ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΠΟΙΟΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΣΕ ΠΟΙΚΙΛΙΕΣ ΠΙΠΕΡΙΑΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ: ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ, ΑΓΡΟΚΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΖΙΖΑΝΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΠΟΙΟΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΣΕ ΠΟΙΚΙΛΙΕΣ ΠΙΠΕΡΙΑΣ Ντούσκας Ευστάθιος Γεωπόνος ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

Επιβλέπουσα: Kουκουρίκου-Πετρίδου Μαγδαληνή, Καθηγήτρια Εξεταστική επιτροπή: Kουκουρίκου-Πετρίδου Μαγδαληνή, Καθηγήτρια Nιάνου Ειρήνη, Λέκτορας Βογιατζής Δημήτριος, Καθηγητής 2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ...5 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ..6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 9 1.ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ.11 1.1. Οικονομική σημασία της πιπεριάς..11 1.2. Βοτανικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά..12 1.3. Καψαϊκίνη...14 1.3.1. Βιοσύνθεση της καψαϊκίνης 16 1.4. Αντιοξειδωτικά...16 1.5. Φαινολικές ουσίες...22 1.6. Ασκορβικό οξύ....26 1.7. ph και οξέα.27 2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ..29 2.1.Φυτικό υλικό...29 2.2. Ποσοτικός προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής ικανότητας στους νωπούς καρπούς πιπεριά.....33 2.3. Ποσοτικός προσδιορισμός των ολικών φαινολών στους νωπούς καρπούς πιπεριάς..35 2.4. Ποσοτικός προσδιορισμός ασκορβικού οξέος (βιταμίνη C) στους νωπούς καρπούς πιπεριάς...37 2.5. Προσδιορισμός του χρώματος 38 2.6. Προσδιορισμός νωπού βάρους καρπών και σπορών..38 2.7. Προσδιορισμός ξηρού βάρους καρπών και σπόρων...38 2.8. Προσδιορισμός καψαϊκίνης 38 2.9. Μέτρηση ph...39 2.10. Προσδιορισμός διαλυτών στερεών...39 2.11. Προσδιορισμός ολικής οξύτητας..39 2.12. Στατιστική επεξεργασία 40 3

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ..41 3.1. Μορφολογικά χαρακτηριστικά. 41 3.1.1. Νωπό βάρος καρπών.....41 3.1.2. Ξηρό βάρος καρπών...42 3.1.3. Μήκος καρπών...43 3.1.4. Διάμετρος καρπών......44 3.1.5. Πάχος της σάρκας των καρπών.. 45 3.1.6. Νωπό βάρος σπόρων.. 47 3.1.7. Ξηρό βάρος σπόρων...48 3.2. Ποιοτικά χαρακτηριστικά.. 50 3.2.1. Χρώμα....50 3.2.2. Διαλυτά στερεά...52 3.2.3. ph...53 3.2.4. Ολική οξύτητα. 54 3.2.5. Kαψαϊκίνη...54 3.2.6. Ολική αντιοξειδωτική ικανότητα.55 3.2.7. Ασκορβικό οξύ...56 3.2.8. Ολικές φαινόλες...58 3.2.9. Συσχέτιση μεταξύ ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας, ολικών φαινολών και ασκορβικού οξέος 59 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ.61 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 68 6. ΑΒSTRACT..69 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.70 8. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ.76 4

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Μετά την ολοκλήρωση της μεταπτυχιακής μου διατριβής θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στην κ. Κουκουρίκου-Πετρίδου Μαγδαληνή, καθηγήτρια Βιολογίας Οπωροκηπευτικών για την ανάθεση του θέματος, την καθοδήγηση, την πολύτιμη βοήθεια της στο εργαστηριακό μέρος αλλά και για την γενικότερη συμπαράσταση της κατά την διάρκεια της εκπόνησης και συγγραφής της παρούσας διατριβής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την κ. Νιάνου Ειρήνη, λέκτορα του τομέα Γενετικής Βελτίωσης για την βοήθεια της καθ όλη την διάρκεια της συγγραφής της μεταπτυχιακής μου διατριβής, όπως επίσης και τον κ. Βογιατζή Δημήτριο καθηγητή Βιολογίας Οπωροκηπευτικών σαν μέλος της τριμελούς επιτροπής αλλά και για τις εύστοχες παρατηρήσεις του κατά την διόρθωση της παρούσας διατριβής. Τέλος ευχαριστώ θερμά την εταιρεία «Θερμοκήπια Δράμας Α.Ε» και τον συνεταιρισμό «Ζυγός» στην Βέροια, για την ευγενική παροχή του φυτικού υλικού και για την συνεχή συνεργασία και παροχή πληροφοριών καθ όλη την διάρκεια του πειραματικού μέρους των μεταπτυχιακών μου σπουδών. 5

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΑΝΟVA = Analysis Of Variance ( ανάλυση της παραλλακτικότητας) α* = δείχνει την διαβάθμιση του χρώματος από το πράσινο (-α*) έως και το κόκκινο (+α*) ανάλογα με τις τιμές τις γωνίας Hue b* = δείχνει την διαβάθμιση του χρώματος από τo κίτρινο (+b*) έως και το μπλε (-b*) ανάλογα με τις τιμές τις γωνίας Hue CV = συντελεστής παραλλακτικότητας DNA = deoxyribonucleic acid (δεοξυριβονουκλεικό οξύ) Fcrit = F κριτήριο FRAP = Ferric Reducing Antioxidant Power GAE = gallic acid equivalents (ισοδύναμα γαλλικού οξέος) Η2Ο2 = υπεροξείδιο του υδρογόνου L* = χρωματικός παράγοντα ο οποίος και παίρνει τιμές από 0 (μαύρο) ως 100 (λευκό) LDL = low density lipoprotein ( χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτείνη ) n = αριθμός επαναλήψεων ΝΟ = οξείδιο του αζώτου Ν0 2 = νιτρώδες οξείδιο Na 2 MoO 4 2Η2O = μολυβδαινικό νάτριο Ό2Η = υπερυδροξυλική ρίζα Ο2 = υπεροξειδικό ανιόν ΟRAC = oxygen radical absorbance capacity r = συντελεστής συσχετίσεως (παίρνει τιμές από -1 έως +1) r² = συντελεστής προσδιορισμού (παίρνει τιμές από 0 έως 1) RΟΟ = η ρίζα περοξειδίου ROS = reactive oxygen species ( ενεργές μορφές οξυγόνου) ΤPTZ = τριπυρίδυλο-τριαζίνη UV = ultraviolet (υπεριώδης) ΒΕ = βαθμοί ελευθερίας ΕΣΔ = ελάχιστα στατιστικά σημαντικές διαφορές Μ1=ΜΤΠ, μέσο τετράγωνο παραγόντων 6

Μ2=ΜΤΣ, μέσο τετράγωνο σφάλματος 2 σ p = ολική φαινοτυπική παραλλακτικότητα 2 σ b = παραλλακτικότητα των τιμών εντός της ποικιλίας 2 σ w = παραλλακτικότητα των τιμών των ποικιλιών μεταξύ τους ΣΣΔ= στατιστικά σημαντικές διαφορές 7

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία έγινε αξιολόγηση 7 μορφολογικών και 8 ποιοτικών χαρακτηριστικών σε 25 ποικιλίες γλυκιάς πιπεριάς (E.41.9816, Derby, Raiko, Rubiero, Marbuka, Yellow Kelly, E.41.9957, Fierro,E.41.9933, Thiaf, Palermo, Helsinki, Spider, Ferrari, Odyssey,Orange Orangery, 35-136, Portobello, Yecla, 35-304, 35-103, Fuscinato, Banan, Fosoco, Costas ή Φλωρίνης) και σε 3 ποικιλίες καυτερής πιπεριάς (Μedina, Yanca Βέροιας και Yanca Δράμας). Οι καρποί που χρησιμοποιήθηκαν βρίσκονταν στο στάδιο συγκομιδής για κατανάλωση. Οι μετρήσεις που έγιναν αφορούσαν το νωπό και ξηρό βάρος του καρπού και των σπόρων (g), το μήκος, την διάμετρο και το πάχος της σάρκας του καρπού (cm), το χρώμα της κάθε ποικιλίας, τις συγκεντρώσεις των διαλυτών στερεών, της ολικής οξύτητας (% κιτρικό οξύ), του pη, του ασκορβικού οξέος (mg/100g), των ολικών φαινολών (mg GAE / g ν.β), της αντιοξειδωτικής ικανότητας (μmol A.O./g ν.β.) και τέλος την ποσότητα καψαϊκίνης στις 3 καυτερές ποικιλίες (Medina, Yanca Βέροιας, Yanca Δράμας). Γενικά στα ποιοτικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν παρατηρήθηκε μεγάλη ποικιλομορφία. Οι τιμές της συγκέντρωσης των ολικών φαινολών κυμαίνονταν από 0.93 mg GAE/g ν.β (Μarbuka) έως 0.39 mg GAE/g ν.β (Ε.41.9933), του ασκορβικού οξέος από 87.1 mg/100g (Portobello) έως 37.8 mg/100g (Βanan) και της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας από 20.215 μmol A.O/g ν.β (Medina) έως 7.77 μmol A.O/g ν.β (Ε.41.9957). Οι μετρήσεις δείχνουν ότι το περιβάλλον και οι καλλιεργητικές φροντίδες επηρεάζουν τα χαρακτηριστικά της κάθε ποικιλίας. 8

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η καλλιεργούμενη στην Ελλάδα πιπεριά ανήκει στο είδος Capsicum annuum L.var. annuum της οικογένειας Solanaceae και κατάγεται από περιοχές της τροπικής και υποτροπικής Αμερικής. Υπάρχουν αρκετές ενδείξεις πως το είδος αυτό καλλιεργήθηκε αρχικά στο Περού και ακολούθως στο Μεξικό πριν από το 5000 π.x ενώ μετά την ανακάλυψη της Αμερικής, διαδόθηκε η καλλιέργεια του σε πολλές περιοχές της γης. Περιλαμβάνει πολλούς γενοτύπους που παράγουν γλυκούς ή καυτερούς καρπούς. Το άγριο είδος πιπεριάς είναι το Capsicum annuum var. Aviculare, που είναι αυτοφυές στις περιοχές που προαναφέρθηκαν (Ντόγρας, 2002). Τα τελευταία χρόνια λόγω του αυξημένου ενδιαφέροντος για την κατανάλωση πιπεριάς τόσο στην χώρα μας όσο και παγκοσμίως, έχουν δημιουργηθεί πολλά υβρίδια και νέες ποικιλίες, από τα οποία μερικά καλλιεργούνται ήδη στην χώρα μας και κάποια άλλα βρίσκονται ακόμη σε πειραματικό στάδιο. Τα καινούργια αυτά υβρίδια και ποικιλίες παρουσιάζουν διαφορές σε χαρακτηριστικά τους που σχετίζονται με το μέγεθος, το σχήμα, το χρώμα, την γεύση και τις χρήσεις τους. Έτσι καλλιεργούνται πιπεριές που δίνουν καρπούς φουσκωτούς ή μακρόστενους, πράσινους, κίτρινους, πορτοκαλί ή κόκκινους με γλυκιά ή καυτερή γεύση που καταναλίσκονται μαγειρεμένοι ή νωποί. Εκτός των παραπάνω χαρακτηριστικών διαφορές παρουσιάζονται και στο περιεχόμενο διαφόρων άλλων ουσιών που είναι ωφέλιμες για την υγεία των καταναλωτών όπως π.χ τα αντιοξειδωτικά και το ασκορβικό οξύ. Στην παρούσα εργασία επιχειρείται μια εκτίμηση των ποιοτικών και μορφολογικών χαρακτηριστικών 28 διαφορετικών ποικιλιών ή υβριδίων πιπεριάς. Οι μετρήσεις που έγιναν αφορούσαν το νωπό και ξηρό βάρος του καρπού (g), το νωπό και ξηρό βάρος των σπόρων (g), το μήκος και την διάμετρο του καρπού όπως και το πάχος της σάρκας ξεχωριστά (cm), το χρώμα της κάθε ποικιλίας ως προς την παραμέτρους L (συντελεστής φωτεινότητας) και την γωνία Hue (Hue angle), τις συγκεντρώσεις των διαλυτών στερεών, τις συγκεντρώσεις της ολικής οξύτητας της κάθε ποικιλίας εκφρασμένη σε % κιτρικό οξύ, τις ποσότητες του ασκορβικού οξέος που περιείχαν (mg/100g), το 9

pη της κάθε ποικιλίας, τις τιμές συγκέντρωσης των ολικών φαινολών mg GAE / g (ν.β), το ποσοστό των ολικών αντιοξειδωτικών μmol A.O./g (ν.β.) με την μέθοδο FRAP και τέλος την ποσότητα καψαϊκίνης σε 3 καυτερές ποικιλίες (Medina, Yanca Βέροιας, Yanca Δράμας) και μια μη καυτερή (Costas) που χρησιμοποιήθηκε σαν μάρτυρας. 10

1.ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 1.1. Οικονομική σημασία της πιπεριάς Σε παγκόσμια κλίμακα, η Ασία με κυρίαρχο την Κίνα, κατέχει τα πρωτεία στην καλλιέργεια της πιπεριάς. Η παγκόσμια παραγωγή της πιπεριάς το 2004 έφτασε τους 24.027.000 τόνους σε έκταση περίπου 16.556.000 στρεμμάτων. Ο μεγαλύτερος όγκος καλλιέργειας της πιπεριάς εντοπίζεται κυρίως στην περιοχή της Ασίας αφού σχεδόν το 65% της παραγωγής προέρχεται από ασιατικές χώρες (Εικόνα 1). Η Κίνα βρίσκεται στην πρώτη θέση με 12.028.000 τόνους και 10.023.000 στρέμματα καλύπτοντας το 50% της παγκόσμιας παραγωγής. Σημαντική παραγωγή παρουσίασε και το Μεξικό με 3.013.000 τόνους και 2.002.000 στρέμματα και η Τουρκία με 2.887.000 τόνους και 1.426.000 στρέμματα (Αθανασιάδης, 2008). Τα κράτη-μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωσης εμφάνισαν σχετικά χαμηλή παραγωγή αλλά με πολύ υψηλές μέσες αποδόσεις που στην Ολλανδία έφτασαν περίπου τα 26.500 κιλά το στρέμμα (Αθανασιάδης, 2008). Εικόνα 1. Ποσοστό (%) συμμετοχής των ηπείρων στην παγκόσμια παραγωγή πιπεριάς την καλλιεργητική περίοδο 2003-2004. 11

Με βάση τα πιο πρόσφατα διαθέσιμα στοιχεία η καλλιέργεια της πιπεριάς (Υπουργείο Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, 2003), κατέλαβε το 2003 έκταση 6.392 στρεμμάτων και είχε μέση απόδοση 7.786 Kg/στρ. Κέντρα θερμοκηπιακής καλλιέργειας πιπεριάς είναι το Λασίθι (2.650 στρ.), η Ημαθία (1.515 στρ.), η Τριφυλία (700στρ.), το Ηράκλειο (340 στρ.) και η Θεσσαλονίκη (314 στρ.). Την ίδια χρονιά (2003), η υπαίθρια καλλιέργεια πιπεριάς κατέλαβε έκταση 32.239 στρεμμάτων και είχε μέση απόδοση 1.894 Kg/στρ. Σημαντικά κέντρα υπαίθριας καλλιέργειας πιπεριάς είναι η Ηλεία (6.000 στρ.), η Ξάνθη (3.400 στρ.), τα Τρίκαλα (3.000 στρ.), η Εύβοια (1500 στρ.), η Καβάλα (1400 στρ.), η Ημαθία (1.350 στρ.) και η Θεσσαλονίκη (1.300στρ), ενώ η συνολική παράγωγη ήταν περίπου 87.000 τόνοι. 1.2. Βοτανικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά Το φυτό του είδους C. annuum είναι ποώδες ύψους 50-150 cm όταν καλλιεργείται στο ύπαιθρο ενώ άλλα είδη πιπεριάς μπορούν να αποκτούν την μορφή θάμνου, όπως π.χ. το C. frutescens. Τα φυτά του C. annuum όταν καλλιεργούνται σε θερμοκήπιο μπορεί να ξεπεράσουν σε ύψος ακόμη και τα 2 μέτρα με το κατάλληλο κλάδεμα, οπότε οι βλαστοί τους ξυλοποιούνται καθώς αναπτύσσονται. Οι βλαστοί της πιπεριάς είναι περιορισμένης σε ύψος ανάπτυξης, δεδομένου ότι η επιμήκυνση τους σταματά με τον σχηματισμό ενός άνθους στην κορυφή. Το πρώτο άνθος σχηματίζεται στην κορυφή του κεντρικού βλαστού σε ύψος περίπου 15-20 cm. Η παραπέρα ανάπτυξη των βλαστών συνεχίζεται με την εκβλάστηση δυο ή τριών πλευρικών οφθαλμών κάτω από την κορυφή τους. Έτσι διχοτομείται ή τριχοτομείται συνεχώς ο κάθε βλαστός μετά από τον σχηματισμό ορισμένων φύλλων και ενός άνθους στην κορυφή. Οι βλαστοί του φυτού είναι πολύ εύθραυστοι και μπορεί να σπάσουν κατά τις καλλιεργητικές περιποιήσεις ή ακόμη και υπό το βάρος μεγάλου φορτίου καρπών σε συνδυασμό με την επίδραση ισχυρού ανέμου, δεδομένου ότι δεν γίνεται υποστύλωση των φυτών (Ντογράς, 2002 ). Το ριζικό σύστημα είναι μετρίου σχετικά μεγέθους αλλά η κεντρική ρίζα του σπορόφυτου μπορεί να φθάσει σε βάθος μεγαλύτερο του 1 μέτρου 12

όταν η σπορά γίνεται σε ελαφρό έδαφος. Πάντως οι περισσότερες ρίζες φθάνουν σε βάθος 30-60 cm και σε πλάτος εκατέρωθεν του βλαστού 30-50 cm. Το άνθος είναι ερμαφρόδιτο, μερικώς σταυρογονιμοποιούμενο με στεφάνη λευκή ως λευκοπράσινη ή μοβ. Στο είδος C. annuum αναπτύσσεται συνήθως ένα άνθος ανά γόνατο, ενώ σε άλλα είδη αναπτύσσονται μέχρι και τρία (Nτόγρας, 2002 ). Ο καρπός της πιπεριάς είναι ράγα με σχήμα, μέγεθος και τελικό χρώμα που ανάλογα με τον γενότυπο εμφανίζει μεγάλη ποικιλομορφία. Κατά την ανάπτυξη του καρπού, το περικάρπιο αποχωρίζεται από τον πλακούντα, (λόγω διαφοράς στο ρυθμό ανάπτυξης), οπότε δημιουργείται στο εσωτερικό του κοιλότητα όπου αναπτύσσεται ο ξηρός πλακούντας που φέρει τους σπόρους (Ντόγρας, 2002, Bosland and Votana, 2000). Το χρώμα του καρπού της πιπεριάς, λόγω των χρωστικών που περιέχει, μεταβάλλεται έντονα κατά την πορεία ωρίμανσης του καρπού. Το αρχικό χρώμα είναι πράσινο, στην πορεία κίτρινο-πορτοκαλί και καταλήγει σε κόκκινο. Η εναλλαγή των χρωμάτων αλλά και το τελικό χρώμα του καρπού εξαρτάται αποκλειστικά από το γενετικό υλικό του φυτού και το περιβάλλον. Το πράσινο χρώμα του καρπού οφείλεται κυρίως στην παρουσία της χλωροφύλλης που περιέχεται στους χλωροπλάστες (Conforti et al., 2007). Κατά την ωρίμανση ταυτόχρονα με την διάσπαση των χλωροφυλλών, παρατηρείται και σύνθεση καροτενοειδών (Markus et al., 1999) και οι χλωροπλάστες μετατρέπονται σε χρωμοπλάστες. Όλα τα καροτενοειδή είναι ισοπρενοειδή με 40 άτομα C στο μόριο τους και σχηματίζονται από τη συμπύκνωση 8 μονάδων ισοπρενίου. Η συγκεκριμένη συμπύκνωση αποτελεί και ένα από τα βασικά στάδια της βιοσύνθεσης των ισοπρενοειδών (Hornero- Mendez et al., 2000). Η κρυπτοξανθίνη, καψορουβίνη και κυρίως η καψανθίνη είναι χρωστικές που συντίθενται αποκλειστικά στο φυτό της πιπεριάς και είναι υπεύθυνες για το κόκκινο χρώμα (Minguez-Mosquera and Hornero-Mendez, 1994). Αντίθετα οι ξανθοφύλλες και πρωτίστως η ζεαξανθίνη, είναι χρωστικές υπεύθυνες για το κίτρινο χρώμα του καρπού και η αναλογία κίτρινων προς κόκκινων χρωστικών δίνει και το τελικό χρώμα στον καρπό (Hornero-Mendez et al., 2000). Το σχήμα του καρπού διαφέρει ανάλογα με τον γενότυπο από κωνικό ή επίμηκες ως σφαιροειδές. Συνήθως ο καρπός των καυτερών ποικιλιών 13

αποτελείται από 2-3 καρπόφυλλα, ενώ των γλυκών τύπου καμπάνας, από 3-5 καρπόφυλλα (Nτόγρας, 2002 ). Κατά την ωρίμανση του καρπού η περιεκτικότητα του περικαρπίου σε σάκχαρα αυξάνεται και συντίθενται διάφορες χρωστικές ουσίες όπως ακόμη και η καυστική ουσία καψαϊκίνη στις καυτερές ποικιλίες, στην οποία ουσία οφείλεται και η καυστικότητα τους. Ι.3. Καψαϊκίνη Η καψαϊκίνη είναι ένα άχρωμο αλκαλοειδές, με μορφή κρυσταλλική, έχει σημείο τήξης τους 64-65 o C και μοριακό βάρος 305.46. Καλοί διαλύτες της είναι ο αιθέρας, το βενζόλιο, το αλκαλικό νερό, ο οξικός αιθυλεστέρας κ.α. (Tασιοπούλου, 2008). Στο νερό η καψαϊκίνη δεν μπορεί να διαλυθεί. Σχήμα 1.Χημικός τύπος καψαϊκίνης. Για πρώτη φορά η καψαϊκίνη ανακαλύφθηκε και απομονώθηκε από τον Bocholt το 1816 ενώ το 1846 ο Tresh κατάφερε να απομονώσει σημαντική ποσότητα αυτής προσδιορίζοντας ταυτόχρονα και τον χημικό της τύπο, ο οποίος φαίνεται στο Σχήμα 1. Ο προσδιορισμός της καψαϊκίνης υλοποιήθηκε στο εργαστήριο από τον Benedek (Σιώμος, 1984). Παράγεται στα εξωτερικά επιδερμικά κύτταρα του πλακούντα και πιο συγκεκριμένα σε αδένες οι οποίοι βρίσκονται σε ένα φυτικό ιστό ο οποίος ενώνει τον πλακούντα με το περικάρπιο. Με το πέρας της βιοσύνθεσης της μεταφέρεται στα σπέρματα και στους ιστούς του πλακούντα και πιο συγκεκριμένα εγκαθίσταται μέσα σε ένα αρκετά μεγάλο αριθμό μικροσκοπικών κυστιδίων κατά μήκος του περικαρπίου (Prasad et al., 2006, Stewart et al., 2007). Στην Εικόνα 2 απεικονίζεται η ανατομία του καρπού 14

πιπεριάς (εγκάρσια τομή) όπου φαίνονται τα διάφορα μέρη του καρπού και οι αδένες παραγωγής της καψαϊκίνης, (Bosland and Votana, 2000). Εικόνα 2. Ανατομία του καρπού πιπεριάς (εγκάρσια τομή) Ο σχηματισμός των καρπών ξεκινά μετά την πτώση των πετάλων και αυξάνονται αργά σε μήκος. Στη συνέχεια, ανάλογα πάντα και με την ποικιλία, αυξάνονται με γρήγορο ρυθμό μέχρι ένα ορισμένο σημείο οπότε και αρχίζει να σταθεροποιείται το μήκος τους. Η καψαϊκίνη αρχίζει να συσσωρεύεται λίγο πριν από τη μεγάλη αύξηση του μήκους και η έντονη αύξησή της διαρκεί συγκεκριμένο χρόνο αναλόγως της ποικιλίας. Μετά το μέγιστο της συγκέντρωσης της παραμένει σταθερή και μόνο σε ελάχιστες περιπτώσεις μπορεί να μειωθεί, (Kirschbaum-Titze et al., 2002 ). Πιστεύεται ότι το φυτό της καυτερής πιπεριάς αναπτύσσει καυστικότητα με σκοπό να προστατεύσει τους καρπούς της από τα θηλαστικά ζώα ενώ αντιθέτως οι καρποί τρώγονται από τα πουλιά τα οποία δεν έχουν την αίσθηση της καυστικότητας και έτσι μεταφέρουν τους σπόρους (Bosland and Votana, 2000). 15

Ι.3.1. Βιοσύνθεση της καψαϊκίνης Η βιοσύνθεση της καψαϊκίνης πραγματοποιείται από δυο διαφορετικές μεταβολικές διαδικασίες. Στη μια συμμετέχουν αρωματικές ενώσεις και εμπλέκεται στο δευτερογενή μεταβολισμό όπου και σχηματίζονται διάφορες φαινολικές ενώσεις ενώ στην δεύτερη διαδικασία παρατηρείται μεταβολισμός των λιπαρών οξέων, ξεκινά με ένα αμινοξύ και καταλήγει στην σύνθεση της καψαϊκίνης (Σχήμα 3), (Aluru et al., 2003). Σχήμα 2. Βιοσύνθεση της καψαϊκίνης (Aluru et al., 2003) Εκτός από την καψαϊκίνη έχουν προσδιοριστεί και άλλα αλκαλοειδή που προκαλούν καυστικότητα, αλλά η καψαϊκίνη και η διυδροκαψαϊκίνη είναι οι κύριες ενώσεις που την προκαλούν, (Contreras Padilla and Yahia, 1998). 1.4. Αντιοξειδωτικά Τα αντιοξειδωτικά είναι βιοενώσεις των οργανισμών που έχουν την δυνατότητα να απενεργοποιούν την περίσσεια των ελευθέρων ριζών με δύο βασικούς μηχανισμούς: (1) προσφέροντας μονήρες ηλεκτρόνιο, (2) μεταφέροντας και προσφέροντας υδρογόνο (Prior et al., 2005). Οι δυο αυτοί 16

μηχανισμοί λειτουργούν σχεδόν παράλληλα και με κυριαρχία του ενός ή του άλλου μηχανισμού. Απενεργοποιώντας και εκκαθαρίζοντας την περίσσεια των ελευθέρων ριζών, τα αντιοξειδωτικά επιτυγχάνουν να απαλλάξουν τους αερόβιους οργανισμούς από την οξειδωτική καταπόνηση και την οξειδωτική ζημιά που προκαλούν. Τα φυτά σε αντίθεση με τους ανθρώπους μπορούν να παράγουν το σύνολο των συστατικών του αντιοξειδωτικού τους μηχανισμού, ενώ οι άνθρωποι έχουν ανάγκη από τη πρόσληψη κάποιων αντιοξειδωτικών μέσω της διατροφής τους. Σε γενικές γραμμές, τα φυτικά προϊόντα παρουσιάζουν πολύ μεγαλύτερη συγκέντρωση αντιοξειδωτικών από ό,τι τα ζωικά. Παρατηρούνται διαφορές μεταξύ των φυτικών προϊόντων στη συγκέντρωση των αντιοξειδωτικών που είναι της τάξης του 1:10 και κάποιες φόρες ακόμη μεγαλύτερη (Ηalvorsen et al., 2002). Η οξειδωτική καταπόνηση των οργανισμών είναι όπως προαναφέρθηκε αποτέλεσμα της περίσσειας ελευθέρων ριζών. Οι σημαντικότερες ελεύθερες ρίζες στον οργανισμό μας είναι μορφές οξυγόνου που έχουν υποστεί μερική αναγωγή. Αυτού του είδους οι ανηγμένες μορφές οξυγόνου, είναι ισχυρότερα οξειδωτικά από ό,τι το οξυγόνο όταν αυτό βρίσκεται στη βασική του κατάσταση, είναι ιδιαίτερα τοξικές και ονομάζονται δραστικές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species ή ROS). Προσβάλλουν νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες, λιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών και πολλά μικρά μόρια (φαινόλες, σάκχαρα κ.α.). Οι βλάβες που προξενούν οι ανηγμένες αυτές μορφές του οξυγόνου εκδηλώνονται με διαφόρους τρόπους όπως με διάσπαση χρωστικών, διάρρηξη μεμβρανών, μεταλλάξεις DΝΑ, εκροή ενδοκυτταρικών συστατικών, μεγάλη εξασθένηση φωτοσυνθετικής και αναπνευστικής ικανότητας, νέκρωση και γηρασμό. Η υψηλότερη κυτταρική συγκέντρωση αερίου οξυγόνου μεταξύ των αερόβιων οργανισμών παρατηρείται στα φυτά. Επομένως η παραγωγή ROS είναι έντονη στους φυτικούς οργανισμούς με αποτέλεσμα την παραγωγή ποικίλων αντιοξειδωτικών ουσιών ως αντιστάθμισμα στην οξειδωτική καταπόνηση που δέχονται. Οι συγκεκριμένες αντιοξειδωτικές ουσίες θεωρούνται υψηλής ποιότητας αλλά και πολύ ευεργετικές στην ανθρώπινη δίαιτα (Ηalvorsen et al., 2002). Από την άλλη, η λήψη πολλών αντιοξειδωτικών βιταμινούχων συμπληρωμάτων, σύμφωνα με έρευνα του πανεπιστημίου της Κοπεγχάγης 17

μπορεί να μείωσει το προσδόκιμο ζωής. Σύμφωνα με την έρευνα αυτή σε 68 κλινικές μελέτες, στις οποίες έλαβαν μέρος 230.000 άτομα έδειξαν ότι υπάρχει αύξηση της θνησιμότητας κατά 16% αυτών που καταναλώνουν συχνά και σε μεγάλες δόσεις βιταμίνη Α. Επίσης βρέθηκε ότι η Β-καροτίνη αυξάνει την θνησιμότητα κατά 7% και η βιταμίνη Ε κατά 4%. Τέλος η έρευνα αυτή έδειξε ότι μεγάλες ποσότητες βιταμίνης C και σεληνίου δεν προκαλούν προβλήματα αλλά ούτε καταγράφηκαν και κάποια οφέλη (www.wikipedia.com). Οι ελεύθερες ρίζες αυτές είναι μόρια με ασύζευκτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική τους στοιβάδα και εκτός του ότι είναι σχετικώς σταθερά μπορούν και να υφίστανται αυτόνομα ενώ είναι επίσης και πολύ ενεργές. Η παρουσία του ασύζευκτου ηλεκτρονίου αυξάνει την δραστικότητα τους, καθώς αναζητείται ακόμη ένα για να σταθεροποιήσουν το μόριο τους. Η απόσπαση των ηλεκτρονίων, που προκαλούν οι ελεύθερες ρίζες σε διάφορα μόρια των κυττάρων, συντελεί στον σχηματισμό νέων ριζών και τελικά βλάβη σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο. Οι κυριότερες ελεύθερες ρίζες είναι όπως έχει ήδη αναφερθεί οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS). Αυτές είναι: η ρίζα υδροξυλίου (ΟΗ ), το υπεροξειδικό ανιόν (Ο2 ), η ρίζα περοξειδίου (RΟΟ ) η υπερυδροξυλική ρίζα (Ό2Η) και τέλος η ρίζα αλκοξειδίου (RΟ ). Στην κατηγορία των ROS ανήκουν και κάποια αλλά μόρια που παρόλο του ότι δεν είναι ελεύθερες ρίζες παρουσιάζουν παρόμοιες ιδιότητες με αυτές. Τέτοια μόρια είναι το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) το οξυγόνο απλής κατάστασης ( Ο2) και το όζον (O3). Στην κατηγορία των ελευθέρων ριζών ανήκουν επίσης και οι ενεργές μορφές αζώτου, όπως το οξείδιο του αζώτου ( ΝΟ) και το νιτρώδες οξείδιο (Ν0 2 ) (Νικολαίδης, 2008). Οι παράγοντες που προκαλούν την παραγωγή ROS και ακολούθως την οξειδωτική καταπόνηση είναι ενδογενείς και εξωγενείς. Στους ενδογενείς εμπεριέχονται κάποιες οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις που καταλύονται από ένζυμα της κατηγορίας των αφυδρογονασών και οξειδασών. Ακόμη σε παραγωγή ROS συντελούν: Η β-οξείδωση στα μικροσωμάτια Η ατελής αναγωγή του Ο2 στο χλωροπλάστη κατά τη διάρκεια της αναπνοής στο μιτοχόνδριο Διεργασίες του φυσιολογικού γηρασμού των κυττάρων 18

Η διεργασία της φωτοαναπνοής στα υπεροξυσωμάτια Στους εξωγενείς παράγοντες αντιθέτως περιλαμβάνονται: Οι ατμοσφαιρικοί ρύποι Η UV ακτινοβολία Οι προσβολές από διάφορα παθογόνα Τα βαρέα μέταλλα Διάφορα ζιζανιοκτόνα Η υψηλή ένταση του φωτός. Η ανοξία και η υποξία. Οι ακραίες θερμοκρασίες του περιβάλλοντος Η έλλειψη κάποιων θρεπτικών στοιχείων Εκτός από όλα αυτά τα αρνητικά όμως οι ελεύθερες ρίζες έχουν και κάποιες θετικές επιδράσεις στα βιολογικά συστήματα όταν δεν βρίσκονται σε περίσσεια. Έτσι διαπιστώθηκε ότι τα φυτά χρησιμοποιούν το Η2Ο2 κατά τη λιγνινοποίηση των κυτταρικών τους τοιχωμάτων ενώ ακόμη βρέθηκε ότι τα ROS λειτουργούν ως μοριακά σήματα, ενεργοποιώντας μηχανισμούς που έχουν σχέση με την αντίσταση σε προσβολές από παθογόνους μικροοργανισμούς. Επίσης στον ανθρώπινο οργανισμό η ελεύθερη ρίζα ΝΟ έχει αποδειχθεί ευεργετική σε ένα πλήθος λειτουργιών (www.wikipedia.com). Ουσιαστικά ο κύριος ρόλος των αντιοξειδωτικών ουσιών είναι η εξουδετέρωση και εκκαθάριση των ελευθέρων ριζών ή της βλάβης που αυτές προξενούν. Μπορούμε να τις φανταστούμε σαν ουσίες που κατά κάποιο τρόπο «θυσιάζονται» στον αγώνα που δίνει ο οργανισμός για την καταπολέμηση των ελευθέρων ριζών που υπάρχουν σε αυτόν. Έτσι προσφέρουν το ηλεκτρόνιο τους και συνδέονται με την ελλιπή χημική ένωση δημιουργώντας με αυτόν τον τρόπο μια ολοκληρωμένη χημική αλυσίδα. Η κάθε μια από αυτές τις ουσίες ενεργεί με τέτοιο τρόπο ώστε να εξουδετερώσει μια συγκεκριμένη ομάδα ελευθέρων ριζών, ενισχύοντας έτσι τους μηχανισμούς εξουδετέρωσης που ήδη υπάρχουν στον οργανισμό (Koύτσικας, 2008). Όσον αφορά τα μη ενζυμικά αντιοξειδωτικά μόρια στα φυτά ενδιαφέρον παρουσιάζουν το ασκορβικό οξύ, οι τοκοφερόλες, η γλουταθειόνη, τα καροτενοειδή και οι φαινολικές ουσίες. Οι τοκοφερόλες είναι ετεροκυκλικές λιπόφιλες ενώσεις με μεγάλο μοριακό βάρος και εκτός του ότι δρουν και σαν 19

βιταμίνες Ε, προστατεύουν τις κυτταρικές μεμβράνες από την οξείδωση των λιπιδίων τους. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί 4 μορφές τοκοφερολών, α-, β-, γ-, δ-, από τις οποίες σημαντικότερη θεωρείται η α-τοκοφερόλη. Η γλουταθειόνη είναι ένα τριπεπτίδιο που αποτελείται από γλουταμικό οξύ, γλυκίνη και κυστεΐνη και η οποία βρίσκεται στο κυτόπλασμα σε μεγάλες ποσότητες, και είναι μια από τις σπουδαιότερες αντιοξειδωτικές ουσίες των κυττάρων. Ο κεντρικός ρόλος της στην αντιοξειδωτική δράση είναι η αναγέννηση μιας άλλης ισχυρής αντιοξειδωτικής ουσίας, του ασκορβικού οξέος μέσω του κύκλου γλουταθειόνης-ασκορβικού οξέος. Το ασκορβικό οξύ το βρίσκουμε στα εσπεριδοειδή, τα ακτινίδια, τα πεπόνια, τα ροδάκινα, τις φράουλες, τα λαχανικά αλλά και τις κόκκινες πιπεριές. Τα καροτενοειδή είναι μια ομάδα λιποδιαλυτών χρωστικών στην οποία περιέχονται περισσότερα από 700 μέλη, μεταξύ των οποίων είναι η β-καροτίνη που στον οργανισμό μετατρέπεται σε βιταμίνη Α, η α-καροτίνη αλλά και το λυκοπένιο το οποίο περιέχεται σε μεγάλες ποσότητες στην τομάτα το οποίο παρέχει και σημαντική προστασία από τον καρκίνο του προστάτη, (Κούτσικας, 2008). Από όλα αυτά 50 απορροφούνται από το ανθρώπινο σώμα ενώ μόνο 14 έχουν ανιχνευτεί στο αίμα. Μειωμένη απορρόφηση τους προκαλείται κυρίως από την χρήση αντισυλληπτικών φαρμάκων, την υπερβολική κατανάλωση αλκοόλης και την αυξημένη έκθεση στην UV ακτινοβολία. Η αντιοξειδωτική τους ικανότητα αποδίδεται κυρίως στην ξεχωριστή τους μοριακή δομή αλλά και στο εκτεταμένο σύστημα συζυγιακών διπλών δεσμών (Κούτσικας, 2008). Το ασκορβικό οξύ είναι υδατοδιαλυτή ουσία με ισχυρή αντιοξειδωτική δράση στο κυτόπλασμα αλλά κυρίως στον αποπλάστη. Έχει την ικανότητα να προσφέρει ηλεκτρόνια σε μια σειρά ενζυμικών και μη ενζυμικών αντιδράσεων κάτι το οποίο το καθιστά σαν ένα από τα κύρια αντιοξειδωτικά του κυττάρου. Οι φαινολικές ουσίες είναι μια πολύ μεγάλη ομάδα δευτερογενών μεταβολιτών οι οποίες βρίσκονται σε μεγάλες ποσότητες στους φυτικούς ιστούς και έχουν και αυτές ισχυρή αντιοξειδωτική δράση. Η αντιοξειδωτική τους αυτή ικανότητα οφείλεται στο γεγονός ότι μπορούν με ευκολία να διαθέσουν ένα ηλεκτρόνιο ή πρωτόνιο και παρόλα αυτά να διατηρούν και τη σταθερότητα του μορίου τους, ανακατανέμοντας το συνολικό τους φορτίο και στην ικανότητα τους να σχηματίζουν χηλικές ενώσεις με διάφορα ιόντα μεταβατικών μετάλλων όπως είναι τα δισθενή κατιόντα του σιδήρου και του 20

χαλκού. Όπως γίνεται αντιληπτό η περιεκτικότητα των τροφίμων σε αντιοξειδωτικά είναι ένα ακόμη χαρακτηριστικό ποιότητας. Οι αντιοξειδωτικές ουσίες είναι παράγοντας που επηρεάζει την ποιότητα των τροφίμων αφού εμπλέκονται στο μηχανισμό της άμυνας των φυτών και μεταβάλλουν επίσης την εξέλιξη ορισμένων φυσιολογικών ανωμαλιών στους καρπούς, επιμηκύνουν τη μετασυλλεκτική τους ζωή και επιβραδύνουν ή καταστέλλουν τελείως τη μόλυνση από παθογόνα. Οι υψηλές συγκεντρώσεις επομένως των ελευθέρων ριζών στα ανθρώπινα βιολογικά συστήματα εμφανίζονται σαν συνέπεια ασθενειών, κακής διατροφής, καπνίσματος, ναρκωτικών και άλλα. Εάν αυτές οι ελεύθερες ρίζες δεν αντιμετωπιστούν εγκαίρως αρχίζουν να αναζητούν το ελεύθερο ηλεκτρόνιο στον περιβάλλοντα χώρο του κυττάρου και αν δεν το βρουν προχωράνε περισσότερο και χτυπούν τον πυρήνα του εκεί όπου βρίσκεται το DNA μας δημιουργώντας έτσι σοβαρές αλλοιώσεις (Ηalvorsen et al., 2006). Έτσι οι ελεύθερες ρίζες εκτός των άλλων θεωρούνται υπεύθυνες για: Την αρτηριοσκλήρωση Τον καρκίνο αλλοιώνοντας το γενετικό μας υλικό Την διαδικασία της γήρανσης αφού καταστρέφουν σιγά σιγά τα κύτταρα μας Τον εκφυλισμό της ωχράς κηλίδας του ματιού που οδηγεί στην απώλεια της όρασης Για αυτό η πρόσληψη αντιοξειδωτικών μέσω κατανάλωσης τροφίμων και ιδιαίτερα φυτικών προϊόντων που έχουν υψηλές συγκεντρώσεις αντιοξειδωτικών, είναι ευεργετική για την ανθρώπινη υγεία. Έτσι μια λύση απέναντι στην οξειδωτική καταπόνηση του οργανισμού είναι η κατανάλωση φυτικών προϊόντων που αποτελούν πολύ καλές πηγές αντιοξειδωτικών ουσιών (Wu et al., 2004). Αν και σε κάποιες κλινικές δοκιμές η χρήση μεμονωμένων αντιοξειδωτικών συστατικών, όπως η βιταμίνη Ε, βιταμίνη C, β-καροτένιο και άλλα, δεν έδωσαν και τόσο ενθαρρυντικά αποτελέσματα, είναι αποδεδειγμένη η υψηλή διαιτητική αξία των πιπεριών και άλλων φυτικών προϊόντων. Η εξήγηση που προσπάθησαν να δώσουν για την έλλειψη θετικής δράσης μεμονωμένων αντιοξειδωτικών συστατικών, είναι ότι πιθανό να είναι 21

αναγκαία η συνεργιστική δράση πολλών φυτοχημικών ουσιών μαζί, πολλές εκ των οποίων δεν γνωρίζουμε καν την ύπαρξη τους, ώστε να έχουμε καλύτερη αντιοξειδωτική δράση (Ηalvorsen et al., 2002). Έτσι μετά την αναγνώριση της λειτουργίας της οξειδωτικής καταπόνησης αλλά κυρίως και του αντιδότου της, που είναι τα αντιοξειδωτικά, η δημιουργία μιας βάσης δεδομένων που να καθορίζει την αντιοξειδωτική ικανότητα όλων των τροφίμων είναι αναγκαία (Wu et al., 2004). Κύριες πηγές αντιοξειδωτικών είναι τα φρούτα και τα λαχανικά στα οποία απαντώνται σε σχετικά μεγάλες ποσότητες. Η μέτρηση της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας είναι ένα σχετικά νέο μέσο που θα μπορούσε να διερευνήσει τις σχέσεις μεταξύ της ανθρώπινης δίαιτας και των ασθενειών που προκαλούνται από οξειδωτική καταπόνηση (Ρellegrini et al., 2006). 1.5. Φαινολικές ουσίες Οι φαινολικές ουσίες αποτελούν μια από τις κύριες κατηγορίες δευτερογενών μεταβολιτών στα φυτά με συμμετοχή σε λειτουργίες ανάπτυξης, αύξησης και ανταπόκρισης σε διαφορές περιβαλλοντικές καταπονήσεις, με αποτέλεσμα να έχουν μεγάλη επίδραση στη γεωργική παραγωγή. Από διαιτητικής άποψης, οι φαινολικές ουσίες θεωρούνται υψηλής αντιοξειδωτικής ικανότητας και επομένως εξαιρετικά χρήσιμες για την ανθρώπινη διατροφή. Φαινολικές ουσίες ονομάζονται τα υδροξυβενζολικά παράγωγα, με το ΗΟ ενωμένο με τον αρωματικό δακτύλιο. Οι φαινολικές ουσίες σχηματίζονται δια μέσου της μεταβολικής οδού του σικιμικού οξέος και των φαινυλοπροπανοειδών. Το τελικό προϊόν της μεταβολικής οδού του σικιμικού οξέος αλλά και ο ενδιάμεσος μεταβολίτης που συνδέει τη μεταβολική οδό του σικιμικού οξέος με τον μεταβολισμό των φαινυλοπροπανοειδών είναι η φαινυλαλανίνη. Η φαινυλαλανίνη μετατρέπεται μέσω μιας συγκεκριμένης ενζυμικής δράσης σε π-κουμαρικό οξύ το οποίο και χρησιμεύει σαν αρχικός μεταβολίτης για τον σχηματισμό των τριών κυριοτέρων ομάδων των φαινολικών ουσιών που είναι τα στιλβενοειδή, τα φλαβονοειδή και οι λιγνίνες μαζί με τις λιγνάνες. Πιστεύεται ότι το 20% περίπου των σακχάρων που σχηματίζονται κατά τη διαδικασία της φωτοσύνθεσης, χρησιμοποιούνται κατά τον μεταβολισμό των φαινυλοπροπανοειδών, σχηματίζοντας έτσι τη πλειοψηφία των φαινολικών συστατικών (Ververidis et al., 2007). Όλες οι 22

κατηγορίες των φαινολικών συστατικών φαίνονται στο Σχήμα 3 (Κουτελιδάκης, 2004). Σχήμα 3.Κατηγορίες φαινολικών ουσιών Η φαινολική σύσταση των καρπών καθορίζεται από γενετικούς και περιβαλλοντικούς κυρίως παράγοντες αλλά επηρεάζεται και από παράγοντες που προκαλούν οξειδωτική αντίδραση στα φυτά τόσο κατά την καλλιέργεια και την αύξηση όσο και κατά την αποθήκευση των καρπών της πιπεριάς. Δύο από τις σπουδαιότερες διεργασίες, όπου εμπλέκονται οι φαινολικές ουσίες, είναι:1) η αντιοξειδωτική τους δράση και 2) το καφέτιασμα που προκαλούν στους φυτικούς ιστούς όταν υποστούν οξείδωση και μετατραπούν σε κινόνες (Robards et al., 1999). Mία άλλη αρνητική ιδιότητα των φαινολικών ουσιών που αναφέρεται από τον Pedrosa και τους συνεργάτες του (2000) είναι η ιδιότητα τους να επηρεάζουν την ποιότητα των πρωτεϊνών των καρπών μετασυλλεκτικά, μειώνοντας έτσι την πεπτικότητα τους, διαφοροποιώντας τις οργανοληπτικές τους ιδιότητες αλλά και την σταθερότητα τους κατά την αποθήκευση. Οι φαινολικές ουσίες εμπεριέχονται σε όλους τους φυτικούς ιστούς, ενώ σε κυτταρικό επίπεδο τις συναντάμε κυρίως στα χυμοτόπια υπό μορφή γλυκοζιτών αλλά και στα κυτταρικά τοιχώματα. Η γλυκοζυλίωση των φαινολικών ουσιών είναι ένας συγκεκριμένος κυτταρικός μηχανισμός δια μέσου του οποίου οι φαινολικές ουσίες γίνονται περισσότερο διαλυτές και 23

κινητικές, όπως επίσης και ένας τρόπος να παραμένουν αδρανείς όταν δεν είναι αναγκαία η επίδραση τους (Ververidis et al., 2007). Εκτός όμως από τον σχηματισμό των φαινυλοπροπανοειδών κατά την φυσιολογική αύξηση και ανάπτυξη των φυτών, παρατηρείται επίσης και μια αύξηση της βιοσύνθεσης τους μετά από περιβαλλοντική καταπόνηση (ψύχος, υψηλές θερμοκρασίες, τραυματισμός, UV ακτινοβολία κ. α. ) και προσβολές από παθογόνους μικροοργανισμούς. Οι φαινολικές ουσίες μπορούν επίσης να προσφέρουν ανθεκτικότητα απέναντι σε διάφορες μετασυλλεκτικές μυκητολογικές ασθένειες. Ο Ververidis και οι συνεργάτες του (2007) αναφέρουν ότι φαινολικές ουσιές στους φυτικούς οργανισμούς: Προστατέυουν από UV ακτινοβολία, ιδιαίτερα σε οργανισμούς που αναπτύσσονται σε περιοχές με μεγάλο υψόμετρο. Δρούν ως αντιμικροβιακοί παράγοντες. Είναι απωθητικά εντόμων και φυτοφάγων ζώων όπως είναι οι ταννίνες, των οποίων η γεύση τους γίνεται απωθητική, ενώ ταυτόχρονα έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν την αύξηση και ανάπτυξη πολλών μορφών μυκήτων και να προστατεύουν έτσι το ξύλο πολλών δένδρων από αποσύνθεση. Λειτουργούν ως μοριακά σήματα αλλά και ως φωτοϋποδοχείς κατά τα πρώτα βήματα της συμβίωσης ψυχανθών και ριζόβιων. Προσελκύουν διάφορα έντομα μέσω χρωστικών όπως είναι οι ανθοκυανίνες οι οποίες και είναι υπεύθυνες για το ιώδες, το κόκκινο και το μπλε χρώμα των ανθέων και των καρπών. Συμβάλλουν στη ρύθμιση της μεταφοράς αυξίνης. Οι φαινολικές ουσίες θεωρούνται ευεργετικές στην ανθρώπινη δίαιτα, όπου πέρα από την αντιοξειδωτική τους ικανότητα προσφέρουν αρκετές ακόμη θεραπευτικές βιολογικές δράσεις ως αντιαλεργικά, αντιφλεγμονώδη, αγγειοδιασταλτικά μέσα και αντιθρομβωτικά, (Velioglu et al., 1998). Από τις φαινολικές ουσίες, τα φλαβονοειδή θεωρούνται υψηλής αξίας στην ανθρώπινη δίαιτα, (Ververidis et al., 2007). Ο Ververidis και οι συνεργάτες του (2007), αναφέρουν επίσης την θετική δράση των φλαβονοειδών σε ασθενείς με διάφορες καρδιοαγγειακές παθήσεις, ερμηνεύοντας αυτήν την δράση σαν συνέπεια της μείωσης της οξείδωσης της LDL-λιποπρωτεΐνης, η οξειδωμένη μορφή της οποίας θεωρείται ως η αμέσως υπεύθυνη για την 24

ανάπτυξη αθηρωματικής πλάκας στα αγγεία. Η μέση ημερήσια δόση των φλαβονοειδών στην ανθρώπινη δίαιτα πρέπει να κυμαίνεται από 60 έως 800mg. Σε τέσσερεις από έξη επιδημιολογικές μελέτες που έγιναν από τον Pietta (2000) αναφέρθηκε η πιθανή προστατευτική επίδραση φλαβονοειδών σε ασθενείς με καρδιοαγγειακές παθήσεις. Εξάλλου η αντιοξειδωτική ικανότητα των φλαβονοειδών σε in vitro έρευνες έχει διερευνηθεί επαρκώς και έχει επίσης αποδειχθεί. Ο Ρietta (2000) επεξηγεί τους μηχανισμούς αυτούς με τους οποίους εκδηλώνεται αυτή η αντιοξειδωτική ικανότητα των φλαβονοειδών που είναι οι παρακάτω: Σχηματισμός διαφόρων χηλικών ενώσεων με ιόντα μεταβατικών μετάλλων (Fe +2, Cu + ) τα οποία και εμπλέκονται άμεσα στο σχηματισμό ελευθέρων ριζών. Αναστολή της δράσης των ενζύμων τα οποία είναι υπεύθυνα για το σχηματισμό διαφόρων ενεργών μορφών οξυγόνου (οξειδάση ξανθίνης, πρωτεϊνική κινάση C κ. α.). Προστασία και επανανεργοποίηση άλλων αντιοξειδωτικών ουσιών (ασκορβικό οξύ, τοκοφερόλες κ. α.). Εκκαθάριση ελευθέρων ριζών ως δότες ηλεκτρονίου ή υδρογόνου. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις οι φαινολικές ουσίες δρουν ικανοποιητικά ως αντιοξειδωτικά, ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις μπορεί να λειτουργήσουν και ως προοξειδωτικά. Είναι πιθανό ότι κατά την in vivo δράση των φλαβονοειδών και μετά την επεξεργασία που υφίστανται κατά την πεπτική λειτουργία μέσα στον ανθρώπινο οργανισμό, η συμπεριφορά τους να μην είναι ακριβώς αυτή που αναλύθηκε λίγο πιο πάνω ως αντιοξειδωτικών. Πιο συγκεκριμένα οι Williams et al. (2004), αναφερόμενοι στο προηγούμενο θέμα θεωρούν ότι ίσως τελικά τα φλαβονοειδή να μην λειτουργούν ως αντιοξειδωτικά αλλά σαν συγκεκριμένοι μοριακοί αγγελιοφόροι που δρουν σε ένζυμα, υποδοχείς μεμβρανών και μεταγραφικούς παράγοντες όπου επάγουν η καταστέλλουν διάφορες μεταβολικές οδούς. Η θέση αυτή στηρίζεται σε διάφορα πειραματικά δεδομένα όπου αποδείχθηκε ότι τα φλαβονοειδή ήταν σε θέση να προστατέψουν τους ανθρώπινους νευρώνες απέναντι στην οξειδωτική καταπόνηση περισσότερο αποτελεσματικά από ό,τι το ασκορβικό οξύ, ακόμη και όταν το τελευταίο 25

βρισκόταν σε δέκα φορές μεγαλύτερη συγκέντρωση από ό,τι τα φλαβονοειδή. Αυτό μάλιστα, σύμφωνα με τους Williams et al. (2004), δείχνει ότι η δράση των φλαβονοειδών είναι αντιοξειδωτική. 1.6. Ασκορβικό οξύ Το ασκορβικό οξύ ή βιταμίνη C είναι μια υδατοδιαλυτή ουσία με υπόλευκη κρυσταλλική μορφή, όξινη γεύση και ισχυρή αντιοξειδωτική δράση. Ο μοριακός του τύπος είναι C6H8O6 και ο στερεοχημικός του τύπος φαίνεται στην Εικόνα 3. Παράγεται από όλους τους φυτικούς οργανισμούς, ενώ αντίθετα ο ανθρώπινος οργανισμός δεν το παράγει και για αυτό και θεωρείται απαραίτητο συστατικό για την ανθρώπινη δίαιτα. Έλλειψη του ασκορβικού οξέος προκαλεί ουλίτιδα, πόνο στις αρθρώσεις, δύσκολο επούλωμα πληγών και εύκολο σχηματισμό μωλώπων στο δέρμα. Σε φυσιολογικές καταστάσεις το ασκορβικό οξύ υφίσταται με την ανηγμένη του μορφή μέσα στα φύλλα και κυρίως μέσα στους χλωροπλάστες (Βlokhina et al., 2002). Σε καταστάσεις καταπόνησης συσσωρεύεται σε μεγάλες ποσότητες στα κυτταρικά τοιχώματα, προστατεύοντας με αυτό τον τρόπο τις κυτταρικές μεμβράνες από την καταστροφική επίδραση των ελευθέρων ριζών, (Smirnoff et al., 1996). Έτσι η ικανότητα αυτή του ασκορβικού οξέος να προσφέρει ηλεκτρόνια σε μια μεγάλη ποικιλία ενζυμικών αλλά και μη ενζυμικών αντιδράσεων, το καθιστά σαν τον κύριο εκκαθαριστή ελευθέρων ριζών στην υδρόφιλη φάση του κυττάρου. Το ασκορβικό οξύ συντελεί επίσης στην αναγέννηση της α-τοκοφερόλης, ενώ επανενεργοποιείται δια μέσου του κύκλου γλουταθειόνης - ασκορβικού οξέος. Το ασκορβικό οξύ εμπλέκεται και σε άλλες λειτουργίες μη αντιοξειδωτικές, όπως στην κυτταροδιαίρεση αλλά και στην επιμήκυνση των κυττάρων, (Βlokhina et al., 2002). Στα φυτά όλα τα κύτταρα είναι σε θέση να συνθέσουν ασκορβικό οξύ αλλά η σύνθεση του συντελείται κυρίως στα μεριστωματικά κύτταρα (Αrrigoni and De Tullio, 2002). Η βιοσύνθεση του ασκορβικού οξέος στα φυτά ακολουθεί μια μεταβολική οδό τεσσάρων σταδίων (μεταβολική οδός Smirnoff- Wheeler), αρχικά με GDP-D-μαννόζη, ακολούθως με GDP-L-γαλακτόζη και L-γαλακτόζη και τελικά με L-γαλάκτονο-1,4-λακτόνη που είναι και η πρόδρομος ουσία του ασκορβικού οξέος. 26

. Εικόνα 3.Στερεοχημικός τύπος ασκορβικού οξέος. Διάφορες έρευνες που έχουν γίνει έδειξαν ότι η επαρκής πρόσληψη ασκορβικού οξέος συσχετίζεται με την θεραπεία του άσθματος, βελτιώνει το ανοσοποιητικό σύστημα, μπορεί να μειώσει τις λοιμώξεις του άνω αναπνευστικού συστήματος ενώ τέλος φρούτα και λαχανικά που είναι πλούσια σε βιταμίνη C μειώνουν την εμφάνιση διαφόρων μορφών καρκίνου, μειώνουν τον κίνδυνο εμφάνισης καταρράκτη αλλά βελτιώνουν και την υγεία του καρδιαγγειακού συστήματος. 1.7. ph και οξέα Η έννοια του ph εισάχθηκε το 1909 από το Δανό χημικό Sοrensen. Το ph είναι ένας εύχρηστος τρόπος έκφρασης της συγκέντρωσης των ιόντων υδρογόνου σε ένα υδατικό διάλυμα. Πιο συγκεκριμένα, ως "ph" ορίζεται ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθμος της συγκέντρωσης των ιόντων υδρογόνου [H + ] στο διάλυμα. Δηλαδή: ph=-log[h + ]. Το ph αποτελεί μέτρο οξύτητας ή αλκαλικότητας ενός διαλύματος, εξ ου και αναφέρεται ως ενεργός οξύτητα. Η κλίμακα ph που κυμαίνεται από 0 έως 14, χρησιμοποιείται ευρέως για τον προσδιορισμό της οξύτητας ενός διαλύματος. Διαλύματα για τα οποία η τιμή 27

του ph είναι μικρότερη από 7 χαρακτηρίζονται ως όξινα, ενώ διαλύματα με ph μεγαλύτερο του 7 χαρακτηρίζονται αλκαλικά. Tέλος, τα διαλύματα με ph=7 ονομάζονται ουδέτερα. Για τα περισσότερα διαλύματα η τιμή του ph βρίσκεται κάπου ανάμεσα στο 0 και το 14. Παρόλ' αυτά, ιδιαίτερα όξινα ή αλκαλικά διαλύματα είναι δυνατόν να έχουν ph μικρότερο από 0 (ιδιαίτερα όξινο διάλυμα) ή μεγαλύτερο από 14 (ιδιαίτερα αλκαλικό διάλυμα). Κάτι τέτοιο δεν αντιτίθεται στον ορισμό του ph, το οποίο ως λογαριθμική συνάρτηση μπορεί θεωρητικά να παίρνει οσοδήποτε μικρές ή μεγάλες τιμές. Για παράδειγμα, στο διάλυμα που υπάρχει μέσα σε μια μπαταρία η συγκέντρωση των ιόντων υδρογόνου είναι περίπου ίση με 3 mol/l, ([H + ]=3M), οπότε το ph του είναι αρνητικό (περίπου ίσο με -0,5). 28

2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1.Φυτικό υλικό Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν καρποί 25 ποικιλιών γλυκιάς πιπεριάς (E.41.9816, Derby, Raiko, Rubiero, Marbuka, Yellow Kelly, E.41.9957, Fierro,E.41.9933, Thiaf, Palermo, Helsinki, Spider, Ferrari, Odyssey,Orange Orangery, 35-136, Portobello, Yecla, 35-304, 35-103, Fuscinato, Banan, Fosoco, Costas ή Φλωρίνης) και καρποί 3 ποικιλιών καυτερής πιπεριάς (Μedina, Yanca Βέροιας και Yanca Δράμας). Oι Yanca Βέροιας, Costas ή Φλωρίνης, Raiko και Banan προήρθαν από τον αγροτικό συνεταιρισμό «ΖΥΓΟΣ» στην Βέροια ενώ οι υπόλοιπες από τα θερμοκήπια Δράμας Α.Ε. Οι καρποί που χρησιμοποιήθηκαν για τις μετρήσεις βρίσκονταν στο στάδιο ωριμότητας που διατίθενται στην αγορά για κατανάλωση κατά την συγκομιδή τους και για αυτό παρουσίαζαν και μεγάλη ποικιλομορφία στο χρώμα τους. Παρακάτω φαίνεται το στάδιο στο οποίο βρίσκονταν οι καρποί κατά την συγκομιδή και τις αναλύσεις. Εικόνα 4. Ποικιλία Ε.41.9816 Εικόνα 5. Ποικιλία Ε41.9933 29

Εικόνα 6.Ποικιλία Ε.41.9957 Εικόνα 7.Ποικιλία Fuscinato Εικόνα 8.Ποικιλία Ferrari Εικόνα 9.Ποικιλία Fierro Εικόνα 10. Ποικιλία Μarbuka Εικόνα 11.Ποικιλία Fosoco 30

Εικόνα 12.Ποικιλία Medina Εικόνα 13.Ποικιλία Odysseus Εικόνα 14.Ποικιλία Orange Orangery Εικόνα 15.Ποικιλία Palermo Εικόνα 16.Ποικιλία Rubiero Εικόνα 17.Ποικιλία Spider 31

Εικόνα 18.Ποικιλία Yanca(Δράμας) Εικόνα 19.Ποικιλία Helsinki Εικόνα 20.Ποικιλία Yecla Εικόνα 21.Ποικιλία Orange Glory Εικόνα 22.Ποικιλία Derby Εικόνα 23.Ποικιλία Yellow Kelly 32

Εικόνα 24.Ποικιλία Costas (Florinis) Εικόνα 25.Ποικιλία Yanca (Βέροιας) Εικόνα 26.Ποικιλία Banan Εικόνα 27.Ποικιλία Raiko 2.2. Ποσοτικός προσδιορισμός της αντιοξειδωτικής ικανότητας στους νωπούς καρπούς πιπεριάς. Η δοκιμή FRAP είναι μια αρκετά γρήγορη και άμεση φασματοφωτομετρική μέθοδος μέσω της οποίας υπολογίζουμε την συνολική αντιοξειδωτική δύναμη ενός φυτικού εκχυλίσματος (Soobrattee et al., 2005). Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην αναγωγή, κάτω από όξινες συνθήκες, του συμπλόκου Fe +3 - τριπυρίδυλο- τριαζίνη (Fe + -ΤΡΤΖ) σε δισθενή μορφή, το οποίο και αποκτά έντονο μπλε χρώμα και έχει απορρόφηση στα 593 nm. Οι συνθήκες της δοκιμής είναι τέτοιες που ευνοούν την 33

αναγωγή του τρισθενούς συμπλόκου (Fe + -ΤΡΤΖ) από το σύνολο των αντιοξειδωτικών ουσιών που βρίσκονται στο διάλυμα δοκιμής, (Βenzie and Strain, 1996). Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την εκχύλιση των δειγμάτων των 28 ποικιλιών πιπεριάς και την εφαρμογή της δοκιμή FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) περιγράφεται παρακάτω : Ξήρανση των δειγμάτων για 48 ώρες στους 68 C Λειοτρίβιση και ομογενοποίηση των δειγμάτων με γουδί και γουδοχέρι Ζύγιση 1 g δείγματος και τοποθέτηση σε δοκιμαστικούς σωλήνες για εκχύλιση με 10 ml εκχυλιστικού μέσου Λήψη του υπερκείμενου εκχυλιστικού μετά από 24 ώρες και αντικατάσταση με νέο ίσου όγκου Ενοποίηση του όγκου των 2 εκχυλισμάτων μετά από 48 ώρες Συμπλήρωση του εκχυλίσματος μέχρι τελικού όγκου 25 ml Eκχυλιστικο μέσο: 50% μεθανόλη 1,2 Μ ΗCl. Παρασκευή εκχυλιστικού: σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml τοποθετήθηκαν 50 ml μεθανόλης, ακολούθως προστέθηκαν 10 ml πυκνό HCl 11-12M (ή 36-37%) και συμπληρώθηκε η ογκομετρική φιάλη με αποσταγμένο νερό. Για την εκτέλεση της δοκιμής παρασκευαζόταν αρχικά το διάλυμα εργασίας FRAP (αντιδραστήριο FRAΡ) με ανάμιξη, σε αναλογία 10:1:1, των αντιδραστηρίων: α) ρυθμιστικό διάλυμα οξικών 0,3Μ,ρΗ=3,6 β) διάλυμα 10 mm tripyridil-s-triazine (ΤΡΤΖ) σε 40 mμ HCl και γ) 20mΜ διαλύματος τριχλωριούχου σιδήρου (FeCl3 6H2O) το οποίο και πρέπει να ανανεώνεται μετά από κάθε νέα μέτρηση. Σαν πρότυπη αντιοξειδωτική ουσία χρησιμοποιήθηκε υδατικό διάλυμα ασκορβικού οξέος συγκέντρωσης 1mΜ το οποίο και παρασκευάζεται λίγο πριν την χρήση του. Ακολούθως αναμιγνύουμε σε δοκιμαστικό σωλήνα 3 ml από το διάλυμα εργασίας FRAP και 100 μl δείγματος η πρότυπου αντιοξειδωτικού. Ακολούθως το μείγμα μετά από καλή ομογενοποίηση σε ομογενοποιητή τοποθετούνταν αμέσως για επώαση σε υδατόλουτρο στους 37 C. Ακριβώς 4 34

λεπτά, μετά από την ανάμιξη των αντιδραστηρίων, μετριέται η απορρόφηση με φασματοφωτόμετρο oρατού-uv, (Μ 106, Camspec, UK), στα 593 nm. Ως μάρτυρας χρησιμοποιούταν ποσότητα απεσταγμένου νερού ίση με την ποσότητα του εκχυλίσματος των δειγμάτων, δηλαδή ποσότητα από 10 έως 100 μl. Η τιμή της απορρόφησης στα 593 nm, μετατρεπόταν στην τιμή FRΑΡ του δείγματος συσχετίζοντας την απορρόφηση του εξεταζόμενου δείγματος με την απορρόφηση του πρότυπου διαλύματος ασκορβικού οξέος. Αναλυτικότερα, οι τιμές FRAP του εκχυλίσματος για κάθε δείγμα υπολογιζόταν σε μμ, με τη χρήση της εξίσωσης: ΔΑ593nm δείγματος τιμή FRΑΡ εκχυλίσματος = ----------------------- x τιμή FRΑΡ προτύπου ΔΑ593nm προτύπου όπου ΔΑ593nm είναι η απορρόφηση στα 593 nm. Το παραπάνω κλάσμα είναι ο λόγος της απορρόφησης ίσης ποσότητας δείγματος και πρότυπου διαλύματος ασκορβικού οξέος. Διάλυμα ασκορβικού οξέος 1000 μμ έχει τιμή FRΑΡ 2000 μμ, καθώς το ασκορβικό οξύ έχει στοιχειομετρική σταθερά ίση με 2 (Βenzie and Strain, 1996). Οι τιμές FRΑΡ εκφράζονται σε μμ ασκορβικού οξέος (Α. Ο.) ανά γραμμάριο νωπού βάρους του καρπού (ν. β.), σύμφωνα με τη σχέση: τιμή FRΑΡ δείγματος [μμ (Α. Ο). / g (ν. β.)]=v (L) x --------- x τιμή FRΑΡ 1(g) εκχυλίσματος (μμ). Όπου V=(0,005 ή 0,025, ανάλογα με το αν έγινε αραίωση ή όχι) και 1(g) το βάρος του φυτικού υλικού που χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση. Έγιναν συνολικά δυο αναλύσεις για κάθε δείγμα. 1 2.3. Ποσοτικός προσδιορισμός των ολικών φαινολών στους νωπούς καρπούς πιπεριάς. Για την παραλαβή των ολικών φαινολών η μέθοδος που εφαρμόστηκε ήταν μια τροποποιημένη μέθοδος των Μoya και Νavvaro, (1994). Τυχαία επιλέχθηκε μια ποσότητα από τους καρπούς των διαφόρων ποικιλιών και έγινε ομογενοποίηση τους, χρησιμοποιώντας πορσελάνινο γουδί και γουδοχέρι. Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν 0,2 g του δείγματος σε σωλήνα 35

φυγόκεντρου και προστέθηκαν 10 ml μεθανόλης 80%. Ακολουθούσε συνεχής ανάδευση των σωλήνων φυγόκεντρου, σε αναδευτήρα, για 15 λεπτά της ώρας και κατόπιν φυγοκέντρηση για 5 λεπτά. Μετά το πέρας της φυγοκέντρησης λαμβανόταν το υπερκείμενο και προσθέτονταν άλλα 5 ml μεθανόλης (80%) στο εναπομείναν ίζημα. Ακολουθούσε ανάδευση για 15 λεπτά της ώρας σε αναδευτήρα. Στη συνέχεια τα δείγματα φυγοκεντρίζοταν. Με το τέλος της φυγοκέντρησης λήφθηκε για δεύτερη φορά το υπερκείμενο και άρχισε η τρίτη φάση εκχύλισης στο εναπομείναν ίζημα όμοια ακριβώς με την δεύτερη φάση εκχύλισης. Μετά το πέρας και των τριών εκχυλίσεων ο συνολικός όγκος του εκχυλιστικού υγρού των δειγμάτων ήταν 20 ml. Στον παραπάνω αναφερόμενο όγκο του εκχυλιστικού υγρού των δειγμάτων έγινε ο ποσοτικός προσδιορισμός των ολικών φαινολών των καρπών πιπεριάς. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των ολικών φαινολών των καρπών πιπεριάς πραγματοποιήθηκε στο τελικό εκχύλισμα των 20 ml του οποίου η παραλαβή περιγράφηκε προηγουμένως. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε στηρίζεται σε μια συγκεκριμένη αντίδραση οξειδοαναγωγής με οξειδωτικό παράγοντα το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu και η συγκέντρωση των φαινολών προσδιορίστηκε με τη χρήση φασματοφωτόμετρου ορατού-uv, (Skerget et al., 2005) Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu αραιωνόταν σε αναλογία 1:10 με νερό απεσταγμένο και σε 2,5 ml του αραιωμένου αντιδραστηρίου προσθέταμε 250 μl εκχυλίσματος και 250 μl απεσταγμένο νερό. Μετά από 30 δευτερόλεπτα (το αργότερο μέχρι 8 λεπτά), προσθέτονταν 2 ml διαλύματος Νa2CO3 (75 g/l). Στην συνέχεια το δείγμα αναδευόταν καλά και επωάζονταν σε υδατόλουτρο στους 50 C για 5 λεπτά. Μετά τη ψύξη του δείγματος ακολουθούσε μέτρηση της απορρόφησης στα 760 nm. Ως μάρτυρας χρησιμοποιούνταν 500 μl απεσταγμένο νερό. Από κάθε δείγμα έγινε προσδιορισμός της συγκέντρωσης των ολικών φαινολών σε τρεις διαφορετικές εκχυλίσεις. Οι τιμές της απορρόφησης αντιστοιχίζονταν σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος (μg GΑΕ) στο διάλυμα δοκιμής, με τη βοήθεια της πρότυπης καμπύλης που είχε κατασκευαστεί για τον σκοπό αυτό (Γράφημα 3, Παράρτημα). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ισοδύναμα γαλλικού οξέος (GAE) mg ανά γραμμάριο νωπού ιστού με χρήση της εξίσωσης: 36

1 1 GΑΕ δείγματος [mg / g (ν. β.)]= ------ x 20 (ml) x--------x0,001x GΑΕ δοκιμής (μg) Όπου είναι: 0,25(mL) 1(g) 0,25(mL), ο όγκος του εκχυλίσματος που χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμή 20(mL), ο όγκος του τελικού εκχυλίσματος 1(g), το νωπό βάρος του καρπού που χρησιμοποιήθηκε στην εκχύλιση 0,001, ο συντελεστής μετατροπής των μg σε mg 2.4. Ποσοτικός προσδιορισμός ασκορβικού οξέος (βιταμίνη C) στους νωπούς καρπούς πιπεριάς. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του ασκορβικού οξέος στους καρπούς των 28 ποικιλιών πιπεριάς που εξετάστηκαν, έγινε με τη βοήθεια του ανακλασίμετρου (reflectometer) RQflex της εταιρίας Μerck, όπως περιγράφεται παρακάτω: Ζυγίστηκαν 10g από το φυτικό μας υλικό τα οποία και τοποθετηθήκαν σε ομογενοποιητή (blender) στον οποίο προστέθηκαν και 20 ml οξαλικό οξύ 1% για να αποφευχθεί η οξείδωση του ασκορβικού οξέος. Ακολούθως το εκχύλισμα διηθήθηκε και το διήθημα που προέκυψε χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του ασκορβικού οξέος των καρπών της πιπεριάς ως εξής: Η μια άκρη της ειδικής ταινίας (strip) βυθίστηκε στο διηθημένο εκχύλισμα του δείγματος για περίπου 2 δευτερόλεπτα. Ακολούθως τοποθετήθηκε η άκρη της ταινίας στην ειδική υποδοχή του ανακλασιμέτρου πριν το πέρας των 15 δευτερολέπτων Σημειώνουμε την ένδειξη (Ε) σε mg/l. O υπολογισμός της συγκέντρωσης του ασκορβικού οξέος γίνεται σύμφωνα με τον τύπο: Ασκορβικό οξύ (mg/100 g σάρκας καρπού ) = Ένδειξη οργάνου (mg/1) x όγκος εκχυλιστικού (ml) ------------------------------------------------------------- x 0,1 Βάρος ιστού (g) Για κάθε δείγμα έγιναν 2 μετρήσεις. 37

2.5. Προσδιορισμός του χρώματος Το χρώμα της πιπεριάς προσδιορίστηκε με το χρωματόμετρο Minolta CR- 200 και οι μετρήσεις γίνονταν σε τρία σημεία σε κάθε καρπό. Ένα κοντά στον κάλυκα, ένα στο μέσο του καρπού και το τρίτο στο άκρο του καρπού. Το όργανο βαθμονομήθηκε με την εργαστηριακή λευκή πλάκα και για να εκφραστεί το χρώμα χρησιμοποιήθηκαν οι παράμετροι L*, a* και b* όπου η τιμή L* δείχνει την λαμπρότητα ή φωτεινότητα και παίρνει τιμές από 0 (μαύρο) ως 100 (λευκό), η τιμή b* την διαβάθμιση από κίτρινο(+b *) σε μπλε (-b*) και η τιμή (a*) την διαβάθμιση του χρώματος από το πράσινο (-a*) έως και το κόκκινο (+α*) και από τις τιμές τους υπολογίζουμε την γωνία Hue (Hue angle). 2.6. Προσδιορισμός νωπού βάρους καρπών και σπόρων Μετά την απομάκρυνση των ακαθαρσιών και των ξένων υλών με πλύσιμο των καρπών αφαιρέθηκαν ο κάλυκας και ο πλακούντας με τα σπέρματα από κάθε καρπό και ζυγίστηκε το υπόλοιπο μέρος του καρπού. Οι σπόροι μετά την αφαίρεση του πλακούντα ζυγίστηκαν αμέσως. 2.7. Προσδιορισμός ξηρού βάρους καρπών και σπόρων Μετά τον προσδιορισμό του νωπού βάρους τοποθετήθηκαν οι καρποί σε κλίβανο και πιο συγκεκριμένα σε θερμοκρασία 58 C για 7 μέρες μέχρι και την πλήρη αφυδάτωση τους και στην συνέχεια ζυγίστηκαν. Ακολούθως λειοτριβήθηκαν σε πορσελάνινο γουδί και σαν σκόνη αποθηκεύτηκαν στον καταψύκτη του ψυγείου μέχρι και την μέρα των αναλύσεων της καψαϊκίνης. Οι σπόροι μετά την μέτρηση τού νωπού τους βάρους τοποθετηθήκαν σε ηλιόλουστο μέρος για 4 μέρες όπου και αφυδατώθηκαν πλήρως και ακολούθως ζυγίστηκαν. 2.8. Προσδιορισμός καψαϊκίνης Mετρήσεις έγιναν στις ποικιλίες Yanca Βέροιας, Υαnca Δράμας, Medina όπως επίσης και στην ποικιλία Costas που χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας (μη 38