«ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΔΡΑΣΗ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΣΤΟΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΟΚΟΚΚΟ». ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ. του ΛΙΑΠΗ ΝΙΚΟΛΑΟΥ

«ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΔΡΑΣΗ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΣΤΟΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΟΚΟΚΚΟ». ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ του ΛΙΑΠΗ ΝΙΚΟΛΑΟΥ Τμήμα Τεχνολογίας Βιολογικής Γεωργίας και Τροφίμων Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό ίδρυμα Ιονίων Νήσων Αργοστόλι Κεφαλληνίας Φεβρουάριος 2013 1

«ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΔΡΑΣΗ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΣΤΟΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΟΚΟΚΚΟ». Η πτυχιακή εργασία εγκρίθηκε από: Επιβλέπων Εκπαιδευτικός: Ηρειώτου Ευφημία Σαμαράς Ιωάννης Σακαντάνη Ελένη Τμήμα Τεχνολογίας Βιολογικής Γεωργίας και Τροφίμων Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό ίδρυμα Ιονίων Νήσων Αργοστόλι Κεφαλληνίας Φεβρουάριος 2013 2

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα πτυχιακή εργασία εξετάστηκε η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων των φυτών: Pistacia lentiscus (φύλλα και καρποί), Crithmum maritimum, Rosmarinus officinalis (φύλλα), Pelargonium capitatum (φύλλα), Laurus nobilis Κεφαλλονιάς-Λευκάδας-Ζακύνθου, Myrtus communis Κεφαλλονιάς- Λευκάδας-Ζακύνθου, Lavandula angustifolia, Thymus vulgaris στον μικροοργανισμό Streptococcus pneumoniae καθώς και των χημικών ενώσεων carvacrol, eugenol, caryophyllene, terpinyl acetate, linalyl acetate, myrtenol, a- terpineol, (-) carveol, g-terpinene, p-cymene, (-) limonene, eucalyptol, a-pinene, (+) limonene που αποτελούν επιμέρους συστατικά των προαναφερθέντων ελαίων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα έλαια των φυτών Pelargonium capitatum, Laurus nobilis (Ζακύνθου), Thymus vulgaris, Ocimum basilicum, Mentha spicata είχαν ιδιαίτερα έντονη δράση, τα έλαια των φυτών Laurus nobilis (Κεφαλονιάς), Laurus nobilis (Λευκάδας), Myrtus communis (Λευκάδας), Myrtus communis (Κεφαλονιάς), Myrtus communis (Ζακύνθου), Origanum majorana είχαν μέση δράση ενώ τα έλαια των φυτών Pistacia lentiscus (φύλλα και καρπός), Crithmum maritimum (άνθος και καρπός), Crithmum maritimum (φύλλα), Rosmarinus officinalis (φύλλα), Lavandula angustifolia, Foeniculum vulgare, Smyrnium rotundifolium (φύλλα), Smyrnium rotundifolium (καρπός), Smyrnium rotundifolium (άνθη) και Vitex agnus-castus έδειξαν ελάχιστη έως μηδενική δράση. Οι επιμέρους ουσίες μπορούν να διαιρεθούν στις ακόλουθες ομάδες ως προς την αντιμικροβιακή τους δράση: Οι ενώσεις carvacrol και eugenol έχουν ιδιαίτερα έντονη αντιμικροβιακή δράση, οι ενώσεις caryophyllene, terpinyl acetate, linalyl acetate, myrtenol, a-terpineol, (-) carveol έχουν μέση ενώ οι ενώσεις g-terpinene, p-cymene, (-) limonene, eucalyptol, a-pinene, (+) limonene δεν έχουν αντιμικροβιακή δράση. 3

ABSTRACT During this research work, the antimicrobial activity of the essential oils derived from the plants: Pistacia lentiscus (leaves and fruit), Crithmum maritimum, Rosmarinus officinalis (leaves), Pelargonium capitatum (leaves), Laurus nobilis Kefalonia-Leukas-Zante, Myrtus communis Kefalonia-Leukas-Zante, Lavandula angustifolia, Thymus vulgaris was examined on Streptococcus pneumoniae. Furthermore, the antimicrobial activity of the chemical substances carvacrol, eugenol, caryophyllene, terpinyl acetate, linalyl acetate, myrtenol, a-terpineol, (-) carveol, g-terpinene, p-cymene, (-) limonene, eucalyptol, a-pinene, (+) limonene which are components of the prementioned essential oils was examined on the same microorganism. Results indicate that the essential oils derived from the plants Pelargonium capitatum, Laurus nobilis (Zante), Thymus vulgaris, Ocimum basilicum, Mentha spicata showed high antimicrobial activity, followed by the activity shown by the essential oils derived from Laurus nobilis (Kefalonia), Laurus nobilis (Leukas), Myrtus communis (Leukas), Myrtus communis (Kefalonia), Myrtus communis (Zante), Origanum majorana which showed an intermediate activity. Essential oils derived from the plants Pistacia lentiscus (leaves and fruit), Crithmum maritimum (flower and fruit), Crithmum maritimum (leaves), Rosmarinus officinalis (leaves), Lavandula angustifolia, Foeniculum vulgare, Smyrnium rotundifolium (leaves), Smyrnium rotundifolium (leaves), Smyrnium rotundifolium (flower) και Vitex agnuscastus showed no activity. The chemical substances used in this work may be divided as follows: Carvacrol and eugenol showed high antimicrobial activity, caryophyllene, terpinyl acetate, linalyl acetate, myrtenol, a-terpineol, (-) carveol showed intermediate activity whereas g-terpinene, p-cymene, (-) limonene, eucalyptol, a-pinene, (+) limonene showed no activity. 4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Κεφάλαιο Σελίδα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ...1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ...3 2.1. Χρήσεις αιθέριων ελαίων...3 2.2. Χημική σύσταση-ιδιότητες...4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. ΓΕΝΟΣ: Streptococcus......6 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...12 4.1. Στόχος πειραματικής έρευνας...12 4.2. Αιθέρια έλαια...13 4.3. Στελέχη μικροοργανισμών...13 4.4. Θρεπτικά υλικά...14 4.5. Ανάπτυξη στελεχών από πρότυπες καλλιέργειες...14 4.6. Εξέταση αντιμικροβιακής δράσης εκχυλισμάτων αγκινάρας και αιθέριων ελαίων...15 4.7. Καταμέτρηση αντιμικροβιακής δράσης...16 4.8. MIC (Minimum Inhibitory Concentration)...17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...18 5.1. Καταμέτρηση ζώνης αναστολής...18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...23 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...25 5

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα Σελίδα 1.Αιθέρια έλαια...2 2. Αρωματικά φυτά-πηγές αιθέριων ελαίων...5 3.Είδη στρεπτοκόκκου...7 4.Τύποι αιμόλυσης...8 5.Εκτεταμένη στρεπτοκοκκική λοίμωξη...9 6.Στρεπτοκοκκικό εξάνθημα...9 7.Μηχανισμός φαγοκυττάρωσης...11 8.Χρώση πολυσακχαρίτη του S. pneumoniae...11 9. Συχνότητα μηνιγγίτιδας και ποσοστιαία αναλογία αιτιολογικού παράγοντα...11 10. Συχνότητα κρουσμάτων S. pneumonia σε παιδιά κάτω των πέντε ετών...12 11. Βακτηριακά στελέχη της εταιρίας...13 12. Βήματα ανάπτυξης στελεχών από πρότυπες καλλιέργειες...14 13. Προσδιορισμός θολερότητας καλλιέργειας μικροοργανισμών...15 14. Τοποθέτηση δίσκων και αιθέριου ελαίου στα τρυβλία...16 15. Ζώνη αναστολής...16 16. Εμβολιασμός τρυβλίου ELISA και ανάγνωσή του μετά την επώαση...17 6

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Κεφάλαιο Σελίδα 1.1. Disc assay αιθέριων ελαίων.....19 1.2. MIC αιθέριων ελαίων....20 1.3. Disc assay επιμέρους συστατικών των αιθέριων ελαίων...22 1.4. MIC επιμέρους συστατικών των αιθέριων ελαίων...23 7

ΚΕΦΑΛΑΙΟ I ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά τα τελευταία 60 χρόνια, οι βελτιώσεις στην έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία μολυσματικών ασθενειών είχαν σαν αποτέλεσμα την τεράστια μείωση στη θνησιμότητα που οφείλεται στις ασθένειες αυτές. Αυτό οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στην καλύτερη κατανόηση που έχουμε σήμερα των βιολογικών μηχανισμών στο μοριακό επίπεδο των ασθενειών αυτών, και στην καλύτερη κατανόηση της παθοφυσιολογίας και επιδημιολογίας, αλλά και στην ανάπτυξη νέων και δραστικών αντιμικροβιακών θεραπειών που ήταν ικανές να καταστρέφουν τους συγκεκριμένους μολυσματικούς παράγοντες βοηθώντας με τον τρόπο αυτό τον ξενιστή να θεραπευθεί από τη μόλυνση. Τα αντιμικροβιακά αυτά σκευάσματα θεωρήθηκαν αρχικά σα θαυματουργά φάρμακα, ενώ η πρόσβαση στα πρώτα αυτά συστεμικά αντιβιοτικά (σουλφοναμίδες και πενικιλλίνη) δεν ήταν εφικτή στο γενικό κοινό. Στην πράξη, τα σκευάσματα αυτά ήταν ελάχιστα και πολύ ακριβά και τα φύλαγαν για τον στρατό κατά τον 2 ο παγκόσμιο πόλεμο (Lerner, 2004). Με την ανακάλυψη νέων αντιβιοτικών έγινε απλοπλοίηση των βιομηχανικών διαδικασιών, αναπτύχθηκαν νέες τεχνικές και έτσι διευκολύνθηκε η πρόσβαση στα αντιβιοτικά και άρχισαν να χρησιμοποιούνται σε παγκόσμιο επίπεδο. Τα αντιβιοτικά έγιναν πραγματική «πανάκεια» για την ιατρική με ευρεία χρήση για την θεραπεία, ακόμη και των πιο απλών μολύνσεων. Ο ίδιος ο Alexander Fleming, στηριζόμενος στην έρευνα που έγινε στο εργαστήριο του, σε συνέντευξη που έδωσε στο New York Times το 1945, είχε προειδοποιήσει ότι αλόγιστη χρήση της πενικιλλίνης θα οδηγούσε στην επιλογή ανθεκτικών στελεχών του Staphylococcus aureus που θα προκαλούσαν πιο επικίνδυνες μολύνσεις. Επιπλέον, είχε προειδοποιήσει ότι τα ανθεκτικά αυτά βακτήρια θα μπορούσαν να μεταδοθούν από άτομο σε άτομο (Levy, 2002). Ένα χρόνο μετά την ευρεία χρήση του αντιβιοτικού, υπήρξε σημαντική αύξηση των ανθεκτικών μορφών του βακτηρίου στη πενικιλλίνη. Λίγα χρόνια αργότερα, το ποσοστό των ανθεκτικών μορφών ξεπερνούσε το 50%. 8

Δυστυχώς, η κατάσταση δεν βελτιώθηκε κατά το πρόσφατο παρελθόν. Αντίθετα, κοινά βακτήρια που ήταν ευαίσθητα στα αντιβιοτικά αναπτύσσουν ανθεκτικότητα στα σκευάσματα αυτά. Τα πρώτα ανθεκτικά βακτήρια που δημιούργησαν πρόβληματα ήταν μικροοργανισμοί σε νοσοκομεία. Στη συνέχεια, εξαπλώθηκαν στην ευρύτερη κοινωνία και είναι πλέον υπεύθυνα για την πρόκληση σοβαρών ασθενειών παγκόσμια. Στη πτυχιακή αυτή μελέτη εξετάστηκε η αντιμικροβιακή δράση συγκεκριμένων αιθέριων ελαίων, προϊόντων υδροαπόσταξης βιολογικών φυτικών ιστών σε έξη στελέχη του παθογόνου μικροοργανισμού Streptococcus pneumoniae. Ο μικροοργανισμός αυτός είναι ένα από τα πιο κοινά παθογόνα που προκαλούν μολύνσεις του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος και άλλες σοβαρές παθήσεις, ειδικά σε παιδιά. Κατά τα τελευταία 15 χρόνια, η αντίσταση στα αντιβιοτικά των στελεχών που απομονώνονται κλινικά έχει αυξηθεί πολύ και αποτελεί πρόβλημα για τη θεραπεία των πνευμονοκοκκικών μολύνσεων (Kaplan, 2004). Εικόνα 1: Αιθέρια έλαια Πηγή: http://www.healthyliving.gr 9

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙI ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ 2.1. ΧΡΗΣΕΙΣ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ Ιστορικά, πολλά φυτικά έλαια και εκχυλίσματα, όπως αυτό του τσαγιού και του γαρύφαλλου, έχουν χρησιμοποιηθεί σαν τοπικά αντισηπτικά ή έχουν αναφερθεί να έχουν αντιμικροβιακές ιδιότητες (Burt, 2004). Η μελέτη των φυτών, ως προς τις αντιμικροβιακές τους ιδιότητες, είναι σημαντική γιατί αποτελεί πιθανές πηγές νέων αντιμικροβιακών ουσιών (Burt, 2004). Επιπλέον, με την αύξηση του ενδιαφέροντος για φυσικές θεραπείες και ζήτηση δραστικών ουσιών, ασφαλών φυσικών προϊόντων από τους καταναλωτές απαιτείται λεπτομερής μελέτη, τόσο της χημικής σύστασης, όσο και της αντιμικροβιακής τους δράσης. Η αντιμικροβιακή δραστηριότητα πολλών αιθέριων ελαίων και φυτικών εκχυλισμάτων έχει μελετηθεί για κάποιους μικροοργανισμούς, ο αριθμός των οποίων είναι περιορισμένος (Holley και Patel, 2005, Gutierrez et al., 2008, Bajpai et al., 2011). Προβλήματα τα οποία αντιμετωπίζουμε στις μελέτες αυτές περιλαμβάνουν τη χρήση ελαίων που παρότι έχουν το ίδιο όνομα, προέρχονται από διαφορετικό είδος φυτού και ότι η μέθοδος που χρησιμοποιείται για να μετρηθεί η αντιμικροβιακή δράση ποικίλει. Συνήθως, χρησιμοποιούνται μέθοδοι αραίωσης σε στερεό ή υγρό θρεπτικό υλικό. Τα περισσότερα από τα έλαια αυτά υπάρχουν στο εμπόριο σαν φαρμακευτικά ή προϊόντα κοσμητικής παρότι για κάποια υπάρχει έρευνα που υποδεικνύει τοξικές ιδιότητες (ευκάλυπτος, γαρύφαλλο, φασκόμηλο). Παρά τις τοξικές τους ιδιότητες, τα προϊόντα αυτά χρησιμοποιούνται. Στην μελέτη αυτή όλα τα αιθέρια έλαια τα οποία εξετάζονται είναι 100% βιολογικά. 10

2.2. ΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ-ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Τα αιθέρια έλαια είναι πτητικές, φυσικές πολύπλοκες ενώσεις που χαρακτηρίζονται από έντονο άρωμα και παράγονται από αρωματικά φυτά σαν δευτερογενείς μεταβολίτες. Ο πρώτος τρόπος παραγωγής τους αναπτύχθηκε το μεσαίωνα από τους Άραβες και περιλάμβανε την απόσταξη τους. Είναι γνωστά για τις αντισηπτικές τους ιδιότητες (βακτηριοκτόνα, ιοκτόνα και μυκητοκτόνα), για τις ιατρικές τους ιδιότητες και για το άρωμα τους. Χρησιμοποιούνται για τη συντήρηση του τροφίμου και για τις αντιμικροβιακές, αναλγητικές, αντιφλεγμονώδεις, σπασμολυτικές τους ιδιότητες και σαν τοπικά αναισθησιογόνα. Επί του παρόντος τα χαρακτηριστικά αυτά δεν έχουν αλλάξει εκτός από το γεγονός ότι έχουν αυξηθεί οι γνώσεις του τρόπου δράσης ειδικά στον αντιμικροβιακό τομέα. Στη φύση, τα αιθέρια έλαια παίζουν σημαντικό ρόλο στην προστασία των φυτών ενάντι σε βακτήρια, ιούς, μύκητες, έντομα, και απωθούν τα φυτοφάγα ζώα από το να καταναλώνουν τα φυτά αυτά. Επιπλέον, προσελκύουν κάποια έντομα που βοηθούν στην μεταφορά γύρης και σπόρων, ενώ ταυτόχρονα απωθούν τα ανεπιθύμητα. Τα αιθέρια έλαια χρησιμοποιούνται ιδιαίτερα σε χώρες με θερμό κλίμα, όπως οι χώρες γύρω από τη Μεσόγειο και οι τροπικές χώρες. Σ αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο στα παραδοσιακά φαρμακοσκευάσματα. Είναι υγρά, πτητικά, συνήθως άχρωμα λιποδιαλυτά και γενικά έχουν μικρότερη πυκνότητα από αυτήν του νερού. Μπορούν να προέλθουν από οποιοδήποτε μέρος του φυτού και είναι αποθηκευμένα σε εκκριτικά κύτταρα, κοιλότητες ή επιδερμικά κύτταρα. Επί του παρόντος, είναι γνωστά περίπου 3.000 έλαια, 300 από τα οποία χρησιμοποιούνται εμπορικά (Bakkali et al.,2008). H χημική σύσταση των βοτάνων είναι πολύπλοκη και ο καθορισμός της αρκετά δύσκολος. Τα δραστικά συστατικά και οι ενώσεις τους ποικίλουν και εξαρτώνται, τόσο από το είδος, όσο και από πολλούς παράγοντες όπως τη περιοχή προέλευσης, (θερμοκρασία, υγρασία, φως και άνεμος) και το χρόνο συγκομιδής. Άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν τη χημική σύσταση περιλαμβάνουν τη μέθοδο αποξήρανσης, πλύσης, θραύσης και πολτοποίησης των φυτών, αποθήκευσης και συντήρησης. Επειδή η συγκομιδή εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, όπως 11

καλλιέργεια σε μη ιδανικές συνθήκες, οπότε και μπορεί να περιέχουν μικρότερες συγκεντρώσεις δραστικών συστατικών ή μεγαλύτερες συγκεντρώσεις εντομοκτόνων. Αυτό μπορεί να έχει επικίνδυνες επιπτώσεις όταν αυξάνονται οι συγκεντρώσεις ορισμένων στοιχείων σε τοξικά επίπεδα (Alaerts et al,.2007). Για παράδειγμα, θεραπεία για απώλεια βάρους που στηριζόταν σε βότανα και που χρησιμοποιήθηκε στο Βέλγιο προκάλεσε νεφροπάθεια λόγω επιμολύνσεων του βοτάνου Stephania tetradra (Feng Fangqi) με το βότανο Αristolochia fanghi (Guang Fangji). Οι ασθενείς κατέληξαν να χρειάζονται αιμοδιάλυση ή μεταμόσχευση νεφρών. Η σύγχυση μπορεί να οφείλεται λόγω μετάφρασης ή λόγο διαφορών που προκύπτουν στη κινέζικη γλώσσα. Απαιτούνται λοιπόν αξιόπιστες μέθοδοι που να προσδιορίζουν τις ποσότητες των δραστικών ή των τοξικών συστατικών και να εξασφαλίζουν την ποιότητα των βοτάνων. Η πολυπλοκότητα των συστατικών στα βότανα καθιστά δύσκολο τον έλεγχο τους. Κατά τη τελευταία δεκαετία, η παραδοσιακή κινεζική ιατρική έγινε δημοφιλής στην Ευρώπη. Η χρήση βοτάνων και προϊόντων φυσικής προέλευσης είναι συνηθισμένο φαινόμενο και έτσι απαιτείται ο προσδιορισμός και ο ποιοτικός τους έλεγχος (C. Aschwanden, 2002).. Εικόνα 2: Αρωματικά φυτά-πηγές αιθέριων ελαίων. Πηγή: www.gardenfantastic.com 12

ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙΙΙ ΓΕΝΟΣ: Streptococcus Streptococcus: Από το 1977 όπου και έγινε ο προσδιορισμός του από τους Billroth και Ehrlich το γένος είναι μόνιμα στο επίκεντρο, διότι περιλαμβάνει μικροοργανισμούς που προκαλούν μεγάλο αριθμό ασθενειών στον άνθρωπο και στα ζώα. Ελάχιστοι άλλοι μικροοργανισμοί παράγουν τόσο μεγάλο αριθμό εξωτοξινών και ενζύμων μέσω των οποίων μπορούν να προκαλέσουν μόλυνση σε οποιοδήποτε ιστό. Ορισμένοι στρεπτόκοκκοι είναι γνωστό ότι προκαλούν δευτερογενείς νόσους που επηρεάζουν, καρδιά, νεφρά, αρθρώσεις και εγκέφαλο. Παρότι ορισμένοι στρεπτόκοκκοι είναι παθογόνα του ανθρώπου, άλλοι αποτελούν μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας της στοματικής και εντερικής κοιλότητας. Η φυσιολογική στρεπτόκοκκικη χλωρίδα μπορεί σε ορισμένες περιπτώσεις να εισέλθει στο αίμα και να προκαλέσει σηψαιμία η οποία συνήθως έχει σαν αποτέλεσμα την ενδοκαρδίτιδα. Ορισμένοι στρεπτόκοκκοι οι οποίοι είναι μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του στόματος, είναι υπεύθυνοι για την πρόκληση τεριδόνας. Το γένος Streptococcus ανήκει στην οικογένεια Streptococacceae. Το σημαντικότερα παθογενή για τον άνθρωπο είδη είναι τα Streptococcus pyogenes (group A streptococci), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae (group B) και Streptococcus faecalis (enterococci-group D). Το ποσοστό γουανίνης συν κυτοσίνη (G+C) ειναι 33-44%. Υβριδική ανάλυση ανάμεσα στους στρεπτοκόκκους (συμπεριλαμβανομένων και των πνευμονιόκοκκων) φανερώνουν στενή σχέση ανάμεσα σε όλα τα είδη. Μορφολογία: Οι στρεπτόκοκκοι είναι Gram θετικοι, συνήθως ακίνητοι κόκκοι που δημιουργούν αλυσίδες. Ορισμένοι βέβαια α-αιμολυτικοί στρεπτόκοκκοι (όπως οι πνευμονιόκοκκοι και οι στρεπτόκοκκοι της στοματικής κοιλότητας) υπάρχουν σε δυάδες ή σε σχετικά σε μικρές αλυσίδες. Σε αντίθεση η αιμολυτικοί στρεπτόκοκκοι δημιουργούν σχετικά μεγάλου μεγέθους αλυσίδες. 13

Εικόνα3: Είδη στρεπτοκόκκου: α:http://www.sciencephoto.com β:http://www.123rf.com γ:http://www.tumblr.com/tagged/streptococcus Κατά την ανάπτυξη τους σε αιματούχο υπόστρωμα διάφορα είδη στρεπτοκόκκων μπορούν να μεταβάλλουν την αιμογλομπίνη. Έτσι, η πλειονότητα των ειδών των στελεχών του S. faecalis δεν τροποποιούν την αιμογλομπίνη και δε δημιουργούν ζώνες γύρω από την αποικία. Οι περισσότεροι στρεπτοκόκκοι της στοματικής κοιλότητας και οι πνευμονιόκοκκοι που τροποποιούν την αιμογλομπίνη σε πράσινες χρωστικές, ορίζονται σαν α-αιμολυτικοί, ενώ ο S. pyogenes και ο S. agalactiae δημιουργούν διαυγείς ζώνες πραγματικής αιμόλυσης γύρω από τις αποικίες, φαινόμενο που ονομάζεται β-αιμόλυση. Τα χαρακτηριστικά αυτά βοηθούν πάρα πολύ στα αρχικά βήματα ταυτοποίησης των στρεπτοκόκκων, παρότι η τελική ταυτοποίηση εξαρτάται απο βιοχημικές και ορολογικές αναλύσεις. 14

Εικόνα 4: Τύποι αιμόλυσης Πηγή: http://drugline.org/medic/term/hemolysis/ Μεταβολισμός: Οι στρεπτόκοκοι είναι υποχρεωτικά αναερόβιοι, οξεόφιλοι μικροοργανισμοί. Η ανάπτυξή τους σε θρεπτικά υποστρώματα που δεν εμπεριέχουν αίμα ή παράγωγά του, είναι φτωχή, αλλά μπορεί να βοηθηθεί πολύ με την προσθήκη πρωτεϊνών του αίματος και αναγωγικών παραγόντων. Όλοι οι στρεπτοκόκκοι χρησιμοποιούν αναερόβια τις: γλυκόζη, μαλτόζη, λακτόζη και σουκρόζη. Το γένος είναι αρνητικό στην αντίδραση της καταλάσης. Τοξίνες: Η στρεπτοκοκικκή μόλυνση διευκολύνεται από εξωκυτταρικά προϊόντα. που παράγουν διάφορα είδη: Στρεπτολυσσίνες: Η πλειονότητα των στρεπτοκόκκων παράγει δυο διακριτές αιμολυσίνες, οι οποίες ονομάζονται στρεπτολυσσίνες Ο και S. Οι αιμολυτικές ζώνες γύρω από τις αποικίες του στρεπτοκόκκου σε αιματούχο υπόστρωμα, οφείλονται κυρίως στη στρεπτολυσσίνη S. Και οι δύο αιμολυσίνες είναι παθογονεις για τα κύτταρα των θηλαστικών και εμποδίζουν τη φαγοκυττάρωση. Η στρεπτολυσσίνη Ο είναι καρδιοτοξική. 15

Εικόνα 5: Εκτεταμένη στρεπτοκοκκική λοίμωξη Πηγή: http://wwwnc.cdc.gov/eid/article/12/6/05-1194-f4.htm Ερυθρογενής τοξίνη: Οι περισσότεροι στρεπτόκοκκοι της ομάδας A παράγουν τουλάχιστον μία απο τις τρεις διαφορετικές ερυθρογενείς τοξίνες. Προκαλούν πυρετό, εξάνθημα και καταστροφή μακροφάγων. Εικόνα 6: Στρεπτοκοκκικό εξάνθημα Πηγή: http://www.health-reply.com/streptococcal-toxic-shock-syndrome_3538/ Πρωτεϊνάση: Ένζυμο που προκαλεί νέκρωση στο μυοκάρδιο και στο σκελετικό μυ. Παράγοντες εξάπλωσης: Υπάρχει πληθώρα εξωκυτταρικών προιόντων των στρεπτοκόκκων που θεωρούνται παράγοντες εξάπλωσης γιατί βοηθούν την εξάπλωση του μικροοργανισμού στους ιστούς με το να διασπούν διάφορες ουσίες που συγκρατούν τα κύτταρα μεταξύ τους πχ υαλλουρομιδάση. 16

Streptococcus pneumoniae (pneumonococcus): Είδος στρεπτόκοκκου που δημιουργεί α-αιμολυτικές ζώνες σε αιματούχο υπόστρωμα και πολύ εύκολα αυτολύεται. Είναι υπεύθυνο για την πνευμονοκοκκική πνευμονία, σηψαιμία και μηνιγγίτιδα. Μορφολογία: Το κύτταρο είναι ωοειδές και συνήθως σε δυάδες, παρότι μπορεί να υπάρχουν και μικρές αλυσίδες σε εκκρίσεις ασθενών. Οι πνευμονιόκοκκοι αναπτύσσονται πολύ καλά σε θρεπτικά υποστρώματα που περιέχουν εκχυλίσματα κρέατος και έχουν εμπλουτιστεί με ορό ή αίμα. Στα υποστρώματα αυτά οι αποικίες του πνευμονιόκοκκου έχουν 1mm διάμετρο, είναι υπερυψωμένες, λείες και κυκλικές. Εξαίρεση αποτελεί ο τύπος 3 του πνευμονιόκοκκου που αναπτύσσεται σε μεγαλύτερες και βλεννώδεις αποικίες. Όταν συμβεί αυτόλυση το ύψος του κέντρου της αποικίας μειώνεται. Τα στελέχη περιβάλλονται από κάψα που αποτελείται από πολυσακχαρίτες που διαφέρουν τόσο ορολογικά, όσο και χημικά. Παθογένεση: Οι πολυσακχαρίτες της κάψας καθιστούν τον πνευμονιόκοκκο παθογενή, εμποδίζοντας τη φαγοκυττάρωση, τόσο στα πολυμορφοπύρηνα λεμφοκύτταρα, όσο και στα μακροφάγα. Η ύπαρξη των πολυσακχαριτών, οι οποίοι είναι ανθεκτικοί στη διάσπαση από τα ένζυμα του ξενιστή αποτελεί και το μόνο παθογενή παράγοντα του συγκεκριμένου μικροοργανισμού. Επιδημιολογία: Η μόλυνση με τον S. pneumoniae συμβαίνει μέσω σταγονιδίων που απελευθερώνονται από μολυσμένα άτομα. Το βακτήριο αναπτύσσεται μόνο στον άνθρωπο κι έτσι ο άνθρωπος είναι η μόνη δεξαμενή μόλυνσης. Είναι συχνό φαινόμενο η μετάδοση του βακτηρίου σε άτομα τις ίδιας οικογένειας αλλά και η ύπαρξη ασυπτωματικών φορέων, ιδιαίτερα σαν επακόλουθο ιογενών μολύνσεων της άνω αναπνευστικής οδού. 17

Εικόνα 7: Μηχανισμός φαγοκυττάρωσης Πηγή: http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud Εικόνα 8: Χρώση πολυσακχαρίτη του S. pneumoniae. Πηγή:http://www.redorbit.com Εικόνα 9: Συχνότητα μηνιγγίτιδας και ποσοστιαία αναλογία αιτιολογικού παράγοντα. Πηγή: http://www.scielosp.org 18

Εικόνα 10: Συχνότητα κρουσμάτων S. pneumoniae σε παιδιά κάτω των πέντε ετών. Πηγή: http://www.docstoc.com ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙV ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 4.1. ΣΤΟΧΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ Στόχος του πειράματος ήταν η εξέταση της αντιμικροβιακής δράσης των αιθέριων ελαίων των φυτών: σε έξη στελέχη του Streptococcus pneumoniae. Τα αιθέρια έλαια επελέγησαν, έτσι ώστε να είναι βιολογικά αποστάγματα για να μην υπάρχουν ενδοιασμοί ως προς τη δράση τους, ενώ οι αραιώσεις τους έγιναν σε αιθυλική αλκοόλη η οποία και εξετάστηκε ως προς την αντιμικροβιακή της δραστικότητα, ώστε να αποκλιστεί η περίπτωση η αντιμικροβιακή δράση να οφείλεται στον αραιωτικό παράγοντα που χρησιμοποιείται στο πείραμα. Επιπλέον, εξετάστηκαν ως προς την αντιμικροβιακή τους δράση και χημικές ενώσεις που αποτελούν επι μέρους συστατικά αιθέριων ελαίων και περιλαμβάνουν τις ουσίες. 19

4.2. ΑΙΘΕΡΙΑ ΕΛΑΙΑ Τα αιθέρια έλαια που εξετάστηκαν στην μελέτη αυτή είναι: σχίνος, κρίταμος, δενδρολίβανο, αρμπαρόριζα, δάφνη Κεφαλλονιάς-Λευκάδας-Ζακύνθου, μυρσίνη Κεφαλλονιάς-Λευκάδας-Ζακύνθου, λεβάντα, μάραθος, αγριοσέλινο, λυγαριά, θυμάρι. Όλα τα αιθέρια έλαια ήταν προϊόντα υδροαπόσταξης φυτών βιολογικής καλλιέργειας. Οι χημικές ενώσεις που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή είναι και αποτελούν υπερκάθαρες ενώσεις που χρησιμοποιούνται για standards στoν αέριο χρωματογράφο. 4.3. ΣΤΕΛΕΧΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Τα στελέχη των μικροοργανισμών που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια του πειράματος ήταν: Streptococcus pneumoniae 6303, S. pneumoniae 27336, S. pneumoniae 49619, S. pneumoniae 49150, S. pneumoniae 6305, S. pneumoniae 49136. Collection). Εικόνα 11: Βακτηριακά στελέχη της εταιρίας (American Type Culture 20

4.4. ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια του πειράματος για την ανάπτυξη των βακτηρίων ήταν το: Trypticase Soy agar (TSA), Difco, εμπλουτισμένο με 5% αίμα προβάτου. Το εμπειρικό αυτό υλικό είναι κατάλληλο για την άριστη ανάπτυξη των συγκεκριμένων μικροοργανισμών, και η χρήση του υποδεικνύεται από την, τόσο για την αναβίωση των καλλιεργειών της, όσο και για τις μετέπειτα ανακαλλιέργειες. 4.5. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΑΠΟ ΠΡΟΤΥΠΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Βακτηριακά στελέχη της εταιρείας (American Type Culture Collection) απλώθηκαν στο κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα κατά τις υποδείξεις της εταιρείας. Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 37 ο C για 48h σε γυάλα αναεροβίωσης με κερί και μετά ανακαλλιεργήθηκαν, ώστε να προκύψουν απομονωμένες αποικίες και να ελεγχθεί έτσι η καθαρότητα των στελεχών. Εικόνα 12: Βήματα ανάπτυξης στελεχών από πρότυπες καλλιέργειες. 21

4.6. ΕΞΕΤΑΣΗ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΑΓΚΙΝΑΡΑΣ ΚΑΙ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ Από το κάθε τρυβλίο βακτηριακών στελεχών πάρθηκε δείγμα και δημιουργήθηκε εναιώρημα σε πεπτόνη (0,9%) θολερότητας 3 McFarland. 2 ml του εναιωρήματος αναμίχθηκαν σε 18 ml soft agar (λυωμένο και σε θερμοκρασία 45 ο C) και τοποθετήθηκαν στην επιφάνεια του κατάλληλου θρεπτικού υποστρώματος (αιματούχο TSA). Εικόνα 13: Προσδιορισμός θολερότητας καλλιέργειας μικροοργανισμών. Το τρυβλίο αφέθηκε ώστε το άγαρ με το εναιώρημα μικροοργανισμών να στερεοποιηθεί για ~20 min και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν αποστειρωμένοι δίσκοι (διαμέτρου 0,7cm), άσεπτα. Στο κάθε δίσκο τοποθετήθηκε δείγμα 5 μl από αιθέριο έλαιο ή χημική ένωση και το τρυβλίο επωάστηκε στη κατάλληλη θερμοκρασία. 22

Εικόνα 14: Τοποθέτηση δίσκων και αιθέριου ελαίου στα τρυβλία. 4.7. ΚΑΤΑΜΕΤΡΗΣΗ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ Μετά την επώαση, το κάθε τρυβλίο φωτογραφήθηκε και μετρήθηκε η διάμετρος της ζώνης παρεμπόδισης της ανάπτυξης και καταγράφηκαν τα αποτελέσματα. Αν η διάμετρος αναστολής είναι <1.1 η αντιμικροβιακή δράση κρίνεται αμελητέα, αν είναι 1.0<διαμέτρου<2.0 τότε κρίνεται καλή και τέλος αν η διάμετρος είναι >2.0 η αντιμικροβιακή δράση κρίνεται πολύ καλή. Εικόνα 15: Ζώνη αναστολής της αύξησης λόγω της δράσης αιθέριων ελαίων με τα οποία είναι εμποτισμένοι οι δίσκοι διηθητικού χαρτιού. 23

4.8. MIC (Minimum Inhibitory Concentration) 250 μl από το κάθε στέλεχος μικροοργανισμού διανεμήθηκαν σε κάθε σειρά (12 βοθρύα) του τρυβλίου ELISA. Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν αιθέρια έλαια έτσι ώστε η τελική συγκέντωση του ελαίου να είναι 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 και 0.001% (v/v). Σαν MIC ορίστηκε η χαμηλότερη συγκέντρωση ελαίου που παρεμπόδιζε την ανάπτυξη θολερότητας. Εικόνα 16: Εμβολιασμός τρυβλίου ELISA ανάγνωσή του μετά την επώαση. 24

ΚΕΦΑΛΑΙΟ V ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5.1. ΚΑΤΑΜΕΤΡΗΣΗ ΖΩΝΗΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ Τα αποτελέσματα της αντιμικροβιακής δράσης των αιθέριων ελαίων αναγράφονται στον Πίνακα 1.1. και 1.2. Με βάση τα αποτελέσματα της εξέτασης των δίσκων (disc assay) τα αιθέρια έλαια των αρωματικών φυτών Pelargonium capitatum, Laurus nobilis (Ζακύνθου), Thymus vulgaris, Ocimum basilicum, Mentha spicata είχαν πολύ καλή αντιμικροβιακή δράση. Επιπλέον, τα αιθέρια έλαια των φυτών Laurus nobilis (Κεφαλονιάς), Laurus nobilis (Λευκάδας), Myrtus communis (Λευκάδας), Myrtus communis (Κεφαλονιάς), Myrtus communis (Ζακύνθου), Origanum majorana είχαν μέτρια αντιμικροβιακή δράση, ενώ τα αιθέρια έλαια των φυτών Pistacia lentiscus (φύλλα και καρπός), Crithmum maritimum (άνθος και καρπός), Crithmum maritimum (φύλλα), Rosmarinus officinalis (φύλλα), Lavandula angustifolia, Foeniculum vulgare, Smyrnium rotundifolium (φύλλα), Smyrnium rotundifolium (καρπός), Smyrnium rotundifolium (άνθη) και Vitex agnus-castus έδειξαν ελάχιστη έως μηδενική δράση. Τα αποτελέσματα της εξέτασης των δίσκων επιβεβαιώνονται από την εξέταση MIC, όπου παρατηρούμε ότι τα αιθέρια έλαια με την πολύ καλή αντιμικροβιασκή δράση (Pelargonium capitatum, Laurus nobilis (Ζακύνθου), Thymus vulgaris, Ocimum basilicum, Mentha spicata) είναι τα πιο δραστικά και κατά την εξέταση MIC. Επιπλέον, τα αιθέρια έλαια των Laurus nobilis (Κεφαλονιάς), Laurus nobilis (Λευκάδας), Myrtus communis (Λευκάδας), Myrtus communis (Κεφαλονιάς), Myrtus communis (Ζακύνθου), Origanum majorana είχαν μέτρια αντιμικροβιακή δράση κατά την εξέταση MIC, ακριβώς όπως παρατηρήθηκε και κατά το Disc assay. Τέλος, από τα φυτά που κατά την εξέταση των δίσκων είχαν ελάχιστη δράση, η εξέταση MIC έγινε μόνο για τα έλαια των φυτών Rosmarinus officinalis (φύλλα) και Pistacia lentiscus (φύλλα και καρπός), όπου και φαίνεται ότι και αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με αυτά του disc assay. 25

Πίνακας 1.1. Disc assay αιθέριων ελαίων Αιθέριο έλαιο(5μl/δίσκο) 6303 27336 Streptococcus pneumoniae 49619 49150 6305 49136 1 Pistacia lentiscus (leaves and fruit) 1.0 1.0 1.0 1.1 1.2 0.8 2 Crithmum maritimum(leaves) 1.1 1.1 0.8 0.9 1.2 1.0 3 Crithmum maritimum (flower & fruit) 0.9 0.9 0.8 0.8 1.0 1.0 4 Rosmarinus officinalis(leaves) 1.1 1.1 1.0 1.1 1.2 1.1 5 Pelargonium capitatum (leaves) 2.7 3.1 2.8 3.1 3.1 3.3 6 Laurus nobilis(kefalonia) 1.4 1.2 1.2 1.3 1.2 1.4 7 Laurus nobilis(leukas) 1.8 1.5 1.5 1.6 1.7 1.8 8 Laurus nobilis(zante) 2.7 2.6 2.7 2.5 3.0 2.6 9 Myrtus communis (Zante) 1.3 1.4 1.2 1.3 1.4 1.4 10 Myrtus communis(leukas) 1.7 1.9 1.6 1.5 1.6 1.5 11 Myrtus communis(kefalonia) 1.6 1.9 1.6 1.7 1.9 1.5 12 Lavandula angustifolia 1.0 1.3 1.1 1.4 1.2 1.3 13 Foeniculum vulgare 0.9 1.0 1.0 0.9 1.0 1.0 14 Smyrnium rotundifolium (leaves) 1.0 0.9 0.9 0.9 1.0 0.9 15 Smyrnium rotundifolium (fruit) 0.9 0.8 1.0 0.8 0.8 0.8 16 Smyrnium rotundifolium (flower) 0.9 0.9 1.1 0.8 0.8 1.0 17 Vitex agnus-castus 1.1 1.0 1.1 1.1 1.0 1.1 18 Thymus vulgaris 3.9 4.0 3.6 3.8 3.9 3.7 19 Ocimum basilicum 2.8 2.6 2.9 3.6 3.0 3.1 20 Origanum majorana 1.5 1.4 1.5 1.6 1.5 1.4 21 Mentha spicata 3.3 3.1 3.2 3.2 3.5 3.2 26

Πίνακας 1.2. MIC αιθέριων ελαίων Αιθέριο έλαιο(% v/v) ATC C 6303 Streptococcus pneumoniae ATC C 27336 ATC C 49619 ATC C 49150 ATC C 6305 ATC C 49136 Pistacia lentiscus Σκίνος (leaves and fruit) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Μέντα Mentha spicata 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 Ματζουράν α Origanum majorana 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Βασιλικός Ocimum basilicum 0.05 0.1 0.1 0.05 0.05 0.05 Θυμάρι Thymus vulgaris 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 Αρμπαρόριζ α Pelargonium capitatum (leaves) 0.05 0.1 0.05 0.05 0.05 0.05 Δενδρολίβα νο Rosmarinus officinalis (leaves) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Λεβάντα Lavandula angustifolia 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Δάφνη Λευκάδας Laurus nobilis (Leukas) 0.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Δάφνη Ζακύνθου Laurus nobilis (Zante) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 Δάφνη Κεφαλονιάς Laurus nobilis (Kefalonia) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Μυρσίνη Λευκάδας Myrtus communis (Leukas) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Μυρσίνη Ζακύνθου Myrtus communis (Zante) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Μυρσίνη Κεφαλονιάς Myrtus communis(kefalon ia) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Τα αποτελέσματα της αντιμικροβιακής δράσης των επι μέρους συστατικών των αιθέριων ελαίων της εξέτασης των δίσκων αναγράφονται στο Πίνακα 1.3. Όπως φαίνεται οι ενώσεις που εξετάστηκαν μπορούν να χωριστούν σε τρεις κατηγορίες βάσει της αντιμικροβιακής τους δράσης. Στη πρώτη κατηγορία εντάσσονται οι ενώσεις carvacrol και eugenol, οι οποίες παρουσιάζουν πολύ καλή αντιμικροβιακή δράση. Οι ενώσεις caryophyllene, terpinyl acetate, linalyl acetate, myrtenol, a- terpineol, (-) carveol έχουν μέτρια αντιμικροβιακή δράση και τέλος οι χημικές ουσίες 27

g-terpinene, p-cymene, (-) limonene, eucalyptol, a-pinene, (+) limonene που εντάσσονται στη τρίτη κατηγορία παρουσιάζουν μηδενική έως ελάχιστη αντιμικροβιακή δράση. Αντίστοιχα αποτελέσματα όπως φαίνεται στο Πίνακα 1.4. έδωσε και η εξέταση MIC. Οι ενώσεις carvacrol και eugenol έχουν την καλύτερη αντιμικροβιακή δράση αφού απαιτούνται 0.001 και 0.01% v/v αιθέροιυ ελαίου, ακολουθούν οι ενώσεις caryophyllene, terpinyl acetate, linalyl acetate, myrtenol, a-terpineol, (-) carveol με μέτρια αντιμικροβιακή δράση ενώ οι ενώσεις g-terpinene, p-cymene, (-) limonene, eucalyptol, a-pinene, (+) limonene παρουσιάζουν όπως και στην προηγούμενη εξέταση την μικρότερη δράση. Επιπλέον, τα αιθέρια έλαια των φυτών Laurus nobilis (Κεφαλονιάς), Laurus nobilis (Λευκάδας), Myrtus communis (Λευκάδας), Myrtus communis (Κεφαλονιάς), Myrtus communis (Ζακύνθου), Origanum majorana είχαν μέτρια αντιμικροβιακή δράση, ενώ τα αιθέρια έλαια των φυτών Pistacia lentiscus (φύλλα και καρπός), Crithmum maritimum (άνθος και καρπός), Crithmum maritimum (φύλλα), Rosmarinus officinalis (φύλλα), Lavandula angustifolia, Foeniculum vulgare, Smyrnium rotundifolium (φύλλα), Smyrnium rotundifolium (καρπός), Smyrnium rotundifolium (άνθη) και Vitex agnus-castus έδειξαν ελάχιστη έως μηδενική δράση. 28

Πίνακας 1.3. Disc assay επιμέρους συστατικών των αιθέριων ελαίων Disc Assay (5 μl/disc) Streptococcus pneumoniae strain Compound 49619 49150 6303 49136 27336 6305 1 Carvacrol 5.5 5.6 5.2 6.2 6.1 5.9 2 caryophyllene 1.2 1.4 1.6 1.6 1.5 1.4 3 g-terpinene 0.7 0.6 0.5 0.6 0.5 0.5 4 p-cymene 0 0 0 0 0 0 5 Eugenol 4.6 4.5 3.9 4.6 4.1 4.4 6 (-) limonene 1.1 1.1 1.0 0.9 1.1 1.0 7 terpinyl acetate 1.4 1.7 1.6 1.3 1.6 1.6 8 Eucalyptol 0 0 0 0 0 0 9 linalyl acetate 2.1 2.3 1.8 2.0 1.9 2.0 10 Myrtenol 2.9 3.1 3.0 3.2 3.3 3.3 11 a-pinene 0 0 0 0 0 0 12 (+) limonene 1.0 1.2 0.7 0.9 0.7 0.9 13 a-terpineol 2.0 1.9 2.2 2.2 2.2 2.1 14 (-) carveol 1.7 2.1 2.2 2.2 2.3 2.3 29

Πίνακας 1.4. MIC επιμέρους συστατικών των αιθέριων ελαίων MIC Streptococcus pneumoniae strain Compound (% v/v) 49619 49150 6303 49136 27336 6305 1 Carvacrol 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 2 Caryophyllene 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 3 g-terpinene 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 4 p-cymene >10 >10 >10 >10 >10 >10 5 Eugenol 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 6 (-) limonene 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 7 terpinyl acetate 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 8 Eucalyptol >10 >10 >10 >10 >10 >10 9 linalyl acetate 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 10 Myrtenol 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 11 a-pinene >10 >10 >10 >10 >10 >10 12 (+) limonene 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 13 a-terpineol 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 14 (-) carveol 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 30

ΚΕΦΑΛΑΙΟ VΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Βακτήρια υπεύθυνα για σοβαρές παθήσεις καθίστανται συνεχώς ανθεκτικά στα γνωστά αντιβιοτικά σκευάσματα. Το γεγονός αυτό είναι ένα από τα σοβαρότερα προβλήματα υγείας του 21 ου αιώνα. Αυτό έχει σαν επίπτωση την ανάγκη μακροχρόνιας και πιο ακριβής θεραπείας. Το πρόβλημα αρχικά, εντοπίζεται σε νοσοκομεία και σε ανασοκατεσταλμένους ασθενείς (Alanis, 2005). Σήμερα έχει επεκταθεί σε όλες τις κοινωνίες καθιστώντας τις βακτηριακές μολύνσεις επικίνδυνες και δύσκολες στη θεραπεία. Οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους τα βακτήρια γίνονται ανθεκτικά στα αντιβιοτικά είναι πολλοί και πολύπλοκοι. Τα βακτήρια έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα σε όλες τις ομάδες αντιβιοτικών που υπάρχουν. Η συνηθέστερη μέθοδος με την οποία γίνεται μεταφορά της πληροφορίας για την ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά είναι μέσω πλασμιδίου. Σχετικά πρόσφατα, νέοι μηχανισμοί αντίστασης στα αντιβιοτικά έχουν δημιουργήσει πλασμίδια υπεύθυνα για αντίσταση σε πολλά αντιβιοτικά που μεταφέρονται σε ένα πλασμίδιο (MDR-multi drug resistance). Βακτήρια που φέρουν αυτό το πλασμίδιο είναι γνωστα σαν «superbugs». Η αλόγιστη χρήση των αντιβιοτικών, τόσο στα νοσοκομεία, όσο και εκτός νοσοκομείων, αλλά και στη βιομηχανία τροφίμων και στην εκτροφή ζώων είναι ο κυριότερος παράγοντας της δραματικής αύξησης της βακτηριακής ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά. Επιπλέον, ο αριθμός των νέων αντιβιοτικών που αναπτύσσονται και εγκρίνονται έχει μειωθεί κατά πολύ τα τελευταία χρόνια. Φαρμακευτικές εταιρείες, μεγάλα ακαδημαϊκά ιδρύματα, αλλά και κυβερνήσεις δεν χρηματοδοτούν έρευνα ανάπτυξης νέων σκευασμάτων, ώστε να παραχθεί η επόμενη γενιά ασφαλών και δραστικών αντιμικροβιακών σκευασμάτων. Σε πολλές περιπτώσεις, μεγάλες φαρμακευτικές εταιρείες έχουν διακόψει τα ερευνητικά προγράμματα ανάπτυξης νέων σκευασμάτων για καθαρά οικονομικούς λόγους. Όλοι αυτοί οι λόγοι έχουν σαν αποτέλεσμα η κοινωνία στο σύνολό της να είναι σε κίνδυνο από την διάδοση των MDR βακτηριακών στελεχών. 31

Όπως φαίνεται στους προηγούμενους πίνακες τη καλύτερη αντιμικροβιακή δράση είχαν τα αιθέρια έλαια που προέρχονται από τα φυτά Pelargonium capitatum, Laurus nobilis (Ζακύνθου), Thymus vulgaris, Ocimum basilicum, Mentha spicata, ενώ από τις επιμέρους ενώσεις την καλύτερη δράση είχαν οι ενώσεις carvacrol και eugenol. Επιπλέον, όλα τα στελέχη είχαν παρόμοια ευαισθησία στο εκάστοτε έλαιο ή χημική ένωση. Η πολύ καλή αντιμικροβιακή δράση που παρουσιάζουν τα συγκεκριμένα έλαια έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον για το συγκεκριμένο βακτηριακό είδος. Το ενδιαφέρον έγκειται στο γεγονός ότι επειδή το συγκεκριμένο παθογόνο είναι αναπνευστικό, η ασθένεια θα μπορούσε να θεραπευθεί αναπνευστικά χωρίς να χρειάζεται θεραπεία συστεμική (από το στόμα). Τα συγκεκριμένα έλαια είναι ιδιαίτερα πτητικά και άρα είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν σαν spray. Τέλος, πρέπει να τονιστεί ότι είναι απαραίτητη η μελέτη της τοξικολογικής δράσης των αιθέριων ελαίων πριν μπορέσει να αποφανθεί κανείς για την πιθανότητα χρήσης τους ως αντιβιοτικά. 32

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Αlaerts G., Mattijs, Smeyers-Verbeke J., Vander Heyden Y., 2007. Chromatographic fingerprint development for herbal extracts: A screening and optimization methodology on monolithic columns J. of Chromatography A, 1172:1 Alanis A.J. 2005, Review article: Are we in the post-antibiotic era? Archives of Medical Research 36: 697 Aschwanden C., Bull., 2001. World Health Organ. 79: 691 Bajpai K. V, Kwang H. B, Kang S.C 2012, Control of Salmonella in foods by using essential oils. Food Research Intern. 45: 722 Bakkali F., Averbeck S., Averbeck D, Idaomar, 2008, Biological effects of essential oils-a review. Food and Chem. Toxicol. 46:446. Burt S. 2004. Review article: Their antibacterial properties and potential applications in foods. Intern. J. of Food Microbiol. 94: 223 Gutierrez J. Barry-Ryan C. Bourke P. 2008, The antimicrobial efficacy of plant essential oil combinations and interactions with food ingredients. Intern. Journal of Food Microbiol. 124: 91 Holley R.A. 2005 Review article: Improvement in shelf-life of perishable foods by plant essential oils and smoke antimicrobials. Food Microbiol. 22. p. 273 Lerner P.I. Producing penicillin. 2004. N. Engl. J. Med.:351:524 Levy S.B. From tragedy the antibiotic era is born. 2002. In: The Antibiotic Paradox: How the Misuse of Antibiotics Destroys Their Curative Powers, 2 nd ed. Cambridge, MA: Persus Publishing: pp. 1-14 Kaplan S.L. 2004. Review of antibiotic resistance, antibiotic treatment and prevention of pneumococcal pneumonia. Paediatric Respiratory Rev. 153-s158 33