Φροντιστήριο Εργαστηρίου Βιοχημείας II. Βερούτη Σοφία, Υποψήφια διδάκτωρ Κ.Α.Δημόπουλος, Καθηγητής

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Φροντιστήριο Εργαστηρίου Βιοχημείας II. Βερούτη Σοφία, Υποψήφια διδάκτωρ Κ.Α.Δημόπουλος, Καθηγητής"

Οἰδίπους Ιωαννίδης
8 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Φροντιστήριο Εργαστηρίου Βιοχημείας II Βερούτη Σοφία, Υποψήφια διδάκτωρ Κ.Α.Δημόπουλος, Καθηγητής 1

2 Ορισμός Βιολογικός ρόλος Κατάταξη Απομόνωση Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός Εργαστηριακή άσκηση 2

3 Ορισμός Οργανικές υδατοδιαλυτές (ως επί το πλείστον) ενώσεις με γενικό τύπο C x (H 2 O) y (H 2 O : υδατ, C: άνθρακες) Μόρια με αναλογία άνθρακα, υδρογόνο, οξυγόνο 1:2:1 3

4 Μια από τις κυριότερες τάξεις βιομορίων η πιο άφθονη. Είναι καλή πηγή ενέργειας για τους οργανισμούς. Το άμυλο και τα σάκχαρα είναι οι κύριες υδατανθρακούχες πηγές ενέργειας και παρέχουν 4 θερμίδες/kcal (17 kj) ανά γραμμάριο. Πηγή άνθρακα για την σύνθεση των άλλων βιομορίων. Παράγονται με φωτοσύνθεση στα φυτά. 4

Το άμυλο και τα σάκχαρα είναι οι κύριες υδατανθρακούχες πηγές ενέργειας και

5 1. Χρησιμεύουν ως α) αποθήκες ενέργειας (άμυλο στα φυτά γλυκογόνο στα ζώα) β) καύσιμα γ) μεταβολικά ενδιάμεσα 2. Αποτελούν μέρος του δομικού σκελετού του DNA, RNA (δεοξυριβόζη και ριβόζη) (αποθήκευση και έκφραση γενετικών πληροφοριών) 3. Δομικά στοιχεία στα κυτταρικά τοιχώματα βακτηρίων και φυτών και στο σκελετό των αρθρόποδων 4. Συνδέονται με λιποειδή και πρωτεΐνες στις κυτταρικές επιφάνειες και είναι ενώσεις κλειδιά στην διεργασία αναγνώρισης των κυττάρων. 5

πληροφοριών) 3. Δομικά στοιχεία στα κυτταρικά τοιχώματα βακτηρίων και φυτών και στο σκελετό των αρθρόποδων 4.

6 1. Τουλάχιστον ένα ασύμμετρο άτομο άνθρακα. 2. Γραμμική ή κυκλική μορφή. 3. Σχηματίζουν πολυμερή μέσω γλυκοζιτικών δεσμών. 4. Δημιουργούν δεσμούς υδρογόνου με το νερό αλλά και με άλλα βιομόρια. 6

7 Οι υδατάνθρακες είναι αδιάλυτοι σε οργανικούς διαλύτες, με εξαίρεση τα γλυκολιποειδή. Οι περισσότεροι είναι ευδιάλυτοι στο νερό (εξαίρεση αποτελεί η κυτταρίνη, που είναι σχετικά αδιάλυτη) Είναι διαλυτοί σε χαμηλά ph (σε αντίθεση με τις πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα) Μετουσιώνονται πιο δύσκολα από τις πρωτεΐνες Καταβυθίζονται με υδατοδιαλυτούς διαλύτες (αιθανόλη, ακετόνη) 7

αδιάλυτη) Είναι διαλυτοί σε χαμηλά ph (σε αντίθεση με τις πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα)

8 8

9 D-Αλδόζες D-Κετόζες 9

10 D-γλυκεριναλδεύδη, 3-p- γλυκεριναλδεύδη p- διυδρόξυακετόνη 4-P-ερυθρόζη Ριβόζη Δεοξυριβόζη Ριβουλόζη Ξυλουλόζη D-γλυκόζη D-μαννόζη D-γαλακτόζη D-φρουκτόζη Σεδοεπτουλόζη 10

11 Εναντιομέρεια Οι πιο απομακρυσμένος από την καρβονυλομάδα *C καθορίζει τη στερεοισομέρεια Mirror plane Mirror plane H CHO OH HO CHO H HO CHO H H CHO OH H OH HO H H OH HO H CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH D-Erythrose L-Erythrose D-Threose L-Threose Διαστερεομέρεια Σχηματισμός ημιακεταλών σε υδατικό περιβάλλον Νέο *C Ανωμερή α,β 11

HO H H OH HO H CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH D-Erythrose L-Erythrose D-Threose

13 o Ο-Γλυκοζιτικός δεσμός (α,β) Ημιακεταλικό ΟΗ + ΟΗ (ROH, PhOH,RCOOH) o Ν-γλυκοζιτικός δεσμός (α,β) Ημιακεταλικό ΟΗ + NH 2 -R o Ονοματολογία Είδος σακχάρου Αριθμός σακχάρων 13

14 Φρουκτόζη Γλυκόζη Γαλακτόζη Τρείς διαφορετικοί μονοσακχαρίτες συνδέονται για να σχηματίσουν τους τρεις κυριότερους δισακχαρίτες. Σακχαρόζη Μαλτόζη Λακτόζη 14

15 άμυλο γλυκογόνο κυτταρίνη Πολυσακχαρίτες 15

17 Εκχύλιση με νερό Προσθήκη τριχλωροξικού οξέος καταβυθίζει πρωτεΐνες και νουκλεικά οξέα Θέρμανση μετουσιώνει τις πρωτεΐνες Προσθήκη διαλυτών (χλωροφόρμιο: ισοαμυλική αλκοόλη 25:1) μετουσιώνει τις πρωτεΐνες Χρήση ενζύμων (DNAάση, RNAαση, πρωτεάσες) που αποικοδομούν νουκλεϊνικά οξέα και πρωτεΐνες Καταβύθιση με αιθανόλη 17

(χλωροφόρμιο: ισοαμυλική αλκοόλη 25:1) μετουσιώνει τις πρωτεΐνες Χρήση ενζύμων

18 Φυσικές και χημικές ιδιότητες Διαλυτότητα Πολωσιμετρία Ειδικό βάρος Δείκτης διάθλασης Αναγωγικές ιδιότητες Χρωστικές αντιδράσεις Αντιδράσεις προσθήκης Αντιδράσεις οξείδωσεις Ενζυμικές αντιδράσεις Χρωματογραφικές μέθοδοι Στήλης, TLC, HPLC, GLC 18

αντιδράσεις Αντιδράσεις προσθήκης Αντιδράσεις οξείδωσεις

19 1. Μονοσακχαρίτες 2. Δισακχαρίτες εκτός από την Fru και την Tre 3. Πολυσακχαρίτες ως προς το ένα άκρο τους 19

20 1. Schoorl Regenbogen: όχι στοιχειομετρική αντίδραση, συνολικά ανάγοντα σάκχαρα. Cu +2 (OH) 2 +NaOH (φελίγγειο υγρό) CuSO 4 + NaOH + Τρυγικό K/Na 2. Kolthoff: προσδιορίζει μόνο αλδόζες Η περίσσεια Cu προσδιορίζεται με ιωδομετρικό προσδιορισμό Cu Ι - 2Cu + + Ι 2 Ι 2 + S 2 O 3-2 S 4 O Ι - Αλδονικά οξέα Η περίσσεια του Ι 2 ογκομετρείται με S 2 O

Kolthoff: προσδιορίζει μόνο αλδόζες Η περίσσεια Cu προσδιορίζεται με ιωδομετρικό

21 Η παραγόμενη φορμαλδεϋδη με χρωμοτροπικό οξύ δίνει χρώμα που μετρούμενο δηλώνει και το ποσόν της διασπώμενης ένωσης. 21

22 Μερικοί πολυσακχαρίτες (αμυλόζη, αμυλοπηκτίνη, γλυκογόνο, δεξτράνες) σχηματίζουν έγχρωμα σύμπλοκα με ιώδιο. Πρόκειται για ενώσεις έγκλισης Ι 2 στην έλικα του μορίου. Για να δώσουν έγχρωμη ένωση πρέπει να έχουν τουλάχιστον 8 διαδοχικά μονοσάκχαρα ώστε να σχηματισθεί η έλικα και να εγκλείσει το Ι 2. Σχήμα

23 o o o Αμυλόζη + Ι 2 μπλέ-μαύρο (όχι πολλές πλευρικές αλυσίδες) Αμυλοπηκτίνη + Ι 2 λιγότερο έντονο χρώμα (οι πλευρικές αλυσίδες παρεμποδίζουν τον σχηματισμό έλικας) Γλυκογόνο + Ι 2 καφέ ανοιχτό χρώμα (οι πλευρικές αλυσίδες εμποδίζουν τον σχηματισμό έλικας) 23

24 1. Χρωματογραφία στήλης Στατική φάση: ρητίνη ιοανταλλαγής Κατιονανταλλαγής: πολυμερή με ελεύθερες - COOH και SO 3 H Ανιονανταλλαγής: πολυμερή με ελεύθερες ή υποκατεστημένες ομάδες NH 2 2. Χαρτοχρωματογραφία Στατική φάση: Kυτταρίνη η οποία διαθέτει μόρια νερού. Κινούμενη φάση: Οξικός αιθυλεστέρας/ πυριδίνη/ νερό 8:2:1 νερό/ n-βουτανόλη/ οξικό οξύ 5:4:1 Εμφάνιση των κηλίδων: με χρωστικές αντιδράσεις Μειονεκτήματα Καταστρεπτική Χρονοβόρα Μεγάλες ποσότητες 24

25 3. Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) Στατική φάση: κυτταρίνη (κυρίως) ή silica gel G με KH 2 PO 4 (σπάνια) Κινητή φάση: Οξικός αιθυλεστέρας/ πυριδίνη/ νερό 8:2:1 νερό/ n-βουτανόλη/ οξικό οξύ 5:4:1 Εμφάνιση των κηλίδων: με χρωστικές αντιδράσεις ή απανθράκωση με π. οξέα 4. Αέρια υγρή χρωματογραφία (GLC) Σακχαρα τριμεθυλοσιλυλοπαράγωγα (TMS) ή ακετυλοπαράγωγα ή μεθυλεστέρες Μπορεί να συνδυαστεί με φασματοσκοπία μάζας (MS) 5. Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) Κύριο πλεονέκτημα: μη καταστρεπτική τεχνική Στήλες: silica με συνδεδεμένες στην επιφάνεια του ομάδες CN και NH 2 25

26 Δημητριακά Παγωτό 26

27 Η 2 SO 4 Η 2 SO 4 27

28 28

29 1) Αντίδραση με βάση Schiff 2) Αντίδραση με φαινυλυδραζίνη Οι φαινυλοζαζόνες είναι κρυσταλλικά, δυσδιάλυτα σώματα, με χαρακτηριστική οπτική στροφή. Μετρώντας το σ.τ. και την οπτική στροφική ικανότητα των οζαζονών που προκύπτουν μπορούν να ταυτοποιηθούν τα σάκχαρα από τα οποία προήλθαν. Σάκχαρα που διαφέρουν στα δυο πρώτα άτομα άνθρακα δίνουν την ίδια οζαζόνη 29

30 Προσδιορισμός δομής υδατανθράκων Προσδιορισμός σύστασης Προσδιορισμός αλληλουχίας και ισομερισμού της συνένωσης των μονοσακχαριτών Μέτρηση αναγωγικής ισχύος Υδρόλυση με ήπιες όξινες συνθήκες Εύρεση αριθμού αναγωγικών άκρων Μίγμα μονοσακχαριτών Προσδιορισμός αριθμού Προσδιορισμός φύσης Αναγωγικές μέθοδοι Χρωστικές μέθοδοι GLC HPLC MS 30

31 Προσδιορισμός δομής υδατανθράκων Προσδιορισμός σύστασης Προσδιορισμός αλληλουχίας και ισομερισμού της συνένωσης των μονοσακχαριτών Προσδιορισμός αλληλουχίας Προσδιορισμός ανωμερικής διαμόρφωσης Υδρόλυση προς ολιγοσακχαρίτες με οξέα ή με ειδικά ένζυμα Σχάση με ένζυμα γνωστής εξειδίκευσης NMR Διαχωρισμός ολιγοσακχαριτών με χρωματογραφικές μεθόδους Προσδιορισμός ανάγοντος άκρου με αναγωγή με NaBH 4 Προσδιορισμός μη αναγώντων άκρων Μεθυλίωση Όξινη υδρόλυση Ταυτοποίηση μεθυλιωμένων παραγώγων Οξείδωση με υπεριωδικό 31

32 In vivo πείραμα: Μελέτη μεταβολισμού Μελέτη κινητοποίησης του γλυκογόνου σε συνθήκες νηστείας (Γλυκογονόλυση) Πειραματικό υλικό: καλλιέργεια Tetrahymena pyriformis στο τέλος της λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης 32

33 1. Κινάση της γλυκόζης 2. Φωσφογλυκομουτάση 3. Πυροφωσφορυλάση της UDP-γλυκόζης 4. Συνθάση του γλυκογόνου 5. Φωσφορυλάση 6. Φωσφογλυκομουτάση 33

34 Όταν η συνθάση είναι ενεργή η φωσφορυλάση είναι ανενεργή Η δραστικότητα των ενζύμων ελέγχεται με ομοιοπολική μεταβολή της πρωτοταγούς δομής και με αλλοστερική μεταβολή της διαμόρφωσης της δομής του. AMP αλλοστερικός ενεργοποιητής της b μορφής της φωσφορυλάσης 34

35 Καλλιέργεια κυττάρων (200ml) 400xg, 10 min 200 ml φυσιολογικό ορό 400xg, 10 min Παραλαβήκυττάρων με 10 ml φυσιολογικό ορό Υπερκείμενο + αιθανόλη Δείγμα 1 Ανάδευση 1 ώρα Δείγμα 2 Προσδιορισμοί Καταβύθιση γλυκογόνου Βρασμός Ομογενοποίση κυττάρων 15000xg,20 min Γλυκόζης Ολικών σακχάρων Προσδιορισμός Ολικών σακχάρων Υπερκείμενο 35

36 Βασική Βιοχημεία, Δημόπουλος, Κ.Α., Αντωνοπούλου, Σ., 2 η Έκδοση, Αθήνα, 2009 Πειραματική Βιοχημεία, Clark, J.M., Switzer, R.L., Μετάφραση: Παπαδόπουλος, Γ., Παπαδόπουλος, Μ., Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο 1992 Ιστοσελίδα Τμήματος Χημείας: 36

37 37

Σχετικά έγγραφα

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ. Άσκηση 4 η : Ταυτοποίηση Σακχάρων. ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ Εργαστήριο Χημείας

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ. Άσκηση 4 η : Ταυτοποίηση Σακχάρων. ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ Εργαστήριο Χημείας Άσκηση 4 η : Ταυτοποίηση Σακχάρων ΑΣΚΗΣΕΙΣ 1. Εκχύλιση - Διήθηση Διαχωρισμός-Απομόνωση 2. Φασματοφωτομετρία Ποσοτικός Προσδιορισμός 3. Χρωματογραφία Διαχωρισμός-Απομόνωση 4. Ταυτοποίηση Σακχάρων Χαρακτηριστικές