ΝΕΕΣ MΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΝΕΕΣ MΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ"

Ἀδράστεια Στεφανόπουλος
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 ΝΕΕΣ MΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΒΑΝΤΑΡΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ (M.Sc, Ph.D)

2 Επιδημίες μολυσματικών ασθενειών συχνά οφείλονται σε έκθεση σε μία κοινή πηγή ενός αιτιολογικού παράγοντα. Κατά την επιδημιολογική μελέτη, οι μικροοργανισμοί που εμπλέκονται συνήθως σε μία επιδημία σχετίζονται δηλαδή έχουν κοινή προέλευση. Μία σημαντική διαδικασία για την επιδημιολογική μελέτη είναι η τυποποίηση των μικροοργανισμών που είναι υπεύθυνοι για την πρόκληση της επιδημίας. Όλες οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την τυποποίηση των μικροβίων πρέπει να πληρούν συγκεκριμένους όρους: Όλοι οι οργανισμοί που ανήκουν σε ένα είδος θα πρέπει να τυποποιούνται με τη μέθοδο αυτή (10-15% των M. avium δεν τυποποιούνται με τεχνικές που χρησιμοποιούν ορολογικούς markers, Επίσης η τυποποίηση με βακτηριοφάγους δεν μπορεί να εφαρμοστεί στη περίπτωση του S. aureus που δεν έχει τον υποδοχέα βακτηριοφάγου) Κάθε μέθοδο τυποποίησης πρέπει να έχει συγκεκριμένη διακριτική ικανότητα. Πρέπει να μπορεί να διακρίνει μη συγγενικά στελέχη και την ίδια στιγμή να διακρίνει την σχέση όλων των οργανισμών που έχουν απομονωθεί από άτομα που έχουν μολυνθεί από την ίδια πηγή Πρέπει επίσης να έχει αναπαραγωγιμότητα. PULSE FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) Η καλύτερη μέθοδος για την βιοχημική και μοριακή τυποποίηση βακτηρίων. 1. Καλλιέργεια των βακτηρίων σε υγρό ή στερεό θρεπτικό υλικό μαζί με αγαρόζη 2. Ενζυμική λύση του βακτηρίου μέσα στην αγαρόζη 3. Πέψη με ένζυμα περιορισμού που δεν κόβουν συχνά στο βακτήριο

3 4. Ηλεκτροφόρηση σε μία συσκευή σε μεταβλητό πεδίο τάσεων 5. Τα τμήματα DNA που ενισχύθηκαν διαφέρουν και κυμαίνονται από kb. 6. Ανάλυση του ηλεκτροφορητικού προτύπου με ειδικά στατιστικά πακέτα 7. Για την μελέτη των προτύπων της PFGE κάποιοι κανόνες πρέπει να τηρούνται. Ο Tenover και οι συνεργάτες του (1995) έχουν προτείνει ορισμένους βασικούς κανόνες για την τυποποίηση των βακτηρίων Βακτήρια που δείχνουν το ίδιο ηλεκτροφορητικό πρότυπο θεωρούνται ίδια στελέχη Βακτήρια που διαφέρουν από μία έως τρεις ζώνες θεωρούνται αρκετά συγγενικά Βακτήρια που διαφέρουν από 4-6 ζώνες είναι πιθανόν συγγενικά Βακτήρια που διαφέρουν πάνω από 6 ζώνες θεωρούνται άσχετα. 8. Η PFGE έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορα βακτήρια όπως: E.coli, Acetinobacter, Pseudomonas Aeruginosa, M. avium, S. aureus, Ανθεκτικούς στην Vancomycin εντερόκοκκους. 9. Μειονέκτημα της τεχνικής είναι ότι χρειάζεται 2-3 ημέρες για να ολοκληρωθεί και να πάρουμε έγκυρα αποτελέσματα. Southern blotting και RFLP τεχνικές Η μέθοδος χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ενός συγκεκριμένου γονιδίου στα βακτήρια. Η μέθοδος βασίζεται στις διαφορές βακτηριακών στελεχών με βάση την παρατήρηση ότι οι περιοχές που κόβουν ορισμένα ένζυμα περιορισμού εμφανίζουν μεγάλη ποικιλομορφία. 1. Πέψη του DNA των βακτηρίων με ένα ένζυμο περιορισμού

4 3. Μεταφορά των τμημάτων του DNA σε μεμβράνη κυτταρίνης ή nylon με Southern blotting 4. Υβριδισμός της μεμβράνης με ανιχνευτές που ανιχνεύουν το γονίδιο που μας ενδιαφέρει 5. Οι ανιχνευτές έχουν ενωθεί με διάφορες χρωμογόνες ή φθορίζουσες ουσίες Έχουν χρησιμοποιηθεί για την τυποποίηση Brucella, Legionella, Pseudomonas aeruginosa, Ribotyping Εφαρμογή της προηγούμενης τεχνικής αλλά οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται προέρχονται από τα γονίδια 16S και 23S rrna. Η μέθοδος έχει εφαρμοσθεί επιτυχημένα για την διαφοροποίηση βακτηριακών στελεχών. Η τεχνική αυτή καταλήγει σε μικρό αριθμό ζωνών που απλοποιεί την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Επίσης πολλές διαφορετικές γενετικές θέσεις (ή γονίδια) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την τυποποίηση βακτηρίων. PCR - locus specific RFLP 1. Ενίσχυση με PCR ενός συγκεκριμένου γονιδίου 2. Πέψη με ένζυμα περιορισμού του προϊόντος της PCR 3. Ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη 4. Χρώση του gel 5. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Έχει χρησιμοποιηθεί για την τυποποίηση του Helicobacter pylori (Διαφορές στο γονίδιο urec), M. tuberculosis (ανίχνευση μεταλλάξεων

5 στο katg που αντιστοιχούν σε διαφορετικά επίπεδα ανθεκτικότητας στην ισονιαζίδη). Μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι μόνο περιορισμένο τμήμα του γονιδιώματος μπορεί να μελετηθεί. Η τεχνική αυτή δίνει χειρότερα αποτελέσματα από την PFGE και τις βιοχημικές τεχνικές RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA 1. PCR ενίσχυση με ένα μόνο εκκινητή 3. Χρώση 4. Ερμηνεία αποτελεσμάτων Με την τεχνική αυτή έχουν ταυτοποιηθεί τα στελέχη C. albicans, P. mirabilis, L. pneumophila, Haemophilus RAPD έχει μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα από την RFLP ανάλυση ή την ανάλυση των 16S RNA γονιδίων αλλά μικρότερη διακριτική ικανότητα από την Rep-PCR. Μειονέκτημα είναι η έλλειψη αναπαραγωγιμότητας και προτυποποίησης REP-PCR 1. PCR ενίσχυση με REP ή ERIC εκκινητές για περιοχές repetitive του DNA των βακτηρίων 3. Ερμηνεία Οι επαναλήψιμες περιοχές έχουν περιγραφεί για διάφορα εντερικά βακτήρια. Οι REP περιοχές είναι αλληλουχίες 38bp. Επίσης, οι εντεροβακτηριακές επαναλήψιμες εσωγονιδιακές αλληλουχίες (ERIC) μήκους 126bp έχουν χρησιμοποιηθεί για την E.coli και την Salmonella.

6 Είναι από τις πιο ευρέα χρησιμοποιημένες τεχνικές τελευταία. Έχει χρησιμοποιηθεί για την τυποποίηση στελεχών όπως Citrobacter, Enterobacter, Burkholderia cepacia, L. pneumophila. Είναι εύκολη και γρήγορη τεχνική. Έχει μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα από τη μελέτη του πλασμιδιακού profile. Έχει ευρεία εφαρμογή σε πολλά είδη. Είναι καλύτερη από άλλες τεχνικές όπως οι βιοχημικές, η μελέτη ριβοτύπου. Επίσης δείχνει πολύ καλά και συγκρίσιμα αποτελέσματα με την PFGE αν και έχει ελαφρά λιγότερη διακριτική ευχέρεια. Cleavage Fragment Length Polymorhism. 1. Ενίσχυση με PCR 2. Πέψη με εξωνουκλεάση 3. Καθαρισμός στήλης 4. Πέψη με ένζυμο αποκοπής (cleavase) 5. Ηλεκτροφόρηση 6. Μεταφορά σε μεμβράνη 7. Έκθεση σε χημειοφθορισμό 8. Ερμηνεία Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) 1. Πέψη με ένζυμα περιορισμού (EcoRI και MseI) 2. Σύνδεση με linkers (που περιέχουν μία θέση περιορισμού και μία ομόλογη αλληλουχία σε μία θέση που ενώνεται ο εκκινητής) 3. Επιλεκτική PCR (αν έχουμε πέψει με EcoRI τότε χρησιμοποιούνται εκκινητές που ενώνονται π.χ μόνο σε τμήματα GAATTCAA). Ο ένας από τους δύο εκκινητές μπορεί να περιέχει ένα ραδιενεργό ή ένα φθορίζον τμήμα. 4. Ηλεκτροφόρηση σε Automated Sequencer

7 5. Ερμηνεία Δύο τύποι AFLP χρησιμοποιούνται : 1) Προϋποθέτει τη χρήση δύο ενζύμων και δύο εκκινητών για την ενίσχυση και 2) Προϋποθέτει τη χρήση ενός ενζύμου και ενός εκκινητή H μέθοδος είναι αναπαραγώγιμη, και έχει καλή διακριτική ικανότητα. Η διακριτική της ικανότητα είναι μεγαλύτερη από της μεθόδου με το ριβότυπο αλλά δεν έχει συγκριθεί ακόμα με την PFGE ή την Rep-PCR. H μέθοδος αυτή είναι πιο κουραστική από την Rep-PCR αλλά και τα αποτελέσματα λαμβάνονται πιο εύκολα από ότι με την PFGE. DNA Sequencing 1. PCR ενίσχυση αλληλουχιών που ενδιαφέρουν 3. Ανάλυση με computer 4. Ερμηνεία αποτελεσμάτων Μειονεκτήματα: α) Μπορεί να αναλυθεί αλληλουχία μικρού τμήματος του χρωμοσώματος β) Το τμήμα του DNA πρέπει να αποτελείται από μια ποικίλη περιοχή που περιβάλλεται από υψηλά συντηρημένες περιοχές γ) Η ποικιλότητα ανάμεσα μέσα την επιλεγμένη αλληλουχία πρέπει να είναι επαρκής για να μπορούν να διαφοροποιηθούν τα διαφορετικά στελέχη συγκεκριμένου είδους.

Σχετικά έγγραφα

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΦΥΤΩΝ

ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΦΥΤΩΝ Μοριακοί Δείκτες Επιμέλεια διαφανειών Τραντάς Μάνος 1 Μοριακοί Δείκτες είναι αλληλουχίες DNA (ή πρωτεϊνών) που μπορούν να συσχετιστούν με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά ώστε να ανιχνευτούν