ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΔΕΥΤΕΡΟΓΕΝΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΩΝ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΤΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΑΤΑΣ, ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΗΣ ΜΕ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΡΟΠΟ ΚΑΙ ΣΕ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΔΑΦΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΛΛΙΟΠΗ Ι. ΚΑΔΟΓΛΙΔΟΥ Πτυχιούχος Γεωπόνος Α.Π.Θ., M.Sc. Α.Π.Θ. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΔΕΥΤΕΡΟΓΕΝΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΩΝ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΤΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΑΤΑΣ, ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΗΣ ΜΕ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΡΟΠΟ ΚΑΙ ΣΕ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΔΑΦΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΛΛΙΟΠΗ Ι. ΚΑΔΟΓΛΙΔΟΥ Πτυχιούχος Γεωπόνος Α.Π.Θ., M.Sc. Α.Π.Θ. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

3 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΔΕΥΤΕΡΟΓΕΝΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΩΝ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΤΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΑΤΑΣ, ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΗΣ ΜΕ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΡΟΠΟ ΚΑΙ ΣΕ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΔΑΦΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΚΑΛΛΙΟΠΗ Ι. ΚΑΔΟΓΛΙΔΟΥ Πτυχιούχος Γεωπόνος Α.Π.Θ., M.Sc. Α.Π.Θ. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στη Γεωπονική Σχολή Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Κατεύθυνση Γενετικής, Βελτίωσης, Αγροκομίας και Ζιζανιολογίας ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ελένη-Ίσις Α. Κωνσταντινίδου, Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Γεωπονική Σχολή Α.Π.Θ. Δέσποινα Βώκου, Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας Α.Π.Θ. Ηλίας Ελευθεροχωρινός, Καθηγητής Γεωπονική Σχολή Α.Π.Θ. ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Χρήστος Δόρδας, Επίκουρος Καθηγητής Γεωπονική Σχολή Α.Π.Θ. Αναστασία Λαγοπόδη, Επίκουρος Καθηγήτρια Γεωπονική Σχολή Α.Π.Θ. Αικατερίνη Καραμανώλη, Λέκτορας Γεωπονική Σχολή Α.Π.Θ. Καλλιόπη Ραδόγλου, Ερευνήτρια Α' ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε.

4 Καλλιόπη Ι. Καδογλίδου Α.Π.Θ. ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΔΕΥΤΕΡΟΓΕΝΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΤΩΝ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΤΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΑΤΑΣ, ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΗΣ ΜΕ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΡΟΠΟ ΚΑΙ ΣΕ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΔΑΦΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ «Η έγκριση της παρούσης Διδακτορικής Διατριβής από τη Γεωπονική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2)

5 Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελεί μέρος του έργου ΠΕΝΕΔ με τίτλο «Αξιοποίηση εγχώριων φυσικών πόρων στη βιολογική γεωργία: Ρύθμιση παραμέτρων του συστήματος έδαφος-φυτό με δευτερογενείς μεταβολίτες αρωματικών φυτών». Το έργο υλοποιήθηκε στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα Γ' Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης και συγχρηματοδοτήθηκε κατά: 75% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαϊκή ένωση - Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο 25% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο - Υπουργείο Ανάπτυξης - Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας. v

6 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους εκείνους που με την καθοδήγηση, τη συμβολή και τη συμπαράστασή τους στάθηκαν αρωγοί στην ολοκλήρωση της διδακτορικής μου διατριβής. Ευχαριστώ πρωτίστως τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής. Ευχαριστώ από τα βάθη της καρδιάς μου την καθηγήτρια της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Eλένη-Ίσιδα Κωνσταντινίδου, η οποία έφερε την κύρια ευθύνη της καθοδήγησής μου. Πάντα μου πρόσφερε αφειδώς υποδείξεις και πολύτιμες συμβουλές τόσο στην οργάνωση των πειραμάτων όσο και κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας. Η διαλεκτική της σκέψη στη σύλληψη και στο σχεδιασμό των πειραμάτων αλλά και οι νέες κατευθύνσεις στη μελέτη ενός θέματος αποτελούν φωτεινά παραδείγματα για μένα. Ιδιαίτερα θα ήθελα να την ευχαριστήσω για τις ατελείωτες ώρες που αφιέρωσε στη διόρθωση της διατριβής. Η διδασκαλία της κατά τη διάρκεια των σπουδών μου (προπτυχιακών, μεταπτυχιακών και διδακτορικού), είναι για μένα ανεκτίμητη παρακαταθήκη για την επιστημονική μου εξέλιξη. Ευχαριστώ θερμά τον καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Ηλία Ελευθεροχωρινό, μέλους της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, ο οποίος παρακολούθησε όλα τα στάδια της εκπόνησης της διατριβής μου, με ενεθάρρυνε και με τις σαφείς υποδείξεις του και τις ορθές παρεμβάσεις του ακούραστα με καθοδήγησε. Συνετέλεσε ουσιαστικά στη βελτίωση της λογικής μου. Τον ευχαριστώ και εκτίμησα ιδιαίτερα γιατί ασχολήθηκε ενεργά με τη διόρθωση της διατριβής μου, παρά το ασφυκτικά πιεστικό καθημερινό του πρόγραμμα. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. κ. Δέσποινα Βώκου που με την απλόχερη παροχή προτάσεων και υποδείξεων, με στήριξε με αμεσότητα σε όλα τα στάδια της διατριβής, ενώ συγχρόνως ήταν και η επιστημονικώς υπεύθυνη του έργου που χρηματοδότησε την προσπάθειά μου. Η επιμονή της και η εγρήγορσή της για περαιτέρω μελέτη σε ό,τι ενδιαφέρον πειραματικά προέκυπτε, θα είναι φωτεινό παράδειγμα για μένα. Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γεωργικής Χημείας της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ., κάτω από την άμεση καθοδήγηση της λέκτορος της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Αικατερίνης Καραμανώλη. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την κ. Καραμανώλη για την υπομονή της και για την πολύτιμη και ουσιαστική βοήθεια που μου προσέφερε κατά την πειραματική διαδικασία, καθώς απετέλεσε για μένα vi

7 δασκάλα των περισσότερων τεχνικών και εργαλείων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Ευχαριστώ θερμά την επίκουρη καθηγήτρια της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Αναστασία Λαγοπόδη για την πολύτιμη, στενή και ευχάριστη συνεργασία της στα θέματα της διατριβής που αφορούσαν τους μύκητες. Η κ. Λαγοπόδη, πέρα από την επιστημονική συμβολή της, στάθηκε ως πραγματική φίλη δίπλα στις αδυναμίες του χαρακτήρα μου και με στήριξε σε δύσκολες στιγμές. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω την ερευνήτρια Α' του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. κ. Καλλιόπη Ραδόγλου και τον επίκουρο καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Χρήστο Δόρδα για την τιμή που μου έκαναν να είναι μέλη της εξεταστικής μου επιτροπής, αλλά και για τις χρήσιμες υποδείξεις τους για τη βελτίωση της διατριβής. Την κ. Καλλιόπη Ραδόγλου ευχαριστώ επιπλέον, μαζί με τον μεταπτυχιακό φοιτητή κ. Γρηγόρη Μοράκη, για τη βοήθειά τους στις μετρήσεις φωτοσύνθεσης. Οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στη λέκτορα της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. κα Χρυσούλα Τανανάκη και στον καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Ανδρέα Θρασυβούλου για την ουσιαστική συμβολή τους σε μέρος της διατριβής μου που αφορούσε τη χρωματογραφική ανάλυση. Τον κ. Χρήστο Παπαδόπουλο της εταιρείας γεωργικών εφοδίων «Ύψιλον» ευχαριστώ για την συνεχή και αφιλοκερδή χορήγηση του υβριδίου τομάτας. Ευχαριστίες οφείλω και στον ερευνητή Β του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. κ. Κωνσταντίνο Μπλαδενόπουλο για την παραχώρηση φυτικού υλικού σιταριού και κριθαριού από καλλιέργειές τους στο Ινστιτούτο Σιτηρών καθώς και στον λέκτορα της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. κ. Αθανάσιο Μολασιώτη για τη βοήθεια που μου προσέφερε στην ανόργανη ανάλυση των φυτικών ιστών. Ακόμη, ευχαριστώ τον επίκουρο καθηγητή της Σχολής Τεχνολογίας Γεωπονίας του Τ.Ε.Ι. Λάρισας κ. Ιωάννη Βασιλάκογλου για την παραχώρηση ορισμένων σπόρων ζιζανίων, που αποτελούσαν μέρος της προσωπικής του συλλογής. Ευχαριστίες οφείλω και σε όλο το προσωπικό και συναδέλφους φίλους του εργαστηρίου Γεωργικής Χημείας για τη συνεργασία τους, τη δημιουργία ευχάριστου συναδελφικού κλίματος μέσα στο εργαστήριο και τα χαλαρωτικά μας διαλείμματα: στη Γεωργία Τάνου, στην Αικατερίνη Σουνά, στο Δημήτριο Χάλκο (με τον οποίο επιπλέον πραγματοποιήσαμε από κοινού την εγκατάσταση ορισμένων πειραμάτων), στην Άντρη Παφίτου. vii

8 Τέλος, τις περισσότερες ευχαριστίες οφείλω στους αγαπημένους μου γονείς Γιάννη και Βάγια, στον αδελφό μου Χρήστο και στο σύζυγό μου Δημήτρη, γιατί με την ενθάρρυνσή τους, την αμέριστη υλική και ηθική συμπαράσταση και κυρίως την υπομονή τους όλα αυτά τα χρόνια, μπόρεσα να ολοκληρώσω αυτόν τον κύκλο της ζωής μου. viii

9 Στους γονείς μου, στο σύζυγό μου, για την υπομονή τους, για την εμψύχωσή τους Στην κόρη μου, για τις ώρες που με στερήθηκε ix

10 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Σελίδα ΠΕΡΙΛΗΨΗ 5 ABSTRACT 9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Δευτερογενείς μεταβολίτες 14 2 Αρωματικά φυτά και αιθέρια έλαια Αλληλοπάθεια Βελτίωση του εδάφους με προσθήκη κομπόστας Bιολογική γεωργία Ερευνητικό αντικείμενο 22 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 24 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΚΟΜΠΟΣΤΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΕ ΤΟΜΑΤΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΗ ΜΕ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΡΟΠΟ 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κομποστοποίηση Επεμβάσεις Επιδράσεις των επεμβάσεων στα ζιζάνια και στα σπορόφυτα της τομάτας Επιδράσεις των επεμβάσεων στο εδαφικό περιβάλλον Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κομποστοποίηση Επιδράσεις των επεμβάσεων στα ζιζάνια και στα σπορόφυτα της τομάτας Επιδράσεις των επεμβάσεων στο εδαφικό περιβάλλον Ανίχνευση νιτροποιητικών βακτηρίων Προσδιορισμός ολικού πληθυσμού εδαφογενών μυκήτων ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 61 1

11 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 66 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΧΩΡΙΣ ΚΟΜΠΟΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΣE ΤΟΜΑΤΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΗ ΜΕ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΡΟΠΟ 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Φυτικό υλικό Εγκατάσταση πειράματος (πείραμα σε σπορεία) Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού από έξι φυτά στη 72 φυτρωτική ικανότητα και στην αύξηση των σποροφύτων τομάτας Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού δυόσμου και 72 φασκόμηλου στη φυτρωτική ικανότητα και στην αύξηση των σποροφύτων τομάτας Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού δυόσμου και 73 φασκόμηλου στον πληθυσμό εδαφογενών μυκήτων 3.3. Πείραμα αγρού Επιπτώσεις στα φυτά της τομάτας Επιπτώσεις στο εδαφικό περιβάλλον Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού από έξι φυτά στη 74 φυτρωτική ικανότητα και στην αύξηση των σποροφύτων τομάτας 4.2. Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού δυόσμου και 76 φασκόμηλου στη φυτρωτική ικανότητα και στην αύξηση των σποροφύτων τομάτας 4.3. Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού δυόσμου και 78 φασκόμηλου στον πληθυσμό εδαφογενών μυκήτων 4.4. Πείραμα αγρού ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 85 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 87 ΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΦΥΛΛΩΝ ΚΑΙ ΑΙΘΕΡΙΟΥ ΕΛΑΙΟΥ ΤΟΥ ΑΡΩΜΑΤΙΚΟΥ ΦΥΤΟΥ Mentha spicata ΣΤΟ ΕΔΑΦΟΣ 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 88 2

12 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματική διαδικασία Χρωματογραφική ανάλυση δειγμάτων - Προσδιορισμός επιμέρους συστατικών ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 98 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙN VITRO ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΟΥ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΑΙΘΕΡΙΟΥ ΕΛΑΙΟΥ ΤΟΥ ΑΡΩΜΑΤΙΚΟΥ ΦΥΤΟΥ Mentha spicata ΚΑΙ ΤΟΥ ΚΥΡΙΟΥ ΣΥΣΤΑΤΙΚΟΥ ΤΟΥ-ΚΑΡΒΟΝΗ 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Προσδιορισμός επιμέρους συστατικών του αιθερίου ελαίου Εργαστηριακός έλεγχος ζιζανιοκτόνου δράσης του αιθερίου ελαίου και της 106 καρβόνης 3.3. Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Προσδιορισμός επιμέρους συστατικών του αιθερίου ελαίου Εργαστηριακός έλεγχος ζιζανιοκτόνου δράσης του αιθερίου ελαίου και της 108 καρβόνης 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 120 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΚΑΙ ΜΟΝΟΤΕΡΠΕΝΙΩΝ ΣΤΗΝ ΑΥΞΗΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΛΙΩΝ ΚΑΙ ΣΤΗ ΣΠΟΡΙΟΠΟΙΗΣΗ ΕΔΑΦΟΓΕΝΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Παραλαβή αιθερίων ελαίων-χημική ανάλυση δευτερογενών μεταβολιτών Εργαστηριακός έλεγχος αντιμυκητιακής δράσης αιθερίων ελαίων και των 127 3

13 κύριων συστατικών τους Απομόνωση μυκήτων από καλλιέργεια τομάτας Προετοιμασία μολύσματος κονιδίων Τεχνική διάχυσης από εμποτισμένους χάρτινους δίσκους Αναστολή ανάπτυξης μυκηλίου Αναστολή ικανότητας σποριοποίησης Ικανότητα επανάκτησης της μυκηλιακής ανάπτυξης Αντιμυκητιακή δράση καρβόνης και καρβακρόλης στο έδαφος Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Παραλαβή αιθερίων ελαίων-χημική ανάλυση δευτερογενών μεταβολιτών Εργαστηριακός έλεγχος αντιμυκητιακής δράσης αιθερίων ελαίων και των 133 κύριων συστατικών τους Απομόνωση μυκήτων από καλλιέργεια τομάτας Αναστολή ανάπτυξης μυκηλίου Αναστολή ικανότητας σποριοποίησης Ικανότητα επανάκτησης της μυκηλιακής ανάπτυξης Αντιμυκητιακή δράση καρβόνης και καρβακρόλης στο έδαφος ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 152 ΓΕΝΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 153 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 156 4

14 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 5

15 Σε πέντε ανεξάρτητα πειράματα μελετήθηκε η επίδραση των δευτερογενών μεταβολιτών αρωματικών φυτών σε διάφορα φυσιολογικά και αγροκομικά χαρακτηριστικά τομάτας καλλιεργούμενης με βιολογικό τρόπο και στο εδαφικό περιβάλλον. Στο πρώτο πείραμα διερευνήθηκε η επίδραση της ενσωμάτωσης στο έδαφος κομπόστας των αρωματικών φυτών δυόσμου (Mentha spicata L.) και φασκόμηλου (Salvia fruticosa Mill.) σε σπορόφυτα τομάτας και στο εδαφικό περιβάλλον. Οι κομπόστες ενσωματώθηκαν σε ποσότητα 0, 2, 4, 8% (w:w, κομπόστα:έδαφος), με προσθήκη οργανικής ή συμβατικής λίπανσης. Η ωφέλιμη φωτοσύνθεση, η στοματική αγωγιμότητα και η φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα των σποροφύτων τομάτας αυξήθηκαν σημαντικά παρουσία κομπόστας δυόσμου σε ποσότητα 8% στο έδαφος, ανεξαρτήτως είδους λίπανσης. Ο συνδυασμός κομπόστας δυόσμου σε ποσότητα 8% σε συνδυασμό με οργανική λίπανση μείωσε σημαντικά τον πληθυσμό των αγρωστωδών και κυρίως των πλατύφυλλων ζιζανίων, ενώ είχε θετική επίδραση στο ξηρό βάρος του υπέργειου και του ριζικού συστήματος των σποροφύτων τομάτας. Στο εδαφικό περιβάλλον, τα νιτροποιητικά βακτήρια των γενών Nitrosomonas και Νitrosospira δεν επηρεάστηκαν από την προσθήκη των συγκεκριμένων ποσοτήτων κομπόστας δυόσμου ή φασκόμηλου στο έδαφος, ενώ ο εδαφογενής πληθυσμός μυκήτων αυξήθηκε σημαντικά και ανάλογα με την χρησιμοποιηθείσα ποσότητα κομπόστας των δύο αρωματικών φυτών. Στο δεύτερο πείραμα διερευνήθηκε η επίδραση της ενσωμάτωσης στο έδαφος αποξηραμένου φυτικού υλικού δυόσμου (M. spicata) και φασκόμηλου (S. fruticosa) (επιλεγέντων μεταξύ άλλων αρωματικών φυτών και χειμερινών σιτηρών), χωρίς προθύστερη κομποστοποίησή τους, σε σπορόφυτα τομάτας και στο εδαφικό περιβάλλον. Το πείραμα αυτό επιπλέον αποσκοπούσε και στη σύγκριση της επίδρασης αποδομούμενου υλικού αρωματικών φυτών στις προαναφερθείσες παραμέτρους σε σχέση με εκείνην του κομποστοποιημένου. Η ενσωμάτωση στο έδαφος εν δυνάμει κομποστοποιήσιμου φυτικού υλικού δυόσμου είχε σημαντική θετική επίδραση, σε όλες τις ποσότητες εφαρμογής του (2, 4 και 8%, w:w, φυτικό υλικό:έδαφος), στη φυτρωτική ικανότητα, στο ύψος (διπλάσιο σε σχέση με το μάρτυρα), στο μέγιστο μήκος και πλάτος φύλλου και στο ξηρό βάρος των σποροφύτων τομάτας (εξαπλάσιο σε σχέση με το μάρτυρα). Στο εδαφικό περιβάλλον, η επίδρασή του στον ολικό πληθυσμό μυκήτων ήταν παρόμοια με αυτή της προαναφερθείσης κομπόστας των αρωματικών φυτών. 6

16 Στο τρίτο πείραμα μελετήθηκε η διαδικασία αποδόμησης των αιθερίων ελαίων και των τερπενίων που περιέχονται σε εν δυνάμει κομποστοποιήσιμο φυτικό υλικό δυόσμου (M. spicata) που ενσωματώθηκε στο έδαφος σε ποσότητα 0, 2, 4 και 8% (w:w, φυτικό υλικό:έδαφος). H διαδικασία αποδόμησης διερευνήθηκε με απόσταξη και ακολούθως ανάλυση με GC-MS εδαφικών δειγμάτων που πάρθηκαν σε 0, 15, 35 και 60 ημέρες από την ενσωμάτωση του φυτικού υλικού στο έδαφος. Στις 60 ημέρες από την ενσωμάτωση του φυτικού υλικού, η περιεκτικότητα του εδάφους σε αιθέριο έλαιο δυόσμου μειώθηκε περισσότερο από 90% σε όλες τις επεμβάσεις (διαφορετικές ποσότητες ενσωμάτωσης του φυτικού υλικού), σε σχέση με την περιεκτικότητά του τη χρονική στιγμή της ενσωμάτωσης του φυτικού υλικού στο έδαφος. Επίσης, η ανάλυση του αποσταχθέντος αιθερίου ελαίου δυόσμου έδειξε μείωση της συγκέντρωσης των μονοτερπενίων (κυρίως της καρβόνης) και αύξηση της συγκέντρωσης των σεσκιτερπενίων (κυρίως του καρυοφυλλένιου, του μπουρμπονένιου, του καλαμελένιου και του επι-δικυκλο-σεσκιφελλανδρένιου), γνωστών τερπενίων που ενεργοποιούν τη χημική άμυνα των φυτών και που πρόσφατα διερευνάται η χρήση τους ως φυτορρυθμιστικών ουσιών. Στο τέταρτο πείραμα διερευνήθηκε η αλληλοπαθητική δράση του αιθερίου ελαίου του αρωματικού φυτού δυόσμος (M. spicata) και του κύριου συστατικού του, του μονοτερπενίου καρβόνη, εναντίον της τομάτας (Lycopersicon esculentum L.) και των ζιζανίων Abutilon theophrasti L., Datura stramonium L., Oryza sativa L. και Phalaris paradoxa L. σε πειράματα in vitro. Τα αποτελέσματα έδειξαν ισχυρή ανασταλτική επίδραση (φαινόμενο αλληλοπάθειας) στη βλαστική ικανότητα, στην αύξηση και στο νωπό βάρος των ζιζανίων φάλαρη (P. paradoxa) και τάτουλας (D. stramonium) και μικρότερη, αλλά επίσης σημαντική αναστολή στις ίδιες παραμέτρους των ζιζανίων αγριοβαμβακιά (A. theophrasti) και κόκκινο ρύζι (O. sativa). Η βλαστική ικανότητα της τομάτας μειώθηκε κατά 50% σε σχέση με τον μάρτυρα παρουσία 3.22 μl του αιθερίου ελαίου δυόσμου/τρυβλίο. Γενικώς, η τομάτα έδειξε μειωμένη βλαστική ικανότητα και μειωμένη αύξηση κατά τα πρώτα στάδια και στις λοιπές συγκεντρώσεις του αιθερίου ελαίου και της καρβόνης που εφαρμόσθηκαν. Στο πέμπτο πείραμα διερευνήθηκε η επίδραση των αιθερίων ελαίων δυόσμου (M. spicata), λεβάντας (Lavandula stoechas L.), ρίγανης (Origanum vulgare L. subsp. hirtum) και φασκόμηλου (S. fruticosa), καθώς και των μονοτερπενίων καρβόνης, φεγχόνης, καρβακρόλης, 1,8-κινεόλης, α-πινενίου και τερπινεν-4-όλης εναντίον εδαφογενών μυκήτων (μεμονωμένα ή σε μίγματά τους) σε in vitro πειράματα (σε 7

17 τρυβλία) και στο έδαφος. Μελετήθηκε η επίδραση της εφαρμογής 1, 5 και 10 μl των προαναφερθεισών ουσιών/τρυβλίο στην ανάπτυξη του μυκηλίου και στη σποριοποίηση των μυκήτων Aspergillus sp., Fusarium oxysporum, Penicillium sp. και Verticillium dalhiae, οι οποίοι απομονώθηκαν από αγρό όπου καλλιεργούνταν τομάτα με βιολογικό τρόπο. Τα αιθέρια έλαια και τα κύρια μονοτερπένιά τους (εκτός από την 1,8-κινεόλη) προκάλεσαν μεγαλύτερη από 50% μείωση στην ανάπτυξη του μυκηλίου και στη σποριοποίηση σε τουλάχιστον έναν από τους μύκητες (V. dalhiae) και σε μία από τις μελετηθείσες δόσεις (10 μl). Η μεγαλύτερη μείωση στην ανάπτυξη μυκηλίου προκλήθηκε από την εφαρμογή των αιθερίων ελαίων της ρίγανης και του δυόσμου, καθώς και από τα μονοτερπένια καρβακρόλη και καρβόνη, που είναι αντιστοίχως, τα κύρια συστατικά των προηγούμενων ελαίων. Η σποριοποίηση ορισμένων μυκήτων μειώθηκε ενώ άλλων αυξήθηκε. Μεταξύ των διαφόρων μυκήτων που εξετάστηκαν, ανθεκτικότεροι ήταν ο Aspergillus sp. και ο F. οxysporum, με ανάκτηση της μυκηλιακής ανάπτυξής τους σε όλες τις δόσεις των αιθερίων ελαίων και των μονοτερπενίων, ενώ ο πλέον ευαίσθητος σε όλα τα αιθέρια έλαια και μονοτερπένια ήταν ο V. dalhiae. Λέξεις κλειδιά: αιθέρια έλαια, δυόσμος (Mentha spicata L.), εδαφογενείς μύκητες, ζιζανιοκτόνος δράση, κομποστοποίηση, μυκητοκτόνος δράση, νιτροποιητικά βακτήρια, φωτοσύνθεση, φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα. 8

18 ABSΤRACT 9

19 Effects of secondary metabolites from aromatic plants on the physiology of biologically cultivated tomato and on its soil environment Five different experiments were conducted to investigate the effects of secondary metabolites of aromatic plants on physiological and agronomical characteristics of tomato subjected to biological cultivation, as well as their effects in soil environment. In the first experiment, effects of incorporating into the soil compost derived from spearmint (Mentha spicata L.) or sage (Salvia fruticosa Mill.) on tomato seedlings and on soil parameters were investigated. The composts were incorporated into the soil at doses of 0, 2, 4, 8% (w:w, compost:soil) in combination with organic or conventional fertilizers. Regardless of the type of fertilization applied, net photosynthesis, stomatal conductance and quantum yield of photochemical energy conversion of tomato seedlings treated with 8% spearmint compost incorporated into the soil, were significantly increased. The combination of 8% of spearmint compost with the organic fertilizer and its incorporation into the soil, significantly reduced the population of weeds in particular of the broadleaved ones. In addition, it caused positive effects on shoot and root dry weight of tomato seedlings. In soil environment, ammonia-oxidizing bacteria belonging to Nitrosomonas and Νitrosospira were not affected by any of the compost fertilizer combination added into the soil. On the other hand, populations of soil-borne fungi were significantly affected, increasing linearly with the increasing quantities of the applied spearmint or sage composts. In a second experiment, the effects of incorporating into the soil dry plant material of spearmint and sage (chosen among several aromatic plants and cereals) on tomato seedlings and in soil environment without previous composting were investigated. This experiment intended to compare the effects of decomposing and of already composted material of the aromatic plants on above mentioned parameters. Incorporation into the soil of the decomposing spearmint plant material, had a significant positive effect on germination, seedling height (up to 195% compared to untreated control), dry weight (up to 698% compared to untreated control) and on length and width of the most robust leaf, at all doses applied (2, 4 and 8%, w:w, plant material:soil). Effects on total soil-borne fungal populations were similar to those reported for the composts of the aromatic plants. 10

20 In a third experiment, the degradation process of spearmint essential oils and terpenes when the decomposing material was incorporated into the soil at doses of 0, 2, 4 and 8% (w:w, plant material:soil), was examined. The degradation process was studied by GC-MS analysis of soil samples collected at 0, 15, 35 and 60 days following plant material incorporation into the soil. In all treatments (doses of incorporated plant material), spearmint essential oil content in the soil was reduced more than 94% compared to the content at zero time. GC-MS analysis of distilled spearmint oil, indicated decrease of monoterpene (mainly of carvone) and increase of sesquiterpene concentration (mostly of caryophyllene, bourbonene, calamelene and epibicyclosesquiphellandrene), substances well known to activate the chemical defence of plants. In a fourth experiment, the allelopathic action of spearmint essential oil and of its main component, the monoterpene carvone, against tomato (Lycopersicon esculentum L.) and against four weeds (Abutilon theophrasti L., Datura stramonium L., Oryza sativa L. and Phalaris paradoxa L.), was investigated in vitro. Results indicated strong inhibition (allelopathic phenomenon) of germination, growth, and fresh weight of P. paradoxa and D. stramonium and minor, but significant, of A. theophrasti and O. sativa. In the presence of 3.22 μl of spearmint oil, germination of tomato was reduced by 50% comparing to untreated control. With respect to germination and first growth, tomato was in general sensitive, even at the lower tested concentrations of spearmint oil and of carvone. In a fifth experiment, the effects of essential oils of spearmint (M. spicata), lavender (Lavandula stoechas), oregano (Origanum vulgare subsp. hirtum), and sage (S. fruticosa), as well of the monoterpenes carvone, fenchone, carvacrol, 1,8-cineole, α-pinene and terpinen-4-ol against soil borne-fungi (in pure and mixed cultures), in growth media (in vitro) and in the soil environment were investigated. The effects of essential oils and monoterpenes applied at 1, 5 and 10 μl/plate on growth and sporulation of Aspergillus sp., Fusarium oxysporum, Penicillium sp. and Verticillium dahliae isolated from a biological cultivation of tomato were examined. At least in one fungus (V. dalhiae) and at one of the tested doses (10 μl), all essential oils tested (except 1,8-cineole) and all individual monoterpenoids reduced mycelial growth and sporulation more than 50%. The strongest inhibitory activity on growth was exhibited by oregano and spearmint oils and by carvacrol and carvone, their main constituents, respectively. On sporulation, clearly stimulatory effects were observed alongside with 11

21 inhibitory ones. Among the four fungi tested, Aspergillus sp. and F. οxysporum were the most tolerant as their mycelial growth recovered at all doses of essential oils and monoterpenes, while V. dalhiae was the most sensitive. Key words: antifungal activity, biological composting, essential oils, herbicidal activity, nitrifying bacteria, photosynthesis, spearmint (Mentha spicata L.), quantum yield of photochemical energy conversion, soil-borne fungi. 12

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 13

23 1. Δευτερογενείς μεταβολίτες Τα φυτά, εκτός από τους ζωτικής σημασίας πρωτογενείς μεταβολίτες, διαθέτουν και έναν μεγάλο αριθμό μεταβολικών προϊόντων (πολύ μεγαλύτερο από εκείνον του πρωτογενούς μεταβολισμού) που παράγονται σε επιμέρους ιστούς και σε συγκεκριμένα στάδια ανάπτυξης των φυτών. Ειδικότερα, τα βιομόρια αυτά είναι γνωστά ως δευτερογενείς μεταβολίτες, επειδή προέρχονται από ενδιάμεσες ενώσεις του πρωτογενούς μεταβολισμού και συντίθενται μέσω βιοχημικών οδών που στο σύνολό τους συνιστούν τον δευτερογενή μεταβολισμό. Οι δευτερογενείς αυτοί μεταβολίτες, συνήθως επιτελούν οικολογικό ρόλο προάγοντας την επιβίωση των φυτών-φορέων τους, την ανταγωνιστικότητα σε βιοτικές και την αντοχή σε αβιοτικές καταπονήσεις. Είναι ευρέως αποδεκτό πλέον, ότι η σύνθεση των δευτερογενών μεταβολιτών συνδέεται στενά με την ύπαρξη και λειτουργία θεμελιωδών αμυντικών μηχανισμών, απαραίτητων για την επιβίωση των φυτικών ειδών. Με βάση τα πρόδρομα βιομόρια, προϊόντα του πρωτογενούς μεταβολισμού από τα οποία συντίθενται οι δευτερογενείς μεταβολίτες, οι τελευταίοι κατατάσσονται στις παρακάτω ομάδες (π.χ. Καραμπουρνιώτης, 2003): 1) φαινολικές ουσίες, οι οποίες περιλαμβάνουν μεταβολίτες που χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη ενός τουλάχιστον αρωματικού δακτυλίου στο μόριό τους και συντίθενται κυρίως μέσω των βιοχημικών οδών του σικιμικού οξέος ή/και του μηλονικού οξέος, 2) τερπένια, τα οποία συντίθενται μέσω της βιοσυνθετικής οδού του μεβαλονικού οξέος με πρόδρομο μόριο το ακέτυλο-συνένζυμο Α (ή οξικό συνένζυμο Α) ή μέσω της βιοσυνθετικής οδού της φωσφογλυκεριναλδεύδης/πυροσταφυλικού οξέος και αποτελούν τα βασικά συστατικά των αιθερίων ελαίων και 3) αζωτούχοι δευτερογενείς μεταβολίτες, οι οποίοι είναι ενώσεις που προέρχονται κυρίως από αμινοξέα. Οι δευτερογενείς μεταβολίτες εντοπίζονται σχεδόν σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, από τα βακτήρια έως και τα θηλαστικά, ενώ η παρουσία τους είναι ιδιαίτερα έντονη σε οργανισμούς με έλλειψη ανοσοποιητικού συστήματος. Οι δευτερογενείς μεταβολίτες των φυτών περιλαμβάνουν ουσίες προσελκυστικές (όπως οι διάφορες χρωστικές), απωθητικές εντόμων και θηλαστικών ή τοξίνες που προκαλούν αναστολή στην ανάπτυξη άλλων οργανισμών. Αποτελούν αντικείμενο πολύχρονης έρευνας από οικολογικής και φαρμακολογικής πλευράς και πολλές σύνθετες βιολογικές δράσεις τους έχουν ήδη προσδιοριστεί. Παρά την πληθώρα των αναγνωρισμένων επιδράσεων των δευτερογενών μεταβολιτών, οι προσδιορισθείσες βιοχημικές διαδικασίες υπό τις οποίες συμβαίνουν οι επιδράσεις αυτές είναι 14

24 ελάχιστες. Η ικανότητα των μορίων αυτών να συνδέονται μέσω δεσμών υδρογόνου ή υδρόφοβων δεσμών, όπως το κλειδί στη κλειδαριά, με τα κέντρα υποδοχής των διαφόρων πρωτεΐνών, αποτελεί την πρωταρχική εξήγηση της δράσης τους (Hadacek 2002). Οι δευτερογενείς μεταβολίτες συμμετέχουν τόσο στην προστασία των φυτικών ιστών των φυτών από τα οποία προέρχονται, όσο και σε μια σειρά σημαντικών λειτουργιών. Ειδικότερα, παρεμβαίνουν ως εξειδικευμένα σήματα για τη δημιουργία συμβιωτικών σχέσεων μεταξύ φυτών και μικροοργανισμών, προστατεύουν τους ιστούς από αβιοτικές καταπονήσεις, π.χ. την υπεριώδη ακτινοβολία μέσω των παραγόμενων φλαβονοειδών, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της αναπαραγωγής και επιδρούν στην ανάπτυξη άλλων φυτών, ζώων και μικροοργανισμών (Hadacek 2002). 2. Αρωματικά φυτά και αιθέρια έλαια Ένας από τους χαρακτηριστικότερους τύπους του Μεσογειακού οικοσυστήματος είναι το φρυγανικό οικοσύστημα, το οποίο στην Ελλάδα καταλαμβάνει το 13% της επιφάνειάς της (Διαμαντόπουλος 1983). Τα φρύγανα 1) αναπτύσσονται σε φτωχά, άγονα και υποβαθμισμένα από πυρκαγιά ή υπερβόσκηση εδάφη, 2) παρουσιάζουν εποχικό διμορφισμό, με κύριο γνώρισμάτους τη μετατροπή των μεγάλων φύλλων του χειμώνα σε μικρά το καλοκαίρι και 3) είναι προσαρμοσμένα σε ξηρό και θερμό περιβάλλον. Tα αρωματικά φυτά κυριαρχούν στα φρυγανικά οικοσυστήματα της Ελλάδας (Margaris et al. 1982). H οικογένεια με τον μεγαλύτερο αριθμό ειδών αρωματικών φυτών στη χώρα μας είναι των Lamiaceae (Labiatae, Χειλανθή). Το βασικότερο χαρακτηριστικό των αρωματικών φυτών είναι η παραγωγή αιθερίων ελαίων, τα οποία είναι μίγματα πτητικών, οργανικών ενώσεων που προσδίδουν στα φυτά μια συγκεκριμένη οσμή. Οι ουσίες αυτές είναι μικρού μοριακού βάρους και μεγάλης οικονομικής αξίας. Τα κύρια συστατικά των αιθερίων ελαίων είναι μονοτερπένια και σεσκιτερπένια, ομάδες δευτερογενών μεταβολιτών εξαιρετικά διαδεδομένων, με σημαντικούς αμυντικούς και αλληλοπαθητικούς ρόλους για το φυτό (π.χ. Καραμπουρνιώτης 2003). Πέρα από τους λόγους για τους οποίους η φύση προίκισε ορισμένα φυτά με αιθέρια έλαια, ο άνθρωπος είχε ανακαλύψει από αρχαιοτάτων χρόνων ότι οι ουσίες αυτές έχουν ισχυρή βιολογική δράση και επομένως μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ποικίλες ανάγκες του. 15

25 3. Αλληλοπάθεια Το φαινόμενο της αλληλοπάθειας (Einhellig 1995) περιλαμβάνει όλους τους τύπους των χημικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ φυτών ή/και μικροοργανισμών. Αρκετές χιλιάδες διαφορετικές οργανικές ενώσεις που προέρχονται από φυτά και μικροργανισμούς επηρεάζουν την ανάπτυξη και τις λειτουργίες των γειτνιαζόντων οργανισμών (ουσίες με αλληλοπαθητική δράση). Πολλές τέτοιες ουσίες (αλληλοπαθητικές) ταυτοποιήθηκαν τα τελευταία χρόνια και έχει πλέον αποδειχθεί ότι η δράση τους αποτελεί σημαντικό χαρακτηριστικό που καθορίζει τις αμοιβαίες σχέσεις μεταξύ των οργανισμών. Επιπλέον του ρόλου τους στη σύνθεση των φυτοκοινοτήτων, ενέχονται στη διαδοχή των φυτών, στη διατήρηση του σπόρου, στη βλάστηση σπορίων μυκήτων, στον κύκλο του αζώτου, στην παραγωγικότητα των καλλιεργειών και στην άμυνα του φυτού. Η παραγωγή αλληλοπαθητικών ουσιών είναι στενά συνδεδεμένη με τον ανταγωνισμό για θρεπτικά στοιχεία και την καταπόνηση από ασθένειες, ακραίες θερμοκρασίες, ξηρασία και ζιζανιοκτόνα (Einhellig 1995). Η αλόγιστη χρήση χημικώς συντιθέμενων αγροχημικών προκαλεί συχνά δυσμενείς περιβαλλοντικές επιπτώσεις, όπως διατάραξη της ισορροπίας του πληθυσμού των εδαφικών μικροοργανισμών, έλλειψη θρεπτικών στοιχείων και αλλαγή των φυσικοχημικών ιδιοτήτων του εδάφους, που έχουν ως συνέπεια τη μείωση της παραγωγικότητας των καλλιεργειών (Chou 1999). H ενσωμάτωση των γονιδίων (που συμμετέχουν στη διαδικασία παραγωγής αλληλοπαθητικών ουσιών) σε καλλιεργούμενα φυτά ή η χρήση αλληλοπαθητικών ουσιών στα συστήματα γεωργίας θα μπορούσε να μειώσει τη χρήση των χημικώς συντιθέμενων μυκητοκτόνων, ζιζανιοκτόνων και εντομοκτόνων και επομένως να βελτιώσει την κατάσταση του περιβάλλοντος (Chou 1999). Οι επιστήμονες συμφωνούν ότι η μελλοντική έρευνα στην αλληλοπάθεια θα πρέπει να εστιασθεί: 1) πρωταρχικά στη συνεχόμενη έρευνα του δυναμικού των αλληλοπαθητικών ουσιών που προέρχονται από καλλιέργειες ή μικροοργανισμούς, 2) στην καθιέρωση πρακτικών μεθόδων εφαρμογής των αλληλοπαθητικών ουσιών στις καλλιεργούμενες εκτάσεις, 3) στην κατανόηση του τρόπου δράσης των αλληλοπαθητικών ουσιών στους οργανισμούς-στόχους και του ρόλου τους στη βιοποικιλότητα και στη λειτουργία του οικοσυστήματος, 4) στη διερεύνηση της ύπαρξης των γονιδίων που κωδικοποιούν αλληλοπαθητικές ουσίες σε φυτά και μικροοργανισμούς και, 5) στην ανάπτυξη καλύτερης μεθοδολογίας για την 16

26 απομόνωση αλληλοπαθητικών ουσιών ή αποδομημένων συστατικών τους από το περιβάλλον, ιδιαίτερα από το εδαφικό (Chou 1999). 4. Βελτίωση του εδάφους με προσθήκη κομπόστας Έρευνες δεκαετιών έδειξαν ότι η προσθήκη οργανικών υπολειμμάτων στο έδαφος με τη μορφή κομπόστας βελτιώνει τη δομή του εδάφους και αποτελεί πηγή θρεπτικών στοιχείων (λίπανση του εδάφους) για τα καλλιεργούμενα φυτά. H χρήση των οργανικών υπολειμμάτων ως λιπασμάτων αυξάνεται παγκοσμίως, καθώς οι πρακτικές που αφορούν την περιβαλλοντικώς ορθή εφαρμογή τους ολοένα και εξελίσσονται, ώστε να τελειοποιηθούν. Η Ευρωπαϊκή Κοινότητα παράγει ετησίως περίπου δύο (2) δισεκατομμύρια τόνους απορριμμάτων, με συνεχώς αυξανόμενη τάση (Düring and Gäth 2002). Το γεγονός αυτό είχε ως συνέπεια τον καθορισμό στρατηγικής που περιορίζει την παραγωγή απορριμμάτων και ελαχιστοποιεί, όπου είναι εφικτό, την παρουσίας τους μέσω κομποστοποίησης. Επιπλέον, λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε οργανική ουσία και σε αρκετά θρεπτικά στοιχεία των στερεών απορριμμάτων, η Ευρωπαϊκή Ένωση πρότεινε τη χρήση τους στη γεωργία. Εκτός από τη Γερμανία, η οποία χρησιμοποιεί 6-7 εκατομμύρια τόνους κομπόστας ετησίως, τα υπόλοιπα κράτη-μέλη της Ευρωπαϊκής ένωσης συνεχίζουν να αναζητούν και να αναπτύσσουν στρατηγικές για τη συλλογή και βιοαποδόμηση απορριμμάτων με σκοπό τη δημιουργία χρήσιμης για τη γεωργία κομπόστας (European Commission 2000). Στις ΗΠΑ, η χρήση των βιοστερεών απορριμμάτων υπό μορφή κομπόστας προκειμένου να βελτιωθεί η γονιμότητα του εδάφους, υποστηρίζεται από τον Οργανισμό Προστασίας Περιβάλλοντος (ΕPA, Environmental Protection Agency). Οι Cook and Beyea (1998) αναφέρουν ότι η χρήση κομποστών που προέρχονται από βιομηχανικά απορρίμματα θα πρέπει να αποφεύγεται επειδή αυξάνει τη συγκέντρωση βαρέων μετάλλων και άλλων τοξικών στοιχείων στο έδαφος. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι περισσότερες κομπόστες που προέρχονται από βιομηχανικά απόβλητα περιέχουν μεγάλες ποσότητες βαρέων μετάλλων και κατιόντων Cu και Zn. Ο διαχωρισμός τους (SS-MSW, Source-Separated Municipal Solid Waste) για παρασκευή κομπόστας μείωσε την τοξικότητά τους στις καλλιέργειες και στο περιβάλλον (Epstein et al. 1992, Deportes et al. 1995, Barth 2000, Hoitink 2000), εντούτοις η χρήση τους στη γεωργία είναι περιορισμένη εξαιτίας των υψηλών επιπέδων σε βαρέα μέταλλα. 17

27 Tα κομποστοποιήσιμα υλικά παρουσιάζουν μεγάλη παραλλακτικότητα σε χαρακτηριστικά όπως το ph, η αλατότητα, η περιεκτικότητα σε άνθρακα, οι συγκεντρώσεις των λοιπών θρεπτικών στοιχείων, οι τύποι, οι πληθυσμοί και η δραστηριότητα των μικροοργανισμών του εδάφους στο οποίο ενσωματώνονται. Ακατέργαστα και κομποστοποιημένα οργανικά υλικά αυξάνουν τις μικροβιακές κοινότητες στο έδαφος (Albiach et al. 2000). Η διάρκεια της πληθυσμιακής αύξησης των μικροοργανισμών του εδάφους επηρεάζεται από την ποσότητα και τις αναλογίες των κομποστοποιήσιμων ενώσεων άνθρακα, καθώς και από τη διαθεσιμότητα των λοιπών θρεπτικών στοιχείων, ιδιαίτερα του αζώτου (Hartz et al. 2000, Adediran et al. 2003), αλλά τα μικροβιακά χαρακτηριστικά των βελτιωμένων εδαφών επανέρχονται στην αρχική τους κατάσταση μετά από μερικά χρόνια (Speir et al. 2003, Garcia Gil et al. 2004). Γενικώς, οι κοπριές και τα βιομηχανικά απόβλητα έχουν μεγαλύτερη αλατότητα και αυξημένες συγκεντρώσεις βαρέων μετάλλων, χαλκού, ψευδαργύρου και καδμίου, σε σχέση με τα απορρίμματα αστικών κήπων (Hao and Chang 2003, Usman et al. 2004). Χλωρά κατάλοιπα γεωργικών εκτάσεων και κήπων μπορεί να περιέχουν υπολείμματα χημικώς συντιθέμενων ενώσεων, όπως ζιζανιοκτόνα, εντομοκτόνα, μυκητοκτόνα και ρυθμιστές ανάπτυξης. Ο βαθμός κομποστοποίησης των υλικών εξαρτάται από τις συνθήκες κομποστοποίησης (Buyuksonmez et al. 2000). Η οργανική ουσία, κατά τη διάρκεια της κομποστοποίησης, εμπλουτίζει το έδαφος με θρεπτικά στοιχεία όπως N, P, K καθώς και με απαραίτητα μικροστοιχεία (Jacobsen 1995). Επίσης, η εφαρμογή κομπόστας στο έδαφος προκαλεί ενεργοποίηση της μικροβιακής βιομάζας και της μικροβιακής δραστηριότητας (Leifeld et al. 2002). Σύμφωνα με τον EPA (US EPA 1997), η χρήση της κομπόστας στη γεωργία, λόγω της προσθήκης ωφέλιμων μικροοργανισμών, μπορεί να βοηθήσει στον έλεγχο παρασιτικών ασθενειών των φυτών και να μειώσει τις απώλειες της παραγωγής. Οι Cotxarrera et al. (2002) έδειξαν ότι η κομπόστα αστικών στερεών λυμάτων μπορεί να μειώσει ικανοποιητικά τη μυκητολογική ασθένεια της αδροφουζαρίωσης (Fusarium wilt) στην τομάτα. Επιπλέον, σπορόφυτα τομάτας και μαρουλιού που αναπτύχθηκαν σε διάφορες ποσότητες κομπόστας που προερχόταν από αλεσμένα κομμάτια δασικών υπολειμμάτων, αναμεμιγμένων με τύρφη, παρουσίασαν μεγαλύτερη ανάπτυξη συγκριτικά με άλλα που αναπτύχθηκαν σε τύρφη, υποδεικνύοντας ότι η κομπόστα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως εναλλακτικό υπόστρωμα της ευρέως χρησιμοποιούμενης τύρφης για παραγωγή σποροφύτων λαχανοκομικών ειδών 18

28 (Ribeiro et al. 2007). Στην ίδια έρευνα, τα σπορόφυτα τομάτας που αναπτύχθηκαν σε 100% κομπόστα είχαν μεγαλύτερη ανάπτυξη των υπολοίπων. Επιπλέον, η κομπόστα αύξησε το ph από 6,3 (μάρτυρας) σε 6,9 (100% κομπόστα), τη διαθεσιμότητα του Ν, του Ca και του Mg στο έδαφος και κατ επέκταση τη συγκέντρωσή τους στους φυτικούς ιστούς, αλλά μείωσε τη συγκέντρωση του Κ και του Mn (Ribeiro et al. 2007). Οι Cunha-Queda et al. (2007) έδειξαν ότι, κατά τη διαδικασία της κομποστοποίησης τεμαχιδίων φλοιού από ευκάλυπτο και πεύκο, αυξάνονται οι μικροβιακοί πληθυσμοί (αερόβια βακτήρια, νιτροποιητικά βακτήρια, ολικοί μύκητες, ακτινομύκητες) και οι συγκεντρώσεις των ενζύμων κυτταρινάση, β-γλυκοσιδάση, λιπάση, πρωτεάση και ουρεάση, τα οποία επηρεάζουν σημαντικά τον κύκλο του άνθρακα και του αζώτου. Βέβαια, άλλες εργασίες έδειξαν ότι η χρήση κομποστών από αστικά στερεά απόβλητα και από βιομηχανίες αγροτικών προϊόντων στα εδάφη αυξάνουν την αλατότητα (Garcia-Gomez et al. 2002, Castillo et al. 2004) και το ph του εδάφους με αποτέλεσμα τη μείωση της διαθεσιμότητας των θρεπτικών στοιχείων (Ribeiro et al. 1999, Perez-Murcia et al. 2006), καθώς και την παρουσία φυτοτοξικών ουσιών (Hadar et al. 1985, Ribeiro et al. 2000). Οι Levy and Taylor (2003) βρήκαν ότι οι κομπόστες από απορρίμματα γουνοφόρων ζώων και κοπριά αλόγου προκάλεσαν αύξηση του ριζικού συστήματος και του βλαστού των σποροφύτων τομάτας, αλλά η κομπόστα από αστικά στερεά απόβλητα προκάλεσε ισχυρή αναστολή στην αύξηση των φυτών. Ο εδαφικός χούμος χαρακτηρίζεται από βραδύ ρυθμό αποδόμησης και υψηλό ποσοστό οργανικών μορίων (χουμικές ενώσεις) προσροφημένων στα ανόργανα κολλοειδή του εδάφους. Ειδικότερα, ο εδαφικός χούμος περιέχει χουμικά οξέα (μακρομόρια μεγάλου μοριακού βάρους), φουλβικά οξέα (μικρού μοριακού βάρους) και χουμίνες (χουμικά υλικά με μικρή περιεκτικότητα δραστικών χημικών ριζών όπως καρβοξύλια, φαινολικά υδροξύλια κλπ) (Swift 1996). Η φθίνουσα σειρά των χουμικών ενώσεων στη μικροβιακή αποδόμησή τους είναι χουμίνη > φουλβικό οξύ > χουμικό οξύ (Qualls 2004). Οι κομπόστες και οι άλλες συμπυκνωμένες πηγές οργανικών υλικών, όπως η τύρφη και ο λιγνίτης, περιέχουν επίσης χουμικά και φουλβικά οξέα. Οι χουμικές ενώσεις προάγουν τη μικροβιακή δραστηριότητα και αυξάνουν την παροχή θρεπτικών στοιχείων και την διέλευσή τους μέσω των κυτταρικών τοιχωμάτων (Valdrighi et al. 1996). Ο εδαφικός χούμος αυξάνει την ανάπτυξη των ετερότροφων και αυτότροφων βακτηρίων, αλλά έχει περιορισμένη 19

29 επίδραση στους ακτινομύκητες και σχεδόν ανύπαρκτη επίδραση στους μυκηλιακούς (filamentous) μύκητες (Vallini et al. 1993, Valdrighi et al. 1995, 1996). Οι Vallini et al. (1997) βρήκαν ότι τα νιτροποιητικά βακτήρια (χημειότροφα) αδυνατούν να χρησιμοποιήσουν χουμικά οξέα ως εναλλακτική πηγή άνθρακα και άλλων θρεπτικών στοιχείων. Τα χουμικά οξέα των κομποστών [οι οποίες παρασκευάζονται από οργανικά απορρίμματα ή ανακυκλωμένο χαρτί παρουσία γαιοσκωλήκων (vermicomposts)], εκτός από την παροχή αζώτου στα φυτά, δρουν και ως φυτορρυθμιστικές ουσίες αφού περιέχουν ενώσεις όπως η γιββερελλίνη, το ινδολοοξικό οξύ και η κυτοκινίνη (Atiyeh et al. 2002). 5. Βιολογική γεωργία Ο κύριος στόχος του τρόπου καλλιέργειας στη σύγχρονη γεωργία δεν είναι η μεγιστοποίηση της παραγωγής, αλλά η βελτιστοποίηση της ποιότητας των παραγόμενων προϊόντων. Τα προβλήματα που δημιούργησε η συμβατική γεωργία, με την μη ορθή χρήση γεωργικών φαρμάκων και λιπασμάτων και με την εξάντληση των αγρών λόγω λανθασμένων συστημάτων διαχείρισης από την άποψη διατήρησης της περιβαλλοντικής ισορροπίας, οδήγησαν διεθνώς στην αναζήτηση εναλλακτικών μορφών καλλιέργειας φιλικών προς το περιβάλλον. Η βιολογική γεωργία, τόσο στην Ευρώπη όσο και στην Ελλάδα, αναπτύχθηκε κυρίως μετά την ψήφιση από το Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο του Κανονισμού 2092/91 (Βιολογικός Τρόπος Παραγωγής Γεωργικών Προϊόντων). Ο Κανονισμός αποτελεί το νομοθετικό πλαίσιο με κοινούς κανόνες και πρότυπα παραγωγής, τυποποίησης, μεταποίησης, αποθήκευσης και εισαγωγής από τρίτες χώρες γεωργικών προϊόντων για ανθρώπινη κατανάλωση, υποχρεώνοντας στην τήρηση προϋποθέσεων για τον έλεγχο και την πιστοποίηση των προϊόντων βιολογικής γεωργίας. Η βιολογική γεωργία, σύμφωνα με τον Κανονισμό αυτό, μπορεί να ορισθεί ως ένα σύστημα διαχείρισης των αγροτικών εκμεταλλεύσεων που συνεπάγεται σημαντικούς περιορισμούς στη χρησιμοποίηση χημικώς συντιθέμενων λιπασμάτων ή γεωργικών φαρμάκων. Πρόκειται για ένα ολιστικό σύστημα διαχείρισης και παραγωγής το οποίο αποσκοπεί στην καλύτερη λειτουργία του αγρο-οικοσυστήματος, τη διατήρηση της βιοποικιλότητας και της βιολογικής δράσης του εδάφους. Είναι βασισμένο στην ελάχιστη χρήση εισροών και σε πρακτικές διαχείρισης που δίνουν έμφαση στη χρήση ενδογενών μέσων διαχείρισης και όχι στην εισαγωγή εξωγενών παραγόντων. Οι βασικές οδηγίες για τη βιολογική παραγωγή βασίζονται στη χρήση 20

30 υλικών και πρακτικών που ενσωματώνουν τα μέρη του αγροτικού συστήματος στο συνολικό οικοσύστημα. Αυτό επιτυγχάνεται με μια σειρά τεχνικών και πρακτικών όπως η χρήση φυσικώς συντιθέμενων λιπασμάτων (κοπριά, επεξεργασμένα ή μη υπολείμματα από άλλες γεωργικές δραστηριότητες κλπ.), η κατάλληλη επιλογή φυτικού και ζωϊκού υλικού, η αμειψισπορά, η χρήση ανανεώσιμων πηγών ενέργειας, ο έλεγχος ασθενειών και εντόμων με βιολογικές μεθόδους (επιλογή κατάλληλων ποικιλιών, χρήση φυσικών εχθρών των ασθενειών και σκευασμάτων φυσικής προέλευσης, αβλαβών για το περιβάλλον). Ο τρόπος λίπανσης και η μορφή (τύπος) των λιπασμάτων των καλλιεργειών είναι η κύρια διαφορά μεταξύ των δύο συστημάτων παραγωγής, συμβατικού και βιολογικού. Η συμβατική παραγωγή στηρίζεται σχεδόν αποκλειστικά στη χρήση των ανόργανων χημικώς συντιθέμενων λιπασμάτων, ενώ η βιολογική γεωργία βασίζεται στα θρεπτικά στοιχεία που προέρχονται από α) οργανική λίπανση (π.χ. κοπριά ζωϊκής προέλευσης, υγρή ή στερεή, κομπόστες), β) αμειψισπορά (συμμετοχή ψυχανθών στο σύστημα της εναλλαγής των καλλιεργειών, γ) χλωρές λιπάνσεις (π.χ. επίσπορες ή ενδιάμεσες), δ) αξιοποίηση πετρωμάτων και ορυκτών για φώσφορο, κάλιο, ασβέστιο, μαγνήσιο, ιχνοστοιχεία κ.λπ., ε) βιομηχανικής προέλευσης οργανικά λιπάσματα, εγκεκριμένα από οργανισμό πιστοποίησης και, στ) αύξηση της βιολογικής δραστηριότητας του εδάφους με σκοπό την προσφορά μεγαλύτερων ποσοτήτων θρεπτικών στοιχείων και κυρίως αζώτου. Η εφαρμογή της βιολογικής γεωργίας είναι πολύ περιορισμένη σε έκταση σε σχέση με αυτή της συμβατικής γεωργίας. Βέβαια, το ενδιαφέρον των παραγωγών αλλά και του κοινού για την παραγωγή προϊόντων βιολογικής γεωργίας αυξάνεται συνεχώς με αποτέλεσμα να υπάρχει διαρκής ανάπτυξη και επέκταση της βιολογικής καλλιέργειας. Αυτό αποτελεί σημαντικό κίνητρο για τον Έλληνα αγρότη, αφού έχει όλες τις προϋποθέσεις από άποψη φυσικών συνθηκών να ενταχθεί επιτυχώς σε βιολογικά προγράμματα καλλιεργειών. Αξίζει να αναφερθεί ότι η δυναμική της παραγωγής προϊόντων βιολογικής γεωργίας στην Eυρώπη αποδεικνύεται από το ότι από στρέμματα βιολογικών καλλιεργειών το 1985 και βιοκαλλιεργητές, το 2003 οι καλλιεργούμενες εκτάσεις έφθασαν τα στρέμματα και οι βιοκαλλιεργητές τους (κατά μέσο όρο 159 και 314 στρέμματα ανά βιοκαλλιεργητή, αντιστοίχως) (Anonymous 2008). Οι πρώτες επίσημες καταγραφές για εκτάσεις καλλιεργούμενες με βιολογικό τρόπο παραγωγής γεωργικών προϊόντων στην Ελλάδα εμφανίζονται το 1989 με 21

31 συνολική έκταση 1000 στρεμμάτων. Το 1998 καταγράφονται στρέμματα (σύνολο εκτάσεων με βιολογική καλλιέργεια ή υπό μετατροπή) και το 2004, στρέμματα (περίπου το 1,5% της συνολικής καλλιεργούμενης έκτασης). Ο αριθμός αυτός αυξάνεται διαρκώς, καθώς, σύμφωνα πάντα με τις καταγραφές του Υπουργείου Γεωργίας, το 2005 η βιολογική γεωργία ασκήθηκε από επιχειρηματίες (παραγωγούς και μεταποιητές) σε στρέμματα, εκ των οποίων τα στρέμματα ήταν βοσκότοποι. Το είδος της καλλιέργειας που κυριάρχησε ήταν η ελιά και ακολουθούσαν το αμπέλι, τα εσπεριδοειδή και τα σιτηρά. Η Πελοπόννησος υπερτερούσε όσον αφορά την έκταση εφαρμογών και είναι το πρώτο γεωγραφικό διαμέρισμα της χώρας όπου εφαρμόστηκαν συστήματα βιολογικής διαχείρισης καλλιεργειών. Αξιόλογες προσπάθειες για εγκατάσταση βιολογικής γεωργίας είναι τα προγράμματα βιοκαλλιέργειας ελιάς στη Μεσσηνιακή Μάνη και Κορινθιακής σταφίδας στην επαρχία Αιγιαλείας (νομός Αχαΐας), η καλλιέργεια και μεταποίηση αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών στο Λαύκο Πηλίου, καθώς και ο Αγροτικός Συνεταιρισμός Οργανικών Καλλιεργειών ΒΙΟΤΟΠ στην Αλεξάνδρεια Ημαθίας. 6. Ερευνητικό αντικείμενο Η προσθήκη κομποστών στο έδαφος κατά τα τελευταία χρόνια παρουσιάζει αυξημένο ενδιαφέρον επειδή αποτελεί ασφαλέστερη για το περιβάλλον εναλλακτική μορφή βελτίωσης της οργανικής ουσίας του εδάφους και της μικροβιακής δραστηριότητάς του (Garcia et al. 1994, Pascual et al. 1997, Rivero et al 2004). Η επίδραση όμως των κομποστών που προέρχονται από αρωματικά φυτά, παρά τα προαναφερθέντα, δεν έχει μελετηθεί επαρκώς (Chouliaras et al. 2007, Cunha-Queda et al. 2007). Ειδικότερα, εκτός από τις παραδοσιακές χρήσεις των αρωματικών φυτών ή των αιθερίων ελαίων τους στη βοτανοθεραπεία και στις βιομηχανίες τροφίμων και καλλυντικών, η συμβολή τους στη βελτίωση του εδάφους και η πιθανή χρήση τους ως μικροβιοκτόνα, εντομοκτόνα, ή ζιζανιοκτόνα είναι υπό διερεύνηση. Οι Dudai et al. (1999) και ο Tworkoski (2002) αναφέρουν ότι τα αρωματικά φυτά περιέχουν αλληλοπαθητικές ουσίες που αναστέλλουν τη βλαστική ικανότητα των σπόρων των ζιζανίων και ως εκ τούτου θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την αντιμετώπιση των ζιζανίων. Επίσης, άλλοι ερευνητές (Vokou et al. 1993, Dudai et al. 1999, Ιsman 2000, Gravanis et al. 2001, Tworkoski 2002, Daferera et al. 2003, Gravanis et al. 2004, Gravanis et al. 2005) βρήκαν ότι τα φυτά αυτά ή τα αιθέρια έλαιά τους μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αντιμετώπιση εδαφογενών φυτοπαθογόνων 22

32 βακτηρίων και νηματωδών. Η χώρα μας, αν και είναι ιδιαίτερα πλούσια σε αρωματικά φυτά με σημαντική οικονομική σημασία, δεν έχει δημιουργήσει τις απαιτούμενες προϋποθέσεις για την αποτελεσματικότερη αξιοποίησή τους. Μεταξύ αυτών των φυτών, ο δυόσμος (Μ. spicata) και το φασκόμηλο (S. fruticosa) θα μπορούσαν να αποτελέσουν τα φυτά-πιλότο για μελέτη και περατέρω αξιοποίηση. Τα προαναφερθέντα δεδομένα δείχνουν ότι στη χώρα μας δεν έχουν διερευνηθεί σε βάθος οι επιδράσεις των αρωματικών φυτών και ειδικότερα των αιθερίων ελαίων στη γεωργία και στο εδαφικό περιβάλλον. Αυτό αποτέλεσε το βασικότερο λόγο σχεδιασμού της παρούσας διδακτορικής διατριβής όπου διερευνήθηκαν οι επιδράσεις της ενσωμάτωσης στο έδαφος αρωματικών φυτών (υπό μορφή κομποστοποιημένου ή υπό κομποστοποίηση φυτικού υλικού) και κατ επέκταση οι επιδράσεις των αιθερίων ελαίων τους και των λοιπών εμπεριεχομένων δευτερογενών μεταβολιτών: i) Στη φυσιολογία και στα αγροκομικά χαρακτηριστικά τομάτας (ύψος σποροφύτων, φωτοσυνθετικές παράμετροι, ξηρό βάρος σποροφύτων και περιεκτικότητα του υπέργειου και του ριζικού συστήματος σε διάφορα ιχνοστοιχεία) καλλιεργούμενης με βιολογικό τρόπο ii) Στη βλαστική ικανότητα και στην αύξηση των ζιζανίων iii) Στο εδαφικό περιβάλλον (μικροβιακοί πληθυσμοί και in vitro αντιμυκητιακή δραστικότητα των αιθερίων ελαίων και των μονοτερπενίων τους) iv) Στην πορεία αποδόμησης των αιθερίων ελαίων στο έδαφος. 23

33 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΚΟΜΠΟΣΤΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΦΥΤΩΝ ΣΕ ΤΟΜΑΤΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΗ ΜΕ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΡΟΠΟ 24

34 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Διερευνήθηκε η επίδραση της ενσωμάτωσης στο έδαφος κομποστών των αρωματικών φυτών δυόσμου (M. spicata) και φασκόμηλου (S. fruticosa) σε σπορόφυτα τομάτας (L. esculentum) καλλιεργούμενης με συμβατικό ή με βιολογικό τρόπο. Τα αρωματικά φυτά επιλέχθηκαν ως υλικά κομποστοποίησης επειδή αποτελούν σημαντικό εκπρόσωπο του μεσογειακού οικοσυστήματος και επειδή τα αιθέρια έλαιά τους 1) δρουν επιλεκτικά άλλοτε προάγοντας και άλλοτε αναστέλλοντας τη φυτρωτική ικανότητα και την ανάπτυξη των φυτών, 2) άλλοτε ευνοούν τους μικροβιακούς πληθυσμούς και την αποδόμηση των οργανικών υπολειμμάτων, και άλλοτε έχουν αντιμικροβιακή δράση. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε σε θάλαμο ανάπτυξης φυτών όπου μελετήθηκαν τέσσερις ποσότητες κομπόστας ενσωματωμένης στο έδαφος (0, 2, 4 και 8%, w:w κομπόστα:έδαφος), σε συνδυασμό με δύο είδη λίπανσης, οργανική και συμβατική. Ειδικότερα, χρησιμοποιήθηκαν 1.13 g ανά φυτοδοχείο του συμβατικού λιπάσματος N-P-K (12Ν-12P-17K + 2Mg + ιχνοστοιχεία) στη συμβατική λίπανση και 2.82 g ανά φυτοδοχείο του οργανικού λιπάσματος Humus vita, stallatico super (Fomet S.p.A.) στην οργανική λίπανση. Η επίδραση των προαναφερθέντων συνδυασμένων παραγόντων στο εδαφικό περιβάλλον (ύπαρξη νιτροποιητικών βακτηρίων των γενών Nitrosomonas και Nitrosospira και πληθυσμών μυκήτων) διερευνήθηκε σε δείγματα που πάρθηκαν 20, 40 και 60 ημέρες μετά την ενσωμάτωση. Παράλληλα, εκτιμήθηκε η επίδρασή τους στη φυτρωτική ικανότητα ζιζανίων και στα σπορόφυτα τομάτας με μετρήσεις της ωφέλιμης φωτοσύνθεσης, της στοματικής αγωγιμότητας, της φωτοσυνθετικής αποτελεσματικότητας, του ξηρού βάρους των σποροφύτων, και της εκατοστιαίας περιεκτικότητας μακρο- και μικροστοιχείων στο υπέργειο και στο ριζικό σύστημα των σποροφύτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι κομπόστες των αρωματικών φυτών δεν επηρεάζουν τα νιτροποιητικά βακτήρια, ενώ αυξάνουν σημαντικά τον ολικό πληθυσμό των εδαφογενών μυκήτων σε όλες τις ποσότητες εφαρμογής τους (2, 4, 8%, w:w) και ανεξαρτήτως του συνδυασμού λίπανσης. Η ενσωμάτωση κομπόστας δυόσμου στο έδαφος σε ποσότητα 8%, ανεξαρτήτως είδους λίπανσης, αύξησε τη φωτοσυνθετική λειτουργία των σποροφύτων τομάτας. Επίσης, η ενσωμάτωση κομπόστας δυόσμου στο έδαφος σε ποσότητα 8% και σε συνδυασμό με την οργανική λίπανση μείωσε τη φυτρωτική ικανότητα των αγρωστωδών και πλατύφυλλων 25

35 ζιζανίων, αλλά αύξησε το ξηρό βάρος των σποροφύτων τομάτας. Επιπλέον, ο συνδυασμός αυτός μετέβαλε την περιεκτικότητα του υπέργειου και του ριζικού συστήματος των σποροφύτων τομάτας σε άζωτο, φώσφορο, κάλιο, ασβέστιο, μαγνήσιο, σίδηρο, ψευδάργυρο, μαγγάνιο και νάτριο. 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το περιβαλλοντικό κόστος των συμβατικών μεθόδων καλλιέργειας έχει στρέψει κατά τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον προς τη βιολογική γεωργία, επειδή οι πρακτικές που χρησιμοποιούνται συμβάλλουν στη βελτίωση του εδάφους και έχουν κύριο στόχο τη μείωση της επιβάρυνσης του περιβάλλοντος και ταυτόχρονα την αύξηση της παραγωγικότητας και τη βελτίωση της ποιότητας των παραγόμενων γεωργικών προϊόντων. Υπάρχουν πολλά διαφορετικά είδη κομποστοποιήσιμων υλικών που έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί ως εδαφοβελτιωτικά εδάφους σε βιολογικές και συμβατικές καλλιέργειες. Μεταξύ αυτών αναφέρονται κομπόστες από χρησιμοποιημένα και εξαντληθέντα υποστρώματα καλλιέργειας μανιταριών (Wang et al. 1984), θαλάσσια φύκη (Eyras et al. 1998), φυτικά χλωροφυλλούχα υπολείμματα (Hartz et al. 1996), υπολείμματα επεξεργασμένης ελιάς (olive mill waste) και κόπρου πουλερικών (Walker and Bernal 2008), βλαστικά υπολείμματα αμπέλου, ράγες σταφυλιού και περιβλήματα σπόρων (Kostov et al. 1996b), ζαχαροκάλαμο (Stoffella and Graetz 2000), αστικά στερεά υπολείμματα, απορρίμματα γουνοφόρων ζώων και λυματολάσπη (ιλύς λυμάτων καθαρισμού) (Levy and Taylor 2003). Είναι γνωστό ότι ορισμένα από τα οργανικά αυτά εδαφοβελτιωτικά περιορίζουν τους πληθυσμούς των ζιζανίων και των μικροοργανισμών του εδάφους. Παρά τη μεγάλη ποικιλία των οργανικών εδαφοβελτιωτικών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εναλλακτική λίπανση στις καλλιέργειες, η χρήση κομποστών αρωματικών φυτών έχει ελάχιστα μελετηθεί (Chouliaras et al. 2007, Cunha-Queda et al. 2007). Τα αρωματικά φυτά κατέχουν εξέχουσα θέση στο Μεσογειακό οικοσύστημα. Ορισμένα από τα αιθέρια έλαια αυτών των φυτών, τα οποία είναι προϊόντα δευτερογενούς μεταβολισμού και αποτελούνται από χαμηλού μοριακού βάρους ισοπρενοειδείς ενώσεις, έχουν ζιζανιοκτόνο δράση in vitro (Dudai et al. 1999, Duke et al. 2000, Angelini et al. 2003, Arminante et al. 2006, Azizi and Fuji 2006, Da Mastro et al. 2006, Vasilakoglou et al. 2007, Argyropoulos et al. 2008), ενώ άλλα 26

36 χαρακτηρίζονται από δράση εναντίον φυτοπαθογόνων μυκήτων in vitro (Beylier 1979, Morris et al. 1979, Deans and Richie 1987, Knobloch et al. 1989, Cosentino et al. 1999, Hammer et al. 1999, Mourey and Canillac 2002, Daferera et al. 2003). Η εδαφική μικροβιακή βιομάζα φαίνεται ότι αντιδρά και αυτή στην παρουσία αιθερίων ελαίων. Οι Vokou et al. (1984), διαπίστωσαν ότι τα αιθέρια έλαια των αρωματικών φυτών Coridothimus capitatus L. και Satureja thymbra L. αυξάνουν την αναπνοή των εδαφογενών βακτηρίων. Στο ίδιο συμπέρασμα καταλήγουν και για τα αιθέρια έλαια των φυτών C. capitatus L., O. vulgare L. subsp. vulgare, M. spicata, Rosmarinus officinalis L. και Lavandula angustifοlia Mill. (Vokou and Liotiri 1999). Επιπλέον, οι Vokou et al. (2002) αναφέρουν σημαντική αύξηση όχι μόνον της αναπνοής των εδαφογενών βακτηρίων αλλά και του ολικού εδαφικού βακτηριακού πληθυσμού υπό την επίδραση του αιθερίου ελαίου της L. stoechas. Οι προαναφερθείσες ιδιότητες των αιθερίων ελαίων προσελκύουν το ενδιαφέρον για περαιτέρω μελέτη τους ως εδαφοβελτιωτικών, ως φυσικώς συντιθέμενων ζιζανιοκτόνων αλλά και ως πιθανών ουσιών που προάγουν την ανάπτυξη των καλλιεργούμενων φυτών, ιδιαίτερα σε συστήματα βιολογικής γεωργίας. Ο σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η μελέτη των επιδράσεων της ενσωμάτωσης στο έδαφος κομπόστας των αρωματικών φυτών δυόσμου και φασκόμηλου: i) Στη φυτρωτική ικανότητα ζιζανίων ii) Στα φυσιολογικά και αγροκομικά χαρακτηριστικά της τομάτας (ωφέλιμη φωτοσύνθεση, στοματική αγωγιμότητα, φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα, ξηρό βάρος, περιεκτικότητα των στοιχείων N, P, K, Ca, Mg, Fe, Zn, Mn και Na στο υπέργειο και στο ριζικό σύστημα των σποροφύτων) iii) Στο εδαφικό περιβάλλον (συνολικός πληθυσμός των εδαφογενών μυκήτων και των νιτροποιητικών βακτηρίων). 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Επειδή η παρούσα διδακτορική διατριβή εντάσσεται στο πλαίσιο του ερευνητικού προγράμματος ΠΕΝΕΔ 2001 με τίτλο «Αξιοποίηση εγχώριων φυσικών πόρων στη βιολογική γεωργία: Ρύθμιση παραμέτρων του συστήματος έδαφος-φυτό 27

37 με δευτερογενείς μεταβολίτες αρωματικών φυτών» (κωδικός έργου 10081_01ΕΔ317), η εγκατάσταση του πειράματος που στη συνέχεια περιγράφεται, πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με τον συμμετέχοντα στο ίδιο πρόγραμμα κ. Δημήτριο Χάλκο, υποψήφιο διδάκτορα του Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ Κομποστοποίηση Η παρασκευή της κομπόστας των αρωματικών φυτών δυόσμου (M. spicata) και φασκόμηλου (S. fruticosa) πραγματοποιήθηκε σε θερμοκήπιο του Εργαστηρίου Γεωργίας στο Αγρόκτημα της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. Επαρκείς ποσότητες φυτικού υλικού των προαναφερθέντων φυτών αγοράστηκαν από το εμπόριο. Το φυτικό υλικό κάθε είδους αποτελούνταν από υπέργεια αποξηραμένα τμήματα (βλαστούς, φύλλα και άνθη), τα οποία τεμαχίστηκαν με το χέρι για να επιταχυνθεί ο ρυθμός κομποστοποίησής τους (ο τεμαχισμός των υλικών αυξάνει την επιφάνεια των υλικών όπου οι μικροοργανισμοί μπορούν να δράσουν αμέσως). Το υλικό τοποθετήθηκε σε τρεις συνολικά στοιβάδες μέσα σε πλαστικές σίτες, οι οποίες κάλυπταν το εσωτερικό πλαστικών δοχείων. Ενδιάμεσα των στοιβάδων προστέθηκαν: (α) ποσότητα εδάφους σε αναλογία 5% (w:w, έδαφος:φυτικό υλικό), (β) λίπασμα ΝPK ( ) σε αναλογία 0.5% (w:w), και (γ) NH 4 NO 3 σε αναλογία 0.25% (w:w). Η υγρασία του προς κομποστοποίηση υλικού διατηρήθηκε σε ικανοποιητικά επίπεδα με δύο ποτίσματα εβδομαδιαίως και ταυτόχρονη αναμόχλευσή του. Ο χρόνος περάτωσης της κομποστοποίησης καθορίστηκε από το χρόνο σταθεροποίησης της αναλογίας C/N (Φωτίου 2004, Χάλκος, αδημοσίευτα δεδομένα) Επεμβάσεις Ποσότητα εδάφους από αγρόκτημα όπου επί σειρά ετών καλλιεργούνταν τομάτα με βιολογικό τρόπο (περιοχή Κρύας Βρύσης νομού Πέλλας), αφέθηκε να ξηρανθεί και ακολούθως αναμίχθηκε με ποταμίσια άμμο σε αναλογία 7:3 (v:v, έδαφος:άμμο). Tα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του εδάφους ήταν άργιλος 64.0% %, ιλύς 22.4 %, άμμος 13.6 %, οργανική ουσία 3.26 %, CaCO %. Στη συνέχεια προστέθηκε η κομπόστα δυόσμου ή φασκόμηλου στις ποσότητες 0, 2, 4 και 8% (w:w, κομπόστα:έδαφος). Ακολούθως, χρησιμοποιήθηκε (σύμφωνα με τη συνήθη δοσολογία σε καλλιέργεια τομάτας) ως συμβατική λίπανση 1.13 g ανά φυτοδοχείο του συμβατικού λιπάσματος N-P-K (12Ν-12P-17K + 2Mg + ιχνοστοιχεία) και ως 28

38 οργανική λίπανση 2.82 g ανά φυτοδοχείο του οργανικού λιπάσματος Humus vita, stallatico super (Fomet S.p.A.). Χρησιμοποιήθηκε το 2 x 2 x 4 [2 είδη λίπανσης x 2 είδη κομπόστας (αρωματικά φυτά) x 4 επίπεδα κομπόστας] παραγοντικό πείραμα σε πλήρως τυχαιοποιημένες ομάδες. Κάθε συνδυασμένος παράγοντας (επέμβαση) είχε τρεις επαναλήψεις (φυτοδοχεία χωρητικότητας 500 g). Τα 48 φυτοδοχεία του πειράματος τοποθετήθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης ελεγχόμενων συνθηκών (φωτοπερίοδος 16 h, θερμοκρασία και σχετική υγρασία ατμόσφαιρας 25 0 C/50% και 18 0 C/70% κατά τη διάρκεια της ημέρας και της νύχτας, αντιστοίχως). Ακολούθως πραγματοποιήθηκε σπορά πέντε σπόρων τομάτας (L. esculentum, υβρίδιο Carla F1) ανά φυτοδοχείο. Η υγρασία διατηρήθηκε σε φυσιολογικά για την ανάπτυξη του φυτού επίπεδα, με την προσθήκη ίσης ποσότητας νερού ανά φυτοδοχείο ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Μετά το φύτρωμα, επιλέχθηκαν για να μελετηθούν τα τρία πιο εύρωστα και ομοιόμορφα σπορόφυτα τομάτας ανά φυτοδοχείο. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές στο χρόνο Επιδράσεις των επεμβάσεων στα ζιζάνια και στα σπορόφυτα της τομάτας Στις 20, 40 και 60 ημέρες από την εγκατάσταση του πειράματος (ΗΜΕ) μετρήθηκε ο αριθμός και το είδος των πλατύφυλλων και αγρωστωδών ζιζανίων που ακολούθως απομακρύνθηκαν με το χέρι. Επίσης, στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ μετρήθηκε η ωφέλιμη φωτοσύνθεση των τριών σποροφύτων τομάτας ανά φυτοδοχείο, η στοματική αγωγιμότητα και η φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα, καθώς από προηγούμενες μελέτες αποδείχθηκε ότι αποτελούν αξιόπιστους δείκτες προκειμένου να εκτιμηθεί η επίδραση που ασκούν οι μεταβολές του εδαφικού υποστρώματος στην ανάπτυξη καλλιεργούμενων φυτών (Οuzounidou and Constantinidou 1999, Issa et al. 2001, Samartzidis et al. 2005, Ouzounidou et al. 2008). H ωφέλιμη φωτοσύνθεση και η στοματική αγωγιμότητα εκτιμήθηκαν με τη βοήθεια του φορητού συστήματος φωτοσύνθεσης LI-6200 (LI-COR, Inc. Lincon NE, USA), εξοπλισμένου με αναλυτή αερίων υπερύθρου ακτινοβολίας LI Για το σκοπό αυτό, σε κάθε πειραματικό τεμάχιο (φυτοδοχείο) ελήφθησαν τρεις μετρήσεις από το άνω 1/3 των φύλλων των τριών σποροφύτων. Οι συγκεκριμένες δύο παράμετροι εκτιμήθηκαν στις 30 και 60 ΗΜΕ. Η φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα εκτιμήθηκε στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ από την εγκατάσταση του πειράματος, με τη χρήση του φορητού φθορισμόμετρου 29

39 PAM-2000 (Walz, Effeltrich, Germany) και του υπολογιστικού πακέτου εκτίμησης δεδομένων DA Όπως και με τη μέτρηση της φωτοσύνθεσης, σε κάθε πειραματικό τεμάχιο (φυτοδοχείο) ελήφθησαν τρεις μετρήσεις από το άνω 1/3 των φύλλων των τριών σποροφύτων. H απόσταση μεταξύ των οπτικών ινών και του υποδοχέα φύλλου ρυθμίστηκε στα 12 mm. Σε κάθε μέτρηση υπολογίσθηκε η φωτονική απόδοση της φωτοχημικής μετατροπής (quantum yield of photochemical energy conversion) στο PSII. Τα σπορόφυτα της τομάτας, μετά το πέρας των 60 ημερών, απομακρύνθηκαν από τα φυτοδοχεία και ακολούθως προσδιορίστηκε το νωπό βάρος για το υπέργειο και το ριζικό τους σύστημα. Στη συνέχεια, αφού αποξηράνθηκαν σε κλίβανο για 48 ώρες στους 72 0 C, προσδιορίστηκε το ξηρό βάρος τους. Η περιεκτικότητα των στοιχείων N, P, K, Ca, Mg, Fe, Zn, Mn και Na υπολογίσθηκε ξεχωριστά για το υπέργειο και το ριζικό σύστημα των σποροφύτων τομάτας κάθε επέμβασης στο Εργαστήριο Δενδροκομίας του Αγροκτήματος της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. Το άζωτο μετρήθηκε με τη μέθοδο Kjeldahl. Ο φώσφορος μετρήθηκε με τη χρωματομετρική μέθοδο του φωσφοβαναδομολυβδαινικού αμμωνίου και η απορρόφηση των διαλυμάτων μετρήθηκε με φασματοφωτόμετρο στα 470 nm. Οι μετρήσεις των υπολοίπων ιχνοστοιχείων έγιναν με ατομική απορρόφηση (Perkin Elmer 2340, USA) Eπιδράσεις των επεμβάσεων στο εδαφικό περιβάλλον Στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ έγιναν δειγματοληψίες εδάφους και προσδιορίστηκε η ύπαρξη ή η αναστολή των νιτροποιητικών βακτηρίων (ΑΟΒ, Ammonia-Oxidizing Bacteria) και ο πληθυσμός των εδαφογενών μυκήτων. Χρησιμοποιήθηκε το υγρό θρεπτικό υπόστρωμα LM (MacDonald and Spokes 1980, Donaldson and Henderson 1989) με προσθήκη 3.78 mm (NH 4 ) 2 SO 4 (Ammonium sulphate, LMA) για την ανίχνευση του γένους Nitrosomonas spp. ή 3.78 mm (NH 2 ) 2 CO (Urea, LMU) για την ανίχνευση του γένους Nitrosospira spp. (Aakra et al. 1999). Το υγρό θρεπτικό υπόστρωμα LM περιείχε ανά λίτρο απεσταγμένου νερού 1.47 mm KH 2 PO 4, 140 μm CaCl 2 2H 2 O, 160 μm MgSO 4 7H 2 O, 20 mm HEPES (N- (2-hydroxyethyl)-piperazine-N -2-ethanesulfonic acid), 3.8 mg l 1 FeNaEDTA, 0.1 mg l 1 (457 nm) NaMoO 4 2H 2 O, 0.2 mg l 1 (1.23 μm) MnCl 2, mg l 1 (8.4 nm) CoCl 2 6H 2 O, 0.1 mg l 1 (348 nm) ZnSO 4 7H 2 O, 0.02 mg l 1 (80 nm) CuSO 4 5H 2 O, 1 30

40 mg l 1 phenol red, 1.5 mm NaHCO 3 (η προσθήκη του τελευταίου γινόταν μετά την αποστείρωση για 20 min στους 121 C.). Το (NH 4 ) 2 SO 4 και το (NH 2 ) 2 CO προστίθετο για την παρασκευή των δύο αντίστοιχων θρεπτικών υποστρωμάτων LMA και LMU. Πριν την αποστείρωση, το ph των υποστρωμάτων LMA και LMU ρυθμίστηκε στο 7.5 με διάλυμα 10 M NaOH. Τα εδαφικά δείγματα αναμίχθηκαν σε LMA ή LMU σε συγκέντρωση 0.1 g εδάφους ml -1 και ομογενοποιήθηκαν σε blender για 3 min με ταχύτητα rpm στους 0 ο C. Μετά την ομογενοποίηση, το ph των δειγμάτων ρυθμίστηκε εκ νέου στο 7.5 με την προσθήκη 1 M NaOH. Το ph δεν υπερέβη το , επειδή πολλά είδη του γένους Nitrosospira δεν είναι ανθεκτικά σε υψηλότερο ph (Jiang and Bakken 1999). Δείγμα (100 μl) ομογενοποιημένου εδάφους μεταφέρθηκε σε αποστειρωμένους γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες και αναμίχθηκε με 4.9 ml LMA ή LMU. Τα δείγματα αραιώθηκαν περαιτέρω πέντε διαδοχικές φορές, σε αποστειρωμένους γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες έως την τελική αραίωση g εδάφους ml -1 LMA ή LMU. Για κάθε εδαφικό δείγμα πραγματοποιήθηκαν δύο σειρές διαδοχικών αραιώσεων. Στη συνέχεια, οι δοκιμαστικοί σωλήνες καλύφθηκαν με πλαστική μεμβράνη (parafilm) και επωάσθηκαν στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 4 μήνες. Η ανάπτυξη των νιτροποιητικών βακτηρίων ανιχνεύθηκε με την αλλαγή χρώματος που παρατηρήθηκε στο θρεπτικό υλικό (Aakra et al. 1999). Για την εκτίμηση του πληθυσμού των εδαφογενών μυκήτων χρησιμοποιήθηκε η τεχνική των διαδοχικών αραιώσεων σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα (Water Agar, WA) (Τuite 1969). Δείγματα εδάφους 10 g προστέθηκαν σε 200 ml WA 0.2%, σε κωνική σφραγισμένη φιάλη. Τα υλικά αναδεύτηκαν για 20 min στις 200 στροφές/λεπτό, και κατόπιν 1 ml του διαλύματος αυτού μεταφέρθηκε σε 9 ml 0.2% WA και αναδεύτηκε για 4 min. Στη συνέχεια 1 ml του τελευταίου διαλύματος παραλήφθηκε και προστέθηκε σε 49 ml 0.2% WA και αναδεύτηκε για 2 min. Ένα ml του τελικού διαλύματος μεταφέρθηκε σε κάθε ένα από τα πέντε τρυβλία petri και προστέθηκαν 17 ml του θρεπτικού υποστρώματος Czapek Dox Agar (2 g NaNO 3, 1 g K 2 HPO 4, 0.5 g MgSO 4 7H 2 O, 0.5 g KC, 0.01 g FeSO 4, 30 g sucrose, 20 g agar, 1 lt dd H 2 O), θερμοκρασίας 48 0 C. Για την καταπολέμηση των βακτηρίων προστέθηκαν με φιλτράρισμα 0.8 ml γαλακτικού οξέος και 150 mg θειικής στρεπτομυκίνης σε 10 ml H 2 O και 6 ml αιθανόλης για κάθε λίτρο στερεού θρεπτικού υποστρώματος. Οι κόκκοι εδάφους κατανεμήθηκαν ομοιόμορφα με κυκλικές κινήσεις των τρυβλίων petri, τα οποία επωάστηκαν για μια εβδομάδα στους 22 0 C (Τuite 1969). Η περιγραφή αυτή 31

41 αποτελεί γενική απεικόνιση της τεχνικής, ενώ ο πραγματικός αριθμός των διαδοχικών αραιώσεων εξαρτήθηκε κάθε φορά από τον πληθυσμό των μυκήτων, ο οποίος εκφράσθηκε ως μονάδες αποικιών (CFU, Colony Forming Units) ανά γραμμάριο εδάφους. Μετά την επώαση των μυκήτων έγινε μέτρηση του συνολικού πληθυσμού των αποικιών μυκήτων, η κάθε μία από τις οποίες τοποθετήθηκε στη συνέχεια μέσα σε γυάλινο δοκιμαστικό σωλήνα που περιείχε PDA (Potato Dextrose Agar, Sigma Chemical Company) και διατηρήθηκε σε ψυχρό θάλαμο θερμοκρασίας 4 0 C Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση όλων των πειραματικών δεδομένων (ANOVA) πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πρόγραμμα Statistica 6.0 (StatSoft Italia srl). Χρησιμοποιήθηκε το 2 x 2 x 4 [2 είδη λίπανσης x 2 είδη κομπόστας (αρωματικά φυτά) x 4 επίπεδα κομπόστας] παραγοντικό πείραμα σε πλήρως τυχαιοποιημένες ομάδες. Η σύγκριση των μέσων όρων έγινε με το κριτήριο της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς (ΕΣΔ) σε επίπεδο σημαντικότητας P 0.05, ενώ οι τιμές CFU/g εδάφους πριν από την ANOVA μετατράπηκαν σε λογαριθμικές τιμές. 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1. Κομποστοποίηση Η διαδικασία κομποστοποίησης κάτω από τις συνθήκες υψηλής θερμοκρασίας και υγρασίας του θερμοκηπίου διήρκησε 60 περίπου ημέρες, χρόνο στον οποίο ο λόγος C/N είχε τιμή 11 για την κομπόστα δυόσμου και περίπου 23 για την κομπόστα φασκόμηλου (Χάλκος, αδημοσίευτα δεδομένα) Επιδράσεις των επεμβάσεων στα ζιζάνια και στα σπορόφυτα της τομάτας Τα αγρωστώδη ζιζάνια που εμφανίσθηκαν κατά τη διάρκεια του πειράματος ήταν η αγριάδα (Cynodon dactylon L.) και ο βέλιουρας (Sorghum halepense L.). Ο συνολικός αριθμός αυτών των ζιζανίων στις 60 ημέρες από την εγκατάσταση του πειράματος επηρεάστηκε σημαντικά μόνο από το χρόνο πειραματισμού και από το είδος της κομπόστας που χρησιμοποιήθηκε (Πίνακας Π.1.1). Ειδικότερα, περισσότερα αγρωστώδη ζιζάνια παρατηρήθηκαν στις επεμβάσεις με κομπόστα 32

42 φασκόμηλου (Σχήμα 1.1 Α) και κατά τον δεύτερο χρόνο εκτέλεσης του πειράματος (Σχήμα 1.1 Β). Τα πλατύφυλλα ζιζάνια που εμφανίστηκαν κατά τη διάρκεια του πειραματισμού ήταν το τραχύ βλήτο (Amaranthus retroflexus L.), η λουβουδιά (Chenopodium album L.), η γλυστρίδα (Portulaca oleracea L.) και ο τάτουλας (D. stramonium). O πληθυσμός των πλατύφυλλων ήταν πολύ μεγαλύτερος από αυτόν των αγρωστωδών ζιζανίων (Σχήματα 1.1 και 1.2). Α 5 Αγρωστώδη 4 a Πληθυσμός ζιζανίων b * 0 Κομπόστα φασκόμηλου Κομπόστα δυόσμου Β Πληθυσμός ζιζανίων b Αγρωστώδη a ος 2 ος Χρόνος πειραματισμού Σχήμα 1.1. Συνολικός πληθυσμός αγρωστωδών ζιζανίων στις κομπόστες φασκόμηλου και δυόσμου (Α) και στους δύο χρόνους πειραματισμού (Β). Ο πληθυσμός καταγράφηκε κατά τη διάρκεια των 60 ημερών του πειράματος. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) 33

43 Η ανάλυση παραλλακτικότητας (ANOVA) του συνολικού πληθυσμού των πλατύφυλλων ζιζανίων (60 ΗΜΕ) έδειξε ότι ο πληθυσμός τους επηρεάστηκε σημαντικά από το χρόνο πειραματισμού, το είδος της λίπανσης, το είδος της κομπόστας, την ποσότητα της κομπόστας, καθώς και από την αλληλεπιδράση μεταξύ χρόνου πειραματισμού και ποσότητας της κομπόστας, αλλά και μεταξύ είδους κομπόστας και ποσότητας εφαρμογής της (Πίνακας Π.1.1). Ειδικότερα, ο πληθυσμός των πλατύφυλλων ζιζανίων ήταν μεγαλύτερος στις επεμβάσεις της οργανικής λίπανσης σε σχέση με αυτές της συμβατικής λίπανσης, καθώς και στις επεμβάσεις της κομπόστας φασκόμηλου σε σχέση με αυτές της κομπόστας δυόσμου (οι μέσοι όροι δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, ο πληθυσμός των πλατύφυλλων ζιζανίων ήταν αντιστρόφως ανάλογος με την ποσότητα της κομπόστας, ανεξαρτήτως του είδους της (οι μέσοι όροι δεν παρουσιάζονται). Σε κάθε χρόνο πειραματισμού τα πλατύφυλλα ζιζάνια ήταν αντιστρόφως ανάλογα με την ποσότητα οιασδήποτε κομπόστας, δυόσμου ή φασκόμηλου, με σημαντικά μικρότερες τιμές κατά τον δεύτερο χρόνο πειραματισμού (εκτός από το έδαφος-μάρτυρα) (Σχήμα 1.2). Τέλος, κατά τον πρώτο χρόνο πειραματισμού ο πληθυσμός των πλατύφυλλων ζιζανίων ήταν σημαντικά μεγαλύτερος στις επεμβάσεις με κομπόστα φασκόμηλου από ό,τι με κομπόστα δυόσμου (Σχήμα 1.3). a Πλατύφυλλα 30 a Πληθυσμός ζιζανίων b bc b b b c * M Ποσότητα κομπόστας στο έδαφος (%) Σχήμα 1.2. Συνολικός πληθυσμός πλατύφυλλων ζιζανίων σε κομπόστα δυόσμου ή φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος) σε κάθε έτος πειραματισμού. Η πρώτη και η δεύτερη σειρά στηλών αντιπροσωπεύουν τον πληθυσμό ζιζανίων κατά το πρώτο και δεύτερο έτος πειραματισμού, αντιστοίχως. Ο πληθυσμός καταγράφηκε κατά τη διάρκεια των 60 ημερών του πειράματος. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) ** Το Μ παριστάνει το έδαφος-μάρτυρα, χωρίς προσθήκη κομπόστας φασκόμηλου ή δυόσμου (0%) ** 34

44 30 25 Ποσότητα κομπόστας (%) (M) a Πλατύφυλλα ab Πληθυσμός ζιζανίων bc bc c d bc ** 0 Κομπόστα φασκόμηλου Κομπόστα δυόσμου Μ * Σχήμα 1.3. Συνολικός πληθυσμός πλατύφυλλων ζιζανίων σε κομπόστα δυόσμου ή φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος). Ο πληθυσμός καταγράφηκε κατά τη διάρκεια των 60 ημερών του πειράματος. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) ** Το Μ παριστάνει το έδαφος-μάρτυρα, χωρίς προσθήκη κομπόστας φασκόμηλου ή δυόσμου (0%) Η ωφέλιμη φωτοσύνθεση των σποροφύτων τομάτας που μετρήθηκε στις 30 και 60 ΗΜΕ επηρεάστηκε σημαντικά από την ποσότητα της κομπόστας (σχολιάζεται παρακάτω). Στις 30 ΗΜΕ, η ωφέλιμη φωτοσύνθεση επηρεάστηκε σημαντική από το είδος της λίπανσης και της κομπόστας, καθώς επίσης και από την αλληλεπίδραση μεταξύ είδους λίπανσης και κομπόστας, είδους λίπανσης και ποσότητας κομπόστας, καθώς και κομπόστας με συγκέντρωσή της (Στήλη Α του Πίνακα Π.1.2). Τέλος, η αλληλεπίδραση του χρόνου πειραματισμού με τις επιμέρους παραμέτρους δεν ήταν στατιστικώς σημαντική στις 30 και 60 ΗΜΕ, γι αυτό και οι τιμές της ωφέλιμης φωτοσύνθεσης που παρουσιάζονται στα Σχήματα 1.4, 1.5 και 1.6 είναι οι μέσοι όροι των δύο χρόνων πειραματισμού. Στις 30 ΗΜΕ, η ωφέλιμη φωτοσύνθεση των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν σε έδαφος όπου χρησιμοποιήθηκε ποσότητα 4 και 8% οιασδήποτε κομπόστας, αυξήθηκε κατά 15 και 25%, αντιστοίχως, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες (Σχήμα 1.4). Στις 60 ΗΜΕ, η ωφέλιμη φωτοσύνθεση των σποροφύτων στις επεμβάσεις όπου χρησιμοποιήθηκε ποσότητα 4 και 8% οιασδήποτε κομπόστας, παρουσίασε αύξηση κατά 5 και 7%, αντιστοίχως (Σχήμα 1.4). Αναλυτικότερα, στις 30 ΗΜΕ η ωφέλιμη φωτοσύνθεση των σποροφύτων στις επεμβάσεις με 4 και 8% κομπόστα φασκόμηλου αυξήθηκε κατά 13 και 16%, αντιστοίχως, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες, ενώ στις αντίστοιχες επεμβάσεις με κομπόστα δυόσμου κατά 35

45 7,0 0,5 Ωφέλιμη φωτοσύνθεση (μmol CO 2 m -2 s -1 ) 6,0 5,0 4,0 7,0 6,0 5,0 c bc 30 ΗΜΕ 30 ΗΜΕ a a b b 0,4 c c 60 ΗΜΕ 60 ΗΜΕ a ab c Στοματική αγωγιμότητα (mol CO 2 m -2 s -1 ) 0,3 0,5 a b 0,4 c c* c 4,0 0, M** Ποσότητα κομπόστας στο έδαφος (%) M Ποσότητα κομπόστας στο έδαφος (%) Σχήμα 1.4. Ωφέλιμη φωτοσύνθεση και στοματική αγωγιμότητα στις 30 και 60 ημέρες από την εφαρμογή κομπόστας δυόσμου ή φασκόμηλου. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) ** Το Μ παριστάνει το έδαφος-μάρτυρα, χωρίς προσθήκη κομπόστας φασκόμηλου ή δυόσμου 18 και 34% (Σχήμα 1.5). Στις 60 ΗΜΕ, η ωφέλιμη φωτοσύνθεση στις ποσότητες κομπόστας δυόσμου 4 και 8% αυξήθηκε κατά 5% και 10%, αντιστοίχως (Σχήμα 1.5 ). 36

46 7,0 Ποσότητα κομπόστας (%) (M) 30 ΗΜΕ a 0,5 30 ΗΜΕ a Ωφέλιμη φωτοσύνθεση (μmol CO 2 m -2 s -1 ) 6,0 5,0 4,0 7,0 6,0 5,0 c b b bc bc bc b c 60 ΗΜΕ a ab bc c c Στοματική αγωγιμότητα (mol CO 2 m -2 s -1 ) 0,4 0,3 0,5 0,4 bc bc b bc b de b bc 60 ΗΜΕ a b cd c * e 4,0 Κομπόστα φασκόμηλου Κομπόστα δυόσμου Μ** 0,3 Κομπόστα φασκόμηλου Κομπόστα δυόσμου Μ Σχήμα 1.5. Ωφέλιμη φωτοσύνθεση και στοματική αγωγιμότητα των σποροφύτων τομάτας που αναπτύχθηκαν στις διάφορες ποσότητες κομποστών δυόσμου και φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος) στις 30 και στις 60 ΗΜΕ. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) ** Το Μ παριστάνει το έδαφος-μάρτυρα, χωρίς προσθήκη κομπόστας φασκόμηλου ή δυόσμου Στις 30 ΗΜΕ, η ωφέλιμη φωτοσύνθεση των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν παρουσία ποσότητας 2, 4 και 8% οιασδήποτε κομπόστας στο έδαφος σε συνδυασμό με την οργανική λίπανση αυξήθηκε κατά 6, 12 και 20%, αντιστοίχως, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες της οργανικής λίπανσης (Σχήμα 1.6). Η ωφέλιμη φωτοσύνθεση των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν παρουσία 4 και 8% οιασδήποτε κομπόστας στο έδαφος σε συνδυασμό με τη συμβατική λίπανση αυξήθηκε κατά 18 και 29%, αντιστοίχως, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες της συμβατικής λίπανσης (Σχήμα 1.6). Στις 60 ΗΜΕ, η ωφέλιμη φωτοσύνθεση των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν σε 2, 4 και 8% οιασδήποτε κομπόστας σε συνδυασμό με την οργανική λίπανση 37

47 7,0 Ποσότητα Κομπόστας (%) 0 (Μ) ,5 Ωφέλιμη φωτοσύνθεση (μmol CO 2 m -2 s -1 ) 6,0 5,0 4,0 7,0 6,0 5,0 e c de bc d ab c a 30 ΗΜΕ 30 ΗΜΕ b b bc 0,4 d d d d Στοματική αγωγιμότητα (mol CO 2 m -2 s -1 ) 60 ΗΜΕ 60 ΗΜΕ a ab bc ab bc 0,3 0,5 a 0,4 b b d d b cd b a b a * a 4,0 0,3 Οργανική Λίπανση Συμβατική Λίπανση Οργανική Λίπανση Συμβατική Λίπανση Σχήμα 1.6. Ωφέλιμη φωτοσύνθεση και στοματική αγωγιμότητα σε σπορόφυτα τομάτας που αναπτύχθηκαν στις διάφορες ποσότητες κομπόστας δυόσμου ή φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος) σε συνδυασμό με τις δύο λιπάνσεις. Οι μετρήσεις έγιναν στις 30 και στις 60 ΗΜΕ. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) αυξήθηκε μέχρι 6%, σε σχέση με τον αντίστοιχο μάρτυρα, ενώ σε συνδυασμό με τη συμβατική μέχρι 8% (Σχήμα 1.6). Η στοματική αγωγιμότητα των σποροφύτων τομάτας στις 30 και 60 ΗΜΕ, επηρεάστηκε σημαντικά από το είδος της λίπανσης, το είδος και την ποσότητα της κομπόστας, καθώς και από τις αλληλεπιδράσεις (είδος λίπανσης x είδος κομπόστας, είδος λίπανσης x ποσότητα κομπόστας, είδος κομπόστας x ποσότητα κομπόστας, καθώς και είδος λίπανσης x είδος κομπόστας x ποσότητα κομπόστας) (Στήλη Β του Πίνακα Π.1.2). Επειδή η στοματική αγωγιμότητα δεν επηρεάστηκε από το χρόνο πειραματισμού και τις περισσότερες αλληλεπιδράσεις στις 30 και στις 60 ΗΜΕ, οι τιμές της στοματικής αγωγιμότητας που παρουσιάζονται στα Σχήματα 1.4, 1.5 και 1.6 είναι οι μέσοι όροι των δύο χρόνων πειραματισμού. 38

48 Στις 30 ΗΜΕ, η στοματική αγωγιμότητα των σποροφύτων στις επεμβάσεις όπου χρησιμοποιήθηκε 4 και 8% οιασδήποτε κομπόστας αυξήθηκε κατά 9 και 17%, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες, αντιστοίχως (Σχήμα 1.4). Στις 60 ΗΜΕ, η στοματική αγωγιμότητα των σποροφύτων στις επεμβάσεις όπου χρησιμοποιήθηκε 4 και 8% οιασδήποτε κομπόστας αυξήθηκε κατά 7 και 13%, αντιστοίχως (Σχήμα 1.4). Αναλυτικότερα, στις 30 ΗΜΕ, η στοματική αγωγιμότητα των σποροφύτων στις επεμβάσεις με 8% κομπόστας φασκόμηλου παρουσίασε αύξηση κατά 10%, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες, ενώ στις επεμβάσεις με 4 και 8% κομπόστας δυόσμου η αντίστοιχη αύξηση ήταν 10 και 24% (Σχήμα 1.5). Στις 60 ΗΜΕ, η στοματική αγωγιμότητα αυξήθηκε κατά 6 και 8%, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες, στο 4 και 8% κομπόστας φασκόμηλου, αντιστοίχως, και κατά 8 και 18%, στις αντίστοιχες ποσότητες δυόσμου (Σχήμα 1.5). Στις 30 ΗΜΕ, η στοματική αγωγιμότητα των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν σε έδαφος με 4 και 8% οιασδήποτε κομπόστας σε συνδυασμό με οργανική λίπανση αυξήθηκε κατά 8 και 13%, αντιστοίχως, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες της οργανικής λίπανσης (Σχήμα 1.6). Η ωφέλιμη φωτοσύνθεση των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν σε 4 και 8% κομπόστας δυόσμου ή φασκόμηλου στο έδαφος σε συνδυασμό με τη συμβατική λίπανση παρουσίασε αύξηση της τάξης του 8 και 19%, αντιστοίχως, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες της συμβατικής λίπανσης (Σχήμα 1.6). Στις 60 ΗΜΕ, η ωφέλιμη φωτοσύνθεση των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν σε 2, 4 και 8% κομπόστας δυόσμου ή φασκόμηλου σε συνδυασμό με οργανική λίπανση αυξήθηκε μέχρι 16%, σε σχέση με τον αντίστοιχο μάρτυρα, ενώ σε συνδυασμό με τη συμβατική λίπανση μέχρι 9% (Σχήμα 1.6). Η φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα των σποροφύτων τομάτας στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ επηρεάστηκε σημαντικά μόνο από την ποσότητα της κομπόστας και από ορισμένες μόνον αλληλεπιδράσεις (Πίνακας Π.1.3). Επειδή ο χρόνος πειραματισμού δεν επηρέασε το χαρακτηριστικό αυτό στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ, οι τιμές της φωτοσυνθετικής αποτελεσματικότητας που παρουσιάζονται στα Σχήματα 1.7 και 1.8 είναι οι μέσοι όροι των δύο χρόνων πειραματισμού. 39

49 0,7 20 ΗΜΕ 0,6 b a a b * 0,5 0,4 Φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα 0,7 40 ΗΜΕ 0,6 a bc b c 0,5 0,4 0,7 60 ΗΜΕ 0,6 0,5 ab a a b 0, Ποσότητα κομπόστας στο έδαφος (%) M ** Σχήμα 1.7. Φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα των σποροφύτων τομάτας που αναπτύχθηκαν στις διάφορες ποσότητες εφαρμογής (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος) κομπόστας δυόσμου ή φασκόμηλου. Οι μετρήσεις έγιναν στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) ** Το Μ παριστάνει το έδαφος-μάρτυρα, χωρίς προσθήκη κομπόστας φασκόμηλου ή δυόσμου 40

50 Ποσότητα κομπόστας (%) 0, (Μ) 0,6 c b b c b a 20 ΗΜΕ * c 0,5 0,4 0,7 Φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα 0,6 0,5 0,4 0,7 b a bcd bcd bc cd 40 ΗΜΕ d 60 ΗΜΕ 0,6 0,5 bc ab c bc bc a c 0,4 Κομπόστα φασκόμηλου Κομπόστα δυόσμου Μ ** Σχήμα 1.8. Φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα των σποροφύτων τομάτας που αναπτύχθηκαν σε έδαφος με διάφορες ποσότητες κομποστών δυόσμου και φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος). Οι μετρήσεις έγιναν στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) ** Το Μ παριστάνει το έδαφος-μάρτυρα, χωρίς προσθήκη κομπόστας φασκόμηλου ή δυόσμου 41

51 Η φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν σε 4% και 8% οιασδήποτε κομπόστας αυξήθηκε μέχρι 11%, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ (Σχήμα 1.7). Αναλυτικότερα, στις 20 ΗΜΕ η φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα των σποροφύτων στις επεμβάσεις με 4 και 8% κομπόστα φασκόμηλου αυξήθηκε έως και 6%, σε σχέση με τα σπορόφυταμάρτυρες, ενώ στις αντίστοιχες επεμβάσεις με κομπόστα δυόσμου κατά 5 και 10% (Σχήμα 1.8). Στις 40 ΗΜΕ, η φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα αυξήθηκε κατά 8 και 16% στις επεμβάσεις με 4 και 8% κομπόστας δυόσμου, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες, ενώ στις 60 ΗΜΕ, η φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα αυξήθηκε κατά 9% μόνον από την επέμβαση 8% κομπόστας δυόσμου (Σχήμα 1.8). Τα ξηρά βάρη των σποροφύτων τομάτας επηρεάστηκαν από το είδος της λίπανσης, το είδος και την ποσότητα της κομπόστας, αλλά και από τις περισσότερες αλληλεπιδράσεις των παραγόντων (Πίνακας Π.1.4). Επειδή ο χρόνος πειραματισμού και η αλληλεπίδρασή του με τους άλλους παραγόντες δεν επηρέασαν σημαντικά το χαρακτηριστικό ουτό, οι τιμές που παρουσιάζονται στο Σχήμα 1.9 είναι οι μέσοι όροι των δύο χρόνων πειραματισμού. Η προσθήκη οιασδήποτε ποσότητας κομπόστας αρωματικού φυτού αύξησε το ξηρό βάρος του υπέργειου και του ριζικού συστήματος των σποροφύτων τομάτας, ανεξάρτητα από το είδος λίπανσης (Σχήμα 1.9). Το ξηρό βάρος των σποροφύτων ήταν μεγαλύτερο στις επεμβάσεις της οργανικής λίπανσης σε σχέση με τη συμβατική λίπανση και στις επεμβάσεις με την κομπόστα δυόσμου σε σχέση με την κομπόστα φασκόμηλου. Η μεγαλύτερη επίδραση στην αύξηση του ξηρού βάρους του υπέργειου και του ριζικού συστήματος των σποροφύτων τομάτας προήλθε από την εφαρμογή στο έδαφος 8% κομπόστας δυόσμου σε συνδυασμό με οργανική λίπανση. Το ξηρό βάρος του υπέργειου συστήματος των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν σε έδαφος με 8% κομπόστα φασκόμηλου και με προσθήκη οργανικής λίπανσης παρουσίασε αύξηση της τάξης του 120%, σε σχέση με τα σπορόφυταμάρτυρες της οργανικής λίπανσης. Το ξηρό βάρος του υπέργειου συστήματος των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν σε έδαφος με 2, 4 και 8% ίδιας κομπόστας και με προσθήκη συμβατικής λίπανσης αυξήθηκε κατά 93%, 118% και 209%, αντιστοίχως, σε σχέση με τον αντίστοιχο μάρτυρα. Το ξηρό βάρος του υπέργειου συστήματος των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν παρουσία 2%, 4% και 8% κομπόστας δυόσμου και με προσθήκη οργανικής λίπανσης αυξήθηκε κατά 239%, 363% και 698%, 42

52 Ποσότητα κομπόστας (%) (Μάρτυρας οργανικής λίπανσης) 0 (Μάρτυρας συμβατικής λίπανσης) 8,0 Υπέργειο σύστημα 6,0 Ξηρό βάρος (g) 4,0 2,0 0,0 1,0 h h ef c b a cd b de fg fg b h gh * 0,8 a Ριζικό σύστημα 0,6 0,4 0,2 f e de cd b de de c de de b g g 0,0 ΟΦ ** ΟΔ ΣΦ ΣΔ ΟΜ ΣΜ Σχήμα 1.9. Ξηρό βάρος του υπέργειου και του ριζικού συστήματος των σποροφύτων τομάτας σε κομπόστα δυόσμου ή φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος) συνδυασμένη με δύο είδη λίπανσης [οργανική (2.82 g ανά φυτοδοχείο του οργανικού λιπάσματος Humus vita, stallatico super) και συμβατική (1.13 g ανά φυτοδοχείο του συμβατικού λιπάσματος 12Ν-12P-17K + 2Mg + ιχνοστοιχεία)]. Οι παράμετροι μετρήθηκαν στις 60 ΗΜΕ. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) ** OΦ=Οργανική Λίπανση + Κομπόστα Φασκόμηλου, ΟΔ=Οργανική Λίπανση + Κομπόστα Δυόσμου, ΣΦ=Συμβατική Λίπανση + Κομπόστα Φασκόμηλου, ΣΔ=Συμβατική Λίπανση + Κομπόστα Δυόσμου, ΟΜ=Μάρτυρας Οργανικής Λίπανσης, ΣΜ=Μάρτυρας Συμβατικής Λίπανσης 43

53 αντιστοίχως, σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες της οργανικής, ενώ κατά 224% σε 8% δυόσμου και με προσθήκη συμβατικής λίπανσης, σε σχέση με τα σπορόφυταμάρτυρες της συμβατικής. Τα αποτελέσματα του ξηρού βάρους του ριζικού συστήματος των σποροφύτων τομάτας στις ίδιες επεμβάσεις ήταν παρόμοια και ως εκ τούτου δεν σχολιάζονται. Αξίζει να αναφερθεί ότι το ξηρό βάρος του ριζικού συστήματος των σποροφύτων διέφερε σημαντικά από αυτό των αντίστοιχων σποροφύτων-μαρτύρων σε όλα τα επίπεδα κομπόστας φασκόμηλου ή δυόσμου. Τα σπορόφυτα που αναπτύχθηκαν παρουσία 2%, 4% και 8% κομπόστας φασκόμηλου στο έδαφος σε συνδυασμό με οργανική λίπανση εμφάνισαν μεγαλύτερη περιεκτικότητα αζώτου σε σχέση με τον μάρτυρα της οργανικής λίπανσης κατά 42%, 54% και 58%, αντιστοίχως, ενώ σε συνδυασμό με τη συμβατική λίπανση αυτή μειώθηκε κατά -7%, -19% και -21%, αντιστοίχως, σε σχέση με το μάρτυρα της συμβατικής (Σχήμα 1.10). Τα σπορόφυτα που αναπτύχθηκαν παρουσία 2%, 4% και 8% κομπόστας δυόσμου στο έδαφος σε συνδυασμό με οργανική λίπανση είχαν αύξηση στο άζωτο του υπέργειου τμήματός τους κατά 37%, 73% και 75%, αντιστοίχως, σε σχέση με το μάρτυρα της οργανικής λίπανσης, ενώ σε συνδυασμό με συμβατική λίπανση 1%, 7% και 2%, αντιστοίχως, σε σχέση με τον μάρτυρα (Σχήμα 1.10). Στο ριζικό σύστημα, όλες οι επεμβάσεις της οργανικής λίπανσης προκάλεσαν αύξηση της περιεκτικότητας του αζώτου, αλλά σε μικρότερο βαθμό σε σχέση με την αντίστοιχη αύξηση του υπεργείου συστήματος (Σχήμα 1.10). Οι επεμβάσεις της συμβατικής λίπανσης προκάλεσαν μείωση στην περιεκτικότητα αζώτου στο ριζικό σύστημα, η οποία ήταν πιο έντονη με κομπόστα δυόσμου (μείωση κατά -8%, -5% και -70%, σε προσθήκη 2, 4, 8%, αντιστοίχως, σε σχέση με το μάρτυρα). Ο φώσφορος είχε τη μεγαλύτερη αύξηση (89% σε σχέση με το μάρτυρα) στο υπέργειο τμήμα των σποροφύτων τομάτας που αναπτύχθηκαν σε 2% κομπόστα φασκόμηλου με οργανική λίπανση και τη μεγαλύτερη μείωση (-38% σε σχέση με το μάρτυρα) στην επέμβαση 8% κομπόστας δυόσμου με οργανική λίπανση (Σχήμα 1.10). Γενικά, οι επεμβάσεις με κομπόστα φασκόμηλου αύξησαν το φωσφόρο, ενώ οι επεμβάσεις με κομπόστα δυόσμου μείωσαν την περιεκτικότητα του υπέργειου συστήματος των σποροφύτων σε φώσφορο. Αντιθέτως, η συγκέντρωση του φωσφόρου στις ρίζες των σποροφύτων τομάτας αυξήθηκε από τη συμβατική λίπανση, ενώ αυτή μειώθηκε από την οργανική λίπανση (Σχήμα 1.10). Η μεγαλύτερη αύξηση στο φώσφορο παρατηρήθηκε στις ρίζες των σποροφύτων της επέμβασης 8% 44

54 Ποσότητα Κομπόστας (%) (Μάρτυρας Οργανικής Λίπανσης) 0 (Μάρτυρας Συμβατικής Λίπανσης) mg Ν g -1 ξηράς ουσίας 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 Υπέργειο σύστημα 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 Ριζικό σύστημα 0,8 0,8 mg P g -1 ξηράς ουσίας 0,6 0,4 0,2 0,0 0,6 0,4 0,2 0,0 mg K g -1 ξηράς ουσίας 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 ΟΦ * ΟΔ 0,0 ΣΦ ΣΔ ΟΜ ΣΜ ΟΦ ΟΔ ΣΦ ΣΔ ΟΜ ΣΜ Σχήμα Περιεκτικότητα σε άζωτο, φώσφορο και κάλιο (mg g -1 ξηράς ουσίας) του υπέργειου και του ριζικού συστήματος των σποροφύτων τομάτας που αναπτύχθηκαν σε κομπόστα δυόσμου ή φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος) συνδυασμένη με δύο είδη λίπανσης. * OΦ=Οργανική Λίπανση + Κομπόστα Φασκόμηλου, ΟΔ=Οργανική Λίπανση + Κομπόστα Δυόσμου, ΣΦ=Συμβατική Λίπανση + Κομπόστα Φασκόμηλου, ΣΔ=Συμβατική Λίπανση + Κομπόστα Δυόσμου, ΟΜ=Μάρτυρας Οργανικής Λίπανσης, ΣΜ=Μάρτυρας Συμβατικής Λίπανσης 45

55 κομπόστας φασκόμηλου με συμβατική λίπανση (αύξηση 36% σε σχέση με το μάρτυρα). Αντίθετα, η μεγαλύτερη μείωση παρατηρήθηκε σε 8% κομπόστα φασκόμηλου με προσθήκη οργανικής λίπανσης (-53%, σε σχέση με το μάρτυρα). Η περιεκτικότητα καλίου του υπέργειου τμήματος των σποροφύτων σε όλες σχεδόν τις επεμβάσεις ήταν αυξημένη σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες (Σχήμα 1.10). Η αύξηση κυμάνθηκε από 13% (2% κομπόστα δυόσμου και συμβατική λίπανση) μέχρι 64% (8% κομπόστα φασκόμηλου και οργανική λίπανση). Εξαίρεση αποτέλεσε ο συνδυασμός 8% κομπόστας φασκόμηλου με συμβατική λίπανση, όπου παρατηρήθηκε μείωση της συγκέντρωσης καλίου κατά 10%. Αντιθέτως, η συγκέντρωση του καλίου στις ρίζες των σποροφύτων διαφοροποιήθηκε σημαντικά από αυτή των σποροφύτων-μαρτύρων εκεί όπου εφαρμόστηκε κομπόστα δυόσμου ή φασκόμηλου με οργανική λίπανση. Ειδικότερα, ο πρώτος συνδυασμός προκάλεσε αύξηση καλίου κατά 19-32%, ενώ ο δεύτερος (8% κομπόστα φασκόμηλου και οργανική λίπανση) μείωση κατά 55% (Σχήμα 1.10). Η περιεκτικότητα ασβεστίου στο υπέργειο τμήμα των σποροφύτων σε όλες τις επεμβάσεις μειώθηκε από 2 μέχρι και 30% σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες (Σχήμα 1.11). Εξαίρεση αποτέλεσε ο συνδυασμός των διαφόρων ποσοτήτων κομπόστας φασκόμηλου με οργανική λίπανση, ο οποίος προκάλεσε αύξηση της περιεκτικότητας του υπέργειου τμήματος των σποροφύτων σε ασβέστιο κατά 32-60%. Η συγκέντρωση ασβεστίου ήταν αυξημένη σε σχέση με τους μάρτυρες στις ρίζες των σποροφύτων παρουσία οργανικής λίπανσης (εξαίρεση η μείωση κατά 50% στο συνδυασμό 8% κομπόστα φασκόμηλου και οργανική λίπανση) και σημαντικά μειωμένη παρουσία συμβατικής λίπανσης (Σχήμα 1.11). Οι επεμβάσεις σε συνδυασμό με οργανική λίπανση αύξησαν την περιεκτικότητα μαγνησίου στο υπέργειο τμήμα των σποροφύτων, ενώ οι επεμβάσεις σε συνδυασμό με συμβατική λίπανση τη μείωσαν σε σχέση με το μάρτυρα (Σχήμα 1.11). Η οργανική λίπανση συνδυασμένη με κομπόστα φασκόμηλου προκάλεσε μεγαλύτερη αύξηση (44-58%) της περιεκτικότητας μαγνησίου σε σχέση με την κομπόστα δυόσμου (10-19%). Αντιθέτως, ο συνδυασμός της συμβατικής λίπανσης με φασκόμηλο προκάλεσε μεγαλύτερη μείωση (13-21%) της περιεκτικότητας μαγνησίου του υπεργείου τμήματος, σε σχέση με την κομπόστα δυόσμου (μείωση κατά 3-7%). Η περιεκτικότητα μαγνησίου των ριζών των σποροφύτων ήταν σχεδόν σε όλες τις επεμβάσεις μειωμένη σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες (Σχήμα 1.11). Η μείωση κυμάνθηκε από 1% μέχρι και 64% 46

56 Ποσότητα Κομπόστας (%) mg Ca g -1 ξηράς ουσίας 2,5 2 1,5 1 0, (Μάρτυρας Οργανικής Λίπανσης) 0 (Μάρτυρας Συμβατικής Λίπανσης) Υπέργειο σύστημα 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Ριζικό σύστημα 0,8 0,8 mg Mg g -1 ξηράς ουσίας 0,6 0,4 0,2 0 0,6 0,4 0,2 0 Περιεκτικότητα Fe (ppm) ΟΦ ΟΔ ΣΦ ΣΔ ΟΜ ΣΜ ΟΦ ΟΔ ΣΦ ΣΔ ΟΜ ΣΜ * Σχήμα Περιεκτικότητα σε ασβέστιο και μαγνήσιο (mg g -1 ξηράς ουσίας) και σίδηρο (ppm) του υπέργειου και ριζικού τμήματος των σποροφύτων τομάτας σε κομπόστα δυόσμου ή φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος) συνδυασμένη με δύο είδη λίπανσης. * OΦ=Οργανική Λίπανση + Κομπόστα Φασκόμηλου, ΟΔ=Οργανική Λίπανση + Κομπόστα Δυόσμου, ΣΦ=Συμβατική Λίπανση + Κομπόστα Φασκόμηλου, ΣΔ=Συμβατική Λίπανση + Κομπόστα Δυόσμου, ΟΜ=Μάρτυρας Οργανικής Λίπανσης, ΣΜ=Μάρτυρας Συμβατικής Λίπανσης 47

57 σε 8% κομπόστα φασκόμηλου με οργανική λίπανση. Εξαίρεση αποτέλεσε ο συνδυασμός κομπόστας δυόσμου με οργανική λίπανση που αύξησε κατά 5% - 19% την περιεκτικότητα μαγνησίου των ριζών. Η περιεκτικότητα σιδήρου του υπέργειου τμήματος των σποροφύτων ήταν μειωμένη σε σχέση με τους μάρτυρες εκτός από τον συνδυασμό 4% κομπόστας φασκόμηλου με συμβατική λίπανση, όπου η συγκέντρωση σιδήρου αυξήθηκε κατά 62%, και το συνδυασμό 4% και 8% κομπόστας δυόσμου με οργανική λίπανση, όπου υπήρξε αύξηση μέχρι και 69% (Σχήμα 1.11). Αντίθετα, η οργανική λίπανση μείωσε την περιεκτικότητα των ριζών σε σίδηρο, ενώ η συμβατική λίπανση την αύξησε (Σχήμα 1.11). Η περιεκτικότητα ψευδαργύρου στο υπέργειο αλλά και στο ριζικό τμήμα των σποροφύτων ήταν μικρότερη από την αντίστοιχη των μαρτύρων στις περισσότερες επεμβάσεις, με εξαίρεση το συνδυασμό κομπόστας φασκόμηλου με συμβατική λίπανση, όπου σημειώθηκε αύξηση μέχρι και 130% (Σχήμα 1.12). Η περιεκτικότητα μαγγανίου στο υπέργειο τμήμα των σποροφύτων αυξήθηκε στις επεμβάσεις με οργανική λίπανση μέχρι 129% και μειώθηκε στις επεμβάσεις με συμβατική λίπανση μέχρι και 23%, σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες (Σχήμα 1.12). Αντίθετα, η περιεκτικότητα μαγγανίου αυξήθηκε στις επεμβάσεις με συμβατική λίπανση μέχρι και 100% και μειώθηκε στις επεμβάσεις με οργανική λίπανση μέχρι και 42%, σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες (Σχήμα 1.12). Η περιεκτικότητα του νατρίου στο υπέργειο τμήμα των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν στις διάφορες επεμβάσεις ήταν ανάλογη με αυτή της περιεκτικότητας μαγγανίου (αυξημένη στις επεμβάσεις οργανικής, μειωμένη σχεδόν σε όλες τις επεμβάσεις συμβατικής) (Σχήμα 1.12). Αντιθέτως, η περιεκτικότητα νατρίου στις ρίζες των σποροφύτων ήταν αυξημένη κατά % εκεί όπου χρησιμοποιήθηκε κομπόστα δυόσμου με οργανική λίπανση και κατά 21-63% με συμβατική λίπανση (Σχήμα 1.12). Μείωση κατά 64% της περιεκτικότητας νατρίου του ριζικού τμήματος των σποροφύτων παρατηρήθηκε εκεί όπου χρησιμοποιήθηκε κομπόστα φασκόμηλου σε συνδυασμό με οργανική λίπανση. 48

58 Ποσότητα Κομπόστας (%) (Μάρτυρας Οργανικής Λίπανσης) 0 (Μάρτυρας Συμβατικής Λίπανσης) Περιεκτικότητα Zn (ppm) Υπέργειο σύστημα Ριζικό σύστημα Περιεκτικότητα Mn (ppm) Περιεκτικότητα Na (ppm) 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,4 0,3 0,2 0,1 ΟΦ ΟΔ ΣΦ ΣΔ ΟΜ ΣΜ 0 * ΟΦ ΟΔ ΣΦ ΣΔ ΟΜ ΣΜ Σχήμα Περιεκτικότητα σε ψευδάργυρο, μαγγάνιο και νάτριο (ppm) του υπέργειου και ριζικού τμήματος των σποροφύτων τομάτας που αναπτύχθηκαν σε κομπόστα δυόσμου ή φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος) συνδυασμένη με δύο είδη λίπανσης. * OΦ=Οργανική Λίπανση + Κομπόστα Φασκόμηλου, ΟΔ=Οργανική Λίπανση + Κομπόστα Δυόσμου, ΣΦ=Συμβατική Λίπανση + Κομπόστα Φασκόμηλου, ΣΔ=Συμβατική Λίπανση + Κομπόστα Δυόσμου, ΟΜ=Μάρτυρας Οργανικής Λίπανσης, ΣΜ=Μάρτυρας Συμβατικής Λίπανσης 49

59 4.3. Επιδράσεις των επεμβάσεων στο εδαφικό περιβάλλον Ανίχνευση νιτροποιητικών βακτηρίων Η ανάπτυξη των νιτροποιητικών βακτηρίων εκτιμήθηκε μακροσκοπικά με την αλλαγή χρώματος του θρεπτικού υποστρώματος μετά από επώαση (εντός δοκιμαστικών σωλήνων) τεσσάρων μηνών (Εικόνα 1.1). Σε κάθε θρεπτικό υπόστρωμα, η αλλαγή χρώματος από ροδόχροο σε κίτρινο υποδήλωνε την παραγωγή νιτρωδών ιόντων και ως εκ τούτου την παρουσία των νιτροποιητικών βακτηρίων του γένους Nitrosomonas (σε υπόστρωμα LMA) και Nitrosospira (σε υπόστρωμα LMU). Γενικώς, τα νιτροποιητικά βακτήρια των γενών Nitrosomonas και Nitrosospira, τα οποία είναι υπεύθυνα για τη βιολογική μετατροπή του αμμωνιακού αζώτου σε νιτρώδη ιόντα, παρέμειναν ενεργά μέχρι και στις 60 ΗΜΕ μετά από προσθήκη οποιασδήποτε ποσότητας κομπόστας δυόσμου ή φασκόμηλου στο έδαφος και των συνδυασμών τους με οργανική ή συμβατική λίπανση. Εικόνα 1.1. Μακροσκοπική αλλαγή χρώματος στους δοκιμαστικούς σωλήνες (με θρεπτικό υπόστρωμα LMA και πέντε διαδοχικές αραιώσεις δειγματοληψίας εδάφους από φυτοδοχείο με έδαφος αναμεμιγμένο με 4% κομπόστα και συμβατική λίπανση) που υποδεικνύει την ύπαρξη Nitrosomonas τέσσερις μήνες μετά την επώαση. Ο δοκιμαστικός σωλήνας-μάρτυρας περιέχει καθαρό LMA χωρίς έδαφος Προσδιορισμός ολικού πληθυσμού εδαφογενών μυκήτων Η ανάλυση παραλλακτικότητας (ANOVA) του ολικού πληθυσμού των μυκήτων (Πίνακας Π.1.5) έδειξε ότι τον πρώτο χρόνο ο πληθυσμός των μυκήτων ήταν μικρότερος από αυτόν κατά τον δεύτερο χρόνο πειραματισμού (τα αποτελέσματα δεν παρουσιάζονται). Επειδή η αλληλεπίδραση της επανάληψης του πειράματος στο χρόνο με κάθε μία από τις επιμέρους παραμέτρους δεν ήταν στατιστικώς σημαντική στις περισσότερες περιπτώσεις, οι τιμές του πληθυσμού των μυκήτων που παρουσιάζονται στα Σχήματα 1.13 και 1.14 είναι οι μέσοι όροι των δύο χρόνων πειραματισμού. 50

60 1,0E HME 8,0E+04 a 6,0E+04 4,0E+04 b b c * 2,0E+04 0,0E+00 CFU/ g εδάφους 1,0E+05 8,0E+04 6,0E+04 4,0E+04 c b a 40 HME d 2,0E+04 0,0E+00 1,0E+05 8,0E HME 6,0E+04 a 4,0E+04 b b 2,0E+04 c 0,0E M Ποσότητα κομπόστας στο έδαφος (%) ** Σχήμα Πληθυσμοί oλικών εδαφογενών μυκήτων (CFU/g εδάφους) σε έδαφος με κομπόστα δυόσμου ή φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος). Οι μετρήσεις έγιναν σε 20, 40 και 60 ΗΜΕ. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) ** Το Μ παριστάνει το έδαφος-μάρτυρα, χωρίς προσθήκη κομπόστας φασκόμηλου ή δυόσμου Στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ, ο ολικός πληθυσμός των εδαφογενών μυκήτων αυξήθηκε ανάλογα με την ποσότητα εφαρμογής κομπόστας δυόσμου ή φασκόμηλου στο έδαφος (Σχήμα 1.13). Οι αλληλεπιδράσεις του είδους λίπανσης με κομπόστα, είδους λίπανσης με ποσότητα εφαρμογής κομπόστας, καθώς και είδους λίπανσης με κομπόστα και τη συγκέντρωσή της ήταν σημαντικές στις 20 και 40 ΗΜΕ (Πίνακας Π.1.5). Αναλυτικότερα, στις 20 ΗΜΕ, ο πληθυσμός των ολικών εδαφογενών μυκήτων 51

61 κυμάνθηκε από 2 x 10 4 μέχρι 9 x 10 4 CFU/g εδάφους στην αλληλεπίδραση είδους λίπανσης με κομπόστα και τη συγκέντρωσή της. Η υψηλότερη τιμή παρατηρήθηκε στην περίπτωση της συμβατικής λίπανσης με 8% κομπόστα δυόσμου (Σχήμα 1.14). Οι μάρτυρες οργανικής και συμβατικής λίπανσης παρουσίασαν το μικρότερο πληθυσμό μυκήτων σε σχέση με κάθε επέμβαση. Η οργανική λίπανση είχε μεγαλύτερο πληθυσμό όταν συνδυάστηκε με κομπόστα φασκόμηλου σε σχέση με την κομπόστα δυόσμου, ενώ η συμβατική λίπανση είχε μεγαλύτερο πληθυσμό όταν συνδυάστηκε με κομπόστα δυόσμου σε σχέση με την κομπόστα φασκόμηλου. Στις 40 ΗΜΕ, ο ολικός πληθυσμός των εδαφογενών μυκήτων παρουσίασε την ίδια περίπου εικόνα, με σταθερά υψηλότερες όμως τιμές, από ό,τι στις 20 ΗΜΕ (Σχήμα 1.14). Η υψηλότερη τιμή καταγράφηκε και πάλι στο συνδυασμό συμβατικής λίπανσης με 8% κομπόστα δυόσμου, ενώ η χαμηλότερη τιμή καταγράφηκε στο μάρτυρα της συμβατικής λίπανσης και ακολούθως στο μάρτυρα της οργανικής λίπανσης. Στις 60 ΗΜΕ, ο ολικός πληθυσμός των μυκήτων μειώθηκε σημαντικά σε σχέση με τους αντίστοιχους πληθυσμούς στις 20 και στις 40 ΗΜΕ, σε όλους τους συνδυασμένους παράγοντες που διατήρησαν αμετάβλητη τη μεταξύ τους αναλογία (Σχήμα 1.14). Η υψηλότερη τιμή καταγράφηκε και πάλι στο συνδυασμό συμβατικής λίπανσης με 8% κομπόστα δυόσμου, ενώ η χαμηλότερη τιμή στο μάρτυρα της συμβατικής λίπανσης και στο μάρτυρα της οργανικής λίπανσης. Ο πληθυσμός των μυκήτων ήταν ανάλογος με την ποσότητα της κομπόστας και στις 60 ΗΜΕ. 52

62 Ποσότητα κομπόστας (%) (Μάρτυρας οργανικής λίπανσης) 0 (Μάρτυρας συμβατικής λίπανσης) 1,0E+05 8,0E+04 a 20 HME 6,0E+04 4,0E+04 2,0E+04 bcdebc b bcd def def fgh efg cde efg cde fgh h * 0,0E+00 CFU/ g εδάφους 1,2E+05 1,0E+05 8,0E+04 6,0E+04 4,0E+04 2,0E+04 bc bc b de bc cde ef cde bc ef cde a 40 HME ef f 0,0E+00 1,0E+05 8,0E+04 6,0E+04 4,0E+04 ab ab ab abc bcde cde ab bcde cde def efg a 60 HME gh h 2,0E+04 0,0E+00 ΟΦ** ΟΔ ΣΦ ΣΔ ΟΜ ΣΜ Σχήμα Πληθυσμοί oλικών εδαφογενών μυκήτων (CFU / g εδάφους) σε έδαφος με κομπόστα δυόσμου ή φασκόμηλου (0, 2, 4, 8%, w:w, κομπόστα:έδαφος) συνδυασμένη με δύο είδη λίπανσης. Οι δειγματοληψίες και η καταμέτρηση έγιναν στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ. * Ίδια γράμματα στηλών δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων (P 0.05) ** OΦ=Οργανική Λίπανση + Κομπόστα Φασκόμηλου, ΟΔ=Οργανική Λίπανση + Κομπόστα Δυόσμου, ΣΦ=Συμβατική Λίπανση + Κομπόστα Φασκόμηλου, ΣΔ=Συμβατική Λίπανση + Κομπόστα Δυόσμου, ΟΜ=Μάρτυρας Οργανικής Λίπανσης, ΣΜ=Μάρτυρας Συμβατικής Λίπανσης 53

63 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Το ενδιαφέρον σχετικά με τη θρεπτική κατάσταση του εδάφους κατά τα τελευταία χρόνια δεν εστιάζεται μόνο στην εκτίμηση της θρεπτικής του κατάστασης, αλλά και στο είδος των θρεπτικών στοιχείων που ανακυκλώνονται μέσω της χλωράς λίπανσης και των κομποστών. Ειδικότερα για το άζωτο, βρέθηκε ότι ο ρυθμός νιτροποίησής του συνδέεται και με το φαινόμενο της αλληλοπάθειας, αλλά η σημασία της δεύτερης παραμένει ακόμη υπό διερεύνηση (Attiwill and Adams 1993). Σχετικώς με την επίδραση της χλωράς λίπανσης και των κομποστών στη νιτροποίηση, η ανίχνευση νιτρωδών ιόντων στην παρούσα εργασία δείχνει ότι η δράση των νιτροποιητικών βακτηρίων του γένους Nitrosomonas και Nitrosospira δεν επηρεάζεται αρνητικά από την προσθήκη κομπόστας δυόσμου και φασκόμηλου στο έδαφος και από την προσθήκη οργανικής ή συμβατικής λίπανσης. Αυτό σημαίνει ότι ο αρωματικός χαρακτήρας των κομποστών δυόσμου και φασκόμηλου δεν αναστέλλει τη διαδικασία οξείδωσης του αμμωνιακού αζώτου σε νιτρώδη ιόντα στο έδαφος, η οποία αποτελεί και την πρώτη αντίδραση της νιτροποίησης. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με αυτά των Thevathasan et al. (1998), οι οποίοι βρήκαν ότι ο δευτερογενής μεταβολίτης «γιουγκλόνη» [juglone, φαινολική ένωση που εκλύεται από την καρυδιά (Juglans regia) ως αλληλοπαθητικός μεταβολίτης] δεν επηρεάζει τη διαδικασία της νιτροποίησης σε πειράματα αγρού αλλά και εργαστηρίου. Αντίθετα, οι Innerebner et al. (2006) αναφέρουν ότι ο πληθυσμός των νιτροποιητικών βακτηρίων του γένους Nitrosomonas και Νitrosospira σε εδάφη που υπέστησαν κατεργασία με κομπόστες από οργανικά απορρίμματα, κοπριά ζώων και χλωρά λίπανση, ήταν δύο φορές υψηλότερος (4,3 x 10 7 CFU/g εδάφους) σε σχέση με τον πληθυσμό τους σε έδαφος με συμβατική λίπανση (1,9 x 10 7 CFU/g εδάφους). Τα πολυετή αγρωστώδη και άλλα φυτά αναστέλλουν τη διαδικασία της νιτροποίησης στο έδαφος λόγω πιθανώς των βακτηριοστατικών ιδιοτήτων των ριζών τους (Theron 1951). Αυτό επιβεβαιώνεται από τα πειράματα του Richardson (1938), ο οποίος βρήκε αυξημένη συγκέντρωση αμμωνιακού αζώτου σε σχέση με εκείνη του νιτρικού σε εδάφη της Αγγλίας με αγρωστώδεις καλλιέργειες. Ο Rice (1984), βασιζόμενος σε αρκετές μελέτες, βρήκε ότι η ικανότητα των αγρωστωδών να χρησιμοποιούν περισσότερο αποτελεσματικά το αμμωνιακό από ό,τι το νιτρικό άζωτο είναι η κυριότερη αιτία της αναστολής της νιτροποίησης σε εδάφη καλλιεργούμενα με αγρωστώδη είδη. Ο White (1986) βρήκε ότι οι χαμηλοί ρυθμοί νιτροποίησης σε 54

64 δάση Pinus ponderosa οφείλονταν στην ύπαρξη μονοτερπενίων στο έδαφος. Επίσης, οι Bremner and McCarty (1993) αναφέρουν ότι οι χαμηλοί ρυθμοί νιτροποίησης οφείλονται στην ύπαρξη φαινολικών ουσιών, ταννινών και μονοτερπενίων που αυξάνουν την ετεροτροφική ακινητοποίηση των αμμωνιακών ιόντων με αποτέλεσμα τη μειωμένη διαθεσιμότητα των αμμωνιακών ιόντων για τα νιτροποιητικά βακτήρια. Στο ίδιο συμπέρασμα κατέληξαν και οι Paavolainen et al. (1998), οι οποίοι αναφέρουν αύξηση της μικροβιακής αναπνοής αλλά με παράλληλη μείωση της νιτροποίησης μετά από προσθήκη μονοτερπενίων σε νορβηγικά δάση Picea abies. Τέλος, οι Ward et al. (1997) βρήκαν αναστολή της νιτροποίησης του Nitrosomonas europaea σε καθαρές καλλιέργειες μετά από προσθήκη των μονοτερπενίων λιμονένιο, α-πινένιο, σαβινένιο, μυρκένιο και γ-τερπινένιο. Από την άλλη, οι Strauss and Lamberti (2002) συμπέραναν ότι η μειωμένη νιτροποίηση σε εδάφη δασικών περιοχών οφείλεται όχι μόνο σε φαινόμενα αλληλοπάθειας, αλλά και στον ανταγωνισμό μεταξύ των ετερότροφων βακτηρίων. Οι διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων της παρούσας εργασίας και ορισμένων από τις προαναφερθείσες εργασίες πιθανώς να οφείλεται στις διαφορές τύπου και ποσότητας των δευτερογενών μεταβολιτών στο έδαφος. Συγκεκριμένα, η επίδραση της καρβόνης και της 1,8-κινεόλης (κύρια συστατικά αντιστοίχως των αρωματικών φυτών δυόσμου και φασκόμηλου που χρησιμοποιήθηκαν για τις κομπόστες) στην νιτροποίηση δεν έχει ακόμη μελετηθεί. Επίσης, η επίδραση και των λοιπών τερπενίων των αρωματικών φυτών που χρησιμοποιήθηκαν δεν έχει ακόμη μελετηθεί. Η ενσωμάτωση κομπόστας δυόσμου (κυρίως σε ποσότητα 8%) σε έδαφος όπου είχε εφαρμοσθεί οργανική ή συμβατική λίπανση αύξησε το ύψος (Χάλκος, αδημοσίευτα δεδομένα), την ωφέλιμη φωτοσύνθεση, τη στοματική αγωγιμότητα, τη φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα και το ξηρό βάρος του υπέργειου τμήματος και του ριζικού συστήματος των σποροφύτων της τομάτας. Αντίθετα, ο Verdonck (1988) βρήκε ότι η άμεση ενσωμάτωση οργανικών υλικών, όπως το πριονίδι ή ο φλοιός δένδρων, στις καλλιεργούμενες εκτάσεις προκάλεσε φυτοτοξικότητα, μακροχρόνια ακινητοποίηση του αζώτου και αλατότητα. Επίσης, οι Ramamurthy et al. (1996) αναφέρουν φυτοτοξικότητα στα καλλιεργούμενα φυτά μετά από χρήση κομπόστας, η οποία όμως μειώθηκε με προσθήκη ειδικών μυκήτων στο κομποστοποιήσιμο υλικό, διαδικασία που δεν χρειάστηκε να εφαρμοσθεί στην παρούσα εργασία και αποτελεί σημαντικό συγκριτικό πλεονέκτημα. Συγκεκριμένα, οι Ramamurthy et al. (1996) 55

65 βρήκαν ότι η προσθήκη ουρίας και του μύκητα Volvariella volvaceae σε έδαφος με κομποστοποιημένα τεμαχίδια φλοιού (πριονίδια) του δένδρου Eucalyptus tereticornis προκάλεσε θετική επίδραση στη φυτρωτική ικανότητα, την περιεχόμενη χλωροφύλλη και το ρυθμό αύξησης των σποροφύτων σιταριού και κρεμμυδιού. Προηγούμενη έρευνα των Beauchemin et al. (1992) επίσης έδειξε ότι η άμεση εφαρμογή στο έδαφος υλικών με υψηλή περιεκτικότητα λιγνίνης και κυτταρίνης δεν ενδείκνυται για τις καλλιέργειες, επειδή αυξάνει τη συγκέντρωση ορισμένων στοιχείων του εδάφους προξενώντας φυτοτοξικότητα και αναστολή της βλαστικής ικανότητας των σπερμάτων. Άλλη έρευνα (Meunchang et al. 2006) έδειξε ότι η προσθήκη αζωτοδεσμευτικών βακτηρίων των γενών Azospirillum, Azotobacter και Βeijerinckia σε κομποστοποιημένα υπολείμματα τεύτλων προκάλεσε μεγαλύτερη αύξηση των σποροφύτων τομάτας και του περιεχόμενου σε αυτά αζώτου από ό,τι η προσθήκη απλής κομπόστας. Αυτό αποδόθηκε στο γεγονός ότι α) η περιοχή της ριζόσφαιρας των φυτών αποικίζεται από τα αζωτοδεσμευτικά βακτήρια με αποτέλεσμα να δεσμεύεται περισσότερο άζωτο και να υπάρχει χαλαρή συμβίωση υπό μορφή προσφοράς αζωτούχων ουσιών από τα βακτήρια και υδατανθράκων από το φυτό που ακολούθως αυξάνεται ταχύτερα (Κumar and Narula 1999, Kumar and Singh 2001), β) τα αζωτοδεσμευτικά βακτήρια προάγουν την έκλυση φυτορρυθμιστικών ουσιών που ρυθμίζουν την αύξηση των ριζών (Lin et al. 1983, Bashan and Levanomy 1990, Bashan and Hoguin 1997, Amooaghaie et al. 2002) και γ) τα αζωτοδεσμευτικά βακτήρια προκαλούν κατά 10% υψηλότερο ρυθμό ανοργανοποίησης της οργανικής ουσίας της κομπόστας και παρέχουν ως εκ τούτου περισσότερο διαθέσιμο άζωτο για τα φυτά (Meunchang et al. 2006). Η διαδικασία της κομποστοποίησης δεν είναι τελείως κατανοητή από μικροβιολογικής και χημικής απόψεως. Συγκεκριμένα, εικάζεται ότι για να ξεκινήσει η διαδικασία της μετατροπής-αποδόμησης του κομποστοποιήσιμου υλικού είναι αναγκαία η παρουσία μικροβίων (Crawford 1983, Davis et al. 1992, Kakezawa et al. 1992, Poggi-Varaldo and Oleszkiewiez 1992). Επιπλέον, οι Hoitnk and Fahy (1986) αναφέρουν ότι το κομποστοποιήσιμο υλικό μειώνει τον πληθυσμό των παθογόνων μικροοργανισμών του εδάφους και αποτελεί ως εκ τούτου ιδανικό υπόστρωμα για την ανάπτυξη λαχανοκομικών ειδών και δασικών σποροφύτων (Davis et al. 1992). Η επαγόμενη ανάπτυξη των φυτών μπορεί να αποδοθεί σε παραγωγή ουσιών που προάγουν την ανάπτυξή τους (διεγέρτες αύξησης), βελτιώνουν το πορώδες, την υδατοϊκανότητα και τη θρεπτική κατάσταση του εδάφους, μειώνουν τους 56

66 φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς, αποδομούν τις ανασταλτικές (της αύξησης) ουσίες (Ramamurthy et al. 1996). Επίσης, η κομπόστα μπορεί να είναι φορέας κάποιων φυτορρυθμιστικών μεταβολιτών που παράγονται από μικροοργανισμούς του εδάφους (Ramamurthi et al. 1996). Οι Valdrighi et al. (1996) αναφέρουν ότι η θετική επίδραση της κομπόστας από φυτικά χλωροφυλλούχα υπολείμματα στην ανάπτυξη του Cichorium intybus (ραδίκι) οφειλόταν στην υψηλή συγκέντρωση χουμικών ουσιών. Αυτό (θετική επίδραση των χουμικών οξέων στην αύξηση των φυτών) εικάζεται ότι οφείλεται α) στην ικανότητά τους να αυξάνουν τη διαπερατότητα των βιολογικών μεμβρανών που έχει ως συνέπεια την καλύτερη θρέψη των φυτών (Samson and Visser 1989), β) στη μεγαλύτερη ικανότητα μεταφοράς ιόντων στους ιστούς της ρίζας (Dell Agnola and Nardi 1987, Varanini et al. 1993) και γ) στην αύξηση του μικροβιακού πληθυσμού και του ρυθμού αποδόμησης ορισμένων οργανικών υπολειμμάτων (Visser 1985 a, b). Οι Valdrighi et al. (1996) αναφέρουν σημαντική αύξηση του ολικού πληθυσμού των βακτηρίων του εδάφους (ετερότροφων και αυτότροφων νιτροποιητικών) και αμελητέα επίδραση στους ακτινομύκητες του εδάφους 120 ημέρες από την ενσωμάτωση κομπόστας (φυτικά χλωροφυλλούχα υπολείμματα) στο έδαφος. Στην παρούσα εργασία, η σημαντική αύξηση του ολικού πληθυσμού των εδαφογενών μυκήτων και του ολικού βακτηριακού πληθυσμού (Χάλκος, αδημοσίευτα δεδομένα) στο εδαφικό περιβάλλον σε όλες τις επεμβάσεις όπου έγινε προσθήκη κομπόστας είναι ανάλογη με τα ευρήματα των Valdrighi et al. (1996) για βακτηριακούς πληθυσμούς. Η ικανότητα των μικροοργανισμών να αφομοιώνουν οργανική ύλη (κομποστοποιήσιμο φυτικό υλικό που αποτελείται από κυτταρίνη, λιγνίνη, πρωτεΐνες και λιπίδια) εξαρτάται από την ικανότητά τους να παράγουν τα αναγκαία για την αποδόμηση των προαναφερθεισών οργανικών ενώσεων καταλυτικά ένζυμα (Tuomela et al. 2000). Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών βασίζεται στην ύπαρξη πηγών άνθρακα ή/και μακροστοιχείων (όπως είναι το άζωτο, ο φώσφορος και το κάλιο) και αρκετών μικροστοιχείων. Ο άνθρακας χρησιμεύει κυρίως ως πηγή ενέργειας των μικροοργανισμών και σε μικρότερο βαθμό ενσωματώνεται στα κύτταρά τους. Μέρος της ενέργειας που παράγεται χρησιμοποιείται στο μικροβιακό μεταβολισμό, ενώ η υπόλοιπη ενέργεια εκλύεται ως θερμότητα. Το άζωτο διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών, ως δομικό στοιχείο των πρωτεϊνών, των νουκλεϊκών οξέων, των αμινοξέων και των ενζύμων που είναι απαραίτητα για τη λειτουργία και την αύξηση των κυττάρων τους. Όπου το άζωτο απαντάται σε χαμηλή 57

67 συγκέντρωση κατά τη διάρκεια της κομποστοποίησης, η διάρκεια της αποδόμησης των υλικών είναι βραδεία, ενώ όπου απαντάται σε υψηλή συγκέντρωση αυτό (άζωτο) εκλύεται υπό μορφή αμμωνίας. Η μικροβιακή δραστηριότητα μειώνεται σε ξηρά εδάφη επειδή οι μικροοργανισμοί χρησιμοποιούν συνήθως υδατοδιαλυτά οργανικά μόρια. Επίσης, μειώνεται και σε πολύ υγρά εδάφη όπου δημιουργούνται συνθήκες έλλειψης οξυγόνου και έκπλυσης των θρεπτικών στοιχείων (Golueke, 1991). Γενικά, η επιτυχής κομποστοποίηση είναι αποτέλεσμα της ικανότητας ενός συστήματος να παρέχει στη μικροβιακή του κοινότητα επαρκή υγρασία, οξυγόνο, θερμοκρασία και θρεπτικά στοιχεία (Ηerrmann and Shann 1997). Με δεδομένες τις συνθήκες αυτές, η κομποστοποίηση ακολουθεί τρεις φάσεις: (1) τη μεσοφιλική φάση, (2) τη θερμοφιλική φάση και (3) τη φάση πτώσης της θερμοκρασίας και ωρίμανσης της κομπόστας που διαρκεί αρκετούς μήνες. Αναλυτικότερα, στην αρχή της κομποστοποιήσης αποδομούνται οι ευκόλως διαλυτές πηγές άνθρακα (μονοσακχαρίτες, άμυλο και λιπίδια) που χρησιμοποιούνται από τους μικροοργανισμούς με συνέπεια τη μείωση του ph ως αποτέλεσμα της αύξησης των παραγόμενων οργανικών οξέων. Στο επόμενο στάδιο αποδομούνται οι πρωτεΐνες, οι οποίες απελευθερώνουν άζωτο και αυξάνουν το ph. Τέλος, η κομποστοποίηση ολοκληρώνεται με την αποδόμηση των ανθεκτικότερων ενώσεων, όπως είναι η κυτταρίνη, η ημικυτταρίνη και η λιγνίνη, οι οποίες μετασχηματίζονται μερικώς σε χούμο (Crawford and Crawford 1980). Στην αρχή της κομποστοποίησης κυριαρχούν τα μεσόφιλα βακτήρια (1 η φάση), ενώ με τη άνοδο της θερμοκρασίας πάνω από 40 0 C αναλαμβάνουν τα θερμόφιλα βακτήρια, οι ακτινομύκητες και οι θερμόφιλοι μύκητες (2 η φάση). Η μικροβιακή δραστηριότητα μειώνεται δραματικά σε θερμοκρασία > 60 0 C, ενώ με την πτώση της θερμοκρασίας επανεμφανίζονται τα μεσόφιλα βακτήρια και οι λιγνολυτικοί μύκητες (3 η φάση) (Strom 1985). Οι κύριοι υπεύθυνοι για την αποδόμηση κυτταρινών και ημικυτταρινών είναι οι ακτινομύκητες στη 2 η φάση της ανάπτυξης της μέγιστης θερμοκρασίας στο κομποστοποιήσιμο υλικό, ενώ για την αποδόμηση της λιγνίνης οι λιγνολυτικοί μύκητες στην 3 η φάση. Η παρουσία υψηλού πληθυσμού μυκήτων στις διάφορες επεμβάσεις με κομπόστες που παρατηρήθηκε στην παρούσα εργασία πιθανώς να οφείλεται σε μύκητες λιγνολυτικούς που δραστηριοποιούνται από την κομπόστα. Αυτό ενισχύεται και από τη σταδιακή μείωση του πληθυσμού των μυκήτων στο έδαφος από τις 20 στις 60 ΗΜΕ, η οποία πιθανώς να συνδέεται με τη σταδιακή μείωση της λιγνίνης λόγω αποδόμησης. 58

68 O Κostov (1996a) αναφέρει ότι κατά τη διάρκεια της κομποστοποίησης κλαδιών αμπελιού, περιβλημάτων ρυζιού και υπολειμμάτων λιναριού, σημαντικά μεγαλύτερη ποσότητα νιτρικού αζώτου παρατηρείται στις 50 ημέρες της κομποστοποίησης. Η χαμηλή ποσότητα του νιτρικού αζώτου μέχρι την πεντηκοστή ημέρα οφείλεται στον υψηλό βαθμό ακινητοποίησης του αμμωνιακού αζώτου και σε κάποιο βαθμό στην αναστολή των νιτροποιητικών βακτηρίων εξαιτίας της ύπαρξης φυτοτοξικών ουσιών (ταννινών και φαινολών) που παράγονται συχνά στα πρώτα στάδια της κομποστοποίησης (Solbraa 1979 a, b, Saveie and Gourbiere 1989, Kostov 1996a). Στην παρούσα εργασία, ο λόγος C/N ήταν περίπου 11 για την κομπόστα δυόσμου και περίπου 23 για την κομπόστα φασκόμηλου (Χάλκος, αδημοσίευτα δεδομένα) σε χρονικό διάστημα 60 ημερών από την έναρξη της κομποστοποίησης. Ο χαμηλός λόγος C/N για την κομπόστα δυόσμου υποδηλώνει την επιτυχή διαδικασία της ανοργανοποίησης του κομποστοποιήσιμου υλικού, την έλλειψη ακινητοποίησης του αζώτου και ταυτόχρονα τη διαθεσιμότητά του στο εδαφικό διάλυμα. Αντίθετα, ο υψηλός λόγος C/N στην κομπόστα φασκόμηλου υποδηλώνει την υψηλή ακινητοποίησή του αζώτου (Barbarika et al. 1985). Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας επιτρέπουν την εξαγωγή των εξής συμπερασμάτων: i) H προσθήκη των εξετασθεισών ποσοτήτων κομπόστας δυόσμου ή φασκόμηλου στο έδαφος δεν επηρέασε τα νιτροποιητικά βακτήρια των γενών Nitrosomonas και Νitrosospira. ii) Ο εδαφογενής πληθυσμός μυκήτων αυξήθηκε σχεδόν αναλογικά με την αύξηση της ποσότητας κομπόστας των δύο αρωματικών φυτών. iii) Η ενσωμάτωση στο έδαφος κομπόστας δυόσμου σε ποσότητα 8%, ανεξαρτήτως είδους λίπανσης (οργανικής ή συμβατικής), αύξησε σημαντικά την ωφέλιμη φωτοσύνθεση, τη στοματική αγωγιμότητα και τη φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα. iv) Η ενσωμάτωση στο έδαφος κομπόστας δυόσμου σε ποσότητα 8%, σε συνδυασμό με οργανική λίπανση προκάλεσε: Μείωση του πληθυσμού των αγρωστωδών και κυρίως των πλατύφυλλων ζιζανίων. Αύξηση του ξηρού βάρους του υπέργειου και του ριζικού συστήματος των σποροφύτων της τομάτας. 59

69 Αύξηση της περιεκτικότητας σε άζωτο (έως και 75%) του υπέργειου και του ριζικού συστήματος των σποροφύτων της τομάτας. Συνεπώς η ενσωμάτωση κομπόστας δυόσμου ως εδαφοβελτιωτικού σε έδαφος, όπου έγινε οργανική κυρίως λίπανση, μπορεί να ευνοήσει την ανάπτυξη των σποροφύτων της τομάτας, να αναστείλει τη φυτρωτική ικανότητα ορισμένων ζιζανίων και ταυτόχρονα να μην παρεμποδίσει τη διαδικασία της νιτροποίησης. 60

70 6. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Πίνακας Π.1.1. Συνδυασμένη ανάλυση παραλλακτικότητας του πληθυσμού των αγρωστωδών και των πλατύφυλλων ζιζανίων, όπως επηρεάστηκε από το είδος της λίπανσης (οργανική, συμβατική), το είδος της κομπόστας (δυόσμος, φασκόμηλο) και την εφαρμοσθείσα ποσότητα της κομπόστας (0, 2, 4, 8%). Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές στο χρόνο. Σημαντικότητα του F Πηγή παραλλακτικότητας ΒΕ Αγρωστώδη Πλατύφυλλα Επαναλήψεις 2 NS NS Επαναλήψεις στο χρόνο (Y) 1 ** ** Λίπανση (L) 1 NS ** Y X L 1 NS NS Κομπόστα (C) 1 * ** Y X C 1 NS NS L X C 1 NS NS Y X L X C 1 NS NS Ποσότητα εφαρμογής (Q) 3 NS ** Y X Q 3 NS * L X Q 3 NS NS Y X L X Q 3 NS NS C X Q 3 NS * Y X C X Q 3 NS NS L X C X Q 3 NS NS Y X L X C X Q 3 NS NS Σφάλμα 63 CV, % *P 0.05 **P 0.01 ΒΕ = Βαθμοί ελευθερίας ΗΜΕ = Hμέρες μετά την εγκατάσταση του πειράματος NS = not significant 61

71 Πίνακας Π.1.2. Συνδυασμένη ανάλυση παραλλακτικότητας της ωφέλιμης φωτοσύνθεσης και της στοματικής αγωγιμότητας των σποροφύτων τομάτας, όπως επηρεάστηκε από το είδος της λίπανσης (οργανική, συμβατική), το είδος της κομπόστας (δυόσμος, φασκόμηλο) και την εφαρμοσθείσα ποσότητα της κομπόστας (0, 2, 4, 8%). Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές στο χρόνο και μετρήσεις ελήφθησαν σε κάθε επανάληψη στις 20, 40, 60 ΗΜΕ. Σημαντικότητα του F A. Ωφέλιμη φωτοσύνθεση B. Στοματική αγωγιμότητα Πηγή παραλλακτικότητας ΒΕ 30 ΗΜΕ 60 ΗΜΕ 30 ΗΜΕ 60 ΗΜΕ Επαναλήψεις 2 NS NS NS NS Επαναλήψεις στο χρόνο (Y) 1 NS NS NS NS Λίπανση (L) 1 ** NS ** ** Y X L 1 NS NS NS NS Κομπόστα (C) 1 ** NS ** ** Y X C 1 ** NS NS NS L X C 1 ** NS NS ** Y X L X C 1 NS NS NS NS Ποσότητα εφαρμογής (Q) 3 ** ** ** ** Y X Q 3 NS NS NS NS L X Q 3 * NS * ** Y X L X Q 3 NS NS NS NS C X Q 3 ** NS ** ** Y X C X Q 3 NS NS NS NS L X C X Q 3 NS NS NS ** Y X L X C X Q 3 NS NS NS NS Σφάλμα 63 CV, % *P 0.05 **P 0.01 ΒΕ = Βαθμοί ελευθερίας ΗΜΕ = Hμέρες μετά την εγκατάσταση του πειράματος NS = not significant 62

72 Πίνακας Π.1.3. Συνδυασμένη ανάλυση παραλλακτικότητας της φωτοσυνθετικής αποτελεσματικότητας, όπως επηρεάστηκε από το είδος της λίπανσης (οργανική, συμβατική), το είδος της κομπόστας (δυόσμος, φασκόμηλο) και την εφαρμοσθείσα ποσότητα της κομπόστας (0, 2, 4, 8%). Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές στο χρόνο και μετρήσεις ελήφθησαν σε κάθε επανάληψη στις 20, 40, 60 ΗΜΕ. Σημαντικότητα του F ΗΜΕ Πηγή παραλλακτικότητας ΒΕ Επαναλήψεις 2 NS NS NS Επαναλήψεις στο χρόνο (Y) 1 NS NS NS Λίπανση (L) 1 NS NS ** Y X L 1 NS NS NS Κομπόστα (C) 1 NS ** NS Y X C 1 NS NS NS L X C 1 NS NS ** Y X L X C 1 NS NS NS Ποσότητα εφαρμογής (Q) 3 ** ** * Y X Q 3 NS NS NS L X Q 3 ** NS NS Y X L X Q 3 NS NS NS C X Q 3 NS ** ** Y X C X Q 3 NS NS NS L X C X Q 3 NS NS ** Y X L X C X Q 3 NS NS NS Σφάλμα 63 CV, % *P 0.05 **P 0.01 ΒΕ = Βαθμοί ελευθερίας ΗΜΕ = Hμέρες μετά την εγκατάσταση του πειράματος NS = not significant 63

73 Πίνακας Π.1.4. Συνδυασμένη ανάλυση παραλλακτικότητας του ξηρού βάρους του υπέργειου και του ριζικού συστήματος των σποροφύτων τομάτας, όπως επηρεάστηκε από το είδος της λίπανσης (οργανική, συμβατική), το είδος της κομπόστας (δυόσμος, φασκόμηλο) και την εφαρμοσθείσα ποσότητα της κομπόστας (0, 2, 4, 8%). Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές στο χρόνο. Πηγή Παραλλακτικότητας ΒΕ Σημαντικότητα του F Υπέργειο σύστημα Υπόγειο σύστημα Επαναλήψεις 2 NS NS Επαναλήψεις στο χρόνο (Y) 1 NS NS Λίπανση (L) 1 ** ** Y X L 1 NS NS Κομπόστα (C) 1 ** ** Y X C 1 NS NS L X C 1 ** ** Y X L X C 1 NS NS Ποσότητα εφαρμογής (Q) 3 ** ** Y X Q 3 NS NS L X Q 3 ** ** Y X L X Q 3 NS NS C X Q 3 ** ** Y X C X Q 3 NS NS L X C X Q 3 ** ** Y X L X C X Q 3 NS NS Σφάλμα 63 CV, % *P 0.05 **P 0.01 ΒΕ = Βαθμοί ελευθερίας NS = not significant 64

74 Πίνακας Π.1.5. Συνδυασμένη ανάλυση παραλλακτικότητας του ολικού πληθυσμού των μυκήτων, όπως επηρεάστηκε από το είδος της λίπανσης (οργανική, συμβατική), το είδος της κομπόστας (δυόσμος, φασκόμηλο) και την εφαρμοσθείσα ποσότητα της κομπόστας (0, 2, 4, 8%). Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές στο χρόνο και μετρήσεις ελήφθησαν σε κάθε επανάληψη στις 20, 40, 60 ΗΜΕ. Σημαντικότητα του F ΗΜΕ Πηγή παραλλακτικότητας ΒΕ Επαναλήψεις 2 NS * * Επαναλήψεις στο χρόνο (Y) 1 * * NS Λίπανση (L) 1 NS NS * Y X L 1 NS NS NS Κομπόστα (C) 1 NS NS NS Y X C 1 NS NS NS L X C 1 ** ** NS Y X L X C 1 NS NS NS Ποσότητα εφαρμογής (Q) 3 ** ** ** Y X Q 3 NS * NS L X Q 3 * * NS Y X L X Q 3 NS NS NS C X Q 3 NS NS NS Y X C X Q 3 NS NS NS L X C X Q 3 * * NS Y X L X C X Q 3 NS NS NS Σφάλμα 63 CV, % *P 0.05 **P 0.01 ΒΕ = Βαθμοί ελευθερίας ΗΜΕ = Hμέρες μετά την εγκατάσταση του πειράματος NS = not significant 65

75 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΦΥΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΧΩΡΙΣ ΚΟΜΠΟΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΣΕ ΤΟΜΑΤΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΜΕΝΗ ΜΕ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΤΡΟΠΟ 66

76 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η επίδραση φυτικού υλικού ως εδαφοβελτιωτικού (χωρίς προηγούμενη κομποστοποίησή του) σε τομάτα (L. esculentum) καλλιούργεμενη με βιολογικό τρόπο. Η τομάτα επελέγη στην παρούσα εργασία καθώς συχνά καλλιεργείται στην Ελλάδα με βιολογικό τρόπο. Το φυτικό υλικό που μελετήθηκε ως εδαφοβελτιωτικό προερχόταν από τα αρωματικά φυτά δυόσμος (M. spicata), λεβάντα (L. stoechas), ρίγανη (O. vulgare subsp. hirtum) και φασκόμηλο (S. fruticosa) και από δύο χειμερινά σιτηρά, κριθάρι (Hordeum vulgare L.)-ποικιλία Αθηναΐδα και σιτάρι (Triticum aestivum L.)-ποικιλία Ερμής. Τα αρωματικά φυτά επιλέχθηκαν για να μελετηθούν ως εδαφοβελτιωτικά εξαιτίας α) της αφθονίας τους (αποτελούν σημαντικό εκπρόσωπο του μεσογειακού οικοσυστήματος), β) της επιλεκτικής δράσης των αιθερίων ελαίων τους (άλλοτε προάγουν άλλοτε αναστέλλουν τη φυτρωτική ικανότητα και την ανάπτυξη των φυτών) και γ) της επιλεκτικής δράσης τους σε μικροοργανισμούς (άλλοτε καταστέλλουν φυτοπαθογόνους μικροοργανισμούς άλλοτε ευνοούν εδαφογενείς μικροβιακούς πληθυσμούς και αυξάνουν τις μεταβολικές διεργασίες στο έδαφος). Τα χειμερινά σιτηρά συμπεριλήφθηκαν ως πιθανά εδαφοβελτιωτικά, προκειμένου να γίνει σύγκρισή τους με τα αρωματικά φυτά, καθώς είναι ήδη γνωστές οι αλληλοπαθητικές ιδιότητες των πρώτων. Μελετήθηκε η επίδραση των προαναφερθέντων φυτών στη φυτρωτική ικανότητα και στην αύξηση της τομάτας. Αποξηραμένα φύλλα από τα φυτά κάθε είδους αναμίχθηκαν με τα ανώτερα 10 cm εδάφους οριοθετημένων τεμαχίων ενός οργωμένου αγρού σε ποσότητες 0, 2, 4 και 8% (w:w, φυτικό υλικό:έδαφος). Στις 0, 20, 40 και 60 ημέρες από την ενσωμάτωση των φύλλων στο έδαφος ελήφθησαν δείγματα από όλες τις επεμβάσεις και μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο όπου σπάρθηκε τομάτα. Τρεις εβδομάδες αργότερα μετρήθηκε ο αριθμός και το ύψος των σποροφύτων. Στις περισσότερες περιπτώσεις ο δυόσμος αύξησε περισσότερο τη φυτρωτική ικανότητα και το ύψος των σποροφύτων τομάτας, ακολούθως η κριθή και ο σίτος, ενώ η λεβάντα και η ρίγανη μείωσαν τις προηγούμενες παραμέτρους. Το φασκόμηλο, στις περισσότερες περιπτώσεις, προκάλεσε σημαντική μείωση των αξιολογηθεισών παραμέτρων, κυρίως 20 ημέρες μετά την ενσωμάτωση των φύλλων του στο έδαφος. Με βάση τα αποτελέσματα του προκαταρκτικού αυτού πειράματος επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη τα δύο αρωματικά φυτά δυόσμος και φασκόμηλο και ο πειραματισμός επαναλήφθηκε 67

77 επεκτείνοντας τη διάρκειά του στις 90 ημέρες. Εκτιμήθηκαν επιπρόσθετα α) το μέγιστο μήκος φύλλων, το πλάτος φύλλων και το ξηρό βάρος των σποροφύτων της τομάτας, και β) ο πληθυσμός των εδαφογενών μυκήτων στο έδαφος. Όλες οι παράμετροι των σποροφύτων, σε όλες τις επεμβάσεις (εκτός από εκείνες στις 0 ημέρες από την ενσωμάτωση των φύλλων στο έδαφος) ήταν μεγαλύτερες εκεί όπου ενσωματώθηκε φυτικό υλικό δυόσμου στο έδαφος. Όσον αφορά την ενσωμάτωση στο έδαφος φυτικού υλικού φασκόμηλου, η φυτρωτική ικανότητα δεν αναστάλθηκε αλλά σε αρκετές περιπτώσεις το ύψος των σποροφύτων ήταν μικρότερο έως και 25% περίπου σε σχέση με το μάρτυρα. Ο πληθυσμός των εδαφογενών μυκήτων αυξήθηκε παρουσία και των δύο αρωματικών φυτών στο έδαφος. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η εφαρμογή δυόσμου ως εδαφοβελτιωτικού φύλλων σε καλλιέργειες τομάτας θα μπορούσε να έχει πρακτική σημασία. Αντίθετα, η βελτίωση των ιδιοτήτων του εδάφους από φύλλα φασκόμηλου σε συνδυασμό με την ανασταλτική επίδρασή τους στην αύξηση της τομάτας (που παρατηρήθηκε τουλάχιστον στο προκαταρκτικό πείραμα) επιβάλλει την περαιτέρω διερεύνηση τους και σε άλλες καλλιέργειες. 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Είναι ευρέως αποδεκτό ότι ο συμβατικός τρόπος καλλιέργειας της τομάτας αποτελεί εντατικό τρόπο άσκησης γεωργίας που χρησιμοποιεί τεχνικές και χημικά που επηρεάζουν την ισορροπία του οικοσυστήματος, υποβαθμίζουν την ποιότητα του εδάφους, αυξάνουν την επιφανειακή απορροή του νερού (καθώς δημιουργείται πλησίον της επιφάνειας του εδάφους ένα αδιαπέραστο στο νερό στρώμα), συνεισφέρουν στη ρύπανση των νερών και του εδάφους και επιβαρύνουν το κόστος παραγωγής (Rice et al. 2001). Τα προβλήματα αυτά οδήγησαν στην ανάπτυξη εναλλακτικών συστημάτων διαχείρισης καλλιεργειών που, με τη χρήση ανανεώσιμων οργανικών πόρων ή/και με τον περιορισμό της κατεργασίας του εδάφους, στοχεύουν στον εμπλουτισμό του εδάφους σε οργανική ουσία και στη βελτίωση της ποιότητάς του. Η ζωϊκή κόπρος και η κομπόστα αποτελούν οργανικές πηγές θρεπτικών στοιχείων που αυξάνουν την οργανική ουσία και βελτιώνουν την ποιότητα του εδάφους (Wright et al. 1998). Τα εδαφοβελτιωτικά συχνά χρειάζεται να 68

78 ενσωματωθούν στο έδαφος προκειμένου να αποφευχθούν απώλειες, ιδιαιτέρως του αζώτου, λόγω εξάτμισης ή έκπλυσης ή επιφανειακής απορροής του. Η εφαρμογή τους προτείνεται σε θερμοκηπιακά συστήματα καλλιέργειας με παραδοσιακό τρόπο κατεργασίας του εδάφους, όπου συμβάλλουν στη βελτίωση της ποιότητάς του. Βέβαια, και πειράματα αγρού, όπου αξιολογήθηκε η επίδραση της προσθήκης κομποστοποιημένων στερεών αστικών αποβλήτων στο έδαφος, έδειξαν ότι αυτά τα υλικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εδαφοβελτιωτικά αφού βελτιώνουν τις φυσικές ιδιότητες του εδάφους και αυξάνουν τη διαθεσιμότητα του νερού και των απαραίτητων θρεπτικών στοιχείων (McConnell et al. 1993, Rosen et al. 1993, Raviv 1998). Η τελευταία προσέγγιση προσφέρει καλύτερο σύστημα καλλιέργειας από εκείνο της μειωμένης κατεργασίας του εδάφους με εδαφοκάλυψη, το οποίο δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό και είναι λιγότερο επίπονο και δαπανηρό. Οι εδαφογενείς μικροβιακές κοινότητες διαδραματίζουν πρωτεύοντα ρόλο στο εδαφικό οικοσύστημα καθώς συνεισφέρουν στους κύκλους των θρεπτικών στοιχείων, στην καταστολή παθογόνων μικροβίων, στη σταθεροποίηση της δομής του εδάφους και στη μείωση των ξενοβιοτικών ουσιών (xenobiotics), δηλαδή των οργανικών χημικών ουσιών που δεν υπάρχουν και δεν συντίθενται στο φυσικό περιβάλλον. Η μικροβιακή βιομάζα του εδάφους, η δραστικότητα και η δομή της έχουν αποδειχθεί ότι αποτελούν αξιόπιστους δείκτες για τον έλεγχο και σύγκριση των διαφόρων συστημάτων καλλιέργειας. Οι μικροβιακές κοινότητες αντανακλούν τις επιπτώσεις από τον τρόπο διαχείρισης του εδάφους, αν και η σύνδεση μεταξύ της εδαφικής μικροβιακής κοινότητας και της ποιότητας του εδάφους δεν είναι απολύτως αποσαφηνισμένη. Καθώς όμως πολλές από τις ιδιότητες του εδάφους που σχετίζονται με την ποιότητά του μεταβάλλονται βραδέως από την επίδραση των διαφόρων συστημάτων διαχείρισης του εδάφους, στην παρούσα εργασία αξιολογήθηκαν οι μικροβιακές κοινότητες που αναμένεται να αντιδράσουν ταχύτερα σε ένα εναλλακτικό σύστημα καλλιέργειας (Martini et al. 2004). Η μελέτη αφορούσε στη διερεύνηση της χρήσης αρωματικών φυτών ως εδαφοβελτιωτικών σε συστήματα βιολογικής γεωργίας προκειμένου να ελεγχθεί η πιθανή ύπαρξη θετικής επίδρασής τους στην αύξηση των καλλιεργούμενων φυτών και στη μικροβιακή δραστηριότητα. Προκαταρκτικός στόχος της έρευνας ήταν η σύγκριση έξι φυτών, τεσσάρων αρωματικών και δύο καλλιεργούμενων, ως προς την ικανότητα να χρησιμοποιηθούν ως εδαφοβελτιωτικά ή να συμβάλλουν στην αύξηση του χούμου του εδάφους. Η τομάτα (L. esculentum) επιλέχθηκε ως η καλλιέργεια 69

79 εφαρμογής, επειδή αποτελεί χαρακτηριστικό εκπρόσωπο των λαχανοκομικών φυτών που συχνά καλλιεργούνται στη χώρα μας με βιολογικό τρόπο. Ο δεύτερος στόχος του πειράματος ήταν η περαιτέρω αξιολόγηση των δύο καλύτερων αρωματικών φυτών του προκαταρκτικού πειράματος. Η παρούσα έρευνα πραγματοποιήθηκε με σκοπό τη διερεύνηση των επιπτώσεων της ενσωμάτωσης στο έδαφος κομποστοποιήσιμου αποξηραμένου υλικού των επιλεγέντων αρωματικών φυτών i) στην καλλιέργεια της τομάτας (εκτίμηση φυτρωτικής ικανότητας, μέγιστου μήκους και πλάτους των φύλλων και ξηρού βάρους των σποροφύτων) και ii) στο εδαφικό περιβάλλον (εκτίμηση του συνολικού πληθυσμού των μυκήτων). Επίσης, το πείραμα αυτό αποσκοπούσε και στη σύγκριση της επίδρασης του εν δυνάμει κομποστοποιήσιμου υλικού στις προαναφερθείσες παραμέτρους σε σχέση με εκείνην του ήδη κομποστοποιημένου υλικού αρωματικών φυτών (Κεφάλαιο 1). Βέβαια, το πείραμα αυτό διέφερε από το πείραμα του Κεφαλαίου 1 της παρούσας διατριβής και στο ότι το φυτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε ως εδαφοβελτιωτικό δεν συνδυάστηκε με οργανική ή συμβατική λίπανση. Από πρακτική άποψη, η παρούσα έρευνα αποσκοπούσε στην εξεύρεση κατάλληλου τρόπου κομποστοποιήσης φυτικού υλικού, το οποίο (κομποστοποιήσιμο υλικό) θα είναι εύχρηστο, θα έχει τα επιθυμητά χαρακτηριστικά για το καλλιεργούμενο φυτό και για το εδαφικό περιβάλλον και θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μικρή κλίμακα για την παραγωγή εύρωστων σποροφύτων. 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η εγκατάσταση των πειραμάτων του Κεφαλαίου 2 πραγματοποιήθηκε από κοινού με τον κ. Χάλκο Δημήτριο, υποψήφιο διδάκτορα και συμμετέχοντα στο ίδιο πρόγραμμα. Υπενθυμίζεται ότι η παρούσα διδακτορική διατριβή εντάσσεται στο πλαίσιο του ερευνητικού προγράμματος ΠΕΝΕΔ 2001 με τίτλο «Αξιοποίηση εγχώριων φυσικών πόρων στη βιολογική γεωργία: Ρύθμιση παραμέτρων του συστήματος έδαφος-φυτό με δευτερογενείς μεταβολίτες αρωματικών φυτών» (κωδικός έργου 10081_01ΕΔ317). Η μελέτη περιελάμβανε δύο πειράματα: 1) το προκαταρκτικό πείραμα κατά τον πρώτο χρόνο, όπου διερευνήθηκαν η φυτρωτική ικανότητα και η αύξηση των σποροφύτων τομάτας παρουσία κομποστοποιήσιμων υλικών από αρωματικά φυτά ή 70

80 χειμερινά σιτηρά και 2) το κυρίως πείραμα κατά το δεύτερο χρόνο, όπου διερευνήθηκαν περαιτέρω τα δύο καλύτερα επιλεγέντα φυτά από το πρώτο πείραμα (μετρήσεις ίδιες με εκείνες του πρώτου πειράματος και επιπρόσθετα μέτρηση του μέγιστου μήκους και πλάτους των φύλλων και προσδιορισμός του ξηρού βάρους των σποροφύτων). Στο κυρίως πείραμα προσδιορίστηκε επιπρόσθετα και η βιολογική δραστηριότητα του εδάφους με εκτίμηση παραμέτρων του εδαφογενούς μικροβιακού πληθυσμού Φυτικό υλικό Το φυτικό υλικό των αρωματικών φυτών [δυόσμος (M. spicata), λεβάντα (L. stoechas), ρίγανη (O. vulgare subsp. hirtum) και φασκόμηλο (S. fruticosa)] που χρησιμοποιήθηκε στο πείραμα αγοράστηκε από το εμπόριο ή συλλέχθηκε από πληθυσμούς τους στην ευρύτερη περιοχή του Νομού Θεσσαλονίκης. Το φυτικό υλικό κάθε είδους αποτελούνταν από υπέργεια αποξηραμένα τμήματα (βλαστοί, φύλλα και άνθη), τα οποία τεμαχίστηκαν με το χέρι για να επιταχυνθεί ο ρυθμός κομποστοποίησής τους (ο τεμαχισμός των υλικών αυξάνει την επιφάνεια των υλικών όπου οι μικροοργανισμοί μπορούν να δράσουν αμέσως). Επιπλέον, φύλλα και στελέχη από ώριμα προς συγκομιδή φυτά κριθαριού (H. vulgare)-ποικιλία Αθηναΐδα και σιταριού (T. aestivum)-ποικιλία Ερμής, συλλέχθηκαν από καλλιέργειες του Ινστιτούτου Σιτηρών Θεσσαλονίκης του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε., τεμαχίστηκαν και ακολούθως αεροξηράνθηκαν στο θερμοκήπιο για 10 ημέρες Εγκατάσταση πειράματος (πείραμα σε σπορεία) Το πείραμα εγκαταστάθηκε σε οργωμένο αγρό του Εργαστηρίου Γεωργίας στο Αγρόκτημα της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. Ειδικότερα, σε οριοθετημένα τεμάχια (τοποθετήθηκε εντός της κάθε συγκεκριμένης εδαφικής περιοχής πλαστικό πλέγμα), διαστάσεων 30 x 30 cm, αφαιρέθηκε το έδαφος από βάθος 10 cm. Ακολούθως, ποσότητα 5 kg από το έδαφος αυτό (κοσκινισμένο με κόσκινο 3 mm) αναμίχθηκε με φυτικό υλικό ώστε να προκύψουν οι ποσότητες 0 (μάρτυρας), 2, 4 και 8% (w:w, φυτικό υλικό:έδαφος). Το μίγμα του φυτικού υλικού-εδάφους επανατοποθετήθηκε στο ίδιο σημείο του αγρού από το οποίο είχε αφαιρεθεί αρχικά. Η απαραίτητη υγρασία του προς κομποστοποίηση υλικού στα πειραματικά τεμάχια διασφαλίστηκε με δύο αρδεύσεις εβδομαδιαίως και με επακόλουθη αναμόχλευσή του. Κάθε πείραμα (προκαταρκτικό και κυρίως) ακολούθησε το πειραματικό σχέδιο των 71

81 πλήρως τυχαιοποιημένων ομάδων, είχε τρεις επαναλήψεις και επαναλήφθηκε δύο φορές στο χρόνο. Για κάθε φυτικό είδος υπήρχαν τέσσερις επεμβάσεις (0, 2, 4, 8% w:w, φυτικό υλικό:έδαφος), ενώ οι δειγματοληψίες για ανάλυση-μετρήσεις έγιναν σε 0, 20, 40, 60 ημέρες από την εγκατάσταση του πειράματος (ΗΜΕ) στο προκαταρκτικό πείραμα και σε 0, 20, 40, 60, 90 ΗΜΕ στο κυρίως πείραμα Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού από έξι φυτά στη φυτρωτική ικανότητα και στην αύξηση των σποροφύτων τομάτας Στις 0, 20, 40 και 60 ΗΜΕ, ελήφθησαν από κάθε πειραματικό τεμάχιο δείγματα εδάφους, τα οποία κοσκινίστηκαν στο εργαστήριο με κόσκκινο 3 mm και ακολούθως ελήφθη ποσότητα 100 g από αυτά και τοποθετήθηκε σε κάθε ένα από τρία φυτοδοχεία σπορείου. Πέντε σπόροι τομάτας (L. esculentum υβρίδιο Carla F1), σπάρθηκαν σε κάθε φυτοδοχείο. Τα σπορεία διατηρήθηκαν σε ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκηπίου χωρίς προσθήκη λίπανσης. Η φυτρωτική ικανότητα και το ύψος των σποροφύτων της τομάτας μετρήθηκαν 20 ημέρες μετά τη σπορά. Η μελέτη στο προκαταρκτικό αυτό πείραμα περιορίστηκε στα πρώτα στάδια αύξησης φυτών, όπου η πιθανή έλλειψη θρεπτικών στοιχείων ή/και η ανασταλτική επίδραση άλλων παραγόντων είναι εμφανέστερες. Επιπλέον, η παρούσα εργασία εστιάστηκε στη χρήση κομποστοποιήσιμου φυτικού υλικού ως εδαφοβελτιωτικού σε σπορεία τομάτας και όχι σε υπαίθρια (μεταφυτευμένη) καλλιέργεια τομάτας Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού δυόσμου και φασκόμηλου στη φυτρωτική ικανότητα και στην αύξηση των σποροφύτων τομάτας Τα δύο καλύτερα φυτικά υλικά (από το προκαταρκτικό πείραμα) των αρωματικών φυτών δυόσμος και φασκόμηλο επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη στο κυρίως πείραμα (δεύτερο έτος πειραματισμού). Η εγκατάσταση και ο χειρισμός ακολούθησε την προαναφερθείσα διαδικασία, αλλά η διάρκεια της κομποστοποίησηςσυλλογής δείγματος επεκτάθηκε μέχρι και τις 90 ημέρες. Επίσης, εκτός από τη φυτρωτική ικανότητα μετρήθηκε το μέγιστο μήκος και το πλάτος των φύλλων, προσδιορίστηκε το ξηρό βάρος των σποροφύτων και ο πληθυσμός των εδαφογενών μυκήτων στο έδαφος. Για τον προσδιορισμό του ξηρού βάρους, τα σπορόφυτα πλύθηκαν με άφθονο νερό για την απομάκρυνση τυχόν υπολειμμάτων εδάφους και ξηράθηκαν σε κλίβανο στους 70 C για 48 h. 72

82 Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού δυόσμου και φασκόμηλου στον πληθυσμό εδαφογενών μυκήτων Ο προσδιορισμός του πληθυσμού μυκήτων στα εδαφικά δείγματα έγινε σύμφωνα με την τεχνική των διαδοχικών αραιώσεων σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα WA (Water Agar) (Τuite 1969, βλέπε 3.4 του Κεφαλαίου 1) Πείραμα αγρού Με βάση τα αποτελέσματα του πειραματισμού που προαναφέρθηκε στην 3.2 του παρόντος Κεφαλαίου επιλέχθηκε η ποσότητα 4% (w:w, φυτικό υλικό:έδαφος) δυόσμου και διερευνήθηκαν στον αγρό οι επιπτώσεις της ενσωμάτωσής του σε έδαφος όπου καλλιεργήθηκε τομάτα με βιολογικό τρόπο. Αναλυτικότερα, σε οργωμένο αγρό της περιοχής Κρύας Βρύσης του Νομού Πέλλας, όπου επί σειρά ετών καλλιεργούνταν τομάτα με βιολογικό τρόπο, εγκαταστάθηκε το ακόλουθο πείραμα: σε οριοθετημένα πειραματικά τεμάχια διαστάσεων 3.2 m x 2.4 m=7.68 m 2 ενσωματώθηκαν 20 kg αποξηραμένου φυτικού υλικού δυόσμου σε βάθος 10 cm έτσι ώστε να επιτευχθεί ποσότητα 4% δυόσμου (w:w, φυτικό υλικό:έδαφος). Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν εδαφικά τεμάχια χωρίς την προσθήκη φυτικού υλικού δυόσμου. Χρησιμοποιήθηκε το πειραματικό σχέδιο των πλήρως τυχαιοποιημένων ομάδων με τρεις επαναλήψεις. Mια ημέρα μετά την ενσωμάτωση του φυτικού υλικού δυόσμου στον αγρό μεταφυτεύθηκαν σε κάθε πειραματικό τεμάχιο σε τέσσερις σειρές 32 σπορόφυτα τομάτας (που είχαν αναπτυχθεί σε τύρφη εντός σπορείων). Οι αποστάσεις μεταφύτευσης ήταν μεταξύ των σειρών 60 cm, ενώ μεταξύ των φυτών της ίδιας σειράς 40 cm. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές στο χρόνο Επιπτώσεις στα φυτά της τομάτας Στις 20, 30, 40, 60 και 75 ΗΜΕ μετρήθηκαν τα ύψη και ο αριθμός καρπών, η ωφέλιμη φωτοσύνθεση, η στοματική αγωγιμότητα και η φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα των φυτών σε κάθε πειραματικό τεμάχιο, με μεθοδολογία αντίστοιχη αυτής που περιγράφεται στο Κεφάλαιο Επιπτώσεις στο εδαφικό περιβάλλον Στις 0, 20, 40, 60 και 90 ΗΜΕ εκτιμήθηκαν στο εδαφικό περιβάλλον κάθε πειραματικού τεμαχίου η αναλογία C/N, ο συνολικός πληθυσμός των εδαφογενών 73

83 μυκήτων και η ύπαρξη των νιτροποιητικών βακτηρίων, με τη μεθοδολογία που περιγράφεται στο Κεφάλαιο Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση όλων των πειραματικών δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πρόγραμμα Statistica 6.0 (StatSoft Italia srl). Τα αποτελέσματα του προκαταρκτικού και του κυρίως πειράματος αναλύθηκαν ξεχωριστά. Στο προκαταρκτικό πείραμα χρησιμοποιήθηκε το 6 x 4 (6 είδη κομποστοποιήσιμου υλικού x 4 επίπεδα κομποστοποιήσιμου υλικού) παραγοντικό πείραμα σε πλήρως τυχαιοποιημένες ομάδες. Στο κυρίως πείραμα χρησιμοποιήθηκε το 2 x 4 (2 είδη κομποστοποιήσιμου υλικού x 4 επίπεδα κομποστοποιήσιμου υλικού) παραγοντικό πείραμα σε πλήρως τυχαιοποιημένες ομάδες. Η σύγκριση των μέσων όρων έγινε με το κριτήριο της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς (ΕΣΔ) σε επίπεδο σημαντικότητας P 0.05, ενώ οι τιμές CFU/g εδάφους πριν από την ANOVA μετατράπηκαν σε λογαριθμικές τιμές. 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1. Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού από έξι φυτά στη φυτρωτική ικανότητα και στην αύξηση των σποροφύτων τομάτας Η φυτρωτική ικανότητα και το ύψος των σποροφύτων κατά τη διάρκεια του προκαταρκτικού πειράματος (πρώτος χρόνος πειραματισμού) επηρεάστηκαν σημαντικά στις 20, 40 και 60 ΗΜΕ από το είδος του κομποστοποιήσιμου φυτικού υλικού, την ποσότητα και την αλληλεπίδρασή τους (Πίνακας Π.2.1). Ειδικότερα, στις περισσότερες περιπτώσεις, η θετική επίδραση της ενσωμάτωσης φυτικού υλικού δυόσμου στο έδαφος ήταν μεγαλύτερη από την αντίστοιχη των υπολοίπων αρωματικών φυτών και των χειμερινών σιτηρών (Πίνακας 2.1). Οι ποσότητες 2, 4 και 8% του δυόσμου, που εφαρμόσθηκαν στο έδαφος, δεν διέφεραν σημαντικά ως προς την επίδρασή τους στη φυτρωτική ικανότητα της τομάτας. Αντιθέτως, οι ίδιες ποσότητες του φυτικού υλικού δυόσμου διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους, ως προς την επίδρασή τους στο ύψος των σποροφύτων στις 40 και στις 60 ΗΜΕ. Στις 40 ΗΜΕ, υψηλότερα ήταν τα σπορόφυτα που αναπτύχθηκαν σε έδαφος 74

84 Πίνακας 2.1. Η επίδραση της ενσωμάτωσης στο έδαφος διαφόρων ποσοτήτων φυτικού υλικού των αρωματικών φυτών δυόσμος (M. spicatα), λεβάντα (L. stoechas), ρίγανη (O. vulgare subsp. hirtum), φασκόμηλο (S. fruticosa) και των χειμερινών σιτηρών κριθάρι (H. vulgare, ποικιλία Αθηναΐδα) και σιτάρι (T. aestivum, ποικιλία Ερμής) στη φυτρωτική ικανότητα και στο ύψος σποροφύτων τομάτας στις 0, 20, 40 και 60 ΗΜΕ. Οι τιμές εκφράζονται ως % του μάρτυρα (σπορόφυτα σε έδαφος με 0% σε ενσωματωμένο φυτικό υλικό=100). Η φυτρωτική ικανότητα και το ύψος μετρήθηκαν στις 20 ΗΜΕ. Ίδια γράμματα δείχνουν μη σημαντικές διαφορές μεταξύ των επεμβάσεων κάθε παραμέτρου την ίδια ΗΜΕ (P 0.05). Ο αστερίσκος δείχνει διαφορά από το μάρτυρα. Φυτικό υλικό Φυτρωτική ικανότητα Ύψος Ποσότητα ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού ΗΜΕ 2% 4% 8% 2% 4% 8% 0 Δυόσμος 100.5a 97.9ab 95.4ab 101.0bcde 102.4bc 101.1bcde Λεβάντα 93.3ab 92.3abc 90.2bc 98.6cde 99.3cde 97.5ef Ρίγανη 85.1c* 93.8ab 93.3ab 98.2de 100.6bcde 104.5b Φασκόμηλο 99.0ab 96.9ab 95.9ab 93.8f 99.5cde 99.1cde Κριθάρι 88.7bc 94.4ab 93.8ab 104.2b 99.5cde 101.8bcd Σιτάρι 90.8bc 95.4ab 96.4ab 101.5bcde 102.8bc 109.8a 20 Δυόσμος 147.0a* 150.8a* 149.2a* 170.2a* 175.5a* 183.0a* Λεβάντα 102.7c 95.1de 82.7ef 84.4f* 73.5fg* 67.0g* Ρίγανη 67.6g* 51.9hi* 45.9i* 53.6h* 34.8i* 29.3i* Φασκόμηλο 89.2e* 84.3ef* 78.9f* 82.6f* 78.2fg* 74.7fg* Κριθάρι 131.9bc* 138.9ab* 132.4bc* 114.7e 125.0e* 155.0b* Σιτάρι 132.4bc* 135.7ab* 137.3ab* 138.6c* 143.7bc* 153.4b* 40 Δυόσμος 156.5a* 158.7a* 153.7a* 134.5c* 174.1a* 152.7b* Λεβάντα 107.9d 98.9de 88.7e* 78.2hi* 74.2hi* 61.0i* Ρίγανη 71.7f* 54.8g* 40.7h* 98.2fg 67.8i* 69.9i* Φασκόμηλο 91.5e 90.4e 81.4ef* 91.2gh 88.5gh 89.5gh Κριθάρι 140.1bc* 142.4bc* 145.2ab* 113.0ef 114.9ef 123.1cde* Σιτάρι 139.0bc* 139.5bc* 143.5ab* 114.6ef 116.2de 132.8cd* 60 Δυόσμος 150.6a* 150.0a* 150.6a* 147.5b* 183.1a* 173.9a* Λεβάντα 101.7c 97.2c 84.4de* 82.0ef* 76.9ef* 74.0f* Ρίγανη 79.4ef* 55.6f* 41.7f* 78.3ef* 68.4f* 65.0f* Φασκόμηλο 88.3de 100.0c 80.6e* 95.4e 92.7e 91.4e Κριθάρι 138.9b* 139.4b* 138.9b* 117.1cd* 116.8cd 130.1bcd* Σιτάρι 139.4b* 139.4b* 141.1ab* 133.8bcd* 129.5bcd* 135.4bc* 75

85 αναμεμιγμένο με 4% φυτικό υλικό δυόσμου σε σχέση με τα σπορόφυτα που αναπτύχθηκαν με 2 ή 8%. Η φυτρωτική ικανότητα αυξήθηκε σε όλες τις δειγματοληψίες και το ύψος ήταν μεγαλύτερο από του μάρτυρα παρουσία κομποστοποιήσιμου φυτικού υλικού κριθαριού ή σιταριού στο έδαφος. Η θετική αυτή επίδραση ήταν μικρότερη από αυτή που προκάλεσε το φυτικό υλικό του δυόσμου. Επίσης, η μεγαλύτερη ποσότητα ενσωμάτωσης (8%) φυτικού υλικού κριθαριού ή σιταριού στο έδαφος προκάλεσε μικρότερη ή παρόμοια επίδραση με τη μικρότερη ποσότητα ενσωμάτωσης (2%) φυτικού υλικού δυόσμου στο έδαφος. Η φυτρωτική ικανότητα και το ύψος των σποροφύτων της τομάτας μειώθηκαν σημαντικά από την ενσωμάτωση στο έδαφος φυτικού υλικού ρίγανης και λεβάντας, και σε μικρότερο βαθμό από το φυτικό υλικό φασκόμηλου (προκάλεσε σημαντική αλλά παροδική μείωση των δύο παραμέτρων στις 20 ΗΜΕ). Για το λόγο αυτό δυόσμος και φασκόμηλο προκρίθηκαν για περαιτέρω έρευνα Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού δυόσμου και φασκόμηλου στη φυτρωτική ικανότητα και στην αύξηση των σποροφύτων τομάτας Η φυτρωτική ικανότητα της τομάτας, το μέγιστο μήκος και το πλάτος των φύλλων, καθώς και το ξηρό βάρος των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν σε έδαφος με οιασδήποτε ποσότητα ενσωμάτωσης φυτικού υλικού (2, 4 και 8%, w:w, φυτικό υλικό:έδαφος) δυόσμου ήταν σημαντικά μεγαλύτερα από τα σπορόφυτα-μάρτυρες στις 20, 40, 60 και 90 ΗΜΕ από την ενσωμάτωση (Πίνακας 2.2, Πίνακας Π.2.2). Η θετική αυτή επίδραση στη φυτρωτική ικανότητα και στις άλλες παραμέτρους των σποροφύτων ήταν ανάλογη με την ποσότητα ενσωμάτωσης του φυτικού υλικού δυόσμου στο έδαφος (οι διαφορές από τα σπορόφυτα-μάρτυρες ήταν μεγαλύτερες στις ποσότητες 4 και 8 και δευτερευόντως στην ποσότητα 2%). Η φυτρωτική ικανότητα της τομάτας που αναπτύχθηκε σε έδαφος με οιασδήποτε ποσότητα ενσωμάτωσης φυτικού υλικού φασκόμηλου δεν διέφερε σημαντικά από εκείνη των σποροφύτων-μαρτύρων (Πίνακας 2.2). Το μέγιστο μήκος και πλάτος φύλλων των σποροφύτων που αναπτύχθηκαν παρουσία φυτικού υλικού φασκόμηλου στο έδαφος μειώθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τα σπορόφυταμάρτυρες (Πίνακας 2.2). Στις 20 και 40 ΗΜΕ, το ξηρό βάρος των σποροφύτων τομάτας ήταν μικρότερο από εκείνο του μάρτυρα σχεδόν σε όλες τις 76

86 Πίνακας 2.2. Η επίδραση της ενσωμάτωσης στο έδαφος διαφόρων ποσοτήτων φυτικού υλικού των αρωματικών φυτών δυόσμος (M. spicatα) και φασκόμηλο (S. fruticosa) στη φυτρωτική ικανότητα, στο μέγιστο μήκος και πλάτος των φύλλων και στο ξηρό βάρος των σποροφύτων της τομάτας στις 0, 20, 40, 60 και 90 ΗΜΕ. Οι τιμές εκφράζονται ως % του μάρτυρα (σπορόφυτα σε έδαφος με 0% σε ενσωματωμένο φυτικό υλικό=100). Η φυτρωτική ικανότητα και οι άλλες παράμετροι μετρήθηκαν στις 20 ΗΜΕ. Ίδια γράμματα δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων κάθε παραμέτρου την ίδια ΗΜΕ (P 0.05). Ο αστερίσκος δείχνει διαφορά από το μάρτυρα. Αξιολογούμενη παράμετρος Φυτικό υλικό Φυτρωτική ικανότητα Μήκος φύλλων Πλάτος φύλλων Ξηρό βάρος Ποσότητα ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού ΗΜΕ 2% 4% 8% 2% 4% 8% 2% 4% 8% 2% 4% 8% 0 Δυόσμος 98.6a 104.1a 95.9a 100.8a 105.0a 100.0a 98.2a 101.4a 96.9a 100.0a 96.8a 102.2a Φασκόμηλο 106.9a 101.4a 90.4a 97.7a 96.9a 99.2a 99.2a 96.9a 99.6a 96.1a 102.7a 100.1a 20 Δυόσμος 134.5a* 142.0a* 131.8ab* 122.4b* 138.5a* 140.1a* 184.1a* 206.3a* 200.5a* 147.4b* 165.3ab* 179.8a* Φασκόμηλο 101.6c 106.5bc 80.9c 95.3c* 101.2c 99.4c* 82.9b 85.2b 80.5b 70.4c* 58.0cd* 47.0d* 40 Δυόσμος 146.7a* 146.7a* 152.1a* 121.2b* 140.5a* 142.4a* 178.3a* 198.3a* 193.1a* 157.4c* 185.7b* 214.2a* Φασκόμηλο 101.4b 88.0b 82.6b 81.2c* 87.2c* 84.9c* 81.8bc 83.9b 79.7c* 102.7d 92.3de* 86.1e* 60 Δυόσμος 154.1a* 166.5a* 166.5a* 119.1b* 137.6a* 144.1a* 161.3b* 176.8a* 173.3ab* 139.2c* 186.6b* 199.9a* Φασκόμηλο 100.3b 109.4b 99.1b 81.6c* 86.5c* 86.5c* 87.4c* 88.3c 88.9c 98.5d 94.2de 87.1e* 90 Δυόσμος 163.9a* 170.1a* 165.8a* 119.9b* 139.1a* 146.0a* 177.4a* 196.9a* 192.6a* 134.8c* 184.8b* 200.6a* Φασκόμηλο 97.4b 104.5b 96.6b 92.3c 91.5c 90.5c 105.4b 113.6b 105.2b 104.9d 104.1d 104.2d 77

87 ποσότητες εφαρμογής φυτικού υλικού φασκόμηλου στο έδαφος, ενώ στις 60 ΗΜΕ το ξηρό βάρος των σποροφύτων ήταν κατά 13% μικρότερο του μάρτυρα (περίπτωση ενσωμάτωσης 8% φασκόμηλου στο έδαφος) Επίδραση ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού δυόσμου και φασκόμηλου στον πληθυσμό εδαφογενών μυκήτων Όλες οι επεμβάσεις με φυτικό υλικό δυόσμου και φασκόμηλου αύξησαν σημαντικά τον πληθυσμό των μυκήτων του εδάφους (Πίνακας 2.3, Πίνακας Π.2.2). Η αύξηση των μυκήτων ήταν εντονότερη (διπλάσια ή τριπλάσια) στις επεμβάσεις με φυτικό υλικό δυόσμου από ό,τι με φασκόμηλου. Ο πληθυσμός των μυκήτων αυξανόταν με την αύξηση της ποσότητας του φυτικού υλικού έως και την επέμβαση της ενσωμάτωσης φυτικού υλικού στο έδαφος στις 90 ημέρες. Πίνακας 2.3. Η επίδραση της ενσωμάτωσης στο έδαφος διαφόρων ποσοτήτων φυτικού υλικού των αρωματικών φυτών δυόσμος (M. spicatα) και φασκόμηλο (S. fruticosa) στον ολικός πληθυσμό εδαφογενών μυκήτων στις 0, 20, 40, 60 και 90 ΗΜΕ. Οι τιμές εκφράζονται ως % του μάρτυρα (έδαφος με 0% περιεκτικότητα σε ενσωματωμένο φυτικό υλικό=100). Ίδια γράμματα δείχνουν μη σημαντική διαφορά μεταξύ των επεμβάσεων την ίδια ΗΜΕ. Ο αστερίσκος δείχνει διαφορά από το μάρτυρα. Ποσότητα ενσωματωμένου στο έδαφος φυτικού υλικού (%) ΗΜΕ Φυτικό υλικό Ολικός πληθυσμός εδαφογενών μυκήτων 0 Δυόσμος 125a 83a 99a Φασκόμηλο 124a 98a 117a 20 Δυόσμος 2841c* 4227b* 6456a* Φασκόμηλο 910e* 1685d* 2857c* 40 Δυόσμος 2743c* 3802b* 5465a* Φασκόμηλο 556f* 1074e* 1791d* 60 Δυόσμος 2360c* 2787b* 4440a* Φασκόμηλο 560f* 1384e* 1583d* 90 Δυόσμος 2977c* 4282b* 6054a* Φασκόμηλο 730c* 1987d* 2446c* 4.4. Πείραμα αγρού Τα αποτελέσματα δεν παρουσιάζονται επειδή από την αρχή του πειράματος προέκυψαν προβλήματα επιβίωσης των μεταφυτευθέντων σποροφύτων εξαιτίας της μη κανονικής άρδευσης, αλλά κυρίως λόγω των εντομολογικών και μυκητολογικών 78

88 προσβολών. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκαν υψηλοί και δυσκόλως ελεγχόμενοι πληθυσμοί των εντόμων βρωμούσας (Nezara viridula), πράσινου σκουληκιού (Heliothis armigera), ψωκοπτέρων (Psocoptera), του ακάρεος τετράνυχος (Tetranychus urticae), αλλά και σημαντικές μυκητολογικές προσβολές από περονόσπορο (Phytopthora infestans), αλτερνάρια (Alternaria solani), βοτρύτη (Botrytis cinerea) και αδρομυκώσεις. Τα φυτά, εξαιτίας των προηγούμενων προβλημάτων και προσβολών, παρουσίασαν όλα καχεκτική ανάπτυξη, μηδενική ή μικρή καρποφορία και πτώση των προσβεβλημένων καρπών. Κρίθηκε ότι τα δεδομένα που συλλέχθηκαν δεν θα οδηγούσαν σε αξιόπιστα αποτελέσματα και για το λόγω αυτό δεν επεξεργάστηκαν περαιτέρω. 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα ερευνητικά δεδομένα σχετικώς με τη χρήση των αρωματικών φυτών ως φυτών εδαφοκάλυψης, ως χλωράς λίπανσης, ή ως κομποστοποιημένων ή μη υλικών για ενσωμάτωσή τους στο έδαφος είναι περιορισμένα (Dudai et al. 1999, Tworkoski 2002, Vasilakoglou et al. 2007, Dhima et al. 2009). Ειδικότερα, οι προαναφερθείσες βιβλιογραφικές αναφορές εστιάζονται κυρίως στην ιδιότητα των αρωματικών φυτών να παράγουν φυτοτοξικά αιθέρια έλαια, τα οποία περιορίζουν σημαντικά τον πληθυσμό των ζιζανίων σε πειράματα in vitro και στον αγρό. Επομένως, παραμένει να ελεγχθεί η επίδρασή τους σε καλλιεργούμενα φυτά in vitro και σε συνθήκες αγρού. Τα δεδομένα της εργασίας αυτής έδειξαν ότι το φυτικό υλικό της ρίγανης και της λεβάντας και δευτερευόντως του φασκόμηλου προκάλεσε αναστολή στη φυτρωτική ικανότητα της τομάτας. Η ενσωμάτωση στο έδαφος φυτικού υλικού δυόσμου αποτέλεσε αξιοσημείωτη εξαίρεση, αφού αύξησε τη φυτρωτική ικανότητα της τομάτας και τις λοιπές παραμέτρους (ύψος, μέγιστο μήκος και πλάτος φύλλου και ξηρό βάρος σποροφύτων τομάτας). Βέβαια, το κριθάρι και το σιτάρι επίσης αύξησαν τη φυτρωτική ικανότητα της τομάτας αλλά σε μικρότερο βαθμό από εκείνον με ενσωμάτωση δυόσμου. Οι ποσότητες 2 και 4% (w/w) του φυτικού υλικού δυόσμου στο έδαφος ισοδυναμούν κατά βάρος με ποσότητες 1 και 2 tn/στρ κομπόστας παρασκευασμένης από οργανικά απορρίμματα ή ανακυκλωμένο χαρτί παρουσία γαιοσκωλήκων (vermicompost) που ενσωμάτωσαν στο έδαφος οι Arancon et al. (2003). Τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής είναι παρόμοια με αυτά των 79

89 προαναφερθέντων ερευνητών (Arancon et al. (2003), οι οποίοι αναφέρουν ότι το μήκος βλαστού, η φυλλική επιφάνεια, ο αριθμός ανθέων και η απόδοση της τομάτας, της φράουλας και της πιπεριάς είναι σημαντικά μεγαλύτερες όταν στο έδαφος ενσωματώνονται οι παραπάνω κομπόστες. Οι Ribeiro et al. (2007), οι οποίοι παρασκεύασαν κομπόστα από δασικά υπολείμματα και αξιολόγησαν την επίδρασή της στην παραγωγή σποροφύτων μαρουλιού και τομάτας, βρήκαν ότι η αύξηση των σποροφύτων σε υπόστρωμα κομπόστας ήταν μεγαλύτερη από ό,τι χωρίς αυτό. Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν ότι μεγαλύτερη αύξηση στο ξηρό βάρος ρίζας (68% επιπλέον του μάρτυρα) και στον αριθμό των φύλλων ανά σπορόφυτο (75% επιπλέον του μάρτυρα) παρατηρήθηκε στην ποσότητα 100% κομπόστα. Στην παρούσα εργασία, η ενσωμάτωση 4 ή 8% φυτικού υλικού δυόσμου στο έδαφος επί 20 ημέρες ή περισσότερο, προκάλεσε αύξηση >65% στο ύψος (Χάλκος, αδημοσίευτα δεδομένα), στο μέγεθος των φύλλων και στο ξηρό βάρος των σποροφύτων της τομάτας. Η διαφορά μεταξύ της παρούσας εργασία και εκείνης των Ribeiro et al. (2007) οφείλεται πιθανώς στις μικρότερες ποσότητες (2, 4 και 8%) από τις αντίστοιχες της εργασίας τους. Το τελευταίο τεκμαίρεται από την εργασία των Atiyeh et al. (2002), οι οποίοι αναφέρουν ότι η μεγαλύτερη επίδραση στην αύξηση και στην απόδοση των φυτών καταγράφεται όταν οι ενσωματωμένες στο έδαφος κομπόστες αποτελούν ένα σημαντικό κομμάτι (10-40%) του συνολικού όγκου του υποστρώματος στο οποίο αναπτύσσεται το φυτό. Για παράδειγμα, o Manios (2004) αναφέρει ότι η ανάπτυξη λαχανοκομικών ειδών, όπως η τομάτα και η αγγουριά, είναι μεγαλύτερη όταν ενσωματωθεί στο έδαφος κομπόστα που παράγεται από πολτό, φύλλα και κλαδιά ελιάς και από κλαδιά αμπέλου και περιβλήματα σταφυλιού σε ποσότητα 30% (v:v), ενώ σε μεγαλύτερες ποσότητες αναστέλλεται η αύξηση της ρίζας και του βλαστού. Επίσης, οι Ali et al. (2003) βρήκαν ότι το ξηρό βάρος των καρπών της τομάτας αυξάνεται σημαντικά από την προσθήκη κομπόστας από φυτικά υπολείμματα ρυζιού σε ποσότητα 30% εντός του υποστρώματος. Επιπλέον, οι Kostov et al. (1996a) αναφέρουν ότι η ποιότητα και η απόδοση της τομάτας αυξάνονται σημαντικά (24-61%), σε σχέση με τα φυτάμάρτυρες, όταν ενσωματωθεί στο έδαφος κομπόστα από κλαδιά ελιάς, περιβλήματα ρυζιού και υπολείμματα λιναριού. Οι ίδιοι ερευνητές αποδίδουν τα ευεργετικά αυτά αποτελέσματα της χρήσης κομπόστας στην αποτελεσματικότερη πρόσληψη των θρεπτικών στοιχείων και του νερού. Τέλος, οι Bletsos and Gantidis (2004) βρήκαν ότι μεταφυτευμένα σπορόφυτα τομάτας αυξάνονται καλύτερα υπό την επίδραση 75% 80

90 (v/v, κομπόστα:θρεπτικό μέσο) κομπόστας αστικών στερεών λυμάτων (MSSC, municipal sewage sludge compost) ενσωματωμένης στο θρεπτικό μέσο ανάπτυξής τους. Τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας δείχνουν, σε αντίθεση με όσα προαναφέρθηκαν, ότι το ξηρό βάρος των σποροφύτων τομάτας αυξάνεται κατά 57%, ακόμα και όταν αναπτύσσονται σε έδαφος στο οποίο έχει ενσωματωθεί φυτικό υλικό δυόσμου σε ποσότητα μόλις 2%. Τα σπορόφυτα τομάτας που αναπτύχθηκαν σε έδαφος, όπου είχε ενσωματωθεί φυτικό υλικό δυόσμου, αυξήθηκαν ταχύτερα από ό,τι στο έδαφος-μάρτυρα. Αυτό είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των Kostov et al. (1996b), οι οποίοι βρήκαν ότι τα σπορόφυτα τομάτας είναι έτοιμα για μεταφύτευση 4-5 ημέρες νωρίτερα όταν αναπτύσσονται σε έδαφος με κομπόστα από ό,τι σε έδαφος με τύρφη. Η μικρή αλλά σημαντική μείωση του ph (κατά 10-1 ) σε όλες τις δοκιμαζόμενες ποσότητες μετά τις 40 ΗΜΕ (Χάλκος, αδημοσίευτα δεδομένα) είναι σε αντίθεση με τα αποτελέσματα των Ribeiro et al. (2007), οι οποίοι αναφέρουν ότι το ph του υποστρώματος ανάπτυξης σποροφύτων μαρουλιού και τομάτας αυξάνεται από την προσθήκη κομπόστας από δασικά υπολείμματα. Η ειδοποιός διαφορά της παρούσας εργασίας σε σύγκριση με τις προαναφερθείσες είναι η διαφορά στην ωρίμανση της κομπόστας και στην ποσότητα που χρησιμοποιήθηκε. Ειδικότερα, ενώ στη βιβλιογραφία αναφέρονται έρευνες με ώριμες κομπόστες, στην παρούσα εργασία το φυτικό υλικό χρησιμοποιήθηκε χωρίς προηγούμενη κομποστοποίηση. Επίσης, το φυτικό υλικό του δυόσμου που ενσωματώνεται στο έδαφος δείχνει ότι είναι πιο αποτελεσματικό σε μικρότερες ποσότητες (2-8%) σε σχέση με τις ποσότητες που χρησιμοποιήθηκαν οι κομπόστες σε προηγούμενες εργασίες. Το φυτικό υλικό του δυόσμου στην παρούσα εργασία, εκτός από τη θετική επίδραση στην αύξηση των σποροφύτων της τομάτας, αύξησε και τον πληθυσμό των εδαφογενών μυκήτων. Η αύξηση του ολικού πληθυσμού μυκήτων ήταν συγκριτικά μεγαλύτερη από την αύξηση του ολικού βακτηριακού πληθυσμού του εδάφους, η οποία καταγράφηκε σε παράλληλη μελέτη (Χάλκος, αδημοσίευτα δεδομένα). Ειδικότερα στη μελέτη του Χάλκου, η αύξηση των βακτηρίων λόγω των φυτικών υλικών από τα αρωματικά φυτά που ενσωματώθηκαν στο έδαφος συνδέθηκε με παράλληλη αύξηση των ρυθμών αποδόμησης σε σχέση με τον αντίστοιχο του μάρτυρα. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής, η έρευνα των Levy and Taylor (2003) έδειξε ότι η ενσωμάτωση στο έδαφος στερεών αποβλήτων από την 81

91 επεξεργασία χαρτοπολτού-μη κομποστοποιηθέντος είχε αρνητικές επιδράσεις στην τομάτα. Αυτό πιθανώς να οφείλεται στις χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται κατά τη λεύκανση του χαρτοπολτού. Η σύντομη σταθεροποίηση του λόγου C:N (τιμές 9 έως 12 περίπου μετά από 40 ημέρες ενσωμάτωσης, Χάλκος, αδημοσίευτα δεδομένα) έχει αναφερθεί νωρίτερα από άλλο ερευνητή (Φωτίου 2004) και μπορεί να αποδοθεί στη έντονη αύξηση και δραστηριοποίηση των μικροοργανισμών του εδάφους (υψηλός πληθυσμός μυκήτων και βακτηρίων, υψηλός ρυθμός αποδόμησης) που οδηγεί σε μικρή μόνο ακινητοποίηση του αζώτου και, κατά συνέπεια, σε υψηλή διαθεσιμότητά του για τα φυτά. Επίσης, η ταχεία-σύντομη σταθεροποίηση του λόγου C/N δείχνει ότι η κομποστοποιήσιμη του φυτικού υλικού γίνεται σε σύντομο χρονικό διάστημα. Οι Levy and Taylor (2003), σε αντίθεση με τα ευρήματα αυτά, αναφέρουν ότι τα δασικά υπολείμματα εμφανίζουν C/N πολύ υψηλό (36-100), γεγονός που οδηγεί σε ισχυρή ακινητοποίηση και άρα έλλειψη του αζώτου από το εδαφικό διάλυμα. Πολλοί ερευνητές εστιάζουν και μελετούν τις αρχικές και τελικές φυσικοχημκές ιδιότητες των κομποστών, αλλά δείχνουν μικρότερο ενδιαφέρον στις μικροβιακές διεργασίες της εδαφικής κοινότητας που επηρεάζουν άμεσα την ποιότητα της κομπόστας και το καλλιεργούμενο φυτό. Η αύξηση της φυτρωτικής ικανότητας και των υπολοίπων φυσιολογικών παραμέτρων της τομάτας μπορεί να αποδοθεί και στη μεγάλη αύξηση του εδαφικού μικροβιακού πληθυσμού (μυκήτων και βακτηρίων) λόγω της ενσωμάτωσης φυτικού υλικού δυόσμου. Εξάλλου, είναι ευρέως γνωστό ότι τα αρωματικά φυτά και ειδικότερα τα αιθέρια έλαια ενεργοποιούν τη μικροβιακή δραστηριότητα του εδάφους, γεγονός που συνδέεται με την αύξηση του εδαφογενούς μικροβιακού πληθυσμού (Vokou et al. 1984, Vokou and Margaris 1988). Η παραγωγή ορμονών ή/και χουμικών και φουλβικών οξέων στο αποσυντιθέμενο φυτικό υλικό των αρωματικών φυτών στο έδαφος πιθανώς να είναι επιπρόσθετος παράγων που δρα ρυθμιστικά στην αύξηση των φυτών, ανεξαρτήτως της διαθεσιμότητας των θρεπτικών στοιχείων. Ειδικότερα, οι Arancon et al. (2003) βρήκαν ότι η θετική επίδραση στην ανάπτυξη των φυτών και η αύξηση των αποδόσεων δεν μπορεί να αποδοθεί μόνο στην υψηλή διαθεσιμότητα των μακροστοιχείων εξαιτίας της ενσωμάτωσης κομπόστας στο έδαφος, αφού σε όλες τις επεμβάσεις του πειράματός τους είχαν εξασφαλίσει την επάρκεια των μακροστοιχείων με ανόργανη λίπανση. Επιπροσθέτως, οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν 82

92 ότι η ενσωμάτωση κομπόστας στο έδαφος αυξάνει τη μικροβιακή βιομάζα και την ως εκ τούτου ανοργανοποίηση των θρεπτικών στοιχείων. Οι Atiyeh et al. (2002) αποδίδουν τη μεγαλύτερη ανάπτυξη και απόδοση των φυτών στην παραγωγή ρυθμιστών αύξησης από τους μικροοργανισμούς του εδάφους και όχι από την αποδόμηση της κομπόστας. Οι Canellas et al. (2000), οι οποίοι πειραματίστηκαν με κομπόστα παρασκευασμένη από υπολείμματα καλλιέργειας γουινέας (Panicum maximum) και απόβλητα μονάδων εκτροφής ζώων, παρουσία γαιοσκωλήκων που υποβοηθούν στην παραγωγή χουμικών ενώσεων, βρήκαν ανταλλάξιμες ομάδες αυξίνης στα χουμικά οξέα, γεγονός που ενισχύει την ορμονική τους δράση στην κομπόστα. Στην παρούσα εργασία, η ανάλυση του αναμεμιγμένου εδάφους με διάφορες ποσότητες φυτικού υλικού δυόσμου με σύστημα GC-MS (Κεφάλαιο 3) έδειξε ταχεία μείωση των μονοτερπενίων (όπως η καρβόνη) και ταυτόχρονη αύξηση των σεσκιτερπενίων, όπως το καρυοφυλλένιο (caryophyllene) και το καλαμελένιο (calamelene) στο εδαφικό περιβάλλον σε διάστημα κομποστοποίησης 60 ημερών. Η παρουσία των σεσκιτερπενίων στο εδαφικό περιβάλλον έχει συσχετιστεί σε προηγούμενες έρευνες με μεγάλη αύξηση λαχανοκομικών καλλιεργειών (Nakajima et al. 2005, Kashiwabara et al. 2006) και με παραγωγή ουσιών-σημάτων από τις ρίζες (root signalling) των καλλιεργούμενων φυτών (Rasmann et al. 2005, Cheng et al. 2007). Η ενσωμάτωση στο έδαφος φυτικού υλικού φασκόμηλου βελτιώνει τις ιδιότητες του εδάφους και θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί ως εδαφοβελτιωτικό. Βέβαια, η αρνητική του επίδραση στο ύψος των σποροφύτων και στο μέγιστο μήκος των φύλλων των σποροφύτων τομάτας επιβάλλει περαιτέρω έρευνα στην ίδια ή και σε άλλες καλλιέργειες. Αντίθετα, τα αποτελέσματα του δυόσμου δείχνουν ότι οποιαδήποτε ποσότητα φυτικού υλικού ενσωματωθεί στο έδαφος, ακόμη και η 2%, μπορεί να αποτελέσει ικανό εδαφοβελτιωτικό για την παραγωγή σποροφύτων τομάτας και να αντικαταστήσει επιτυχώς το υπόστρωμα τύρφης που χρησιμοποιείται μέχρι τώρα. Το πρακτικό όφελος της έρευνας αυτής είναι η εξεύρεση φυτικού υλικού δυόσμου ως κατάλληλου εδαφοβελτιωτικού που μπορεί να ενσωματωθεί αμέσως στο έδαφος χωρίς τη χρονοβόρα κομποστοποίησή του. Επίσης, η μείωση του χρόνου που απαιτείται για τη μεταφύτευση των σποροφύτων είναι εξίσου σημαντικό πλεονέκτημα αυτού του υλικού. Επομένως, η ενσωμάτωση στο έδαφος φυτικού υλικού δυόσμου χωρίς κομποστοποίηση έχει μεγάλη προοπτική εφαρμογής ως εδαφοβελτιωτικό σε 83

93 τομάτα καλλιεργούμενη με βιολογικό τρόπο και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή εύρωστων σποροφύτων. 84

94 6. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Πίνακας Π.2.1. Συνδυασμένη ανάλυση παραλλακτικότητας των δεδομένων της φυτρωτική ικανότητας και του ύψους των σποροφύτων τομάτας, όπως επηρεάστηκαν από την ενσωμάτωση στο έδαφος διαφόρων ποσοτήτων φυτικού υλικού των αρωματικών φυτών δυόσμος (M. spicatα), λεβάντα (L. stoechas), ρίγανη (O. vulgare subsp. hirtum), φασκόμηλο (S. fruticosa) και των χειμερινών σιτηρών κριθαριού (H. vulgare, ποικιλία Αθηναΐδα) και σιταριού (T. aestivum, ποικιλία Ερμής) στις 0, 20, 40 και 60 ΗΜΕ. Η φυτρωτική ικανότητα και το ύψος των σποροφύτων μετρήθηκαν 20 ημέρες μετά τη σπορά της τομάτας στα αντίστοιχα υποστρώματα. 0 HME 20 HME 40 HME 60 HME P C P x C CV, % P C P x C CV, % P C P x C CV, % P C P x C CV, % Φυτρωτική ικανότητα * NS NS 6.4 ** ** ** 7.6 ** ** ** 7.2 ** ** ** 5.6 Ύψος σποροφύτων ** ** ** 1.7 ** ** ** 5.4 ** NS ** 7.6 ** NS ** 7.4 P = Υπό κομποστοποίηση ενσωματωμένο φυτικό υλικό (αρωματικά φυτά, χειμερινά σιτηρά) C = Ποσότητα εφαρμογής 0, 2, 4 ή 8% P x C = Αλληλεπίδραση των δύο προηγούμενων παραγόντων *P 0.05 ** P 0.01 NS = not significant 85

95 Πίνακας Π.2.2. Συνδυασμένη ανάλυση παραλλακτικότητας των δεδομένων της φυτρωτική ικανότητας, του μέγιστου μήκους και πλάτους των φύλλων και του ξηρού βάρους των σποροφύτων τομάτας, καθώς και του ph του εδάφους, του C/N και του ολικού πληθυσμού εδαφογενών μυκήτων όπως επηρεάστηκαν από την ενσωμάτωση στο έδαφος διαφόρων ποσοτήτων φυτικού υλικού των αρωματικών φυτών δυόσμος (M. spicatα) και φασκόμηλο (S. fruticosa) στις 0, 20, 40, 60 και 90 ΗΜΕ. Η φυτρωτική ικανότητα και οι άλλες παράμετροι μετρήθηκαν 20 ημέρες μετά τη σπορά της τομάτας στα αντίστοιχα υποστρώματα. 0 HME 20 HME 40 HME 60 HME 90 HME P C P x C CV, % P C P x C CV, % P C P x C CV, % P C P x C CV, % P C P x C CV, % Φυτρωτική ικανότητα NS NS NS 17.0 ** ** ** 12.1 ** ** ** 14.0 ** ** ** 15.3 ** ** ** 13.8 Μήκος φύλλων * NS NS 17.3 ** ** ** 3.9 ** ** ** 3.4 ** ** ** 4.1 ** ** ** 3.4 Πλάτος φύλλων NS NS NS 5.0 ** ** ** 4.6 ** ** ** 5.4 ** ** ** 4.9 ** ** ** 7.9 Ξηρό βάρος NS NS NS 8.3 ** ** ** 8.0 ** ** ** 9.2 ** ** ** 7.5 ** ** ** 8.0 Mύκητες NS NS NS 15.3 ** ** ** 12.3 ** ** ** 8.0 ** ** ** 9.9 ** ** ** 5.5 P = Υπό κομποστοποίηση ενσωματωμένο φυτικό υλικό (δυόσμου ή φασκόμηλου) C = Ποσότητα εφαρμογής 0, 2, 4 ή 8% P x C = Αλληλεπίδραση των δύο προηγούμενων παραγόντων *P 0.05 ** P 0.01 NS = not significant 86

96 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΦΥΛΛΩΝ ΚΑΙ ΑΙΘΕΡΙΟΥ ΕΛΑΙΟΥ ΤΟΥ ΑΡΩΜΑΤΙΚΟΥ ΦΥΤΟΥ Mentha spicata ΣΤΟ ΕΔΑΦΟΣ 87

97 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η διαδικασία αποδόμησης των αιθερίων ελαίων και των τερπενίων που περιέχονται στο φυτικό υλικό του αρωματικού φυτού δυόσμος (M. spicata). Το φυτικό υλικό ενσωματώθηκε στο έδαφος σε ποσότητα 0, 2, 4 και 8% (w:w, φυτικό υλικό:έδαφος). H διαδικασία αποδόμησης των αιθερίων ελαίων και των τερπενίων προσδιορίστηκε με απόσταξη και ακολούθως ανάλυση με GC-MS εδαφικών δειγμάτων που πάρθηκαν σε 0, 15, 35 και 60 ημέρες από την ενσωμάτωση του φυτικού υλικού στο έδαφος (ΗΜΕ). Στις 60 ΗΜΕ, η περιεκτικότητα του εδάφους σε αιθέριο έλαιο δυόσμου μειώθηκε περισσότερο από 94% σε όλες τις επεμβάσεις (διαφορετικές ποσότητες ενσωμάτωσης του φυτικού υλικού), σε σχέση με την περιεκτικότητά του κατά τη στιγμή της ενσωμάτωσης του φυτικού υλικού στο έδαφος. Παράλληλα, η σύσταση του αιθερίου ελαίου δυόσμου μεταβλήθηκε δραματικά. Συγκεκριμένα, τα μονοτερπένια ανιχνεύθηκαν σε πολύ μικρότερη συγκέντρωση από αυτήν που είχαν στο αρχικό αιθέριο έλαιο δυόσμου, ενώ οχτώ από αυτά (μυρκένιο, g-τερπινένιο, σαβινένιο, μενθόνη, βορνεόλη, τερπιν-4-όλη, ισοπουλεγκόνη και α-τερπινεόλη) απουσίαζαν παντελώς από τη σύσταση του ελαίου που αποστάχθηκε δύο μήνες μετά την ενσωμάτωση στην ποσότητα 2%. Την ίδια χρονική στιγμή, η καρβόνη, η οποία αποτελεί το κύριο συστατικό του αιθερίου ελαίου του δυόσμου με ποσοστό συμμετοχής περίπου 50%, ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 1%, σε όλες τις ποσότητες ενσωμάτωσης. Αντιθέτως, η εκατοστιαία περιεκτικότητα του αποσταχθέντος αιθερίου ελαίου σε σεσκιτερπένια διατηρήθηκε ή αυξήθηκε σε όλες τις επεμβάσεις. Η μεγαλύτερη αύξηση παρατηρήθηκε στην ποσοστιαία συμμετοχή των σεσκιτερπενίων καρυοφυλλενίου (caryophyllene), μπουρμπονενίου (bourbonene), καλαμελένιου (calamelene) και επι-δικυκλο-σεσκιφελλανδρένιου (epibicyclosesquiphellandrene). Μεταξύ των υπολοίπων σεσκιτερπενίων, το β- ελεμένιο (β-elemene), το β-κυμπεμπένιο (β-cybebene), το δικυκλο-γερμακρένιο (bicyclogermacrene) και το χουμουλένιο (humulene, ισομερές του καρυοφυλλενίου), παρουσίασαν επίσης εντυπωσιακή αύξηση της περιεκτικότητάς τους στο αποσταχθέν έδαφος 15 ημέρες από την ενσωμάτωση του φυτικού υλικού στο έδαφος. Τα σεσκιτερπένια είναι γνωστά προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού των φυτών που λειτουργούν ως ουσίες-διαμεταγωγείς σημάτων σε συνθήκες βιοτικής ή αβιοτικής καταπόνησης προκειμένου να ενεργοποιήσουν τη χημική άμυνα των 88

98 φυτών, ενώ πρόσφατα διερευνάται η πιθανότητα να δρουν και ως φυτορρυθμιστικές ουσίες. 2. EΙΣΑΓΩΓΗ Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί η διαδικασία αποδόμησης των αιθερίων ελαίων κατά την πορεία της κομποστοποίησης στο έδαφος φύλλων του αρωματικού φυτού δυόσμου (M. spicata). Η ανάγκη για διερεύνηση των δραστικών συστατικών που παραμένουν στο έδαφος κατά την αποδόμηση προέκυψε από τα αποτελέσματα της ενσωμάτωσης στο έδαφος διαφόρων ποσοτήτων φυτικού υλικού δυόσμου. Σύμφωνα με αυτά κατά τη διαδικασία της κομποστοποίησης του δυόσμου, διαπιστώθηκε θετική επίδραση σε αυξητικές παραμέτρους τομάτας και σε πληθυσμούς εδαφογενών μυκήτων (Κεφάλαια 1, 2). 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1. Πειραματική διαδικασία Το φυτικό υλικό αποτελούνταν από υπέργεια αποξηραμένα τμήματα (βλαστούς, φύλλα και άνθη) δυόσμου και αγοράστηκε από το εμπόριο. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε σε αγρό του Εργαστηρίου Γεωργίας στο Αγρόκτημα της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. Σε οριοθετημένα τεμάχια (τοποθετήθηκε εντός της κάθε συγκεκριμένης εδαφικής περιοχής πλαστικό πλέγμα) διαστάσεων 40 x 40 cm αφαιρέθηκε το έδαφος σε βάθος 10 cm. Ακολούθως, 10 kg εδάφους από κάθε πειραματικό τεμάχιο αναμίχθηκε με φυτικό υλικό του δυόσμου σε ποσότητες 0, 2, 4 και 8% (w:w, φυτικό υλικό:έδαφος). Το μίγμα με φυτικό υλικό δυόσμου-έδαφος επανατοποθετήθηκε στα ίδια πειραματικά τεμάχια από όπου είχε αφαιρεθεί. Χρησιμοποιήθηκε το πειραματικό σχέδιο των πλήρως τυχαιοποιημένων ομάδων με τρεις επαναλήψεις-πειραματικά τεμάχια για κάθε επέμβαση. Η υγρασία του προς κομποστοποίηση υλικού διατηρήθηκε στα πειραματικά τεμάχια σε ικανοποιητικό επίπεδο με δύο αρδεύσεις εβδομαδιαίως και επακόλουθη αναμόχλευση. Στις 0, 15, 35 και 60 ημέρες από την εγκατάσταση του πειράματος (ΗΜΕ), ελήφθησαν από κάθε πειραματικό τεμάχιο δείγματα εδάφους 2 kg το καθένα. Ακολούθησε απόσταξη του κάθε δείγματος, διάρκειας 3 ωρών, σε συσκευή Clevenger. Το έλαιο παραλήφθηκε και υπολογίσθηκε η επί τοις % απόδοσή του. 89

99 Μετά το τέλος της απόσταξης έγινε ξήρανση του αιθερίου ελαίου πάνω από άνυδρο Na 2 SO 4, παραλαβή και φύλαξή του σε σκουρόχρωμα μπουκάλια στους -20 º C. Επιπλέον, κατά την εγκατάσταση του πειράματος, ποσότητα 100 g αποξηραμένου φυτικού υλικού δυόσμου υποβλήθηκε σε άμεση απόσταξη σε συσκευή Clevenger, προκειμένου να προσδιοριστεί η εκατοστιαία περιεκτικότητα του δυόσμου σε αιθέριο έλαιο. Ο προαναφερθείς τρόπος απόσταξης του εδαφικού δείγματος ήταν η κατάληξη μιας σειράς προκαταρκτικών πειραμάτων, όπου δοκιμάσθηκαν δύο διαφορετικές μέθοδοι απόσταξης. Το έδαφος αρχικώς είχε υποβληθεί σε έξι διαδοχικές εκχυλίσεις και διηθήσεις σε κενό αέρος, με παραμονή στο υδατόλουτρο στους ενδιάμεσους χρόνους. Το τελικό διηθημένο υλικό υποβλήθηκε σε απόσταξη. Τελικώς, διαπιστώθηκε ότι, αντί αυτής της χρονοβόρας διαδικασίας, μπορούσε να χρησιμοποιηθεί απευθείας απόσταξη του εδαφικού δείγματος, αφού η παραληφθείσα ποσότητα αποστάγματος ήταν ίδια ανεξαρτήτως της μεθόδου Χρωματογραφική ανάλυση δειγμάτων - Προσδιορισμός επιμέρους συστατικών Τα έλαια που παραλήφθησαν από τις αποστάξεις των επεμβάσεων στις 15, 35 και 60 ΗΜΕ, καθώς και το αιθέριο έλαιο που παρελήφθη από την απόσταξη 100 g αποξηραμένου δυόσμου αναλύθηκαν με GC-MS στο Εργαστήριο Μελισσοκομίας του Αγροκτήματος της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. Χρησιμοποιήθηκε αέριος χρωματογράφος (Agilent 6890, USA) σε συνδυασμό με φασματογράφο μάζας GC-MS (Agilent 5973). Ο διαχωρισμός επιτεύχθηκε με τριχοειδή στήλη HP-5MS 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm. Η είσοδoς μικροποσότητας (2μl) στη στήλη έγινε με εισαγωγέα τύπου split-splitless, με λόγο split 1:80 και σε θερμοκρασία C, ενώ η ροή του φέροντος αερίου (ήλιο) ήταν 1 ml/min. Ο διαχωρισμός των πτητικών συστατικών στην τριχοειδή στήλη πραγματοποιήθηκε με το εξής πρόγραμμα θερμοκρασίας: αρχική θερμοκρασία 40 0 C (για 5min), με ρυθμό 6 0 C/min αύξηση στους C, με ρυθμό 4 0 C/min αύξηση στους C, με ρυθμό 3 0 C/min αύξηση στους C, με ρυθμό 2 0 C/min αύξηση στους C και με ρυθμό 20 0 C/min αύξηση σε τελική θερμοκρασία C (διατήρηση για 5 min). Η ανίχνευση των διαχωρισμένων συστατικών πραγματοποιήθηκε σε φασματογράφο μάζας, ο οποίος λειτουργούσε κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες: θερμοκρασία interface C, θερμοκρασία πηγής ιονισμού C, θερμοκρασία τετράπολου

100 0 C, δυναμικό ιονισμού +70eV. Τα χρωματογραφήματα επεξεργάστηκαν και ολοκληρώθηκαν με το πρόγραμμα MSD ChemStation. Η ταυτοποίηση των κορυφών επιτεύχθηκε με τη σύγκριση του άγνωστου φάσματος μάζας με αυτά που ήταν αποθηκευμένα στις ηλεκτρονικές βιβλιοθήκες Nist98 και Wiley275L. 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η ενσωμάτωση φύλλων δυόσμου στο έδαφος σε ποσότητα 2, 4 και 8% προκάλεσε σημαντικές αλλαγές στην ποσοτική (Πίνακας 3.1) και ποιοτική σύσταση (Σχήματα 3.1 και 3.2, Πίνακας Π.3.1) του αιθερίου ελαίου στο αποσταχθέν υλικό σε σχέση με αυτό που παραλήφθηκε από αποξηραμένο φυτικό υλικό δυόσμου. Η απόσταξη 100 g δυόσμου απέδωσε 620 μl (620 μl/100g δυόσμου) αιθερίου ελαίου, ποσότητα ανάλογη με αυτή που παρελήφθη σε κάθε επέμβαση (2, 4, 8%, w:w φυτικό υλικό:έδαφος) στις 0 ΗΜΕ (Πίνακας 3.1). Οι ποσότητες του ελαίου που αποστάχθηκαν από τα εδαφικά δείγματα στις 16 συνολικά επεμβάσεις δίνονται στον Πίνακα 3.1. Το ποσοστό του αποσταχθέντος ελαίου ήταν κατά την ενσωμάτωση (0 ΗΜΕ) ανάλογο της ποσότητας του δυόσμου που ενσωματώθηκε στο έδαφος, ενώ με την πάροδο του χρόνου παρουσίασε φθίνουσα πορεία σε κάθε επέμβαση. Έπειτα από χρονικό διάστημα 60 ημερών σε όλες τις επεμβάσεις του πειράματος, η περιεκτικότητα του εδάφους σε αιθέριο έλαιο δυόσμου μειώθηκε σχεδόν ή περισσότερο από 94% σε σχέση με την περιεκτικότητά του τη στιγμή της ενσωμάτωσης (0 ΗΜΕ) (Πίνακας 3.1). Πίνακας 3.1. Απόδοση σε αιθέριο έλαιο του εδάφους που αναμίχθηκε με διάφορες ποσότητες φυτικού υλικού δυόσμου στις 0, 15, 35 και 60 ημέρες από την ενσωμάτωση αποξηραμένου φυτικού υλικού δυόσμου στο έδαφος (ΗΜΕ). Απόδοση εδάφους σε αιθέριο έλαιο (μl/100 g εδάφους) ΗΜΕ Περιεκτικότητα δυόσμου στο έδαφος 0% 2% 4% 8%

101 Δυόσμος ΗΜΕ 50 2% ΗΜΕ Δυόσμος % συμμετοχή μονοτερπενίου % ΗΜΕ Δυόσμος 50 8% a-pinene camphene sabinene b-pinene myrcene limonene 1,8-cineol g-terpinene sabinene hydraete menthone borneol terpin-4-ole isopulegone a-terpineol dihydro-carveol dihydro-carvone carveol(cis+trans) pulegone carvone dihydrocarveol acetate carvyl acetate ΗΜΕ Δυόσμος Σχήμα 3.1. Περιεκτικότητα μονοτερπενίων του αιθερίου ελαίου δυόσμου που αποστάχθηκε στις 15, 35 και 60 ημέρες μετά την ενσωμάτωση αποξηραμένου φυτικού υλικού δυόσμου στο έδαφος (ΗΜΕ). Η πρώτη σειρά του άξονα z (Δυόσμος), απεικονίζει την περιεκτικότητα μονοτερπενίων στο αιθέριο έλαιο που αποστάχθηκε από αποξηραμένο φυτικό υλικό δυόσμου. 92

102 Η ποιοτική σύσταση του αποσταχθέντος ελαίου από το έδαφος έδειξε ότι η αναλογία των μονοτερπενίων μειώθηκε και διαφοροποιήθηκε σημαντικά μεταξύ των διαφόρων επεμβάσεων. Συγκεκριμένα, η καρβόνη, που αποτελεί το κύριο συστατικό του αιθερίου ελαίου δυόσμου, με ποσοστό συμμετοχής μεγαλύτερο από 50% στο αιθέριο έλαιο που παραλήφθηκε από αποξηραμένο φυτικό υλικό δυόσμου, μειώθηκε σημαντικά και στις 60 ΗΜΕ έφτασε στο 1% (Σχήμα 3.1, Πίνακας Π.3.1). Παρομοίως, η περιεκτικότητα του ελαίου σε λιμονένιο, 1,8-κινεόλη και διϋδρο-καρβεόλη (dihydro-carveol) παρουσίασε φθίνουσα τάση με το χρόνο και σε κάποιες περιπτώσεις (στις 60 ΗΜΕ) μειώθηκε μέχρι και 10 φορές σε σχέση με το ποσοστό συμμετοχής στο αιθέριο έλαιο που παραλήφθηκε από αποξηραμένο φυτικό υλικό δυόσμου. Η πουλεγκόνη μειώθηκε από 8% στο αιθέριο έλαιο που παραλήφθηκε από φυτικό υλικό δυόσμου σε τιμές μικρότερες από 0.87% στις 60 ΗΜΕ. Τέλος, και οι περιεκτικότητες όλων των υπολοίπων μονοτερπενίων μειώθηκαν στο έδαφος σε διάστημα 60 ημερών. Η περιεκτικότητα του αποσταχθέντος υλικού σε σεσκιτερπένια, σε αντίθεση με τα προηγούμενα, αυξήθηκε σε όλες τις επεμβάσεις στις 15, 35 και 60 ΗΜΕ σε σχέση με το αιθέριο έλαιο από αποξηραμένο φυτικό υλικό δυόσμου (Σχήμα 3.2, Πίνακας Π.3.1). Η μεγαλύτερη αύξηση παρατηρήθηκε στην ποσοστιαία συμμετοχή των σεσκιτερπενίων καρυοφυλλένιο (caryophyllene) και μπουρμπονένιο (bourbonene), η οποία στις 60 ΗΜΕ ήταν 16 και 10% μεγαλύτερη, αντιστοίχως, στην επέμβαση 2% δυόσμος στο έδαφος. Η αντίστοιχη περιεκτικότητα των συγκεκριμένων σεσκιτερπενίων στο αιθέριο έλαιο από αποξηραμένο φυτικό υλικό δυόσμου ήταν 1.4 και 1%, αντιστοίχως. Εξίσου σημαντική αύξηση στην περιεκτικότητά τους εντός του εδάφους παρουσίασαν τα σεσκιτερπένια καλαμελένιο (calamelene) και επι-δικυκλοσεσκιφελλανδρένιο (epibicyclosesquiphellandrene), τα οποία στις 60 ΗΜΕ είχαν περιεκτικότητα μεγαλύτερη από 8.5% το καθένα στην επέμβαση 2% δυόσμος, αν και η αντίστοιχη περιεκτικότητά τους στο αιθέριο έλαιο φυτικού υλικού δυόσμου ήταν για το καθένα 0.7%. Μεταξύ των υπολοίπων σεσκιτερπενίων, το β-ελεμένιο (βelemene), το β-κυμπεμπένιο (β-cybebene), το δικυκλο-γερμακρένιο (bicyclogermacrene) και το χουμουλένιο (humulene, ισομερές του καρυοφυλλενίου), παρουσίασαν επίσης σημαντική αύξηση της περιεκτικότητάς τους στο αποσταχθέν έδαφος, η οποία ήταν φανερή στις 15 ΗΜΕ και αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου (35 και 60 ΗΜΕ). 93

103 Δυόσμος ΗΜΕ 20 2% 10 0 ΗΜΕ Δυόσμος % συμμετοχή σεσκιτερπενίου % ΗΜΕ Δυόσμος 20 8% 10 0 (d-germacrene) a-humulene epibicyclosesquiphellandrene d-germacrene b-cybebene bicyclogermacrene b-elemene b-bourbonene b-elemene caryophyllene b-cybe(b)nene /(phellandrene) calamelene a-cadinene spathulenol g-cadinene/a-amorphene a-cybebene T-cadinene cadinol 14Norcadin-5-en-4-one caryophyllene oxide mintsulfide 2methylpropylester 1,2 benzened ΗΜΕ Δυόσμος Σχήμα 3.2. Εκατοστιαία περιεκτικότητα σεσκιτερπενίων του αιθερίου ελαίου δυόσμου που αποστάχθηκε στις 15, 35 και 60 ημέρες μετά την ενσωμάτωση αποξηραμένου φυτικού υλικού δυόσμου στο έδαφος (ΗΜΕ). Η πρώτη σειρά του άξονα z (δυόσμος), απεικονίζει την περιεκτικότητα σεσκιτερπενίων στο αιθέριο έλαιο που αποστάχθηκε από αποξηραμένο φυτικό υλικό δυόσμου. 94

104 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα μονοτερπένια και τα σεσκιτερπένια αποτελούν την πλειονότητα των πτητικών ενώσεων που απελευθερώνονται από τα φυτά έπειτα από διάφορες προσβολές, συνήθως μυκητολογικής, βακτηριακής, εντομολογικής ή παρασιτικής φύσεως. Η ευρύτερη ομάδα των τερπενίων, παράγεται κυρίως από διάφορα γυμνόσπερμα και δικότυλα και λιγότερο από μονοκότυλα φυτά. Το ενδιαφέρον στρέφεται στην απομόνωση, εισαγωγή και υπερέκφραση των υπεύθυνων γονιδίων σε γενετικώς τροποποιημένα φυτά προκειμένου να παράγουν τα συγκεκριμένα τερπένια (Martin et al. 2004, Tholl et al. 2005). Οι ενώσεις αυτές είναι σημαντικές για την επιβίωση των φυτών καθώς συμμετέχουν σε πλήθος διεργασιών που συνδέονται ειδικά με την αλληλεπίδραση με άλλους οργανισμούς. Σε περίπτωση εντομολογικής προσβολής εκτός από την άμεση δράση που μπορεί να έχουν στο έντομο-εχθρό, απελευθερούμενα στο περιβάλλον μπορούν να προσελκύσουν αρθρόποδα, τα οποία αποτελούν φυσικούς εχθρούς επιβλαβών εντόμων και συνεπώς περιορίζουν τη ζημία του φυτού-ξενιστή (Dudareva et al. 2003). Για παράδειγμα, οι Rasmann et al. (2005) βρήκαν ότι ο αραβόσιτος, σε περίπτωση προσβολής του ριζικού συστήματος από ενήλικα έντομα ή λάβρες Diabrotica virgifera virgifera, εκλύει στο εδαφικό περιβάλλον καρυοφυλλένιο που προσελκύει φυσικούς εχθρούς των εντόμων αυτών, όπως για παράδειγμα εντομοπαθογόνους νηματώδεις, και με αυτόν τον τρόπο αμύνεται ή αυτοπροστατεύευται από εντομολογικές προσβολές. Τα τελευταία χρόνια δίδεται ιδιαίτερη έμφαση σε αυτή την έμμεση άμυνα που εκδηλώνουν ορισμένα φυτά με την παραγωγή των συγκεκριμένων τερπενίων (Arimura et al. 2004, Degen et al. 2004, Schnee et al. 2006). Οι Cheng et al. (2007) αναφέρουν ότι τα σεσκιτερπένια β- καρυοφυλλένιο (β-caryophyllene), β-ελεμένιο (β-elemene) και α-χουμουλένιο (αhumulene) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη χημική άμυνα άγριων ειδών ρυζιού αλλά και γενετικώς τροποποιημένων φυτών ρυζιού και Arabidopsis όπου υπερεκφράστηκαν τα υπεύθυνα γονίδια. Το αποτέλεσμα ήταν η ενίσχυση της άμυνας των φυτών εναντίον του εντόμου-παρασίτου Anagrus nilaparvatae μέσω της αύξησης της συγκέντρωσης των σεσκιτερπενίων. Όλα τα προαναφερθέντα σεσκιτερπένια (β-καρυοφυλλένιο, β-ελεμένιο, α-χουμουλένιο) ανιχνεύθηκαν, στην παρούσα έρευνα, σε μεγάλη συγκέντρωση στο αιθέριο έλαιο που αποστάχθηκε από έδαφος αναμεμιγμένο με κομποστοποιήσιμο φυτικό υλικό δυόσμου. Ειδικότερα, στις 60 ΗΜΕ, σε όλες τις επεμβάσεις του πειράματος (2, 4, 8%, w:w φυτικό υλικό 95

105 δυόσμου:έδαφος), η περιεκτικότητα του εδάφους σε αιθέριο έλαιο δυόσμου μειώθηκε περισσότερο από 94%, σε σχέση με αυτή των αντίστοιχων υπό κομποστοποίηση συγκεντρώσεων στις 0 ΗΜΕ. Επίσης, όλα τα μονοτερπένια μειώθηκαν σημαντικά στις 15 ΗΜΕ και διατηρήθηκαν σε χαμηλή ποσοστιαία συμμετοχή στο κομποστοποιήσιμο υλικό μέχρι και τις 60 ΗΜΕ σε σχέση με αυτή που είχαν στο αιθέριο έλαιο αποξηραμένου δυόσμου. Συγκεκριμένα, οκτώ από αυτά, το μυρκένιο (myrcene), το γ-τερπινένιο (g-terpinene), το σαβινένιο (sabinene hydraete), η μενθόνη (menthone), η βορνεόλη (borneol), η τερπιν-4-όλη (terpin-4-ole), η ισοπουλεγκόνη (isopulegone) και η α-τερπινεόλη (α-terpineol) απουσίαζαν από το έδαφος στις 60 ΗΜΕ, στην επέμβαση 2% δυόσμος στο έδαφος. Η σημαντικότερη ποιοτική μεταβολή του αποσταχθέντος ελαίου αφορούσε στην καρβόνη, η οποία μειώθηκε σημαντικά, αφού η ποσοστιαία συμμετοχή της ήταν μεγαλύτερη από 50% στο αποσταχθέν έλαιο από αποξηραμένο φυτικό υλικό δυόσμου και 1% στις 60 ΗΜΕ σε οποιαδήποτε επέμβαση (2, 4 ή 8% περιεκτικότητα φυτικού υλικού δυόσμου στο έδαφος). Η περιεκτικότητα του εδάφους στα σεσκιτερπένια καρυοφυλλένιο, μπουρμπονένιο, καλαμελένιο και επι-δικυκλο-σεσκιφελλανδρένιο αυξήθηκε μέχρι και τις 60 ημέρες από την ενσωμάτωση σε όλες τις επεμβάσεις σε σχέση με αυτή που είχαν στο αιθέριο έλαιο από αποξηραμένο δυόσμο, υποδεικνύοντας ότι οι ουσίες αυτές δεν αποδομούνται εύκολα στο εδαφικό περιβάλλον. Η αύξηση στην ποσοστιαία συμμετοχή τους πιθανόν να συνδέεται με την αντίστοιχη μείωση της ποσοστιαίας συμμετοχής των μονοτερπενίων στο αναμεμιγμένο με δυόσμο έδαφος, με χημικές αντιδράσεις που θα πρέπει μελλοντικά να μελετηθούν. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας συμφωνούν με αυτά των Vokou et al. (2006) που αναφέρουν επίσης ταχεία αποδόμηση των μονοτερπενίων εντός του εδάφους. Είναι γνωστό ότι οι ρίζες των φυτών υπό συνθήκες βιοτικών ή αβιοτικών καταπονήσεων παράγουν ουσίες-διαμεταγωγείς σημάτων, συνήθως προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού, οι οποίες προστατεύουν τα φυτά. Στην κατηγορία αυτών των ουσιών έχουν αναφερθεί και τα σεσκιτερπένια β-καρυοφυλλενίου (βcaryophyllene), β-ελεμενίου (β-elemene) και α-χουμουλενίου (α-humulene) που αυξήθηκαν σε σπορόφυτα ρυζιού που υπέστησαν μεταχείριση με εστέρα του μεθυλγιασμονικού οξέος (methyl jasmonate ή methyl (1R,2R)-3-Oxo-2-(2Z)-2-pentenylcyclopentaneacetate κατά IUPAC), ουσίας που εκλύεται όταν το φυτό παρασιτίζεται από έντομα (Cheng et al. 2007). Επομένως, η παραμονή των σεσκιτερπενίων στο εδαφικό περιβάλλον που διαπιστώθηκε στην παρούσα μελέτη θα μπορούσε να 96

106 βοηθήσει στη βελτίωση της άμυνας των φυτών σε διάφορες καταπονήσεις. Αυτό σημαίνει ότι η ενσωμάτωση στο έδαφος αποξηραμένων φύλλων δυόσμου, ακόμη και σε ποσότητα 2%, μπορεί να βοηθήσει στην προστασία των καλλιεργούμενων φυτών από διάφορους παράγοντες καταπόνησης. Το συγκριτικό πλεονέκτημα της εφαρμογής μιας τέτοιας εναλλακτικής μεθόδου προστασίας των φυτών από διάφορες προσβολές έγκειται στην οικολογική της προσέγγιση και διαφοροποιείται σημαντικά από τις βιοτεχνολογικές μεθόδους παραγωγής γενετικώς τροποποιημένων φυτών με υπερέκφραση σεσκιτερπενίων. Τα σεσκιτερπένια, εκτός από τον ενισχυτικό τους ρόλο στην άμυνα του φυτού, δρουν και ως ουσίες που προάγουν την αύξηση των φυτών (plant growth promoters). Για παράδειγμα, οι Kashiwabara et al. (2006) αναφέρουν ότι τρία σεσκιτερπένια της ρεπρεζεντίνης D, E, F (repraesentin D, E και F), τα οποία απομονώθηκαν από τον μύκητα Lactarius repraesentaneus, επαυξάνουν μέχρι και 164% την επιμήκυνση του ριζιδίου σποροφύτων μαρουλιού. Επιπρόσθετα το σεσκιτερπένιο 1,2-προπανεδιόλη ευνόησε αυξητικές παραμέτρους σποροφύτων μαρουλιού (Nakajima et al. 2005). Στη θετική δράση των σεσκιτερπενίων θα μπορούσε να αποδοθεί και η σημαντική σε σχέση με τους μάρτυρες αύξηση των σποροφύτων τομάτας που αναπτύχθηκαν σε έδαφος αναμεμιγμένο με δυόσμο, πριν ή μετά την κομποστοποίησή του (Κεφάλαια 1 και 2). Η εξακρίβωση των βιοχημικών οδών που οδηγούν σε μεταβολές της σύστασης του αιθερίου ελαίου του δυόσμου θα ήταν εξαιρετικά χρήσιμη, επειδή θα συνέβαλε στην επαρκή κατανόηση των ποιοτικών και ποσοτικών μεταβολών που υφίσταται το αιθέριο έλαιο στο έδαφος όταν ο δυόσμος χρησιμοποιείται ως εδαφοβελτιωτικό. 97

107 6. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Π.3.1. Χρόνος έκλουσης ουσιών με βάση τον οποίο ταυτοποιήθηκαν τα εμπεριεχόμενα τερπένια και προσδιορίσθηκε η εκατοστιαία περιεκτικότητά τους μετά από απόσταξη αποξηραμένου φυτικού υλικού δυόσμου (M. spicata) και εδάφους αναμεμιγμένου με αποξηραμένο φυτικό υλικό δυόσμου. Η ανάλυση έγινε μετά από απόσταξη των αντίστοιχων εδαφικών δειγμάτων στις 15, 35 και 60 ΗΜΕ. Χρόνος έκλουσης ταυτοποιημένης ουσίας Εκατοστιαία περιεκτικότητα συστατικού αιθερίου ελαίου Αιθέριο έλαιο αποξηραμένου φυτικού υλικού δυόσμου 2% Δυόσμος στο έδαφος 4% Δυόσμος στο έδαφος 8% Δυόσμος στο έδαφος HME a-pinene 1,07 1,23 0,12 0,26 1,60 1,73 0,49 1,24 1,03 0, camphene 0,12 0,16 0,11 0,02 0,19 0,22 0,06 0,17 0,12 0, sabinene 0,89 0,92 0,04 0,09 0,98 1,08 0,57 1,06 0,34 0, b-pinene 1,26 1,69 0,16 0,44 1,75 1,84 0,36 1,28 1,27 0, myrcene 0,45 0,65 0,03-0,61 0,66 0,08 0,50 0,21 0, limonene 5,86 8,30 0,47 0,82 9,28 8,39 1,24 5,91 2,19 0, ,8-cineol 5,86 2,19 0,38 0,46 2,05 1,98 0,78 1,55 1,60 0, g-terpinene 0,29 0,15 0,02-0,12 0,14 0,05 0,14 0,13 0, sabinene hydraete 0,16 0,29 0,02-0,30 0,32 0,03 0,31 0,11 0, menthone 0,84 0,76 0,08-0,79 0,84 0,04 1,03 0,50 0, borneol 0,19 0,72 0,20-0,72 0,54 0,24 0,79 0,32 0, terpin-4-ole 0,43 0,29 0,06-0,35 0,40 0,16 0,71 0,15 0, isopulegone 0,73 0,59 0,02-0,51 0,41-0,81 0,04 0, a-terpineol 0,23 0,26 0,04-0,24 0,22 0,04 0,18 0,08 0, dihydro-carveol 5,64 4,65 1,14 0,78 2,15 2,50 1,49 17,74 2,43 1, dihydro-carvone 1,01 1,01 0,29 0,24 8,63 9,24 0,05 6,14 0,45 0, carveol(cis+trans) 2,32 1,61 0,41 0,23 1,81 1,62 0,64 2,69 1,41 0, pulegone 7,95 3,64 0,41 0,48 3,40 3,53 0,43 5,52 1,03 0, carvone 50,53 35,23 1,66 1,27 36,18 31,95 1,35 23,31 3,64 1, dihydrocarveol acetate 3,59 1,00 0,84 1,41 0,96 1,04 0,94 3,53 3,91 2, carvyl acetate 2,39 0,66 0,37 0,39 0,64 0,73 0,39 2,24 1,26 0, b-bourbonene 1,00 2,13 8,07 9,97 1,53 1,74 8,77 1,26 7,02 8, b-elemene 0,36 1,26 4,82 5,64 0,73 0,98 4,25 0,64 3,75 3, caryophyllene 1,38 3,68 12,72 16,19 2,74 2,99 13,17 1,84 10,08 11, b-cybe(b)nene /(phellandrene) 0,09 0,28 1,08 1,17 0,19 0,22 1,18 0,15 0,86 1, (d-germacrene, 55,67,79,91,105,119,133,161,204) 0,08 0,28 1,09 1,31 0,21 0,24 1,26 0,17 0,99 1, (55,81,91,105,119,161,204) 0,17 0,28 1,30 0,96 0,15 0,22 0,93 0,14 0,88 0, a-humulene 0,17 0,25 0,85 0,89 0,19 0,21 1,01 0,16 0,65 0, epibicyclosesquiphellandrene 0,76 2,20 7,10 8,55 1,63 1,85 7,67 1,14 6,42 6,75 98

108 Χρόνος έκλουσης ταυτοποιημένης ουσίας Εκατοστιαία περιεκτικότητα συστατικού αιθερίου ελαίου Αιθέριο έλαιο αποξηραμένου φυτικού υλικού δυόσμου 2% Δυόσμος στο έδαφος 4% Δυόσμος στο έδαφος 8% Δυόσμος στο έδαφος ΗΜΕ d-germacrene 0,09 0,29 1,02 1,26 0,21 0,24 1,03 0,19 0,88 1, b-cybebene 0,70 2,17 5,29 5,27 1,67 1,92 6,32 1,06 4,32 4, bicyclogermacrene 0,39 1,44 4,96 5,33 1,05 1,20 5,85 0,70 3,57 3, b-elemene 0,22 0,84 2,26 2,19 0,78 0,72 2,25 0,42 1,56 2, g-cadinene/a-amorphene 0,11 0,37 1,45 1,70 0,28 0,31 1,43 0,23 1,13 1, calamelene 0,71 2,09 7,19 9,56 1,67 1,76 6,74 1,28 5,95 6, a-cadinene 0,13 0,43 1,60 1,88 0,39 0,42 1,64 0,27 1,23 1, spathulenol 0,08 1,04 1,62 1,50 1,06 1,07 1,96 0,92 1,28 1, caryophyllene oxide 0,12 0,72 1,58 1,78 0,63 0,66 1,74 0,59 1,28 1, a-cybebene 0,22 1,49 3,24 3,48 1,45 1,49 3,53 1,21 2,59 2, T-cadinene 0,04 0,54 1,10 3,11 0,22 1,16 1,29 0,43 0,88 1, cadinol 0,08 1,29 2,80 1,03 1,18 0,53 3,08 1,00 1,90 2, α-ισομερές του 14Norcadin-5-en-4-one 0,02 0,43 0,74 0,73 0,43 0,43 0,56 0,35 0,62 0, mintsulfide - 0,17 0,91 1,06 0,10 0,10 0,65 0,06 0,65 0, methylpropylester 1,2 benzenedicarboxylic acid - 0,97 1,67 0,32 0,31 0,30 0,09 0,10 0,65 0,06 SUM% 98,71 90,63 81,30 91,77 92,01 90,13 85,79 91,18 81,36 76,94 SUM% (μόνο >1%) 88,84 79,35 74,74 84,66 80,81 80,93 78,24 79,54 71,83 67,80 99

109 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΙN VITRO ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΖΙΖΑΝΙΟΚΤΟΝΟΥ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΑΙΘΕΡΙΟΥ ΕΛΑΙΟΥ ΤΟΥ ΑΡΩΜΑΤΙΚΟΥ ΦΥΤΟΥ Mentha spicata ΚΑΙ ΤΟΥ ΚΥΡΙΟΥ ΣΥΣΤΑΤΙΚΟΥ ΤΟΥ-ΚΑΡΒΟΝΗ 100

110 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Μελετήθηκε η αλληλοπαθητική δράση του αιθερίου ελαίου του αρωματικού φυτού δυόσμος (Mentha spicata L.) και του κύριου συστατικού του-μονοτερπενίου καρβόνη εναντίον των ζιζανίων A. theophrasti, D. stramonium, O. sativa και Phalaris paradoxa και της τομάτας (L. esculentum). Η βλαστική ικανότητα, το μήκος του ριζιδίου, το μήκος του υποκοτυλίου, καθώς και το νωπό βάρος των αρτίβλαστων εκτιμήθηκαν σε πειράματα in vitro. Tο αιθέριο έλαιο του δυόσμου και η καρβόνη προκάλεσαν ισχυρή αναστολή σε όλες τις εξετασθείσες παραμέτρους των ζιζανίων P. paradoxa και D. stramonium και μικρότερη αναστολή στις αντίστοιχες παραμέτρους των A. theophrasti και O. sativa. Η βλαστική ικανότητα της τομάτας μειώθηκε κατά το ήμισυ σε σχέση με τον μάρτυρα παρουσία 3.22 μl του αιθερίου ελαίου δυόσμου. Γενικώς, η τομάτα έδειξε μειωμένη βλαστική ικανότητα και μείωση κατά τα πρώτα στάδια αύξησης και στις λοιπές συγκεντρώσεις του αιθερίου ελαίου και της καρβόνης που εφαρμόσθηκαν. Tα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το αιθέριο έλαιο του δυόσμου ή η καρβόνη μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως «φυσικώς συντιθέμενα ζιζανιοκτόνα» σε καλλιέργεια τομάτας, σε κατάλληλη χρονική στιγμή πριν τη μεταφύτευσή της, ώστε να αναστέλλεται επιτυχώς τη φυτρωτική ικανότητα των ζιζανίων αλλά και να μην επηρεάζεται δυσμενώς η ανάπτυξη της μεταφυτευθείσας τομάτας. 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η διαρκώς κλιμακούμενη προσπάθεια εφαρμογής φυσικών προϊόντων στην αντιμετώπιση των ζιζανίων προέκυψε λόγω των προβλημάτων της χρήσης και του κόστους των χημικώς συντιθέμενων ζιζανιοκτόνων, καθώς και από την ανάγκη για ολοκληρωμένη διαχείριση των ζιζανίων ως επιμέρους πρακτική κατά την εφαρμογή της γεωργίας μειωμένων εισροών (Kupatt et al. 1993). Επιπλέον, η ανάπτυξη ανθεκτικότητας διαφόρων ζιζανίων στα χρησιμοποιούμενα χημικώς συντιθέμενα ζιζανιοκτόνα αύξησε το ενδιαφέρον για την εξεύρεση εναλλακτικών λύσεων. H χρήση φυσικών προϊόντων, όπως οι φυσικώς συντιθέμενες αλληλοπαθητικές ουσίες, αποκτά εξαιρετικό ενδιαφέρον (Duke and Abbas 1995, Duke et al. 2000) παρά το γεγονός ότι καταλαμβάνουν μικρό μερίδιο στην παγκόσμια αγορά αγροτικών εφοδίων (Singh et al. 2002). Πολλές έρευνες στρέφονται πλέον στην απομόνωση, στην ταυτοποίηση και στον έλεγχο της βιοδραστικότητας φυσικών προϊόντων των φυτών 101

111 καθώς και στην εξεύρεση πρωτοκόλλου εφαρμογής τους (Duke et al. 2000). Εργαλεία της βιοτεχνολογίας, όπως η γονιδιωματική (genomics) και η πρωτεομική (proteomics) ανάλυση, χρησιμοποιούνται για να βελτιώσουν τις ζιζανιοκτόνες ιδιότητες αυτών των αλληλοπαθητικών ουσιών (Birkett et al. 2001). Σε αντίθεση με τα προαναφερθέντα, οι Dayan et al. (2000) υποστηρίζουν ότι, πριν από την μελέτη αυτών των ουσίων σε βιοτεχνολογικό επίπεδο, είναι επιτακτική ανάγκη να προσδιοριστούν οι φυσιολογικές και βιοχημικές επιδράσεις των αλληλοπαθητικών ουσιών σε στόχους-ζιζάνια και σε καλλιεργούμενα φυτά. Τα φυτά αποτελούν ιδανική πηγή παραγωγής αλληλοπαθητικών ουσιών, δηλαδή βιολογικώς δραστικών ουσιών με μεγάλη ποικιλομορφία από πλευράς χημικής δομής, οι οποίες προσδιορίζονται ως αλληλοπαθητικοί μεταβολίτες. Η μηδική (Medicago sativa L.), το σόργο (Sorghum sp. L.), το ρύζι (Oryza sativa L.) και διάφορα είδη του γένους Eucalyptus είναι ευρέως γνωστά φυτά για τις αλληλοπαθητικές τους ιδιότητες (Anaya 1999). Επίσης, και ζιζάνια, όπως για παράδειγμα το Sicyos deppei της οικογένειας Curcubitaceae, παρουσιάζουν αλληλοπαθητικές ιδιότητες και αναστέλλουν τη βλαστική ικανότητα και την ανάπτυξη αραβοσίτου (Zea mays L.), φασολιού (Phaseolus vulgaris L.), κολοκυθιού (Cucurbita peppo L.), μαρουλιού (Lactuca sativa L.), τομάτας (L. esculentum), βλήτου (Amaranthus hypochondriacus L.) και μουχρίτσας (Echinochloa crus-galli L.) (Hernández-Bautista et al. 1996, Cruz-Ortega et al. 1998). Οι φαινολικές ενώσεις ή τα παράγωγα του κινναμικού οξέος, που παράγονται από τα πολυετή αγγειόσπερμα, ταυτοποιήθηκαν από τον Rice (1984) ως ισχυροί αναστολείς της βλαστικής ικανότητας και της αύξησης των φυτών. Άλλοι ερευνητές (Friedman and Walker 1983, Putnam 1985, Waller 1989) αναφέρουν ότι οι κουμαρίνες, τα φλαβονοειδή, τα αλκαλοειδή και κάποιες πρωτεΐνες και αμινοξέα είναι ενώσεις ικανές να προκαλέσουν παρόμοιες αναστολές. Μεταξύ των φυσικών προϊόντων με αλληλοπαθητική δράση συγκαταλέγονται η AAL-τοξίνη (τοξίνη που παράγεται από τον μύκητα Alternaria alternata f.sp. lycopersici), τα τερπένια (συγκεκριμένα τα μονοτερπένια, τα σεσκιτερπένια λακτόνης και τα διτερπένια) και η υδαντοσιδίνη (hydantocidin), ένα νουκλεοσίδιο προερχόμενο από τον ακτινομύκητα Streptomyces hydroscopicus (Ναkajima et al. 1991, Duke et al. 2000). Μεταξύ των προαναφερθέντων χημικών ομάδων και ενώσεων, η δράση των πτητικών μονοτερπενίων ως ισχυρών αναστολέων της ανάπτυξης των φυτών έχει μελετηθεί αρκετά (Muller et al. 1964, Al-Saadawi et al. 1985, Fisch er 1991, Singh et al. 1991, 102

112 Kohli et al. 1998, Kong et al. 1999, Vokou 1999). Τα μονοτερπένια είναι η απλούστερη αντιπροσωπευτική ομάδα των τερπενίων αλλά και η μεγαλύτερη ομάδα των δευτερογενών μεταβολιτών. Αυτά αποτελούν συστατικά των αιθερίων ελαίων αρωματικών φυτών όπως η ρίγανη (O. syriacum L.) (Dudai et al. 1999), η λεβάντα (L. angustifolia), η ρίγανη (O. vulgare), το φασκόμηλο (S. fruticosa), το δενδρολίβανο (R. officinalis) (Karamanoli et al. 2000), o ευκάλυπτος (Eucalyptus sp. L.) (Kohli 1990, Singh et al. 2005), η αρτεμισία (Artemisia spp. L.) (Ahmad and Misra 1994) κ.ά. Οι Muller et al. (1964) και ο Muller (1965) βρήκαν ότι σε διάμετρο 90 cm γύρω από τα καλλιεργούμενα αρωματικά φυτά, όπως η πλατύφυλλη φασκομηλιά (S. leucophylla L. Greene) ή η Artemisia californica L., δεν φυτρώνουν ετήσια φυτά, ενώ η παρουσία των δεύτερων είναι περιορισμένη σε απόσταση 2-6 μέτρων γύρω από τους δύο αυτούς αρωματικούς θάμνους. Τα μονοτερπένια, εκτός από αναστολείς της αύξησης των φυτών, είναι γνωστά και για τη δράση τους ως προστατευτικές ουσίες των φυτών και ως ελκυστικές των εντόμων ουσίες κατά την επικονίαση των φυτών (Fischer et al. 1994, Paiva 2000). Tα τελευταία χρόνια διερευνάται η φυτοτοξική δράση των μονοτερπενίων εναντίον των ζιζανίων, αφού μεταξύ των σημαντικών πλεονεκτημάτων τους συγκαταλέγονται η μειωμένη υπολειμματική τους διάρκεια στο έδαφος λόγω της υψηλής πτητικότητάς τους, η μη έκπλυσή τους στα υπόγεια νερά και η χαμηλή τοξικότητά τους στα θηλαστικά (Isman 2000). Επίσης, η πιθανή διαφορά στο μηχανισμό δράσης των μονοτερπενίων σε σχέση με αυτούς των χημικώς συντιθέμενων ζιζανιοκτόνων, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων χημικώς συντιθέμενων ζιζανιοκτόνων στο μέλλον (Dayan et al. 1999). O Tworkoski (2002) αναφέρει ότι τα αιθέρια έλαια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιολογικά ζιζανιοκτόνα σε καλλιέργειες οργανικής (βιολογικής) γεωργίας. Αξίζει να αναφερθεί ότι έχει ήδη μελετηθεί η ζιζανιοκτόνος δράση της 1,8- και της 1,4- κινεόλης έναντι των ζιζανίων E. crus-galli και Cassia obtusifolia L. (Romagni et al. 2000a). Οι ίδιοι ερευνητές βρήκαν ομοιότητα στη χημική δομή της κινεόλης και του χημικώς συντιθέμενου ζιζανιοκτόνου cinmethylin και παρατήρησαν ότι η cinmethylin δρα ως «πρόδρομο» ζιζανιοκτόνο που στη συνέχεια μεταβολίζεται και παράγει το κυρίως δραστικό ζιζανιοκτόνο, την 2-υδροξυ-1,4-κινεόλη (Romagni et al. 2000b). Οι Singh et al. (2005) μελέτησαν τη ζιζανιοκτόνο δράση του αιθερίου ελαίου του Eucalyptus citriodora L. εναντίον του ζιζανίου Parthenium hysterophorus L. και βρήκαν ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του αιθερίου ελαίου του ευκάλυπτου 103

113 συνδυάστηκε με παράλληλη μείωση της βλαστικής ικανότητας, της χλωροφύλλης και της αναπνοής του ζιζανίου. Παρομοίως, μεταξύ των μονοτερπενίων που μελετήθηκαν για τη ζιζανιοκτόνο δράση τους εναντίον του ζιζανίου C. occidentalis L., η σιτρονελλάλη και η λιναλοόλη είχαν μεγαλύτερη επίδραση από άλλα μονοτερπένια (αυτά της κινεόλης και της σιτρονελλόλης) στην αύξηση, στο ξηρό βάρος, στη χλωροφύλλη και στην αναπνοή των ζιζανίων (Singh et al. 2002). Οι Da Mastro et al. (2006) που πραγματοποίησαν μελέτη σε φυτοδοχεία και σε αγρό βρήκαν ότι η φυτρωτική ικανότητα και η βιομάζα σπαρθέντων ζιζανίων περιορίστηκε σημαντικά από την επίδραση φύλλων και βλαστών υβριδίου ρίγανης (O. vulgare L. ssp. virilidum x O. vulgare L. ssp. hirtum (Link) Iestwart) που ενσωματώθηκε στο έδαφος. Οι Dudai et al. (1999) βρήκαν ότι η ενσωμάτωση στο έδαφος αιθερίων ελαίων O. syriacum L., Micromeria fruticosa L. και Cymbopogon citrates L. μείωσε τη βλαστική ικανότητα του σιταριού. Οι Vasilakoglou et al. (2007) αναφέρουν σημαντική αναστολή της βλαστικότητας και της αύξησης ετήσιων ζιζανίων, όπως η μουχρίτσα (E. crus-galli) και η λουβουδιά (C. album), από χρήση αιθερίων ελαίων ρίγανης ή μαντζουράνας. Οι Angelini et al. (2003) βρήκαν ότι η βλαστικότητα των C. album, P. oleracea και E. crus-galli αναστέλλεται πλήρως από την εφαρμογή αιθερίου ελαίου δενδρολίβανου (R. officinalis). Ο μηχανισμός δράσης των αιθερίων ελαίων ως προς τη ζιζανιοκτόνο δράση τους δεν είναι ακόμη πλήρως γνωστός (Τworkoski 2002). Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι το αιθέριο έλαιο του δυόσμου δεν ασκεί επίδραση στο DNA, στο RNA, ή στην πρωτεΐνοσύνθεση, αλλά μεταβάλλει την διαπερατότητα των κυτταρικών μεμβρανών (Ismaiel and Pierson 1990). Επιπλέον, τα πτητικά μονοτερπένια, όπως οι κινεόλες, είναι δυνητικοί αναστολείς της μίτωσης (Baum et al. 1998, Romagni et al. 2000a) και καταστροφείς των μιτοχονδριακών μεμβρανών (Lorber and Muller 1980). Βέβαια, σημαντική παραλλακτικότητα διαπιστώνεται ως προς τη φυτοτοξικότητα που προκαλούν ακόμη και συγγενή/ισομερή μονοτερπένια, όπως η 1,8-κινεόλη και η 1,4- κινεόλη (Romagni et al. 2000a), παρατήρηση που καθιστά επιτακτική την ανάγκη περαιτέρω διερεύνησης του μηχανισμού δράσης τους. Η ζιζανιοκτόνος δράση του αιθερίου ελαίου του δυόσμου (M. spicata), αλλά και άλλων αρωματικών φυτών, όπως της λεβάντας (L. stoechas), της ρίγανης (O. onites), του δενδρολίβανου (R. officinalis) και του φασκόμηλου (S. officinalis), μελετήθηκε από τους Azirak and Caraman (2008) εναντίον των ζιζανίων Alcea pallida L., A. retroflexus L., Centaurea salsotitialis L., Raphanus raphanistrum 104

114 L., Rumex nepalensis L., Sinapis arvensis L. και Sonchus oleraceus L. Η μελέτη αυτή έδειξε ότι το αιθέριο έλαιο του δυόσμου, αλλά και το κύριο συστατικό του, η καρβόνη, αναστέλλουν σημαντικά την in vitro βλαστικότητα των σπόρων όλων των προηγούμενων ζιζανίων. Η βιβλιογραφία, παρά τα προαναφερθέντα, είναι ελλιπής ως προς τη μελέτη της ζιζανιοκτόνου δράσης του αιθερίου ελαίου του δυόσμου και της καρβόνης σε ζιζάνια συχνά απαντώμενα στον Ελλαδικό χώρο, όπως η αγριοβαμβακιά (Α. theophrasti), ο τάτουλας (D. stramonium), το κόκκινο ρύζι (O. sativa) και η φάλαρη (P. paradoxa). Η μόνη εργασία είναι των Argyropoulos et al. (2008), όπου μελετήθηκε in vitro η δράση του αιθερίου ελαίου του δυόσμου (M. spicata) και της καρβόνης εναντίον διαφόρων ζιζανίων, μεταξύ των οποίων και του κόκκινου ρυζιού (O. sativa). Στην παρούσα εργασία εκτιμήθηκε in vitro η φυτοτοξική δράση του αιθερίου ελαίου του δυόσμου (M. spicata) και του κύριου συστατικού του, του μονοτερπενίου καρβόνη, στα προαναφερθέντα ζιζάνια και στην τομάτα. Αξιολογήθηκε η επίδρασή τους στη βλαστική ικανότητα, στο μήκος ριζιδίου και υποκοτυλίου, καθώς και στο νωπό βάρος των αρτίβλαστων τομάτας και ζιζανίων. Από τα ζιζάνια που επιλέχθηκαν, μερικά (αγριοβαμβακιά, τάτουλας) απαντώνται συχνά και σε καλλιέργειες τομάτας. 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1. Προσδιορισμός επιμέρους συστατικών του αιθερίου ελαίου Το φυτικό υλικό δυόσμου (M. spicata L.) αγοράστηκε από το εμπόριο. Ποσότητα 100 g φυτικoύ υλικού, αποτελούμενο από φύλλα, βλαστούς και άνθη, τοποθετήθηκε σε 2 L φιάλη, με 1.5 L απεσταγμένο νερό και αποστάχθηκε σε συσκευή Clevenger επί 3 ώρες. Το αιθέριο έλαιο παραλήφθηκε, υπολογίστηκε η συγκέντρωσή του, ξηράνθηκε πάνω από άνυδρο Na 2 SO 4, και αποθηκεύθηκε σε σκουρόχρωμα μπουκάλια στους C. Η καρβόνη, κύριο συστατικό του αιθερίου ελαίου του δυόσμου, αγοράστηκε από το εμπόριο και χρησιμοποιήθηκε ως αυθεντική ουσία αναφοράς (authentic reference substance). Για τον ποσοτικό και ποιοτικό προσδιορισμό των επιμέρους συστατικών του αιθερίου ελαίου, χρησιμοποιήθηκε αέριος χρωματoγραφία με φασματοσκοπία μάζας (GC-MS). Η μεθοδολογία περιγράφεται αναλυτικά παραπάνω ( 3.2 του κεφαλαίου 3). 105

115 3.2. Εργαστηριακός έλεγχος ζιζανιοκτόνου δράσης του αιθερίου ελαίου και της καρβόνης Ώριμοι σπόροι συλλέχθηκαν από τα ζιζάνια αγριοβαμβακιά (Α. theophrasti L.), κόκκινο ρύζι (O. sativa), τάτουλας (D. stramonium L.) και φάλαρη (P. paradoxa L.). Οι σπόροι αυτοί αεροξηράνθηκαν στο θερμοκήπιο και ακολούθως, αφού κοσκινίστηκαν για να απομακρυνθούν οι λισβοί σπόροι και τυχόν υπολείμματα, αποθηκεύτηκαν σε ψυγείο στους C μέχρι της χρησιμοποίησής τους. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε και πιστοποιημένος σπόρος τομάτας (L. esculentum, υβρίδιο Carla F1). Η βλαστική ικανότητα των σπόρων κυμαινόταν από 12,5 (τάτουλας) μέχρι 98% (κόκκινο ρύζι) (επιβεβαιώθηκε με δοκιμές βλαστικής ικανότητας). Πενήντα (50) σπόροι από κάθε ένα από τα προαναφερθέντα ζιζάνια τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένα γυάλινα τρυβλία 9 εκατοστών. Αυτά ακολούθως καλύφθηκαν με 5 g περλίτη (επιλέχθηκε ως αδρανές υλικό επειδή δεν προσροφά οργανικές ενώσεις) που ενυδατώθηκε με 15 ml αποστειρωμένου νερού. Στο κέντρο κάθε τρυβλίου τοποθετήθηκε μικρό δοχείο από αλουμινόχαρτο, όπου εναποτέθηκαν 0.0, 1.0, 2.5, 5.0 και 10.0 μl αιθερίου ελαίου δυόσμου ή καρβόνης, έτσι ώστε οι σπόροι των ζιζανίων να μην έρχονται σε άμεση επαφή με το αιθέριο έλαιο, αλλά να επηρεάζονται μόνο από την πτητική του φάση (Εικόνα 4.1). Στη συνέχεια τα τρυβλία σφραγίσθηκαν με πλαστική μεμβράνη (parafilm) για να αποφευχθεί τυχόν εξάτμιση και επωάσθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης στους 27 ± 2 0 C για 8-10 ημέρες. Κάθε συγκέντρωση αιθερίου ελαίου δυόσμου ή καρβόνης δοκιμάσθηκε σε τρεις επαναλήψεις σε πλήρως τυχαιοποιημένη διάταξη (πλήρως τυχαιοποιημένες ομάδες). Μετά το τέλος της περιόδου επώασης, τα αρτίβλαστα απομακρύνθηκαν προσεκτικά από τα τρυβλία και προσδιορίστηκε ο μέσος όρος της βλαστικης ικανότητας τους, το μήκος του ριζιδίου, το μήκος του υποκοτυλίου, καθώς και το νωπό βάρος ολόκληρου του αρτίβλαστου. Για κάθε μια από τις παραμέτρους αυτές υπολογίσθηκε το επίπεδο αναστολής της σύμφωνα με την εξίσωση: % αναστολή = [(Τ / C) x 100], όπου C, ο μέσος όρος των τριών επαναλήψεων-μετρήσεων της κάθε παραμέτρου στα τρυβλία-μάρτυρες T, ο μέσος όρος των τριών επαναλήψεων-μετρήσεων της κάθε παραμέτρου στα τρυβλία που εκτέθηκαν στο αιθέριο έλαιο δυόσμου ή στην καρβόνη. Οι μέσοι όροι των παραμέτρων (άξονας y) για κάθε συγκέντρωση του αιθερίου ελαίου ή της καρβόνης (άξονας x) χρησιμοποιήθηκαν για την εξεύρεση της 106

116 γραμμής συμμεταβολής που περιγράφει καλύτερα τη σχέση μεταξύ των αξιολογηθεισών παραμέτρων και της συγκέντρωση του αιθερίου ελαίου ή της καρβόνης. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια της εξίσωσης συμμεταβολής, υπολογίστηκε η ποσότητα του αιθερίου ελαίου δυόσμου ή της καρβόνης που προκάλεσε μείωση των τιμών των εκτιμηθεισών παραμέτρων κατά 50% (Ι 50 ). Τομάτα Κόκκινο ρύζι Φάλαρη Εικόνα 4.1. Βιοδοκιμές σε τρυβλία για τον έλεγχο της ζιζανιοκτόνου δράσης 0, 1, 5 και 10 μl του αιθερίου ελαίου δυόσμου στην τομάτα (L. esculentum) και σε σπόρους των ζιζανίων κόκκινο ρύζι (O. sativa) και φάλαρη (P. paradoxa) Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση όλων των πειραματικών δεδομένων (ANOVA) πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πρόγραμμα Statistica 6.0 (StatSoft Italia srl). Χρησιμοποιήθηκε το 5 x 2 x 5 (5 ελεγχόμενα φυτά x 2 ελεγχόμενες ουσίες x 5 συγκεντρώσεις εφαρμογής) παραγοντικό πείραμα σε πλήρως τυχαιοποιημένες ομάδες. Η σύγκριση των μέσων όρων έγινε με το κριτήριο της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς (ΕΣΔ) σε επίπεδο σημαντικότητας P Η εξεύρεση της εξίσωσης και της γραμμής συμμεταβολής έγινε με το πρόγραμμα EXCEL. 107

117 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1. Προσδιορισμός επιμέρους συστατικών του αιθερίου ελαίου Η απόδοση της απόσταξης των αποξηραμένων φύλλων του δυόσμου, εκπεφρασμένη ως % περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο, κυμάνθηκε από 0,6 μέχρι 1%. Η κύρια ουσία που περιείχε το αιθέριο έλαιο του δυόσμου [αέριος χρωματoγραφίαφασματοσκοπία μάζας (GC-MS)] ήταν η καρβόνη (50.5% περιεκτικότητα) Εργαστηριακός έλεγχος ζιζανιοκτόνου δράσης του αιθερίου ελαίου και της καρβόνης Η επίδραση των συγκεντρώσεων εφαρμογής του αιθερίου ελαίου δυόσμου στα ζιζάνια φάλαρη (P. paradoxa) και κόκκινο ρύζι (O. sativa) φαίνεται στην Εικόνα μl μl Phalaris paradoxa Oryza sativa Εικόνα 4.2. Επίδραση 0, 1, 2.5, 5 και 10 μl αιθερίου ελαίου δυόσμου (M. spicata) στο μήκος ριζιδίου και στο μήκος υποκοτυλίου των ζιζανίων φάλαρη (P. paradoxa) και κόκκινο ρύζι (O. sativa). Η προσπάθεια εξεύρεσης της καλύτερης γραμμής συμμεταβολής μεταξύ βλαστικής ικανότητας ή μήκους ριζιδίου ή μήκους υποκοτυλίου ή νωπού βάρους αρτίβλαστων (y) και συγκέντρωσης αιθερίου ελαίου δυόσμου ή καρβόνης (x) έδειξε ότι η εξίσωση της ευθύγραμμης συμμεταβολής (y=α-bx) περιγράφει καλύτερα τη σχέση αυτή (Πίνακας 4.1). Αυτό τεκμαίρεται από τους υψηλούς συντελεστές προσδιορισμούς (R 2 ) των περισσότερων εξισώσεων συμμεταβολής. 108

118 Φυτό Πίνακας 4.1. Εξισώσεις ευθύγραμμης συμμεταβολής και συντελεστές προσδιορισμού (R 2 ) μεταξύ βλαστικής ικανότητας ή μήκους ριζιδίου ή μήκους υποκοτυλίου ή νωπού βάρους αρτίβλαστων (y) και συγκέντρωσης αιθερίου ελαίου δυόσμου ή καρβόνης (x). Εξίσωση ευθύγραμμης συμμεταβολής που προκύπτει από την επίδραση αιθερίου ελαίου δυόσμου Αγριοβαμβακιά Βλαστική ικανότητα y= x R 2 =0.90 Μήκος ριζιδίου y= x R 2 =0.99 Μήκος υποκοτυλίου y= x R 2 =0.82 Νωπό βάρος αρτίβλαστων y= x R 2 =0.97 Κόκκινο ρύζι y= x R 2 =0.65 y= x R 2 =0.95 y= x R 2 =0.66 y= x R 2 =0.93 Τάτουλας y= x R 2 =0.86 y= x R 2 =0.92 y= x R 2 =0.94 y= x R 2 =0.97 Φάλαρη y= x R 2 =0.86 y= x R 2 =0.94 y= x R 2 =0.93 y= x R 2 =0.94 Τομάτα y= x R 2 =0.86 y= x R 2 =0.95 y= x R 2 =0.98 y= x R 2 =0.89 Εξίσωση ευθύγραμμης συμμεταβολής που προκύπτει από την επίδραση καρβόνης Βλαστική Μήκος Μήκος Νωπό βάρος Φυτό ικανότητα ριζιδίου υποκοτυλίου αρτίβλαστων Αγριοβαμβακιά y= x R 2 =0.75 y= x R 2 =0.90 y= x R 2 =0.90 y= x R 2 =0.96 Κόκκινο ρύζι y= x R 2 =0.65 y= x R 2 =0.85 y= x R 2 =0.99 y= x R 2 =0.97 Τάτουλας y= x R 2 =0.73 y= x R 2 =0,75 y= x R 2 =0,75 y= x R 2 =0.94 Φάλαρη y= x R 2 =0.97 y= x R 2 =0.84 y= x R 2 =0.81 y= x R 2 =0.90 Τομάτα y= x R 2 =0.97 y= x R 2 =0.78 y= x R 2 =0.90 y= x R 2 =

119 Το αιθέριο έλαιο του δυόσμου επηρέασε σημαντικά τις αξιολογηθείσες παραμέτρους των ζιζανίων και της τομάτας (Πίνακας Π.4.1). Ειδικότερα, το αιθέριο έλαιο δυόσμου (2.54 έως 3.84 μl/τρυβλίο) μείωσε τη βλαστική ικανότητα των ζιζανίων τάτουλας και φάλαρη και της τομάτας κατά 50% (Σχήμα 4.1, Πίνακας 4.2). 100 Αγριοβαμβακιά Κόκκινο ρύζι Τάτουλας Φάλαρη Τομάτα 80 Βλαστική ικανότητα (% του μάρτυρα) , Aιθέριο έλαιο δυόσμου (μl) , Καρβόνη (μl) Σχήμα 4.1. Επίδραση του αιθερίου ελαίου δυόσμου (M. spicata) ή της καρβόνης στη βλαστική ικανότητα των ζιζανίων αγριοβαμβακιά (A. theophrasti), κόκκινο ρύζι (O. sativa), τάτουλας (D. stramonium), φάλαρη (P. paradoxa) και τομάτας (L. esculentum). Όλες οι τιμές είναι είναι εκπεφρασμένες ως % του αντίστοιχου μάρτυρα (μάρτυρας=100). 110

120 Πίνακας 4.2. Ποσότητα αιθερίου ελαίου δυόσμου (M. spicata) και καρβόνης που προκαλούν κατά 50% αναστολή (Ι 50 ) της βλαστικής ικανότητας, του μήκους ριζιδίου, του υποκοτυλίου και του νωπού βάρους αρτίβλαστων των ζιζανίων αγριοβαμβακιά (A. theophrasti), κόκκινο ρύζι (O. sativa), τάτουλας (D. stramonium), φάλαρη (P. paradoxa), και της καλλιεργούμενης τομάτας (L. esculentum). Φυτό Ι 50 (μl αιθερίου ελαίου δυόσμου/τρυβλίο) Βλαστική ικανότητα Μήκος ριζιδίου Μήκος υποκοτυλίου Νωπό βάρος αρτίβλαστων Αγριοβαμβακιά Κόκκινο ρύζι Τάτουλας Φάλαρη Τομάτα Φυτό Ι 50 (μl καρβόνης/τρυβλίο) Βλαστική ικανότητα Μήκος ριζιδίου Μήκος υποκοτυλίου Νωπό βάρος αρτίβλαστων Αγριοβαμβακιά Κόκκινο ρύζι Τάτουλας Φάλαρη Τομάτα

121 Η βλαστική ικανότητα των σπόρων της αγριοβαμβακιάς και του κόκκινου ρυζιού παρουσία οιασδήποτε συγκέντρωσης αιθερίου ελαίου δυόσμου ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από αυτήν των άλλων δύο ζιζανίων, σε σχέση πάντα με τους μάρτυρές τους, καθώς καμία από τις χρησιμοποιηθείσες συγκεντρώσεις (ακόμη και αυτή των 10 μl/τρυβλίο) δεν ανέστειλε τη βλάστησή τους κατά 50%. Η βλαστική ικανότητα των σπόρων της τομάτας μειώθηκε κατά 50% σε σχέση με το μάρτυρα, παρουσία 3.22 μl του αιθερίου ελαίου δυόσμου/τρυβλίο. Η καρβόνη προκάλεσε παρόμοιες μειώσεις στη βλαστική ικανότητα των ζιζανίων και της τομάτας με αυτές που προκάλεσε το αιθέριο έλαιο του δυόσμου (Σχήμα 4.1). Ειδικότερα, η βλαστική ικανότητα των ζιζανίων τάτουλας και φάλαρη μειώθηκε κατά 50% σε συγκεντρώσεις 2.37 και 2.50 μl καρβόνης/τρυβλίο, αντιστοίχως. Η αντίστοιχη συγκέντρωση για την τομάτα ήταν Ι 50 =2.71 μl, ενώ για την αγριοβαμβακιά και το κόκκινο ρύζι Ι 50 =7.54 και Ι 50 =5.26, αντιστοίχως. Το μήκος ριζιδίου και το μήκος υποκοτυλίου των αρτίβλαστων μειώθηκαν σημαντικά μετά από εφαρμογή του αιθερίου ελαίου δυόσμου ή της καρβόνης (Σχήματα 4.2 και 4.3). Παρόμοια ήταν τα δεδομένα στο νωπό βάρος των αρίβλαστων (Σχήμα 4.4). Ειδικότερα, το Ι 50 για το ριζίδιο όλων των υπό μελέτη φυτών ήταν ίσο ή μικρότερο από 3.32 μl/τρυβλίο για το αιθέριο έλαιο του δυόσμου και 2.80 μl/τρυβλίο για την καρβόνη σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες (Πίνακας 4.2). Ειδικότερα, το Ι 50 για το μήκος του ριζιδίου και του υποκοτυλίου της τομάτας ήταν ίσο ή μικρότερο του 2.94 για το αιθέριο έλαιο του δυόσμου, και ίσο ή μικρότερο του 2,45 για την καρβόνη. Γενικώς, η αγριοβαμβακιά και το κόκκινο ρύζι ήταν ανθεκτικότερα από ό,τι ο τάτουλας και η φάλαρη ως προς την αύξηση ριζιδίου και υποκοτυλίου. Το μήκος ριζιδίου είχε σχεδόν πάντα μικρότερες Ι 50 τιμές από το μήκος υποκοτυλίου σε όλα τα φυτά, υποδεικνύοντας τη μεγαλύτερη ευαισθησία της πρώτης παραμέτρου από τη δεύτερη στην επίδραση του αιθερίου ελαίου δυόσμου ή της καρβόνης. Τα δεδομένα του νωπού βάρους των ζιζανίων και της τομάτας ήταν ανάλογα με αυτά στο μήκος ριζιδίου και υποκοτυλίου και γι αυτό το λόγο δεν σχολιάζονται περισσότερο (Σχήμα 4.4). 112

122 100 Αγριοβαμβακιά Κόκκινο ρύζι Τάτουλας Φάλαρη Τομάτα Μήκος ριζιδίου (% του μάρτυρα) , Αιθέριο έλαιο δυόσμου (μl) , Καρβόνη (μl) Σχήμα 4.2. Επίδραση του αιθερίου ελαίου δυόσμου (M. spicata) ή της καρβόνης στο μήκος ριζιδίου αρτίβλαστων των ζιζανίων αγριοβαμβακιά (A. theophrasti), κόκκινο ρύζι (O. sativa), τάτουλας (D. stramonium), φάλαρη (P. paradoxa), και της τομάτας (L. esculentum). Όλες οι τιμές είναι εκπεφρασμένες ως % του αντίστοιχου μάρτυρα (μάρτυρας=100). 113

123 100 Αγριοβαμβακιά Κόκκινο ρύζι Τάτουλας Φάλαρη Τομάτα Μήκος υποκοτυλίου (% του μάρτυρα) , Αιθέριο έλαιο δυόσμου (μl) , Καρβόνη (μl) Σχήμα 4.3. Επίδραση του αιθερίου ελαίου δυόσμου (M. spicata) ή της καρβόνης στο μήκος υποκοτυλίου αρτίβλαστων των ζιζανίων αγριοβαμβακιά (A. theophrasti), κόκκινο ρύζι (O. sativa), τάτουλας (D. stramonium), φάλαρη (P. paradoxa), και της τομάτας (L. esculentum). Όλες οι τιμές είναι εκπεφρασμένες ως % του αντίστοιχου μάρτυρα (μάρτυρας=100). 114

124 100 Αγριοβαμβακιά Κόκκινο ρύζι Τάτουλας Φάλαρη Τομάτα 80 Νωπό βάρους αρτίβλαστων (% του μάρτυρα) , Αιθέριο έλαιο δυόσμου (μl) , Καρβόνη (μl) Σχήμα 4.4. Επίδραση του αιθερίου ελαίου δυόσμου (M. spicata) ή της καρβόνης στο νωπό βάρος αρτίβλαστων των ζιζανίων αγριοβαμβακιά (A. theophrasti), κόκκινο ρύζι (O. sativa), τάτουλας (D. stramonium), φάλαρη (P. paradoxa) και της τομάτας (L. esculentum). Όλες οι τιμές είναι εκπεφρασμένες ως % του αντίστοιχου μάρτυρα (μάρτυρας=100). 115

125 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η in vitro ισχυρή αναστολή στη βλαστική ικανότητα, στην αύξηση του ριζιδίου και του υποκοτυλίου και στο νωπό βάρος αρτίβλαστων των ζιζανίων τάτουλας και φάλαρη και μικρότερη στα ζιζάνια αγριοβαμβακιά και κόκκινο ρύζι από το αιθέριο έλαιο του δυόσμου και το μονοτερπένιο καρβόνη θα πρέπει να οφείλεται σε αλληλοπαθητικές ιδιότητες αυτών των ουσιών. Η ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση της καρβόνης στον τάτουλα και στη φάλαρη (η βλαστική ικανότητα και η αύξηση ριζιδίου και υποκοτυλίου τους είχαν Ι 50 περίπου στα 2.30 μl καρβόνης και 2.90 μl αιθερίου ελαίου δυόσμου/τρυβλίο) είναι αποτέλεσμα της μεγαλύτερης ευαισθησίας αυτών των ζιζανίων. Η περιεκτικότητα του αιθερίου ελαίου δυόσμου σε καρβόνη είναι περίπου 50% και ως εκ τούτου η οποιαδήποτε συγκέντρωση αιθερίου ελαίου δυόσμου αναμενόταν να προκαλέσει την ίδια επίδραση με τη μισή περίπου συγκέντρωση καρβόνης. Εντούτοις, στις περισσότερες περιπτώσεις η συσχέτιση των ανασταλτικών ποσοτήτων δυόσμου και καρβόνης (Πινακας 4.2) φανερώνει ότι οι ανασταλτικές επιδράσεις του αιθερίου ελαίου του δυόσμου θα πρέπει να οφείλονται εκτός από την καρβόνη και στην αθροιστική/ή συνεργιστική δράση των υπολοίπων συστατικών του αιθερίου ελαίου. Η in vitro ευαισθησία της τομάτας (μείωση βλαστικής ικανότητας και αύξησης) στις διάφορες συγκεντρώσεις του αιθερίου ελαίου δυόσμου και καρβόνης είναι σε αντίθεση με τα αποτελέσματα που παρατέθηκαν στα προηγούμενα κεφάλαια 1 και 2, όπου βρέθηκε ότι η ενσωμάτωση στο έδαφος κομπόστας ή κομποστοποιήσιμου φυτικού υλικού δυόσμου είχε θετική επίδραση στη φυτρωτική ικανότητα, στο ύψος και στο ξηρό βάρος των σποροφύτων τομάτας σε σχέση με τα σπορόφυτα-μάρτυρες. Οι συγκεντρώσεις του αιθερίου ελαίου ή της καρβόνης εντός του εδάφους πιθανώς να είναι πολύ μικρότερες και επομένως λιγοτερο τοξικές σε σχέση με αυτές των in vitro πειραμάτων. Η διαφορετική χημική σύσταση του αιθερίου ελαίου του κομποστοποιημένου ή υπό κομποστοποίηση δυόσμου στο έδαφος σε σχέση με το αρχικό αιθέριο έλαιο που αποστάζεται από αποξηραμένη φυτική ύλη πιθανώς να εξηγεί αυτές τις διαφορές. Η άποψη αυτή ενισχύεται από τα αποτελέσματα του κεφαλαίου 3, όπου διαπιστώθηκε ποιοτική αλλαγή στο έλαιο που αποστάχθηκε από έδαφος αναμεμιγμένο με φυτικό υλικό δυόσμου, αποδόμηση της καρβόνης και ποσοστιαία κυριαρχία των σεσκιτερπενίων, ουσιών στις οποίες έχει αποδοθεί και δράση ρυθμιστών αύξησης. Βέβαια, για την επιβεβαίωση της εκδοχής 116

126 αυτής θα πρέπει να μελετηθεί in vitro η επίδραση αιθερίου ελαίου που θα αποσταχθεί από κομποστοποιήσιμο φυτικό υλικό δυόσμου αναμεμιγμένου με έδαφος στη βλαστική ικανότητα, στη φυτρωτική ικανότητα και στην ανάπτυξη της τομάτας. Στο μέλλον θα πρέπει να μελετηθεί η επίδραση του αιθερίου ελαίου δυόσμου και της καρβόνης στη βλαστική ικανότητα και άλλων ποικιλιών τομάτας, οι οποίες πιθανόν θα είναι λιγότερο ευαίσθητες από την χρησιμοποιηθείσα στην παρούσα εργασία. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας σχετικά με τη δραστικότητα των αιθερίων ελαίων και των συστατικών τους εναντίον ζιζανίων και καλλιεργούμενων φυτών είναι σε συμφωνία με αυτά των Dudai et al. (2000a), οι οποίοι αναφέρουν ότι τα αιθέρια έλαια που αποστάχθηκαν από τα αρωματικά φυτά C. citrates, M. fruticosa και O. syriacum ήταν ισχυροί αναστολείς της βλαστικής ικανότητας σπόρων σιταριού, αφού προκάλεσαν >50% αναστολή της βλαστική ικανότητάς τους σε συγκεντρώσεις nl/ml. Οι Vokou and Margaris (1986) αναφέρουν ότι το αιθέριο έλαιο του αρωματικού φυτού Thymus capitatus L. είναι ιδιαίτερα τοξικό στη βλαστική ικανότητα των δικών του σπόρων. Οι ίδιοι ερευνητές υποστηρίζουν ότι για την εκδήλωση αλληλοπάθειας από τα αρωματικά φυτά είναι αναγκαία η προσρόφηση των πτητικών ελαίων τους στα κολλοειδή του εδάφους. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας είναι συγκρίσιμα με αυτά των άλλων ερευνητών. Ειδικότερα, Οι Azirak and Caraman (2008) αναφέρουν ότι συγκεντρώσεις 3, 6, 10 και 20 μl/τρυβλίο του αιθερίου ελαίου του δυόσμου προκάλεσαν σημαντική φυτοτοξικότητα σε σπόρους των ζιζανίων A. pallida, A. retroflexus, C. salsotitialis, R. raphanistrum, R. nepalensis, S. arvensis και S. oleraceus. Παρόμοια συμπεριφορά εκδήλωσε και η καρβόνη σε συγκεντρώσεις 62.5, 125, 250 και 500 μg/ml. Τα ζιζάνια εναντίον των οποίων ελέγχθηκε η φυτοτοξική ικανότητα του αιθερίου ελαίου δυόσμου και της καρβόνης ήταν διαφορετικά από αυτά των Azirak and Caraman (2008), αλλά κάποιες από τις συγκεντρώσεις με ζιζανιοκτόνο δράση είναι παρόμοιες. Η μειωμένη ευαισθησία του κόκκινου ρυζιού στην παρούσα εργασία συμφωνούν με αυτά των Argyropoulos et al. (2008), οι οποίοι βρήκαν ότι το ζιζάνιο αυτό είναι από τα πλέον ανθεκτικά στα αιθέρια έλαια μεταξύ των οποίων και του δυόσμου. Ο μηχανισμός και τρόπος δράσης των αιθερίων ελαίων εναντίον σπόρων ζιζανίων και καλλιεργούμενων φυτών δεν έχει αποσαφηνιστεί. Οι Dudai et al. (2000b) αναφέρουν ότι τα μονοτερπένια, βασικά συστατικά των αιθερίων ελαίων, επιδρούν στους σπόρους των φυτών σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις και ότι η 117

127 συγκέντρωσή τους στα διάφορα μέρη των σπόρων σιταριού διαφέρει. Τα μονοτερπένια είναι οι σημαντικότερες αλληλοπαθητικές ενώσεις που παράγονται κυρίως σε περιοχές με θερμό και ξηρό κλίμα και διαμέσου της πτητικής τους φύσης (υψηλή τάση των ατμών τους) διεισδύουν στο έδαφος και επηρεάζουν δυσμενώς την αύξηση των φυτών (Scrivanti et al. 2003). Αυτά παράγονται από διάφορα γένη αρωματικών φυτών όπως τα Μentha, Origanum, Thymbra, Thymus και ενισχύουν τη χημική άμυνα των φυτών αυτών εναντίον διαφόρων μικροοργανισμών (Azirak and Karaman 2008). Η φυτοτοξική δράση του αιθερίου ελαίου του δυόσμου και της καρβόνης μπορεί να αποδοθεί σε ανατομικές και φυσιολογικές καταπονήσεις στις οποίες υποβάλλονται οι σπόροι και τα αρτίβλαστα (Μuller et al. 1969, Rai et al. 2003). Ειδικότερα, οι Lorber and Muller (1976) αναφέρουν ότι η μείωση στον αριθμό και στην ποικιλομορφία των κυτταρικών οργανιδίων, συμπεριλαμβανομένων και των μιτοχονδρίων, καθώς και η αποδόμηση των μεμβρανών που περιβάλλουν τον πυρήνα, τα μιτοχόνδρια και τα δικτυοσωμάτια οδηγούν σε δομική κατάρρευση και σε ανατομικές αλλαγές που τελικώς εξηγούν την αναστολή της αύξησης των ριζών κρεμμυδιού (Allium cepa L.) από αιθέρια έλαια. Επίσης, η συσσώρευση ελευθέρων λιπιδίων εντός των κυττάρων και η μείωση της μεταφοράς οξυγόνου (Μuller et al. 1969), αλλά και η αναστολή του ανοίγματος των στοματίων στα κουκιά (Vicia faba L.) (Rai et al. 2003) είναι συνέπεια της δράσης διαφόρων αιθερίων ελαίων. Ο επιτυχής και εμπορικώς αποδεκτός έλεγχος ζιζανίων με τη χρήση αλληλοπαθητικών ουσιών στον αγρό θα πρέπει να συνδυάζεται με αναστολή στη φυτρωτική ικανότητα αρκετών ειδών ζιζανίων και ταυτόχρονα χωρίς τοξική επίδραση στο καλλιεργούμενο φυτό. Βέβαια, τα in vitro αποτελέσματα της χρήσης αλληλοπαθητικών ουσιών θα πρέπει να επιβεβαιώνονται και σε επίπεδο αγρού προκειμένου να προσδιορίζεται η ποσότητα των αλληλοπαθητικών μονοτερπενίων που απελευθερώνεται στο έδαφος από τα αρωματικά φυτά και η επάρκειά της να αναστέλλει τη φυτρωτική ικανότητα ή την αύξηση διαφορετικών ζιζανίων. Tα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας δείχουν ότι το αιθέριο έλαιο δυόσμου ή η καρβόνη μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φυσικώς συντιθέμενα ζιζανιοκτόνα σε καλλιέργεια τομάτας. Η εφαρμογή θα πρέπει να γίνεται σε κατάλληλη χρονική στιγμή πριν τη μεταφύτευση ώστε να αναστέλλεται η φυτρωτική ικανότητα ζιζανίων αλλά να μην επηρεάζεται δυσμενώς η ανάπτυξη της μεταφυτευόμενης τομάτας. Θα πρέπει δηλαδή το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί 118

128 από την εφαρμογή του αιθερίου ελαίου δυόσμου ή της καρβόνης μέχρι τη μεταφύτευση της τομάτας να είναι αρκετό ώστε αυτά να έχουν αποδομηθεί (Κεφάλαιο 3). Η έρευνα αυτή δείχνει ότι το αιθέριο έλαιο του δυόσμου και η καρβόνη πιθανόν να έχουν την ικανότητα να ελέγχουν και στον αγρό κάποια ζιζάνια σε καλλιέργειες τομάτας. Αυτό σημαίνει ότι θα πρέπει να διερευνηθεί η πιθανότητα εξεύρεσης κατάλληλων ποικιλιών τομάτας, οι οποίες δεν θα επηρεάζονται από τη χρήση αυτών των ουσιών. 119

129 6. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Πίνακας Π.4.1. Συνδυασμένη ανάλυση παραλλακτικότητας της φυτρωτικότητας, του μήκους ριζιδίου, του μήκους υποκοτυλίου, καθώς και του νωπού βάρους αρτίβλαστων των ζιζανίων αγριοβαμβακιά (A. theofrasti), τάτουλας (D. stramonium), κόκκινο ρύζι (O. sativa), φάλαρη (P. paradoxa) και της τομάτας (L. esculentum), όπως επηρεάστηκαν από την εφαρμογή αιθερίου ελαίου δυόσμου (M. spicata) και του κύριου συστατικού του, της καρβόνης. Σημαντικότητα του F Πηγή παραλλακτικότητας B.E. Βλαστική ικανότητα Μήκος ριζιδίου Μήκος υποκοτυλίου Νωπό βάρος αρτίβλαστων Επαναλήψεις 2 NS NS NS NS Ελεγχόμενο φυτό (W) 4 ** ** ** ** Eλεγχόμενη ουσία (S) 1 ** ** ** ** Συγκέντρωση εφαρμογής (C) 4 ** ** ** ** W x S 4 ** ** ** ** W x C 16 ** ** ** ** S x C 4 ** ** ** ** W x S x C 16 ** ** ** ** Σφάλμα 99 CV, % *P 0.05 **P 0.01 ΒΕ = Βαθμοί ελευθερίας NS = not significant 120

130 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΚΑΙ ΜΟΝΟΤΕΡΠΕΝΙΩΝ ΣΤΗΝ ΑΥΞΗΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΛΙΩΝ ΚΑΙ ΣΤΗ ΣΠΟΡΙΟΠΟΙΗΣΗ ΕΔΑΦΟΓΕΝΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ 121

131 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Διερευνήθηκε η επίδραση αιθερίων ελαίων και μονοτερπενίων τους εναντίον εδαφογενών μυκήτων (μεμονωμένα ή σε μίγματά τους) σε in vitro πειράματα (σε τρυβλία) και στο έδαφος. Τα αιθέρια έλαια που χρησιμοποιήθηκαν αποστάχθηκαν από τα αρωματικά φυτά δυόσμο (M. spicata), λεβάντα (L. stoechas), ρίγανη (O. vulgare subsp. hirtum) και φασκόμηλο (S. fruticosa). Τα μονοτερπένια που δοκιμάστηκαν ήταν η καρβόνη, η φεγχόνη, η καρβακρόλη, η 1,8-κινεόλη, το α- πινένιο και η τερπινεν-4-όλη. Μελετήθηκε η επίδραση των προαναφερθέντων ουσιών στην ανάπτυξη του μυκηλίου και στη σποριοποίηση των μυκήτων Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae, οι οποίοι απομονώθηκαν από αγρό όπου καλλιεργούνταν τομάτα με βιολογικό τρόπο. Όλα τα αιθέρια έλαια και τα μονοτερπένιά τους ανέστειλαν την ανάπτυξη του μυκηλίου σε όλους τους μύκητες και τη σποριοποίηση στους περισσότερους από αυτούς. Η μεγαλύτερη μείωση στην ανάπτυξη μυκηλίου προκλήθηκε από την εφαρμογή των αιθερίων ελαίων της ρίγανης και του δυόσμου, καθώς και από τα μονοτερπένια καρβακρόλη και καρβόνη, που είναι αντιστοίχως, τα κύρια συστατικά των προηγούμενων ελαίων. Η σποριοποίηση των μυκήτων μειώθηκε ή αυξήθηκε, κατά περίπτωση. Ειδικότερα, η παραγωγή κονιδίων αυξήθηκε από όλες τις δόσεις του α-πινενίου στον Penicillium sp. και του αιθερίου ελαίου του φασκόμηλου στον F. οxysporum. Σε κάποιες άλλες περιπτώσεις, σημειώθηκε θετική επίδραση στη σποριοποίηση του F. οxysporum από την κινεόλη και την καρβόνη, καθώς και των Aspergillus sp. και V. dalhiae από το αιθέριο έλαιο της λεβάντας. Η αντιμυκητιακή δραστικότητα ήταν είτε μυκητοστατική εναντίον των Aspergillus και F. oxysporum, καθώς η ανάπτυξη του μυκηλίου τους ανακτήθηκε έπειτα από την αφαίρεση του παράγοντα αναστολής, είτε μυκητοκτόνος όπως εναντίον του V. dalhiae κυρίως στις δύο μεγαλύτερες δόσεις. Πειράματα όπου και οι τέσσερις μύκητες εμβολιάσθηκαν στο έδαφος και αφέθηκαν να επωασθούν, έδειξαν ότι ο V. dalhiae ήταν ο πλέον ευαίσθητος μύκητας στην παρουσία καρβακρόλης ή καρβόνης, με την ανάπτυξή του να αναστέλλεται πλήρως σε όλες τις δόσεις που δοκιμάσθηκαν, ενώ ο Aspergillus sp. ήταν ο πλέον ανθεκτικός. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ισχυρή επίδραση και επιλεκτική δράση των αιθερίων ελαίων και των μονοτερπενίων εναντίον εδαφογενών μυκήτων, οι οποίοι μπορεί να είναι παθογόνοι και να επιφέρουν σημαντικές απώλειες σε καλλιέργεια τομάτας. Αξιοσημείωτη είναι η απόλυτη αναστολή της ανάπτυξης του V. dalhiae, ενός από τους πλέον δύσκολα 122

132 ελεγχόμενους μύκητες, αφού για την καταπολέμησή του οι εφαρμοζόμενες μέθοδοι είναι ανεπαρκείς. Επιπλέον, η θετική επίδραση στη σποριοποίηση που παρουσιάστηκε σε αρκετές περιπτώσεις θα μπορούσε να ελεγχθεί και προκειμένου για ωφέλιμα στελέχη μυκήτων, τα οποία δυνητικά ελέγχουν ζημίες, με μηχανισμούς ανταγωνιστικότητας ή με παραγωγή αντιβιοτικών. 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα φυτά παράγουν πληθώρα δευτερογενών μεταβολιτών. Είναι πλέον αποδεκτό ότι σημαντικό μέρος των οργανικών αυτών ενώσεων αποτελεί μέρος της χημικής άμυνας των φυτών εναντίον μικροβιακών προσβολών (Dixon 2001). Σύγχρονες ερευνητικές τάσεις εστιάζονται στη δραστικότητα ενώσεων που απομονώνονται από φυτικά είδη και στη χρήση τους ως εναλλακτικών των χημικώς συντιθέμενων μυκητοκτόνων με σκοπό την καταπολέμηση παθογόνων μικροοργανισμών. Η μεταστροφή αυτή στην έρευνα προέκυψε από την ανάπτυξη ανθεκτικότητας πολλών παθογόνων μικροοργανισμών στα χημικώς συντιθέμενα μυκητοκτόνα (Holmes and Eckert 1999, Hunter and Reeves 2002) και της αρνητικής επίδρασής τους σε ωφέλιμους οργανισμούς. Επιπλέον, η χρήση σημαντικού αριθμού χημικώς συντιθέμενων μυκητοκτόνων έχει περιοριστεί ή και απαγορευτεί σε πολλές χώρες επειδή θεωρούνται ύποπτα εισαγωγής στην τροφική μας αλυσίδα (Wilson et al. 1997, Sokovic and Griensven 2006). Η ανάγκη για εξεύρεση ασφαλέστερων εναλλακτικών μεθόδων φυτοπροστασίας ολοένα και αυξάνει. Φυσικώς συντιθέμενα μυκητοκτόνα, που βασίζονται σε δευτερογενείς φυτικούς μεταβολίτες θα μπορούσαν να προταθούν ως εναλλακτικές φυτοπροστατευτικές ουσίες, ιδιαίτερα χρήσιμες στη βιολογική γεωργία. Τα αιθέρια έλαια είναι μίγματα ισοπρενοειδών ενώσεων, χαμηλού μοριακού βάρους, στα οποία εξάλλου οφείλεται και ο αρωματικός τους χαρακτήρας. Αποτελούν μια ετερογενή ομάδα, της οποίας η ποιότητα και η ποσότητα ποικίλλει ανάλογα με τα στάδια ανάπτυξης, τις οικολογικές συνθήκες και άλλους παράγοντες του φυτού από το οποίο αποστάζεται το αιθέριο έλαιο (Pareek et al. 1980, Gulati 1980, Philip and Damodaran 1985, Maheshwari et al. 1986). Χάρη στα βιοδραστικά συστατικά τους, τα αιθέρια έλαια αποτελούν ελπιδοφόρα μικροβιοκτόνα σκευάσματα στη φαρμακολογία, στην κλινική και στην ιατρική μικροβιολογία, στη συντήρηση των 123

133 τροφίμων, στη φυτοπαθολογία, κ.α. Στη βιβλιογραφία υπάρχουν πολλές εργασίες που ασχολούνται με τις αντιμικροβιακές ιδιότητες των αιθερίων ελαίων εναντίον παθογόνων βακτηρίων και μυκήτων (Beylier 1979, Morris et al. 1979, Deans and Richie 1987, Knobloch et al. 1989, Cosentino et al. 1999, Hammer et al. 1999, Karamanoli et al. 2000, Mourey and Canillac 2002, Daferera et al. 2003). Η χρήση τους ως φυτοπροστατευτικών ουσιών θεωρείται γενικά λιγότερο επιβλαβής από ότι αυτή των χημικώς συντιθέμενων χημικών φαρμάκων (Sokovic and Griensven 2006), εξαιτίας της φυσικής τους προέλευσης, η οποία τα καθιστά ασφαλέστερα για το περιβάλλον. Επιπλέον, οι χημικές τους ιδιότητες δεν επιτρέπουν στα παθογόνα να αναπτύξουν εύκολα αντοχή σε ένα μίγμα συστατικών, στο οποίο μπορεί να εκδηλώνονται διαφορετικοί μηχανισμοί αντιμικροβιακής δράσης (Daferera et al. 2003). Ένα επιπρόσθετο πλεονέκτημα της χρήσης τους ως φυσικών μικροβιοκτόνων είναι η πτητικότητά τους, εξαιτίας της οποίας ελάχιστα ή καθόλου υπολείμματα παραμένουν στο φυτικό κεφάλαιο και γενικότερα στο περιβάλλον μετά την εφαρμογή τους. Το έδαφος φιλοξενεί έναν τεράστιο αριθμό μυκήτων. Συγκεκριμένα για τα γένη των μυκήτων που θα μελετηθούν στην παρούσα εργασία, τα Fusarium και Verticillium προσβάλλουν τα καλλιεργούμενα φυτά (Woltz and Jones 1981), ενώ τα Aspergillus και Penicillium μπορούν να προκαλέσουν σημαντικές απώλειες της παραγωγής ως μετασυλλεκτικά παθογόνα (Snowdon 1991, Gullino et al. 2002). Εντούτοις ορισμένα στελέχη των προαναφερθέντων μυκήτων μπορούν να δράσουν και ως βιολογικοί παράγοντες ελέγχου εναντίον άλλων εδαφογενών παθογόνων (Kiss 2003, Alabouvette et al. 1998). Διάφορα στελέχη μυκήτων είναι ευαίσθητα στην παρουσία των αιθερίων ελαίων, αλλά παρουσιάζουν έναν παραλλάσοντα βαθμό αναστολής που εξαρτάται από τη χημική σύσταση των ελαίων στα οποία εκτίθενται (Müller-Riebau et al. 1995, Alvarez-Castellanos et al. 2001, Singh et al. 2002). Διάφορα είδη του γένους Aspergillus είναι ευαίσθητα στην έκθεσή τους σε αιθέρια έλαια. Για παράδειγμα, η μυκηλιακή ανάπτυξη του A. niger μειώθηκε από το αιθέριο έλαιο του φυτού Dennetia tripetala (pepperfruit) (Ejechi et al. 1999), του A. ochraceus από το αιθέριο έλαιο της ρίγανης, του δυόσμου, του βασιλικού, του φασκόμηλου και του κορίανδρου (Basílico and Basílico 1999), ενώ του A. parasiticus από το αιθέριο έλαιο του θυμαριού, του κύμινου, του γαρύφαλλου, του δενδρολίβανου και του φασκόμηλου (Farag et al. 1989). Ο τελευταίος μύκητας 124

134 ανέστειλε τελείως την ανάπτυξή του παρουσία θυμόλης σε συγκέντρωση 500μg/ml θρεπτικού υλικού (Buchanan and Shepherd 1981). Όσον αφορά τον Fusarium, οι Daferera et al. (2003) αναφέρουν απόλυτη αναστολή της ανάπτυξής του Fusarium solani var. coeruleum in vitro από τα αιθέρια έλαια της ρίγανης, του δίκταμου, της μαντζουράνας, της λεβάντας, του δενδρολίβανου και του φασκόμηλου. Επιπροσθέτως, οι Pawar and Thaker (2007) αναφέρουν πως μεταξύ 75 αιθερίων ελαίων που μελέτησαν, επτά (από τα κύμινο, λεμονόχορτο, κανέλλα, κάσσια (cassia fennel), περγαμόντο, δάφνη και βασιλικό), εκδήλωσαν μέτρια προς ισχυρή ανασταλτική επίδραση, ενώ τα υπόλοιπα ήταν σχεδόν αδρανή. Αντιθέτως, οι Duru et al. (2003) παρατήρησαν πως αιθέρια έλαια του φυτού Pistacia sp. προάγουν την in vitro αύξηση του μύκητα F. sambucinum. Αναφορικά με τον Penicillium, το ξηρό βάρος μυκηλίου των P. aurantiogriseum και P. viridicatum μειώθηκε σημαντικά in vitro υπό την επίδραση % καθενός από τα αιθέρια έλαια ευκάλυπτου, δενδρολίβανου και αρτεμισίας (Khaddor et al. 2006), ενώ η μυκηλιακή ανάπτυξη, η παραγωγή και η βλάστηση κονιδίων του P. digitatum αναστάλθησαν παρουσία μg/ml αιθερίου ελαίου ρίγανης, θυμαριού, δίκταμου και μαντζουράνας (Daferera et al. 2000). Η αντιμυκητιακή δράση των αιθερίων ελαίων εναντίον του Verticillium sp. έχει μελετηθεί ελάχιστα. Οι Sokovic and Griensven (2006), αναφέρουν πως μεταξύ δέκα διαφορετικών αιθερίων ελαίων που μελέτησαν, μόνο αυτά της ρίγανης, του θυμαριού και του δυόσμου προκάλεσαν ισχυρή in vitro δράση ενανίον του V. fungicola. Γενικά, η αντιμυκητιακή και η αντιβακτηριακή δραστικότητα των αιθερίων ελαίων έχει συσχετισθεί από τους προαναφερθέντες και από άλλους ερευνητές (Vokou 1999, Karamanoli et al. 2000, Kalemba and Kunicka 2003), με την ύπαρξη των οξυγονούχων μονοτερπενίων που περιέχουν. Στη βιβλιογραφία υπάρχει πληθώρα εργασιών που σχετίζονται με την επίδραση των αιθερίων ελαίων και των συστατικών τους στην ανάπτυξη του μυκηλίου των μυκήτων, η οποία αποτελεί τη συνήθη παράμετρο εκτίμησης της δράσης τους. Η σποριοποίηση, η οποία διαδραματίζει σημαντικότατο ρόλο στο βιολογικό κύκλο των μυκήτων, έχει μελετηθεί ελάχιστα (Tantaoui-Eleraki et al. 1994, Rahman et al. 2004, Kuate et al. 2006). Περιορισμένος επίσης αριθμός εργασιών αναφέρεται σε τυχόν αναστροφή της αναστολής που τα αιθέρια έλαια προκαλούν. Επιπροσθέτως, δεν έχει διερευνηθεί η επίδραση των αιθερίων ελαίων εναντίον μίγματος μυκήτων σε εδαφικό περιβάλλον, έτσι ώστε οι τυχόν ανταγωνιστικές ή 125

135 συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μυκήτων να περιλαμβάνονται και να μελετώνται. Για τους λόγους αυτούς, θεωρήσαμε σημαντική την επιπλέον έρευνα της αντιμυκητιακής δραστικότητας επιλεγμένων αρωματικών φυτών, που είναι ευρέως εξαπλωμένα στον Ελλαδικό-Μεσογειακό χώρο, είναι πλούσια σε αιθέρια έλαια και που κάποια από αυτά καλλιεργούνται πλέον συστηματικά. Οι εδαφογενείς μύκητες που μελετήθηκαν, απομονώθηκαν από βιολογική καλλιέργεια τομάτας και ανήκαν στα γένη Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae, από τους πιο κοινούς αποικιστές του εδάφους και δυνητικά φυτοπαθογόνα ή σαπρόφυτα της καλλιέργειας αυτής. Η παρούσα εργασία εστιάστηκε στο να: i) απομονώσει φυσικούς πληθυσμούς εδαφογενών μυκήτων από καλλιέργεια τομάτας όπου επί σειρά ετών εφαρμoζόταν βιολογική μέθοδος καλλιέργειας και να διερευνήσει την εναντίον τους δραστικότητα αιθερίων ελαίων προερχόμενων από τέσσερα αρωματικά φυτά, που αναπτύσσονται στον Ελλαδικό χώρο καθώς και των κύριων συστατικών τους και να ii) προσδιορίσει αν η αντιμυκητιακή δράση των αιθερίων ελαίων οφείλεται στα κύρια συστατικά τους. Στόχος της εργασίας ήταν να μελετηθεί κατά πόσον τα εκχυλίσματα των αρωματικών φυτών και των συστατικών τους θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στον έλεγχο μυκήτων σε καλλιέργειες βιολογικής γεωργίας. 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1. Παραλαβή αιθερίων ελαίων-χημική ανάλυση δευτερογενών μεταβολιτών Το φυτικό υλικό των αρωματικών φυτών δυόσμου (M. spicata), λεβάντας (L. stoechas), ρίγανης (O. vulgare subsp. hirtum) και φασκόμηλου (S. fruticosa) που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα έρευνα αγοράστηκε από το εμπόριο ή συλλέχθηκε από φυσικούς πληθυσμούς τους στην ευρύτερη περιοχή του Νομού Θεσσαλονίκης. Για κάθε αρωματικό φυτό, 50 g φυτικoύ υλικού αποτελούμενο από φύλλα, βλαστούς και άνθη, τοποθετήθηκε σε φιάλη 2 L η οποία περιείχε 1.5 L απεσταγμένο νερό. Το υλικό αποστάχθηκε επί 3 ώρες, σε συσκευή Clevenger, παραλήφθηκαν τα αιθέρια έλαια και υπολογίστηκε η συγκέντρωσή τους. Στη συνέχεια αποξηράνθηκαν πάνω 126

136 από άνυδρο Na 2 SO 4, και τοποθετήθηκαν σε σκουρόχρωμα μπουκάλια, στους C. Για τον ποσοτικό και ποιοτικό προσδιορισμό των επιμέρους συστατικών των αιθερίων ελαίων χρησιμοποιήθηκε αέριος χρωματoγραφία (Varian 3700). Οι συνθήκες εργασίας έχουν περιγραφεί νωρίτερα (Vokou et al. 1993). Τα κύρια συστατικά των αιθερίων ελαίων ταυτοποιήθηκαν με βάση τον χρόνο έκλουσής τους και προηγούμενες έρευνες αναφορικά με το χημικό προφίλ του αιθερίου ελαίου του δυόσμου (Kokkini and Vokou 1989), της λεβάντας (Vokou et al. 2002), της ρίγανης (Vokou et al. 1993) και του φασκόμηλου (Karousou et al. 1998). Εκτός από τα αιθέρια έλαια, έξι μονοτερπένια (καρβόνη, φεγχόνη, καρβακρόλη, 1,8-κινεόλη, α-πινένιο και τερπινεν-4-όλη) αγοράστηκαν από το εμπόριο και χρησιμοποιήθηκαν επίσης στα πειράματα. Τα τέσσερα πρώτα αποτελούν τα κύρια συστατικά των αιθερίων ελαίων δυόσμου, λεβάντας, ρίγανης, και φασκόμηλου, αντιστοίχως. Τα δύο τελευταία επιλέχθηκαν όχι μόνον γιατί αποτελούν κοινά συστατικά των αιθερίων ελαίων, αλλά ακόμη επειδή αντιπροσωπεύουν διαφορετικές χημικές ομάδες από τα προηγούμενα. Συγκεκριμένα, οι έξι πρότυπες ουσίες αντιπροσωπεύουν τις ομάδες των φαινολών (καρβακρόλη), των κετονών (καρβόνη, φεγχόνη), των αιθέρων (κινεόλη), των υδρογονανθράκων (α-πινένιο) και των αλκοολών (τερπινεν-4-όλη) Εργαστηριακός έλεγχος αντιμυκητιακής δράσης αιθερίων ελαίων και των κύριων συστατικών τους Απομόνωση μυκήτων από καλλιέργεια τομάτας Οι εδαφογενείς μύκητες απομονώθηκαν από αγρόκτημα όπου επί σειρά ετών καλλιεργούνταν τομάτα με βιολογικό τρόπο (περιοχή Κρύας Βρύσης νομού Πέλλας). Η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε διαγράφοντας πορεία σε σχήμα W στον αγρό, συλλέγοντας είκοσι ίσου όγκου δείγματα εδάφους με τη βοήθεια δειγματολήπτη από τα 20 επιφανειακά εκατοστά του εδάφους. Τα δείγματα αναμίχθηκαν (bulk soil sample) και ξηράνθηκαν με φυσικό τρόπο. Στη συνέχεια παραλήφθησαν οι μύκητες με τη μέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων (Τuite 1969) σε θρεπτικό υπόστρωμα Water Agar (WA) έτσι όπως περιγράφεται αναλυτικά στην 3.4 του Kεφαλαίου 1. Για την παραλαβή των μυκήτων χρησιμοποιήθηκαν τα στερεά θρεπτικά υποστρώματα Czapek Dox Agar (CDA) και Water Agar (WA) που επίσης περιγράφονται αναλυτικά στην 3.4 του Kεφαλαίου 1. Η τεχνική των διαδοχικών αραιώσεων δίνεται μόνο ως μια γενική απεικόνιση της τεχνικής, ενώ ο τελικός αριθμός των διαδοχικών 127

137 αραιώσεων εξαρτήθηκε κάθε φορά από τον μυκητολογικό πληθυσμό. Μετά την επώασή τους, οι μύκητες που αναπτύχθηκαν απαριθμήθηκαν, μεταφέρθηκαν μέσα σε γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες, που περιείχαν CDA και διατηρήθηκαν σε ψυχρό θάλαμο (4 0 C). Στη συνέχεια για να ταυτοποιηθούν ή να χρησιμοποιηθούν οι μύκητες μεταφέρθηκαν σε τρυβλία petri που περιείχαν CDA, ώστε να αναπτυχθούν εκ νέου σε καθαρές καλλιέργειες με επώαση στους 22 0 C. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των αποικιών καταγράφηκαν ο ρυθμός ανάπτυξης και ο χρόνος σποριοποίησής τους. Μετά την έναρξη σποριοποίησης έγινε προσπάθεια ταυτοποίησης σε οπτικό μικροσκόπιο, είτε με απευθείας παρατήρηση του μυκηλίου και των καρποφοριών του κάθε μύκητα από το τρυβλίο, είτε μέσω παρασκευάσματος σε σταγόνα λακτοφαινόλης. Κατά τη μικροσκοπική παρατήρηση εξετάστηκε η μορφή και το σχήμα των καρποφοριών και των σπορίων του κάθε μύκητα, ενώ μακροσκοπικά παρατηρήθηκε στα τρυβλία το χρώμα και η μορφή της αποικίας, η ομοιομορφία της ανάπτυξης και ο ρυθμός αύξησης των μυκήτων. Η ταυτοποίηση των μυκήτων έγινε στη συνέχεια με τη βοήθεια κλειδών προσδιορισμού. Έπειτα από την απομόνωση και την ταυτοποίησή τους, επιλέχθηκαν τέσσερις μύκητες: οι φυτοπαθογόνοι Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae, οι οποίοι ανιχνεύονται συχνά στη ριζόσφαιρα των φυτών. Σπόρια των προαναφερθέντων μυκήτων παραλήφθησαν από μονόσπορες καλλιέργειές τους και οι νέες καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα CDA στους 5 0 C Προετοιμασία μολύσματος κονιδίων Τα κονίδια συλλέχθηκαν από καλλιέργειες ηλικίας μιας εβδομάδας σε CDA για τους μύκητες F. oxysporum, Aspergillus sp. και Penicillium sp. και από καλλιέργεια δύο εβδομάδων για τον V. dalhiae. Στην επιφάνεια κάθε τρυβλίου τοποθετήθηκαν 10ml απεσταγμένο νερό με 0.05% γαλακτωματοποιητή Tween 80 και τα κονίδια αποκολλήθηκαν από το μυκήλιο κάθε αποικίας με τη βοήθεια μηχανικής τριβής με γυάλινη ράβδο. Στη συνέχεια το εναιώρημα σπορίων φιλτραρίστηκε μέσω τετραπλής αποστειρωμένης γάζας προκειμένου να αφαιρεθούν τα υπολείμματα των μυκηλιακών υφών και φυγοκεντρήθηκε στις 6000 στροφές/min για 10min. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε ενώ το ίζημα ως εναιώρημα σε 0.05% Τween 80, αναδεύτηκε για λίγα λεπτά. Ο αριθμός των κονιδίων υπολογίσθηκε με αιματοκυττόμετρο. 128

138 Τεχνική διάχυσης από εμποτισμένους χάρτινους δίσκους Η αντιμυκητιακή δράση των αιθερίων ελαίων καθώς και των κύριων συστατικών τους εκτιμήθηκε με βάση την τεχνική διάχυσης από εμποτισμένους χάρτινους δίσκους. Οι παράμετροι που αξιολογήθηκαν ήταν η ανάπτυξη του μυκηλίου κάθε μύκητα, η ικανότητα σποριοποίησής του, καθώς και η ικανότητα επανάκτησης της ανάπτυξης του μυκηλίου του. Η τελευταία παράμετρος εφόσον παρατηρήθηκε, θεωρήθηκε ως μυκητοστατική δράση των υπό μελέτη ουσιών. Xρησιμοποιήθηκε η τεχνική επίστρωσης (overlaying, Aggarwal et al. 2002), σύμφωνα με την οποία παρασκευάσθηκε χαλαρό υπόστρωμα CDA (0.8% άγαρ), αποστειρώθηκε και τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο. Όταν η θερμοκρασία του έγινε 40 ο C, μολύνθηκε με διάλυμα κονιδίων, ώστε να επιτευχθεί επιθυμητή συγκέντρωση (5 x 10 5 κονίδια/ml). Ποσότητα 5ml επιστρώθηκε στην επιφάνεια αποστειρωμένων τρυβλίων 90 mm τα οποία περιείχαν το καθένα 15 ml CDA ως στερεοποιημένο υπόστρωμα. Χάρτινοι αποστειρωμένοι δίσκοι Whatman No. 5, διαμέτρου 5 mm, τοποθετήθηκαν στο κέντρο της επιφάνειας κάθε τρυβλίου και πιέστηκαν ελαφρά ώστε να εξασφαλιστεί καλή επαφή με το εμβολιασμένο υπόστρωμα. Στη συνέχεια οι χάρτινοι δίσκοι εμποτίσθηκαν με τα αιθέρια έλαια ή με τα κύρια συστατικά τους. Τα τρυβλία σφραγίστηκαν με πλαστική μεμβράνη (parafilm) για να αποφευχθεί η εξάτμιση των ουσιών και επωάσθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης στους 22 ± 1 o C, για 6-8 ημέρες. Για κάθε αιθέριο έλαιο ή κύριο συστατικό του εξετάστηκαν 3 δόσεις: 1, 5 και 10 μl (ανά δίσκο) σε πλήρως τυχαιοποιημένη διάταξη (πλήρως τυχαιοποιημένες ομάδες), ενώ όλες οι επεμβάσεις επαναλήφθηκαν 3 φορές. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο όγκος του τρυβλίου είναι περίπου 100 cm 3, οι προηγούμενες δόσεις αντιστοιχούν σε συγκέντρωση 10, 50 και 100 ppm πτητικών ενώσεων, αντιστοίχως. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν για κάθε μύκητα τρυβλία όπου οι χάρτινοι δίσκοι εμποτίσθηκαν με αντίστοιχες ποσότητες αποστειρωμένου H 2 O Αναστολή ανάπτυξης μυκηλίου H αντιμυκητιακή δράση εμφανίστηκε ως δακτύλιος αναστολής της μυκηλιακής ανάπτυξης γύρω από τους εμποτισμένους χάρτινους δίσκους (Εικόνα 5.1). Προκειμένου να μετρηθεί η αναστολή της ανάπτυξης μυκηλίου με τη βοήθεια χάρακα σχεδιάστηκαν στο εξωτερικό της βάσης κάθε τρυβλίου δύο ακτίνες, που σχημάτιζαν γωνία 90 o με σημείο εκκίνησης 129

139 Εικόνα 5.1. Έλεγχος αντιμυκητιακής δράσης αιθερίων ελαίων εναντίον του μύκητα Aspergillus sp. με την τεχνική διάχυσης από εμποτισμένους χάρτινους δίσκους. Στους χάρτινους δίσκους της κάτω σειράς τρυβλίων τοποθετήθηκαν 1, 5 και 10 μl αιθερίου ελαίου ρίγανης, η επάνω σειρά τρυβλίων είναι οι αντίστοιχοι μάρτυρες. το κέντρο κάθε τρυβλίου. H ανάπτυξη του μυκηλίου υπολογίσθηκε ως ο μέσος όρος του μήκους των μυκηλιακών υφών, σε mm, κατά μήκος των δύο ακτίνων Αναστολή ικανότητας σποριοποίησης Ένα τεταρτημόριο θρεπτικού υποστρώματος από κάθε τρυβλίο μαζί με το υπερκείμενο μυκήλιο μεταφέρθηκε σε αποστειρωμένους δοκιμαστικούς σωλήνες, όγκου 50 ml, που έκλειναν ερμητικά. Αποστειρωμένο νερό (10 ml) προστέθηκε στους σωλήνες, οι οποίοι στη συνέχεια αναδεύτηκαν για 30 min στις 300 στροφές/min προκειμένου να αποκολληθούν τα κονίδια από την επιφάνεια του θρεπτικού υποστρώματος. Η πυκνότητα των κονιδίων εκτιμήθηκε με αιματοκυττόμετρο και τα αποτελέσματα εκφράσθηκαν ως κονίδια/cm 2 θρεπτικού υποστρώματος Ικανότητα επανάκτησης της μυκηλιακής ανάπτυξης Προκειμένου να προσδιοριστεί η μυκητοστατική ή η μυκητοκτόνος δράση των αιθερίων ελαίων και των κύριων συστατικών τους, αποκόπηκαν από κάθε τρυβλίο δίσκοι μυκηλίου διαμέτρου 5 mm από την άκρη του μυκηλίου που γειτνίαζε με την άλω αναστολής και τοποθετήθηκαν εκ νέου σε τρυβλία με αποστειρωμένο CDA. Στην περίπτωση που υπήρχε απόλυτη αναστολή της μυκηλιακής ανάπτυξης οι δίσκοι αποκόπηκαν από την περιφέρεια του τρυβλίου, όπου η πιθανότητα ύπαρξης μυκηλιακών υφών ήταν μεγαλύτερη. Τα τρυβλία επωάσθηκαν για 7 ημέρες στους 22±1 o C. Εφόσον μετά από πάροδο 7 ημερών δεν παρατηρήθηκε καμία περαιτέρω αύξηση του μυκηλιακού δίσκου, η επέμβαση του αιθερίου ελαίου ή του κύριου 130

140 συστατικού του κρίθηκε ως μυκητοκτόνος. Στην περίπτωση που παρατηρήθηκε έστω και ελάχιστη αύξηση του μυκηλιακού δίσκου, η επέμβαση κρίθηκε ως μυκητοστατική και εκτιμήθηκε η επανάκτηση της μυκηλιακής ανάπτυξης σε σχέση με το μάρτυρα, σύμφωνα με την εξίσωση: % Επανάκτηση = [(T/C) X 100], όπου C, ο μέσος όρος του μήκους των μυκηλιακών υφών (mm) στα τρυβλία-μάρτυρες, T, ο μέσος όρος του μήκους των μυκηλιακών υφών (mm) μυκήτων που εκτέθηκαν στα αιθέρια έλαια ή στα κύρια συστατικά τους Αντιμυκητιακή δράση καρβόνης και καρβακρόλης στο έδαφος Για την εκτίμηση της αντιμυκητιακής δραστικότητας της καρβόνης (κύριου συστατικού του αιθερίου ελαίου δυόσμου) και της καρβακρόλης (κύριου συστατικού του αιθερίου ελαίου ρίγανης), εναντίον μίγματος των τεσσάρων μυκήτων στο έδαφος, 100 g αποστειρωμένου εδάφους τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένα γυάλινα δοχεία, όγκου 900 cm 3 και μολύνθηκαν με 15 ml αποστειρωμένου νερού που εμπεριείχε 5 x 10 5 κονίδια από τον καθένα μύκητα (Εικόνα 5.2). Η καρβόνη και η καρβακρόλη εφαρμόσθηκαν σε δόσεις 4.5, 22.5, 45 και 90 μl στα 100 g εδάφους ανά γυάλινο δοχείο. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο όγκος του γυάλινου δοχείου είναι περίπου 900 cm 3, αυτές οι δόσεις αντιστοιχούν σε συγκεντρώσεις 5, 25, 50 και 100 ppm. Επομένως τουλάχιστον οι δύο υψηλότερες δόσεις εφαρμογής των αιθερίων ελαίων και των κύριων συστατικών τους στα in vitro πειράματα στα τρυβλία (10, 50, 100 ppm) και στο έδαφος στα γυάλινα δοχεία, είναι συγκρίσιμες. Δοχεία με έδαφος χωρίς την προσθήκη καρβόνης ή καρβακρόλης, μολυσμένα με την ίδια συγκέντρωση σπορίων, χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες. Οι αρνητικοί μάρτυρες περιείχαν μόνο αποστειρωμένο έδαφος αναμεμιγμένο με αποστειρωμένο νερό. Όλες οι επεμβάσεις έγιναν σε τρεις επαναλήψεις. Τα δοχεία σφραγίσθηκαν με πλαστική μεμβράνη (parafilm) και επωάσθηκαν στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου o C), για τρεις εβδομάδες. Στο χρονικό διάστημα που μεσολάβησε, ο ρώγος του εδάφους διατηρήθηκε με την εβδομαδιαία προσθήκη 10 ml αποστειρωμένου νερού, και ακολούθως ανάδευση με αποστειρωμένη σπάτουλα. Στο τέλος κάθε εβδομάδας, δείγματα 10 g εδάφους από κάθε δοχείο αναλύονταν σύμφωνα με την τεχνική των διαδοχικών αραιώσεων (Τuite 1969), όπως αυτή περιγράφεται στην 3.4 του Kεφαλαίου 1. Ο συνολικός πληθυσμός κάθε μύκητα, εκπεφρασμένος ως CFU 131

141 Εικόνα 5.2. Αποστειρωμένα γυάλινα δοχεία με 100 g αποστειρωμένου εδάφους, εμβολιασμένα με μίγμα των μυκήτων Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae (5 x 10 5 κονίδια από τον κάθε μύκητα). Η καρβόνη και η καρβακρόλη προστέθηκαν σε δόσεις 0, 4.5, 22.5, 45 και 90 μl στα 100g εδάφους ανά γυάλινο δοχείο. (Colony Forming Units) ανά γραμμάριο εδάφους υπολογίσθηκε έπειτα από επώαση στους 22 ± 1 o C για 5-6 ημέρες Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση όλων των πειραματικών δεδομένων (ANOVA) πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πρόγραμμα Statistica 6.0 (StatSoft Italia srl). Χρησιμοποιήθηκε το 4 x 10 x 4 (4 γένη μυκήτων x 10 εξεταζόμενες ουσίες x 4 δόσεις εφαρμογής) παραγοντικό πείραμα σε πλήρως τυχαιοποιημένες ομάδες. Η σύγκριση των μέσων όρων έγινε με το κριτήριο της ελάχιστης σημαντικής διαφοράς (ΕΣΔ) σε επίπεδο σημαντικότητας P Αναλύθηκαν οι πραγματικές τιμές της μυκηλιακής ανάπτυξης (mm) και της σποριοποίησης (αριθμός κονιδίων/cm 2 θρεπτικού υποστρώματος), εντούτοις στα αποτελέσματα οι τιμές παρουσιάζονται εκπεφρασμένες ως επί τοις % του μάρτυρα. Oι τιμές CFU/g εδάφους στο πείραμα ελέγχου της αντιμυκητιακής δραστικότητας της καρβόνης και της καρβακρόλης στο έδαφος πριν από την ANOVA μετασχηματίστηκαν σε λογαριθμικές τιμές. 132

142 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1. Παραλαβή αιθερίων ελαίων-χημική ανάλυση δευτερογενών μεταβολιτών Με απόσταξη Clevenger παραλήφθηκαν τα αιθέρια έλαια από τους ιστούς αποξηραμένων φύλλων δυόσμου, λεβάντας, ρίγανης και φασκόμηλου. Η απόδοσή τους εκπεφρασμένη ως επί τοις % περιεκτικότητα σε αιθέριο έλαιο κυμάνθηκε μεταξύ 0,6-1,8%. Η εκατοστιαία συμμετοχή των κύριων συστατικών στα έλαια των τεσσάρων φυτών παρουσιάζεται στον Πίνακα 5.1. Στο δυόσμο και στη ρίγανη το κύριο συστατικό αντιπροσωπεύει περισσότερο από το 50% της σύστασης του ελαίου τους, ενώ στη λεβάντα και στο φασκόμηλο το 40%, περίπου. Πίνακας 5.1. Περιεκτικότητα (%) του κύριου συστατικού στα αιθέρια έλαια δυόσμου, λεβάντας, ρίγανης και φασκόμηλου. Φυτικό είδος Κύριο συστατικό % Περιεκτικότητα Δυόσμος καρβόνη 55 Λεβάντα φεγχόνη 37 Ρίγανη καρβακρόλη 66 Φασκόμηλο 1,8-κινεόλη Εργαστηριακός έλεγχος αντιμυκητιακής δράσης αιθερίων ελαίων και των κύριων συστατικών τους Απομόνωση μυκήτων από καλλιέργεια τομάτας Από τους εδαφογενείς μύκητες που προήλθαν από την βιολογική καλλιέργεια τομάτας, απομονώθηκαν και προσδιορίσθηκαν επτά γένη που ανήκαν στην τάξη Moniliales. Τα γένη αυτά και η % συμμετοχή τους στο συνολικό πληθυσμό των μυκήτων ήταν το F. oxysporum με 26%, το Cladosporium sp. με 5%, το Gliocladium sp. με 4.6%, το Trichoderma sp. με 3%, το Penicillium sp. με 2%, ο Aspergillus sp. με 1.5% και το V. dalhiae με 2.5%. Ακόμη προσδιορίσθηκε το γένος Rhizopus sp. που ανήκει στην τάξη Mucorales, με 6% συμμετοχή στο συνολικό πληθυσμό των μυκήτων. Επιλέχθηκαν για να μελετηθούν οι μύκητες Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae, ως από τους αντιπροσωπευτικότερους μύκητες που ανιχνεύονται συχνά στη ριζόσφαιρα των καλλιεργούμενων φυτών, γνωστά γένη μυκήτων, μέλη των οποίων αποτελούν κοινά παθογόνα ή κοινά σαπρόφυτα των 133

143 καλλιεργούμενων φυτών. Επιπλέον απομονώθηκαν και λιγότερο σημαντικοί για τα καλλιεργούμενα φυτά μύκητες οι οποίοι ταυτοποιήθηκαν, όπως επίσης και ένας αριθμός ωομυκήτων Αναστολή ανάπτυξης μυκηλίου Τα αιθέρια έλαια του δυόσμου, της λεβάντας, της ρίγανης και του φασκόμηλου προξένησαν αναστολή της μυκηλιακής ανάπτυξης των Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae (Εικόνα 5.3). Όλοι οι παράγοντες που εξετάσθηκαν (είδος μύκητα, αιθέριο έλαιο/μονοτερπένιο, συγκέντρωση εφαρμογής), μεμονωμένοι ή σε συνδυασμό, επηρέασαν σημαντικά την ανάπτυξη του μυκηλίου (Πίνακας Π.5.1). Η αντιμυκητιακή δράση των τεσσάρων αιθερίων ελαίων, εκπεφρασμένη ως επί τοις % της μυκηλιακής ανάπτυξης του μάρτυρα παρουσιάζεται στον Πίνακα 5.2. Η μυκηλιακή ανάπτυξη στα τρυβλία-μάρτυρες για όλους τους εξεταζόμενους μύκητες ήταν 45 mm (ακτίνα τρυβλίου), καθώς κάλυπτε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου. Τα αιθέρια έλαια εκδήλωσαν μια μάλλον δοσο-εξαρτώμενη δράση εναντίον των μυκήτων. Γενικά, η ισχυρότερη αναστολή παρατηρήθηκε από την εφαρμογή αιθερίου ελαίου ρίγανης σε όλους τους μύκητες, ακόμη και στη μικρότερη συγκέντρωση εφαρμογής. Συγκριτικά με τα άλλα τρία αιθέρια έλαια αυτό προκάλεσε την ισχυρότερη αναστολή στη μικρότερη (1 μl) και ενδιάμεση (5 μl) συγκέντρωση, όχι όμως πάντα στη μεγαλύτερη συγκέντρωση (10 μl). Στην τελευταία, το αιθέριο έλαιο του δυόσμου απεδείχθη το δραστικότερο, καθώς ανέστειλε απόλυτα την ανάπτυξη των Aspergillus και Penicillium. Τα αιθέρια έλαια της λεβάντας και του φασκόμηλου δεν επηρέασαν την ανάπτυξη των Aspergillus, Penicillium και F. οxysporum στη μικρότερη συγκέντρωση εφαρμογής τους, ενώ αμελητέα (φασκόμηλο) ή μικρή (λεβάντα) ήταν η επίδραση της ενδιάμεσης και μεγαλύτερης συγκέντρωσης εφαρμογής τους. Εντούτοις, τα ίδια αιθέρια έλαια αποδείχθηκαν δραστικά εναντίον του V. dalhiae, του οποίου ανέστειλαν ισχυρά (φασκόμηλο) ή απόλυτα (λεβάντα) την ανάπτυξη στη μεγαλύτερη συγκέντρωση εφαρμογής τους. 134

144 Α Β Γ Δ Εικόνα 5.3. Έλεγχος αντιμυκητιακής δράσης της λεβάντας στον Aspergillus sp. (Α), της ρίγανης στον F. οxysporum (Β), της 1,8-κινεόλης στον V. dalhiae (Γ), και της καρβακρόλης στον Penicillium sp. (Δ), όπως εμφαίνεται από την αναστολή ανάπτυξης μυκηλίου γύρω από εμποτισμένους με την αντίστοιχη δραστική ουσία χάρτινους δίσκους. H επάνω σειρά των φωτογραφιών Α, Β και Γ εμφανίζει τα τρυβλία-μάρτυρες, όπου οι δίσκοι εμποτίστηκαν με 1, 5 και 10 μl αποστειρωμένου Η 2 Ο, ενώ στην κάτω σειρά τοποθετήθηκαν από αριστερά προς τα δεξιά 1, 5 και 10 μl αιθερίου ελαίου ή μονοτερπενίου, αντιστοίχως

145 Πίνακας 5.2. Μυκηλιακή ανάπτυξη των Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae (εκπεφρασμένη ως επί τοις % του αντίστοιχου μάρτυρα), παρουσία αιθερίων ελαίων ή μονοτερπενίων. Στο μάρτυρα αποδόθηκε η τιμή 100. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική διαφορά από τον μάρτυρα. Αιθέριο έλαιο / Συγκέντρωση Μυκηλιακή ανάπτυξη (% του μάρτυρα) 1 μονοτερπένιο (μl /δισκίο) Aspergillus F.oxysporum Penicillium V. dalhiae sp. sp. Δυόσμος k l 91.0m* 91.0 m* f* 91.5 i* 64.0 h* 49.0 e* a* 90.0 h* 0.0 a* 11.0 b* Λεβάντα k l o 91.0 m* j* l 89.0 l * 63.0 g* i* 98.0 k* 85.0 k* 0.0 a* Ρίγανη hi* 80.0 e* 71.0 i* 56.0 f * d* 17.0 b* 41.0 e* 0.0 a* b* 6.0 a* 32.0 c* 0.0 a* Φασκόμηλο k l o 96.0 o* k l 96.0 n* 71.0 h* k* l 91.0 m* 33.0 c* Καρβακρόλη g* 82.6 f * 76.1 j* 46.7 d* c* 54.3 d* 39.6 d* 0.0 a* b* 48.6 c* 22.2 b* 0.0 a* Καρβόνη k l 90.2lm* 74.1 i* e* 91.5 i* 59.3 g* 0.0 a* a* 54.4 d* 0.0 a* 0.0 a* 1,8-Κινεόλη k l o p k l o 91.6 m* k l o 81.7 j* Φεγχόνη k l o p k l o 91.4 m* k 97.8 k* o 0.0 a* α-πινένιο k l o 93.0 n* k l o 84.4 k* k l o 82.2 j * Τεπινεν-4-όλη k l o 95.6 o* k 94.8 j* 72.2 i* 86.7 l* h* 85.6 g* 45.2 f* 0.0 a* 1 Οι σχετικές τιμές της μυκηλιακής ανάπτυξης εντός της ίδιας στήλης, που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα, δεν διαφέρουν σημαντικά σύμφωνα με το Fischer s protected LSD test σε επίπεδο σημαντικότητας P Κάθε τιμή είναι ο μέσος όρος τριών επαναλήψεων. 136

146 Η αντιμυκητιακή δραστικότητα των έξι μονοτερπενίων παρουσιάζεται επίσης στον Πίνακα 5.2. Γενικά, η ισχυρότερη αναστολή καταγράφηκε από την καρβακρόλη, η οποία επηρέασε όλους τους μύκητες σε όλες τις δόσεις εφαρμογής της. Η προκληθείσα αναστολή της μυκηλιακής ανάπτυξης κυμάνθηκε από 17% στον F. oxysporum έως 100% στον V. dalhiae. Η καρβόνη ακολουθούσε σε δραστικότητα, αν και η επίδρασή της εναντίον των Aspergillus και Penicillium ήταν ισχυρότερη από την καρβακρόλη στη μεγαλύτερη συγκέντρωση εφαρμογής της. Η φεγχόνη ήταν αναποτελεσματική ή ελάχιστα αποτελεσματική, εκτός από την περίπτωση εφαρμογής της μεγαλύτερης συγκέντρωσης της εναντίον του V. dalhiae, την ανάπτυξη του οποίου ανέστειλε πλήρως. Η 1,8-κινεόλη και το α-πινένιο ήταν εντελώς αναποτελεσματικά εναντίον όλων των μυκήτων, εκτός από τον V. dalhiae την ανάπτυξη του οποίου μείωσαν στη μεγαλύτερη συγκέντρωση εφαρμογής τους περίπου έως 20%. Η τερπινεν-4-όλη επέδειξε ενδιάμεση δραστικότητα μεταξύ αυτής της καρβόνης και της φεγχόνης. Στη μεγαλύτερη συγκέντρωση εφαρμογής του το συγκεκριμένο μονοτερπένιο, ήταν δραστικότατο εναντίον του V. dalhiae, του οποίου την ανάπτυξη ανέστειλε πλήρως και του Penicillium, του οποίου την ανάπτυξη μείωσε περίπου κατά το ήμισυ Αναστολή ικανότητας σποριοποίησης Η δραστικότητα των εξεταζόμενων αιθερίων ελαίων και των κύριων συστατικών τους στη σποριοποίηση των μυκήτων εκπεφρασμένη ως επί % της ικανότητας σποριοποίησης του μάρτυρα παρουσιάζεται στον Πίνακα 5.3. Στον Πίνακα 5.4 παρουσιάζονται οι πραγματικές τιμές σποριοποίησης στους μάρτυρες. Καταγράφηκαν ισχυρές αναστολές αλλά και ισχυρές αυξήσεις της σποριοποίησης των μυκήτων. Ειδικότερα το αιθέριο έλαιο της ρίγανης, σε όλες τις δόσεις εφαρμογής του, μείωσε σημαντικά τη σποριοποίηση όλων των μυκήτων. Στη μικρότερη συγκέντρωση εφαρμογής του προκάλεσε αναστολή που κυμάνθηκε από 56% στον F. oxysporum έως 74% στους Penicillium και V. dalhiae, ενώ στην ενδιάμεση προκάλεσε παρόμοια αναστολή με αυτή της μεγαλύτερης συγκέντρωσης εφαρμογής του (Πίνακας 5.3). Το αιθέριο έλαιο του δυόσμου, σε όλες τις δόσεις εφαρμογής του, μείωσε ιδιαίτερα τη σποριοποίηση των Aspergillus και Penicillium. Η δράση του ιδίου ελαίου ήταν ασθενέστατη εναντίον της σποριοποίησης των F. oxysporum και V. dalhiae στη μικρότερη συγκέντρωση 137

147 Πίνακας 5.3. Σποριοποίηση των Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae (εκπεφρασμένη ως επί τοις % του αντίστοιχου μάρτυρα) παρουσία των αιθερίων ελαίων ή των μονοτερπενίων τους. Στο μάρτυρα αποδόθηκε η τιμή 100. Όλες οι τιμές του πίνακα, εκτός από τρεις που σημειώθηκαν με (-), διαφέρουν σημαντικά από τον μάρτυρα. Αιθέριο έλαιο / Συγκέντρωση Σποριοποίηση (% του μάρτυρα) 1,2 μονοτερπένιο (μl/δισκίο) Aspergillus sp. F.oxysporum Penicillium V. dalhiae sp. Δυόσμος abc 94.7 j(-) 4.9 abcd 98.5 l(-) a 32.7 e 2.3 ab 16.1 bc e 13.1 bc Λεβάντα i 71.4 h 3.7 abc m j 9.7 abc 2.0 a 7.3 a g 6.9 abc 0.7 a Ρίγανη ef 43.9 f 26.1 f 26.2 de cd 1.3 a 4.0 abcd bcd 0.0 a 4.2 abcd Φασκόμηλο h l 5.8 abcd 69.2 j g m 2.7 ab 32.4 ef de n 2.7 ab 8.1 ab Καρβακρόλη ab 14.4 bcd 29.6 f 20.0 cd ab 0.0 a 15.2 e a 0.0 a 0.6 a Καρβόνη 1 7.3abc k 11.0 de 29.2 e ab 22.5 de 1.3 a abc 1,8-Κινεόλη h m 10.7 cde 80.1 k h 49.7 fg 3.1 ab 40.1 fgh g 15.4 bcd 1.3 a 26.4 de Φεγχόνη i(-) 45.6 f 9.2 bcde 87.7 k g 54.5 de 4.4 abcd 42.0 gh bcd 5.0 ab 0.7 a α-πινένιο f 86.0 ij g 47.7 hi de 75.5 hi gh 33.9 efg ab 52.5 fg h 33.7 efg Τεπινεν-4-όλη abc 61.8 g 5.1 abcd 52.3 i a 44.4 f 1.2 a 10.7 ab ab 17.1 cd 1.2 a 1 Οι σχετικές τιμές της σποριοποίησης εντός της ίδιας στήλης που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα, δεν διαφέρουν σημαντικά σύμφωνα με το Fischer s protected LSD test σε επίπεδο σημαντικότητας P Τα κενά κελιά υποδηλώνουν ότι καμία μέτρηση δεν πραγματοποιήθηκε, εξαιτίας της πλήρους αναστολής της μυκηλιακής ανάπτυξης. Κάθε τιμή είναι ο μέσος όρος τριών επαναλήψεων. 138

148 Πίνακας 5.4. Αριθμός κονιδίων που παρήχθησαν από τους Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae στα τρυβλία-μάρτυρες (± standard error). Κάθε χάρτινος δίσκος εμποτίστηκε με 1, 5 ή 10 μl αποστειρωμένου νερού. Συγκέντρωση Σποριοποίηση (κονίδια x 10 6 /cm 2 του μυκηλίου) (μl/δισκίο) Aspergillus F. oxysporum Penicillium V. dalhiae sp. sp ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.20 Κάθε τιμή είναι ο μέσος όρος τριών επαναλήψεων. εφαρμογής του, αλλά ισχυρή στην ενδιάμεση και στην υψηλότερη συγκέντρωση εφαρμογής του. Τα αιθέρια έλαια της λεβάντας και του φασκόμηλου παρουσίασαν θετικές και αρνητικές επιδράσεις, ταυτόχρονα. Αναλυτικότερα, το έλαιο της λεβάντας μείωσε περισσότερο από 94% τη σποριοποίηση του Penicillium σε όλες τις δόσεις εφαρμογής του και περισσότερο από 90% τη σποριοποίηση του F. oxysporum στην ενδιάμεση και στη μεγαλύτερη συγκέντρωση εφαρμογής του. Αντιθέτως το ίδιο αιθέριο έλαιο, αναλόγως με τη συγκέντρωση, είχε αρνητική ή θετική επίδραση στη σποριοποίηση των V. dalhiae και Aspergillus. Συγκεκριμένα, η σποριοποίηση του V. dalhiae μειώθηκε ισχυρά από την ενδιάμεση συγκέντρωση εφαρμογής αιθερίου ελαίου λεβάντας αλλά αυξήθηκε κατά 22% περίπου από τη μικρότερη. Η σποριοποίηση του Aspergillus αυξήθηκε από τη μικρότερη και την ενδιάμεση συγκέντρωση εφαρμογής λεβάντας, αλλά μειώθηκε κατά το ήμισυ από τη μεγαλύτερη συγκέντρωση της. Παρόμοια με το αιθέριο έλαιο της λεβάντας ήταν και η συμπεριφορά του ελαίου του φασκόμηλου, το οποίο προκάλεσε σχεδόν απόλυτη αναστολή της σποριοποίησης του Penicillium σε όλες τις δόσεις του. Επιπροσθέτως, το έλαιο του φασκόμηλου μείωσε τη σποριοποίηση των Aspergillus και V. dalhiae με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά είχε θετική επίδραση στη σποριοποίηση του F. oxysporum με δοσο-εξαρτώμενο και πάλι τρόπο (46, 78, 96% αύξηση από τη μικρότερη προς τη μεγαλύτερη συγκέντρωση). Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα έξι μονοτερπένια που εξετάστηκαν ανέστειλαν τη σποριοποίηση των μυκήτων (Πίνακας 5.3). Η μεγαλύτερη αναστολή παρατηρήθηκε από την καρβακρόλη, η οποία προκάλεσε δραματική μείωση της σποριοποίησης σε όλους τους μύκητες, ακόμη και στη μικρότερη συγκέντρωση εφαρμογής της (1 μl/ τρυβλίο). Η καρβόνη ήταν επίσης πολύ δραστική 139

149 αναστέλλοντας σημαντικά τη σποριοποίηση όλων των εξεταζόμενων μυκήτων σε όλες τις δόσεις εφαρμογής της, με μία μόνο εξαίρεση, αυτής του F. oxysporum (στο 1 μl/τρυβλίο καρβόνης αυξήθηκε κατά 16%, ενώ στα 5 και 10 μl/τρυβλίο ελαττώθηκε κατά 80% τουλάχιστον). Η επίδραση της τερπινεν-4-όλης ήταν συγκρίσιμη με της καρβακρόλης και της καρβόνης. Η φεγχόνη μείωσε ισχυρά τη σποριοποίηση όλων των μυκήτων στην ενδιάμεση και μεγαλύτερη συγκέντρωση εφαρμογής, αλλά όχι πάντα στη μικρότερη. Στην πραγματικότητα, στη μικρότερη συγκέντρωση επέδρασε θετικά στη σποριοποίηση του Aspergillus sp, αν και στατιστικώς μη σημαντικά. Όπως όλες οι οξυγονούχες ενώσεις, η 1,8-κινεόλη ήταν πολύ δραστική εναντίον του Penicillium προκαλώντας σχεδόν απόλυτη αναστολή της σποριοποίησής του. Ήταν όμως λιγότερο αποτελεσματική εναντίον της σποριοποίησης του Aspergillus στην ενδιάμεση και στη μεγαλύτερη συγκέντρωση, ενώ επέδρασε θετικά στη σποριοποίηση του F. oxysporum κατά 180%, στη μικρότερη συγκέντρωση εφαρμογής της. Το α-πινένιο προκάλεσε μια αξιοσημείωτη δοσο-εξαρτώμενη αναστολή της σποριοποίησης των Aspergillus και F. oxysporum (ισχυρότερη στον Aspergillus), ενώ ήταν εξίσου αποτελεσματικό σε όλες τις δόσεις εφαρμογής του εναντίον του V. dalhiae. Εντούτοις, το ίδιο μονοτερπένιο είχε θετική επίδραση στη σποριοποίηση του Penicillium, που ήταν ο πλέον ευαίσθητος μύκητας στη σποριοποίησή του σε όλα τα υπόλοιπα μονοτερπένια. Αναλυτικότερα, τα υπόλοιπα μονοτερπένια ανεξαρτήτως συγκέντρωσης εφαρμογής, ελάττωσαν τη σποριοποίηση του Penicillium (περισσότερο από 70%), ενώ το α-πινένιο ανεξαρτήτως συγκέντρωσης εφαρμογής, προκάλεσε αύξηση (περισσότερο από 35%) της σποριοποίησής του Ικανότητα επανάκτησης της μυκηλιακής ανάπτυξης Η μυκητοστατική ή μυκητόκτονος δράση των αιθερίων ελαίων και των κύριων συστατικών τους αξιολογήθηκε εκτιμώντας την τυχόν επανάκτηση της μυκηλιακής ανάπτυξης μετά από την απομάκρυνση του ανασταλτικού παράγοντα. Τα αποτελέσματα εκπεφρασμένα ως επανάκτηση σε νέες καλλιέργειες δίνονται στον Πίνακα 5.5. Ειδικότερα, όλα τα αιθέρια έλαια προκάλεσαν μη αντιστρέψιμη αναστολή της μυκηλιακής ανάπτυξης στον V. dalhiae στην ενδιάμεση και στη μεγαλύτερη συγκέντρωση εφαρμογής τους. Η αναστολή που προκλήθηκε από κάθε συγκέντρωση εφαρμογής των αιθερίων ελαίων λεβάντας και φασκόμηλου ήταν πλήρως αναστρέψιμη στους Aspergillus, F. oxysporum και Penicillium. Αντιθέτως, η 140

150 Πίνακας 5.5. Επανάκτηση της μυκηλιακής ανάπτυξης έπειτα από επανακαλλιέργεια των Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae (εκπεφρασμένη ως επί τοις % του αντίστοιχου μάρτυρα), σε περιβάλλον ελεύθερο των παραγόντων αναστολής. Αιθέριο έλαιο / Συγκέντρωση Επανάκτηση της μυκηλιακής ανάπτυξης 1 μονοτερπένιο (μl/δισκίο) Aspergillus sp. F. oxysporum Penicillium sp. V. dalhiae Δυόσμος a a a 45.5 d b a 44.5 d 0.0 g e a 5.6 f 0.0 g Λεβάντα a a a 68.2 c a a a 0.0 g a a a 0.0 g Ρίγανη a a 77.8 b 36.4 e b 94.0 b 38.9 d 0.0 g c 74.0 d 38.9 d 0.0 g Φασκόμηλο a a a 72.7 bc a a a 0.0 g a a a 0.0 g Καρβακρόλη a a 77.8 b 0.0 g b 84.0 c 72.2 b 0.0 g d 60.0 e 0.0 f 0.0 g Καρβόνη a a a 0.0 g b a 77.8 b 0.0 g d a 0.0 f 0.0 g 1,8-Κινεόλη a a a 72.7 bc a a a 50.0 d a a a 45.5 d Φεγχόνη a a a 97.7 a a a 38.9 d 77.3 b a a 38.9 d 0.0 g α-πινένιο a a a 77.3 b a a a 27.3 f a a a 0.0 g Τεπινεν-4-όλη a a a 68.2 c a a 55.6 c 45.5 d a a 16.7 e 0.0 g 1 Οι σχετικές τιμές σποριοποίησης εντός της ίδιας στήλης, που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα, δεν διαφέρουν σημαντικά σύμφωνα με το Fischer s protected LSD test σε επίπεδο σημαντικότητας P Κάθε τιμή είναι ο μέσος όρος τριών επαναλήψεων. 141

151 αναστολή ήταν μερικώς αναστρέψιμη στους Aspergillus και Penicillium, όταν εκτέθηκαν στην ενδιάμεση ή στην μεγαλύτερη συγκέντρωση αιθερίου ελαίου ρίγανης ή δυόσμου, καθώς και παρομοίως στον F.oxysporum όταν εκτέθηκε στο έλαιο της ρίγανης. Όλα τα μονοτερπένια, εκτός από την 1,8-κινεόλη, προκάλεσαν μη αναστρέψιμη αναστολή στον V. dalhiae τουλάχιστον στη μεγαλύτερη συγκέντρωση εφαρμογής τους (φεγχόνη, πινένιο, τερπινεόλη), ενώ η καρβόνη και η καρβακρόλη σε όλες τις δόσεις εφαρμογής. Οι Aspergillus, F. oxysporum και Penicillium ανέκτησαν πλήρως την ανάπτυξή τους, έπειτα από την έκθεσή τους σε οποιαδήποτε συγκέντρωση της 1,8-κινεόλης ή του α-πινένιου. Την ίδια συμπεριφορά επέδειξε και ο F. oxysporum στην καρβόνη, στη φεγχόνη και στην τερπινεν-4-όλη, καθώς και ο Aspergillus στην φεγχόνη και στην τερπινεν-4-όλη. Κανένας από τους μύκητες που υπέστη μεταχείριση με την ενδιάμεση και την υψηλότερη συγκέντρωση καρβακρόλης δεν κατάφερε να ανακάμψει πλήρως μετά την απομάκρυνσή της Αντιμυκητιακή δράση καρβόνης και καρβακρόλης στο έδαφος H αντιμυκητιακή δράση της καρβόνης και της καρβακρόλης, όταν εφαρμόσθηκαν εναντίον μίγματος των τεσσάρων μυκήτων στο έδαφος στο πείραμα μέσα σε γυάλινα δοχεία, παρουσιάζονται στα Σχήματα 5.1 Α και Β, αντιστοίχως. Οι πληθυσμοί των μυκήτων στους μάρτυρες παρέμειναν σχεδόν σταθεροί. Σε διάρκεια τριών εβδομάδων, σε γενικές γραμμές οι μύκητες Aspergillus sp. και Penicillium sp. παρουσίασαν τους μεγαλύτερους πληθυσμούς. Ο μύκητας V. dalhiae δεν ανιχνεύτηκε μέχρι την τρίτη εβδομάδα δειγματοληψίας, οπότε και παρουσιάστηκε μόνο όταν χρησιμοποιήθηκαν 0 (μάρτυρας) και 4.5 μl καρβόνης. Γενικά, η καρβόνη και η καρβακρόλη, όταν χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 22.5 μl ανά 100 g εδάφους, προκάλεσαν μείωση του πληθυσμού των μυκήτων κατά 10 2 CFU/g εδάφους σε σχέση με το μάρτυρα. Η μεγαλύτερη συγκέντρωση εφαρμογής των 45 μl των δύο οξυγονούχων μονοτερπενίων ανέστειλε επιπλέον τον πληθυσμό των μυκήτων προκαλώντας μια μείωση κατά 10 4 CFU/g εδάφους σε σχέση με το μάρτυρα. Εντούτοις, όταν τα δύο μονοτερπένια χρησιμοποιήθηκαν στη μικρότερη συγκέντρωση (4.5 μl), είχαν σε γενικές γραμμές θετική επίδραση, τουλάχιστον στην ανάπτυξη του Aspergillus, ενώ η χρήση της μεγαλύτερης συγκέντρωσης τους (90 μl) προκάλεσε απόλυτη αναστολή της ανάπτυξης όλων των μυκήτων. 142

152 Σχήμα 5.1. Ανάπτυξη των Aspergillus sp., F. oxysporum, Penicillium sp. και V. dalhiae κατά τη διάρκεια τριών εβδομάδων. Οι μύκητες εμβολιάσθηκαν σε 100g εδάφους (τοποθετημένα εντός 900 cm 3 γυάλινων δοχείων) με την προσθήκη 0 μl (0), 4.5 μl (1), 22.5 μl (2), 45 μl (3) ή 90 μl (4) καρβόνης (Α) και καρβακρόλης (Β). Κάθε τιμή αποτελεί μέσο όρο τριών μετρήσεων. Α log CFU/100g εφάφους Aspergillus sp. Penicillium sp. F. oxysporum V. dalhiae LSD 0,05 = 0.12 LSD 0,05 = 0.09 LSD 0,05 = η εβδομάδα 2 η εβδομάδα 3 η εβδομάδα μl/δοχείο Β log CFU/100g εδάφους Aspergillus sp. Penicillium sp. F. oxysporum V. dalhiae LSD 0,05 = 0.06 LSD 0,05 = 0.07 LSD 0,05 = μl/δοχείο 1 η εβδομάδα 2 η εβδομάδα 3 η εβδομάδα 143

153 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα αποτελέσματα επιτρέπουν τη σύγκριση της βιοδραστικότητας των αιθερίων ελαίων και των κύριων συστατικών τους εναντίον μυκήτων μέσω της μελέτης της επίδρασής τους στη μυκηλιακή ανάπτυξη, στη σποριοποίηση και στην επανάκτηση της μυκηλιακής ανάπτυξης. Η καταγραφή αυτή της βιοδραστικότητας των ουσιών αυτών, πιθανόν εντέλει να υποδείξει την δυνατότητα χρήσης τους στην πράξη ως αντιμυκητιακών. Το αιθέριο έλαιο της ρίγανης παρουσίασε την ισχυρότερη ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη μυκηλίου και στη σποριοποίηση όλων των μυκήτων. Το αιθέριο έλαιο του δυόσμου ήταν επίσης ιδιαίτερα δραστικό εναντίον όλων των μυκήτων, εκτός από τον F. oxysporum. Μεταξύ των συστατικών των αιθερίων ελαίων που δοκιμάστηκαν η καρβακρόλη και η καρβόνη, τα κύρια συστατικά των αιθερίων ελαίων της ρίγανης και του δυόσμου, αντιστοίχως, παρουσίασαν την υψηλότερη αντιμυκητιακή δράση. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τους Sokovic and Griensven (2006), οι οποίοι αναφέρουν ότι τα αιθέρια έλαια της ρίγανης και του δυόσμου είναι εξαιρετικά δραστικά εναντίον των V. fungicola και Trichoderma harzianum. Η ισχυρή αντιμυκητιακή δράση της καρβόνης και της καρβακρόλης, καθώς και του ισομερούς της θυμόλης, έχει νωρίτερα αναφερθεί εναντίον μετασυλλεκτικών παθογόνων (Thompson 1989) και φυτοπαθογόνων μυκήτων (Müller-Riebau et al. 1995). Στην παρούσα εργασία, τα αιθέρια έλαια του φασκόμηλου και της λεβάντας προκάλεσαν ασήμαντη ή μικρή αναστολή στην ανάπτυξη τριών από τους τέσσερις μύκητες, αλλά ήταν ιδιαιτέρως δραστικά εναντίον της ανάπτυξης του V. dalhiae. Παρόμοια ήταν και η συμπεριφορά των κύριων συστατικών τους, 1,8-κινεόλης και φεγχόνης, αντιστοίχως, τα οποία ήταν πρακτικώς αναποτελεσματικά, εκτός από την περίπτωση του V. dalhiae την ανάπτυξη του οποίου ανέστειλε απολύτως η φεγχόνη στη μεγαλύτερη συγκέντρωση εφαρμογής της. Έχει αναφερθεί ότι το αιθέριο έλαιο της λεβάντας παρουσίασε ισχυρή δραστικότητα εναντίον του F. oxysporum και ενδιάμεση εναντίον του Aspergillus flavous (Angioni et al. 2006), αλλά η συγκέντρωση εφαρμογής στη δεύτερη περίπτωση ήταν πολύ μεγαλύτερη (60 μl, τεχνική διάχυσης από χάρτινους δίσκους) από ότι στην παρούσα έρευνα. Έλλειψη δραστικότητας του αιθερίου ελαίου λεβάντας παρατηρήθηκε εναντίον του A. nidulans (Moon et al. 2007). 144

154 Αναφορικά με το αιθέριο έλαιο του φασκόμηλου, υπάρχουν εργασίες που αναφέρουν μικρή αντιμυκητιακή δράση εναντίον των Fusarium sp. και Botrytis cinerea (Daferera et al. 2003), αλλά υψηλή εναντίον των F. solani f. sp. cucurbitae, Rhizoctonia solani και Sclerotinia sclerotiorum (Pitarokili et al. 2003). Τα αντιφατικά αυτά αποτελέσματα μπορούν να αποδοθούν στις διαφορετικές φυλές του μύκητα που μελετήθηκε και στους διαφορετικούς τύπους του αιθερίου ελαίου που αποστάζεται ακόμη και από το ίδιο είδος φυτού, καθώς η ποιοτική και ποσοτική σύσταση του ελαίου αλλάζει και εξαρτάται από γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες (Gulati 1980, Pareek et al. 1980, Philip and Damodaran 1985, Maheshwari et al. 1986, Vokou 1999). Μεταξύ αρωματικών φυτών του ιδίου είδους παρατηρείται παραλλακτικότητα στη χημική τους σύνθεση σε επίπεδο πληθυσμών, αλλά και σε επίπεδο ανεξάρτητων φυτών-μονάδων του ιδίου πληθυσμού. Μεταξύ της χημικής δομής των συστατικών των αιθερίων ελαίων και της αντιμυκητιακής τους δράσης υπάρχει συσχέτιση, όπως αναφέρεται στη βιβλιογραφία (π.χ. Villar et al. 1986). Οι Knobloch et al. (1989), αναφέρουν ότι η διακύμανση στην αντιμυκητιακή δράση των συστατικών των αιθερίων ελαίων εξαρτάται από την υδατοδιαλυτότητά τους (π.χ., την ικανότητά τους να διαπερνούν τα δομημένα με χιτίνη κυτταρικά τοιχώματα των μυκηλιακών υφών). Για παράδειγμα, τα μονοτερπένια-αλκοόλες όπως η τερπινεόλη και η λιναλοόλη παρουσιάζουν ισχυρή αντιμικροβιακή δράση, ιδιαίτερα έκδηλη σε ολόκληρα κύτταρα. Τα μονοτερπένιαυδρογονάνθρακες έχουν ασθενέστερες αντιμυκητιακές ιδιότητες καθώς η χαμηλή υδατοδιαλυτότητά τους περιορίζει τη διάχυσή τους εντός του θρεπτικού μέσου (Knobloch et al. 1987). Συνεπώς, οι μονοτερπενικοί υδρογονάνθρακες, εξαιτίας της χαμηλής διαλυτότητάς τους, παραμένουν στην επιφάνεια του θρεπτικού μέσου ή εξατμίζονται αλλά δεν διαπερνούν τα κυτταρικά τοιχώματα και, όπως φαίνεται από τα αποτελέσματά μας (μηδενική ή μικρή μυκηλιακή αναστολή από οποιαδήποτε συγκέντρωση του μονοτερπενίου-υδρογονάνθρακα α-πινενίου), ούτε και το άγαρ. Εντούτοις, τα αιθέρια έλαια και τα κύρια συστατικά τους δεν ήταν αποτελεσματικά μόνο εξαιτίας της διάχυσής τους στο θρεπτικό μέσο ή λόγω επαφής. Η πτητικότητά τους αποτέλεσε έναν επιπλέον παράγοντα υποβοηθώντας προφανώς την αναστολή της μυκηλιακής ανάπτυξης ακόμη και από μικρότερες ποσότητές τους, που παράλληλα έδρασαν και ως ισχυροί αναστολείς της σποριοποίησης. Συνεπώς, η συγκέντρωση ατμών και η δραστικότητα της αερίου επαφής πρέπει να συνυπολογίζεται. 145

155 Οι οξυγονούχες και μη οξυγονούχες αλκοόλες (π.χ. καρβακρόλη) και οι κετόνες (π.χ. καρβόνη, φεγχόνη) είναι αποτελεσματικότερες από τους αιθέρες (π.χ. 1,8-κινεόλη) και τους μονοτερπενικούς υδρογονάνθρακες (π.χ. α-πινένιο) (Knobloch et al. 1987, Griffin et al. 2000, Skaltsa 2003). Ειδικές λειτουργικές ομάδεςυποκαταστάτες της χημικής δομής των αιθερίων ελαίων αυξάνουν επιπρόσθετα τη δράση τους, καθώς παρεμβαίνουν στις πρωτεΐνες των κυτταρικών μεμβρανών (Pauli and Knobloch 1987, Knobloch et al. 1989). Το σημείο δράσης των μονοτερπενίων είναι η κυτταρική μεμβράνη. Διαπιστώθηκε ότι αρκετά μονοτερπένια επηρεάζουν τις δομικές και λειτουργικές ιδιότητες των λιπιδίων του πλασμαλήμματος βακτηρίων και ζυμομυκήτων, προκαλώντας διαρροή των ενδοκυτταρικών υλικών (π.χ. Trombetta et al. 2005). Επιπλέον, οι Cox et al. (2000) αναφέρουν ότι τα μονοτερπένια αναστέλλουν ένζυμα που συμμετέχουν στην φυσιολογική λειτουργία της αναπνοής των μικροβίων, στη μεταφορά του οξυγόνου και στη διαδικασία της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Έχει αναφερθεί ότι η ελεύθερη ομάδα OH - των φαινολών και των αλκοολών πρέπει να αποτελεί το κλειδί της δραστικότητάς τους (Griffin et al. 2000). Είναι γνωστό ότι ελεύθερη ομάδα OH - αντιδρά εύκολα και μπορεί να σχηματίσει δεσμούς υδρογόνου με τα ενεργά κέντρα ενζύμων. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι τα αιθέρια έλαια που περιέχουν φαινολικές ενώσεις και κετόνες, όπως τα αιθέρια έλαια της ρίγανης-καρβακρόλη και του δυόσμου-καρβόνη, αντιστοίχως, (Σχήμα 5.2) είναι τα πλέον δραστικά. Σχετικά με την καρβακρόλη, τα αποτελέσματα συμφωνούν με αυτά που αναφέρονται από τους Farag et al. (1989), οι οποίοι την χαρακτήρισαν ως εξαιρετικά μυκητοτοξική εναντίον του Aspergillus parasiticus και κατέληξαν στη διαπίστωση συσχέτισης μεταξύ της χημικής δομής και των αντιμυκητιακών ιδιοτήτων κάθε ουσίας. Στην παρούσα εργασία, τα αιθέρια έλαια και τα κύρια συστατικά τους φαίνεται να αναστέλλουν ισχυρότερα την σποριοποίηση παρά τη μυκηλιακή ανάπτυξη των μυκήτων. Ακόμη και στη μικρότερη συγκέντρωση εφαρμογής η σποριοποίηση των μυκήτων μειώθηκε σημαντικά, με εξαίρεση κάποιες περιπτώσεις όπου καταγράφηκε μάλιστα αύξηση στη σποριοποίηση. Για παράδειγμα ο Penicillium σταμάτησε την παραγωγή κονιδίων παρουσία οποιουδήποτε αιθερίου ελαίου ή μονοτερπενίου, με εξαίρεση την περίπτωση του υδρογονάνθρακα α-πινενίου. Όμως αντίθετα με τα αποτελέσματα της ανάπτυξης μυκηλίου, όπου δεν 146

156 Σχήμα 5.2. Συντακτικοί τύποι και ονομασία κατά IUPAC της καρβακρόλης και της καρβόνης. Καρβακρόλη 5-isopropyl-2-methylphenol Στερεοϊσομερή καρβόνης 2-methyl-5-(prop-1-en-2-yl) ή cyclohex-2-enone παρατηρήθηκε θετική δράση των διαφόρων ουσιών, επαναλαμβανόμενες αυξήσεις καταγράφηκαν στη σποριοποίηση των μυκήτων. Έτσι, όπως προαναφέρθηκε, στον Penicillium η παραγωγή κονιδίων αυξήθηκε από το α-πινένιο. Παρομοίως, στον F. oxysporum η σποριοποίηση αυξήθηκε από το αιθέριο έλαιο του φασκόμηλου, την κινεόλη και την καρβόνη, ενώ στους Aspergillus και V. dalhiae από το αιθέριο έλαιο λεβάντας. Η θετική επίδραση στη σποριοποίηση παρατηρήθηκε είτε σε μία μόνο (π.χ. F. oxysporum και μικρότερη συγκέντρωση της 1,8-κινεόλης) ή σε όλες τις δόσεις (π.χ. F. oxysporum και έλαιο φασκόμηλου). Στις περισσότερες περιπτώσεις, παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ της επίδρασης των αιθερίων ελαίων στην αύξηση και στη σποριοποίηση των μυκήτων με αυτή των κύριων συστατικών τους. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνεται μερικώς στις επιδράσεις του ελαίου ρίγανης και καρβακρόλης, καθώς και του ελαίου δυόσμου και καρβόνης. Εντούτοις σε άλλες περιπτώσεις σημειώθηκαν ισχυρότερες ή ηπιότερες επιδράσεις, όπως για παράδειγμα ο Penicillium που ανέκαμψε απόλυτα έπειτα από μεταχείριση με έλαιο λεβάντας, αλλά δεν συνέβη το ίδιο και με τη φεγχόνη, το κύριο συστατικό της λεβάντας. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι αν και η αντιμυκητιακή δραστικότητα των αιθερίων ελαίων συνδέεται στενά με το κύριο συστατικό τους, οι συνεργιστικές ή οι ανταγωνιστικές επιδράσεις των δευτερευόντων συστατικών τους θα πρέπει πάντα να συνυπολογίζονται. Είναι γεγονός πως αβιοτικές καταπονήσεις, όπως η έκθεση στο έντονο φως ή σε χημικές ουσίες, ή σε μηχανική καταπόνηση αυξάνει την διαδικασία της σποριοποίησης των μυκήτων (Hountondji et al. 2006), και/ή της βλάστησης των 147