ΜΟΡΙΑΚΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ

Transcript

1 ΜΟΡΙΑΚΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΦΕΪΝΗΣ ΣΕ ΑΝΑΨΥΚΤΙΚΑ/ΡΟΦΗΜΑΤΑ 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.1 Εισαγωγή στη Φασµατοµετρία Μοριακής Απορρόφησης στο Υπεριώδες/Ορατό (UV/Vis) Η φασματοφωτομετρία UV-Vis στηρίζεται στην ακόλουθη αρχή: όταν μονοχρωματική ακτινοβολία διέρχεται από διάλυμα ουσίας που απορροφά, η ισχύς της ακτινοβολίας ελαττώνεται προοδευτικά κατά μήκος της διαδρομής, λόγω απορρόφησής της από την ουσία. Η ελάττωση της ισχύος ( ) εξαρτάται από τη συγκέντρωση της ουσίας και από την απόσταση που διήνυσε η δέσμη μέσα στο διάλυμα. Οι σχέσεις αυτές εκφράζονται με το νόμο των Lambert-Beer, ο οποίος διατυπώνεται με τη μορφή όπου: : απορρόφηση (καθαρός αριθμός) : ισχύς της προσπίπτουσας ακτινοβολίας : ισχύς της εξερχόμενης ακτινοβολίας : διαπερατότητα (καθαρός αριθμός) : απορροφητικότητα (g -1 L cm -1 ) : μήκος της διαδρομής (cm) : μοριακή απορροφητικότητα (mol -1 L cm -1 ή M -1 cm -1 ) Η απορροφητικότητα χρησιμοποιείται όταν είναι άγνωστη η φύση της ουσίας που απορροφά, κι επομένως και το μοριακό της βάρος, ενώ η μοριακή απορροφητικότητα προτιμάται όταν θέλουμε να συγκρίνουμε ποσοτικά την απορρόφηση διαφόρων ουσιών γνωστού μοριακού βάρους. Η σταθερά αναλογίας ή εξαρτάται από το μήκος κύματος, το διαλύτη, τη μοριακή δομή της διαλυμένης ουσίας και σε μικρό βαθμό από τη θερμοκρασία. H απεικόνιση της ή της ως συνάρτηση του μήκους κύματος ή του κυματαριθμού παρέχει το φάσμα απορρόφησης, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαπίστωση της ύπαρξης χαρακτηριστικών ομάδων, για τη διευκρίνιση της δομής της

2 ουσίας που απορροφά και για την ταυτοποίησή της. Τα χαρακτηριστικά ενός φάσματος είναι το και το αντίστοιχο. Από την απορρόφηση μπορεί να προσδιορισθεί η συγκέντρωση της ουσίας που απορροφά με βάση την εξίσωση Lambert-Beer. Σχήμα 1. Απώλειες από ανάκλαση και σκέδαση Συνήθως, η διαπερατότητα και η απορρόφηση, όπως ορίζονται ανωτέρω, δεν µπορούν να µετρηθούν στο εργαστήριο, επειδή το διάλυµα-δείγµα πρέπει να τοποθετηθεί σε ένα δοχείο µε τοιχώµατα διαπερατά στο φως γνωστό ως κυψελίδα (cell). Όπως δείχνεται στο Σχήµα 1, στις δύο διεπιφάνειες αέρας/τοίχωµα αλλά και στις δύο διεπιφάνειες τοίχωµα/διάλυµα, συµβαίνουν ανακλάσεις και η προκαλούµενη εξασθένιση της δέσµης είναι σηµαντική. Εξασθένιση µιας δέσµης µπορεί να συµβεί ακόµα και ως αποτέλεσµα σκέδασης από τα µεγάλα µόρια, αλλά και της απορρόφησης από τα τοιχώµατα της κυψελίδας. Για αντιστάθµιση αυτών των φαινοµένων συγκρίνεται η ισχύς της δέσµης, που διαπερνά το διάλυµα του αναλύτη µε την ισχύ της δέσµης, που διαπερνά την κυψελίδα όταν αυτή περιέχει το τυφλό, οπότε:

3 Ο νόµος του Βeer εφαρµόζεται και σε υλικά που περιέχουν περισσότερα από ένα απορροφούντα συστατικά. Εάν δεν υπάρχει αλληλεπίδραση µεταξύ των διάφορων συστατικών στο µίγµα, η ολική απορρόφηση ενός τέτοιου συστήματος παρέχεται από τη σχέση (2) όπου οι δείκτες 1, 2, 3,..., n αναφέρονται στα επιµέρους συστατικά του µίγµατος. (2) 1.2 Οργανολογία Τα όργανα για τη µέτρηση της απορρόφησης, στην υπεριώδη, την ορατή και την εγγύςυπέρυθρη ακτινοβολία, αποτελούνται από τα ακόλουθα τµήµατα: (1) πηγές, (2) επιλογείς µήκους κύµατος, (3) υποδοχείς δειγµάτων, (4) µεταλλάκτες ακτινοβολίας και (5) επεξεργαστές σηµάτων και διατάξεις ανάγνωσης μετρήσεων Πηγές Για µετρήσεις µοριακής απορρόφησης απαιτείται µια πηγή συνεχούς φάσµατος εκποµπής, της οποίας η ισχύς δεν μεταβάλλεται απότοµα για µια µεγάλη περιοχή τιµών µήκους κύµατος. Με ηλεκτρική διέγερση δευτερίου ή υδρογόνου υπό χαµηλή πίεση παράγεται ένα συνεχές φάσµα εκποµπής στην υπεριώδη περιοχή. Και τα δύο είδη λυχνιών (δευτερίου και υδρογόνου) παράγουν συνεχές φάσµα στην περιοχή 160 έως 375 nm. Η συνηθέστερη πηγή ορατής και εγγύς-υπέρυθρης ακτινοβολίας είναι η λυχνία νήµατος βολφραµίου. Η λυχνία αυτή χρησιμοποείται για περιοχή µήκους κύµατος 350 έως 2500 nm Υποδοχείς δειγμάτων Όπως ισχύει και µε όλα τα οπτικά στοιχεία ενός φασµατοφωτοµέτρου, έτσι και οι κυψελίδες (cuvettes) που περιέχουν το δείγµα ή τον διαλύτη, πρέπει να κατασκευάζονται από υλικό το οποίο επιτρέπει τη διέλευση της ακτινοβολίας της περιοχής εργασίας. Για εργασία στην υπεριώδη περιοχή (κάτω από τα 350 nm) απαιτούνται κυψελίδες από χαλαζία ή τηγµένη πυριτία. Και τα δύο υλικά είναι διαπερατά από ορατή και υπέρυθρη ακτινοβολία µέχρι τα 3 µm. Για την περιοχή 350 έως 2000 nm µπορεί να χρησιµοποιηθεί και απλή πυριτική ύαλος. Για την ορατή περιοχή χρησιμοποιούνται και πλαστικές κυψελίδες.

4 1.2.3 Τύποι οργάνων (μονής/διπλής δέσμης) Ένα φωτόμετρο μονής δέσμης αποτελείται από μια πηγή ακτινοβολίας, ένα φίλτρο ή μονοχρωμάτορα για επιλογή του μήκους κύματος, αντικρισμένες (ταιριασμένες) κυψελίδες που μπορούν να παρεμβληθούν εναλλάξ στη δέσμη, έναν μεταλλάκτη, έναν ενισχυτή και μια συσκευή ανάγνωσης του αναλυτικού σήματος. Στα φωτόμετρα μονής δέσμης, η δέσμη της ακτινοβολίας ακολουθεί μία και μόνη διαδρομή δια μέσου του δείγματος ανά πάσα στιγμή. Για τη μέτρηση της απορρόφησης απαιτείται βαθμονόμηση του 0% Τ και 100% Τ (με τυφλό) για κάθε μήκος κύματος. Τα όργανα αυτά δεν είναι κατάλληλα για συνεχή μέτρηση της απορρόφησης, γιατί τόσο η πηγή ακτινοβολίας όσο και ο ανιχνευτής παρουσιάζουν ολίσθηση. Σχήμα 2 Απεικόνιση ενός κοινού φασματοφωτομέτρου διπλής δέσμης UV-Vis Στα φωτόμετρα διπλής δέσμης η ακτινοβολία από την πηγή, μετά τη δίοδο μέσα από το μονοχρωμάτορα, χωρίζεται σε δύο δέσμες, μία για το διάλυμα του δείγματος και μία για το τυφλό ή το διάλυμα αναφοράς (Σχήμα 2). Ο διαχωρισμός μπορεί να γίνει κατά δύο τρόπους, είτε στο χώρο, σε δύο ίσες δέσμες, είτε χρονικά, με τεμαχιστή, οπότε γίνεται συγχρόνως και διαμόρφωση του σήματος (φωτόμετρο διπλής δέσμης-μηδενισμού). Τα όργανα διπλής δέσμης έχουν το πλεονέκτημα να αντισταθμίζουν όλες, ακόμη και τις βραχυπρόθεσμες διακυμάνσεις της ακτινοβολίας της πηγής, καθώς και τις ολισθήσεις του μεταλλάκτη και του ενισχυτή. Επίσης αντισταθμίζουν και τις έντονες εξαρτήσεις της έντασης των διαφόρων

5 πηγών από το μήκος κύματος. Επιπλέον, τα όργανα διπλής δέσμης βοηθούν στη συνεχή καταγραφή φασμάτων διαπερατότητας ή απορρόφησης. Τα σύγχρονα φωτόμετρα είναι εφοδιασμένα με μικροϋπολογιστές ή μικροεπεξεργαστές, που ελέγχουν όλες τις λειτουργίες του οργάνου (επιλογή μήκους κύματος, περιοχή σάρωσης φάσματος, ταχύτητα σάρωσης, αυτόματος έλεγχος σχισμής εισόδου κλπ). 1.3 Εφαρμογή της φασματοφωτομετρίας απορρόφησης Η φασματοφωτομετρία UV-Vis χρησιμοποιείται ευρύτατα με σκοπό τη διερεύνηση της δομής μιας ένωσης και την ποιοτική ανάλυση (ταυτοποίηση ουσιών). Κυρίως, όμως, χρησιμοποιείται στην ποσοτική ανάλυση µιας µεγάλης ποικιλίας ανόργανων και οργανικών ουσιών σε διάφορους τομείς που αφορούν την φαρμακευτική, κλινική και περιβαλλοντική ανάλυση καθώς επίσης και την ανάλυση τροφίμων. Σκοπός της άσκησης είναι, μέσω της εξοικείωσης της τεχνικής της φασματοφωτομετρίας UV-Vis, να προσδιοριστεί ποσοτικά η περιεκτικότητα της καφεΐνης σε αναψυκτικά και ροφήματα. Η καφεΐνη είναι μια ουσία που βρίσκεται φυσικά σε κάποιες φυτικής προέλευσης τροφές και συστατικά ροφημάτων, όπως τα φύλλα του τσαγιού και ο καφές ή οι κόκκοι του καφέ. Η καφεΐνη προστίθεται σε αναψυκτικά τύπου κόλα, σε ενεργειακά ποτά και γλυκά. Διατίθεται, επίσης, σε ταμπλέτες που προτείνονται ως ένα προϊόν για την ανακούφιση των συμπτωμάτων της κόπωσης. Aποτελεί ψυχοδιεγερτική ουσία με τη μεγαλύτερη κατανάλωση σε όλο τον κόσμο και χωρίς νομικούς περιορισμούς. Πρόσφατα, η Ευρωπαϊκή Επιτροπή ζήτησε την άποψη επιστημόνων (European Food Safety Authority-EFSA) σχετικά με τα ασφαλή επίπεδα έκθεσης σε καφεΐνη σε ενήλικες, εγκύους, νέους, ηλικιωμένους και σε ανθρώπους που ασκούνται.

6 Σε υγιείς ενήλικες και ηλικιωμένους, μία καθόλα ασφαλής δόση καφεΐνης ισοδυναμεί με 200 mg (περίπου 2 ½ εσπρέσο ή 4 φλιτζάνια τσάι). Για τακτική κατανάλωση, η EFSA κατέληξε πως έως και 400 mg μέσα στο 24ωρο δεν είναι πιθανό να προκαλέσουν πρόβλημα υγείας στους ενήλικους καταναλωτές και σε ενήλικους που συμπεριλαμβάνουν έντονη άσκηση στην καθημερινότητά τους. Για έγκυες και θηλάζουσες γυναίκες, ο EFSA συμπεραίνει πως η κατανάλωση έως και 200 mg τη μέρα είναι ασφαλής για το αγέννητο μωρό ή το νεογέννητο που θηλάζει. Αυτό αντιστοιχεί σε 2 φλιτζάνια καφέ φίλτρου ή 4 φλιτζάνια τσάι. Η βασική πηγή πρόσληψης καφεΐνης στα παιδιά και τα νήπια είναι τα σοκολατούχα ροφήματα ενώ η σοκολάτα, τα αναψυκτικά και τα ενεργειακά ροφήματα αυξάνουν την πρόσληψη καφεΐνης σε εφήβους. Για αυτές τις ηλικίες, ο EFSA πρότεινε ως όριο ασφαλούς κατανάλωσης τα 3 mg/ανά κιλό σωματικού βάρους για παιδιά και εφήβους. 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΚΑΦΕΪΝΗΣ ΑΠΟ ΤΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ 2.0 ml από το αναψυκτικό/ρόφημα [Π1] τοποθετούνται σε σωλήνα φυγοκέντρησης τύπου «falcon» ή διαχωριστική χοάνη και αραιώνονται με 3 ml απεσταγμένου νερού. Ακολούθως προστίθεται 1 ml υδατικού διαλύματος Na 2 CO 3 20% w/v [Π2] (το οποίο παρασκευάζεται σε όγκο 10 ml) και 5 ml CΗ 2 Cl 2. Μετά την εκχύλιση [Π3] απομακρύνεται η στοιβάδα του CΗ 2 Cl 2 και τοποθετείται σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml. H εκχύλιση επαναλαμβάνεται για δεύτερη φορά με 5 ml CΗ 2 Cl 2 και η οργανική στοιβάδα μεταφέρεται στην ογκομετρική φιάλη και συμπληρώνεται με διαλύτη μέχρι χαραγής - τελικός όγκος 25 ml). Ποσότητα από διάλυμα αυτό μεταφέρεται σε κυψελίδα χαλαζία (1 cm) και λαμβάνεται το φάσμα απορρόφησης ( nm). Λαμβάνονται επίσης τα φάσματα διαλυμάτων καφεΐνης σύμφωνα με τις οδηγίες της ενότητας 3 (ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ). 2.2 ΌΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Το χρησιμοποιούμενο για τις μετρήσεις φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού διπλής δέσμης, είναι του οίκου Hitachi, τύπου U-2001, του οποίου οι λειτουργίες ελέγχονται πλήρως από κατάλληλο λογισμικό. Οι μετρήσεις απορρόφησης τελούνται σε τετράγωνη κυψελίδα χαλαζία (l=1cm). Η πορεία που ακολουθείται για τις μετρήσεις απορροφήσεως είναι η εξής:

7 1. Γίνεται εκκίνηση του ηλεκτρονικού υπολογιστή (PC). 2. Τίθεται ο διακόπτης λειτουργίας του οργάνου στη θέση ΟΝ 3. Επιλέγεται η συντόμευση UV Solutions 1,2 από την επιφάνεια εργασίας του Η/Υ. Το πρόγραμμα ξεκινά αυτόματα ανάβοντας τις λάμπες του οργάνου και πραγματοποιώντας τους απαραίτητους ελέγχους. 4. Από το κύριο παράθυρο του προγράμματος απενεργοποιείται η λάμπα δευτερίου μέσω του εικονιδίου D2 Lamp. 5. Από το εικονίδιο Method ενεργοποιείται το παράθυρο διαμόρφωσης μεθόδου λειτουργίας. Από το παράθυρο αυτό επιλέγεται η μέθοδος (loading of method) που θα χρησιμοποιηθεί για τις περαιτέρω αναλύσεις. Στην προκειμένη περίπτωση επιλέγεται η μέθοδος με το όνομα Spectrum. 6. Πριν αρχίσουν οι μετρήσεις των γνωστών και αγνώστων διαλυμάτων μηδενίζεται το όργανο επιλέγοντας το εικονίδιο Autozero. 7. Ακολουθεί η μέτρηση του αγνώστου δείγματος (εικονίδιο measure ). 8. Απενεργοποίηση του οργάνου γίνεται κλείνοντας πρώτα το πρόγραμμα λειτουργίας στον Η/Υ, κατόπιν το όργανο και τέλος με απενεργοποίηση του Η/Υ 3. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ 1. Να ληφθεί το φάσμα του αγνώστου και να συγκριθεί με το φάσμα προτύπου διαλύματος καφεΐνης 10 mg/l σε CΗ 2 Cl 2. Να καταγραφεί το μήκος κύματος που αντιστοιχεί στη μέγιστη απορρόφηση του διαλύματος της καφεΐνης. 2. Να παρασκευασθούν πρότυπα διαλύματα καφεΐνης σε CΗ 2 Cl 2 συγκέντρωσης 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 και 15.0 mg/l τελικού όγκου 10 ml από διάλυμα παρακαταθήκης 100 mg/l και να κατασκευαστεί η καμπύλη βαθμονόμησης. 3. Από τη καμπύλη βαθμονόμησης και τις τιμές απορρόφησης των αγνώστων δειγμάτων να υπολογισθεί η συγκέντρωση της καφεΐνης στα αραιωμένα εκχυλίσματα των αγνώστων δειγμάτων. 4. Να υπολογιστεί η συγκέντρωση της καφεΐνης στο αρχικό δείγμα των 2 ml. 5. Να υπολογισθεί η ποσότητα της καφεΐνης (mg) στα αντίστοιχα υποστρώματα (αναψυκτικό 330 ml/ρόφημα 225 ml). 6. Να εκχυλιστεί ένα πρότυπο δείγμα καφεΐνης (5 ml, 10 mg/l) με CΗ 2 Cl 2 (2 φορές x 2,5 ml) και από την καμπύλη βαθμονόμησης να υπολογιστεί η ακρίβεια της μεθόδου εκφρασμένη ως εκατοστιαία ανάκτηση (R%) [Π4].

8 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Η.Η Willard L.L Merrit Jr. J.A Dean, Instrumental Methods of analysis p και 109. R.L. Pecsok, L.D. Shields, T. Cairns and I.G. McWilliams, Modern Methods of Chemical Analysis, 2nd Ed., John Wiley and Sons, New York. D.A. Skoog, F.J. Holler and T.A. Nieman, PRINCIPLES OF INSTRUMENTAL ANALYSIS, 5th Ed., Thomson Learning, Inc. Urbana-Champaign (1998), Chapters 6,13 and 14. Παρατηρήσεις Π1. Η προτεινόμενη μέθοδος προσδιορισμού της καφεΐνης βρίσκει εφαρμογή σε ένα μεγάλο εύρος δειγμάτων όπως ενεργειακά ποτά, αναψυκτικά τύπου κόλα, και ροφήματα όπως καφές, κακάο, τσάι κλπ. Π2. Το ανθρακικό νάτριο προστίθεται για να καταβυθιστούν τανίνες με τη μορφή αλάτων και αποφευχθεί η παρεμποδιστική τους δράση κατά την μέτρηση της απορρόφησης της καφεΐνης. Επιπλέον, η αύξηση της ιονικής ισχύος του διαλύματος αυξάνει την ανάκτηση/παραλαβή της καφεΐνης στην οργανική στοιβάδα. Π3. Η εκχύλιση είναι απαραίτητη για την παραλαβή της καφεΐνης στην οργανική στιβάδα ενώ τυχόν χρωστικές ενώσεις και ζάχαρα παραμένουν στο αρχικό δείγμα. Κατά τον τρόπο αυτό, αποφεύγεται η παρεμποδιστική δράση των ουσιών αυτών κατά την μέτρηση της απορρόφησης της καφεΐνης. Π4. Η εκατοστιαία ανάκτηση αποτελεί ένα μέτρο εκτίμησης της ακρίβειας της μεθόδου και δίνεται από τον τύπο: R% = (Θεωρητική Συγκέντρωση Καφεΐνης x 100) / (Πειραματική συγκέντρωση Καφεΐνης).