Βασικά εργαλεία της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου

Transcript

1 Βασικά εργαλεία της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA Τα ένζυμα περιορισμού κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες λ ΠΙΝΑΚΑΣ 4.1: Ορισμένα ένζυμα περιορισμού και οι αλληλουχίες που αναγνωρίζουν. ΕΙΚΟΝΑ 4.1: Διαχωρισμός μορίων DNA διαφορετικού μεγέθους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα. Η DNA λιγάση ενώνει τα άκρα τμημάτων DNA που παράγονται από τα ένζυμα έζ περιορισμού

2 Πλασμίδια και ιοί χρησιμοποιούνται ως φορείς αλληλουχιών DNA ΕΙΚΟΝΑ 4.2: Τα ένζυμα περιορισμού παράγουν είτε λί λεία (τυφλά) άκρα είτε κολλώδη άκρα. Στόχος της κλωνοποίησης: απομόνωση ηγονιδίου παραγωγή σε μεγάλες ποσότητες Προφανώς: βακτήρια Πλασμίδια: psc101 (1 EcoRI, tet) psc102 (3 EcoRI, kan) ΕΙΚΟΝΑ 4.3: Φωτογραφία του πλασμιδίου psc101 στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Τα πέντε βασικά βήματα της κλωνοποίησης ΕΙΚΟΝΑ 4.9: Διάκριση μπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισμό ανασυνδυασμένων φορέων. ΕΙΚΟΝΑ 4.5: Τα πέντε βασικά βήματα της κλωνοποίησης DNA σε πλασμίδιο.

3 Το DNA δεν παραμένει αναλλοίωτο Μεταθετά στοιχεία στο γονιδίωμα: DNA τρανσποζόνια ρετροϊοί και ρετρομεταθετά Barbara Mc Clintock (τέλη δεκαετίας 40): "παράξενα" ρξ γενετικά στοιχεία έχουν την ικανότητα να κατευθύνουν τα ίδια τη μετάθεσή τους μέσα στο γονιδίωμα Γεννήθηκε: 16 Ιουνίου 1902 Πέθανε: 2 Σεπτεμβρίου 1992 Nobel Ιατρικής ή Φυσιολογίας: 1983 Αλληλουχίες ένθεσης (IS) Εικόνα 16.2 Τα τρανσποζόνια φέρουν ανάστροφες επάκριες επαναλήψεις και δημιουργούν ομόρροπες επαναλήψεις στο DNA που βρίσκεται εκατέρωθεν της θέσης ένθεσης. Σε αυτό το παράδειγμα, ο στόχος του τρανσποζονίου είναι μια αλληλουχία 5 bp. Τα άκρα του τρανσποζονίου αποτελούνται από ανάστροφες επαναλήψεις 9 bp, όπου οι αριθμοί 1 ως 9 αντιπροσωπεύουν μια αλληλουχία από ζεύγη βάσεων. cis-δραστικές μεταλλάξεις που αποτρέπουν τη μετάθεση εντοπίζονται στα άκρα Τα σύνθετα τρανσποζόνια φέρουν μονάδες IS Εικόνα 16.3 Ένα σύνθετο τρανσποζόνιο έχει μία κεντρική περιοχή η οποία φέρει δείκτες (όπως γονίδια ανθεκτικότητας σε φάρμακα) και περικλείεται από μονάδες IS. Οι μονάδες έχουν βραχείες ανάστροφες επάκριες επαναλήψεις. Αν οι μονάδες έχουν αντίθετο προσανατολισμό, οι βραχείες ανάστροφες επάκριες επαναλήψεις στα άκρα του τρανσποζονίου είναι πανομοιότυπες. Όταν οι δυο μονάδες IS είναι ίδιες, οποιαδήποτε μπορεί να προωθήσει τη μετάθεση. Όταν η μία εμφανίζει μειωμένη λειτουργικότητα, η μετάθεση εξαρτάται αποκλειστικά από την άλλη.

4 Τα μεταθετά στοιχεία χρησιμοποιούνται ως εργαλεία για τη δημιουργία διαγονιδιακών οργανισμών Γενετικός Μετασχηματισμός Ενσωμάτωση εξωγενούς DNA στη γαμετική σειρά οργανισμών Δημιουργία σταθερής αλλαγής του φαινοτύπου Δημιουργία GMOs Απαντήσεις σε ερωτήματα για: τη φυσιολογική δράση του ενσωματωμένου DNA τη γενετική δράση του ενσωματωμένου DNA Ταυτοποίηση και κλωνοποίηση γονιδίων in vivo αξιολόγηση in vitro μεταλλάξεων Βασικές αρχές μετασχηματισμού ευκαρυωτικών κυττάρων ΕΙΚΟΝΑ 6.8: Μεταφορά γονιδίων με ηλεκτροδιάτρηση. ΕΙΚΟΝΑ 6.9: Διαμόλυνση με χρήση λιποσωμάτων.

5 Μεταφορά DNA σε φυτικά κύτταρα ΕΙΚΟΝΑ 6.10: Αναγέννηση φυτών από πρωτοπλάστες. ΕΙΚΟΝΑ 6.11: Άμεση μεταφορά DNA σε φυτικά κύτταρα με βομβαρδισμό μικροσφαιριδίων. ΕΙΚΟΝΑ 6.10: Αναγέννηση φυτών από πρωτοπλάστες. Χρήση ιικών φορέων ΕΙΚΟΝΑ 6.12: ΕΙΚΟΝΑ 6.12: Χρήση ενός ρετροϊικού φορέα για τη σταθερή και μακροπρόθεσμη έκφραση ενός εξωγενούς γονιδίου.

6 Για να συμβάλει στην προστασία του απορρήτου σας, το PowerPoint απέτρεψε την αυτόματη λήψη αυτής της εξωτερικής εικόνας. Για να κάνετε λήψη και να εμφανίσετε αυτή την εικόνα, κάντε κλικ στο στοιχείο "Επιλογές" στη γραμμή μηνυμάτων και, στη συνέχεια, κάντε κλικ στην επιλογή "Ενεργοποίηση εξωτερικού περιεχομένου". ΕΙΚΟΝΑ 6.12: Χρήση ενός ρετροϊικού φορέα για τη σταθερή και μακροπρόθεσμη έκφραση ενός εξωγενούς γονιδίου. Χρήση του Ti πλασμιδίου για εισαγωγή νέων γονιδίων στα φυτά Σε όλες τις περιπτώσεις, το κύτταρο εκφράζει το νέο γονίδιο που έχει εισαχθεί με τη βοήθεια του ιού, αλλά δεν παράγει ποτέ ιούς, διότι το ανασυνδυασμένο γονιδίωμα του ιού στερείται τα απαραίτητα ιικά γονίδια. Το Agrobacterium tumefaciens μολύνει φυτικά κύτταρα δημιουργώντας φυτικούς όγκους. Το πλασμίδιο Ti (~200 kb) είναι υπεύθυνο για την ενσωμάτωση μέρους του (T DNA). Το Τ DNA κωδικοποιεί πρωτεΐνες που προκαλούν κυτταρική διαίρεση ( όγκοι). ) Κωδικοποιεί ένζυμα που μετατρέπουν την αργινίνη σε νοπαλίνη (ή οκτοπίνη) που χρειάζονται για την ανάπτυξη του A. tumefaciens.

7 Για το φυτικό μετασχηματισμό: Οι T DNA αλληλουχίες αντικαθίστανται από τις επιθυμητές αλληλουχίες. Ένα δεύτερο πλασμίδιο που περιέχει τα vir γονίδια επιτρέπει τη κινητοποίηση του διαμορφωμένου T DNA. ΕΙΚΟΝΑ 6.13: Μεταφορά γονιδίων σε φυτικά κύτταρα με τη χρήση ενός δυαδικού συστήματος. ΕΙΚΟΝΑ 6.13: Μεταφορά γονιδίων σε φυτικά κύτταρα με τη χρήση ενός δυαδικού συστήματος. Δημιουργία διαγονιδιακών ζώων με άμεση έγχυση DNA σε έμβρυα ΕΙΚΟΝΑ 6.14: Κατασκευή διαγονιδιακών δ ποντικών με μικροένεση.

8 ΕΙΚΟΝΑ 6.14: Κατασκευή διαγονιδιακών δ ποντικών με μικροένεση. Ιστοειδική έκφραση γονιδίων Μετασχηματισμός Drosophila ΕΙΚΟΝΑ 6.15: Έκφραση διαγονιδίων σε συγκεκριμένους ιστούς. Γενετικός μετασχηματισμός ευρύτατα διαδεδομένος από το 1982 Ιδιαίτερα χρήσιμος για γενετική ανάλυση διότι είναι: Απλός Αποτελεσματικός Υπάρχει μεγάλος αριθμός μεταλλαγμένων στελεχών Υπάρχει μεγάλος αριθμός κλωνοποιημένων γονιδίων Εξεζητημένες τεχνικές Gene tagging Enhancer trapping Προϋποθέσεις Γενετικός μετασχηματισμός Drosophilids Κατάλληλοι και αποτελεσματικοί γονίδια-δείκτες Κατάλληλοι γονιδιακοί φορείς Transposable-element mediated

9 Γενετικός μετασχηματισμός εντόμων γεωργικής σημασίας Δημιουργία διαγονιδίων D. melanogaster Η βελόνα έγχυσης Στοίχιση εμβρύων Drosophila

10 Έγχυση - ένεση Μετά την έγχυση Back-cross injected flies Drain oil off the coverslips Transfer to food vial Μετασχηματισμός Drosophila μέσω του μεταθετού στοιχείου P Μετασχηματισμός μέσω P Επιτυχής σε Drosophilids: συχνότητα 10-30% Μη επιτυχής σε: Aedes aegypti (1989) Aedes triseriatus (1988) Anopheles gambiae (1987) Χαμηλή συχνότητα Μη-ομόλογη ενσωμάτωση Μετασχηματισμός μη-drosophildes μέσω μεταθετών Μετασχηματισμός εντόμων Hermes Mariner PiggyBac Minos

11 Έκφραση του δείκτη EGFP Ανάλυση υποκινητών σε διαγονιδιακά έντομα Χρήση υποκινητών για την καθοδήγηση έκφρασης γονιδίων αναφοράς Ανάλυση λειτουργίας υποκινητών: έλεγχος της έκφρασης γονιδίου αναφοράς υπό τον έλεγχο υποκινητή ώστε να διαλευκανθεί ο ρόλος συγκεκριμένων αλληλουχιών του υποκινητή Υποκινητές που χρησιμοποιούνται για την έκφραση γονιδίων αναφοράς σε διάφορα έντομα Τουλάχιστον 8 υποκινητές της D. melanogaster λειτουργούν σε ετερόλογα έντομα. Ο πλέον χρησιμοποιούμενος μ είναι ο υποκινητής ηήςτου hsp70. Σωστή λειτουργία του γονιδίου cn + της D. melanogaster στο αντίστοιχο μετάλλαγμα του Ae. aegypti: Ο υποκινητής αναγνωρίζεται από το μεταγραφικό μηχανισμό του ξενιστή για τη σωστή αναπτυξιακή και ιστο-ειδική έκφραση Σωστό μάτισμα ιντρονίου Ιστο-ειδικοί και αναπτυξιακο-ειδικοί υποκινητές Λειτουργική ανάλυση DNA αλληλουχιών που ελέγχουν τη γονιδιακή έκφραση Καθορισμός των βασικών συστατικών του υποκινητή Καθορισμός ενισχυτών (enhancers) Καθορισμός: ιστο-, φυλο- και αναπτυξιακοειδική έκφραση Δύο πρακτικές εφαρμογές: Η Μεσογειακή μύγα, Ceratitis capitata Νέα στελέχη γενετικού καθορισμού φύλου εντόμων γεωργικής σημασίας Κουνούπια χωρίς ελονοσία

12 Έλεγχος εντόμων με τη μέθοδο SIT Concept: Generate large amounts of male flies in the laboratory Sterilize them by irradiation Release them in the environment Infertile matings Advantages: Simplicity of biological principle Lack of negative ecological effects Successful applications: Pink bollworm in California Screw-worm in Florida Tsetse flies in Zanzibar Tephritide flies around the world Γενετικός διαχωρισμός φύλου I Στελέχη γενετικού φυλο-διαχωρισμού στη Μεσογειακή μύγα (Genetic Sexing Strains, GSS) Βάση διαχωρισμού φύλων: Χρώμα οπίσθιου τραχειακού ανοίγματος της προνύμφης Χρώμα νύμφης Μέγεθος νύμφης Μηχανική διαλογή φύλου Το στέλεχος T228 Βραδύτερη εμβρυονική ανάπτυξη: αυγά wt εντόμων εκκολάπτονται ύστερα από 36h στους 23 C, μεταλλαγμένα αυγά εκκολάπτονται μετά από 76h. Μια χρωμοσωμική μετατόπιση έκανε σύνδεση του wt αλληλομόρφου του εμπλεκόμενου γονιδιακού τόπου με το Υ χρωμόσωμα. Κατά συνέπεια, τα αρσενικά άτομα είχαν φυσιολογική ανάπτυξη, ενώ τα θηλυκά ήταν μεταλλαγμένα (είχαν καθυστερημένη ανάπτυξη) => Πρώιμος διαχωρισμός φύλων Γενετικός διαχωρισμός φύλου II Γενετική τροποποίηση εντόμων: θηλεο-ειδική έκφραση ενός υπό συνθήκη επικρατούς θανατογόνου γονιδίου Μετασχηματισμός εντόμου με: Tetracycline-repressible transactivator fusion protein (της E. coli) υπό τον έλεγχο ενός θηλεο-ειδικού υποκινητή (eg yolk protein) Ένα προ-αποπτωτικό γονίδιο υπό τον έλεγχο του teto Ανάπτυξη εντόμων με τετρακυκλίνη Απομάκρυνση tet => επαγωγή της έκφρασης του hid => θανάτωση θηλυκών εντόμων The tetracyclineregulated femalekilling system Δυαδικά συστήματα έκφρασης tta: tetracycline controlled transactivator hid: head involution defective, a proapoptotic p p gene. Ectopic expression of hid leads to organismal death caused by induction of apoptosis Έκφραση του tta ελέγχεται από θηλεο-ειδικό και fat-body-ειδικό μεταγραφικό ενισχυτή του γονιδίου yp1. Απουσία τετρακυκλίνης, ο tta συνδέεται στον teto και επάγει την έκφραση του προ-αποπτοτικού γονιδίου hid. Η απώλεια του fat body οδηγεί στη θνησιμότητα των θηλυκών ατόμων. Παρουσία τετρακυκλίνης, τα θηλυκά είναι πλήρως βιώσιμα, αφού η σύνδεση του tta στον teto παρεμποδίζεται, καταστέλλοντας την έκφραση του hid.

13 Το ανωφελές κουνούπι φορέας της ελονοσίας, Anopheles gambiae Ο κύκλος ζωής της ελονοσίας Ο κύκλος του πλασμωδίου στο κουνούπι Parasites cross the mosquito epithelia possibly by a receptor mediated mechanism. SM1, a 12-aa plasmodium peptide that binds specifically to the two epithelia that are traversed by the parasite. Structure of the AgCP[SM1] 4 gene and its expression in transgenic mosquitoes Αναστολή δημιουργίας οοκυστών σε διαγονιδιακά κουνούπια Διαγονιδιακά κουνούπια που αναχαιτίζουν τη μετάδοση της ελονοσίας