμίνης που δημιουργεί ένα φθορίζον προϊόν. Αντιδραστήρια Πρότυπα διαλύματα αλανίνης, μεθειονίνης και σερίνης (0,25 mg/ml) και μείγμα των τριών αμινοξέων. Διάλυμα προπανόλης : νερού (7:3) (κινητή φάση) Διάλυμα νινυδρίνης (2% σε αλκοόλη) 19
Υλικά-Σκεύη Πλάκες χρωματογραφίας (Silica gel 60), θάλαμος ανάπτυξης, τριχοειδείς σωλήνες, στεγνωτήρας, θερμαντικός θάλαμος. Πρακτικό Μέρος Τοποθετούμε το διαλύμα προπανόλης:νερού μέσα στο γυάλινο δοχείο χρωματογραφίας. Κλείνουμε ερμητικά το δοχείο και περιμένουμε για 30 min ώστε η ατμόσφαιρα του θαλάμου να κορεσθεί από τους ατμούς του διαλύτη. Στην πλάκα χρωματογραφίας και με τη βοήθεια ενός μαλακού μολυβιού χαράσσουμε ελαφρά σε μια απόσταση 1.5 cm από το ένα άκρο της μια γραμμή. Πάνω σε αυτήν την γραμμή και σε κανονικές αποστάσεις σημειώνουμε τις θέσεις εφαρμογής των προτύπων διαλυμάτων των αμινοξέων και του μίγματος. Για την εφαρμογή των διαλυμάτων συνήθως χρησιμοποιούμε τριχοειδείς σωλήνες. Η εφαρμογή γίνεται με μεγάλη προσοχή και σε δυο-τρεις δόσεις, ξηραίνοντας με την βοήθεια του στεγνωτήρα μεταξύ των δόσεων το σημείο εφαρμογής (η διάμετρος της κηλίδας του υγρού πρέπει να παραμείνει μικρή και το στρώμα του υλικού δεν πρέπει να διαταραχθεί). Στη συνέχεια, με μεγάλη προσοχή, τοποθετούμε την πλάκα λεπτής στιβάδας μέσα στο δοχείο κατά τέτοιο τρόπο, ώστε η σειρά των κηλίδων να είναι παράλληλη προς την επιφάνεια του υγρού, και οπωσδήποτε πάνω από αυτήν. Όταν το μέτωπο του διαλύτη φθάσει τα 2 εκ. περίπου από το τέλος της πλάκας σταματά η χρωματογράφηση και μεταφέρουμε την πλάκα στον απαγωγό. Σημειώνουμε προσεκτικά με μολύβι το μέτωπο του διαλύτη και ξηραίνουμε την πλάκα με τη βοήθεια του στεγνωτήρα ή την αφήνουμε για λίγα λεπτά στον απαγωγό. Για να αναγνωριστούν τα σημεία στα οποία βρίσκονται τα αμινοξέα, η πλάκα εμβαπτίζεται στιγμιαία σε διάλυμα νινυδρίνης, στεγνώνεται και τοποθετείται στον θερμαντικό θάλαμο στους 110 ο C μέχρι να εμφανιστούν οι σκουρόχρωμες κηλίδες των αμινοξέων. Μετά την εμφάνιση των κηλίδων σημειώνουμε με το μολύβι το κέντρο των κηλίδων και υπολογίζουμε τις αποστάσεις μετακίνησης από την αρχή. ΙΙ. ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Α. Επίδραση του ph στην διαλυτότητα των πρωτεϊνών Οι πλευρικές αλυσίδες (R) μερικών αμινοξικών καταλοίπων καθώς και το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό κατάλοιπο των πρωτεϊνών φέρουν ομάδες που μπορούν να ιονισθούν (Πίνακας Ι). Η ιονισμένη μορφή προκύπτει είτε από την απώλεια Η + (για τις όξινες ομάδες), οπότε η πρωτεΐνη αποκτά ένα αρνητικό φορτίο, είτε από την πρόσληψη Η + (για τις βασικές ομάδες), οπότε η πρωτεΐνη αποκτά ένα θετικό φορτίο. Επειδή οι ομάδες που μπορούν να ιονισθούν έχουν διαφορετική pκα είναι φανερό ότι αν μια ομάδα είναι ιονισμένη ή όχι, και επομένως αν η πρωτεΐνη φέρει ένα φορτίο ή όχι, εξαρτάται από το pη του διαλύματος σύμφωνα με την εξίσωση Henderson Hasselbalch. μη πρωτονιωμένη μορφή ph = pkα + log ----------------------------------------- πρωτονιωμένη μορφή Από την εξίσωση αυτή προκύπτει ότι η pkα ισούται με την τιμή του ph, στην οποία η πρωτονιωμένη και μη πρωτονιωμένη μορφή μιας ομάδας βρίσκονται σε ίσα ποσά στο διάλυμα. Σε τιμές ph που ισούνται με pkα 1 μιας ομάδας, η ομάδα αυτή δρα σαν ρυθμιστής του ph του διαλύματος. 20
Σημειώστε ότι οι όξινες ομάδες είναι ιονισμένες σε pη > από την pκα τους, ενώ οι βασικές ομάδες είναι ιονισμένες σε pη < από την pκα τους. Πίνακας 1. Ομάδες αμινοξέων που ιονίζονται σε πρωτεΐνες Ομάδα Οξύ Βάση Χαρακτηριστική pkα Τελική -COOH -COOH -COO - ~ 3,0 -NH 2 + -NH 3 -NH 2 ~ 8,0 Πλευρική COOH Asp, Glu -COOH -COO - ~ 4,0 -SH Cys -SH -S - ~ 8,5 -OH Tyr -OH -O - ~10,0 =N His =NH + =N ~ 6,5 -NH 2 Lys + -NH 3 -NH 2 ~ 10,0 =NH Arg + =NH 2 =NH ~ 12,0 Οι πρωτεΐνες φέρουν πολλά φορτία αλλά, ανάλογα με το pη, το καθαρό φορτίο τους μπορεί να είναι θετικό ή αρνητικό. Τo pη στο οποίο ο ολικός αριθμός θετικών φορτίων μιας πρωτεΐνης είναι ίσος με τον ολικό αριθμό αρνητικών φορτίων (καθαρό φορτίο πρωτεΐνης = 0) ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο (pi). Σε pη = pι, μια πρωτεΐνη έχει την μικρότερή διαλυτότητα γιατί τα μόριά της συσσωματώνονται και καθιζάνουν ευκολότερα. Παράδειγμα: Στο κανονικό pη του γάλατος (6,3-6,6) η καζεΐνη, μια πρωτεΐνη που βρίσκεται στο γάλα, είναι διαλυμένη σε κολλοειδή μορφή. Όταν όμως το pη του γάλατος ελαττωθεί, λόγω ανάπτυξης βακτηριδίων που ελευθερώνουν οξέα, και φτάσει γύρω στο 4,7 που είναι το pι της καζεΐνης, τότε η καζεΐνη θρομβώνεται και το γάλα πήζει. Πρακτικό Μέρος Καθίζηση στο ισοηλεκτρικό σημείο. Σε μια σειρά από 5 πλαστικούς σωλήνες φυγοκέντρου τοποθετείστε τα κάτωθι αντιδραστήρια και σημειώστε σε ποιο σωλήνα παρατηρείτε το περισσότερο θόλωμα ή ίζημα: Αντιδραστήρια σωλήνας σωλήνας σωλήνας σωλήνας σωλήνας (ml) 1 2 3 4 5 0,5Μ CH 3 COOH 7,8 7,2 5,0 1,8 0,8 0,5M CH 3 COONα 0,2 0,8 3,0 6,2 7,2 0,5% διάλυμα καζεΐνης 2 2 2 2 2 Υπολογίστε το pη του διαλύματος κάθε σωλήνα από την εξίσωση Henderson-Hasselbalch (pκα CH 3 COOH=4,75). Σε ποια τιμή ph παρατηρείτε το περισσότερο ίζημα; Ποια είναι η τιμή pι της καζεΐνης που βρήκατε; 21
Β. Επίδραση της θερμοκρασίας στην διαλυτότητα των πρωτεϊνών Οι περισσότερες πρωτεΐνες αρχίζουν να μετουσιώνονται σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες από 40 ο C και η μετουσίωση είναι συνήθως πλήρης στους 60-70 ο C. Με την θέρμανση καταστρέφεται η φυσική διαμόρφωση (δευτεροταγής και τριτοταγής δομή) των πρωτεϊνών και αυτό έχει συνήθως σαν αποτέλεσμα την ελάττωση της διαλυτότητας και την καταβύθισή τους, λόγω της δημιουργίας τυχαίων συσσωματωμάτων που είναι αδιάλυτα (Παράδειγμα η πήξη της λευκωματίνης του αυγού). Πρακτικό Μέρος Καθίζηση με θέρμανση. Σε 3 δοκιμαστικούς σωλήνες βάλετε από 2ml 2% διαλύματος λευκωματίνης και προσθέσετε στον σωλήνα 1, 0,2 ml Η 2 Ο, στον σωλήνα 2, 0,2 ml 1N HCl και στο σωλήνα 3, 0,2 ml 1N NαΟΗ. Θερμάνετε τους σωλήνες σε υδατόλουτρο σε 100 ο C για 10 λεπτά και κρυώστε σε θερμοκρασία δωματίου. Τι παρατηρείτε; 22
ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΣΚΗΣΗΣ 1 Ι. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ TLC Επισυνάψτε την TLC ή φωτοτυπία της. Σημειώστε με βέλη την θέση κάθε αμινοξέος και υπολογίστε τις τιμές Rf στα πρότυπα διαλύματα και στο μίγμα. Βρείτε την σύσταση του μίγματος. TLC: Rf αλανίνης (Ala, A): Rf μεθειονίνης (Met, M): Rf σερίνης (Ser, S) Rf αμινοξέων στο μίγμα: Σύσταση μίγματος: Γράψτε τις χημικές δομές των τριών αμινοξέων που χρησιμοποιήσατε και βάσει αυτών δικαιολογήστε τις διαφορές στις τιμές Rf. Αλανίνη: Μεθειονίνη: Σερίνη: Δικαιολόγηση Rf: 23
ΙΙ. ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Α. Επίδραση του ph στη διαλυτότητα των πρωτεϊνών. 1. Υπολογίστε το ph του διαλύματος κάθε σωλήνα από την εξίσωση Henderson Hasselbach (pka CH 3 COOH = 4,75). 2. Σε ποια τιμή ph παρατηρείτε το περισσότερο ίζημα; Ποια είναι η τιμή pi της καζεΐνης; Β. Επίδραση της θερμοκρασίας στη διαλυτότητα των πρωτεϊνών. Τι παρατηρείτε; Σχολιάστε τα αποτελέσματά σας. 24
ΑΣΚΗΣΗ 2 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Ι. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΑΙΜΑΤΟΣ (Αντίδραση Drabkin) Εισαγωγή Η αιμοσφαιρίνη περιέχεται στα ερυθροκύτταρα και είναι ο κύριος μεταφορέας οξυγόνου στο αίμα. Αποτελείται από 4 πολυπεπτιδικές αλυσίδες, κάθε μία από τις οποίες φέρει από ένα μόριο αίμης. Ο σίδηρος της αίμης βρίσκεται στην Fe 2+ μορφή και συνδέει αντιστρεπτά ένα μόριο οξυγόνου. Στις δύο ακραίες μορφές της η αιμοσφαιρίνη απαντάται σαν δεοξυαιμοσφαιρίνη (Hb), όταν δεν περιέχει κανένα μόριο Ο 2, ή σαν οξυαιμοσφαιρίνη (HbΟ 2 ), όταν περιέχει τέσσερα μόρια Ο 2. Το άτομο του Fe 2+ στην δεοξυαιμοσφαιρίνη βρίσκεται σε πεντασυναρμοσμένο σύμπλοκο (κατάσταση υψηλού spin), ενώ στην οξυαιμοσφαιρίνη βρίσκεται σε εξασυναρμοσμένο σύμπλοκο (κατάσταση χαμηλού spin). H αιμοσφαιρίνη είναι μία αλλοστερική πρωτεΐνη (παρουσιάζει την χαρακτηριστική σιγμοειδή καμπύλη αποσύνδεσης Ο 2 που οφείλεται στο ότι η σύνδεση κάθε μορίου οξυγόνου είναι συνεργατική) και η συγγένειά της για οξυγόνο επηρεάζεται από τις μεταβολικές συνθήκες (την συγκέντρωση Η +, CO 2 και 2,3 ΒPG). Εκτός από το οξυγόνο, σύμπλοκα συναρμογής με το Fe 2+ της αίμης σχηματίζουν και το μονοξείδιο του άνθρακα, κυανιούχα κ.α., και επειδή τα σύμπλοκα αυτά είναι σταθερότερα, η αιμοσφαιρίνη γρήγορα χάνει την ικανότητά της να μεταφέρει οξυγόνο. Oξείδωση του σιδήρου της αίμης σε Fe 3+ (μεθαιμοσφαιριναιμία), είτε λόγω κατάχρησης οξειδωτικών ουσιών, είτε λόγω κληρονομικών παθήσεων, οδηγεί σε απώλεια της ικανότητας της αιμοσφαιρίνης να συνδέει οξυγόνο και συνήθως χαρακτηρίζεται από κυάνωση. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της αιμοσφαιρίνης στο αίμα είναι μία από τις πιο συνήθεις κλινικές εξετάσεις. Η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης μπορεί να μειωθεί σαν αποτέλεσμα αιμορραγίας, αιμόλυσης ή ελαττωματικής ερυθροποίησης ή να αυξηθεί λόγω ελαττωματικής πνευμονικής λειτουργίας ή ύπαρξης άλλων παθήσεων. Όλες οι αιμοπρωτεΐνες, λόγω της αίμης που περιέχουν, έχουν ένα μέγιστο απορροφητικότητας στα 400-440nm (ζώνη Soret). Επιπλέον οι διάφορες μορφές αιμοσφαιρίνης παρουσιάζουν και άλλα μέγιστα στα 480-630nm (πίνακας I). Πίνακας Ι Παράγωγα αιμοσφαιρίνης Μέγιστα απορροφήσεως (nm) Δεοξυαιμοσφαιρίνη 428-430 555 Οξυαιμοσφαιρίνη 412-415 541 576-578 Καρβοξυαιμοσφαιρίνη 417-418 537 568-572 Μεθαιμοσφαιρίνη (ph 7,0) 404-407 500 540 578 630 Κυανομεθαιμοσφαιρίνη 413-418 480 541 580-590 Έχει επικρατήσει να υπολογίζεται η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης στο αίμα φασματοφωτομετρικά μετά την μετατροπή όλων των μορφών της (οξυ-, δεοξυ-, καρβοξυ-, μεθαιμοσφαιρίνη) σε κυανομεθαιμοσφαιρίνη. 25
Η αρχή της μεθόδου είναι: το Fe 2+ της αιμοσφαιρίνης οξειδώνεται από σιδηροκυανιούχο κάλιο προς Fe 3+ της μεθαιμοσφαιρίνης, η οποία μετατρέπεται στην σταθερή ένωση της κυανομεθαιμοσφαιρίνης με την προσθήκη κυανιούχου καλίου. Hb (Fe 2+ ) + [ (Fe 3+ ) (CN) 6 ] 3- Hb (Fe 3+ ) + [ (Fe 2+ ) (CN 6 ) ] 4-- Μεθαιμοσφαιρίνη (Met-Hb) Hb (Fe 3+ ) + CN - Hb(Fe 3+ )CN Κυανομεθαιμοσφαιρίνη (CN-Met-Hb) Η απορροφητικότητα της κυανομεθαιμοσφαιρίνης μετριέται στα 540 nm (λmax). Η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης σε g/100ml υπολογίζεται από την απορροφητικότητα ενός πρότυπου δείγματος αιμοσφαιρίνης ή από την πρότυπη καμπύλη. Οι φυσιολογικές τιμές για ενήλικες είναι 14-18 g/100 ml για άνδρες και 12-16 g/100 ml για γυναίκες. Στη σημερινή άσκηση θα υπολογίσετε τη συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης σε ένα άγνωστο δείγμα και στο δικό σας αίμα. Υλικά Δείγμα αίματος 10ml αντιδραστήριο Drabkin 3 σωλήνες (Νο 2, 3, 4) που περιέχουν πρότυπα διαλύματα CN-Met-Hb σε αντιδραστήριο Drabkin: A=6g%, B=12g%, Γ=18g% 3 άδειους σωλήνες 6 άδειες πλαστικές κυψελίδες φωτόμετρου 1 ml 1 μικροπιπέτα με πλαστικές μύτες. (Βεβαιωθείτε ότι είναι ρυθμισμένη στο σωστό όγκο και ότι γνωρίζετε τον χειρισμό της) ΠΡΟΣΟΧΗ: Το αντιδραστήριο DRABKIN και επομένως το περιεχόμενο όλων των σωλήνων περιέχει CN -. Xύσετε τα αντιδραστήρια στο τέλος του προσδιορισμού σε ένα ειδικό νεροχύτη όπου δεν χύνετε οξέα και όπου τρέχει συνεχώς νερό για να αποφευχθεί η δημιουργία θανατηφόρου HCN. Τεχνική Το δικό σας αίμα το παίρνετε ως εξής: απολυμάνετε με οινόπνευμα ένα δάκτυλό σας, πιέστε το δάκτυλο ώστε να μαζευτεί το αίμα στο άκρο, τρυπήστε με ένα ξυραφάκι, περιμένετε να σχηματισθεί μια μεγάλη σταγόνα και πάρτε προσεκτικά με την μικροπιπέτα 5 μl αίματος. Ξεπλύνετε επανειλημμένα την πιπέτα, με την οποία πάρθηκε κάθε δείγμα αίματος, με το αντιδραστήριο Drabkin. Στους τρεις άδειους σωλήνες (Νο 1, 5 και 6) προσθέστε Drabkin και δείγμα αίματος σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα (1=τυφλό, 2,3,4=πρότυπο, 5,6=δείγμα). 26
Σωλήνες Αντιδραστήρια 1 2 3 4 5 6 Drabkin(περιέχει Κ 3 [Fe(CN) 6 ], 1 - - - 1 1 KCN(ml) Πρότυπο διάλυμα CN-Met-Hb - 1 - - - - A(ml) Πρότυπο διάλυμα CN-Met-Hb - - 1 - - - B(ml) Πρότυπο διάλυμα CN-Met-Hb - - - 1 - - Γ(ml) Αίμα (ολικό) άγνωστο (ml) - - - - 0,005 - Αίμα (ολικό) δικό σας (ml) - - - - - 0,005 Αναδεύσατε τους σωλήνες και αφήστε τους σε ηρεμία για 10 min. Μεταφέρετε το περιεχόμενο στις κυψελίδες και φωτομετρήστε στα 540 nm έναντι του τυφλού. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μη σημειώνετε τις πλαστικές κυψελίδες. ΙΙ. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΟΣ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ Εισαγωγή Περίπου 350 μεταλλαγμένες αιμοσφαιρίνες είναι γνωστές και μερικές απ' αυτές, όπως π.χ. η HbS, είναι υπεύθυνες για σοβαρές αιμοσφαιρινοπάθειες (διαταραχές στις οποίες η παραγωγή της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης του ενήλικα, HbA, αναστέλλεται μερικά ή ολικά, ή αντικαθίσταται από μία ή περισσότερες μη φυσιολογικές αιμοσφαιρίνες). Η ανίχνευση και η ταυτοποίηση των διαφόρων αιμοσφαιρινών έχει μεγάλη σημασία στην κλινική βιοχημεία. Η κύρια μέθοδος που χρησιμοποιείται αρχικά είναι η ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικό ph, με την οποία διαχωρίζονται οι αιμοσφαιρίνες Α,F,S,C, καθώς και άλλες αιμοσφαιρίνες. Υπενθυμίζεται ότι η σύσταση των φυσιολογικών αιμοσφαιρινών είναι: HbA=α 2 β 2, ΗbA 2 = α 2 δ 2, ΗbF=α 2 γ 2. Οι αλλαγές που παρατηρούνται στις συνηθέστερες μεταλλαγμένες αιμοσφαιρίνες είναι: HbS=β 6 Glu Val, HbC=β 6 Glu Lys, HbD(Punjab)=β 121 Glu Gln, HbO(Arab)=β 121 Glu Lys, HbE=β 26 Glu Lys, HbG=β 42 Glu Ala, HbH=β 4, HbLepore= δ β σύντηξη. Στη σημερινή άσκηση θα χρησιμοποιήσετε τις γνωστές συσκευές ηλεκτροφόρησης Beckman-Paragon και τις έτοιμες πηκτές αγαρόζης, με δείγματα αίματος που θα σας δοθούν. Αιωρείστε τα ερυθρά αιμοσφαίρια σε 2ml φυσιολογικού ορού και ξαναφυγοκεντρήστε. Με μια πλαστική μικροπιπέτα τοποθετείστε 15 σταγόνες του αντιδραστηρίου αιμόλυσης σ' ένα καθαρό σωληνάριο και προσθέσετε 1 σταγόνα από τα πλυμένα, φυγοκεντρημένα ερυθροκύτταρα και αναδεύσετε στο Vortex για 15 sec. Το δείγμα σας (αιμόλυμα) είναι έτοιμο! Τεχνική ηλεκτροφόρησης 1) Βγάλτε την πηκτή από το περικάλυμμα της και πατήστε την ελαφρά με διηθητικό χαρτί (gel blotter). 27
2) Ευθυγραμμίστε προσεκτικά την μήτρα (sample template) με τα σημεία C της πηκτής και πατήστε ελαφρά. 3) Χρησιμοποιώντας κάθε φορά μια διαφορετική μύτη για την μικροπιπέτα τοποθετείστε ~ 5μl από τα διάφορα δείγματα αίματος στις εγκοπές και αφήστε ~ 5 min για να απορροφηθούν. 4) Πατήστε ελαφρά με διηθητικό χαρτί και μετά αφαιρέστε και το χαρτί και την μήτρα. 5) Βάλτε 45ml ρυθμιστικού διαλύματος ph=8,6 σε κάθε διαμέρισμα του μπάνιου ηλεκτροφόρησης και τοποθετείστε την πηκτή πάνω στην γέφυρα (προσέχοντας ώστε το + άκρο της πηκτής να βρίσκεται στο + άκρο του μπάνιου). 6) Ηλεκτροφορήστε στα 150 Volt για 25 min. 7) Αφαιρέστε την πηκτή από το μπάνιο και βάλτε την στο πλαίσιο πηκτής (gel frame). 8) Τοποθετείστε την πηκτή στο μονιμοποιητικό διάλυμα 1 (30% μεθανόλη - 20% οξικό) για 3-5 min. 9) Στεγνώστε την πηκτή στο στεγνωτήρα (gel drier) για ~ 15 min. 10) Τοποθετείστε την πηκτή στην μπλέ χρωστική (διάλυμα 2) για 3-5 min. 11) Τοποθετείστε την πηκτή με την σειρά στα εξής διαλύματα: διάλυμα 3 (5% οξικό) για 1-2 min, διάλυμα 4 (μεθανόλη - οξικό) για 2 min, διάλυμα 5 (5% οξικό) για 2 min. 12) Στεγνώστε την πηκτή (που τώρα θα πρέπει να εμφανίζει μπλέ ζώνες σε ένα διαυγές υπόστρωμα) στο στεγνωτήρα για ~5-10 min. Ερμηνεύστε τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό αιμοσφαιρινών που πήρατε σύμφωνα με τα κάτωθι πρότυπα: Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός αιμοσφαιρινών σε: 28