MIKΡOBIAKH ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΟΤΑΝΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ MIKΡOBIAKH ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

2 ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ Θετικά κατά Gram βακτήρια: Η βιοτεχνολογική σημασία των ακτινοβακτηρίων Δρ. E. A. Κατσίφας ΜΕΤΕΠΤΥΧΙΑΚΟ

3 Η πρώτη δημοσιευμένη απεικόνιση ακτινομυκήτων από τον Ferdinand Cohn ( ) 1898). Απομονώθηκαν από δακρυϊκούς αδένες ανθρώπων και ονομάστηκαν Streptothrix foerster

4 Η κλάση Actinobacteria περιλαμβάνει πέντε υποκλάσεις με τη μεγαλύτερη να είναι εκείνη των Actinobacteriadae Η τάξη Actinomycetales (Buchanan 1917) περιλαμβάνει τους περισσότερους και βιοτεχνολογικά σημαντικότερους αντιπροσώπους και χωρίζεται σε 10 υποτάξεις Το 1997 προτάθηκε από τους Stackebrandt και συνεργάτες, η αλλαγή του ονόματος της κλάσης Actinomycetes σε Actinobacteria.

5 Η κλάση Actinobacteria : φυλογενετικές σχέσεις ανάμεσα σε τάξεις, υποτάξεις και οικογένειες βάσει στοιχείων ανάλυσης του 16S S rrna

6 Είναι θετικά κατά Gram, υψηλής περιεκτικότητας σε G+C, βακτήρια Λόγω των μορφολογικών και φυσιολογικών χαρακτηριστικών αποτελούν μια ομάδα διαχωρισμένη από τα υπόλοιπα βακτήρια τους καλά

7

8 Τα ακτινοβακτήρια δεν τοποθετούνται πια σε διαφορετικό βασίλειο από εκείνο των βακτηρίων Ο αριθμός των γενών έχει φτάσει τα 102

9 Φυλογενετικές σχέσεις ανάμεσα σε 90 γένη ακτινοβακτηρίων βάσει στοιχείων ανάλυσης του 16S rrna

10 Αποικίες ακτινοβακτηρίων σε τρυβλία με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα

11 Α Β Α. Streptomyces sp. B. Microbispora sp. Γ. Actinoplanes sp. Δ. Microtetraspora sp. Γ Δ Φωτογραφίες από φωτονικό μικροσκόπιο στελεχών ακτινοβακτηρίων

12 Α Β Α. Nocardia sp. B. Nocardiopsis dassonvillei Γ. Actinoplanes rectilineatus Δ. Planobispora rosea Ε. Actinomadura sp. ΣΤ. Spirillospora albida Γ Δ Ε ΣΤ

13 Nocardia farcinica Streptomyces noursei Streptomyces cattleya

14

15 Ο κύκλος ζωής των στρεπτομυκήτων σε στερεά θρεπτικά υποστρώματα.

16 ΔΥΝΑΜΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΜΙΚΡΟΚΟΣΜΟΥ - ΕΔΑΦΟΣΤΑΤΗΣ (Karagouni et al. 1993, Βιώνη (PhD) 1997, Κατσίφας (PhD) 1999, Vionis et al. 1997) Δείγμα ίσο με 10% του συνολικού όγκου του συστήματος Άμεση αντικατάσταση με ίση ποσότητα εδαφικού υποστρώματος Όγκος σταθερός Σχολαστική ανάδευση Ανακύκλωση - Εμπλουτισμός του εδαφικού υποστρώματος από 10% έως και 75% του συνολικού όγκου του συστήματος

17 7 6 5 log (β.μ.g-1) MSD (P<0.05) Χρόνος (Ημέρες) Επιβίωση του στελέχους S. albidoflavus ΑΜ41 σε συστήματα μικροκόσμου εδάφους σε τιμές θερμοκρασίας επώασης 22 C ( ), 28 C ( ), 32 C( ) και 35 C ( ). (Κατσίφας, PhD, 1999)

18 Παραδείγματα αναπαραγωγικών κατασκευών ακτινοβακτηρίων

19 Streptosporangium nondiaststicum Streptomyces plicatosporus Herbidospora cretacea

20 Αλυσίδες σπορίων στρεπτομυκήτων Streptomyces avermitilis

21 Αποικίες ακτινοβακτηρίων σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα. Actinoplanes sp. Actinomadura rugatopispora Dactylosporangium vinaceum

22 Streptomyces hygroscopicus Streptomyces hanamyceticus Streptomyces avermitilis Streptomyces sulfonofaciens

23

24 Mycobacterium bovis

25 Nocardia brasiliensis

26 Rhodococcus equi MCI-2132

27 Rhodococcus rhodochrous

28 Streptomyces albulus Streptomyces filipinensis

29 Σαπροφυτικοί κοσμοπολίτικοι οργανισμοί που απαντώνται κυρίως στο έδαφος σε μεγάλους πληθυσμούς Έχουν ικανότητα αποικοδόμησης μεγάλου αριθμού και ποικιλίας οργανικών υποστρωμάτων Εξαιρετικά σημαντικά στις ανοργανοποίησης του οργανικού υλικού διαδικασίες Παράγουν τα περισσότερα από τα αντιβιοτικά (~70%) που χρησιμοποιούνται στην Ιατρική

30 Ελάχιστα ακτινοβακτήρια άνθρωπο, τα ζώα ή τα φυτά. είναι παθογόνοι για τον Π.χ. η ακτινομυκητίαση αποτελεί μια σπάνια ασθένεια που εμφανίζεται κυρίως σε υποανάπτυκτες περιοχές του κόσμου

31 Παραδείγματα παθογόνων ακτινοβακτηρίων Actinomadura madurae, A. pelletieri Nocardia sp. Saccharompolyspora rectivirgula, Thermoactinomyces sp. Dermatophilus sp. Streptomyces scabies Rhodococcus fasciens

32 μετά την ανακάλυψη της στρεπτομυκίνης ένας μεγάλος αριθμός αντιβιοτικών έχει ανακαλυφθεί και απομονωθεί από είδη που ανήκουν κυρίως στα γένη Streptomyces, Streptoverticillium και Micromonospora είναι κυρίως αμινογλυκοσίδες, χλωραφαινικόλη, τετρακυκλινες, μακρολίδια και β-λακτάμες

33 Η δράση τους εκτός από αντιβακτηριακή είναι και αντιμυκητιακή, αντικαρκινική και αντιιική επίσης παράγουν και μια μεγάλη ποικιλία άλλων βιοενεργών ουσιών όπως για παράδειγμα ενζυμικούς αναστολείς

34 άλλα προϊόντα τους είναι τα στεροειδή, ισομεράση της γλυκόζης μετασχηματισμένα άλλοι μεταβολίτες των ακτινοβακτηρίων χρησιμοποιούνται ως εντομοκτόνα, παρασιτοκτόνα, ή αντικαρκινικοί παράγοντες ικανότητα αποικοδόμησης αρωματικών υδρογονανθράκων αλειφατικών και κάποια άλλα έχουν αντιμικροβιακή δράση αναμφίβολα παίζουν ρόλο στη διατήρηση βακτηριακού πληθυσμού σε ποικίλα περιβάλλοντα και του

35 Θεωρούνται σαν μια από τις κύριες πηγές νέων βιοενεργών ουσιών.

36 Το γένος Streptomyces Ένα δισεκατομμύριο χρόνια εξέλιξης χωρίζουν τους στρεπτομύκητες και τα συγγενή γένη ακτινοβακτηρίων από τις άλλες γνωστές ομάδες βακτηρίων. Το γένος Streptomyces παράγει περίπου το 80% όλων των γνωστών αντιβιοτικών που παράγονται από ακτινοβακτήρια συμπεριλαμβανομένων και αυτών που χρησιμοποιούνται στην ιατρική και στη γεωργία.

37 Στην εικόνα παρατηρείτε την παραγωγή του αντιβιοτικού ακτινοροδίνη που γίνεται ορατό υπό μορφή σταγονιδίων στην επιφάνεια αποικίας του S. coelicolor. Η ακτινοροδίνη είναι ένα από τα τέσσερα αντιβιοτικά που παράγει το είδος αυτό και αξίζει να αναφερθεί ότι η εκμετάλλευση του στελέχους αυτού αποφέρει ετησίως 6 δις δολάρια!!!.

38

39 Παραγωγή στρεπτομυκίνης από τον Streptomyces griseous M Η ελάττωση της συγκέντρωσης της γλυκόζης οδηγεί στην αύξηση της παραγωγής του αντιβιοτικού.

40 Τα γένη Streptomyces μετά τα γένη Bacillus είναι οι καλύτεροι παραγωγείς πρωτεασών. Ο S. limosus παράγει αμυλάση όταν στο θρεπτικό υπάρχει μαλτόζη και άμυλο. εμπειρικά θρεπτικά φύσεως, λόγω ποσότητας). χαμηλού (αγροτικά κόστους προϊόντα και αγνώστου διαθέσιμης η υδρόλυσή τους αργή αργός ο ρυθμός παραγωγής

41 Βιομηχανική παραγωγή αντιβιοτικών - ζυμώσεις στην παραγωγή των αντιβιοτικών είναι επιλογή ζύμωσης δύσκολη η υπόστρωμα αναλογίας C/N/P στο θρεπτικό υπόστρωμα οι ζυμώσεις γίνονται συνήθως κάτω από συνθήκες περιορισμένης συγκέντρωσης αζώτου ή φωσφόρου παροχή οξυγόνου στην καλλιέργεια (η συγκέντρωση του αερίου έχει σχέση με το ύψος του βιοαντιδραστήρα) τα ακτινοβακτήρια απαιτούν κατά την αύξησή τους Fe και Zn για την παραγωγή των αντιβιοτικών

42 Έως και το 1992 το χρωμόσωμα των στρεπτομυκήτων θεωρείτο κυκλικό, Το 1993 αναφέρεται από τους Lin και συνεργάτες ότι το χρωμοσωμικό DNA του στελέχους S. lividans 66 είναι γραμμικό, ενώ παράλληλα πραγματοποιείται η χαρτογράφηση του από τους Leblond και συνεργάτες. Έκτοτε γραμμικά χρωμοσώματα έχουν παρατηρηθεί σε πολλά είδη στρεπτομυκήτων (S. griseus 2247, S. lividans ZX7, S. coelicolor M130). Αποτέλεσμα : η γραμμικότητα του χρωμοσώματος θεωρείται γενική ιδιότητα των στρεπτομυκήτων (Chen και συνεργάτες,, 1994)

43 Το χρωμοσωμικό DNA των στρεπτομυκήτων είναι ασυνήθιστα μεγάλο για βακτήριο,, (περίπου( 6-9 Mb) σε σύγκριση με αυτό άλλων βακτηρίων όπως η E. coli και Β. subtilis (περίπου 4 Μb) και υψηλής περιεκτικότητας σε G+C (~72%). S. coelicolor γονίδια

44

45 γενετική αστάθεια - μεγάλη ικανότητα προσαρμογής μεταφορά γενετικού υλικού ανάμεσα σε διαφορετικά είδη, γένη ή και κλάσεις διεθνή ερευνητικά προγράμματα για την μελέτη των γονιδίων ανθεκτικότητας, μεταφοράς γενετικού υλικού και ανίχνευσης και απομόνωσης νέων στελεχών και μεταβολιτών

46 Ακραία περιβάλλοντα

47 Στρεπτομύκητες από ακραία περιβάλλοντα με ικανότητα αποικοδόμησης πετρελαϊκών υδρογονανθράκων από 44% έως 75% Στέλεχος Αριθμός ατόμων άνθρακα C26 C28 C30 C32 C34 O N A R N H % αποικοδόμηση αλειφατικών υδρογονανθράκων σε υγρές καλλιέργει ργειεςες (με GC-MS ανάλυση)

48

49 Το γονίδιο trpb ως δείκτης εκτίμησης της ποικιλότητας των ακτινοβακτηρίων σε Ελληνικά ενδιαιτήματα trpb σε στελέχη αναφοράς DGGE με trpb σε στελέχη αναφοράς Σχεδιασμός μορίων εκκινητών για την ενίσχυση μιας περιοχής 500 βάσεων του γονιδίου trpb των ακτινοβακτηρίων

50 Το γονίδιο trpb ως δείκτης εκτίμησης της ποικιλότητας των ακτινοβακτηρίων σε Ελληνικά ενδιαιτήματα A: σε cdna, 16S rrna B: σε cdna, trpb Olea europa 2. Μαραθώνας 3. Δάσος κωνοφόρων 4. Καισαριανή Α : ενίσχυση της περιοχής 16S rrna των ακτινοβακτηρίων, Β : ενίσχυση της περιοχής trpb των ακτινοβακτηρίων

51 Παραγωγή βιοενεργών ενώσεων oυσίες με βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον Streptomyces exfoliatus (ριζόσφαιρα Ebenus sipthorpii)

52 mau 120 A-Komponenten B mau B-Komponenten mau DAD1 A, Sig=210 DAD1 B, Sig=230 DAD1 C, Sig=260 DAD1 D, Sig=280 DAD1 E, Sig=310 DAD1 F, Sig=360 DAD1 G, Sig=435 DAD1 H, Sig=500 B A 1 nm B 4 mau 1200 C-Komponente nm 100 A Prof. Dr. Hans Peter Fiedler B 1 C nm min HPLC-DAD ανάλυση

53