ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΟΜΕΑΣ IV: Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών Εργαστήριο Χημείας & Τεχνολογίας Τροφίμων ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Παραλαβή φυσικών αντιοξειδωτικών από δενδρολίβανο και εφαρμογή τους σε διεργασίες τηγανίσματος ΣΤΡΙΛΙΓΚΑ ΜΑΡΙΑ Επιβλέπουσα καθηγήτρια: ΩΡΑΙΟΠΟΥΛΟΥ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΑΘΗΝΑ 2018

2 1

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων της Σχολής Χηµικών Μηχανικών του E.M.Π. Η ανάθεση και επίβλεψη του θέματος έγινε από την καθηγήτρια κα Ωραιοπούλου Βασιλική την οποία θα ήθελα να ευχαριστήσω για τις πολύτιμες συμβουλές της και την συνεχή καθοδήγηση καθ όλη τη διάρκεια της διπλωματικής εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον διδάκτορα κ. Τσιμογιάννη Δημήτρη για την απεριόριστη υποστήριξη και την άριστη συνεργασία μας. Η συμβολή του ήταν καθοριστική για την πετυχημένη ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας. Δεν θα μπορούσα να παραλείψω να ευχαριστήσω την Ελένη Γώγου για την συνεργασία μας, τις χρήσιμες συμβουλές της και την προθυμία της να με βοηθήσει σε όλα τα στάδια εκπόνησης της εργασίας. Θα ήθελα ακόμη να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όλα τα μέλη του εργαστηρίου Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων για το φιλικό περιβάλλον και την βοήθειά τους όσες φορές τη χρειάστηκα. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου και τα προσφιλή μου άτομα για την συμπαράσταση και την ηθική υποστήριξη καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. 2

4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η παραγωγή εκχυλίσματος δενδρολίβανου, πλούσιου σε αντιοξειδωτικά συστατικά για χρήση στο τηγάνισμα. Η πειραματική διαδικασία χωρίστηκε σε δύο μέρη: Στο πρώτο μέρος πραγματοποιήθηκαν εναλλακτικές διεργασίες ανάκτησης των αντιοξειδωτικών ουσιών από ξηρά φύλλα φρέσκου δενδρολίβανου και δενδρολίβανο του εμπορίου. Μελετήθηκε η ανάκτηση των δραστικών ουσιών του δενδρολίβανου με εκχύλιση με ακετόνη σε συνδυασμό με δύο εναλλακτικές προσεγγίσεις για την απομάκρυνση των ελαιωδών συστατικών. Στην πρώτη προσέγγιση, μετά την εκχύλιση με ακετόνη και την απομάκρυνση του διαλύτη, πραγματοποιήθηκε κατεργασία του ξηρού εκχυλίσματος με εξάνιο, ενώ στη δεύτερη προσέγγιση το δενδρολίβανο υποβλήθηκε αρχικά σε υδρο-ατμοαπόσταξη και στη συνέχεια εκχυλίστηκε με ακετόνη. Εξετάστηκε επίσης η απομάκρυνση των υδατοδιαλυτών συστατικών της φυτόμαζας που είχε υποβληθεί σε υδρο-ατμοαπόσταξη με κατεργασία με νερό πριν την εκχύλιση με ακετόνη. Επιπλέον, διερευνήθηκε η εκχύλιση του δενδρολίβανου με υδατικό διάλυμα KOH. Σε κάθε περίπτωση τα διαφορετικά εκχυλίσματα που προέκυψαν συγκρίθηκαν ως προς την περιεκτικότητα των ολικών φαινολικών διτερπενίων (TPD), η οποία προσδιορίστηκε με τη μέθοδο HPLC-DAD και ως προς την ικανότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών (EC50), που προσδιορίστηκε με τη μέθοδο DPPH. Στη συνέχεια, ενσωματώθηκαν σε φοινικέλαιο το οποίο υπέστη δοκιμή οξείδωσης στους 180 C για 24 h προκειμένου να μελετηθεί η αντιοξειδωτική τους δράση σε συνθήκες που προσομοιάζουν το τηγάνισμα. Ως δείκτης της πορείας οξείδωσης χρησιμοποιήθηκε ο αριθμός π-ανισιδίνης (p-av), ο οποίος δεν έδειξε σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις τιμές του καθαρού και του εμπλουτισμένου με εκχύλισμα ελαίου. Για τη συνέχεια της πειραματικής διαδικασίας, επιλέχθηκε το ακετονικό εκχύλισμα απελαιωμένου και κατεργασμένου με νερό φρέσκου δενδρολίβανου, με TPD= ppm εκφρασμένα ως καρνοσικό οξύ και EC50= 457 gextr/kgdpph. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε πείραμα οξείδωσης φοινικέλαιου με και χωρίς προσθήκη του επιλεγμένου εκχυλίσματος στους 180 C για χρονικό διάστημα μέχρι 8 h και στη συνέχεια αποθήκευση των δειγμάτων στους 70 C. Μέσω προσδιορισμού του αριθμού υπεροξειδίων (PV), διαπιστώθηκε ότι η αύξηση του χρόνου οξείδωσης στους 180 C είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της περιόδου επώασης του εμπλουτισμένου ελαίου, τη μείωση της προστασίας που παρείχε το αντιοξειδωτικό στο έλαιο έναντι της οξείδωσης μετά το πέρας της περιόδου επώασης καθώς επίσης και τη μείωση της % επιμήκυνσης του χρόνου ζωής του ελαίου. Στο δεύτερο μέρος της πειραματικής διαδικασίας χρησιμοποιήθηκε το επιλεχθέν εκχύλισμα σε πείραμα τηγανίσματος σε εργαστηριακή φριτέζα με χρήση φοινικέλαιου και φετών νωπής πατάτας. Πραγματοποιήθηκαν δύο σειρές τηγανισμάτων σε καθαρό έλαιο και σε έλαιο με 3

5 πρόσθετο εκχύλισμα δενδρολίβανου. Διαπιστώθηκε σημαντική μείωση του ρυθμού οξείδωσης του τηγανιζόμενου ελαίου κατά 66 % με βάση την αύξηση του αριθμού π- ανισιδίνης. Τα chips που παρήχθησαν συσκευάστηκαν σε πολυστρωματικό υλικό υπό ατμόσφαιρα αζώτου και παρακολουθήθηκε η πορεία οξείδωσής τους μέσω του αριθμού υπεροξειδίων. Δεδομένου ότι το έλαιο που απορρόφησαν τα chips περιείχε αντιοξειδωτικό διερευνήθηκε εάν το αντιοξειδωτικό περιορίζει το ρυθμό οξείδωσης και κατά την αποθήκευση του προϊόντος. Έπειτα από 17 εβδομάδες αποθήκευσης των συσκευασμένων chips διαπιστώθηκε περιορισμός του ρυθμού οξείδωσης του ελαίου κατά 60 % και επιμήκυνση της διάρκειας ζωής του προϊόντος κατά 46 %. 4

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΛΙΠΩΝ ΚΑΙ ΕΛΑΙΩΝ Λιπίδια και λιπαρά οξέα Οξείδωση λιπιδίων Αυτοξείδωση Φωτοξείδωση Ενζυμικά καταλυόμενη οξείδωση Παράγοντες που επηρεάζουν τον ρυθμό οξείδωσης των λιπιδίων Οξείδωση ελαίων κατά το τηγάνισμα των τροφίμων Μέθοδοι εκτίμησης οξείδωσης λιπιδίων Μέθοδοι προσδιορισμού πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης Μέθοδοι προσδιορισμού δευτερογενών προϊόντων οξείδωσης...25 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ Πρόσθετα τροφίμων και νομοθεσία Αντιοξειδωτικά ως πρόσθετα τροφίμων Γενικά Κατηγορίες αντιοξειδωτικών Χρήση αντιοξειδωτικών στο τηγάνισμα Δενδρολίβανο Δραστικές ενώσεις δενδρολίβανου Αντιοξειδωτική δράση εκχυλισμάτων δενδρολίβανου Νομοθεσία εκχυλισμάτων δενδρολίβανου.42 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σχεδιασμός πειραμάτων Υλικά και συσκευές Πρώτες ύλες Αντιδραστήρια- Διαλύτες Όργανα-Συσκευές Πειραματικές τεχνικές Ανάκτηση δραστικών ουσιών δενδρολίβανου Εκχύλιση με ακετόνη και απομάκρυνση αιθέριου ελαίου από το εκχύλισμα Υδρο-ατμοαπόσταξη και εκχύλιση με ακετόνη Εκχύλιση με υδατικό διάλυμα ΚΟΗ.51 5

7 3.3.2 Χαρακτηρισμός εκχυλισμάτων και μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης σε φοινικέλαιο Χαρακτηρισμός εκχυλισμάτων Ενσωμάτωση αντιοξειδωτικών εκχυλισμάτων σε φοινικέλαιο Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής δράσης σε φοινικέλαιο Δοκιμή πρόρρησης της αντιοξειδωτικής δράσης στο τηγάνισμα του επιλεγμένου εκχυλίσματος Τηγάνισμα chips Συσκευασία chips και αποθήκευση Παραλαβή ελαίου από chips Αναλυτικές μέθοδοι Μέθοδος μέτρησης αριθμού υπεροξειδίων (PV) Μέθοδος μέτρησης αριθμού π-ανισιδίνης (p-av) Μέθοδος μέτρησης αριθμού συζυγών διενίων Ποσοτικός προσδιορισμός φαινολικών διτερπενίων με HPLC-DAD Προσδιορισμός ικανότητας δέσμευσης ελευθέρων ριζών με DPPH Προσδιορισμός σύστασης αέρα της συσκευασίας των chips 60 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ- ΣΥΖΗΤΗΣΗ Παραλαβή αιθέριου ελαίου με υδρο-ατμοαπόσταξη Απόδοση και χαρακτηρισμός εκχυλισμάτων Καμπύλες αναφοράς και προσδιορισμός ικανότητας δέσμευσης ελευθέρων ριζών Σύγκριση των εκχυλισμάτων ως προς την απόδοση, αντιριζική ικανότητα και περιεκτικότητα σε φαινολικά διτερπένια Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής δράσης σε φοινικέλαιο Αριθμός π-ανισιδίνης (p-av) Αριθμός υπεροξειδίων (PV) και συντελεστής Κ Προσομοίωση αντιοξειδωτικής δράσης του επιλεγμένου εκχυλίσματος (Α5) σε προϊόντα τηγανίσματος Τηγάνισμα chips Μεταβολή αριθμού π-ανισιδίνης κατά τη διάρκεια του τηγανίσματος Μεταβολή αριθμού υπεροξειδίων τηγανισμένων chips ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ- ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ..81 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6: ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ..83 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι. 91 6

8 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ανάγκη της εξασφάλισης και διατήρησης των τροφίμων για μεγάλο χρονικό διάστημα αποτελεί ένα πολύ σημαντικό θέμα για τις σύγχρονες βιομηχανίες τροφίμων. Οι αλλοιώσεις που υφίστανται τα τρόφιμα υπό την επίδραση παραγόντων όπως θερμοκρασία, υγρασία, καταλύτες, φως, ένζυμα, μειώνουν την εμπορική τους αξία και οδηγούν στην υποβάθμισή τους. Ειδικότερα στα τρόφιμα με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά, η υποβάθμιση (ή αλλιώς ταγγισμός ) οφείλεται κυρίως στην οξείδωση των λιπαρών σωμάτων από το οξυγόνο του αέρα και έχει ως αποτέλεσμα ανεπιθύμητες μεταβολές στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τροφίμου. Επιπρόσθετα, η θέρμανση των ελαίων σε υψηλές θερμοκρασίες, όπως κατά το τηγάνισμα, προκαλεί οξειδώσεις αλλά και μεγαλύτερες μεταβολές στα έλαια, όπως πολυμερισμούς, κυκλοποιήσεις κτλ. Σε συνθήκες υψηλής θερμοκρασίας είναι πιθανό να παραχθούν trans λιπαρά τα οποία είναι επικίνδυνα για την υγεία. Μία από τις αποτελεσματικότερες μεθόδους για την αποτροπή της οξείδωσης των λιπών και ελαίων είναι η χρήση πρόσθετων ουσιών που χαρακτηρίζονται ως αντιοξειδωτικά. Πρόκειται για φυσικές ή συνθετικές ουσίες που όταν αναμιγνύονται καλά με το λίπος ή το έλαιο, έχουν την ικανότητα να παρεμποδίζουν τη συνέχιση της αλυσιδωτής αντίδρασης αυτοξείδωσης, όπου εμφανίζεται ο ταγγισμός, δηλαδή η ανάπτυξη δυσάρεστων γεύσεων και οσμών λόγω διάσπασης των προϊόντων οξείδωσης. Έτσι, τα επεξεργασμένα τρόφιμα διατηρούν τη γεύση και το χρώμα τους και παραμένουν κατάλληλα για κατανάλωση για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Τα συνήθως χρησιμοποιούμενα αντιοξειδωτικά είναι οι τοκοφερόλες, η βιταμίνη C, ο γαλλικός προπυλεστέρας (PG), η βουτυλιωμένη υδροξυανισόλη (BHA), η βουτυλιωμένη υδροξυτολουόλη (BHT), η τριτοταγής βουτυλ-υδροκινόνη (TBHQ). Τα τελευταία χρόνια υπάρχει τάση για χρήση φυσικών αντιοξειδωτικών ουσιών που προέρχονται από φυτικές πρώτες ύλες, καθώς πέρα από την προστατευτική τους δράση έναντι της οξείδωσης των λιπαρών έχουν και ευεργετικές ιδιότητες για τον ανθρώπινο οργανισμό. Μια σημαντική πηγή φυσικών αντιοξειδωτικών ουσιών αποτελούν τα αρωματικά φυτά, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως στη Μεσογειακή Διατροφή. Ειδικά στην Ελλάδα, όπου το κλίμα και το έδαφος είναι από τα πλέον κατάλληλα της Μεσογείου, η καλλιέργεια των αρωματικών φυτών ευνοείται ιδιαίτερα. Από τις οικογένειες των αρωματικών φυτών, ενδιαφέρον παρουσιάζει αυτή των Χειλανθών (Lamiaceae), καθώς τα είδη της έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε αντιοξειδωτικές ουσίες. Σήμερα το μόνο θεσμοθετημένο φυσικό αντιοξειδωτικό για τρόφιμα προέρχεται από το δενδρολίβανο (Rosmarinus officinalis), που είναι μέλος της Lamiaceae. Το αντιοξειδωτικό δενδρολίβανου φέρει κωδικό Ε392 και μόλις το 2008 η EFSA (European Food Safety Authority) γνωμοδότησε θετικά για την ασφάλεια των εκχυλισμάτων δενδρολίβανου ως αντιοξειδωτικών και όρισε τις χρήσεις 8

10 του. Επιπλέον όρισε τα επίπεδα προσθήκης, τα οποία καθορίζονται με βάση τη συγκέντρωση των φαινολικών διτερπενίων (καρνοσόλης και καρνοσικού οξέος) που θεωρούνται ως οι δραστικές ουσίες. Από τότε μέχρι σήμερα η χρήση του Ε392 λαμβάνει διαρκώς εγκρίσεις για νέες εφαρμογές σε απλά και σύνθετα τρόφιμα, γεγονός που καταδεικνύει το ενδιαφέρον που υπάρχει για τη χρήση του. Η παραγωγή του διέπεται από συγκεκριμένο νομοθετικό πλαίσιο και προδιαγραφές. Επιτρέπεται η χρήση αιθανόλης, ακετόνης και εξανίου ως διαλυτών εκχύλισης καθώς και υπερκρίσιμου CO2. Επιπλέον είναι επιτρεπτή και η μετέπειτα απόσμηση των εκχυλισμάτων. Σε κάθε περίπτωση τα παραπάνω τελικά προϊόντα έχουν προορισμό προσθήκης σε λίπη, έλαια ή πιο σύνθετα λιπαρά τρόφιμα. Γενικά, η προσθήκη εκχυλισμάτων από αρωματικά φυτά σε προϊόντα τροφίμων είναι μια διαδικασία κατά την οποία θα πρέπει να μελετάται η φύση και τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τόσο του προσθέτου όσο και του τροφίμου εφαρμογής. Πολλές φορές τα δύο μέρη μπορεί να μην είναι πλήρως αναμίξιμα με αποτέλεσμα να υπάρχουν σοβαρά προβλήματα ενσωμάτωσης του προσθέτου, ενώ η ύπαρξη οσμηρών συστατικών στο εκχύλισμα ενδέχεται να αλλοιώνει σημαντικά τον αρχικό οργανοληπτικό χαρακτήρα του τροφίμου. Στα πλαίσια της συγκεκριμένης μελέτης εξετάστηκαν αφενός απλές βιομηχανικές διεργασίες ως προς την ανάκτηση των δραστικών ουσιών του δενδρολίβανου, αφετέρου η αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων που προέκυψαν. Όσον αφορά την αντιοξειδωτική δράση, σε πρώτη φάση εκτιμήθηκε η ικανότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών από τα εκχυλίσματα μέσω της δοκιμής DPPH και επιπλέον η προστασία που παρέχουν σε φοινικέλαιο που χρησιμοποιείται στις βιομηχανίες παραγωγής τηγανισμένων προϊόντων, σε συνθήκες που προσομοιάζουν το τηγάνισμα (180 C). Συνεκτιμήθηκαν τα πρώτα αποτελέσματα της αντιοξειδωτικής δράσης καθώς και η διαύγεια των παραγόμενων ελαιοδιαλυμάτων και τελικά επελέγη ένα εκχύλισμα για περαιτέρω μελέτη ως προς την αντιοξειδωτική του δράση σε πραγματικά τρόφιμα. Μελετήθηκε η αντιοξειδωτική του δράση τόσο κατά το τηγάνισμα chips πατάτας σε φοινικέλαιο, όσο και κατά την αποθήκευση των παραχθέντων chips σε συσκευασία πολυστρωματικού υλικού. 9

11 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΛΙΠΩΝ ΚΑΙ ΕΛΑΙΩΝ 1.1 Λιπίδια και λιπαρά οξέα Τα λίπη και έλαια ή λιπαρά σώματα που χρησιμοποιούνται στη διατροφή διακρίνονται σε φυτικά ή ζωικά ανάλογα με την προέλευσή τους και αποτελούνται από διάφορα λιπίδια. Λιπίδια (ή λιποειδή) καλούνται ουσίες που είναι διαλυτές σε οργανικούς διαλύτες (όπως σε διαιθυλαιθέρα, πετρελαϊκό αιθέρα, χλωροφόρμιο, τετραχλωράνθρακα) και αδιάλυτες στο νερό. Μαζί με τις πρωτεΐνες και τους υδατάνθρακες αποτελούν τα κύρια δομικά συστατικά των ζωντανών κυττάρων, καθώς και των τροφίμων. Η κατηγοριοποίηση των λιπιδίων είναι δυνατή με βάση τη φυσική τους κατάσταση σε θερμοκρασία δωματίου (έλαια αν είναι υγρά και λίπη αν είναι στερεά), την πολικότητά τους (πολικά και ουδέτερα λιπίδια), την αναγκαιότητά τους για τον άνθρωπο (απαραίτητα και μη λιπαρά οξέα) ή τη δομή τους (απλά ή σύνθετα). Η κατηγοριοποίηση με βάση τη δομή είναι προτιμότερη και σύμφωνα με αυτή τα λιπίδια ταξινομούνται σε παράγωγα, απλά και σύνθετα [O Keefe, 2002]. Τα παράγωγα λιπίδια περιλαμβάνουν ελεύθερα λιπαρά οξέα και αλκοόλες, που είναι τα δομικά στοιχεία των απλών και των σύνθετων λιπιδίων. Επίσης περιλαμβάνουν υδρογονάνθρακες (π.χ. τερπένια), λιποδιαλυτές βιταμίνες (A, D, E ή τοκοφερόλες, Κ) και στεροειδείς ορμόνες. Τα απλά λιπίδια που είναι εστέρες λιπαρών οξέων με διάφορες αλκοόλες και περιλαμβάνουν τα τριγλυκερίδια (εστέρες λιπαρών οξέων με γλυκερίνη) και τους κηρούς (εστέρες λιπαρών οξέων με μονοσθενείς αλκοόλες σχετικά υψηλού μοριακού βάρους, εκτός της γλυκερίνης). Κατά την υδρόλυσή τους τα απλά λιπίδια παρέχουν μόνο αλκοόλες και λιπαρά οξέα. Τα σύνθετα λιπίδια περιλαμβάνουν τα φωσφολιπίδια ή φωσφατίδια (εστέρες που περιέχουν λιπαρά οξέα, φωσφορικό οξύ και άλλες ομάδες οι οποίες συνήθως περιέχουν άζωτο), τα γλυκολιπίδια ή σεροβροζίδια (ενώσεις που περιέχουν λιπαρά οξέα, έναν υδατάνθρακα και ένα αζωτούχο τμήμα, αλλά δεν περιέχουν φωσφορικό οξύ) και άλλα σύνθετα λιπίδια όπως σουλφολιπίδια και αμινολιπίδια. Κατά την υδρόλυσή τους τα σύνθετα λιπίδια παρέχουν τρεις ή περισσότερες διαφορετικές ενώσεις. Τα λιπαρά οξέα είναι τα κύρια δομικά στοιχεία στις λιπιδικές δομές. Μόνο ένα μικρό μέρος του ολικού λιπιδικού κλάσματος αποτελείται από ελεύθερα καρβοξυλικά οξέα ή ελεύθερα λιπαρά οξέα (Free Fatty Acids, FFAs). Τα περισσότερα από τα καρβοξυλικά οξέα στο λιπιδικό κλάσμα 10

12 απαντώνται ως εστέρες της γλυκερόλης, δηλαδή τριακυλγλυκερόλες (TAGs), κοινώς γνωστές ως τριγλυκερίδια. Σχήμα 1.1: Δομή τριγλυκεριδίου Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.1, το μόριο του τριγλυκεριδίου αποτελείται από ένα μόριο γλυκερίνης ενωμένο με τρία μόρια λιπαρών οξέων. Οι ιδιότητες των τριγλυκεριδίων εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τη δομή και τη διαμόρφωση των περιεχόμενων λιπαρών οξέων. Τα πιο συνηθισμένα τριγλυκερίδια είναι τα καρβοξυλικά οξέα μακράς αλυσίδας (C14 C22) [Gunstone, 1996]. Σε ένα τριγλυκερίδιο, οι τρεις υδροξυλομάδες είναι δυνατόν να είναι εστεροποιημένες με το ίδιο λιπαρό οξύ (απλό τριγλυκερίδιο) ή με διαφορετικά λιπαρά οξέα (μικτό τριγλυκερίδιο). Τα φυσικά απαντώμενα τριγλυκερίδια είναι συνήθως μικτά. Τα λιπαρά οξέα των τριγλυκεριδίων είναι γραμμικά αλειφατικά καρβοξυλικά οξέα με άρτιο αριθμό ατόμων άνθρακα που φέρουν την καρβοξυλομάδα στο άκρο της αλύσου και κατηγοριοποιούνται σε κορεσμένα και ακόρεστα (με ένα, δύο ή τρεις διπλούς δεσμούς). Τα κυριότερα κορεσμένα λιπαρά οξέα είναι το βουτυρικό (C4), το δαφνικό (C12), το μυριστικό (C14), το παλμιτικό (C16) και το στεατικό οξύ (C18). Τα κυριότερα ακόρεστα λιπαρά οξέα είναι το παλμιτελαϊκό (C16), το ελαϊκό (C18), το λινελαϊκό (C18), το λινολενικό (C18), το αραχιδονικό (C20) και το ερουκικό οξύ (C22). Σχήμα 1.2: Δομή κορεσμένων και ακόρεστων λιπαρών οξέων Στα λιπαρά σώματα τα ακόρεστα λιπαρά οξέα βρίσκονται κυρίως με cis και σπάνια με trans γεωμετρία, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.2. Τα cis ισομερή επικρατούν σε όλα τα εδώδιμα λίπη και έλαια, ενώ λιπαρά οξέα trans μορφής μπορεί να σχηματιστούν κατά τη θέρμανση των 11

13 ελαίων σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες (θερμικός πολυμερισμός κατά το τηγάνισμα ή κατά την υδρογόνωση λιπαρών) και έχει αποδειχθεί ότι είναι επιβλαβή για την υγεία. Τα ακόρεστα λιπαρά οξέα διακρίνονται σε μονοακόρεστα (MUFAs- monounsaturated fatty acids) όπως είναι το ελαϊκό οξύ (κύριο συστατικό των φυτικών ελαίων) και σε πολυακόρεστα (PUFAspolyunsaturated fatty acids) όπως είναι το λινελαϊκό οξύ που ανήκει στα απαραίτητα λιπαρά οξέα, καθώς δεν μπορεί να παραχθεί από τον οργανισμό και πρέπει να λαμβάνεται από τη διατροφή. 1.2 Οξείδωση λιπιδίων Υπάρχουν δύο κύριες αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα στα λίπη και έλαια και έχουν ως αποτέλεσμα την υποβάθμισή τους: Αυτές είναι η οξείδωση και η υδρόλυση (ή αλλιώς λιπόλυση). Συχνά καλούνται και οι δύο με τον όρο ταγγισμός, ωστόσο μερικοί επιστήμονες τείνουν να χρησιμοποιούν αυτόν τον όρο περισσότερο για την αντίδραση της οξείδωσης. Αυτές οι αντιδράσεις διάσπασης δεν συμβαίνουν μόνο στα λίπη και έλαια αυτά καθαυτά, αλλά και στα προϊόντα που τα περιέχουν. Έτσι, για παράδειγμα αλμυρά σνακ που έχουν τηγανιστεί σε κάποιο έλαιο έχουν υποστεί και αυτά οξειδωτικό ταγγισμό ακριβώς όπως και το έλαιο. Όπως υποδηλώνουν και τα ονόματά τους η οξείδωση απαιτεί την παρουσία οξυγόνου προκειμένου να προχωρήσει η αντίδραση και η υδρόλυση την παρουσία νερού [Talbot, 2011]. Οι αντιδράσεις οξείδωσης αποτελούν μία από τις κυριότερες αιτίες υποβάθμισης των λιπιδίων που περιέχονται στις τροφές και μπορεί να συμβεί κατά την παραγωγή, την αποθήκευση τη διανομή και την τελική προετοιμασία των τροφίμων. Όλα τα τρόφιμα που περιέχουν λιπίδια, ακόμα και σε πολύ χαμηλά επίπεδα (<1 %) είναι ευαίσθητα στην οξείδωση που οδηγεί στον ταγγισμό. Οι αλλαγές που προκαλούνται στα τρόφιμα λόγω της οξείδωσης περιλαμβάνουν όχι μόνο απώλεια της γεύσης ή ανάπτυξη ανεπιθύμητων οσμών, αλλά και απώλεια του χρώματος, της θρεπτικής αξίας και συσσώρευση ενώσεων που μπορεί να είναι επιζήμιες για την υγεία των καταναλωτών [Wąsowicz et al., 2004]. Η οξείδωση των λιπιδίων περιλαμβάνει κυρίως την αντίδραση του οξυγόνου με ακόρεστα λιπαρά οξέα (λιπαρά οξέα με διπλούς δεσμούς), χωρίς να αποκλείονται δευτερογενείς αντιδράσεις με κορεσμένα λιπαρά οξέα (χωρίς διπλούς δεσμούς). Στα τρόφιμα, η λιπιδική οξείδωση εντοπίζεται κυρίως σε χύμα λίπη και έλαια ή σε ελαιώδεις φάσεις γαλακτωμάτων, όπου η αντίδραση είναι πιο προφανής στους καταναλωτές. Είναι σημαντικό να αναγνωριστεί ότι η οξείδωση συμβαίνει όπου υπάρχουν ακόρεστα λιπαρά οξέα, δηλαδή σε [Schaich et al., 2013]: Τριγλυκερίδια (σε λιπώδη ιστό, ελαιούχους σπόρους, αιθέρια έλαια φρούτων, σοκολάτα, χύμα έλαια και ελαιώδεις φάσεις γαλακτωμάτων) 12

14 Φωσφολιπίδια (σε μεμβράνες μυϊκών τροφών, κρεάτων και λαχανικών, στρώματα πίτουρου, κρόκους αυγών και φυσικούς και συνθετικούς γαλακτωματοποιητές) Ελεύθερα λιπαρά οξέα (προϊόντα υδρόλυσης τριγλυκεριδίων και φωσφολιπιδίων που βρίσκονται κυρίως σε τρόφιμα που θερμαίνονται, έχουν μικροβιακή μόλυνση ή περιέχουν γαλακτοκομικά λιπίδια) Λιπαρά οξέα εστεροποιημένα σε άλλα μόρια όπως στερόλες και αλκοόλες (όπως στους κηρούς) Η οξείδωση μπορεί να χωριστεί σε τρεις κύριες υποομάδες: Αυτοξείδωση, φωτοξείδωση και ενζυμικά καταλυόμενη οξείδωση [Talbot, 2011], με το φαινόμενο της αυτοξείδωσης να κυριαρχεί στις περισσότερες αντιδράσεις οξείδωσης των λιπιδίων που περιέχονται στα τρόφιμα Αυτοξείδωση Η αυτοξείδωση, όπως υποδηλώνει το όνομά της, είναι μία αντίδραση που ξεκινάει από μόνη της ή αλλιώς αυτό-καταλυόμενη. Η κινητική της αντίδρασης παρουσιάζει μερικά μοναδικά χαρακτηριστικά που δυσχεραίνουν τη μέτρηση και τον έλεγχο της οξείδωσης των λιπιδίων. Οι κυριότεροι λόγοι για τους οποίους η αυτοξείδωση αποτελεί ένα μείζον πρόβλημα στη σταθερότητα των τροφίμων κατά την αποθήκευσή τους είναι οι εξής [Schaich et al., 2013]: o Η λιπιδική οξείδωση είναι αυτό-καταλυόμενη: μόλις ξεκινήσει, η αντίδραση προχωράει και επιταχύνεται μόνη της. o Πολλά περισσότερα από ένα μόρια λιπιδίων οξειδώνονται και περισσότερα από ένα υδροϋπεροξείδια σχηματίζονται σε κάθε έναρξη. Έχουν μετρηθεί μήκη αλυσίδων με αρκετές εκατοντάδες μόρια λιπιδίων. o Πολύ μικρές ποσότητες προ-οξειδωτικών ή αντιοξειδωτικών προκαλούν μεγάλες αλλαγές στον ρυθμό της αντίδρασης. o Η αντίδραση παράγει πολλαπλά ενδιάμεσα προϊόντα που αλλάζουν ανάλογα με τις συνθήκες και τον χρόνο της αντίδρασης. Πρόκειται για μια αλυσιδωτή αντίδραση ελευθέρων ριζών που πραγματοποιείται σε τρία στάδια: Έναρξη, διάδοση και τερματισμός [Frankel, 2014(a)]. Έναρξη Το πρώτο στάδιο της αυτοξείδωσης είναι συνήθως αρκετά αργό. Κατά το στάδιο αυτό, γίνεται απόσπαση ενός ατόμου υδρογόνου από ομάδα μεθυλενίου που βρίσκεται σε α-θέση ως προς τον διπλό δεσμό άνθρακα-άνθρακα της αλυσίδας του ακόρεστου λιπαρού οξέος, οδηγώντας στο σχηματισμό ελεύθερης ρίζας αλκυλίου (R ). Η αντίδραση της αυτοξείδωσης δεν είναι θερμοδυναμικά αυθόρμητη. Για τον λόγο αυτό, απαιτεί έναν εκκινητή ή καταλύτη (όπως 13

15 θερμότητα, φως, ίχνη μετάλλων ή ένζυμα) με τη βοήθεια του οποίου σχηματίζεται μια αρχική ελεύθερη ρίζα αλκυλίου που αντιδρά με το οξυγόνο προκειμένου να αρχίσει η οξείδωση. Διάδοση Στο στάδιο της διάδοσης, που είναι η καρδιά του μηχανισμού οξείδωσης, η σχηματιζόμενη ρίζα αλκυλίου των ακόρεστων λιπιδίων (R ) αντιδρά με ένα μόριο οξυγόνου προς σχηματισμό μιας ελεύθερης ρίζας υπεροξειδίου (ROO ). Αυτό το στάδιο είναι πάντα πολύ πιο γρήγορο από το επόμενο, όπου η δραστική ρίζα υπεροξειδίου προσλαμβάνοντας ένα άτομο υδρογόνου από άλλο μόριο ακόρεστου λιπαρού οξέος σχηματίζει ένα υδροϋπεροξείδιο (ROOH) και μια νέα ρίζα υπεροξειδίου, η οποία με τη σειρά της θα αντιδράσει κατά τον ίδιο τρόπο (αλυσιδωτή αντίδραση). Τα παραγόμενα υπεροξείδια αποτελούν τα πρωτογενή προϊόντα της οξείδωσης, τα οποία είναι σχετικά ασταθή και διασπώνται εύκολα. Τερματισμός Στο τελευταίο στάδιο της αυτοξείδωσης, οι ελεύθερες ρίζες αλκυλίων (R ) και υπεροξειδίων (ROO ) αντιδρούν μεταξύ τους σχηματίζοντας σταθερές ενώσεις, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.3. Έναρξη RH + O 2 R + OOH λιπαρό οξύ ελεύθερη ρίζα λιπαρού οξέος Διάδοση R + O 2 ROO (ελεύθερη ρίζα υπεροξειδίου) ROO + RH R + ROOH (υπεροξείδιο) Τερματισμός R + R R - R ROO + R ROOR αδρανή προϊόντα ROO + ROO ROOR + O 2 Σχήμα 1.3: Στάδια έναρξης, διάδοσης και τερματισμού της αυτοξείδωσης των λιπαρών σωμάτων Κατά το στάδιο της έναρξης της αυτοξείδωσης, τα άτομα υδρογόνου που βρίσκονται σε α-θέση ως προς τον διπλό δεσμό άνθρακα - άνθρακα της αλυσίδας του λιπαρού οξέος είναι πολύ εύκολο να αποσπαστούν. Στο Σχήμα 1.4, παρουσιάζεται μέρος της αλυσίδας ακόρεστου λιπαρού οξέος. Όπως παρατηρείται το υδρογόνο μπορεί να αποσπαστεί είτε από τη μία είτε από την 14

16 άλλη ομάδα μεθυλενίου που βρίσκονται δίπλα στον διπλό δεσμό, σχηματίζοντας δύο πιθανές δομές ελευθέρων ριζών λιπαρού οξέος. Ωστόσο, από τη στιγμή που σχηματίζονται οι ρίζες, η θέση του διπλού δεσμού και συνεπώς η θέση της ελεύθερης ρίζας μπορεί να κινείται κατά μήκος της αλυσίδας του οξέος. Το παράδειγμα του Σχήματος 1.4 δείχνει τέσσερις πιθανές θέσεις ελευθέρων ριζών, οι οποίες κατά το στάδιο της διάδοσης μετατρέπονται σε τέσσερα πιθανά υδροϋπεροξείδια. Το τελικό στάδιο της αυτοξείδωσης είναι η διάσπαση αυτών των υπεροξειδίων κυρίως σε αλδεΰδες και κετόνες. Σχήμα 1.4: Επίδραση της ομάδας μεθυλενίου στην αυτοξείδωση Ο λόγος για την περαιτέρω διάσπαση είναι ότι τα υδροϋπεροξείδια που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της διάδοσης είναι σχετικά ασταθείς ενώσεις και διασπώνται εύκολα σε αλκόξυ-ρίζες με την απώλεια μιας ελεύθερης ρίζας υδροξυλίου (Σχήμα 1.5). 15

17 Σχήμα 1.5: Σχηματισμός αλδεϋδών Αυτή η αλκόξυ- ρίζα μπορεί στη συνέχεια να χωριστεί σε δύο βραχύτερες αλυσίδες στο σημείο εκείνο της αλυσίδας που βρισκόταν η ομάδα υδροϋπεροξειδίου. Από αυτές τις δύο μικρότερες αλυσίδες μπορεί να σχηματιστεί μια αλδεΰδη είτε άμεσα είτε έμμεσα μέσω μιας περαιτέρω αντίδρασης με νερό. Λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των διαφορετικών μηκών αλυσίδας που είναι πιθανά στα λιπαρά οξέα, τον διαφορετικό αριθμό διπλών δεσμών που μπορεί να υπάρχουν, καθώς και το γεγονός ότι κατά τη διάρκεια της διάδοσης η ελεύθερη ρίζα υπεροξειδίου και η θέση του διπλού δεσμού μπορεί να κινηθεί κατά μήκος της αλυσίδας, ο αριθμός των διαφορετικών αλδεϋδών που μπορεί να σχηματιστούν κατά τη διάσπαση των υπεροξειδίων είναι δυνητικά πολύ μεγάλος [Talbot, 2011]. Τα ασταθή υδροϋπεροξείδια που σχηματίζονται στο στάδιο της διάδοσης της αυτοξείδωσης είναι μη πτητικές, άοσμες ενώσεις και αποτελούν τα πρωτογενή προϊόντα οξείδωσης. Η περαιτέρω διάσπαση των υπεροξειδίων οδηγεί στο σχηματισμό πτητικών και δύσοσμων ενώσεων (αλδεΰδες, κετόνες, αλκοόλες, υδρογονάνθρακες, κ.ά.) που αποτελούν τα δευτερογενή προϊόντα οξείδωσης. Τα προϊόντα αυτά ευθύνονται για την οσμή και γεύση ταγγισμού και είναι μια προειδοποίηση ότι τα τρόφιμα δεν είναι πλέον εδώδιμα. Η αυτοξείδωση των λιπαρών ακολουθεί δύο σαφώς διακρινόμενες μεταξύ τους φάσεις, όπως παρουσιάζεται στο σχήμα 1.6. Η πρώτη περίοδος ορίζεται ως το χρονικό διάστημα πριν από την εμφάνιση της ανεπιθύμητης οσμής και γεύσης, γνωστό ως περίοδος επώασης ή χρόνος επώασης (Induction Period-IP ή Induction Time-IT), όπου η οξείδωση είναι σχετικά μικρή. Κατά την περίοδο αυτή, η αντίδραση προχωρά με βραδύ ρυθμό και αντιστοιχεί στο σχηματισμό των 16

18 πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης (υδροϋπεροξείδια). Ως αρχή της δεύτερης φάσης ορίζεται το σημείο στο οποίο η λιπαρή ουσία αρχίζει να παρουσιάζει οσμή και γεύση ταγγισμού και αντιστοιχεί στο σχηματισμό των δευτερογενών προϊόντων οξείδωσης (προϊόντα διάσπασης υπεροξειδίων). Ο ρυθμός της αντίδρασης κατά την περίοδο αυτή αυξάνεται σημαντικά λόγω της καταλυτικής δράσης των σχηματιζόμενων ουσιών. Σχήμα 1.6: Φάσεις (περίοδοι) οξείδωσης λιπαρών σωμάτων Φωτοξείδωση Η φωτοξείδωση αποτελεί έναν άλλο δυνατό τρόπο με τον οποίο ενεργοποιείται το μόριο του λιπαρού οξέος, ώστε να συνεχίσει η αλυσιδωτή αντίδραση ελευθέρων ριζών που περιγράφηκε παραπάνω. Υπάρχουν δύο κατηγορίες αντιδράσεων που είναι δυνατόν να συμβούν: με ή χωρίς φωτοευαισθητοποιητή. Ως φωτοευαισθητοποιητές θεωρούνται οι χημικές ουσίες που όταν απορροφούν φωτεινή ακτινοβολία μεταπίπτουν από τη βασική στη διεγερμένη κατάσταση, η οποία μπορεί να ενεργοποιήσει τα ακόρεστα λιπαρά οξέα ή το μοριακό οξυγόνο. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα μόρια των ουσιών αυτών από την απλή διεγερμένη κατάσταση μπορούν με εκπομπή φθορισμού να επιστρέψουν στη βασική κατάσταση ή και να μεταπέσουν στην τριπλή διεγερμένη κατάσταση [Bradley & Min, 1992]. Χωρίς φωτοευαισθητοποιητή, τα λιπαρά οξέα ενεργοποιούνται κατευθείαν από υπέρυθρο UV φως, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό ελευθέρων ριζών που αντιδρούν με το οξυγόνο. Η φωτοξείδωση με παρουσία φωτοευαισθητοποιητή διακρίνεται σε δύο τύπου αντιδράσεις: Στον πρώτο τύπο αντίδρασης, το φως ενεργοποιεί τον φωτοευαισθητοποιητή, ο οποίος μεταφέρει ενέργεια στο λιπαρό οξύ με αποτέλεσμα τον σχηματισμό ρίζας, η οποία με τη 17

19 σειρά της αντιδρά με το μοριακό οξυγόνο (οξυγόνο τριπλής διεγερμένης κατάστασης, 3 Ο2) παράγοντας υδροϋπεροξείδια. Παράδειγμα τέτοιου φωτοευαισθητοποιητή είναι η ριβοφλαβίνη [Kim, 2007]. Στον δεύτερο τύπο αντίδρασης, μετά την ενεργοποίηση από το φως, ο φωτοευαισθητοποιητής αντιδρά με το μοριακό οξυγόνο (οξυγόνο τριπλής διεγερμένης κατάστασης, 3 Ο2) προς σχηματισμό οξυγόνου απλής διεγερμένης κατάστασης ( 1 Ο2), μια πολύ δραστική μορφή οξυγόνου που αντιδρά κατευθείαν με το μόριο του λιπαρού οξέος παράγοντας υδροϋπεροξείδια. Παράδειγμα τέτοιου φωτοευαισθητοποιητή είναι η χλωροφύλλη [Bradley & Min, 1992]. Τα λιπαρά οξέα αντιδρούν περίπου 1500 φορές ταχύτερα με το οξυγόνο απλής διεγερμένης κατάστασης από ότι με το οξυγόνο τριπλής διεγερμένης κατάστασης [Matthäus, 2010]. Κατά την φωτοξείδωση του πρώτου τύπου, τα σχηματιζόμενα προϊόντα είναι ίδια με αυτά της αυτοξείδωσης, καθώς οι ενδιάμεσες ρίζες που σχηματίζονται είναι ίδιες και στις δύο περιπτώσεις. Αντιθέτως, κατά την φωτοξείδωση δεύτερου τύπου, το οξυγόνο απλής διεγερμένης κατάστασης λόγω της υψηλής του δραστικότητας αντιδρά άμεσα με τον διπλό δεσμό του μορίου του λιπαρού οξέος, ο οποίος μετακινείται σε αλλυλική θέση και ταυτόχρονα αλλάζει γεωμετρία, μετατρεπόμενος από cis σε trans δεσμό. Έτσι, τα υδροϋπεροξείδια που σχηματίζονται έχουν αλλυλικό διπλό δεσμό και είναι διαφορετικά από εκείνα που προκύπτουν κατά την αυτοξείδωση [Chan, 1987]. Σε αντίθεση προς την αυτοξείδωση, η φωτοξείδωση δεν παρεμποδίζεται από τις φαινολικές αντιοξειδωτικές ουσίες που αναστέλλουν την αλυσιδωτή αντίδραση της αυτοξείδωσης. Παρεμποδίζεται όμως από την παρουσία μερικών ενώσεων, όπως τα καροτενοειδή και η α-τοκοφερόλη, οι οποίες απενεργοποιούν τη δραστικότητα του οξυγόνου απλής διεγερμένης κατάστασης [Foote, 1987] Ενζυμικά καταλυόμενη οξείδωση Ο τρίτος τρόπος με τον οποίο είναι δυνατός ο σχηματισμός υδροϋπεροξειδίων είναι η ενζυματική οξείδωση από το ένζυμο λιποξυγενάση, που ανήκει στην κατηγορία των οξειδοαναγωγικών ενζύμων. Η λιποξυγενάση συναντάται σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών οργάνων και ιστών και ιδιαίτερα σε σπόρους οσπρίων (φασόλια και μπιζέλια) και πατάτες. Δρα ως καταλύτης της αντίδρασης ανάμεσα στο οξυγόνο και τα cis,cis- πολυακόρεστα λιπαρών οξέα (PUFAs) προς σχηματισμό υδροϋπεροξειδίων. Ανάλογα με την προέλευσή της, η λιποξυγενάση καταλύει την οξείδωση σε διαφορετικά σημεία στην ανθρακική αλυσίδα. Για παράδειγμα, στους φυτικούς ιστούς, όπου τα κύρια πολυακόρεστα λιπαρά οξέα είναι το ελαϊκό και το λινολενικό οξύ, η εισαγωγή του οξυγόνου τοποθετείται στη θέση 9 (λιποξυγενάση από πατάτα) ή 13 (λιποξυγενάση από σπόρο σόγιας) παράγοντας τα αντίστοιχα υδροϋπεροξείδια [Baysal & Demirdöven, 2007; Hildebrand, 1989]. 18

20 1.2.4 Παράγοντες που επηρεάζουν τον ρυθμό οξείδωσης των λιπιδίων Η οξείδωση των λιπιδίων αποτελεί ένα πολυδιάστατο φαινόμενο. Στις περισσότερες περιπτώσεις είναι δύσκολη η αξιολόγηση της επίδρασης ενός συγκεκριμένου παράγοντα στη συνολική οξειδωτική διεργασία, καθώς υπάρχουν πολλοί που δρουν ταυτόχρονα και μάλιστα συσχετίζονται μεταξύ τους [Velasco et al., 2010]. Περιεκτικότητα σε οξυγόνο Το οξυγόνο αποτελεί απαραίτητο αντιδρών για τη διάδοση της αντίδρασης αυτοξείδωσης, επομένως η απόλυτη απουσία οξυγόνου θα απέτρεπε την οξειδωτική μεταβολή των λιπιδίων. Στην πραγματικότητα, μελέτες που έχουν διεξαχθεί σε λιπιδικά μοντέλα απουσία οξυγόνου έχουν δείξει τον σχηματισμό γεωμετρικών και κυκλικών ισομερών, διμερών και ολιγομερών - χωρίς επιπλέον οξυγόνο- ως τις μόνες ενώσεις που παράγονται [Gardner, 1987]. Ωστόσο, ο σχηματισμός αυτών των ενώσεων σε σημαντικά επίπεδα λαμβάνει χώρα μόνο σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 200 C, δηλαδή σε θερμοκρασίες όπου η διαλυτότητα του οξυγόνου είναι εξαιρετικά χαμηλή, όπως για παράδειγμα στο στάδιο απόσμησης της διεργασίας ραφιναρίσματος των λιπών και ελαίων. Σε αρκετά υψηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου, όπως για παράδειγμα πάνω από 10 % για την οξείδωση του μεθυλο-λινελαϊκού οξέος, ο ρυθμός της αυτοξείδωσης είναι ανεξάρτητος από την συγκέντρωση του οξυγόνου. Αντιθέτως, σε χαμηλές συγκεντρώσεις (κάτω από 1 %), ο ρυθμός της οξείδωσης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη συγκέντρωση του οξυγόνου [Choe & Min, 2006]. Θερμοκρασία Αύξηση της θερμοκρασίας οδηγεί σε σημαντική μείωση της περιόδου επώασης (IP). Ο ρυθμός της οξείδωσης αυξάνεται εκθετικά με την αύξηση της θερμοκρασίας. Επιπλέον υπάρχει μια ισχυρή αλληλεπίδραση μεταξύ θερμοκρασίας και οξυγόνου, καθώς η διαλυτότητα του οξυγόνου μειώνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας. Σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των C τα υδροϋπεροξείδια είναι ασταθή και διασπώνται με ρυθμό μεγαλύτερο από τον ρυθμό σχηματισμού τους. Επομένως, σε διεργασίες όπως το τηγάνισμα των τροφίμων, τα πιο σημαντικά προϊόντα που σχηματίζονται είναι τα δευτερογενή [Patsioura et al., 2017]. Φως Η άμεση επίδραση του φωτός στα λιπίδια έγκειται στο ότι επιταχύνει την αυτοξείδωση ευνοώντας τον σχηματισμό των ελευθέρων ριζών στο στάδιο έναρξης. Ουσιαστικά, δρα ως καταλύτης στην αντίδραση απόσπασης υδρογόνου και στη διάσπαση των υδροϋπεροξειδίων. Στο σημείο αυτό, θα πρέπει να τονιστεί ότι αυτός ο παράγοντας είναι διαφορετικός από αυτόν που περιγράφηκε στην παράγραφο 1.2.2, όπου η παρουσία φωτοευαισθητοποιητών οδηγεί στην φωτοξείδωση των λιπαρών οξέων. 19

21 Σύνθεση λιπαρών οξέων Ο βαθμός ακορεστότητας των λιπαρών οξέων αποτελεί έναν από τους πιο καθοριστικούς παράγοντες στον ρυθμό της λιπιδικής οξείδωσης. Έλαια με μεγαλύτερο βαθμό ακορεστότητας οξειδώνονται πιο γρήγορα από τα λιγότερο ακόρεστα [Parker et al., 2003]. Όσο αυξάνεται ο βαθμός ακορεστότητας τόσο αυξάνεται ο ρυθμός αλλά και η συγκέντρωση των πρωτογενών προϊόντων στο τέλος της περιόδου επώασης [Martin-Polvillo et al., 2004]. Ο σχετικός ρυθμός αυτοξείδωσης του ελαϊκού, λινελαϊκού και λινολενικού οξέος έχει αναφερθεί ότι είναι 1: 40-50: 100 με βάση την απορρόφηση οξυγόνου [Holman, Elmer, 1947]. Στα μίγματα, όπως συμβαίνει στη φύση, ο ρυθμός της οξείδωσης καθορίζεται από τον ρυθμό του πιο ακόρεστου λιπαρού οξέος. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι τα κορεσμένα λιπαρά οξέα οξειδώνονται σε πολύ μικρό βαθμό και παραμένουν αναλλοίωτα ακόμα και όταν η οξείδωση των ακόρεστων λιπαρών οξέων είναι σε υψηλά επίπεδα. Παρόλα αυτά, σε μεγάλες θερμοκρασίες οι μεταβολές που υφίστανται τα κορεσμένα λιπαρά οξέα είναι σημαντικές. Μέταλλα Τα ακατέργαστα έλαια περιέχουν μεταβατικά μέταλλα όπως σίδηρο ή χαλκό, οι περιεκτικότητες των οποίων μειώνονται με τον εξευγενισμό των ελαίων (ή ραφινάρισμα). Τα εδώδιμα έλαια που παρασκευάζονται χωρίς ραφινάρισμα, όπως το έξτρα παρθένο ελαιόλαδο και το σησαμέλαιο περιέχουν σχετικά υψηλές ποσότητες μεταβατικών μετάλλων. Τα μέταλλα αυξάνουν τον ρυθμό της λιπιδικής οξείδωσης, καθώς μειώνουν την ενέργεια ενεργοποίησης του σταδίου έναρξης της αυτοξείδωσης [Jadhav, 1995]. Αντιδρούν κατευθείαν με τα λιπίδια και παράγουν ρίζες αλκυλίων, όπως επίσης και δραστικά είδη οξυγόνου που επιταχύνουν την αντίδραση διάσπασης των υδροϋπεροξειδίων. Συγκεκριμένα, ο χαλκός επιταχύνει τη διάσπαση των υδροϋπεροξειδίων 50 φορές ταχύτερα από το ιόν σιδήρου (Fe 2+ ) και το ιόν σιδήρου δρα 100 φορές ταχύτερα από το ιόν σιδήρου (Fe 3+ ) [Choe & Min, 2006]. Αντιοξειδωτικά Τα εδώδιμα έλαια περιέχουν αντιοξειδωτικές ενώσεις, όπως τοκοφερόλες, τοκοτριενόλες, καροτενοειδή, φαινολικές ενώσεις και στερόλες. Όπως αναλύεται στο Κεφάλαιο 2, τα αντιοξειδωτικά συχνά προστίθενται σκοπίμως στα έλαια για να βελτιώσουν την οξειδωτική τους σταθερότητα, καθώς πρόκειται για ενώσεις που παρατείνουν την περίοδο επώασης της οξείδωσης ή μειώνουν τον ρυθμό της. Ο κύριος μηχανισμός με τον οποίο δρουν τα φαινολικά αντιοξειδωτικά έγκειται στη διακοπή της αλυσιδωτής αντίδρασης της αυτοξείδωσης, καθώς αντιδρούν με τις ελεύθερες ρίζες μετατρέποντάς τις σε πιο σταθερά προϊόντα [Decker, 2008]. 20

22 Φυσική δομή τροφίμου Στα τρόφιμα τα λιπίδια βρίσκονται αναμεμιγμένα με νερό, πρωτεΐνες, υδατάνθρακες και άλλα συστατικά. Η κατανομή των λιπιδίων στο σώμα του τροφίμου παίζει σημαντικό ρόλο στην οξείδωσή τους. Τρόφιμα με λιπίδια που βρίσκονται σε συνεχή φάση συνήθως παρουσιάζουν παρόμοια οξειδωτική συμπεριφορά με τα ίδια λιπίδια όταν αυτά βρίσκονται απομονωμένα από το σώμα του τροφίμου. Οι κρίσιμες παράμετροι είναι η σύνθεση του λίπους και η επιφάνεια του τροφίμου [Fritsch, 1994]. Όταν τα λιπίδια βρίσκονται διασκορπισμένα ή σε μη συνεχή φάση στο τρόφιμο, όπως σε σταγονίδια λιπιδίων, ο ρυθμός της οξείδωσης διαφέρει και μπορεί να είναι μικρότερος ή μεγαλύτερος από αυτόν των λιπιδίων ίδιου τύπου και ίδιας ποσότητας, αλλά σε συνεχή φάση. Το λιπιδικό κλάσμα που είναι πιο εκτεθειμένο στον ατμοσφαιρικό αέρα, δηλαδή στη επιφάνεια του τροφίμου, είναι πιο ευαίσθητο στην οξείδωση. Η κατανομή των λιπιδίων στο τρόφιμο εξαρτάται από την κινητικότητα των μορίων των συστατικών του, η οποία με τη σειρά της είναι συνάρτηση της φύσης, σύνθεσης και φυσικής κατάστασης του τροφίμου, ενώ ταυτόχρονα επηρεάζεται από τη θερμοκρασία και την ενεργότητα του νερού. 1.3 Οξείδωση ελαίων κατά το τηγάνισμα των τροφίμων Το τηγάνισμα αποτελεί μία από τις πιο διαδεδομένες διεργασίες προετοιμασίας των τροφίμων και χρησιμοποιείται ευρέως τόσο από τους καταναλωτές όσο και από τη βιομηχανία τροφίμων. Παρότι φαίνεται απλή σαν διεργασία, στην πραγματικότητα είναι εξαιρετικά περίπλοκη και περιλαμβάνει πολυάριθμες αντιδράσεις που οφείλονται στη δράση του οξυγόνου, στην υψηλή θερμοκρασία και στο νερό που απελευθερώνεται από το τρόφιμο κατά τη διάρκεια της θέρμανσής του. Οι γενικές αντιδράσεις των κύριων συστατικών του ελαίου, δηλαδή των τριγλυκεριδίων, που λαμβάνουν χώρα κατά το τηγάνισμα είναι η οξείδωση, η υδρόλυση, ο πολυμερισμός, η κυκλοποίηση και η ισομερείωση. Λόγω των πολλών παραμέτρων που εμπλέκονται στην διεργασία, ο ρυθμός υποβάθμισης του ελαίου δεν είναι εύκολο να προβλεφθεί. Οι παράμετροι αυτές μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε τρεις ομάδες: o Παράμετροι που σχετίζονται με την ίδια τη διεργασία, όπως θερμοκρασία, χρόνος θέρμανσης, συνεχής ή διακοπτόμενη θέρμανση, κτλ. o Παράμετροι που σχετίζονται με το λίπος ή έλαιο που χρησιμοποιείται, όπως βαθμός ακορεστότητας, αρχική ποιότητα, δευτερεύουσες ενώσεις και πρόσθετα. o Παράμετροι που σχετίζονται με το τρόφιμο που τηγανίζεται. [Jorge et al., 1996; Dobarganes, 1998; Choe & Min, 2007] Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο 1.2, η οξείδωση των λιπιδίων διαδίδεται μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης ελευθέρων ριζών παράγοντας υδροϋπεροξείδια (ROOH) ως πρωτογενή 21

23 προϊόντα οξείδωσης και πολλά δευτερογενή προϊόντα που σχηματίζονται από τη διάσπαση των υδροϋπεροξειδίων. Σε θερμοκρασία δωματίου, ο σχηματισμός των προϊόντων οξείδωσης προχωράει με σχετικά αργό ρυθμό. Τα υδροϋπεροξείδια είναι τα κύρια προϊόντα που σχηματίζονται και η συγκέντρωσή τους αυξάνεται όσο προχωράει η αντίδραση της οξείδωσης. Τα προϊόντα πολυμερισμού φτάνουν σε σημαντικά επίπεδα συγκέντρωσης μόνο στο στάδιο όπου επιταχύνεται η οξείδωση, δηλαδή στο τέλος της περιόδου επώασης (Induction Period, IP). [Márquez-Ruiz et al., 1996]. Ωστόσο, δευτερεύουσες πτητικές ενώσεις που σχηματίζονται και μετά το τέλος της περιόδου επώασης, ειδικά οι καρβονυλικές ενώσεις, παίζουν σημαντικό ρόλο στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά και συνεισφέρουν στην ανεπιθύμητη αλλοίωση της γεύσης του ελαίου [Frankel, 2014(b)]. Σε υψηλές θερμοκρασίες, όπως αυτές του τηγανίσματος, ο σχηματισμός νέων ενώσεων συμβαίνει πολύ γρήγορα, η πίεση του οξυγόνου μειώνεται και κατά συνέπεια οι αντιδράσεις έναρξης της οξείδωσης γίνονται σημαντικές και οδηγούν στην αύξηση της συγκέντρωσης των ριζών αλκυλίων (R ) σε σχέση με τις ρίζες υπεροξειδίων (ROO ). Εξάλλου οι ρίζες υπεροξειδίων διασπώνται άμεσα και πρακτικά δεν υφίστανται πάνω από τους 150 C, γεγονός που δείχνει ότι η διάσπαση των υδροϋπεροξειδίων είναι ταχύτερη από τον σχηματισμό τους [Dobarganes, 1998]. Τα προϊόντα που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της διεργασίας του τηγανίσματος μπορούν να κατηγοριοποιηθούν με βάση το μοριακό τους βάρος σε τρεις κύριες ομάδες: α) διμερή, ολιγομερή και πολυμερή τριγλυκεριδίων, β) οξειδωμένα μονομερή τριγλυκεριδίων και γ) πτητικές ενώσεις. Τα προϊόντα πολυμερισμού (διμερή, ολιγομερή και πολυμερή τριγλυκεριδίων) είναι οι πιο άφθονες ενώσεις στα χρησιμοποιημένα λίπη τηγανίσματος. Τα μοριακά τους βάρη είναι προφανώς μεγαλύτερα από τα αρχικά μη τροποποιημένα τριγλυκερίδια και οι κύριες ενώσεις είναι εκείνες που περιέχουν δεσμούς άνθρακα- άνθρακα ή δεσμούς αιθέρα, δηλαδή δεσμούς άνθρακα- οξυγόνου- άνθρακα [Dobarganes & Márquez-Ruiz 2007]. Τα οξειδωμένα μονομερή τριγλυκεριδίων είναι τριγλυκερίδια, στα οποία τουλάχιστον μία από τις λιπαρές ακυλομάδες είναι οξειδωμένη. Αυτή η ομάδα ενώσεων περιλαμβάνει τριγλυκερίδια που περιέχουν διαφορετικές οξυγονούχες ομάδες (όπως υδροξυ-, κετο-, εποξυομάδες κ.ά.), όπως επίσης και τριγλυκερίδια με λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου [Velasco et al., 2004]. Ταυτόχρονα με τον σχηματισμό τριγλυκεριδίων που περιέχουν λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου από τη διάσπαση αλκοξυ- ριζών, παράγονται επίσης πτητικές ενώσεις. Σε αντίθεση με τα παράγωγα των γλυκεριδίων, οι πτητικές ενώσεις αποβάλλονται σε μεγάλο βαθμό από το έλαιο λόγω της υψηλής θερμοκρασίας. Τέλος, λόγω της υγρασίας που αποβάλλεται από το τρόφιμο κατά τη διάρκεια της θέρμανσης, οι υδρολυτικές αντιδράσεις οδηγούν στον σχηματισμό διακυλογλυκερολών και ελεύθερων λιπαρών οξέων. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα επιταχύνουν τις αντιδράσεις οξείδωσης και επίσης συμβάλλουν στη μείωση του σημείου καπνού, δηλαδή της θερμοκρασίας στην οποία η λιπαρή ύλη αρχίζει να καπνίζει. Τα προϊόντα 22

24 υδρόλυσης είναι ενδιάμεσα προϊόντα και παρότι επηρεάζουν την ποιότητα του τηγανισμένου ελαίου, δεν μεταβάλλουν την θρεπτική του αξία. Αντίθετα, η οξείδωση και η θερμική διάσπαση οδηγεί σε αλλαγές στην αλυσίδα των λιπαρών οξέων των τριγλυκεριδίων και κατά συνέπεια μεταβάλλεται η θρεπτική αξία του ελαίου [Márquez-Ruiz et al., 2010]. 1.4 Μέθοδοι εκτίμησης οξείδωσης λιπιδίων Η οξείδωση των λιπιδίων είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, που γίνεται σε πολλά στάδια και οδηγεί σε παραγωγή πολλών ενδιάμεσων και τελικών προϊόντων. Επομένως, για να εκτιμηθεί η έκταση της οξείδωσης των λιπιδίων σε ένα τρόφιμο, είναι απαραίτητες αναλυτικές μέθοδοι που να προσφέρουν ειδική και ευαίσθητη μέτρηση ενός ή περισσότερων πρωτογενών ή δευτερογενών προϊόντων και να αποτελούν αξιόπιστους δείκτες της οξείδωσης των λιπιδίων. Η επιλογή μιας κατάλληλης μεθόδου για την εκτίμηση της οξείδωσης είναι δύσκολη και συχνά η χρήση μεθόδων συνδυαστικά είναι η πιο σωστή. Μία καλή μέθοδος, θα πρέπει προφανώς να μετράει την λιπιδική οξείδωση πριν το σημείο ταγγισμού, όπου η υποβάθμιση του ελαίου είναι οργανοληπτικά αισθητή. Οι αναλυτικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της οξείδωσης ενός λίπους/ελαίου χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: Μέθοδοι μέτρησης της οξειδωτικής κατάστασης του ελαίου Μέθοδοι εκτίμησης της πιθανής μελλοντικής του σταθερότητας Οι μέθοδοι της πρώτης κατηγορίας παρέχουν ουσιαστικά ένα στιγμιότυπο της οξειδωτικής κατάστασης του ελαίου τη δεδομένη χρονική στιγμή της μέτρησης. Τέτοιες αναλύσεις γίνονται για παράδειγμα πριν από τη συσκευασία ενός λίπους ή τη διανομή ενός ελαίου και μερικές από αυτές συχνά αποτελούν μέρος των προδιαγραφών του προϊόντος. Σε ό,τι αφορά την δεύτερη κατηγορία, με τον όρο οξειδωτική σταθερότητα των ελαίων χαρακτηρίζεται η αντίσταση που παρουσιάζουν στην οξείδωση κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας και αποθήκευσής τους [Guillén, Cabo, 2002] ή αλλιώς το χρονικό διάστημα που απαιτείται μέχρι η οξείδωση να φτάσει σε ένα κρίσιμο σημείο στο οποίο επέρχονται οργανοληπτικές αλλαγές στο έλαιο (ταγγισμός) ή επιταχύνεται ξαφνικά η οξειδωτική διαδικασία (δεύτερη φάση αυτοξείδωσης) [Silva et al., 2001]. Οι μέθοδοι της δεύτερης κατηγορίας παρέχουν μια εκτίμηση αυτού του χρονικού διαστήματος. Ιδανικά, αυτή η περίοδος πρέπει να διαρκεί εβδομάδες ή μήνες επομένως χρησιμοποιούνται επιταχυνόμενες αναλυτικές δοκιμές [Talbot, G., 2011]. Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας, θα αναλυθούν οι μέθοδοι της πρώτης κατηγορίας που αφορούν την εκτίμηση της οξειδωτικής κατάστασης του ελαίου. Η εκτίμηση της οξειδωτικής κατάστασης των λιπών και ελαίων αποτελεί ένα δύσκολο έργο αφενός γιατί υπάρχουν πολλοί παράγοντες που επηρεάζουν την οξείδωση (περιεκτικότητα σε οξυγόνο, θερμοκρασία, φως, κ.ά.), όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο και αφετέρου γιατί 23

25 τα προϊόντα της οξείδωσης διαφέρουν ανάλογα με τον χρόνο, την έκταση της οξείδωσης και τον μηχανισμό που ακολουθείται. Με βάση τα προϊόντα που παράγονται στα στάδια της αυτοξείδωσης των λιπιδίων, οι μέθοδοι εκτίμησης της οξειδωτικής κατάστασης μπορούν να χωριστούν σε μεθόδους προσδιορισμού των πρωτογενών και μεθόδους προσδιορισμού των δευτερογενών προϊόντων Μέθοδοι προσδιορισμού πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης Η πλέον συνήθης μέθοδος που εφαρμόζεται στα εργαστήρια ποιοτικού ελέγχου και έρευνας για τον προσδιορισμό των πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης, όπως είναι τα υδροϋπεροξείδια, είναι ο αριθμός υπεροξειδίων (Peroxide Value, PV). Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι για τον προσδιορισμό του PV, όμως η πιο χρησιμοποιούμενη στη βιομηχανία ελαίων είναι αυτή που βασίζεται στην ιωδομετρική τιτλοδότηση με θειοθειικό νάτριο. Σύμφωνα με τη μέθοδο, τα υπεροξείδια που υπάρχουν στο έλαιο αποδεσμεύουν το ιώδιο από κορεσμένο διάλυμα ιωδιούχου καλίου. Έτσι, ο αριθμός υπεροξειδίων προσδιορίζεται με τιτλοδότηση του σχηματιζόμενου ιωδίου και εκφράζεται συνήθως σε χιλιοστοϊσοδύναμα (meq) ενεργού οξυγόνου που οξειδώνουν το ιωδιούχο κάλιο ανά κιλό ελαίου (meq O2/kg oil). Ενδεικτικά, σύμφωνα με τον κανονισμό 2568/91 της Ευρωπαϊκής Επιτροπής [Commission Regulation (EEC) No 2568/91], η ανώτατη επιτρεπόμενη τιμή PV στο εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο και στο παρθένο ελαιόλαδο ορίζεται στα 20 meq O2/kg ελαίου. Ωστόσο, το όριο αυτό ποικίλλει ανάλογα με τη λιπαρή ύλη και τη χώρα. Η μέθοδος έχει τυποποιηθεί από την IUPAC (IUPAC 2.501), AOCS (AOCS Cd 8-53) και άλλους οργανισμούς ως η επίσημη μέθοδος ανάλυσης λιπών και ελαίων. Τα υπεροξείδια αποτελούν ενδιάμεσα προϊόντα και κατά συνέπεια η μέτρησή τους εκφράζει τη διαφορά ανάμεσα στον σχηματισμό και τη διάσπαση αυτών. Επομένως, θα πρέπει να συνδυάζεται με μια μέθοδο μέτρησης των δευτερογενών προϊόντων οξείδωσης. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό στα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, όπου τα υδροϋπεροξείδια είναι ασταθή και διασπώνται σε δευτερογενή προϊόντα ακόμα και σε χαμηλά επίπεδα οξείδωσης [Velasco et al., 2010]. Ένας άλλος τρόπος προσδιορισμού των σχηματιζόμενων πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης αποτελεί η μέτρηση των συζυγών διενίων. Ο σχηματισμός των υδροϋπροξειδίων από πολυακόρεστα λιπαρά οξέα στις περισσότερες περιπτώσεις συνοδεύεται από σταθεροποίηση των ριζών μέσω αναδιάταξης των διπλών δεσμών (με μετατόπιση ηλεκτρονίων), η οποία οδηγεί στον σχηματισμό συζυγών διενίων. Αυτές οι σχετικά σταθερές ενώσεις απορροφούν στο υπεριώδες φάσμα (UV) σε μήκος κύματος 232 nm, οπότε είναι ανιχνεύσιμες με φασματομετρικές τεχνικές. Η μέθοδος των συζυγών διενίων είναι γρηγορότερη από τη μέθοδο αριθμού υπεροξειδίων, πιο απλή, δεν εξαρτάται από χημικές αντιδράσεις ή ανάπτυξη χρώματος και απαιτεί μικρότερο μέγεθος δείγματος. Παρόλα αυτά, η παρουσία ενώσεων που απορροφούν στην ίδια περιοχή μήκους κύματος μπορεί να οδηγήσει είτε σε υπερεκτίμηση, αν για παράδειγμα υπάρχουν συζυγιακοί διπλοί δεσμοί εξαρχής στο λιπαρό οξύ, είτε σε υποτίμηση, όπως στο ελαϊκό οξύ όπου τα σχηματιζόμενα υδροϋπεροξείδια περιέχουν λιγότερο από δύο 24

26 διπλούς δεσμούς και δεν είναι ανιχνεύσιμα. Επιπλέον, η μέθοδος δεν είναι κατάλληλη για έλαια που έχουν υποβληθεί σε θέρμανση, καθώς στη μέτρηση παρεμβαίνει η απορρόφηση καρβονυλικών ενώσεων που σχηματίζονται από τη διάσπαση των υδροϋπεροξειδίων [Barriuso, 2013]. Η μέθοδος θειοκυανιούχου σιδήρου είναι επίσης μια φασματοφωτομετρική μέθοδος που, όπως περιγράφεται από τους Shantha & Decker (1994), βασίζεται στην ικανότητα των υπεροξειδίων να οξειδώνουν τα δισθενή ιόντα σιδήρου σε τρισθενή ιόντα σύμφωνα με την αντίδραση: Fe 2+ +2H + +O Fe 3+ +Η2O. Μετά από αυτή την αντίδραση, προστίθεται διάλυμα θειοκυανιούχου αμμωνίου το οποίο σχηματίζει θειοκυανιούχο σιδήρου (III). Τα προϊόντα μπορούν στη συνέχεια να μετρηθούν με χρωματομετρία. Η μέθοδος αυτή είναι απλή και εύκολη, με κύριο μειονέκτημα ότι είναι ευαίσθητη στο οξυγόνο του διαλύματος το οποίο μπορεί να επηρεάσει τη μέτρηση. Εκτός από τις ογκομετρικές (PV) και τις φασματομετρικές (συζυγή διένια) μεθόδους που παρουσιάζουν χαμηλή έως μεσαία εκλεκτικότητα και ευαισθησία σε ό,τι αφορά την ανίχνευση και προσδιορισμό των πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης, συχνά χρησιμοποιούνται χρωματογραφικές τεχνικές που είναι πολύ πιο ακριβείς για την εκάστοτε εξεταζόμενη ένωση και επιτρέπουν την καλύτερη ταυτοποίηση μεμονωμένων προϊόντων. Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) επιτρέπει την ανάλυση ενώσεων με διαφορετικά πτητικά χαρακτηριστικά, μοριακό βάρος ή πολικότητα. Οι Zeb και Murkovic (2010) βρήκαν την ισοκρατική HPLC-ESI- MS ως μια χρήσιμη μέθοδο για την ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό των οξειδωμένων μορφών των τριγλυκεριδίων (TAGs), δηλαδή τα μονο- και διυδροϋπεροξείδια Μέθοδοι προσδιορισμού δευτερογενών προϊόντων οξείδωσης Η μηλονική διαλδεΰδη (Malondialdehyde, MDA) είναι μία από τις κυριότερες αλδεΰδες που παράγονται κατά την δευτερογενή οξείδωση των λιπιδίων και συχνά χρησιμοποιείται ως δείκτης οξείδωσης. Για τον προσδιορισμό της, η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι η μέθοδος του 2-θειοβαρβιτουρικού οξέος (ΤΒΑ), η οποία δεν απαιτεί πολύπλοκο εξοπλισμό και θεωρείται εύκολη στην εκτέλεσή της. Αποτελεί μια εμπειρική μέθοδο που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της οξείδωσης των λιπιδίων σε διάφορα τρόφιμα, κυρίως σε κρέατα [Ganhão et al., 2011]. Το ΤΒΑ είναι ιδιαίτερα δραστικό με τις καρβονυλικές ενώσεις, όπως αλδεΰδες και κετόνες και κατά συνέπεια αντιδρά με την MDA σχηματίζοντας ένα κόκκινο φθορίζον σύμπλοκο που παρουσιάζει μέγιστο απορρόφησης στα 532 nm. Έτσι, μετρώντας την απορρόφηση στο συγκεκριμένο μήκος κύματος είναι δυνατή η ποσοτικοποίηση των δευτερογενών προϊόντων οξείδωσης. Το μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι το TBA εκτός από την MDA αντιδρά και με άλλες ενώσεις, όπως αλδεΰδες, υδατάνθρακες, αμινοξέα, κ.ά. που δεν αποτελούν προϊόντα οξείδωσης, 25

27 οδηγώντας σε υπερεκτιμημένη μέτρηση και αποτελέσματα που ποικίλλουν [Salih et al., 1987; Guillen-Sans & Guzman-Chozas, 1998]. Ο αριθμός π-ανισιδίνης (p-anisidine Value, p-av) αποτελεί μια χημική μέθοδο που χρησιμοποιείται επίσης για την εκτίμηση των δευτερογενών προϊόντων οξείδωσης που προκύπτουν από τη διάσπαση των υδροϋπεροξειδίων. Συγκεκριμένα προσδιορίζει την ποσότητα των αλδεϋδών (κυρίως των μη πτητικών αλδεϋδών: 2-αλκενάλη και 2,4-διενάλη) που αντιδρούν με την π-ανισιδίνη παρουσία οξικού οξέος σχηματίζοντας προϊόντα που εμφανίζουν μέγιστη απορρόφηση στα 350 nm. Η μέθοδος ενδείκνυται για έλαια που θερμαίνονται σε υψηλή θερμοκρασία, όπως κατά την διαδικασία του τηγανίσματος, όπου ο αριθμός της π-ανισιδίνης αυξάνεται έντονα λόγω σχηματισμού των δευτερογενών προϊόντων οξείδωσης [Lee et al., 2001]. Αποτελεί τυποποιημένη μέθοδο από την IUPAC (IUPAC 2.504) και την AOCS (AOCS Cd 18-90). Ο αριθμός υπεροξειδίων και ο αριθμός π-ανισιδίνης επιτρέπει τον υπολογισμό της συνολικής οξείδωσης (Totox value): Totox=2 x PV + p-av. Η τιμή αυτή συνδυάζει στοιχεία για την παρελθοντική αλλά και την τρέχουσα κατάσταση του ελαίου και χρησιμοποιείται συχνά για την εκτίμηση της έκτασης της οξείδωσης στη βιομηχανία τροφίμων. Τέλος, είναι δυνατή η μέτρηση των πτητικών δευτερογενών προϊόντων οξείδωσης (όπως υδρογονάνθρακες, αλδεΰδες, ενάλες, διενάλες, κετόνες και οργανικά οξέα) με τη μέθοδο της αέριας χρωματογραφίας. Η μέτρηση μπορεί να γίνει είτε επιλεκτικά για κάθε συστατικό είτε συνολικά για το περιεχόμενο σε πτητικές ενώσεις. Παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία και μπορεί να αποτυπώσει την αλλαγή της γεύσης του λίπους/ελαίου [Sun et al., 2011]. 26

28 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ 2.1 Πρόσθετα τροφίμων και νομοθεσία Σύμφωνα με τον σχετικό Κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1333/2008 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, τα πρόσθετα τροφίμων είναι φυσικές ή συνθετικές ουσίες με ή χωρίς θρεπτική αξία, οι οποίες δεν καταναλώνονται, συνήθως, ως τρόφιμα αυτά καθαυτά, αλλά προστίθενται σκοπίμως σε τρόφιμα, για τεχνολογικούς σκοπούς κατά την παρασκευή, τη μεταποίηση, την προετοιμασία, την επεξεργασία, τη συσκευασία, τη μεταφορά ή την αποθήκευση. Η προσθήκη αυτών των ουσιών μπορεί να έχει κύριο σκοπό τη βελτίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, τη σταθερότητα και τη συντήρηση των τροφίμων. Τα πρόσθετα αξιολογούνται για την ασφάλειά τους πριν να εγκριθούν. Εάν αποδειχθεί η τεχνολογική ανάγκη για τη χρήση τους και η ασφάλειά τους, δηλαδή ότι δεν παρουσιάζουν κανένα κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία, εγκρίνονται. Τα πιο σημαντικά κυβερνητικά όργανα που νομοθετούν, επιβάλλουν το νόμο και εποπτεύουν την έγκριση και τους κανονισμούς των πρόσθετων τροφίμων παγκοσμίως είναι η Ευρωπαϊκή Αρχή για την Ασφάλεια των Τροφίμων (European Food Safety Authority, EFSA) στην Ευρωπαϊκή Ένωση και ο Οργανισμός Φαρμάκων και Τροφίμων (Food and Drug Administration, FDA) στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Με την έγκριση των πρόσθετων, προσδιορίζεται σε ποια τρόφιμα επιτρέπεται η χρήση τους, οι όροι σύμφωνα με τους οποίους γίνεται η προσθήκη αυτή, καθώς και η ελάχιστη δόση που είναι απαραίτητη για την επίτευξη του επιθυμητού αποτελέσματος. Η ποσότητα που προστίθεται από κάθε πρόσθετο είναι αυστηρώς υπολογισμένη για κάθε τρόφιμο, έτσι ώστε η συνολική ημερήσια κατανάλωση ανά άτομο να μην υπερβαίνει την ενδεικτική ημερήσια πρόσληψη. Με άλλα λόγια θα πρέπει η ποσότητα που συσσωρεύεται από την καθημερινή κατανάλωση ενός συγκεκριμένου πρόσθετου να μην έχει οποιαδήποτε επικίνδυνη επίδραση στην υγεία. Αν αποδειχθεί ότι τα πρόσθετα δεν είναι ασφαλή για την ανθρώπινη υγεία, αναστέλλεται η χρήση τους γενικά ή σε συγκεκριμένα μόνο τρόφιμα [Carocho et al., 2014]. Στην Ευρωπαϊκή Ένωση, όλα τα πρόσθετα τροφίμων, εγκεκριμένα ή όχι, φέρουν το γράμμα Ε (που αντιπροσωπεύει την Ευρώπη) και έναν συγκεκριμένο τριψήφιο ή τετραψήφιο αριθμό. Αυτή η ονοματολογία επεκτάθηκε στην Επιτροπή του Κώδικα Τροφίμων (Codex Alimentarius Commission), έτσι ώστε να αναγνωρίζονται εύκολα τα πρόσθετα τροφίμων παγκοσμίως. 27

29 Στη συσκευασία όλων των τροφίμων υπάρχει υποχρεωτικά ο κατάλογος των συστατικών του, ο οποίος συνίσταται στην παράθεση όλων των συστατικών του τροφίμου κατά σειρά ελαττούμενης περιεκτικότητας ως προς το βάρος, συμπεριλαμβανομένων των πρόσθετων. Ο καταναλωτής μπορεί επομένως να ελέγξει ποια Εικόνα 2.1: Πρόσθετα τροφίμων πρόσθετα περιέχονται σε ένα τρόφιμο, διαβάζοντας την ετικέτα. Στον κατάλογο των συστατικών τα πρόσθετα αναφέρονται υποχρεωτικά με το όνομα της κατηγορίας και το ειδικό τους όνομα ή τον αριθμό Ε. Τα πρόσθετα ομαδοποιούνται σε κατηγορίες σύμφωνα με την κύρια λειτουργία τους. Ωστόσο η κατάταξη ενός πρόσθετου σε συγκεκριμένη κατηγορία δεν αποκλείει τη χρησιμοποίησή του και σε άλλες λειτουργίες. Εντός της ΕΕ, τα πρόσθετα τροφίμων χωρίζονται σε 26 λειτουργικές κατηγορίες, ανάλογα με τη λειτουργία τους στα τρόφιμα: γλυκαντικά, χρωστικές ουσίες, συντηρητικά, αντιοξειδωτικά, φορείς, οξέα, ρυθμιστές οξύτητας, αντισυσσωματοποιητικοί παράγοντες, αντιαφριστικά μέσα, παράγοντες διόγκωσης, γαλακτωματοποιητές, γαλακτωματοποιητικά άλατα, ενισχυτικά γεύσης, αφριστικοί παράγοντες, πηκτωματογόνοι παράγοντες, υλικά για γλασάρισμα, υγροσκοπικά μέσα, τροποποιημένα άμυλα, αέρια συσκευασίας, προωστικοί παράγοντες, διογκωτικοί παράγοντες, συμπλοκοποιητές, σκληρυντικοί παράγοντες, σταθεροποιητές, πυκνωτικά μέσα και βελτιωτικά αλεύρων [Regulation (EC) No 1333/2008]. Σύμφωνα με τον Οργανισμό Φαρμάκων και Τροφίμων (FDA), υπάρχουν περισσότερα από 3000 εγκεκριμένα πρόσθετα τροφίμων στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής, που μπορούν να χωριστούν σε 6 κύριες ομάδες: συντηρητικά, διατροφικά πρόσθετα, χρωστικές, παράγοντες γεύσης, παράγοντες υφής και διάφορους άλλους παράγοντες. Τα συντηρητικά μπορούν να χωριστούν σε 3 υποομάδες (αν και κάποια πρόσθετα μπορεί να ανήκουν ταυτόχρονα σε περισσότερες από 1 υποομάδες): αντιμικροβιακά, αντιοξειδωτικά και παράγοντες κατά του μαυρίσματος. Οι παράγοντες γεύσης επίσης μπορούν να χωριστούν σε γλυκαντικές ουσίες, φυσικές/συνθετικές γεύσεις και ενισχυτικά γεύσης. Οι παράγοντες υφής χωρίζονται σε γαλακτωματοποιητές και σταθεροποιητές. Τέλος, οι διάφοροι άλλοι παράγοντες αποτελούνται από πολλές κατηγορίες, όπως συμπλοκοποιητές, ένζυμα, αντιαφριστικά μέσα, υλικά για γλασάρισμα, καταλύτες, διαλύτες, λιπαντικά και προωστικούς παράγοντες [Branen & Haggerty, 2001]. 2.2 Αντιοξειδωτικά ως πρόσθετα τροφίμων Γενικά Τα αντιοξειδωτικά παίζουν κρίσιμο ρόλο στη βιομηχανία των τροφίμων και η προσθήκη τους αποτελεί μία από τις πιο διαδεδομένες μεθόδους για τη συντήρηση των τροφίμων. Το χαμηλό 28

30 τους κόστος και η ευκολία χρήσης τους τα έκαναν μέρος σχεδόν όλων των τροφίμων. Αν και διαφορετικές, όλες οι ομάδες αντιοξειδωτικών έχουν τον ίδιο στόχο: να διατηρήσουν τα τρόφιμα για όσο το δυνατόν μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, προστατεύοντάς τα από φαινόμενα ταγγισμού, όπως απώλεια γεύσης και χρώματος και ανάπτυξη δυσάρεστων οσμών [Carocho et al., 2017]. Στον Πίνακα 2.1 παρουσιάζονται τα μέχρι σήμερα εγκεκριμένα αντιοξειδωτικά από την Ευρωπαϊκή Ένωση με τους αντίστοιχους αριθμούς Ε και την ονομασία τους. Πίνακας 2.1: Εγκεκριμένα αντιοξειδωτικά πρόσθετα από την Ευρωπαϊκή Ένωση Ε 300 Ε 301 Ε 302 Ε 304 E 306 E 307 E 308 E 309 E 310 E 311 E 312 E 315 E 316 E 319 E 320 E 321 E 392 E 586 Ασκορβικό οξύ / Ascorbic acid Ασκορβικό νάτριο / Sodium ascorbate Ασκορβικό ασβέστιο / Calcium ascorbate Εστέρες λιπαρών οξέων με ασκορβικό οξύ / Fatty acid esters of ascorbic Εκχύλισμα πλούσιο σε τοκοφερόλες / Tocopherol-rich extract α-τοκοφερόλη / Alpha-tocopherol γ-τοκοφερόλη / Gamma-tocopherol δ-τοκοφερόλη / Delta-tocopherol Γαλλικός προπυλεστέρας / Propyl gallate Γαλλικός οκτυλεστέρας / Octyl gallate Γαλλικός δωδεκυλεστέρας / Dodecyl gallate Ερυθορβικό οξύ / Erythorbic acid Ερυθορβικό νάτριο / Sodium erythorbate Τριτοταγής βουτυλ-υδροκινόνη (TBHQ) / Tertiary-butyl hydroquinone (TBHQ) Βουτυλ-υδροξυανισόλη (BHA) / Butylated hydroxyanisole (BHA) Βουτυλ-υδροξυτολουόλιο (BHT) / Butylated hydroxytoluene (BHT) Εκχυλίσματα δενδρολίβανου / Extracts of rosemary 4-εξυλορεσορκινόλη / 4-Hexylresorcinol 29

31 Ως αντιοξειδωτικό σε τρόφιμο μπορεί να χαρακτηριστεί οποιαδήποτε ουσία που μπορεί να καθυστερήσει ή να αποτρέψει την ανάπτυξη ταγγισμού ή άλλης υποβάθμισης της γεύσης του τροφίμου λόγω οξείδωσης. Η προσθήκη αντιοξειδωτικών στα τρόφιμα καθυστερεί την ανάπτυξη ανεπιθύμητων γεύσεων ή οσμών επεκτείνοντας την περίοδο επώασης, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2.1. Η προσθήκη αντιοξειδωτικού μετά το τέλος αυτής της περιόδου τείνει να είναι αναποτελεσματική στην καθυστέρηση της ανάπτυξης ταγγισμού. Σχήμα 2.1: Αύξηση περιόδου επώασης (IP) λόγω προσθήκης αντιοξειδωτικού Κατηγορίες αντιοξειδωτικών Τα αντιοξειδωτικά μπορούν να παρεμποδίσουν ή να καθυστερήσουν την οξείδωση με δύο τρόπους: είτε δεσμεύοντας τις ελεύθερες ρίζες των λιπιδίων, οπότε η ουσία χαρακτηρίζεται ως πρωτογενές αντιοξειδωτικό, είτε με μηχανισμό που δεν περιλαμβάνει άμεση δέσμευση των ριζών, οπότε η ουσία χαρακτηρίζεται ως δευτερογενές αντιοξειδωτικό. Επίσης, τα αντιοξειδωτικά μπορούν να χωριστούν σε φυσικά και συνθετικά, όπως αναλύεται στη συνέχεια. Πρωτογενή αντιοξειδωτικά (primary or chain- breaking antioxidants) Τα πρωτογενή αντιοξειδωτικά αντιδρούν με τις ελεύθερες λιπιδικές ρίζες μετατρέποντάς τις σε πιο σταθερά προϊόντα. Η κύρια λιπιδική ρίζα σε κανονικές συνθήκες πίεσης οξυγόνου είναι η ρίζα υπεροξειδίου (ROO ), η οποία είναι οξειδωτικός παράγοντας που ανάγεται άμεσα στο αντίστοιχο ανιόν και στη συνέχεια σε υδροϋπεροξείδιο μέσω ενός δότη ηλεκτρονίου ή μετατρέπεται κατευθείαν σε υδροϋπεροξείδιο μέσω ενός δότη υδρογόνου (ΑΗ). Οι δύο περιπτώσεις μετατροπής της υπεροξειδικής ρίζας φαίνονται στις παρακάτω αντιδράσεις: 30

32 +e ROO ROO - H + ROOH (2.1) ROO + AH ROOH + A (2.2) Οι ρίζες αλκυλίων (R ), από την άλλη πλευρά, είναι αναγωγικοί παράγοντες και προσβάλλονται από αποδέκτες ηλεκτρονίων ως εξής: e R R + Αλκένιο + Η + (2.3) Η αναστολή που προκαλείται από τους αποδέκτες ηλεκτρονίων δεν είναι σημαντική στα περισσότερα συστήματα τροφίμων, αλλά μπορεί να γίνει σημαντική σε βιολογικούς ιστούς. Τα περισσότερα αντιοξειδωτικά τροφίμων επεμβαίνουν στην αυτοξείδωση των λιπιδίων μέσω ταχείας προσφοράς ατόμων υδρογόνου σε λιπιδικές ρίζες σύμφωνα με τις αντιδράσεις (2.2) και (2.4): RO + AH ROH + A (2.4) Εναλλακτικοί μηχανισμοί πρωτογενών αντιοξειδωτικών λαμβάνουν χώρα μόνο σε πολύ χαμηλές πιέσεις οξυγόνου, υψηλές συγκεντρώσεις αντιοξειδωτικού ή χαμηλούς ρυθμούς αλυσιδωτών αντιδράσεων έναρξης. Ένα μόριο είναι δυνατόν να δράσει σαν πρωτογενές αντιοξειδωτικό εφόσον μπορεί να δώσει άμεσα ένα άτομο υδρογόνου σε μια λιπιδική ρίζα και εφόσον η ρίζα που προκύπτει από το αντιοξειδωτικό είναι πιο σταθερή από τη λιπιδική ρίζα ή μετατρέπεται σε άλλα σταθερά προϊόντα [Gordon, 2012]. Τα κυριότερα πρωτογενή αντιοξειδωτικά είναι οι φαινολικές ενώσεις, όπως η βουτυλιωμένη υδροξυανισόλη (BHΑ), το βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο (BHT), η τριτοταγής βουτυλιωμένη υδροκινόνη (TBHQ) (συνθετικά αντιοξειδωτικά), οι τοκοφερόλες και τα καροτενοειδή (φυσικά αντιοξειδωτικά). Δευτερογενή αντιοξειδωτικά (secondary or preventive) Ως δευτερογενή αντιοξειδωτικά χαρακτηρίζονται οι ουσίες που επιβραδύνουν τον ρυθμό της αυτοξείδωσης των λιπιδίων μέσω μιας ποικιλίας διαφορετικών μηχανισμών που δεν περιλαμβάνουν τη δέσμευση των ελευθέρων ριζών των λιπιδίων. Τέτοιοι μηχανισμοί είναι για παράδειγμα η δέσμευση ιόντων μετάλλων ή οξυγόνου, η μετατροπή των υδροϋπεροξειδίων σε μη δραστικά είδη, η απορρόφηση υπεριώδους ακτινοβολίας ή η απενεργοποίηση του οξυγόνου απλής διεγερμένης κατάστασης (μονήρες οξυγόνο). Συνήθως, τα δευτερογενή αντιοξειδωτικά εμφανίζουν αντιοξειδωτική δράση παρουσία κάποιας άλλης δευτερεύουσας ουσίας, όπως στην 31

33 περίπτωση του ασκορβικού οξέος το οποίο είναι αποτελεσματικό μόνο παρουσία τοκοφερολών ή άλλων πρωτογενών αντιοξειδωτικών [Gordon, 2001]. Δευτερογενή αντιοξειδωτικά αποτελούν και τα συνεργιστικά αντιοξειδωτικά τα οποία μπορούν να χωριστούν σε δύο κύριες υποκατηγορίες: σε δεσμευτές οξυγόνου (oxygen scavengers) και σε χηλικούς παράγοντες μετάλλων (chelators). Τα συνεργιστικά δρουν με ποικίλους τρόπους, κυρίως ως δότες υδρογόνου σε φαινολικές ρίζες, αναγεννώντας έτσι το πρωτογενές αντιοξειδωτικό ή αντιδρώντας με το οξυγόνο και απομακρύνοντάς το. Γι αυτό και τα φαινολικά αντιοξειδωτικά μπορούν να χρησιμοποιούνται σε αρκετά μικρές συγκεντρώσεις εάν προστεθεί ταυτόχρονα στο τρόφιμο και ένα συνεργιστικό αντιοξειδωτικό. Επίσης τα συνεργιστικά αντιοξειδωτικά παρέχουν ένα όξινο μέσο το οποίο βελτιώνει τη σταθερότητα των πρωτογενών αντιοξειδωτικών. Οι δεσμευτές οξυγόνου όπως το ασκορβικό οξύ, το παλμιτικό ασκορβύλιο, θειώδη ερυθορβικά άλατα αντιδρούν με το ελεύθερο οξυγόνο και το απομακρύνουν από ένα κλειστό σύστημα. Το ασκορβικό οξύ και το παλμιτικό ασκορβύλιο δρουν επίσης συνεργιστικά με πρωτογενή αντιοξειδωτικά, κυρίως τις τοκοφερόλες. Χηλικές ενώσεις, όπως το αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), το κιτρικό οξύ και τα φωσφορικά δεν είναι αντιοξειδωτικά, αλλά είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικά ως συνεργιστικές ουσίες τόσο με πρωτογενή αντιοξειδωτικά όσο και με δεσμευτές οξυγόνου. Σχηματίζουν σταθερά σύμπλοκα με προοξειδωτικά μέταλλα όπως ο σίδηρος και ο χαλκός, που αυξάνουν αισθητά την ενέργεια ενεργοποίησης των αντιδράσεων έναρξης [Madhavi et al., 1995]. Τα ένζυμα έχουν αξιολογηθεί ως νέα είδη αντιοξειδωτικών στα τρόφιμα. Για παράδειγμα, η υπεροξειδική δισμουτάση (Superoxide Dismutase, SOD) καταλύει την αποσύνθεση του ανιόντος υπεροξειδίου (Ο2 ), ενώ το ένζυμο της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης σεληνίου (Seleno enzyme Glutathione peroxidase, GSH) καταλύει την αναγωγή των υδροϋπεροξειδίων παράγοντας γλουταθειόνη [Pokorný et al., 2001]. Συνθετικά αντιοξειδωτικά Τα συνθετικά αντιοξειδωτικά είναι καθαρές ενώσεις που προστίθενται στα τρόφιμα με σκοπό την προστασία τους από τα φαινόμενα οξείδωσης και την παράταση της διάρκειας ζωής τους. Η παραγωγή συνθετικών αντιοξειδωτικών για προσθήκη σε τρόφιμα γίνεται προς όφελος των καταναλωτών και συνοδεύεται από εξελιγμένες και δαπανηρές δοκιμές με σκοπό την προστασία της υγείας από ενδεχόμενους κινδύνους [Pokorný, 2007]. Σήμερα σχεδόν όλα τα επεξεργασμένα τρόφιμα έχουν ενσωματωμένα συνθετικά αντιοξειδωτικά που αναφέρονται ως ασφαλή, παρότι κάποιες μελέτες δείχνουν το αντίθετο [Carocho & Ferreira, 2013]. Πρόκειται για φαινολικά παράγωγα που έχουν την ικανότητα να τερματίζουν την αλυσιδωτή αντίδραση των ελευθέρων ριζών των λιπαρών οξέων χάρη στη φαινολική δομή που διαθέτουν. Το φαινύλιο που περιέχεται στο μόριο αυτών των αντιοξειδωτικών ενεργεί ως δότης πρωτονίων και 32

34 εμποδίζει τον σχηματισμό νέων ελεύθερων ριζών. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση της έναρξης της αυτοξείδωσης των λιπών και την επιβράδυνσή της στη συνέχεια. Οι ελεύθερες ρίζες του αντιοξειδωτικού που σχηματίζονται κατά την αντίδραση αυτή είναι σταθερές και συνεπώς δεν οξειδώνονται περαιτέρω. Τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα συνθετικά αντιοξειδωτικά είναι τα BHT, BHΑ, TBHQ και ο προπυλεστέρας γαλλικού οξέος (PG), όπως φαίνονται στην Εικόνα 2.2. Εικόνα 2.2: Δομές των κυριότερων συνθετικών αντιοξειδωτικών Φυσικά αντιοξειδωτικά Τα τελευταία χρόνια υπάρχει μια γενική τάση αντικατάστασης των συνθετικών αντιοξειδωτικών στην επεξεργασία των τροφίμων με την προσθήκη φυσικών ουσιών που λόγω της αντιοξειδωτικής τους δράσης παρεμποδίζουν την οξείδωση. Τα φυσικά αντιοξειδωτικά περιλαμβάνουν φαινολικές και πολυφαινολικές ενώσεις, χηλικές ενώσεις, αντιοξειδωτικές βιταμίνες και ένζυμα, καροτενοειδή και καρνοσίνη. Η παρουσία φαινολών στα φυτά θεωρείται ότι τα προστατεύει από τραυματισμούς του ιστού τους [Shahidi, 1997]. Οι μηχανισμοί με τους οποίους αυτά τα αντιοξειδωτικά συμμετέχουν στον έλεγχο της αυτοξείδωσης των τροφίμων και στην προστασία από φαινόμενα ταγγισμού είναι ποικίλοι και εξαρτώνται από τον τύπο και την προέλευση του φυτού [Shahidi, 2000]. Πηγές φυσικών αντιοξειδωτικών αποτελούν τα μπαχαρικά, τα βότανα, το τσάι, τα έλαια, οι σπόροι, τα δημητριακά, το κέλυφος κακάο, τα φρούτα και τα λαχανικά. Οι ερευνητές επικεντρώνονται στο ασκορβικό οξύ, στις τοκοφερόλες και τα καροτενοειδή, όπως επίσης και σε φυτικά εκχυλίσματα που περιέχουν ποικιλία αντιοξειδωτικών όπως φλαβονοειδή (κερκετίνη, καμφερόλη, μυρικετίνη), κατεχίνες ή φαινόλες (καρνοσόλη, ροσμανόλη) και φαινολικά οξέα (καρνοσικό οξύ, ροσμαρινικό οξύ) [Yanishlieva et al., 2001]. Στη συνέχεια αναλύονται τα σημαντικότερα είδη των φυσικών αντιοξειδωτικών. 33

35 Τοκοφερόλες Οι τοκοφερόλες απαντώνται στα φυτικά έλαια και είναι από τα περισσότερο γνωστά και ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιοξειδωτικά. Πρόκειται για μονοφαινολικά συστατικά και μπορούν να διακριθούν σε τοκόλες και τοκοτριενόλες. Και οι δύο ομάδες συναντώνται σε τέσσερα ισομερή (α-, β-, γ- και δ- τοκοφερόλες) ανάλογα με τον αριθμό και τη θέση των μεθυλομάδων στον αρωματικό δακτύλιο (Εικόνα 2.3). Τα περισσότερα φυτικά έλαια περιέχουν τοκοφερόλες σε συγκέντρωση υψηλότερη των 500 ppm. Για παράδειγμα, το φοινικέλαιο περιέχει τοκόλες σε επίπεδα ppm και τοκοτριενόλες ppm [Choe & Min, 2009]. Στις τοκόλες, οι οποίες αναφέρονται ως τοκοφερόλες, η πλευρική ανθρακική αλυσίδα είναι κορεσμένη, ενώ στις τοκοτριενόλες ακόρεστη. Η αντιοξειδωτική τους δράση βασίζεται στην προσφορά ενός υδρογόνου από την υδροξυλική τους ομάδα στις ελεύθερες ρίζες των λιπιδίων [Pokorný et al., 2001] και εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το είδος του τροφίμου στο οποίο προστίθενται, τη συγκέντρωσή τους, την περίσσεια του οξυγόνου και την παρουσία καταλυτικών μετάλλων. Οι τοκοφερόλες μπορεί να εμφανίσουν προοξειδωτική δράση όταν περιέχονται στο τρόφιμο σε υψηλά επίπεδα συγκέντρωσης και παρουσία σιδήρου ή χαλκού. Για να έχουν ικανοποιητική αντιοξειδωτική δράση, συνήθως χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με ασκορβικό οξύ, κιτρικό οξύ ή αμινοξέα που δρουν ως συμπλοκοποιητές μετάλλων. Η δραστικότητά τους μειώνεται με την ακόλουθη σειρά [Pokorný, 1991]: δ-τοκοφερόλη > γ-τοκοφερόλη > β-τοκοφερόλη > α-τοκοφερόλη Εικόνα 2.3: Δομές α-, β-, γ- και δ- τοκοφερολών και τοκοτριενολών Καροτενοειδή Τα καροτένια και τα διάφορα καροτενοειδή περιέχονται σε πολλά φυτά και συχνά χρησιμοποιούνται ως φυσικές χρωστικές ουσίες. Ωστόσο, εμφανίζουν και αντιοξειδωτική 34

36 δράση, κυρίως παρουσία φωτός. Η παρουσία των καροτενοειδών σε εδώδιμα έλαια μπορεί να παρεμποδίσει την προσβολή των λιπαρών οξέων από το ενεργό οξυγόνο στη διεγερμένη κατάσταση ( 1 Ο2). Επίσης, τα καροτενοειδή, όπως είναι η ασταξανθίνη και η κανθαξανθίνη, είναι ικανά να εμποδίζουν τη διάδοση των ελευθέρων ριζών, λόγω των πολλαπλών συζυγιακών διπλών δεσμών που περιέχουν στο μόριό τους [Pokorný, 1991]. Φαινολικά οξέα Τα φαινολικά οξέα απαντώνται ευρέως σε όλα τα φυτά. Μερικά από τα πιο σημαντικά φαινολικά οξέα είναι τα εξής: ροσμαρινικό, καφεϊκό, π- κουμαρικό, φερουλικό, σιναπικό, χλωρογενικό, συριγγικό, βανιλλικό, π- υδροξυβενζοϊκό, 3,4- διυδροξυβενζοϊκό. Οι δομές ορισμένων από τα παραπάνω φαινολικά οξέα φαίνονται στην Εικόνα 2.4. Η θέση και ο βαθμός υδροξυλίωσης είναι σημαντικοί παράγοντες της αντιοξειδωτικής ικανότητας των φαινολικών οξέων. Σύμφωνα με μελέτες, τα μονοφαινολικά φαίνεται να είναι λιγότερο αποτελεσματικά από τα πολυφαινολικά. Η εισαγωγή μιας δεύτερης υδροξυλομάδας στην όρθο (π.χ. καφεϊκό) ή στην πάρα θέση (π.χ. πρωτοκατεχικό οξύ) αυξάνει την αντιοξειδωτική δράση, κάνοντας τα φαινολικά αυτά οξέα πιο αποτελεσματικά από τα αντίστοιχα μονοφαινολικά π- υδροξυβενζοϊκό οξύ και π- κουμαρικό οξύ. Επίσης, η αντιοξειδωτική δράση των μονοφαινολών αυξάνεται σημαντικά με ένα ή δύο μεθοξυ- υποκαταστάτες στις όρθο θέσεις του υδροξυλίου. Για παράδειγμα, το σιναπικό οξύ είναι πιο αποτελεσματικό από το φερουλικό, το οποίο με τη σειρά του δείχνει καλύτερη αντιοξειδωτική δράση από το π- κουμαρικό, ενώ το συριγγικό είναι πιο αποτελεσματικό από το βανιλλικό και το π- υδροξυβενζοϊκό οξύ [Rice- Evans et al., 1996; Pokorný et al., 2001]. Εικόνα 2.4: Δομές των κυριότερων φαινολικών οξέων Η αντιοξειδωτική ικανότητα των φαινολικών οξέων εξαρτάται από το ph. Εμφανίζουν καλή αποτελεσματικότητα σε ph που κυμαίνεται μεταξύ των τιμών 7-8. Η χρήση των φαινολικών οξέων ως αντιοξειδωτικά σε έλαια είναι περιορισμένη λόγω των προβλημάτων της διαλυτότητάς 35

37 τους. Αναφέρεται πως η α- τοκοφερόλη με το ροσμαρινικό ή το καφεϊκό οξύ και η κατεχίνη με το καφεϊκό οξύ δρουν ως ανταγωνιστικά αντιοξειδωτικά [Choe & Min, 2009]. Φλαβονοειδή Τα φλαβονοειδή αποτελούν μια ομάδα φαινολικών ουσιών, οι οποίες συναντώνται ευρέως στο φυτικό βασίλειο σε σημαντικές ποσότητες ( %) [Jovanovic et al., 1994]. Λόγω της αντιοξειδωτικής τους δράσης έχουν πολλές ευεργετικές ιδιότητες για την υγεία του ανθρώπου. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ικανότητά τους να αναστέλλουν την οξείδωση της LDL χοληστερίνης με αποτέλεσμα να επιδεικνύουν μοναδική καρδιοπροστατευτική δράση [Heim et al., 2002]. Σε πρόσφατες μελέτες, η ικανότητα των φλαβονοειδών να αδρανοποιούν οργανικές υπεροξειδικές ρίζες βρέθηκε να είναι τουλάχιστον συγκρίσιμη, αν όχι και μεγαλύτερη σε σχέση με συνθετικά φαινολικά αντιοξειδωτικά, όπως τα ΒΗΤ και ΒΗΑ [Jovanovic et al., 1994]. Η βασική δομή των φλαβονοειδών αποτελείται από δύο βενζολικούς δακτυλίους (Α και Β) ενωμένους με μία γέφυρα τριών ατόμων (C), δηλαδή φέρει τη διαμόρφωση C6C3C6. Μάλιστα σε πολλές περιπτώσεις η γέφυρα των τριών ατόμων C αποτελεί τμήμα ενός τρίτου ετεροκυκλικού δακτυλίου (Εικόνα 2.4). Εικόνα 2.5: Βασική δομή φλαβονοειδών Η υποκατάσταση του C- δακτυλίου έχει ως αποτέλεσμα την κατηγοριοποίηση των φλαβονοειδών σε διάφορες οικογένειες, όπως [Montoro et al., 2005]: Φλαβονόλες (π.χ. κερκετίνη και καμφερόλη) Φλαβόνες (π.χ. λουτεολίνη, απιγενίνη και χρυσίνη) Φλαβανόλες (π.χ. κατεχίνη) Ισοφλαβόνες (π.χ. γενιστεΐνη) Τα φλαβονοειδή δρουν ως αντιοξειδωτικά κυρίως παγιδεύοντας ρίζες οι οποίες περιλαμβάνουν ανιόντα υπεροξειδίου (Ο2 -), υπεροξειδικές ρίζες των λιπιδίων (LOO ) και ρίζες υδροξυλίου (ΟΗ ) [Pokorný et al., 2001]. Η δραστικότητά τους ως αντιοξειδωτικά εξαρτάται από τη δομή και 36

38 κυρίως τη διαμόρφωση του Β δακτυλίου και είναι άμεσα ανάλογη με τον αριθμό των ομάδων υδροξυλίου που περιέχουν [Cao et al., 1997]. Άλλοι μηχανισμοί επιλεγμένων φλαβονοειδών περιλαμβάνουν αποδιέγερση του οξυγόνου απλής διεγερμένης κατάστασης (singlet oxygen quenching) και χηλίωση μετάλλων (metal chelation) [Μπράβου, 2015]. Η αντιοξειδωτική δράση των φλαβονοειδών οφείλεται κατά κύριο λόγο στην προσφορά ατόμων Η από τους υδροξυ-υποκαταστάτες στις ελεύθερες ρίζες, περιορίζοντας εξαιρετικά τη δραστικότητα των τελευταίων. Επειδή δεν έχουν όλα τα υδροξύλια την ίδια ικανότητα προσφοράς ατόμου Η και τα πιθανά είδη ΟΗ- υποκατάστασης είναι πάρα πολλά, τα φλαβονοειδή παρουσιάζουν μεγάλη διαβάθμιση στη δραστικότητά τους [Τσιμογιάννης, 2008]. Έχει αποδειχθεί ότι τη μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση παρέχουν τα φλαβονοειδή με την εξής δομή [Pokorný et al., 2001; Tsimogiannis et al., 2007]: διυδροξυδική δομή στον Β δακτύλιο 2,3- διπλό δεσμό σε συνδυασμό με μια 4- οξο-ομάδα (ομάδα =Ο στη θέση 4 στον C δακτύλιο Παρουσία μιας 3- υδροξυλικής ομάδας στον C δακτύλιο και μιας 5- υδροξυλικής ομάδας στον Α δακτύλιο Ενώ τα φλαβονοειδή ανήκουν κατά βάση στα πρωτογενή αντιοξειδωτικά, μπορούν να λειτουργήσουν και ως χηλικοί παράγοντες, εφόσον η οξείδωση καταλύεται από μέταλλα. Σαφώς, η διπλή τους δράση δεν αποτελεί απλώς ένα θετικό προσθετικό φαινόμενο. Ένα αποτελεσματικό φλαβονοειδές που δρα ως δεσμευτής ελευθέρων ριζών, θα μπορούσε να εμφανίσει χαμηλότερη δραστικότητα ή ακόμη και προοξειδωτική συμπεριφορά σε περίπτωση καταλυόμενης από κάποιο μέταλλο οξείδωσης. Εάν για παράδειγμα το φλαβονοειδές συμπλοκοποιούμενο με το μέταλλο αυξάνει τη λιποδιαλυτότητά του και παράλληλα δεν παρέχει ικανοποιητική στερεοχημική παρεμπόδιση, το μέταλλο ενδέχεται να αλληλεπιδράσει με τα λιπίδια εκκινώντας τα οξειδωτικά φαινόμενα, δράση που δεν θα ήταν σε θέση να επιτελέσει χωρίς το φλαβονοειδές, λόγω της χαμηλής λιποδιαλυτότητάς του [Τσιμογιάννης, 2008]. Γενικά, η έγκριση ενός αντιοξειδωτικού για χρήση στα τρόφιμα απαιτεί εκτεταμένες τοξικολογικές μελέτες που αφορούν σε μεταλλαξιογόνες, καρκινογόνες και τερατογόνες δράσεις. Παρότι πολλές ενώσεις- τόσο συνθετικές όσο και φυσικές- έχουν αντιοξειδωτικές ιδιότητες, μόνο λίγες από αυτές έχουν γίνει αποδεκτές ως «γενικά αναγνωρισμένες ως ασφαλείς» ( generally recognized as safe, GRAS ) για χρήση στα τρόφιμα από διεθνείς οργανισμούς [Madhavi et al., 1995]. Τα φυσικά αντιοξειδωτικά παρότι έχουν αρκετά πλεονεκτήματα έναντι των συνθετικών και προτιμώνται από τους καταναλωτές, εκτός από αντιοξειδωτικές ενώσεις περιέχουν και άλλα ποικίλα συστατικά, η επικινδυνότητα των οποίων δεν είναι ακόμα εντελώς γνωστή. Επιπλέον υψηλές συγκεντρώσεις αντιοξειδωτικών μπορεί να είναι αναποτελεσματικές ή ακόμα και ανεπιθύμητες, καθώς οι ελεύθερες ρίζες δεν πρέπει να 37

39 εξαλειφθούν, αλλά να μειωθεί η συγκέντρωσή τους. Σε μεγάλες συγκεντρώσεις, τα φαινολικά αντιοξειδωτικά αντιδρούν με τις πρωτεΐνες και η αντιοξειδωτική τους δράση μειώνεται [Pokorný, 2007] Χρήση αντιοξειδωτικών στο τηγάνισμα Η προσθήκη αντιοξειδωτικών σε έλαια τηγανίσματος έχει ως σκοπό την επιβράδυνση της οξείδωσης των ελαίων κατά το τηγάνισμα. Επιπλέον, τα αντιοξειδωτικά παίζουν σημαντικό ρόλο και στην αποθήκευση των τηγανισμένων προϊόντων αφού καθυστερούν την οξείδωση και παρατείνουν τη διάρκεια ζωής τους. Τα συνθετικά αντιοξειδωτικά που χρησιμοποιούνται συχνότερα στο τηγάνισμα σε διάφορες μελέτες είναι το ΒΗΑ, το ΒΗΤ, το TBHQ και ο γαλλικός προπυλεστέρας. Το ΒΗΑ και το ΒΗΤ είναι πτητικά και εύκολα αποσυντίθενται σε υψηλές θερμοκρασίες, ενώ ο γαλλικός προπυλεστέρας είναι λιγότερο πτητικός από το TBHQ. Οι Augustin και Berry (1984) σύγκριναν την αντιοξειδωτική δράση των TBHQ, ΒΗΑ και ΒΗΤ κατά τη διάρκεια τηγανίσματος tapioca τσιπς σε φοινικέλαιο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το TBHQ είχε τη καλύτερη αντιοξειδωτική δράση τόσο στο τηγανισμένο έλαιο όσο και στο έλαιο που απορροφήθηκε στα τσιπς κατά την αποθήκευσή τους σε θερμοκρασία δωματίου. Το TBHQ θεωρείται το καλύτερο αντιοξειδωτικό για τα τηγανισμένα προϊόντα και χρησιμοποιείται κυρίως στις Η.Π.Α., ενώ απαγορεύεται η χρήση του στην Ευρώπη και στην Ιαπωνία εξαιτίας της έλλειψης τοξικολογικών μελετών [Χούχουλα, 2003]. Τα τελευταία χρόνια, η χρήση συνθετικών αντιοξειδωτικών, όπως BHT, BHA και TBHQ, ειδικά υπό συνθήκες τηγανίσματος, έχει περιοριστεί καθώς δεν παρουσιάζουν ικανοποιητική απόδοση και θεωρούνται επικίνδυνα για την ανθρώπινη υγεία [Frankel, 2007]. Συνεπώς, το ενδιαφέρον στρέφεται στην ανάπτυξη νέων αντιοξειδωτικών που προέρχονται από φυσικές πηγές με βελτιωμένη αντιοξειδωτική δράση και θερμική σταθερότητα. Ειδικά τα φυτικά εκχυλίσματα από βότανα και μπαχαρικά έχουν προταθεί ότι σταθεροποιούν τόσο τα έλαια κατά τη διάρκεια του τηγανίσματος όσο και τα τηγανισμένα προϊόντα [Houhoula et al., 2003]. Αν και τα φυτικά εκχυλίσματα και οι πολυφαινόλες παρουσιάζουν καλή αντιοξειδωτική δράση σε εφαρμογές τηγανίσματος, ωστόσο ένα βασικό τους μειονέκτημα είναι η χαμηλή τους διαλυτότητα στα έλαια. Για βελτιωμένη αποτελεσματικότητα, απαιτείται το εφαρμοζόμενο αντιοξειδωτικό να είναι διαλυτό ή βέλτιστα διασκορπισμένο στο υπόστρωμα [Aladedunye et al., 2017]. Οι Che Man & Jaswir (2000) μελέτησαν την επίδραση εκχυλισμάτων δενδρολίβανου και φασκόμηλου κατά τη διάρκεια τηγανίσματος τσιπς πατάτας σε φοινικέλαιο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και τα δύο φυτά καθυστέρησαν την αλλοίωση του ελαίου και αύξησαν τη διάρκεια ζωής των τσιπς πατάτας κατά την αποθήκευσή τους. Το ποσοστό των πολυμερισμένων τριγλυκεριδίων μειώθηκε από 0.71 % σε 0.44 % και 0.39 % μετά την προσθήκη δενδρολίβανου και φασκόμηλου αντίστοιχα σε συγκέντρωση 200 ppm. Οι Che Man & Tan (1999) μελέτησαν επίσης την επίδραση εκχυλίσματος δενδρολίβανου και φασκόμηλου σε συγκέντρωση 200 ppm. 38

40 Τα εκχυλίσματα έδειξαν καλή αντιοξειδωτική δράση, καθώς παρατηρήθηκε χαμηλότερη συγκέντρωση του ποσοστού των συζυγών διενίων και τριενίων μετά την προσθήκη των εκχυλισμάτων. Οι Gordon & Kourimska (1995) συνέκριναν την αντιοξειδωτική δράση του παλμιτικού ασκορβυλίου και εκχυλίσματος δενδρολίβανου σε συγκεντρώσεις 200 ppm και 1000 ppm αντίστοιχα κατά τη διάρκεια τηγανίσματος πατάτας σε κραμβέλαιο. Το παλμιτικό ασκορβύλιο παρουσίασε καλύτερη αντιοξειδωτική δράση, καθώς η συγκέντρωση των διμερών βρέθηκε χαμηλότερη στο τηγανισμένο έλαιο μετά την προσθήκη του αντιοξειδωτικού. Ωστόσο, μετά από ανάλυση του τηγανισμένου ελαίου βρέθηκε ότι το ποσοστό των τοκοφερολών στο κραμβέλαιο μειώθηκε λιγότερο στα δείγματα που προστέθηκε εκχύλισμα δενδρολίβανου και παλμιτικού ασκορβυλίου σε σύγκριση με αυτά χωρίς την προσθήκη του αντιοξειδωτικού. Άλλες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί δείχνοντας ότι εμπορικό εκχύλισμα από δενδρολίβανο καθυστερεί τον σχηματισμό διμερών τριγλυκεριδίων, καθώς και την απώλεια τοκοφερολών στα έλαια κατά το τηγάνισμα. Το αιθανολικό εκχύλισμα από το καρύκευμα Satureja hortensis L, το οποίο ευδοκιμεί στη Βουλγαρία, βελτίωσε την οξειδωτική σταθερότητα του ηλιέλαιου σε θερμοκρασία τηγανίσματος [Yanishlieva et al., 1997]. Σύμφωνα με τους Zandi & Gordon (1999), το μεθανολικό εκχύλισμα από φύλλα τσαγιού αποδείχθηκε τόσο δραστικό όσο και το εκχύλισμα δενδρολίβανου στην καθυστέρηση της οξείδωσης του ελαίου κατά το τηγάνισμα τσιπς σε συνεχή διεργασία. Οι Tian & White (1994) μελέτησαν την επίδραση μεθανολικού εκχυλίσματος βρώμης σε βαμβακέλαιο κατά τη θέρμανση στους 180 C και αποδείχθηκε ότι η αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος ήταν μεγαλύτερη σε συγκέντρωση % από ότι σε συγκέντρωση %. Οι Jaswir et al. (2000) μελέτησαν τη δράση φυσικών αντιοξειδωτικών από δενδρολίβανο, φασκόμηλο και κιτρικό οξύ σε εξευγενισμένο και αποσμημένο φοινικέλαιο κατά τη διάρκεια επαναλαμβανόμενων τηγανισμάτων τσιπς πατάτας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης, έπειτα από 5 ημέρες επαναλαμβανόμενων τηγανισμάτων τα τρία αυτά φυσικά αντιοξειδωτικά μείωσαν σημαντικά (P< 0.05) τον ρυθμό οξείδωσης του ελαίου κατά το τηγάνισμα και επηρέασαν σημαντικά (P< 0.05) τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των τσιπς πατάτας, όπως εμφάνιση, γεύση, οσμή και τη γενικότερη αποδοχή. Οι Lalas & Dourtoglou (2003) επίσης μελέτησαν τη χρήση δενδρολίβανου κατά τη διάρκεια διαλείποντος τηγανίσματος τσιπς πατάτας σε σογιέλαιο και παρατήρησαν ότι το δενδρολίβανο βελτίωσε την αντίσταση στον οξειδωτικό ταγγισμό (μείωση της περιόδου επώασης), τόσο για το τηγανισμένο έλαιο όσο και για το έλαιο που είχε απορροφηθεί από τα τσιπς πατάτας. Οι Lolos et al. (1999) μελέτησαν την αντιοξειδωτική δράση εκχυλίσματος ρίγανης κατά την αποθήκευση τσιπς πατάτας στους 63 C. Η προσθήκη του εκχυλίσματος έγινε στο προϊόν μετά το τηγάνισμα. Η αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος στα τσιπς βρέθηκε να είναι ικανοποιητική, αλλά κατώτερη του TBHQ, το οποίο προστέθηκε στο έλαιο τηγανίσματος. Επίσης, μελέτησαν την προσθήκη σκόνης ρίγανης σε σύγκριση με το TBHQ στα τηγανισμένα τσιπς κατά την αποθήκευση στους 63 C. Τα 39

41 αποτελέσματα έδειξαν ότι η σκόνη ρίγανης παρουσίασε σχεδόν την ίδια αντιοξειδωτική προστασία με το TBHQ τις πρώτες ημέρες, αλλά κατώτερη στη συνέχεια. Δενδρολίβανο Τα αρωματικά φυτά είναι γνωστά από την αρχαιότητα για τις ευεργετικές τους ιδιότητες. Η υψηλή περιεκτικότητα σε πολυφαινόλες τα καθιστά πηγές ισχυρών αντιοξειδωτικών ουσιών και το ενδιαφέρον για χρήση των εκχυλισμάτων τους ως πρόσθετα τροφίμων αυξάνεται ολοένα και περισσότερο. Ειδικότερα, το δενδρολίβανο (Rosmarinus officinalis) αποτελεί ένα ισχυρό αρωματικό φυτό που ανήκει στην οικογένεια Lamiaceae ή Labiatae προερχόμενο από την περιοχή της Μεσογείου. Η ονομασία του προέρχεται από τις λατινικές λέξεις ros (δροσιά) και marinus (θάλασσα) που σημαίνει «δροσιά της θάλασσας». Εικόνα 2.6 :Δενδρολίβανο (Rosmarinus officinalis) Δραστικές ενώσεις δενδρολίβανου Ένας μεγάλος αριθμός πολυφαινολικών ενώσεων με αντιμικροβιακή και αντιοξειδωτική δραστηριότητα και παρουσία φαινολικών διτερπενίων έχουν εντοπιστεί στα φύλλα, στα άνθη και στις ρίζες του δενδρολίβανου (Balasundram et al. 2006). Τα ενεργά συστατικά του δενδρολίβανου είναι τα: α-πινένιο (C10H16), 1,8 κινεόλη (C10H18O), καμφορά, ροσμανόλη, ισοροσμανόλη, ροσμαρινικό οξύ, καρνοσόλη (C20H26O4), καρνοσικό οξύ (C20H28O4), βορνεόλη και α-τερπινεόλη [Daferera et al., 2000; Pintore et al., 2002]. Μαζί με το φασκόμηλο, το δενδρολίβανο είναι ευρέως αποδεκτό ως ένα από τα αρωματικά φυτά με την μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση. Πολλές μελέτες για τις αντιοξειδωτικές ουσίες του δενδρολίβανου δείχνουν ότι οι πιο δραστικές ενώσεις είναι τα φαινολικά διτερπένια: καρνοσικό οξύ και καρνοσόλη [Aruoma et al., 1992], η δομή των οποίων φαίνεται στην Εικόνα 2.7. Οι ενώσεις αυτές αποτελούν τουλάχιστον το 90 % των συνολικών φαινολικών διτερπενίων του δενδρολίβανου. Το καρνοσικό οξύ κατά τη διάρκεια των κατεργασιών που υφίσταται το φυτό, μετατρέπεται σε άλλες φαινολικές ενώσεις, κυρίως σε καρνοσόλη και σε μικρότερο βαθμό σε ροσμανόλη, επιροσμανόλη, 7- μεθυλοεπιρομανόλη, και σε καρνοσικό μεθυλεστέρα (Richheimer et al., 1996]. 40

42 Εικόνα 2.7: Δομές καρνοσικού οξέος και καρνοσόλης Σύμφωνα με τους Hernández-Hernández et al. (2009), από τα νωπά φύλλα δενδρολίβανου μπορούν να ληφθούν καρνοσικό οξύ, καρνοσόλη και ροσμαρινικό οξύ σε συγκεντρώσεις ± 0.196, ± και ± mg/ mg εκχυλίσματος αντίστοιχα. Οι del Baño et al. (2003) αναφέρουν πως τα προϊόντα δενδρολίβανου (αιθέριο έλαιο και αποσταγμένα εκχυλίσματα των φύλλων του) παρουσιάζουν διαφορές ως προς την περιεκτικότητά τους σε πολυφαινόλες και αυτό οφείλεται στην υπάρχουσα ποικιλομορφία, στις κλιματικές συνθήκες και στο χρόνο συγκομιδής τους. Οι Schwarz et al. (1992) αναφέρουν ότι τα φαινολικά διτερπένια είναι μέχρι στιγμής τα πιο γνωστά συστατικά που θα μπορούσαν να ανιχνευτούν από το δενδρολίβανο και ένας αξιόπιστος προσδιορισμός των επιμέρους συστατικών του εκχυλίσματος του δεντρολίβανου είναι εφικτός, ακόμη και στα εδώδιμα λίπη που χρησιμοποιούνται κάτω από θερμικές συνθήκες με τα εκχυλίσματα του δεντρολίβανου να προστίθενται ως αντιοξειδωτικά Αντιοξειδωτική δράση εκχυλισμάτων δενδρολίβανου Η χρήση εκχυλίσματος από δενδρολίβανο ως φυσικό αντιοξειδωτικό αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τους Rac και Ostric-Matijasevic (1955). Αργότερα, οι Chang et al. (1977) ανέφεραν μια κατοχυρωμένη διεργασία εκχύλισης δενδρολίβανου και φασκόμηλου με ατμο-απόσταξη υπό κενό προς παραγωγή ενός άοσμου και χωρίς γεύση φυσικού αντιοξειδωτικού για χρήση σε εδώδιμα λίπη και έλαια. Η αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος αποδείχθηκε τόσο σε ζωικά όσο και σε φυτικά έλαια. Σε αρκετές δοκιμές σύγκρισης, τα εκχυλίσματα δενδρολίβανου έχουν αποδειχθεί εξίσου αποτελεσματικά με άλλα κοινώς χρησιμοποιούμενα αντιοξειδωτικά για τη διατήρηση των τροφίμων [Etter, 2004]. Οι del Baño et al. (2003) αναφέρουν πως στα συστήματα λιπιδίων, τα εκχυλίσματα δενδρολίβανου με υψηλότερη περιεκτικότητα σε φαινολικές ενώσεις διτερπενίου είναι πιο αποτελεσματικά, ενώ σε υδατικά συστήματα, το ροσμαρινικό οξύ υποδεικνύει την υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση. Η αντιοξειδωτική δράση του δενδρολίβανου βρέθηκε επίσης ότι είναι σημαντική στο χοιρινό λίπος, στο σογιέλαιο και στο βαμβακέλαιο 41

43 [Houlihan et al., 1984]. Το δενδρολίβανο μελετήθηκε και σε τηγανισμένα προϊόντα, όπου βρέθηκε ότι έχει χαμηλότερη πτητικότητα και καλύτερη σταθερότητα από ότι το ΒΗΑ και το ΒΗΤ σε υψηλές θερμοκρασίες. Σύμφωνα με τους Frankel et al. (1996), τα εκχυλίσματα δενδρολίβανου ανέστειλαν αποτελεσματικά τον σχηματισμό συζυγών διενίων σε καλαμποκέλαιο, σογιέλαιο, αραχιδέλαιο και ιχθυέλαιο Νομοθεσία εκχυλισμάτων δενδρολίβανου Έπειτα από την έγκρισή του για χρήση στα τρόφιμα [Regulation (EC) No 1333/2008], το εκχύλισμα δενδρολίβανου βρίσκει πολλές εφαρμογές στην Ευρωπαϊκή Ένωση, κυρίως σε αφυδατωμένα γάλατα, λίπη, έλαια, επεξεργασμένες πατάτες, τσίχλες, αρτοσκευάσματα, επεξεργασμένα κρέατα, ψάρια και αυγά, θερμικά κατεργασμένα κρέατα, μουστάρδες, σούπες, ζωμούς, σνακς, επεξεργασμένους ξηρούς καρπούς και συμπληρώματα διατροφής (αν και με ορισμένους περιορισμούς στη συγκεκριμένη ομάδα τροφίμων). Με τον Κανονισμό No 1333/2008 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και Συμβουλίου ορίστηκαν τα μέγιστα επιτρεπτά όρια (Maximum Permitted Levels, MPLs) της χρήσης εκχυλισμάτων δενδρολίβανου (Ε 392) ως πρόσθετα τροφίμων. Τα όρια αυτά κυμαίνονται από 15 έως 400 mg/ kg στα τρόφιμα εκφρασμένα ως το άθροισμα του καρνοσικού οξέος και της καρνοσόλης στο συνολικό προϊόν. Για τα φυτικά έλαια (εκτός από το παρθένο και το ελαιόλαδο) και για τα λίπη όπου η περιεκτικότητα σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα είναι μεγαλύτερη από 15 % των συνολικών λιπαρών οξέων και που προορίζονται για χρήση σε μη θερμικά επεξεργασμένα τρόφιμα το όριο προσθήκης αντιοξειδωτικού Ε 392 είναι 30 mg/ kg τροφίμου. Για ιχθυέλαια, έλαια φυκών, ζωικά λίπη και έλαια που προορίζονται για παραγωγή θερμικά επεξεργασμένων τροφίμων (λάδια τηγανίσματος εκτός του ελαιόλαδου και του πυρηνέλαιου) το μέγιστο επιτρεπτό όριο είναι 50 mg/ kg τροφίμου [European Food Safety Authority, 2015]. Σύμφωνα με την Οδηγία της Ευρωπαϊκής Ένωσης 2010/67/ΕΕ της Επιτροπής, η παραγωγή εκχυλισμάτων δενδρολίβανου που προορίζονται για προσθήκη σε τρόφιμα βασίζεται σε συγκεκριμένες διεργασίες εκχύλισης με συγκεκριμένους διαλύτες. Αναλυτικά τα επιτρεπτά εκχυλίσματα είναι τα εξής: Α) Εκχυλίσματα δενδρολίβανου που παράγονται από αποξηραμένα φύλλα δενδρολίβανου με εκχύλιση με ακετόνη. Β) Εκχυλίσματα δενδρολίβανου που παρασκευάζονται με εκχύλιση αποξηραμένων φύλλων με υπερκρίσιμο διοξείδιο του άνθρακα. Γ) Εκχυλίσματα δενδρολίβανου που παρασκευάζονται από αποσμημένο αιθανολικό εκχύλισμα δενδρολίβανου. 42

44 Δ) Εκχυλίσματα δενδρολίβανου, αποσμημένα και αποχρωματισμένα με εκχύλιση δύο σταδίων με εξάνιο και αιθανόλη. 43

45 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.1 Σχεδιασμός πειραμάτων Στόχος της παρούσας διπλωματικής ήταν η ανάκτηση αντιοξειδωτικών συστατικών από το δενδρολίβανο, κατάλληλων για προσθήκη σε τηγάνισμα και η εξέταση της δραστικότητας των ανακτηθέντων συστατικών στο τηγάνισμα. Για την επίτευξη αυτών των στόχων, η πειραματική διαδικασία χωρίστηκε σε δύο μέρη: Στο πρώτο μέρος μελετήθηκε η διεργασία της εκχύλισης για την ανάκτηση των δραστικών ουσιών του δενδρολίβανου και η αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων σε φοινικέλαιο στους 180 C. Στόχος ήταν να επιλεγεί το εκχύλισμα με την καλύτερη αντιοξειδωτική συμπεριφορά για να χρησιμοποιηθεί στο δεύτερο μέρος της πειραματικής διαδικασίας. Στο δεύτερο μέρος μελετήθηκε η επίδραση του αντιοξειδωτικού εκχυλίσματος στο τηγάνισμα chips πατάτας και συγκεκριμένα στην παρεμπόδιση της οξείδωσης του ελαίου (φοινικέλαιο) τόσο κατά τη διάρκεια του τηγανίσματος όσο και κατά την αποθήκευση των chips. Α Μέρος Η ανάκτηση των δραστικών ουσιών του δενδρολίβανου σχεδιάστηκε με μια σειρά από διεργασίες προκειμένου να παραχθούν διαφορετικά εκχυλίσματα και τελικά να επιλεγεί το καταλληλότερο για χρήση στο δεύτερο μέρος της πειραματικής διαδικασίας. Η επιλογή των μεθόδων βασίστηκε στο νομοθετικό πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Ένωσης που επιτρέπει τη χρήση αιθανόλης, ακετόνης και εξανίου ως διαλυτών εκχύλισης, καθώς και υπερκρίσιμου CO2 [Commission Directive 2010/67/EU, 2010/69/EU]. Επιπλέον, είναι επιτρεπτή και η μετέπειτα απόσμηση των εκχυλισμάτων. Σε κάθε περίπτωση τα παραπάνω τελικά προϊόντα μπορούν να προστεθούν σε λίπη, έλαια ή πιο σύνθετα λιπαρά τρόφιμα. Σε πρώτη φάση, εξετάστηκε η εκχύλιση με ακετόνη, που αποτελεί θεσμοθετημένη μέθοδο από την Ευρωπαϊκή Ένωση σε συνδυασμό με δύο εναλλακτικές διεργασίες για την απομάκρυνση του αιθέριου ελαίου και των υδατοδιαλυτών συστατικών: o Στην πρώτη προσέγγιση, πραγματοποιήθηκε πρώτα εκχύλιση με ακετόνη και τα συστατικά του αιθέριου ελαίου που ανακτήθηκαν με την εκχύλιση, απομακρύνθηκαν με κατεργασία του ξηρού εκχυλίσματος με εξάνιo. o Στη δεύτερη προσέγγιση, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της υδρο-ατμοαπόσταξης για την παραλαβή του αιθέριου ελαίου πριν την εκχύλιση. Η διεργασία της υδρο-ατμοαπόσταξης επιλέχθηκε ως η καταλληλότερη, καθώς κατά τη διάρκειά της το φυτό συγκρατείται σε πλέγμα μέσα στη συσκευή, ώστε να μην έρχεται σε επαφή με το νερό, οπότε περνάει μόνο ατμός μέσα από τη φυτόμαζα. Έτσι, αποφεύγονται αντιδράσεις υδρόλυσης που είναι 44

46 ανεπιθύμητες. Μετά την απομάκρυνση του αιθέριου ελαίου με την απόσταξη, η φυτόμαζα ξηράνθηκε, κονιοποιήθηκε και εκχυλίστηκε με ακετόνη. Λόγω της ιδιότητας της ακετόνης να διαλυτοποιεί τόσο λιπιδικά προϊόντα όσο και υδατοδιαλυτά συστατικά του δενδρολίβανου, όπως το καφεϊκό και το ροσμαρινικό οξύ, είναι πιθανό όταν το αντίστοιχο ακετονικό εκχύλισμα ενσωματώνεται στο έλαιο να δημιουργεί θολότητα, καθώς αυτές οι ουσίες έχουν περιορισμένη διαλυτότητα σε λιπαρές ουσίες. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκε και μια εναλλακτική σειρά διεργασιών, στην οποία μετά την υδρο-ατμοαπόσταξη και πριν την εκχύλιση με ακετόνη, το δενδρολίβανο κατατμήθηκε παρουσία νερού προκειμένου να απομακρυνθούν τα υδατοδιαλυτά φαινολικά συστατικά. Σε δεύτερη φάση εξετάστηκε η εκχύλιση ξηρής σκόνης δενδρολίβανου του εμπορίου με υδατικό διάλυμα ΚΟΗ 5 %. Η εκχύλιση με ΚΟΗ είχε διερευνητικό χαρακτήρα, καθώς κατά τη διεργασία αυτή είναι δυνατή η παραλαβή του ολικού φαινολικού φορτίου του φυτού. Οι πολυφαινόλες δρουν ως ασθενή οξέα, οπότε η προσθήκη διαλύματος ΚΟΗ συνεπάγεται την αντίδραση όλων των πολυφαινολών, υδατοδιαλυτών και μη με τη βάση και παραγωγή των αντίστοιχων υδατοδιαλυτών αλάτων. Μετά την οξίνιση οι πολυφαινόλες μεταβαίνουν στην αρχική τους μορφή, οπότε οι υδατοδιαλυτές παραμένουν εν διαλύσει, ενώ οι μη υδατοδιαλυτές καταβυθίζονται, συλλέγονται και ξηραίνονται. Οι διεργασίες που ακολουθήθηκαν για την παραγωγή των εκχυλισμάτων πλούσιων σε αντιοξειδωτικές ουσίες φαίνονται με τη μορφή διαγράμματος ροής στο Σχήμα 3.1. Rosmarinus officinalis κονιοποίηση απόσταξη με υδρατμούς εκχύλιση με υδατικό διάλυμα ΚΟΗ εκχύλιση με ακετόνη προκατεργασία με νερό ξήρανση διήθηση χορτόμαζας απομάκρυνση διαλύτη ξήρανση κονιοποίηση διήθημα φυτικό υλικό προς απόρριψη απόσμηση με εξάνιο Α ο κονιοποίηση εκχύλιση με ακετόνη εκχύλιση με ακετόνη απομάκρυνση διαλύτη οξίνιση-καταβύθιση των συστατικών χαμηλής πολικότητας διήθηση Α 1 απομάκρυνση διαλύτη Α 2 Α 3 κλάσμα στερεών άπολων συστατικών διήθημα προς απόρριψη ξήρανση Α 4 Σχήμα 3.1: Οι εναλλακτικές διεργασίες εκχύλισης και απόσμησης του δενδρολίβανου 45

47 Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την παρασκευή του εκχυλίσματος Α2 εφαρμόστηκε και σε φρέσκες βελόνες δενδρολίβανου, ώστε να εκτιμηθεί η επίδραση της παραμονής για μεγάλο χρονικό διάστημα πριν την κατεργασία του φυτού. Η σύγκριση βέβαια είναι προσεγγιστική καθώς πρόκειται για ποικιλίες διαφορετικής προέλευσης και διαφορετικών συνθηκών ξήρανσης. Για την αξιολόγηση των εκχυλισμάτων και των δραστικών συστατικών τους, προσδιορίστηκε η ικανότητα δέσμευσης της ελεύθερης ρίζας DPPH, που είναι ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για την εξέταση της αντιοξειδωτικής δράσης διαφόρων ουσιών και η περιεκτικότητα σε ολικά φαινολικά διτερπένια (TPD) χρωματογραφικά με τη μέθοδο HPLC-DAD, με την οποία προσδιορίστηκαν οι κύριες αντιοξειδωτικές ουσίες του δενδρολίβανου: το καρνοσικό οξύ και η καρνοσόλη. Η ανάκτηση σε φαινολικά διτερπένια (TPD) αναμενόταν να είναι μικρότερη στο εκχύλισμα Α1 (κατεργασία με εξάνιο) σε σχέση με τα υπόλοιπα, καθώς το εξάνιο διαλυτοποιεί τα φαινολικά διτερπένια. Έτσι, το εκχύλισμα που προέκυψε αναμενόταν να είναι μεν απαλλαγμένο από ελαιώδη συστατικά, να εμφανίζει δε χαμηλότερη ανάκτηση στις κρίσιμες αντιοξειδωτικές ουσίες. Την υψηλότερη ανάκτηση σε TPD αναμενόταν να εμφανίσει το αλκαλικό εκχύλισμα (Α4), καθώς το ΚΟΗ αντιδρά με όλες τις πολυφαινόλες. Επιπλέον, προσδιορίστηκε η αντιοξειδωτική προστασία των εκχυλισμάτων σε φοινικέλαιο σε συγκέντρωση 500 ppm (mg ξηρού εκχυλίσματος/kg ελαίου) στους 180 C, θερμοκρασία που προσομοιάζει το τηγάνισμα. Η επιλογή του εκχυλίσματος για περαιτέρω χρήση έγινε αφ ενός με βάση ποσοτικά κριτήρια, όπως η περιεκτικότητα σε ολικά φαινολικά διτερπένια (TPD) και ο λόγος καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη και αφ ετέρου με βάση ποιοτικά κριτήρια, όπως η δυνατότητα ενσωμάτωσής του σε φοινικέλαιο και η διαύγεια του τελικού μίγματος ελαίου. Στο τελικό στάδιο του πρώτου μέρους, πραγματοποιήθηκε πείραμα οξείδωσης φοινικέλαιου με και χωρίς προσθήκη του επιλεγμένου εκχυλίσματος σε συγκέντρωση 500 ppm (mg ξηρού εκχυλίσματος/kg ελαίου) στους 180 C για χρονικό διάστημα μέχρι 8 h, προκειμένου να προσομοιωθούν οι συνθήκες τηγανίσματος που αφορούν στο δεύτερο μέρος του πειράματος. Στόχος ήταν η εξέταση αφενός της προστασίας που παρέχει το εκχύλισμα στο έλαιο κατά τη διάρκεια της θερμικής του καταπόνησης και αφετέρου η εξέταση της επίδρασης του χρόνου παραμονής σε αυτές τις συνθήκες στην μετέπειτα πορεία της οξείδωσης του ελαίου. Δεδομένου ότι σε αυτή την υψηλή θερμοκρασία, τα πρωτογενή προϊόντα οξείδωσης είναι ασταθή και διασπώνται, ο βαθμός οξείδωσης των ελαίων εκτιμήθηκε με τον αριθμό π-ανισιδίνης (p-av) που αποτελεί μέθοδο μέτρησης των δευτερογενών προϊόντων οξείδωσης. Στη συνέχεια, ακολούθησε αποθήκευση των δειγμάτων σε φούρνο στους 70 C με σκοπό να μελετηθεί η εξέλιξη της οξείδωσης σε σχέση με τον χρόνο αποθήκευσης. Η μελέτη της οξείδωσης για τους διάφορους χρόνους παραμονής των δειγμάτων στους 70 C έγινε μέσω του προσδιορισμού του αριθμού υπεροξειδίων (PV), που αποτελεί μέθοδο μέτρησης των πρωτογενών προϊόντων οξείδωσης (υπεροξείδια). 46

48 Β Μέρος Στο δεύτερο μέρος της πειραματικής διαδικασίας πραγματοποιήθηκε τηγάνισμα φετών νωπής πατάτας σε φοινικέλαιο που χρησιμοποιείται στις βιομηχανίες παραγωγής τηγανισμένων προϊόντων με τη χρήση επαγγελματικής φριτέζας και στη συνέχεια συσκευασία και αποθήκευση αυτών σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας. Η προμήθεια των υλικών που χρησιμοποιήθηκαν (φέτες πατάτας, υλικό συσκευασίας) έγινε από την εταιρία ΤΣΑΚΙΡΗΣ ΑΒΕΕ, προκειμένου να γίνει μια όσο το δυνατόν ακριβέστερη προσέγγιση της παραγωγής chips που πραγματοποιείται στο εν λόγω εργοστάσιο. Έτσι, οι συνθήκες του πειράματος (θερμοκρασία τηγανίσματος, διάρκεια τηγανίσματος, χρόνος αναμονής ανάμεσα στα διαδοχικά τηγανίσματα) καθορίστηκαν με βάση τις αντίστοιχες συνθήκες που τηρούνται στο εργοστάσιο ΤΣΑΚΙΡΗΣ ΑΒΕΕ. Πραγματοποιήθηκε μια σειρά τηγανισμάτων με καθαρό φοινικέλαιο και μια σειρά με εμπλουτισμένο - με το επιλεχθέν εκχύλισμα - φοινικέλαιο, ώστε η τελική περιεκτικότητα του αντιοξειδωτικού εντός του ελαίου της φριτέζας να ανέρχεται στα 50 ppm σε ολικά φαινολικά διτερπένια (εκφρασμένο ως καρνοσικό οξύ), που είναι τα επιτρεπόμενα όρια προσθήκης από την EFSA (European Food Safety Authority). Αυτές οι δύο σειρές τηγανισμάτων πραγματοποιήθηκαν προκειμένου να ελεγχθεί κατά πόσο το αντιοξειδωτικό εκχύλισμα προστατεύει την οξείδωση του προϊόντος που έχει τηγανιστεί με το εμπλουτισμένο έλαιο σε σχέση με αυτό που τηγανίστηκε με καθαρό έλαιο. Η μελέτη της πορείας οξείδωσης του φοινικέλαιου κατά τη διάρκεια των τηγανισμάτων έγινε με προσδιορισμό του αριθμού π-ανισιδίνης (p-av) σε δείγματα ελαίου που λαμβάνονταν καθ όλη τη διαδικασία του τηγανίσματος τόσο για το καθαρό όσο και για το εμπλουτισμένο έλαιο. Τα chips πατάτας που παράχθηκαν, συσκευάστηκαν υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα αζώτου σε πολυστρωματικό υλικό, προσομοιώνοντας όσο το δυνατόν τη μέθοδο συσκευασίας που εφαρμόζεται στην ΤΣΑΚΙΡΗΣ ΑΒΕΕ. Για τη μελέτη της πορείας οξείδωσης του παραχθέντος συσκευασμένου προϊόντος, τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας στους 25 C, απ όπου πραγματοποιούνταν περιοδικές δειγματοληψίες κατά τις οποίες γινόταν παραλαβή του ελαίου από τα chips και μέτρηση του βαθμού οξείδωσης του παραληφθέντος ελαίου μέσω του αριθμού υπεροξειδίων (PV). 3.2 Υλικά και συσκευές Πρώτες ύλες o Το αρωματικό φυτό που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διπλωματική εργασία ήταν το δενδρολίβανο (λατινική ονομασία: Rosmarinus officinalis) της οικογένειας των Χειλανθών (Lamiaceae). Χρησιμοποιήθηκαν βελόνες φρέσκου δενδρολίβανου που συλλέχθηκαν από 47

49 την Πολυτεχνειούπολη Ζωγράφου και δενδρολίβανο του εμπορίου αλβανικής προέλευσης από την εταιρία Αλεξόπουλος Αλέξανδρος & ΣΙΑ ΟΕ. o Το έλαιο που χρησιμοποιήθηκε τόσο στο πρώτο όσο και στο δεύτερο μέρος της πειραματικής διαδικασίας ήταν φοινικέλαιο της εταιρίας PETTAS S.A. Η σύσταση του φοινικέλαιου σε λιπαρά οξέα φαίνεται στον Πίνακα 3.1. Πίνακας 3.1: Σύσταση φοινικέλαιου σε λιπαρά οξέα Συμβολισμός Λιπαρό οξύ Σύσταση C14:0 Μυριστικό οξύ 1,10% C16:0 Παλμιτικό οξύ 40,20% C16:1 Παλμιτολεϊκό οξύ 0,10% C18:0 Στεατικό οξύ 4,20% C18:1 Ελαϊκό οξύ 42,60% C18:2 Λινελαϊκό οξύ 10,90% C18:3 α-λινολενικό οξύ 0,20% C20:0 Αραχιδικό οξύ 0,25% C20:1 Γονδοϊκό οξύ 0,10% C22:0 Βεχενικό οξύ 0,00% o Οι πατάτες που χρησιμοποιήθηκαν στο δεύτερο μέρος της πειραματικής διαδικασίας (τηγάνισμα chips), καθώς και το πολυστρωματικό υλικό συσκευασίας των chips παραλήφθηκαν από την εταιρία ΤΣΑΚΙΡΗΣ ΑΒΕΕ Αντιδραστήρια- Διαλύτες Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για τις εκχυλίσεις ήταν τα εξής: Ακετόνη (Sigma- Aldrich, Steimheim, Germany), εξάνιο (for analysis, Carlo Erba Reagents, Val de Reuil Cedex, France), καυστικό κάλιο (Panreac, Barcelona, Spain), πυκνό υδροχλωρικό οξύ (Fisher Chemical, Loughborough, United Kingdom), πετρελαϊκός αιθέρας (Fisher Chemical, Loughborough, United Kingdom). Για την ενσωμάτωση των εκχυλισμάτων δενδρολίβανου στο φοινικέλαιο έγινε χρήση οξικού αιθυλεστέρα (analytical reagent grade, Fisher Chemical, Loughborough, United Kingdom). Οι αναλύσεις των δειγμάτων ελαίου πραγματοποιήθηκαν με τα εξής αντιδραστήρια: Ιωδιούχο κάλιο (Carlo Erba Reagents, Val de Reuil Cedex, France), διαλυτό άμυλο (Panreac, Barcelona, Spain), οξικό οξύ (for analysis, Carlo Erba Reagents, Val de Reuil Cedex, France), χλωροφόρμιο (analytical reagent grade, Fisher Chemical, Loughborough, United Kingdom), θειοθειικό νάτριο (0.1 Ν, for analysis, Carlo Erba Reagents, Val de Reuil Cedex, France), 48

50 ισοοκτάνιο (for analysis, Carlo Erba Reagents, Val de Reuil Cedex, France), π-ανισιδίνη (Panreac, Barcelona, Spain), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich, Steimheim, Germany). Στις χρωματογραφικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν νερό, ακετονιτρίλιο και μεθανόλη ποιότητας HPLC (Fisher Chemical, Leicestershire, United Kingdom) Όργανα-Συσκευές o Η απόσταξη του αιθέριου ελαίου από το δενδρολίβανο πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, της Σχολής Χημικών Μηχανικών του ΕΜΠ σε πιλοτικής κλίμακας συσκευή αποτελούμενη από χάλκινο καζάνι 17 L (Χαλκός, Θεσσαλονίκη). o Για την κατάτμηση της νωπής φυτόμαζας του απεσταγμένου δενδρολίβανου χρησιμοποιήθηκε οικιακό blender Kenwood Chef A701A (England). o Η άλεση του δενδρολίβανου πραγματοποιήθηκε σε μύλο Retch ZM 1 (Haan, Germany) με κόσκινο 0,5 mm. o Η ξήρανση των φρέσκων βελόνων δενδρολίβανου, καθώς και τα πειράματα οξείδωσης του φοινικέλαιου πραγματοποιήθηκαν σε εργαστηριακό φούρνο κυκλοφορίας αέρα Binder BD 400 (Tuttlingen, Germany). o Η αποθήκευση των οξειδωμένων και εμπλουτισμένων δειγμάτων φοινικέλαιου πραγματοποιήθηκε σε εργαστηριακό κλίβανο Thermawatt TG 103 (Περιστέρι, Ελλάδα). o Οι μετρήσεις των απορροφήσεων των δειγμάτων για τον υπολογισμό των συζυγών διενίων, του αριθμού π-ανισιδίνης, καθώς και οι δοκιμές DPPH έγιναν με χρήση του φασματοφωτόμετρου HITACHI U2900 (Tokyo, Japan). o Οι αναλύσεις των εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκαν σε υγρό χρωματογράφο υψηλής απόδοσης (HPLC), που αποτελούνταν από αντλία βαθμωτής έκλουσης, HP 1100 και ανιχνευτή παράταξης φωτοδιοδίων (Diode Array Detector, DAD) (Hewlett-Packard, Waldbronn, Germany), συνδεδεμένα με στήλη Hypersil C18 column ODS 5 μm, 250 x 4.6 mm (MZ Analysentechnik, Mainz, Germany). o Για τις φασματοφωτομετρικές μεθόδους χρησιμοποιήθηκε ψηφιακό φασματοφωτόμετρο Spectronic Unicam EMEA (Unicam Helios alpha, Leeds, UK). o Η μέτρηση της ποσότητας του O2 που περιεχόταν εντός της συσκευασίας των δειγμάτων chips έγινε με τη βοήθεια της συσκευής Gas-Analyser CheckMate 9900 O2/CO2 PBI Dansensor (Ringsted, Denmark). o Για τις συμπυκνώσεις των εκχυλισμάτων χρησιμοποιήθηκε περιστροφικός εξατμιστής κενού Büchi R-114 με ενσωματωμένο υδρόλουτρο Büchi B-480 (Büchi Laboratoriums Technik AG, Flawil, Switzerland) του εργαστηρίου Οργανικής Χημείας της Σχολής Χημικών Μηχανικών του ΕΜΠ. 49

51 o Οι αναδεύσεις των ελαιοδιαλυμάτων πραγματοποιούνταν σε μαγνητικό αναδευτήρα AGE Magnetic stirrer (Velp Scientifica, Usmate Velate, Italy). o Για την εκχύλιση των δειγμάτων chips χρησιμοποιήθηκε λουτρό υπερήχων Elma Elmasonic S30H (Singen, Germany). o Το τηγάνισμα των φετών πατάτας πραγματοποιήθηκε σε επαγγελματική φριτέζα Electric Fryer EF-101 (Guangdong, China). o Για την αποθήκευση των συσκευασμένων δειγμάτων chips χρησιμοποιήθηκε θάλαμος σταθερής θερμοκρασίας Memmert (Schwabach, Germany). 3.3 Πειραματικές τεχνικές Ανάκτηση δραστικών ουσιών δενδρολίβανου Εκχύλιση με ακετόνη και απομάκρυνση αιθέριου ελαίου από το εκχύλισμα Χρησιμοποιήθηκαν 250 g από ξηρές βελόνες δενδρολίβανου του εμπορίου, οι οποίες αλέσθηκαν σε μύλο Retch ZM 1 (Haan, Germany) με κόσκινο 0,5 mm. Από τη σκόνη δενδρολίβανου που παρήχθη, ζυγίστηκαν 150 g τα οποία εκχυλίστηκαν με 1,05 L ακετόνης (αναλογία ξηρής βάσης- ακετόνης 1:7). Η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε σε ποτήρι ζέσεως 2 L υπό μαγνητική ανάδευση για 2 h. Ακολούθησε διήθηση και ογκομέτρηση του διηθήματος, απομάκρυνση του διαλύτη με συμπύκνωση σε περιστροφικό εξατμιστή κενού, προσδιορισμός της απόδοσης σταθμικά και παραλαβή του εκχυλίσματος σε vial (εκχύλισμα Α0). Στο εκχύλισμα Α0 πραγματοποιήθηκε κατεργασία με εξάνιο για την απομάκρυνση του αιθέριου ελαίου. Αναλυτικά, πραγματοποιήθηκαν 3 πλύσεις σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml με 40 ml εξάνιο η καθεμία. Το στερεό που απέμεινε κωδικοποιήθηκε ως εκχύλισμα Α1 (ακετονικό εκχύλισμα δενδρολίβανου εμπορίου, ελεύθερο διαλυτών σε εξάνιο συστατικών) Υδρο-ατμοαπόσταξη και εκχύλιση με ακετόνη Εναλλακτικά, πραγματοποιήθηκε υδρο-ατμοαπόσταξη του δενδρολίβανου του εμπορίου σε συσκευή απόσταξης του εργαστηρίου. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Ζυγίστηκαν 400 g από ξηρές βελόνες δενδρολίβανου και 4 L απιονισμένου νερού τα οποία προστέθηκαν στη συσκευή. Η παραλαβή του αποστάγματος έγινε σε ογκομετρικό κύλινδρο των 1000 ml. Αφού τέθηκε σε λειτουργία ο αποστακτήρας, ανά τακτά χρονικά διαστήματα γινόταν καταγραφή της θερμοκρασίας μέχρι να φτάσει σε μια σταθερή τιμή. Η χρονική στιγμή που παρατηρήθηκε η πρώτη σταγόνα στον ογκομετρικό κύλινδρο καταγράφηκε ως έναρξη της απόσταξης. Από τη χρονική αυτή στιγμή και έπειτα, ανά τακτά διαστήματα λαμβάνονταν μετρήσεις του όγκου του αιθέριου ελαίου στον αντίστοιχο χρόνο και υπολογίστηκε ο ρυθμός 50

52 απόσταξης του αιθέριου ελαίου (ml/h). Αφού ολοκληρώθηκε η διαδικασία της απόσταξης, η νωπή φυτόμαζα ζυγίστηκε και μοιράστηκε σε δύο ίσες ποσότητες: o Η πρώτη ποσότητα εκχυλίστηκε με νερό σε αναλογία ξηρής βάσης-νερού Έπειτα από προσδιορισμό της περιεχόμενης υγρασίας, ζυγίστηκαν 219,56 g νωπής φυτόμαζας και τοποθετήθηκαν στον κάδο οικιακού blender (Kenwood Chef A701A, England). Προστέθηκαν 1580 ml νερού, η φυτόμαζα κατατμήθηκε και το μίγμα μεταφέρθηκε σε ποτήρι ζέσεως των 2 L, όπου παρέμεινε υπό ανάδευση για 2 h. Ακολούθησε διήθηση, απομάκρυνση του διηθήματος και ξήρανση της φυτόμαζας σε εργαστηριακό φούρνο (Binder BD 400, Tuttlingen, Germany) κυκλοφορίας αέρα στους 45 C. Έπειτα, το ξηρό απεσταγμένο δενδρολίβανο ζυγίστηκε, κονιοποιήθηκε (μύλος Retch ZM 1, Haan, Germany, με κόσκινο 0,5 mm) και από τη σκόνη που προέκυψε ζυγίστηκαν 100 g τα οποία εκχυλίστηκαν με ακετόνη σε αναλογία στερεού (ξηρής βάσης)- ακετόνης 1:7. Η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε σε ποτήρι ζέσεως των 2 L υπό μαγνητική ανάδευση για 2 h. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε διήθηση και απομάκρυνση του διαλύτη υπό κενό (Büchi RE 114, Büchi Laboratoriums Technik AG, Flawil, Switzerland) σε προζυγισμένη σφαιρική φιάλη των 250 ml. Η σφαιρική φιάλη με το υπόλειμμα ζυγίστηκε και παραλήφθηκε σε vial το ακετονικό εκχύλισμα που κωδικοποιήθηκε ως εκχύλισμα Α2 (ακετονικό εκχύλισμα απελαιωμένου και κατεργασμένου με νερό δενδρολίβανου εμπορίου). o Η δεύτερη ποσότητα νωπής φυτόμαζας τοποθετήθηκε κατευθείαν σε εργαστηριακό κλίβανο κυκλοφορίας αέρα στους 45 C για ξήρανση. Αφού ολοκληρώθηκε η ξήρανση, το ξηρό απελαιωμένο δενδρολίβανο κονιοποιήθηκε και υποβλήθηκε σε εκχύλιση με ακετόνη με τις ίδιες συνθήκες που αναφέρονται στην προηγούμενη παράγραφο, οπότε προέκυψε το εκχύλισμα Α3 (ακετονικό εκχύλισμα απελαιωμένου δενδρολίβανου εμπορίου). Η ίδια διαδικασία που ακολουθήθηκε για την παρασκευή του εκχυλίσματος Α2 εφαρμόστηκε και σε φρέσκες βελόνες δενδρολίβανου που συλλέχθηκαν από την περιοχή της Πολυτεχνειούπολης Ζωγράφου. Το φρέσκο δενδρολίβανο τοποθετήθηκε για ξήρανση για 24 h σε εργαστηριακό κλίβανο κυκλοφορίας αέρα στους 45 C. Στη συνέχεια, ζυγίστηκαν 350 g από τις ξηρές βελόνες δενδρολίβανου και προστέθηκαν στον αποστακτήρα μαζί με 3 L απιονισμένο νερό. Μετά το πέρας της απόσταξης, ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία που αναφέρεται στην παρασκευή του Α2 και προέκυψε το εκχύλισμα Α5 (ακετονικό εκχύλισμα απελαιωμένου και κατεργασμένου με νερό φρέσκου δενδρολίβανου) Εκχύλιση με υδατικό διάλυμα ΚΟΗ Η τελευταία διεργασία εκχύλισης που πραγματοποιήθηκε για την παρασκευή εκχυλίσματος δενδρολίβανου πλούσιου σε αντιοξειδωτικές ουσίες ήταν η εκχύλιση με υδατικό διάλυμα KOH 51

53 5 %. Αναλυτικότερα, ζυγίστηκαν 100 g αλεσμένου δενδρολίβανου του εμπορίου σε ποτήρι ζέσεως 2 L, τα οποία εκχυλίστηκαν υπό μαγνητική ανάδευση για 1 h με 1100 ml διαλύματος KOH 5 %. Ακολούθησε διήθηση του εκχυλίσματος και ρύθμιση του ph του διηθήματος με πυκνό HCl σε τιμή ph=5 που είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία αιωρήματος των συστατικών χαμηλής πολικότητας. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε διήθηση, παραλαβή του ιζήματος, ξήρανσή του και επανεκχύλισή του με ακετόνη. Έτσι, παραλήφθηκε το διαλυτό σε ακετόνη κλάσμα του εκχυλίσματος με υδατικό διάλυμα ΚΟΗ 5 %: εκχύλισμα Α4 (αλκαλικό εκχύλισμα δενδρολίβανου εμπορίου, διαλυτό σε ακετόνη). Συγκεντρωτικά, τα εκχυλίσματα δενδρολίβανου που παρήχθησαν με την αντίστοιχη κωδικοποίηση φαίνονται στον Πίνακα 3.2: Πίνακας 3.2: Εκχυλίσματα δενδρολίβανου Εκχύλισμα Α0 Α1 Α2 Α3 Περιγραφή Ακετονικό εκχύλισμα δενδρολίβανου εμπορίου Ακετονικό εκχύλισμα δενδρολίβανου εμπορίου - ελεύθερο διαλυτών σε εξάνιο συστατικών Ακετονικό εκχύλισμα απελαιωμένου και κατεργασμένου με νερό δενδρολίβανου εμπορίου Ακετονικό εκχύλισμα απελαιωμένου δενδρολίβανου εμπορίου Α4 Α5 Αλκαλικό εκχύλισμα δενδρολίβανου εμπορίου - διαλυτό σε ακετόνη Ακετονικό εκχύλισμα απελαιωμένου και κατεργασμένου με νερό φρέσκου δενδρολίβανου Χαρακτηρισμός εκχυλισμάτων και μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης σε φοινικέλαιο Χαρακτηρισμός εκχυλισμάτων Για κάθε εκχύλισμα που παρασκευάστηκε, προσδιορίστηκε η απόδοση, η περιεκτικότητα σε ολικά φαινολικά διτερπένια (TPD), ο λόγος καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη και η ικανότητα δέσμευσης της ελεύθερης ρίζας DPPH, όπως περιγράφονται παρακάτω στις αναλυτικές μεθόδους. 52

54 Ενσωμάτωση αντιοξειδωτικών εκχυλισμάτων σε φοινικέλαιο Κάθε εκχύλισμα που παρασκευάστηκε, αρχικά ενσωματώθηκε σε φοινικέλαιο σε επίπεδο προσθήκης της τάξης του 10 %. Για το σκοπό αυτό, ζυγίστηκαν 0,1 g αντιοξειδωτικού εκχυλίσματος εντός σφαιρικής φιάλης των 10 ml, όπου στη συνέχεια προστέθηκαν 0,9 g φοινικέλαιου. Ακολούθησε προσθήκη 3 ml οξικού αιθυλεστέρα, ομογενοποίηση σε λουτρό υπερήχων και εξάτμιση του οξικού αιθυλεστέρα σε περιστροφικό εξατμιστήρα κενού. Έτσι, προέκυψαν πέντε διαφορετικά δείγματα φοινικέλαιου με αντιοξειδωτικό εκχύλισμα συγκέντρωσης 10 %. Καθένα από τα παραπάνω δείγματα ενσωματώθηκε σε φοινικέλαιο, ώστε η περιεκτικότητα σε εκχύλισμα να ανέρχεται σε 500 ppm (mg ξηρού εκχυλίσματος/kg ελαίου) ως εξής: Για την παρασκευή 60 g εμπλουτισμένου ελαίου, ζυγίστηκαν 0,3 g ελαιοδιαλύματος αντιοξειδωτικού συγκέντρωσης 10 % τα οποία Εικόνα 3.1: Εμπλουτισμένο δείγμα φοινικέλαιου με αντιοξειδωτικό εκχύλισμα (αριστερά) και δείγμα καθαρού φοινικέλαιου (δεξιά) προστέθηκαν σε 59,70 g φοινικέλαιου σε ποτήρι ζέσεως των 100 ml. Ακολούθησε ανάδευση με μαγνήτη σε stirrer και τοποθέτηση των ποτηριών στο φούρνο στους 100 C μέχρι να προκύψει διαυγές ελαιοδιάλυμα. Με τη διαδικασία αυτή, παρασκευάστηκαν πέντε ελαιοδιαλύματα, εμπλουτισμένα με πέντε διαφορετικά αντιοξειδωτικά εκχυλίσματα, βάρους 60 g το καθένα Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής δράσης σε φοινικέλαιο Για καθένα από τα πέντε διαφορετικά εμπλουτισμένα ελαιοδιαλύματα συγκέντρωσης 500 ppm που προέκυψαν όπως περιγράφηκε παραπάνω, μελετήθηκε η πορεία της οξείδωσής τους στους 180 C για 24 h ως εξής: Σε ποτήρια ζέσεως των 100 ml ζυγίστηκαν 10 g εμπλουτισμένου ελαίου, τα οποία τοποθετήθηκαν στον φούρνο στους 180 C. Μαζί με τα δείγματα εμπλουτισμένου ελαίου τοποθετήθηκαν στον φούρνο και δείγματα καθαρού φοινικέλαιου (control). Έτσι, κατά τη διάρκεια ενός 24ώρου πραγματοποιούνταν συχνές δειγματοληψίες τόσο καθαρού όσο και εμπλουτισμένου ελαίου για μέτρηση του αριθμού π-ανισιδίνης (p-av). Συμπληρωματικά, προσδιορίστηκαν και άλλοι δύο δείκτες: ο αριθμός υπεροξειδίων (PV) και ο συντελεστής Κ232 (συζυγή διένια). 53

55 Δοκιμή πρόρρησης της αντιοξειδωτικής δράσης στο τηγάνισμα του επιλεγμένου εκχυλίσματος Χρησιμοποιήθηκε το ακετονικό εκχύλισμα απελαιωμένου και κατεργασμένου με νερό φρέσκου δενδρολίβανου (Α5) που επιλέχθηκε ως το καλύτερο, τόσο με βάση ποιοτικά κριτήρια (δυνατότητα ενσωμάτωσης σε βιομηχανικό φοινικέλαιο και διαύγεια του τελικού μίγματος ελαίου) όσο και με βάση ποσοτικά κριτήρια (περιεκτικότητα σε ολικά φαινολικά διτερπένια (TPD) και λόγος καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη). Σε 6 ποτήρια ζέσεως των 100 ml ζυγίστηκαν από 50 g φοινικέλαιου. Στα 3 εξ αυτών έγινε προσθήκη αντιοξειδωτικού εκχυλίσματος Α5 συγκέντρωσης 50 ppm ως προς ολικά φαινολικά διτερπένια (TPD εκφρασμένο ως καρνοσικό οξύ), ενώ τα υπόλοιπα 3 χρησιμοποιήθηκαν ως control (καθαρό φοινικέλαιο). Στη συνέχεια, τα δείγματα (εμπλουτισμένα και μη) τοποθετήθηκαν στον φούρνο στους 180 C για τα χρονικά διαστήματα: 0, 3.5 και 8 h. Μετά το πέρας κάθε διαστήματος, προσδιορίστηκε ο βαθμός οξείδωσης του ελαίου με τη μέθοδο του αριθμού π-ανισιδίνης (p-av), τόσο για τα εμπλουτισμένα δείγματα όσο και για τα control. Ακολούθως, τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε εργαστηριακό κλίβανο (Thermawatt TG 103, Περιστέρι, Ελλάδα) στους 70 C και μελετήθηκε η εξέλιξη της οξείδωσης σε σχέση με τον χρόνο αποθήκευσης μέσω του προσδιορισμού του αριθμού υπεροξειδίων (PV). Εικόνα 3.2: Μελέτη της πορείας οξείδωσης δειγμάτων φοινικέλαιου σε σχέση με τον χρόνο αποθήκευσης στους 70 C. Εμπλουτισμένο με αντιοξειδωτικό εκχύλισμα Α 5 φοινικέλαιο (αριστερά) και καθαρό φοινικέλαιο (δεξιά) για χρόνο οξείδωσης στους 180 C t=3,5h 54

56 3.3.3 Τηγάνισμα chips Εικόνα 3.3: Επαγγελματική φριτέζα Electric Fryer EF-101 συνδεδεμένη με θερμοστοιχείο για καταγραφή της θερμοκρασίας του ελαίου Για το τηγάνισμα των chips, χρησιμοποιήθηκε εργαστηριακή φριτέζα, η οποία πληρώθηκε αρχικά με 5 kg καθαρού φοινικέλαιου. Καθ όλη τη διάρκεια του τηγανίσματος, η θερμοκρασία του ελαίου καταγραφόταν με θερμοστοιχείο και μεταβαλλόταν σε κάθε κύκλο τηγανίσματος από τους 180 C έως τους 165 C. Οι φέτες πατάτας τηγανίστηκαν σε παρτίδες των 160 g για 120 s με ενδιάμεσες αναμονές 60 s. Κάθε σειρά διαδοχικών τηγανισμάτων διήρκησε συνολικά 60 min. Κατά τη διάρκεια των τηγανισμάτων, λαμβάνονταν δείγματα ελαίου από τη φριτέζα και προσδιοριζόταν ο αριθμός π-ανισιδίνης (p-av). Η πρώτη σειρά τηγανισμάτων πραγματοποιήθηκε σε καθαρό φοινικέλαιο (control chips) και στη συνέχεια η δεύτερη σειρά σε εμπλουτισμένο φοινικέλαιο με το εκχύλισμα Α5, ώστε η τελική περιεκτικότητα του αντιοξειδωτικού εντός του ελαίου της φριτέζας να ανέρχεται σε 50 ppm ως προς ολικά φαινολικά διτερπένια (TPD). Μετά από κάθε τηγάνισμα, τα chips τοποθετούνταν πάνω σε διηθητικό χαρτί ώστε να στραγγίσουν από το έλαιο. Τα δείγματα που παρασκευάστηκαν από κάθε σειρά ομογενοποιήθηκαν, χωρίστηκαν σε παρτίδες και συσκευάστηκαν εντός χρονικού διαστήματος 3 h Συσκευασία chips και αποθήκευση Για τη συσκευασία των chips χρησιμοποιήθηκε πολυστρωματικό υλικό, η προμήθεια του οποίου έγινε από την εταιρία «ΤΣΑΚΙΡΗΣ ΑΒΕΕ». Τα chips πατάτας που παράχθηκαν, αφού ζυγίστηκαν σε παρτίδες των 30 g, συσκευάστηκαν στο πολυστρωματικό υλικό υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα αζώτου με θερμοκόλληση. Στη συνέχεια, τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας 25 C. Εικόνα 3.4: Συσκευασία chips σε πολυστρωματικό υλικό της εταιρίας ΤΣΑΚΙΡΗΣ ΑΒΕΕ 55

57 3.3.5 Παραλαβή ελαίου από chips Κατά τη διάρκεια αποθήκευσης των συσκευασμένων chips πραγματοποιούνταν περιοδικές δειγματοληψίες από τις δύο σειρές δειγμάτων. Ακολουθούσε κατάτμηση του περιεχομένου κάθε συσκευασίας χειρωνακτικά και ζύγιση των chips (~30 g) σε ποτήρια ζέσεως των 200 ml. Η εκχύλιση του ελαίου γινόταν με προσθήκη 40 ml πετρελαϊκού αιθέρα και τοποθέτηση του δείγματος σε λουτρό υπερήχων για διάστημα παραμονής 10 min. Στη συνέχεια, παραλαμβανόταν το πετρελαιθερικό εκχύλισμα σε σφαιρική φιάλη των 250 ml υπό διήθηση. Το στερεό υποβαλλόταν σε άλλες δύο διαδοχικές εκχυλίσεις με τις ίδιες συνθήκες. Εικόνα 3.5: Κατατετμημένα chips τηγανισμένα σε καθαρό φοινικέλαιο (αριστερά) και σε εμπλουτισμένο φοινικέλαιο (δεξιά) Εικόνα 3.6: Εκχύλιση του φοινικέλαιου από κατατετμημένα chips με χρήση πετρελαϊκού αιθέρα σε λουτρό υπερήχων Elma Elmasonic S30H Τέλος, τα οργανικά εκχυλίσματα συμπυκνώνονταν σε περιστροφικό εξατμιστή κενού μέχρι ξηρού με θερμοκρασία υδρόλουτρου στους 40 C και τα παραλαμβανόμενα έλαια υποβάλλονταν σε προσδιορισμό του αριθμού υπεροξειδίων (PV). Εικόνα 3.7: Συμπύκνωση οργανικού εκχυλίσματος σε περιστροφικό εξατμιστή κενού του Εργαστηρίου Οργανικής Χημείας για παραλαβή του ελαίου από chips 56

58 3.4 Αναλυτικές μέθοδοι Μέθοδος μέτρησης αριθμού υπεροξειδίων (PV) Ο προσδιορισμός του αριθμού των υπεροξειδίων έγινε σύμφωνα με την πρότυπη μέθοδο της AOCS, Cd Αρχικά, παρασκευάζονταν τα διαλύματα που χρησιμοποιούνταν στη μέθοδο. Αναλυτικά παρασκευαζόταν κορεσμένο διάλυμα ιωδιούχου καλίου, διάλυμα αμύλου 1 % w/v, μίγμα διαλυτών οξικού οξέος - χλωροφορμίου σε αναλογία 3:2 v/v, καθώς επίσης και διάλυμα θειοθειικού νατρίου (Na2S2O3) 0,1 Ν. Στη συνέχεια, ζυγιζόταν ποσότητα ελαίου ίση με 1 g σε κωνική φιάλη των 100 ml. Στη φιάλη προστίθεντο 20 ml διαλύματος οξικού οξέοςχλωροφορμίου και 500 μl κορεσμένου διαλύματος ιωδιούχου καλίου. Ακολουθούσε ανάδευση της φιάλης για 1 min και έπειτα προσθήκη 20 ml απιονισμένου νερού και 500 μl διαλύματος αμύλου. Τέλος, πραγματοποιούταν τιτλοδότηση του περιεχομένου της φιάλης με θειοθειικό νάτριο και καταγραφόταν ο όγκος του τιτλοδότη που καταναλωνόταν μέχρι να αποχρωματιστεί το διάλυμα. Ακόμη, πραγματοποιούταν τιτλοδότηση και σε τυφλό δείγμα, ώστε να ελεγχθεί τυχόν ανάπτυξη αριθμών υπεροξειδίων στο διάλυμα του ιωδιούχου καλίου και στο μίγμα διαλυτών. Ο αριθμός υπεροξειδίων (Peroxide Value, PV) υπολογίζεται με βάση τον τύπο: PV = (S B) N 1000 m, όπου S: ο όγκος του θειοθειικού νατρίου που καταναλώθηκε κατά την τιτλοδότηση του δείγματος ελαίου (ml) B: ο όγκος του θειοθειικού νατρίου που καταναλώθηκε κατά την τιτλοδότηση του τυφλού δείγματος (ml) Ν: η κανονικότητα του διαλύματος θειοθειικού νατρίου m: η μάζα του δείγματος (g) Μέθοδος μέτρησης αριθμού π-ανισιδίνης (p-av) Ο προσδιορισμός του αριθμού π-ανισιδίνης έγινε σύμφωνα με την πρότυπη μέθοδο της AOCS, Cd Αρχικά, ζυγίζονταν 0,3 g ελαίου σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml και καταγραφόταν η ακριβής μάζα του. Ακολουθούσε αραίωση με ισοοκτάνιο μέχρι τη χαραγή, ανάδευση για πλήρη ομογενοποίηση και προσδιορισμός της απορρόφησης του δείγματος στα 350 nm (Ab). Ως τυφλό δείγμα χρησιμοποιούταν διαλύτης ισοοκτανίου. Στη συνέχεια, παραλαμβάνονταν 5 ml 57

59 από το αραιωμένο ελαιοδιάλυμα, τα οποία εισάγονταν σε δοκιμαστικούς σωλήνες όπου και προστίθετο 1 ml αντιδραστηρίου π-ανισιδίνης. Με τον ίδιο τρόπο, παρασκευαζόταν και το τυφλό δείγμα: Σε 5 ml καθαρού ισοοκτανίου προστίθετο 1 ml διαλύματος π-ανισιδίνης. Τα δείγματα αναδεύονταν και μετά από παραμονή σε ηρεμία για 10 min, πραγματοποιούταν μέτρηση της απορρόφησής τους στα 350 nm (As). Ο αριθμός της π-ανισιδίνης (p-anisidine value, p-av) υπολογίζεται με βάση τον τύπο: p-av= 25 (1,2A s A b ) m, όπου As: η απορρόφηση του αραιωμένου ελαιοδιαλύματος μετά την αντίδρασή του με την π- ανισιδίνη Ab: η αρχική απορρόφηση του αραιωμένου διαλύματος m: η μάζα του ελαιδιαλύματος (g) Μέθοδος μέτρησης αριθμού συζυγών διενίων Ο προσδιορισμός του αριθμού συζυγών διενίων έγινε σύμφωνα με την πρότυπη μέθοδο της IUPAC Αρχικά, ζυγιζόταν ποσότητα ελαίου ίση με 0,1 g σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml και καταγραφόταν η ακριβής μάζα του. Ακολουθούσε πλήρωση της ογκομετρικής φιάλης με ισοοκτάνιο μέχρι τη χαραγή. Στη συνέχεια, τα δείγματα αναδεύονταν ώστε να ομογενοποιηθούν και πραγματοποιούταν μέτρηση της απορρόφησής τους στο μήκος κύματος 232 nm, οπότε προέκυπτε ο αριθμός συζυγών διενίων (Κ232). Ως τυφλό δείγμα χρησιμοποιούταν καθαρό ισοοκτάνιο. Σε περίπτωση που οι τιμές των απορροφήσεων προέκυπταν μεγαλύτερες της μονάδας, πραγματοποιούταν κατάλληλη αραίωση των δειγμάτων και εκ νέου φωτομέτρηση. Ο αριθμός συζυγών διενίων υπολογίζεται με βάση τον τύπο: Α232: η απορρόφηση του δείγματος στα 232 nm C: η συγκέντρωση του δείγματος (g /100 ml) d: το μήκος της κυψελίδας (d=1 cm) Κ232= Α 232 C d, όπου 58

60 3.4.4 Ποσοτικός προσδιορισμός φαινολικών διτερπενίων με HPLC-DAD Ο προσδιορισμός των φαινολικών διτερπενίων (καρνοσικού οξέος και καρνοσόλης) των εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε σε υγρό χρωματογράφο υψηλής απόδοσης (HPLC) του Εργαστηρίου Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, που αποτελούταν από αντλία βαθμωτής έκλουσης HP 1100 και ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων (Diode Array Detector, DAD) (Hewlett Packard, Waldbronn, Germany), συνδεδεμένα με στήλη Hypersil C18 column ODS 5 μm, 250 x 4.6 mm (MZ Analysentechnik, Mainz, Germany). Τα χρωματογραφικά δεδομένα επεξεργάστηκαν με το λογισμικό ChemStation for LC 3D software (Agilent Technologies, , Waldbrook, Germany). Η ανάλυση βασίστηκε στο πειραματικό πρωτόκολλο που πρότειναν οι Okamura et al. (1994) με μόνη τροποποίηση τη χρησιμοποιούμενη στήλη. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε υπό ισοκρατικές συνθήκες με μίγμα νερού- ακετονιτριλίου (40:60) οξινισμένο με φωσφορικό οξύ (0.1% v/v). Ο ρυθμός ροής ήταν 1.0 ml/ min, η ανίχνευση γινόταν στα 230 nm και η διάρκεια κάθε ανάλυσης ήταν 15 min Προσδιορισμός ικανότητας δέσμευσης ελευθέρων ριζών με DPPH Η ικανότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών, προσδιορίστηκε με τη μέθοδο των Brand-Williams et al. (1995). Για την παρασκευή του διαλύματος DPPH, ζυγίζονταν 0,0025 g DPPH, μεταφέρονταν ποσοτικά σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και ακολουθούσε προσθήκη περίπου 60 ml διαλύτη (μεθανόλη). Έπειτα από έντονη ανακίνηση ώστε να διαλυθεί ολόκληρη η ποσότητα DPPH, γινόταν προσθήκη της υπόλοιπης ποσότητας διαλύτη μέχρι τη χαραγή της φιάλης. Το συγκεκριμένο διάλυμα πρέπει να είναι οπωσδήποτε φρέσκο και για το λόγο αυτό παρασκευαζόταν καθημερινά. Σύμφωνα με τη μέθοδο, 3,9 ml διαλύματος DPPH αναμιγνύονταν με 0,1 ml του διαλύματος αντιοξειδωτικού εντός γυάλινης κυψελίδας και καταγραφόταν η μείωση της απορρόφησης σε φασματοφωτόμετρο (HITACHI U2900, Tokyo, Japan) στα 515 nm, που αποτελεί το μέγιστο μήκος απορρόφησης στο φάσμα UV Vis της ρίζας. Το αντιοξειδωτικό δεν έπρεπε να βρίσκεται σε περίσσεια στο διάλυμα της αντίδρασης, επομένως σε κάθε περίπτωση εκχυλίσματος πραγματοποιούνταν αρχικά δοκιμαστικές μετρήσεις προκειμένου να επιλεχθεί εκείνη η συγκέντρωση, για την οποία στο πέρας της αντίδρασης η απορρόφηση ήταν > 0,1. Με βάση τα αποτελέσματα των δοκιμαστικών πειραμάτων, η απαιτούμενη ποσότητα του κάθε εκχυλίσματος μεταφερόταν σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml και αραιωνόταν με διαλύτη μέχρι τη χαραγή. Από αυτό το διάλυμα, παρασκευάζονταν διαλύματα αραίωσης με μεταφορά κατάλληλων ποσοτήτων σε ογκομετρικές φιάλες των 10 ml και πλήρωση με απιονισμένο νερό μέχρι τη χαραγή. Στη συνέχεια, σε γυάλινους σωλήνες μεταφέρονταν 3,9 ml διαλύματος DPPH, και 100 μl κάθε διαλύματος αντιοξειδωτικού- διαλύτη διαφορετικής συγκέντρωσης. Στο 59

61 διάλυμα λευκού προσδιορισμού, μεταφέρονταν 3,9 ml διαλύματος DPPH και 100 μl καθαρού διαλύτη (μεθανόλη), έτσι ώστε να προσδιορίζεται η αυθόρμητη αποσύνθεση της ρίζας. Τα δείγματα έμεναν για 5 h σε σκοτεινό μέρος, ένα επαρκές χρονικό διάστημα για την ολοκλήρωση της αντίδρασης και στο τέλος καταγραφόταν η απορρόφησή τους στα 515 nm. Για κάθε αραίωση πραγματοποιούνταν διπλές μετρήσεις. Με βάση τις απορροφήσεις που καταγράφηκαν, υπολογίστηκε το % ποσοστό DPPH που απομένει, με βάση τον τύπο: Όπου: % rem.dpph=100 (1 A ref A s A 100% ) Aref: η απορρόφηση του τυφλού διαλύματος DPPH στα 515 nm (μετά από 5 h) As: η απορρόφηση του DPPH μετά την αντίδραση με το εκχύλισμα (μετά από 5 h) A100%: η θεωρητική απορρόφηση του διαλύματος DPPH 60.2 μμ σε μεθανόλη, όπως καθορίζεται από την αντίστοιχη καμπύλη αναφοράς. Κάθε συγκέντρωση εκχυλίσματος εκφράστηκε ως gdry extract / kgdpph και παραστάθηκε γραφικά έναντι του αντίστοιχου ποσοστού του αδέσμευτου DPPH. Με γραμμική παλινδρόμηση, υπολογίστηκε η παράμετρος EC50. Πρόκειται για μια παράμετρο που ονομάζεται «αποτελεσματική συγκέντρωση» ή αλλιώς IC50. Η παράμετρος αυτή ορίζεται ως η συγκέντρωση του υποστρώματος που απαιτείται για να προκληθεί 50% απώλεια της δραστικότητας του DPPH (χρώμα). Η παράμετρος αυτή έχει βασικό χαρακτηριστικό ότι όσο υψηλότερη είναι η αντιοξειδωτική δράση, τόσο χαμηλότερη είναι η τιμή της Προσδιορισμός σύστασης αέρα της συσκευασίας των chips Πριν από κάθε δειγματοληψία για παραλαβή του ελαίου από τα συσκευασμένα chips, πραγματοποιούταν προσδιορισμός της σύστασης του αέρα της συσκευασίας. Η περιεκτικότητα του O2 εντός της συσκευασίας προσδιοριζόταν με τη συσκευή Gas Analyser CheckMate 9900 O2/CO2 PBI Dansensor (Ringsted, Denmark). 60

62 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 Παραλαβή αιθέριου ελαίου με υδρο-ατμοαπόσταξη Για την παραλαβή του αιθέριου ελαίου από τις βελόνες δενδρολίβανου χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της υδρο-ατμοαπόσταξης σε εργαστηριακή συσκευή απόσταξης χωρητικότητας 17 L. Η μέση υγρασία στις βελόνες δενδρολίβανου του εμπορίου που χρησιμοποιήθηκαν ήταν (8,0 ± 0,1) %. Κατά τη διάρκεια της διεργασίας και ανά τακτά διαστήματα, γινόταν καταγραφή της θερμοκρασίας, η οποία έφτασε σε μία σταθερή τιμή (T= 98 C) σε χρόνο t= 36 min. Η πρώτη σταγόνα που παρατηρήθηκε στον ογκομετρικό κύλινδρο στην έξοδο της συσκευής, σήμανε την έναρξη της απόσταξης και ήταν σε χρόνο t=28 min από τη στιγμή που τέθηκε σε λειτουργία ο αποστακτήρας και σε θερμοκρασία T= 91 C. Από τη στιγμή αυτή και έπειτα, γινόταν καταγραφή του όγκου του αποστάγματος στον αντίστοιχο χρόνο απόσταξης για τον υπολογισμό της μέσης ροής απόσταξης. Οι μετρήσεις που λήφθηκαν φαίνονται στον Πίνακα 4.1: Πίνακας 4.1: Μετρήσεις ροής αποστάγματος κατά την υδρο-ατμοαπόσταξη δενδρολίβανου Χρόνος απόσταξης (min) Όγκος αποστάγματος (ml) Ροή αποστάγματος (ml/min) , , , ,92 Με βάση τις παραπάνω μετρήσεις, η μέση ροή της διεργασίας της απόσταξης ήταν περίπου 108,5 ml/h. Από τη στιγμή της έναρξης της απόσταξης και ανά τακτά χρονικά διαστήματα γινόταν επίσης καταγραφή του όγκου του αιθέριου ελαίου. Το διάγραμμα του όγκου του παραλαμβανόμενου ελαίου συναρτήσει του χρόνου υδρο-ατμοαπόσταξης παρουσιάζεται στο Σχήμα 4.1: 61

63 Vελαίου (ml) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Χρόνος απόσταξης (min) Σχήμα 4.1: Διάγραμμα μεταβολής του όγκου αιθέριου ελαίου συναρτήσει του χρόνου υδροατμοαπόσταξης δενδρολίβανου Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4.1, η διεργασία παραλαβής αιθέριου ελαίου από το δενδρολίβανο διήρκησε 85 min (από την παρατήρηση της πρώτης σταγόνας). Ωστόσο, ο χρόνος που απαιτήθηκε από την παρατήρηση της πρώτης σταγόνας έως την απόσμηση του αποστάγματος ήταν 140 min. Ο συνολικός όγκος αιθέριου ελαίου που παραλήφθηκε ήταν 1,3 ml. Επίσης, στο Σχήμα 4.1 παρατηρείται ότι από την έναρξη της απόσταξης μέχρι την χρονική στιγμή t=29 min, παραλήφθηκαν 0,7 ml αιθέριου ελαίου, δηλαδή λίγο παραπάνω από την μισή της συνολικής ποσότητας του παραληφθέντος ελαίου. Από τη στιγμή εκείνη και μέχρι το τέλος της διεργασίας, το αιθέριο έλαιο απέσταζε με πιο αργό ρυθμό, αφού στα επόμενα 56 min, παραλήφθηκαν μόλις 0,6 ml ελαίου. Μετά το πέρας της διεργασίας, η μάζα του νωπού δενδρολίβανου ζυγίστηκε και υπολογίστηκε ότι το ποσοστό προσρόφησης νερού από το δενδρολίβανο ανήλθε στο 46 % επί της αρχικής ξηρής μάζας (400 g). 4.2 Απόδοση και χαρακτηρισμός εκχυλισμάτων Καμπύλες αναφοράς και προσδιορισμός ικανότητας δέσμευσης ελευθέρων ριζών Η ικανότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών και ο υπολογισμός της παραμέτρου EC50, όπως αναφέρθηκε και στην παράγραφο 3.4.5, βασίστηκε στη μέθοδο των Brand-Williams et al. (1995). Σύμφωνα με τη μέθοδο, κατασκευάστηκε η καμπύλη αναφοράς του DPPH, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4.2: 62

64 % remaining DPPH A515 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 DPPH reference curve y = 29,139x - 0,0024 R² = 0,9999 0,0E+00 1,0E-02 2,0E-02 3,0E-02 [DPPH] (g/l) Σχήμα 4.2: Καμπύλη αναφοράς DPPH Με βάση την καμπύλη αναφοράς του DPPH υπολογίστηκε η θεωρητική απορρόφηση του διαλύματος DPPH 60.2 μμ σε μεθανόλη (A100%). Από τις φωτομετρικές αναλύσεις των δειγμάτων, προέκυψαν οι τιμές απορρόφησης του τυφλού διαλύματος DPPH (Aref) και οι τιμές απορρόφησης του DPPH μετά την αντίδραση με το εκάστοτε εκχύλισμα (Αs). Έτσι, για κάθε εκχύλισμα υπολογίστηκε το ποσοστό DPPH που απέμενε με βάση τον τύπο: % rem.dpph=100 (1 A ref A s A 100% ) Στο Σχήμα 4.3 παρουσιάζεται ενδεικτικά το διάγραμμα του ποσοστού του εναπομείναντος DPPH συναρτήσει της συγκέντρωσης του αντιοξειδωτικού εκχυλίσματος Α5 (gdry extract / kgdpph). 100 Εκχύλισμα Α y = -0,1098x + 100,18 R² = 0, Cextract (g/kg DPPH) Σχήμα 4.3: Διάγραμμα μεταβολής του ποσοστού εναπομείναντος DPPH συναρτήσει της συγκέντρωσης του εκχυλίσματος Α 5 Τα διαγράμματα μεταβολής του ποσοστού εναπομείναντος DPPH συναρτήσει της συγκέντρωσης για όλα τα εκχυλίσματα παρουσιάζονται συγκεντρωτικά στο Παράρτημα Ι. Από τα διαγράμματα αυτά με γραμμική παλινδρόμηση υπολογίστηκε η παράμετρος EC50, η οποία εκφράζει τη συγκέντρωση του δείγματος που απαιτείται για να προκληθεί απώλεια της 63

65 A (230 nm) δραστικότητας του DPPH κατά 50 %. Επομένως, όσο χαμηλότερη είναι η τιμή της, τόσο υψηλότερη είναι η αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος. Ο δείκτης TPD (ολικά φαινολικά διτερπένια) υπολογίστηκε με βάση τις χρωματογραφικές αναλύσεις HPLC-DAD που πραγματοποιήθηκαν όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο 3.4.4, σύμφωνα με τη μέθοδο των Okamura et al. (1994). Η καμπύλη αναφοράς του καρνοσικού οξέος που προέκυψε παρουσιάζεται στο Σχήμα 4.4: Carnosic acid reference curve y = x R2 = carnosic acid (ppm) Σχήμα 4.4: Καμπύλη αναφοράς καρνοσικού οξέος Τα δείγματα αντιοξειδωτικών εκχυλισμάτων δενδρολίβανου που υποβάλλονταν σε ανάλυση HPLC-DAD είχαν συγκέντρωση περίπου 1000 ppm (mg ξηρού εκχυλίσματος/l διαλύματος ισοπροπανόλης). Με βάση τα αποτελέσματα των χρωματογραφικών αναλύσεων στα 230 nm και με τη βοήθεια της καμπύλης αναφοράς του καρνοσικού οξέος, υπολογίστηκε η συγκέντρωση των ολικών φαινολικών διτερπενίων σε κάθε εκχύλισμα. Στο Παράρτημα ΙΙ παρουσιάζονται αναλυτικά τα χρωματογράφηματα που προέκυψαν από την ανάλυση όλων των εκχυλισμάτων. Ενδεικτικά, παρατίθεται το χρωματογράφημα που προέκυψε από την ανάλυση του εκχυλίσματος Α5 συγκέντρωσης 1050 ppm (Σχήμα 4.5). Οι πρώτες μεγάλες κορυφές, που παρατηρούνται σε χρόνο περίπου 3.5 min, αφορούν σε φαινολικές ενώσεις όπως ροσμανόλη, επιροσμανόλη, κ.ά. που όπως έχει αποδειχθεί δεν παρουσιάζουν σημαντική αντιοξειδωτική δράση. Τα φαινολικά διτερπένια που ευθύνονται για τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες του δενδρολίβανου είναι κυρίως η καρνοσόλη και το καρνοσικό οξύ. Οι χρόνοι έκλουσης της καρνοσόλης και του καρνοσικού οξέος, όπως φαίνεται και στο χρωματογράφημα του Σχήματος 4.5, ήταν περίπου στα 7 και 10 min αντίστοιχα. Τα χρωματογραφήματα που προέκυψαν από τις αναλύσεις όλων των εκχυλισμάτων παρουσιάζονται συγκεντρωτικά στο Παράρτημα ΙΙ. Συμπερασματικά, ο δείκτης TPD δείχνει τη συγκέντρωση των κρίσιμων αντιοξειδωτικών ουσιών (καρνοσικού οξέος και καρνοσόλης) εκφρασμένη ως ppm καρνοσικού οξέος. Έτσι, όσο μεγαλύτερος είναι ο δείκτης αυτός, τόσο υψηλότερη είναι η ανάκτηση των αντιοξειδωτικών ουσιών που επετεύχθη με κάθε μέθοδο εκχύλισης. 64

66 mau DAD1A, Sig=230,10Ref=off (DIMITRIS\A5ROSEM0.D) min Σχήμα 4.5: Χρωματογράφημα HPLC-DAD για το εκχύλισμα Α 5 συγκέντρωσης 1050 ppm (mg ξηρού εκχυλίσματος/l διαλύματος ισοπροπανόλης) 65

67 Ο λόγος καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη αποτελεί δείκτη της καταπόνησης που έχει υποστεί το δενδρολίβανο, δεδομένου ότι το φυσικά απαντώμενο φαινολικό διτερπένιο είναι το καρνοσικό οξύ. Κατά τη διάρκεια των κατεργασιών που υφίσταται το φυτό, μέρος του καρνοσικού οξέος μετατρέπεται κυρίως σε καρνοσόλη και σε σημαντικά μικρότερο βαθμό, σε ροσμανόλη, επιροσμανόλη και 7-Ο-μεθυλο-επιροσμανόλη, ουσίες που εμφανίζουν χαμηλότερη αντιοξειδωτική δράση σε σχέση με τη μητρική ένωση [Richheimer S. et al., 1996]. Επομένως, όσο υψηλότερη είναι η τιμή του συγκεκριμένου λόγου, τόσο μικρότερη ποσότητα του καρνοσικού οξέος έχει αλλοιωθεί προς τα λοιπά φαινολικά διτερπένια Σύγκριση των εκχυλισμάτων ως προς την απόδοση, αντιριζική ικανότητα και περιεκτικότητα σε φαινολικά διτερπένια Για κάθε εκχύλισμα που παρασκευάστηκε, προσδιορίστηκε η απόδοση της διεργασίας, η παράμετρος EC50, η περιεκτικότητα σε ολικά φαινολικά διτερπένια (TPD) και ο λόγος καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη, όπως φαίνονται στον Πίνακα 4.2. Πίνακας 4.2. Οι κυριότεροι ποιοτικοί και ποσοτικοί δείκτες των εκχυλισμάτων δενδρολίβανου Εκχύλισμα Απόδοση διεργασίας (%) EC50 (gextr/kg DPPH) TPD* (ppm) sd carnosic acid/carnosol A A A A A A *εκφρασμένα ως καρνοσικό οξύ Η απόδοση κάθε εκχύλισης προσδιορίστηκε με βάση τον υπολογισμό του ξηρού εκχυλίσματος που προέκυπτε έπειτα από κάθε διεργασία συμπύκνωσης υπό κενό και εκφράστηκε σε ξηρή βάση φυτού (%). Συγκρίνοντας τις αποδόσεις της εκχύλισης με ακετόνη (εκχύλισμα Α0) και της εκχύλισης με υδατικό διάλυμα ΚΟΗ 5 % (εκχύλισμα Α4), προκύπτει ότι η εκχύλιση με ακετόνη είχε μεγαλύτερη απόδοση ως προς τα ολικά ανακτώμενα συστατικά σε σχέση με την εκχύλιση με ΚΟΗ. Παρόλα αυτά, η εκλεκτικότητα στην ανάκτηση των κρίσιμων αντιοξειδωτικών ουσιών, δηλαδή των φαινολικών διτερπενίων (TPD), ήταν υψηλότερη στη μέθοδο της αλκαλικής εκχύλισης. Σε ό,τι αφορά τον λόγο καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη, προκύπτει ότι στο 66

68 εκχύλισμα Α0 η περιεκτικότητα σε καρνοσικό οξύ είναι περίπου 14 φορές υψηλότερη από της καρνοσόλης, δηλαδή η πρώτη ύλη υπέστη μικρή καταπόνηση. Αντιθέτως, η αλκαλική εκχύλιση αν και οδήγησε σε εκλεκτικότερη ανάκτηση των TPD, αλλοίωσε σε σημαντικό βαθμό το προφίλ των ουσιών, καθώς ο λόγος καρνοσικού οξεός προς καρνοσόλη έχει πολύ χαμηλή τιμή. Όπως παρατηρείται και στον Πίνακα 4.2, μεγαλύτερη απόδοση είχε η διεργασία εκχύλισης με ακετόνη (εκχύλισμα Α0). Ωστόσο, επειδή η ακετόνη έχει την ιδιότητα να διαλυτοποιεί τόσο υδατικές όσο και λιπιδικές ενώσεις, το ακετονικό εκχύλισμα Α0 περιέχει και συστατικά αιθέριου ελαίου ή και άλλα κηρώδη συστατικά του φυτού. Για το λόγο αυτό, εξετάστηκαν δύο διαφορετικές προσεγγίσεις για την απομάκρυνση αυτών από το εκχύλισμα. Στην πρώτη προσέγγιση, τα ελαιώδη συστατικά απομακρύνθηκαν με κατεργασία του ξηρού εκχυλίσματος Αο με εξάνιο. Έτσι, το εκχύλισμα Α1 που προέκυψε ήταν μεν απαλλαγμένο από ελαιώδη συστατικά, παρουσίασε δε αρκετά μειωμένη συγκέντρωση ολικών φαινολικών διτερπενίων (TPD), καθώς το εξάνιο διαλυτοποιεί τις κρίσιμες αντιοξειδωτικές ουσίες του δενδρολίβανου (καρνοσικό οξύ και καρνοσόλη). Στην δεύτερη προσέγγιση, η απομάκρυνση του αιθέριου ελαίου επετεύχθη με εφαρμογή της τεχνικής της υδρο-ατμοαπόσταξης σε ξηρές βελόνες δενδρολίβανου και στη συνέχεια ξήρανση της φυτόμαζας, κονιοποίηση και εκχύλιση με ακετόνη (εκχύλισμα Α3). Συγκρίνοντας τις δύο εναλλακτικές προσεγγίσεις απομάκρυνσης των ελαιωδών συστατικών, φαίνεται ότι το εκχύλισμα Α3 υπερτερεί του εκχυλίσματος Α1 τόσο ως προς την ικανότητα δέσμευσης ριζών (EC50) όσο και ως προς την περιεκτικότητα σε φαινολικά διτερπένια (TPD). Οι δύο προηγούμενες παράμετροι έχουν άμεση συσχέτιση, καθώς η μείωση των TPD συνεπάγεται μείωση της αντιριζικής δράσης (δηλαδή αύξηση του EC50). Συνεπώς, η απόσμηση μέσω εκχύλισης με εξάνιο έχει ως αποτέλεσμα τη μερική απομάκρυνση και των φαινολικών διτερπενίων. Συγκεκριμένα μετά την κατεργασία με το εξάνιο, το εκχύλισμα έχει απωλέσει το 52,5 % του φορτίου του σε φαινολικά διτερπένια, οπότε η αύξηση της παραμέτρου EC50 είναι δικαιολογημένη. Η μόνη παράμετρος υπέρ του εκχυλίσματος Α1 είναι ο λόγος καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη, ο οποίος εξακολουθεί να έχει υψηλή τιμή, υποδεικνύοντας ότι η αλληλουχία διεργασιών που ακολουθήθηκε για την παραγωγή του εκχυλίσματος επέφερε χαμηλή καταπόνηση στην πρώτη ύλη. Πάντως ο λόγος καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη στο εκχύλισμα Α3 (τιμή ίση με 4,4) δείχνει ότι οι διεργασίες απόσταξη- εκχύλιση καταπονούν λιγότερο το καρνοσικό οξύ σε σχέση με τις διεργασίες εκχύλισης σε αλκαλικό περιβάλλον οξίνιση (εκχύλισμα Α4). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η ακετόνη ως διαλύτης έχει την ιδιότητα να διαλυτοποιεί τόσο λιπιδικά προϊόντα όσο και υδατοδιαλυτές ενώσεις σε ορισμένο βαθμό. Επομένως, αναμένεται 67

69 κατά την εκχύλιση να ανακτά και υδατοδιαλυτά συστατικά του δενδρολίβανου, όπως το καφεϊκό και το ροσμαρινικό οξύ. Οι συγκεκριμένες ουσίες έχουν περιορισμένη διαλυτότητα σε λιπαρές ύλες, οπότε ενδέχεται να δημιουργούν θολότητα στα έλαια στα οποία θα ενσωματωθούν τα αντίστοιχα εκχυλίσματα. Για το λόγο αυτό, εναλλακτικά των διεργασιών που ακολουθήθηκαν για την παραγωγή του Α3, πραγματοποιήθηκε και μια σειρά διεργασιών στην οποία μετά την απόσταξη και πριν την εκχύλιση με ακετόνη, το δενδρολίβανο κατατμήθηκε παρουσία νερού, ώστε να απομακρυνθούν τα υδατοδιαλυτά φαινολικά συστατικά. Το εκχύλισμα που προέκυψε κωδικοποιήθηκε ως Α2 και όπως φαίνεται στον πίνακα, η απόδοσή του ήταν 3,07 %. Παρατηρείται ότι η απόδοση αυτή είναι χαμηλότερη από εκείνη του Α3 (3,64 %), όπως ήταν αναμενόμενο. Η ανάκτηση των φαινολικών διτερπενίων και ο λόγος καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη διατηρήθηκαν στα ίδια επίπεδα με το εκχύλισμα Α3, συνεπώς η σημαντική αύξηση του EC50 (420 για το Α3 και 672 για το Α2) αποδίδεται στην μειωμένη ανάκτηση πολικών φαινολικών οξέων. Η ακολουθία διεργασιών Α2 εφαρμόστηκε και σε φρέσκο δενδρολίβανο (εκχύλισμα Α5), στο οποίο οι δείκτες απόδοση, EC50 και TPD προσδιορίστηκαν ακόμα καλύτεροι από το εμπορικό δενδρολίβανο. Ο λόγος καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη βρέθηκε χαμηλότερος, ενδεχομένως λόγω των συνθηκών ξήρανσης της πρώτης ύλης (24 h σε εργαστηριακό κλίβανο κυκλοφορίας αέρα θ=45 C). 4.3 Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής δράσης σε φοινικέλαιο Τα εκχυλίσματα που παρήχθησαν, αφού ενσωματώθηκαν σε φοινικέλαιο σε συγκέντρωση 500 ppm (mg ξηρού εκχυλίσματος/kg ελαίου), τοποθετήθηκαν στον φούρνο στους 180 C για 24 h προκειμένου να μελετηθεί η αντιοξειδωτική τους δράση σε συνθήκες που προσομοιάζουν το τηγάνισμα. Μαζί με τα εμπλουτισμένα δείγματα ελαίου, στον φούρνο τοποθετήθηκαν και δείγματα καθαρού ελαίου (control). Ανά τακτά διαστήματα πραγματοποιούνταν δειγματοληψίες για τη μέτρηση του αριθμού π- ανισιδίνης (p-av), τόσο για τα control όσο και για τα εμπλουτισμένα δείγματα. Επιπλέον, για τα δείγματα Α0, Α1, Α2 και Α3 πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις του αριθμού υπεροξειδίων (PV), καθώς και συζυγών διενίων (Κ232) Αριθμός π-ανισιδίνης (p-av) Τα αποτελέσματα των μετρήσεων του αριθμού π-ανισιδίνης για κάθε εκχύλισμα φαίνονται υπό μορφή διαγραμμάτων στα Σχήματα : 68

70 p-av p-av p-av Control Εκχύλισμα Α 0 500ppm αντιοξειδωτικού Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.6: Μεταβολή του αριθμού π-ανισιδίνης συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για το control και το εμπλουτισμένο έλαιο με εκχύλισμα Α Εκχύλισμα Α 1 control 500ppm αντιοξειδωτικού Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.7: Μεταβολή του αριθμού π-ανισιδίνης συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για το control και το εμπλουτισμένο έλαιο με εκχύλισμα Α Εκχύλισμα Α 2 control 500 ppm αντιοξειδωτικό Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.8: Μεταβολή του αριθμού π-ανισιδίνης συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για το control και το εμπλουτισμένο έλαιο με εκχύλισμα Α 2 69

71 p-av p-av p-av control Εκχύλισμα Α 3 500ppm αντιοξειδωτικού Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.9: Μεταβολή του αριθμού π-ανισιδίνης συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για το control και το εμπλουτισμένο έλαιο με εκχύλισμα Α control Εκχύλισμα Α ppm αντιοξειδωτικού Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.10: Μεταβολή του αριθμού π-ανισιδίνης συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για το control και το εμπλουτισμένο έλαιο με εκχύλισμα Α control Εκχύλισμα Α ppm αντιοξιεδωτικού Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.11: Μεταβολή του αριθμού π-ανισιδίνης συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για το control και το εμπλουτισμένο έλαιο με εκχύλισμα Α 5 70

72 Όπως φαίνεται από την κλίση των γραφικών παραστάσεων στα Σχήματα , ο ρυθμός αύξησης του αριθμού π-ανισιδίνης για το εμπλουτισμένο έλαιο είναι μικρότερος από αυτόν για το καθαρό έλαιο, γεγονός που υποδεικνύει την προστασία που παρέχει το αντιοξειδωτικό εκχύλισμα κατά την οξείδωση του ελαίου. Με τον όρο Προστασία (P), χαρακτηρίζεται η παράμετρος ποσοτικοποίησης του περιορισμού του βαθμού οξείδωσης του ελαίου που προκάλεσαν τα αντιοξειδωτικά εκχυλίσματα, η οποία υπολογίστηκε ως η ποσοστιαία μείωση της τιμής π- ανισιδίνης του εμπλουτισμένου ελαίου σε σχέση με την τιμή π- ανισιδίνης του καθαρού ελαίου, όπως αυτές μετρήθηκαν κατά την τελευταία δειγματοληψία του 24ώρου. Τα ποσοστά προστασίας που προέκυψαν για κάθε εκχύλισμα παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.3. Πίνακας 4.3. Τιμές % προστασίας που παρείχε κάθε αντιοξειδωτικό εκχύλισμα στο έλαιο με βάση τον αριθμό π- ανισιδίνης κατά την τελευταία μέτρηση του 24ώρου Εκχυλίσματα Χρόνος οξείδωσης (h) Προστασία (P %) Α0 23,5 17,7 Α ,4 Α ,0 Α ,1 Α ,6 Α ,5 Παρατηρείται ότι, ειδικά σε μεγάλους χρόνους οξείδωσης (t >7 h), οι τιμές του αριθμού π- ανισιδίνης διαφοροποιούνται σημαντικά για το καθαρό και το εμπλουτισμένο έλαιο που σημαίνει ότι η δράση του αντιοξειδωτικού εκχυλίσματος είναι ισχυρότερη όσο αυξάνεται ο χρόνος οξείδωσης. Έπειτα από στατιστική ανάλυση δεδομένων με τη βοήθεια του εργαλείου συσχέτισης του Excel, συσχετίστηκε η Προστασία (P) που παρέχει κάθε αντιοξειδωτικό εκχύλισμα με καθεμία από τις παραμέτρους του Πίνακα 4.2 (απόδοση διεργασίας, EC50, TPD και λόγος καρνοσικού οξέος προς καρνοσόλη) για τη συμπεριφορά όλων των εκχυλισμάτων εκτός από το Α0. Το συγκεκριμένο εκχύλισμα εξαιρέθηκε διότι περιείχε όλα τα συστατικά του αιθέριου ελαίου γεγονός που το καθιστούσε σημαντικά διαφορετικό από τα υπόλοιπα. Διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση της Προστασίας με τον δείκτη TPD (r=0.81), κάτι που ήταν αναμενόμενο, καθώς όσο υψηλότερη είναι η ανάκτηση των ολικών φαινολικών διτερπενίων τόσο μεγαλύτερη είναι η προστασία που παρέχει το αντιοξειδωτικό εκχύλισμα στο έλαιο. Σε ό,τι αφορά τις υπόλοιπες παραμέτρους, δεν διαπιστώθηκε κάποια συσχέτιση αυτών με την Προστασία. 71

73 K Αριθμός υπεροξειδίων (PV) και συντελεστής Κ232 Συμπληρωματικά με τις μετρήσεις του αριθμού π-ανισιδίνης, για τα εκχυλίσματα Α0, Α1, Α2 και Α3 προσδιορίστηκαν οι τιμές του αριθμού υπεροξειδίων (Πίνακας 4.4) και του συντελεστή Κ232 (Σχήματα ). Πίνακας 4.4: Τιμές αριθμού υπεροξειδίων (PV) για το control και τα εμπλουτισμένα δείγματα με εκχυλίσματα Α0, Α1, Α2, Α3 στους αντίστοιχους χρόνους οξείδωσης Χρόνος οξείδωσης (h) PV Control (meq O2/kg oil) PV Α0 (meq O2/kg oil) PV Α1 (meq O2/kg oil) PV Α2 (meq O2/kg oil) 0 0,7 1, PV Α3 (meq O2/kg 2 2,2 3, ,5 5 2,7 5, ,5 3,5 5,9 1,5 1 1 oil) Εκχύλισμα Α Control 500ppm αντιοξειδωτικού y = x R² = y = x R² = Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.12: Μεταβολή του συντελεστή Κ 232 συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για το control και το εμπλουτισμένο έλαιο με εκχύλισμα Α 0 72

74 K232 K232 Εκχύλισμα Α control 500ppm αντιοξειδωτικού y = x R² = y = x R² = Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.13: Μεταβολή του συντελεστή Κ 232 συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για το control και το εμπλουτισμένο έλαιο με εκχύλισμα Α 1 Εκχύλισμα Α control 500ppm αντιοξειδωτικού y = 0,3245x + 2,2936 R² = 0,9989 y = 0,3334x + 1,991 R² = 0, Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.14: Μεταβολή του συντελεστή Κ 232 συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για το control και το εμπλουτισμένο έλαιο με εκχύλισμα Α 2 73

75 K232 Εκχύλισμα Α control 500ppm αντιοξειδωτικού y = 0,3334x + 1,991 R² = 0,9873 y = 0,3007x + 1,6418 R² = 0, Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.15: Μεταβολή συντελεστή Κ 232 συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για το control και το εμπλουτισμένο έλαιο με εκχύλισμα Α 3 Οι τιμές του αριθμού υπεροξειδίων (Πίνακας 4.4) και ο συντελεστής Κ232 (Σχήματα ), όπως αποδείχθηκε, δεν αποτυπώνουν την αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων στις δεδομένες συνθήκες οξείδωσης του ελαίου. Οι χαμηλές τιμές των αριθμών υπεροξειδίων ήταν αναμενόμενες, καθώς τα υπεροξείδια (προϊόντα πρωτογενούς οξείδωσης) είναι ασταθείς ενώσεις που διασπώνται εύκολα στους 180 C. Σε ό,τι αφορά τον συντελεστή Κ232, όπως φαίνεται στα διαγράμματα, δεν υπάρχει διαφοροποίηση των τιμών του για τα control και τα εμπλουτισμένα δείγματα. Έτσι, η χρήση αυτών των δεικτών αποδεικνύεται αναξιόπιστη για το συγκεκριμένο στάδιο οξείδωσης. Επομένως, ο μόνος ασφαλής δείκτης για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής δράσης των εκχυλισμάτων σε θερμοκρασία 180 C είναι ο αριθμός π- ανισιδίνης, καθώς αποτελεί δείκτη δευτερογενούς οξείδωσης Προσομοίωση αντιοξειδωτικής δράσης του επιλεγμένου εκχυλίσματος (Α5) σε προϊόντα τηγανίσματος Η επιλογή του αντιοξειδωτικού εκχυλίσματος, για τη συνέχεια της πειραματικής διαδικασίας, βασίστηκε τόσο σε ποσοτικά χαρακτηριστικά, δηλαδή στους δείκτες των εκχυλισμάτων που αναλύθηκαν παραπάνω, όσο και σε ποιοτικά χαρακτηριστικά, όπως στη δυνατότητα ενσωμάτωσης των εκχυλισμάτων σε φοινικέλαιο και στη διαύγεια του τελικού μίγματος. Έπειτα από δοκιμές προσθήκης των εκχυλισμάτων σε συγκέντρωση 500 ppm (mg ξηρού εκχυλίσματος/kg ελαίου) στο έλαιο, επιλέχθηκε το ακετονικό εκχύλισμα απελαιωμένου και κατεργασμένου με νερό φρέσκου δενδρολίβανου (Α5), καθώς παρουσίασε καλύτερο αποτέλεσμα ενσωμάτωσης και πιο διαυγές ελαιοδιάλυμα. 74

76 p-av Πριν χρησιμοποιηθεί για το δεύτερο μέρος της πειραματικής διαδικασίας (τηγάνισμα chips), μελετήθηκε η αντιοξειδωτική του δράση μέσω του προσδιορισμού του αριθμού π-ανισιδίνης (p- AV) δειγμάτων που είχαν υποβληθεί σε οξείδωση στους 180 C, καθώς και κατά την αποθήκευση αυτών των δειγμάτων υπό συνθήκες επιταχυνόμενης οξείδωσης. Προσδιορισμός αριθμού π-ανισιδίνης για διάφορους χρόνους οξείδωσης στους 180 C Τα αποτελέσματα των μετρήσεων του αριθμού π-ανισιδίνης για τα control και τα εμπλουτισμένα δείγματα ελαίου για διαφορετικά χρονικά διαστήματα οξείδωσης (0, 3.5 και 8 h) παρουσιάζονται στο διάγραμμα του Σχήματος control αντιοξειδωτικό Α5 y = 2,714x + 4,7964 R² = 0,9673 y = 2,5093x + 4,8142 R² = 0, Χρόνος οξείδωσης (h) Σχήμα 4.16: Μεταβολή αριθμού π-ανισιδίνης συναρτήσει του χρόνου οξείδωσης στους 180 C για control και εμπλουτισμένα δείγματα με εκχύλισμα Α 5 Παρατηρείται ότι για μηδενικό χρόνο οξείδωσης στους 180 C, ο αριθμός π-ανισιδίνης στο δείγμα καθαρού φοινικέλαιου έχει χαμηλή τιμή ίση με αυτόν στο εμπλουτισμένο δείγμα, κάτι που ήταν αναμενόμενο καθώς τα δείγματα δεν έχουν οξειδωθεί, επομένως δεν υπάρχουν δευτερογενή προϊόντα οξείδωσης. Όσο αυξάνεται ο χρόνος οξείδωσης παρατηρείται ότι τα εμπλουτισμένα δείγματα εμφανίζουν μετά από 8 h ελαφρώς μικρότερη τιμή π-ανισιδίνης από τα αντίστοιχα control (24.1 ± 0.6 έναντι 25.5 ± 0.6), οι οποίες όμως δεν εμφανίζουν στατιστικά σημαντική διαφορά. To γεγονός αυτό συμφωνεί με τις μετρήσεις που λήφθηκαν κατά τις πρώτες δειγματοληψίες μετά τον χρόνο t= 0 h κατά το πείραμα 24ωρης οξείδωσης στους 180 C για το εκχύλισμα Α5 (Σχήμα 4.11). Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής προστασίας για διάφορους χρόνους παραμονής στους 70 C Κατά την αποθήκευση των δειγμάτων - που είχαν υποστεί οξείδωση στους 180 C για χρόνους t=0 h, t=3.5 h και t=8 h - στους 70 C, η εξέλιξη της οξείδωσης σε σχέση με τον χρόνο αποθήκευσης μελετήθηκε μέσω προσδιορισμού του αριθμού υπεροξειδίων (PV). Τα αποτελέσματα των μετρήσεων παρουσιάζονται στα διαγράμματα του Σχήματος

77 Σχήμα 4.17: Διαγράμματα αριθμού υπεροξειδίων συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης για χρόνους οξείδωσης στους 180 C t=0 h, t=3.5 h, t=8 h Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4.17, τα δείγματα καθαρού φοινικέλαιου παρουσιάζουν υψηλότερες τιμές αριθμών υπεροξειδίων από τα αντίστοιχα εμπλουτισμένα με αντιοξειδωτικό δείγματα, γεγονός που υποδεικνύει την προστασία που παρέχει το αντιοξειδωτικό έναντι της οξείδωσης. Πιο αναλυτικά, παρατηρείται ότι στα εμπλουτισμένα με αντιοξειδωτικό δείγματα υπάρχει αρχικά μια περίοδος κατά την οποία η οξείδωση εξελίσσεται με χαμηλό ρυθμό (περίοδος επώασης, IP). Στο καθαρό φοινικέλαιο παρατηρείται περίοδος επώασης μόνο για το μη θερμασμένο δείγμα στους 180 C. Στα δείγματα με αντιοξειδωτικό, η περίοδος αυτή διαφέρει ανάλογα με τον χρόνο παραμονής του ελαίου στους 180 C, δηλαδή όσο αυξάνεται το χρονικό διάστημα παραμονής, τόσο μειώνεται η περίοδος επώασης (Πίνακας 4.5). Τα δεδομένα του Πίνακα 4.5 (περίοδος επώασης, προστασία, επιμήκυνση χρόνου ζωής) έχουν προσδιοριστεί κατά προσέγγιση. Για μεγαλύτερη ακρίβεια στον υπολογισμό της περιόδου επώασης απαιτούνται συχνότερες δειγματοληψίες για μέτρηση του αριθμού υπεροξειδίων. Έπειτα από την περίοδο επώασης, η οξείδωση προχωρά με γρηγορότερο ρυθμό, όπως είναι φανερό από την αύξηση της κλίσης της καμπύλης. Μάλιστα, ο ρυθμός οξείδωσης παρουσιάζει πιο έντονη αύξηση στα δείγματα που έχουν υποστεί αρχική καταπόνηση στους 180 C. Η αύξηση του αριθμού υπεροξειδίων (PV) προσομοιάζεται ικανοποιητικά από το γραμμικό, ως προς τον χρόνο αποθήκευσης, κινητικό μοντέλο: PV = k t + PV 0 Για την ποσοτικοποίηση του περιορισμού του ρυθμού οξείδωσης που προκάλεσαν τα εκχυλίσματα, υπολογίστηκε η παράμετρος Προστασία (P=(1-ki/kc) 100), όπου ki: η σταθερά αύξησης του PV στο εμπλουτισμένο έλαιο και kc: η σταθερά αύξησης του PV του καθαρού ελαίου. Η Προστασία εκφράζει την % μείωση της σταθεράς σχηματισμού υδροϋπεροξειδίων, που προκαλείται από συγκέντρωση εκχυλίσματος 50 ppm (TPD εκφρασμένο ως καρνοσικό οξύ), ως προς τη σταθερά του καθαρού ελαίου. Συγκεκριμένα, υπολογίστηκαν δύο τιμές Προστασίας 76

78 για κάθε διαφορετικό χρόνο οξείδωσης στους 180 C: μία με βάση τη σταθερά αύξησης του αριθμού υπεροξειδίων κατά την περίοδο επώασης (P1) και μία με βάση τη σταθερά αύξησης του αριθμού υπεροξειδίων μετά την περίοδο επώασης (P2). Επιπλέον, υπολογίστηκε η επιμήκυνση του χρόνου ζωής που επήλθε στο έλαιο λόγω της παρουσίας του αντιοξειδωτικού εκχυλίσματος. Ο υπολογισμός αυτός έγινε με βάση τον χρόνο στον οποίο ο αριθμός υπεροξειδίων έφτασε στην τιμή PV=20 meq O2/kg ελαίου, που θεωρείται ως η ανώτατη επιτρεπόμενη τιμή PV για το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο και το παρθένο ελαιόλαδο [Commission Regulation (EEC) No 2568/91]. Φυσικά, η τιμή αυτή αναφέρεται σε προϊόντα (λίπη, έλαια και τρόφιμα με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά) που περιέχουν ελαιόλαδο και όχι φοινικέλαιο και που διατηρούνται στο ράφι σε θερμοκρασία δωματίου και όχι σε συνθήκες οξείδωσης, όπως αυτές του συγκεκριμένου πειράματος. Επομένως, όπως είναι λογικό, ο υπολογισμός αυτός είναι πολύ προσεγγιστικός. Τα αποτελέσματα αυτών των εκφράσεων ποσοτικοποίησης της αντιοξειδωτικής δράσης του εκχυλίσματος Α5 παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.5: Πίνακας 4.5: Οι περίοδοι επώασης (IP) κατά την αποθήκευση στους 70 C των control και εμπλουτισμένων δειγμάτων ελαίου που υποβλήθηκαν σε διαφορετικούς χρόνους θέρμανσης στους 180 C, οι τιμές Προστασίας του αντιοξειδωτικού Α5 (50 ppm) κατά την περίοδο επώασης (P1) και μετά την περίοδο επώασης (P2) και η % επιμήκυνση του χρόνου ζωής του ελαίου tθέρμανσης 180 C (h) IPcontrol (d) IPantiox (d) P1 (%) P2 (%) Επιμήκυνση χρόνου ζωής (%) Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4.5, οι τιμές Προστασίας που παρείχε το αντιοξειδωτικό στο φοινικέλαιο κατά τη διάρκεια της περιόδου επώασης (P1) παρέμειναν σε συγκρίσιμα επίπεδα ανεξαρτήτως του χρόνου αρχικής θέρμανσης στους 180 C. Ωστόσο, η αύξηση του χρόνου παραμονής στους 180 C έχει ως αντίκτυπο, πέρα από τη μείωση της περιόδου επώασης του εμπλουτισμένου ελαίου, τη μείωση της Προστασίας που παρείχε το αντιοξειδωτικό μετά την περίοδο επώασης (P2), αλλά και τη μείωση της % επιμήκυνσης του χρόνου ζωής του ελαίου. 77

79 p-a.v. 4.4 Τηγάνισμα chips Μετά το τηγάνισμα κάθε παρτίδας, τα chips τοποθετούνταν σε διηθητικό χαρτί προκειμένου να στραγγίσουν από το έλαιο και ζυγίζονταν ώστε να προσδιοριστεί η μάζα ελαίου που απορρόφησαν κατά τη διάρκεια του τηγανίσματος. Η μέση λιποπεριεκτικότητα των παρτίδων τηγανισμένων chips υπολογίστηκε ότι ήταν 30%. Εικόνα 4.1: Παρτίδα νωπών φετών πατάτας πριν το τηγάνισμα Εικόνα 4.2: Επαγγελματική φριτέζα πληρωμένη με φοινικέλαιο Εικόνα 4.3: Τηγανισμένες παρτίδες chips σε διηθητικό χαρτί Μεταβολή αριθμού π-ανισιδίνης κατά τη διάρκεια του τηγανίσματος Κατά τη διάρκεια των τηγανισμάτων των φετών πατάτας, λαμβάνονταν δείγματα ελαίου από τη φριτέζα και προσδιοριζόταν ο αριθμός π-ανισιδίνης (p-av). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 4.18: control palm oil y = 0,2512x + 6,4202 R² = 0, palm oil + 50 ppm TPD A y = 0,0853x + 6,1129 R² = 0, frying time (min) Σχήμα 4.18: Διάγραμμα μεταβολής του αριθμού π-ανισιδίνης καθαρού (control palm oil) και εμπλουτισμένου (palm oil + 50 ppm TPD A 5) φοινικέλαιου συναρτήσει του χρόνου τηγανίσματος Με βάση το διάγραμμα, διαπιστώνεται ότι το αντιοξειδωτικό περιόρισε το ρυθμό οξείδωσης της λιπαρής ύλης περίπου κατά 66%. Συμπεραίνεται λοιπόν ότι το αντιοξειδωτικό προστατεύει σε 78